AT408549B - VIRUS-CONTAINING VACCINE, RECOMBINANT VIRUS AND METHOD FOR EXPRESSING A GENE PRODUCT - Google Patents
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Description
AT 408 549 BAT 408 549 B
Die vorliegende Erfindung betrifft einen virushaltigen Impfstoff, der in Vertebraten eine Immunantwort auslöst, wobei ein synthetisches rekombinantes Virus verwendet wird. Insbesondere betrifft die Erfindung die Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten, insbesondere einem Säugetier, auf ein Vertebraten-Pathogen durch Impfung des Vertebraten mit einem synthetischen rekombinanten, DNA enthaltenden Avipoxvirus, das die antigenen Determinanten des Pathogens codiert und exprimiert, und im speziellen Impfstoffe, die solch ein modifiziertes Avipoxvirus enthalten. Weiter betrifft die Erfindung modifiziertes Avipoxvirus, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung und bestimmte DNA-Sequenzen, die als Zwischenstufen in der Herstellung des modifizierten Avipoxvirus und Verfahren zur Herstellung solcher Sequenzen produziert werden oder beteiligt sind. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird durch den aus EP-A2-0 110 385, US-A-4 603 112 und EP-A2-0 261 940 bekannten Stand der Technik weder gelehrt noch nahegelegt.The present invention relates to a virus-containing vaccine which triggers an immune response in vertebrates, using a synthetic recombinant virus. In particular, the invention relates to eliciting an immune response in a vertebrate, particularly a mammal, to a vertebrate pathogen by vaccinating the vertebrate with a synthetic recombinant DNA-containing avipox virus that encodes and expresses the antigenic determinants of the pathogen, and in particular vaccines that contain such a modified Avipox virus. The invention further relates to modified avipox virus, processes for its production and its use and certain DNA sequences which are produced or are involved as intermediates in the production of the modified avipox virus and processes for producing such sequences. The object of the present invention is neither taught nor suggested by the prior art known from EP-A2-0 110 385, US-A-4 603 112 and EP-A2-0 261 940.
Technischer HintergrundTechnical background
Avipox oder Avipoxvirus ist eine Vögel infizierende, nahe verwandte Gattung von Pockenviren. Die Gattung Avipox schließt die Arten Geflügelpocken, Kanarienpocken, Schneehuhnpocken, Taubenpocken, Wachtelpocken, Spatzenpocken, Starpocken und Truthahnpocken ein. Die Art Geflügelpocken infiziert Hühner. Sie darf nicht mit der menschlichen Erkrankung Windpocken verwechselt werden. Die Gattung Avipox hat viele gemeinsame Merkmale mit anderen Pockenviren und ist ein Mitglied derselben Unterfamilie, Pockenviren von Vertebraten, wie Vaccinia. Pockenviren, einschließlich Vaccinia und Avipox, replizieren innerhalb eukaryotischer Wirtszellen. Diese Viren sind gekennzeichnet durch ihre Größe, Komplexität und durch ihre Replikation im Cytoplasma. Allerdings gehören Vaccinia und Avipox zu verschiedenen Gattungen und sind in ihren jeweiligen Molekulargewichten, ihren antigenen Determinanten und in ihrer Wirtsspezifität verschieden; vgl. Intervirology, Bd. 17, Seiten 42-44, Fourth Report ofthe International Commitee on Taxonomy of Viruses (1982).Avipox or Avipoxvirus is a closely related genus of smallpox viruses that infect birds. The genus Avipox includes the species poultry pox, canary pox, ptarmigan pox, pigeon pox, quail pox, sparrow pox, starpox and turkey pox. Chicken pox infects chickens. It should not be confused with the human disease chickenpox. The genus Avipox has many features in common with other smallpox viruses and is a member of the same subfamily, poxviruses from vertebrates such as vaccinia. Smallpox viruses, including vaccinia and avipox, replicate within eukaryotic host cells. These viruses are characterized by their size, complexity and by their replication in the cytoplasm. However, vaccinia and avipox belong to different genera and are different in their respective molecular weights, their antigenic determinants and their host specificity; see. Intervirology, vol. 17, pages 42-44, Fourth Report ofthe International Committee on Taxonomy of Viruses (1982).
Avipoxviren infizieren nicht unter Vermehrung nicht-vogelartige Vertebraten, wie Säugetiere einschließlich Menschen. Des weiteren vermehrt Avipoxvirus sich nicht, wenn man Säugetier-(einschließlich Menschen-) Zellkulturen beimpft. In solchen Säugetier-Zellkulturen, die mit Avipox infiziert sind, sterben die Zellen wegen eines cytotoxischen Effekts ab, zeigen aber keine Hinweise auf eine virale Infektion unter Vermehrung.Avipox viruses do not infect multiply non-bird-like vertebrates like mammals, including humans. Furthermore, avipox virus does not multiply when inoculating mammalian (including human) cell cultures. In such mammalian cell cultures infected with Avipox, the cells die due to a cytotoxic effect, but show no evidence of viral infection with proliferation.
Die Impfung eines nicht-vogeiartigen Vertebraten wie z.B. eines Säugetiers mit lebenden Avi-pocken führt zur Bildung einer Läsion an der Impfstelle, die an eine Impfung mit Vaccinia erinnert. Es führt aber zu keiner produktiven viralen Infektion. Allerdings ist nun gefunden worden, daß ein auf diese Weise geimpftes Säugetier immunologisch auf das Avipoxvirus reagiert. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis.Vaccination of a non-bird-like vertebrate such as of a mammal with live Avi-pox leads to the formation of a lesion at the vaccination site that is reminiscent of vaccination with vaccinia. However, it does not lead to a productive viral infection. However, it has now been found that a mammal vaccinated in this way reacts immunologically to the avipox virus. This is an unexpected result.
Impfstoffe, die aus abgetötetem Pathogen oder gereinigten antigenen Komponenten solcher Pathogene zusammengestellt sind, müssen in größeren Mengen als Lebendvirus-Impfstoffe injiziert werden, um eine effektive Immunantwort hervorzurufen. Der Grund ist, daß Impfung mit Lebendvirus eine viel effizientere Methode der Impfung ist. Ein vergleichsweise kleines Inoculum kann eine effektive Immunantwort hervorrufen, weil das betreffende Antigen während der Replikation des Virus vermehrt wird. Aus medizinischer Sicht bieten Lebendvirusimpfstoffe eine effektivere und länger anhaltende Immunität, als eine Impfung mit einem abgetöteten Pathogen oder gereinigten Antigenimpfstoff. Daher erfordern Impfstoffe, die aus abgetöteten Pathogen oder gereinigten antigenen Bestandteilen solcher Pathogene zusammengesetzt sind, eine Produktion von größeren Mengen des Impfstoffmaterials als es mit Lebendvirus gebraucht wird.Vaccines composed of killed pathogen or purified antigenic components of such pathogens must be injected in greater quantities than live virus vaccines in order to elicit an effective immune response. The reason is that live virus vaccination is a much more efficient method of vaccination. A comparatively small inoculum can produce an effective immune response because the antigen in question is increased during the replication of the virus. From a medical point of view, live virus vaccines offer more effective and longer-lasting immunity than vaccination with a killed pathogen or purified antigen vaccine. Therefore, vaccines composed of killed pathogens or purified antigenic components of such pathogens require production of larger amounts of the vaccine material than is needed with the live virus.
Aus der vorangegangenen Diskussion ist klar, daß es medizinische und wirtschaftliche Vorteile für den Gebrauch von Lebendvirus-Impfstoffen gibt. Ein solcher Lebendvirus-Impfstoff enthält Vacciniavirus. Es ist bekannt, daß dieses Virus benutzt werden kann, um mittels rekombinanten DNA-Methoden DNA zu inserieren, die genetische Sequenzen der Antigene von Säugetierpathogenen darstellt.It is clear from the previous discussion that there are medical and economic benefits for the use of live virus vaccines. Such a live virus vaccine contains vaccinia virus. It is known that this virus can be used to use recombinant DNA methods to insert DNA which is the genetic sequence of the antigens of mammalian pathogens.
Daher wurden im Stand der Technik Verfahren entwickelt, die die Herstellung von rekombinanten Vacciniaviren durch die Insertion von DNA aus einer beliebigen Quelle (z.B. virale, prokaryoti-sche, eukaryotische, synthetische) in eine nicht-essentielle Region des Vacciniagenoms erlauben, 2Therefore, methods have been developed in the prior art which allow the production of recombinant vaccinia viruses by inserting DNA from any source (e.g. viral, prokaryotic, eukaryotic, synthetic) into a non-essential region of the vaccinia genome, 2
AT 408 549 B einschließlich von DNA-Sequenzen, die für antigene Determinanten eines pathogenen Organismus codieren. Bestimmte rekombinante Vacciniaviren, die mittels dieser Verfahren hergestellt wurden, wurden benutzt, um spezifische Immunität in Säugetieren auf eine Vielfalt von Säugetierpathogenen hervorzurufen, die in der US-A-4,603,112 beschrieben sind, auf deren Inhalt hier Bezug ge-5 nommen wird.AT 408 549 B including DNA sequences which code for antigenic determinants of a pathogenic organism. Certain recombinant vaccinia viruses produced by these methods have been used to elicit specific immunity in mammals to a variety of mammalian pathogens described in US-A-4,603,112, the contents of which are incorporated herein by reference.
Unverändertes Vacciniavirus hat eine lange Geschichte eines relativ sicheren und wirkungsvollen Gebrauchs zur Impfung gegen Pocken. Vor der Ausrottung der Pocken allerdings, als unmodi-fiziertes Vacciniavirus weithin verabreicht wurde, gab es ein geringes, aber reales Risiko von Komplikationen in Form einer generalisierten Vacciniainfektion, besonders bei Patienten, die an io Ekzemen oder Immunsuppression litten. Eine weitere seltene, aber mögliche Komplikation, die aus der Impfung mit Vaccinia folgen kann, ist postvaczinale Encephalitis. Die meisten dieser Reaktionen ergaben sich bei der Impfung von Personen mit Hautkrankheiten, wie Ekzemen, oder mit einem geschwächten Immunsystem, oder von Individuen in Haushaiten, in denen andere ein Ekzem oder eine geschwächte Immunantwort hatten. Vaccinia ist ein Lebendvirus und ist normale lerweise harmlos für eine gesunde Person. Allerdings kann es zwischen Individuen mehrere Wochen lang nach der Impfung übertragen werden. Wenn eine Person mit einer Schwächung der normalen Immunantwort entweder durch Impfung oder durch Ansteckung durch eine frisch geimpfte Person infiziert wird, können die Folgen ernst sein.Unchanged vaccinia virus has a long history of relatively safe and effective use for smallpox vaccination. However, prior to the eradication of smallpox when unmodified vaccinia virus was widely administered, there was a small but real risk of complications in the form of generalized vaccinia infection, especially in patients suffering from ok eczema or immunosuppression. Another rare but possible complication that can result from vaccination with vaccinia is post-vaccinal encephalitis. Most of these reactions have occurred when vaccinating people with skin diseases such as eczema or with a weakened immune system, or individuals in households where others have had eczema or a weakened immune response. Vaccinia is a live virus and is usually harmless to a healthy person. However, it can be transmitted between individuals for several weeks after vaccination. If a person with a weakened immune response is infected either by vaccination or by infection from a freshly vaccinated person, the consequences can be serious.
Somit ist verständlich, daß ein Verfahren, welches in der Vorgehensweise die Vorteile von 20 Lebendvirus-Impfung einschließt, jedoch die vorher angesprochenen Probleme vermindert oder ausschließt, ein höchst wünschenswerter Fortschritt über den gegenwärtigen Stand der Technik wäre. Dies ist heute umso mehr mit dem Vordringen der als "acquired immune deficiency Syndrome" (AIDS) bekannten Krankheit von Bedeutung. Opfer dieser Erkrankung leiden an schwerer Immundysfunktion und können leicht durch eine normalerweise sichere Lebendviruspräparation 25 getroffen werden, wenn sie entweder direkt oder über den Kontakt mit einer Person, die kurz zuvor mit einem derartigen Lebendvirus-Impfstoff immunisiert worden ist, in Kontakt mit einem solchen Virus kommen.Thus, it will be understood that a method that incorporates the benefits of live virus vaccination in the course of the procedure but reduces or eliminates the problems discussed above would be a highly desirable advance over the current state of the art. This is even more so today with the advancement of "acquired immune deficiency syndrome" (AIDS) known illness of importance. Victims of this condition suffer from severe immune dysfunction and can be easily affected by a normally safe live virus preparation 25 when in contact with such a virus, either directly or through contact with a person who has recently been immunized with such a live virus vaccine come.
Gegenstand der Erfindung 30SUBJECT OF THE INVENTION 30
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist, Vertebraten gegen pathogene Organismen zu immunisieren, und der die Vorteile eines Lebendvirus-Impfstoffs hat, und der wenige oder keine der Nachteile sowohl eines Lebendvirusimpfstoffs als auch eines abgetöteten Virus-Impfstoffe hat, besonders, wenn er zum 35 Immunisieren von nicht-vogelartigen Vertebraten verwendet wird.It is an object of the present invention to provide a vaccine which is capable of immunizing vertebrates against pathogenic organisms and which has the advantages of a live virus vaccine and which has little or none of the disadvantages of both a live virus vaccine and has a killed virus vaccine, especially when used to immunize non-bird vertebrates.
Weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist, synthetische rekombinante Avipoxviren zur Verwendung in solchen Impfstoffen Verfügung zu stellen.Another object of this invention is to provide synthetic recombinant avipox viruses for use in such vaccines.
Es ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in nicht-vogelartigen Vertebraten auf ein Antigen durch Impfung des Vertebraten mit einem 40 synthetischen rekombinanten Avipoxvirus zur Verfügung zu stellen, das sich z.B. in Säugetieren nicht unter Vermehrung unter Produktion von infektiösem Virus repliziert. In diesem Fall begrenzt das Virus sich selbst und reduziert die Möglichkeit der Verbreitung auf nicht-geimpfte Wirte.It is another object of this invention to provide a method of eliciting an immune response in non-bird vertebrates to an antigen by vaccinating the vertebrate with a synthetic recombinant avipox virus, e.g. not replicated in mammals with proliferation producing infectious virus. In this case, the virus limits itself and reduces the possibility of spreading to non-vaccinated hosts.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Antigen zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren die Impfung 45 des Vertebraten mit einem Impfstoff umfaßt, der synthetisches rekombinantes, die antigenen Determinanten eines Pathogens für den Vertebraten einschließenden und exprimierenden Avipoxvirus enthält.It is another object of the invention to provide a method for eliciting an immune response in a vertebrate to an antigen, the method comprising inoculating 45 the vertebrate with a vaccine which is synthetic recombinant, the antigenic determinant of a pathogen for the vertebrate including and expressing avipox virus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines Genprodukts in einem Vertebraten durch Impfung des Vertebraten mit einen rekombinanten Virus zur Verfügung 50 zu stellen, der das Genprodukt ohne repiikative Vermehrung des Virus in dem Vertebraten codiert und exprimiert.Another object of the invention is to provide a method for expressing a gene product in a vertebrate by vaccinating the vertebrate with a recombinant virus, which encodes and expresses the gene product in the vertebrate without repeating the virus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Antigen durch Impfung des Vertebraten mit einem rekombinanten, DNA enthaltenden Virus zur Verfügung zu stellen, das das Antigen ohne repiikative Vermehrung des 55 Virus in dem Vertebraten codiert und exprimiert. 3Another object of the invention is to provide a method for eliciting an immune response in a vertebrate to an antigen by vaccinating the vertebrate with a recombinant DNA-containing virus, which encodes and expresses the antigen without repeating the virus in the vertebrate without replicating . 3rd
AT 408 549 BAT 408 549 B
Darstellung der Erfindung in einer Hinsicht betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Pathogen durch Impfung des Vertebraten mit einem synthetischen, rekombinanten Avipoxvirus. Dieser Virus ist modifiziert durch die Gegenwart - in einer nichtessentiellen Region des Avipoxgenoms - von DNA aus einer beliebigen Quelle, welche ein Antigen des Pathogens codiert und exprimiert.In one aspect, the invention relates to a method for triggering an immune response in a vertebrate to a pathogen by vaccinating the vertebrate with a synthetic, recombinant avipox virus. This virus is modified by the presence, in a non-essential region of the avipox genome, of DNA from any source which encodes and expresses an antigen of the pathogen.
In einer weiteren Hinsicht betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Expression eines Genprodukts oder zur Auslösung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Vertebraten mit einem rekombinanten, sich nicht replikativ in den Zellen des Vertebraten vermehrenden Virus, das aber das Genprodukt oder das Antigen in den Zellen des Vertebraten exprimiert.In a further aspect, the invention relates to a method for expressing a gene product or for triggering an immune response to an antigen in a vertebrate with a recombinant virus which does not replicate replicatively in the cells of the vertebrate, but which, however, the gene product or the antigen in the cells of the Vertebrates expressed.
In einer weiteren Hinsicht betrifft die Erfindung synthetisches, rekombinantes Avipoxvirus, das durch Insertion von DNA aus einer beliebigen Quelle, insbesondere aus einer Nicht-Avipoxquelle, in einer nicht-essentiellen Region des Avipoxvirus-Genoms modifiziert ist Synthetisch modifizierte Avipoxvirus-Rekombinanten, die exogene (d.h. Nicht-Avipox) Gene tragen, die ein Antigen codieren und exprimieren und die bei einem Vertebratenwirt eine Immunantwort auf das Antigen und deshalb auf das exogene Pathogen hervorrufen, werden erfindungsgemäß besonders zur Impfung nicht-vogelartiger Vertebraten als neue Impfstoffe benutzt, die die Nachteile üblicher, abgetötete oder attenuierte lebende Organismen benutzende Impfstoffe vermeiden.In a further aspect, the invention relates to synthetic, recombinant avipox virus which is modified by insertion of DNA from any source, in particular from a non-avipox source, in a non-essential region of the avipox virus genome. Synthetically modified avipox virus recombinants which exogenous ( ie non-Avipox) carrying genes which encode and express an antigen and which elicit an immune response to the antigen and therefore to the exogenous pathogen in a vertebrate host, are used according to the invention especially for vaccinating non-bird-like vertebrates as new vaccines which have the disadvantages more common Avoid vaccines that use killed or attenuated living organisms.
Es muß noch einmal bemerkt werden, daß Avipoxviren sich nur replikativ vermehren können in bzw. passagiert werden können durch Vogelarten oder Vogelzellinien. Die rekombinanten, aus Vogelwirtszellen gewonnenen Avipoxviren rufen eine Impfungsläsion ohne replikative Vermehrung des Avipoxvirus hervor, wenn man nicht-vogelartige Vertebraten, wie Säugetiere, in einer der Impfung von Säugetieren mit Vacciniavirus entsprechenden Weise impft. Trotz des Fehlens einer replikativen Vermehrung des Avipoxvirus in solch einem geimpften nicht-vogelartigen Vertebraten geschieht genügend Expression des Virus, so daß das geimpfte Tier immunologisch auf die anti-genen Determinanten des rekombinanten Avipoxvirus und auch auf die antigenen Determinanten antwortet, für die die im Virus enthaltenen exogenen Gene codieren.It must be noted once again that avipox viruses can only replicate replicatively in or can be passaged through bird species or bird cell lines. The recombinant avipox viruses derived from avian host cells cause a vaccination lesion without replicative replication of the avipox virus when non-avian vertebrates, such as mammals, are vaccinated in a manner corresponding to vaccination of mammals with vaccinia virus. Despite the lack of replicative replication of the avipox virus in such a vaccinated non-bird-like vertebrate, enough expression of the virus occurs that the vaccinated animal responds immunologically to the anti-gene determinants of the recombinant avipox virus and also to the antigenic determinants for which those in the virus encode contained exogenous genes.
Bei Impfung einer Vogelart ruft ein solches synthetisches rekombinantes Avipoxvirus nicht nur eine Immunantwort auf die Antigene hervor, die auf der exogenen DNA aus einer beliebigen Quelle enthalten sein können, sondern führt auch zu replikativer Vermehrung des Virus in dem Wirt unter Auslösung einer erwarteten Immunantwort auf den Avipoxvektor per se.When vaccinating a bird species, such a synthetic recombinant avipox virus not only elicits an immune response to the antigens that may be contained on the exogenous DNA from any source, but also leads to replicative replication of the virus in the host, triggering an expected immune response to the Avipox vector per se.
Verschiedene Forscher haben vorgeschlagen, rekombinante Geflügelpocken speziell zum Gebrauch als Veterinär-Impfstoffe für den Schutz von Geflügelbeständen herzustellen; vgl. Boyle und Coupar, J. Gen. Virol. Bd. 67 (1986), Seiten 1591-1600, und Binns et al., Isr. J. Vet. Med., Bd. 42 (1986), Seiten 124-127. Es sind aber weder Vorschläge noch tatsächliche Berichte zum Gebrauch von rekombinanten Avipoxviren zum Erzeugen einer spezifischen Immunität in Säugetieren bekannt geworden.Various researchers have proposed to produce recombinant poultry pox specifically for use as veterinary vaccines for the protection of poultry populations; see. Boyle and Coupar, J. Gen. Virol. Vol. 67 (1986), pages 1591-1600, and Binns et al., Isr. J. Vet. Med., Vol. 42 (1986), pages 124-127. However, no proposals or actual reports on the use of recombinant avipox viruses to produce specific immunity in mammals are known.
Stickl und Mayr, Fortschr. Med. 97(40) (1979), Seiten 1781-1788 beschreiben die Injektion von Avipox-, insbesondere Geflügelpockenviren in Menschen. Allerdings beziehen sich diese Untersuchungen nur auf den Gebrauch von gewöhnlichen Geflügelpocken, um die nicht-spezifische Immunität in Patienten zu verstärken, die an den Nebenwirkungen von Krebschemotherapie leiden. Keine rekombinanten DNA-Techniken sind dabei angewendet. Es gibt keinen Hinweis über einen Avipoxvirus, in das für Antigene von Vertebratenpathogenen codierende DNA inseriert worden ist, oder über ein Verfahren zur Auslösung spezifischer Immunität in Vertebraten. Statt dessen hängt der Stand der Technik von einem allgemeinen und nicht-spezifischen stimulierenden Effekt auf den menschlichen Wirt ab.Stickl and Mayr, progress. Med. 97 (40) (1979), pages 1781-1788 describe the injection of Avipox, in particular fowlpox, viruses into humans. However, these studies only relate to the use of ordinary poultry pox to increase non-specific immunity in patients suffering from the side effects of cancer chemotherapy. No recombinant DNA techniques are used. There is no evidence of an avipox virus in which DNA coding for antigens of vertebrate pathogens has been inserted, or of a method for inducing specific immunity in vertebrates. Instead, the prior art depends on a general and non-specific stimulating effect on the human host.
Eine vollständigere Diskussion der Grundlagen der genetischen Rekombination hilft zum Verständnis, wie die modifizierten rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind.A more complete discussion of the basics of genetic recombination helps to understand how the modified recombinant viruses of the present invention were made.
Genetische Rekombination ist allgemein der Austausch homologer Abschnitte von Desoxyribo-nucleinsäure (DNA) zwischen zwei Strängen von DNA. (In bestimmten Viren kann Ribonucleinsäu-re (RNA) die DNA ersetzen). Homologe Abschnitte einer Nucleinsäure sind Abschnitte der Nuclein-säure (RNA oder DNA), die dieselbe Seguenz der Nucleotidbasen haben.Genetic recombination is generally the exchange of homologous sections of deoxyribonucleic acid (DNA) between two strands of DNA. (In certain viruses, ribonucleic acid (RNA) can replace DNA). Homologous sections of a nucleic acid are sections of the nucleic acid (RNA or DNA) that have the same sequence of nucleotide bases.
Genetische Rekombination kann natürlicherweise stattfinden während der Replikation oder der 4Genetic recombination can occur naturally during replication or the 4th
AT 408 549 BAT 408 549 B
Erzeugung neuer viraler Genome innerhalb der infizierten Wirtszelle. Daher kann genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus in einer mit zwei oder mehr verschiedenen Viren oder anderen genetischen Konstruktionen coinfizierten Wirtszelle stattfinden. Ein DNA-Abschnitt aus einem ersten Genom wird beim Aufbau des Abschnitts des Genoms eines zweiten, coinfizierenden Virus, in welchem die DNA homolog zu der aus dem ersten viralen Genom ist, ausgetauscht.Generation of new viral genomes within the infected host cell. Therefore, genetic recombination between viral genes can occur during the viral replication cycle in a host cell coinfected with two or more different viruses or other genetic constructions. A section of DNA from a first genome is exchanged during the construction of the section of the genome of a second, coinfecting virus in which the DNA is homologous to that from the first viral genome.
Allerdings kann Rekombination auch zwischen Abschnitten von DNA in verschiedenen, nicht vollkommen homologen Genomen stattfinden. Wenn solch ein Abschnitt aus einem ersten Genom mit einem Abschnitt eines anderen Genoms homolog ist (mit Ausnahme beispielsweise der Anwesenheit eines genetischen Markers oder eines Gens, das für eine antigene, in einen Abschnitt der homologen DNA inserierte Determinante codiert) kann immer Rekombination stattfinden. Die Produkte dieser Rekombination lassen sich dann durch die Anwesenheit jenes genetischen Markers oder Gens nachweisen.However, recombination can also take place between sections of DNA in different, not completely homologous genomes. If such a section from a first genome is homologous to a section of another genome (except, for example, the presence of a genetic marker or a gene coding for an antigenic determinant inserted into a section of the homologous DNA), recombination can always take place. The products of this recombination can then be detected by the presence of that genetic marker or gene.
Erfolgreiche Expression der als DNA eingeführten genetischen Sequenz des modifizierten infektiösen Virus erfordert zwei Bedingungen:Successful expression of the genetic sequence of the modified infectious virus introduced as DNA requires two conditions:
Erstens muß die Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virus stattfinden, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Weder für Geflügelpocken noch für andere Avipoxviren wurden bis jetzt nicht-essentielle Regionen analog zu den für Vacciniavirus beschriebenen, gezeigt. Entsprechend wurden für die vorliegende Erfindung nicht-essentielle Regionen von Geflügelpocken durch Spaltung des Geflügelpocken-Genoms in Fragmente, anschließende Trennung der Fragmente nach Größe und Insertion dieser Fragmente in Plasmidkonstrukte zur Vermehrung aufgefunden. Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die als extrachromosomale Elemente in vielen Bakterien einschließlich E co|i gefunden werden. Verfahren zur Insertion von DNA-Sequen-zen, wie Genen für antigene Determinanten oder andere genetische Marker in Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und im einzelnen beschrieben in Maniatis et al., Molecuiar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). Analog wurde bei der Insertion von genetischen Markern und/oder Antigene codierenden Genen in die clonierten Geflügelpockenfragmente vorgegangen. Die erfolgreich rekombinierten Fragmente (wie durch erfolgreiche Wiedergewinnung des genetischen Markers oder Antigens gezeigt wurde), waren diejenigen, die in eine nicht-essentielle Region des Geflügelpockenvirus inserierte DNA enthielten.First, the insertion into a non-essential region of the virus must take place for the modified virus to remain viable. Neither essential regions similar to those described for vaccinia virus have been shown for poultry pox nor for other avipox viruses. Correspondingly, non-essential regions of fowlpox were found for the present invention by splitting the fowlpox genome into fragments, then separating the fragments according to size and inserting these fragments into plasmid constructs for propagation. Plasmids are small, circular DNA molecules that are found as extrachromosomal elements in many bacteria including E co | i. Methods for inserting DNA sequences such as genes for antigenic determinants or other genetic markers in plasmids are well known to those skilled in the art and are described in detail in Maniatis et al., Molecuiar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). An analogous procedure was used for inserting genetic markers and / or genes coding for antigens into the cloned chickenpox fragments. The successfully recombined fragments (as demonstrated by successful recovery of the genetic marker or antigen) were those that contained DNA inserted into a non-essential region of the chickenpox virus.
Die zweite Bedingung zur Expression inserierter DNA ist die Gegenwart eines Promotors in der korrekten Beziehung zu der inserierten DNA. Der Promotor muß so angeordnet sein, daß er vor der zu exprimierenden DNA-Sequenz liegt. Weil Avipoxviren nicht gut charakterisiert sind und Avipox-Promotoren bislang nicht identifiziert waren, sind bekannte Promotoren von anderen Pockenviren erfolgreich als Teil der vorliegenden Erfindung vor der zu exprimierenden DNA inseriert worden. Geflügelpocken-Promotoren können ebenso erfolgreich benutzt werden, um die Verfahren erfindungsgemäß auszuführen und die Produkte herzustellen. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß mit Geflügelpocken-Promotoren, Vaccina-Promotoren und Entomopox-Promotoren Transkription in rekombinanten Pockenviren gestartet wird.The second condition for expression of inserted DNA is the presence of a promoter in the correct relationship to the inserted DNA. The promoter must be arranged so that it is in front of the DNA sequence to be expressed. Because avipox viruses are not well characterized and avipox promoters have so far not been identified, known promoters of other poxviruses have been successfully inserted as part of the present invention in front of the DNA to be expressed. Fowlpox promoters can also be used successfully to carry out the methods of the invention and to manufacture the products. According to the invention it was found that with poultry pox promoters, vaccina promoters and entomopox promoters, transcription is started in recombinant pox viruses.
Boyle and Coupar, J. gen. Virol., Bd. 67 (1986), Seite 1591, vermuten, daß von Vaccinia-Promotoren "erwartet werden kann, daß sie in (Geflügelpocken)-Virus arbeiten". Die Autoren lokalisierten und clonierten ein Geflügelpocken-TK-Gen (Boyle et al., Virology, Bd. 156 (1987), Seiten 355-365) und inserierten es in Vacciniavirus. Dieses TK-Gen wurde vermutlich wegen der Erkennung der Geflügelpocken-TK-Promotorsequenz durch Vaccinia-Polymerase exprimiert. Trotz ihrer Vermutung inserierten die Autoren allerdings weder einen beliebigen Vaccinia-Promotor in das Geflügelpockenvirus noch beobachteten sie irgendeine Expression einer fremden, in dem Geflü-gelpocken-Genom vorhandenen DNA-Sequenz. Vor der vorliegenden Erfindung war nicht bekannt, daß Promotoren aus anderen Pockenviren, wie z.B. Vaccinia-Promotoren, tatsächlich die Expression eines Gens in einem Avipoxgenom ansteuern.Boyle and Coupar, J. Gen. Virol., Vol. 67 (1986), page 1591, suggest that vaccinia promoters "can be expected to work in (chickenpox) virus". The authors localized and cloned a fowlpox TK gene (Boyle et al., Virology, vol. 156 (1987), pages 355-365) and inserted it into vaccinia virus. This TK gene was presumably expressed because of the recognition of the fowlpox TK promoter sequence by vaccinia polymerase. Despite their presumption, however, the authors did not insert any vaccinia promoter into the fowlpox virus, nor did they observe any expression of a foreign DNA sequence present in the fowlpox genome. Prior to the present invention, it was not known that promoters from other pox viruses, such as e.g. Vaccinia promoters, actually target the expression of a gene in an avipox genome.
Beschreibung bestimmter bevorzugter AusführunasformenDescription of certain preferred embodiments
Erfindungsgemäß wurden besonders Geflügelpocken und Kanarienpockenviren als bevorzugte, mittels Rekombination durch Einbau exogener DNA modifizierte Avipoxarten benutztAccording to the invention, poultry pox and canarypox viruses in particular have been used as preferred avipox species modified by recombination by incorporating exogenous DNA
Geflügelpocken ist eine Art von Avipox, die insbesondere Geflügel, nicht aber Säugetiere 5Chickenpox is a type of Avipox that affects poultry in particular, but not mammals 5
AT 408 549 B infiziert. Der als FP-5 bezeichnete Geflügelpockenstamm ist ein kommerzieller, aus Hühnerembryonen stammender Geflügelpockenvirus-Impfstamm, und von American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.), Madison, Wl, United States Veterinary License No. 165, Serial No. 30321, erhältlich.AT 408 549 B infected. The fowlpox strain, designated FP-5, is a commercial chickenpox virus vaccine strain derived from chicken embryos and available from American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.), Madison, Wl, United States Veterinary License No. 165, serial no. 30321, available.
Der hier als FP-1 bezeichnete Geflügelpockenstamm ist ein Duvette-Stamm, der zum Gebrauch als Impfstoff in Eintagsküken modifiziert ist. Der Stamm ist ein kommerzieller Geflügelpok-ken-lmpfstamm, der als O DCEP 25/CEP67/ 2309 October 1980 bezeichnet und von Institute Merieux, Inc. erhältlich ist.The fowlpox strain, referred to here as FP-1, is a Duvette strain modified for use as a vaccine in day-old chicks. The strain is a commercial poultry pox vaccine strain designated O DCEP 25 / CEP67 / 2309 October 1980 and is available from Institute Merieux, Inc.
Kanarienpockenvirus ist eine andere Art von Avipoxvirus. Analog zu den Geflügelpocken infiziert Kanarienpockenvirus besonders Kanarienvögel, nicht jedoch Säugetiere. Der hier als CP bezeichnete Kanarienpockenstamm ist ein kommerzieller Kanarien-Impfstamm, der als LF2 CEP 524 24 10 75 bezeichnet und von Institute Merieux, Inc. erhältlich ist.Canarypox virus is another type of avipox virus. Similar to the chickenpox, canarypox virus particularly infects canaries, but not mammals. The canarypox strain, referred to herein as CP, is a commercial canary vaccine strain, designated LF2 CEP 524 24 10 75, and is available from Institute Merieux, Inc.
Die in diesen Avipoxviren durch genetische Rekombination eingefügten DNA-Sequenzen schließen erfindungsgemäß folgendes ein: Das lac Z-Gen prokaryotischen Ursprungs; das Toll-wutglykoprotein (G)-Gen, das ein Antigen eines nicht-vogelartigen (spezifisch säugetierartigen) Pathogens codiert; das Truthahn-Influenzahämagglutinin-Gen, das für das Antigen eines von einem Avipoxvirus verschiedenen pathogenen Vogelvirus codiert; das gp51,30-Hüllgen des Rinderleukämievirus, einem Säugetiervirus; das Fusionsprotein-Gen des Newcastle Disease Virus (Texasstamm), einem Vogelvirus; das FeLV-Hüilgen des Katzenleukämievirus, einem Säugetiervirus, das RAV-1 env-Gen des Rous-assoziierten Virus, das eine Vogelvirus/Geflügelkrankheit ist; das Nucleoprotein (NP)-Gen des Hühner/Pennsylvania/1/83 Influenzavirus, einem Vogelvirus; das Matrixgen und Peplomergen des infektiösen Bronchitisvirus (Stamm Mass 41), einem Vogelvirus; und das Glykoprotein D-Gen (gD) des Herpes Simplex Virus, einem Säugetiervirus.According to the invention, the DNA sequences inserted into these avipox viruses by genetic recombination include the following: the lac Z gene of prokaryotic origin; the rabies glycoprotein (G) gene, which encodes an antigen of a non-bird-like (specifically mammalian) pathogen; the turkey influenza hemagglutinin gene encoding the antigen of a pathogenic avian virus other than an avipox virus; the gp51,30 envelope gene of bovine leukemia virus, a mammalian virus; the fusion protein gene of Newcastle Disease Virus (Texas strain), an avian virus; the FeLV gene of feline leukemia virus, a mammalian virus, the RAV-1 env gene of the Rous-associated virus, which is an avian / poultry disease; the chicken / Pennsylvania / 1/83 influenza virus, an avian virus nucleoprotein (NP) gene; the matrix gene and peplomer gene of the infectious bronchitis virus (strain Mass 41), an avian virus; and the glycoprotein D gene (gD) of the herpes simplex virus, a mammalian virus.
Die Isolierung des lac Z-Gens ist beschrieben von Casadaban et al., Methods in Enzymology, Bd. 100 (1983), Seiten 293-308. Die Struktur des Tollwut G-Gens ist z.B. von Anilionis et al., Nature, Bd. 294 (1981), Seiten 275-278 beschrieben. Sein Einbau in Vaccinia und Expression in diesen Vektor werden von Kieny et al., Nature, Bd. 312 (1984), Seiten 163-166 diskutiert. Das Truthahn-Influenzahämagglutinin-Gen ist beschrieben von Kawaoka et al., Virology, Bd. 158 (1987), Seiten 218-227. Das Rinderleukämievirus gp51,30 env-Gen wurde beschrieben von Rice et al., Virology, Bd. 138 (1984), Seiten 82-93. Das Fusionsgen von Newcastle Disease Virus (Texasstamm) ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc., als Plasmid pNDV 108. Das Katzenleukämievirus env-Gen wurde von Guiihot et al., Virology, Bd. 161 (1987), Seiten 252-258 beschrieben. Das Rous-assoziierte Virus Typ 1 ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc., als zwei Clone penVRVIPT und mp19env (190). Hühnerinfluenza NP-Gen ist erhältlich von Yoshihira Kawaoka vom St. Jude Children's Research Hospital als Plasmid pNP 33. Ein infektiöser Bronchitisvirus cDNA Clon des IBV Mass 41-Matrix-Gens und Peplomergens ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc. als Plasmid plBVM63. Das Herpes Simplex Virus gD-Gen ist beschrieben von Watson et al., Science, Bd. 218 (1982), Seiten 381-384.The isolation of the lac Z gene is described by Casadaban et al., Methods in Enzymology, Vol. 100 (1983), pages 293-308. The structure of the rabies G gene is e.g. by Anilionis et al., Nature, Vol. 294 (1981), pages 275-278. Its incorporation into vaccinia and expression in this vector are discussed by Kieny et al., Nature, Vol. 312 (1984), pages 163-166. The turkey influenza hemagglutinin gene is described by Kawaoka et al., Virology, Vol. 158 (1987), pages 218-227. The bovine leukemia virus gp51.30 env gene has been described by Rice et al., Virology, vol. 138 (1984), pages 82-93. The Newcastle Disease Virus (Texas strain) fusion gene is available from Institute Merieux, Inc., as plasmid pNDV 108. The feline leukemia virus env gene was described by Guiihot et al., Virology, Vol. 161 (1987), pp. 252-258. The Rous-associated virus type 1 is available from the Institute Merieux, Inc., as two clones penVRVIPT and mp19env (190). Chicken influenza NP gene is available from Yoshihira Kawaoka of St. Jude Children's Research Hospital as plasmid pNP 33. An infectious bronchitis virus cDNA clone of the IBV Mass 41 matrix gene and peplomer gene is available from the Institute Merieux, Inc. as plasmid plBVM63. The herpes simplex virus gD gene is described by Watson et al., Science, Vol. 218 (1982), pages 381-384.
Die rekombinanten Avipoxviren, die nachstehend näher beschrieben werden, schließen einen von drei Vacciniapromotoren ein. Der Pi-Promotor aus dem Ava I H-Abschnitt von Vaccinia ist beschrieben von Wachsman et al., J. of Inf. Dis., Bd. 155 (1987), Seiten 1188-1197. Insbesondere ist dieser Promotor aus dem Ava I H(Xho I G)-Fragment aus dem L-varianten WR Vacciniastamm abgeleitet, in dem der Promotor die Transkription von rechts nach links steuert. Die Kartenposition des Promotors ist etwa 1,3 Kbp (Kilobasenpaare) vom linken Ende von Ava l H, etwa 12,5 Kbp vom linken Ende des Vacciniagenoms und etwa 8,5 Kbp links von der Hind III C/N Verbindungsstelle. Der Promotor hat folgende Sequenz: (GGATCCC)-ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-AGT AGGGT ACTCGT GATTAATTTTATTGTTAAACTTG-(AATTC), wobei die Symbole in Klammern Linkersequenzen sind.The recombinant avipox viruses described below include one of three vaccinia promoters. The Pi promoter from the Ava I H section of Vaccinia is described by Wachsman et al., J. of Inf. Dis., Vol. 155 (1987), pages 1188-1197. In particular, this promoter is derived from the Ava I H (Xho I G) fragment from the L-variant WR vaccinia strain, in which the promoter controls the transcription from right to left. The promoter card position is approximately 1.3 Kbp (kilobase pairs) from the left end of Ava l H, approximately 12.5 Kbp from the left end of the vaccinia genome, and approximately 8.5 Kbp to the left of the Hind III C / N junction. The promoter has the following sequence: (GGATCCC) -ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-AGT AGGGT ACTCGT GATTAATTTTATTGTTAAACTTG- (AATTC), with the symbols in brackets being linker sequences.
Der Hind III H-Promotor (auch ΉΗ" und Ή6”) wurde durch Standardtranskriptions-Kartierungs-techniken festgelegt. Er hat die Sequenz:The Hind III H promoter (also ΉΗ " and Ή6 ") was determined by standard transcription mapping techniques. He has the sequence:
ATTCTTTATT CT AT ACTTAAAAAATG AAAA TAAATAC AAAG GTT CTTGAGGGTT GTGTTAAATT G AAAGCGAGAAATAATCATA-AATT 6ATTCTTTATT CT AT ACTTAAAAAATG AAAA TAAATAC AAAG GTT CTTGAGGGTT GTGTTAAATT G AAAGCGAGAAATAATCATA-AATT 6
AT 408 549 BAT 408 549 B
ATTTCATTATCGCGATATCCGT TAAGTTTGTATCGTAATG.ATTTCATTATCGCGATATCCGT TAAGTTTGTATCGTAATG.
Die Sequenz ist identisch mit der, die als 5-seitig des offenen Leserahmens H6 von Rosel et al., J. Virol., Bd. 60 (1986), Seiten 436-449, beschrieben ist.The sequence is identical to that described as 5-sided of the open reading frame H6 by Rosel et al., J. Virol., Vol. 60 (1986), pages 436-449.
Der 11 K-Promotor ist von Wittek, J. Virol., Bd. 49 (1984), Seiten 371-378 und C. Bertholet et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985), Seiten 2096-2100, beschrieben.The 11 K promoter is described by Wittek, J. Virol., Vol. 49 (1984), pages 371-378 and C. Bertholet et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 82 (1985), pages 2096-2100.
Die rekombinanten Avipoxviren der Erfindung werden in an sich bekannter Weise in zwei Schritten zusammengebaut und analog zu jenen, die in dem vorstehend erwähnten US-Patent 4,603,112 zur Herstellung synthetischer Rekombinanten von Vacciniavirus beschrieben sind.The recombinant avipox viruses of the invention are assembled in a manner known per se in two steps and analogous to those described in the above-mentioned US Pat. No. 4,603,112 for the production of synthetic recombinants of vaccinia virus.
Zuerst wird die in das Virus zu inserierende DNA in ein E coji Plasmid eingebaut, in das zu einem Abschnitt von nicht-essentieller DNA des Avipoxvirus homologe DNA eingebaut wurde. Getrennt davon ist die zu inserierende DNA-Gensequenz mit einem Promotor ligiert worden. Die Promotor-Gen-Verbindung wird danach in die Plasmidkonstruktion eingefügt, so daß die Promotor-Gen-Verbindung auf beiden Seiten von DNA flankiert ist, die homolog zu einem nicht-essentiellen Abschnitt von Avipox-DNA ist. Die daraus hervorgehende Plasmidkonstruktion wird danach durch Wachstum in E. coji Bakterien vermehrt. (Plasmid-DNA wird benutzt, um exogenes genetisches Material zu tragen und zu vermehren; Diese Methodik ist bekannt. Beispielsweise sind diese Plasmidtechniken beschrieben von Clewell, J. Bacteriol., Bd. 110 (1972), Seiten 667-676. Die Techniken der Isolierung von amplifiziertem Plasmid aus dem E coli-Wirt sind ebenfalls bekannt und beispielsweise von Clewell et al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 62 (1969), Seiten 1159-1166) beschrieben).First, the DNA to be inserted into the virus is inserted into an E coji plasmid in which DNA homologous to a section of non-essential DNA of the avipox virus has been inserted. Separately, the DNA gene sequence to be inserted has been ligated to a promoter. The promoter-gene compound is then inserted into the plasmid construction so that the promoter-gene compound is flanked on both sides by DNA that is homologous to a non-essential portion of Avipox DNA. The resulting plasmid construction is then multiplied by growth in E. coji bacteria. (Plasmid DNA is used to carry and propagate exogenous genetic material. This methodology is well known. For example, these plasmid techniques are described by Clewell, J. Bacteriol., Vol. 110 (1972), pages 667-676. The techniques of Isolation of amplified plasmid from the E coli host is also known and is described, for example, by Clewell et al., In Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 62 (1969), pages 1159-1166)).
Das nach dem Wachstum in E coji isolierte amplifizierte Plasmidmaterial wird nun für den zweiten Schritt benutzt. Dazu wird das die zu inserierende DNA-Gensequenz enthaltende Plasmid in eine Zellkultur (z.B. Hühnerembryofibroblasten) zusammen mit dem Avipoxvirus (wie z.B. Geflügelpockenstamm FP-1 oder FP-5) transfiziert. Rekombination zwischen homologer Geflügel-pocken-DNA in dem Plasmid und dem viralen Genom führen zu einem Avipoxvirus, das durch die Gegenwart von Nicht-Geflügelpocken DNA-Sequenzen in einem nicht-essentiellen Abschnitt seines Genoms modifiziert ist.The amplified plasmid material isolated after growth in E coji is now used for the second step. For this purpose, the plasmid containing the DNA gene sequence to be inserted is transfected into a cell culture (e.g. chicken embryo fibroblasts) together with the avipox virus (such as e.g. avian pox strain FP-1 or FP-5). Recombination between homologous fowlpox DNA in the plasmid and the viral genome results in an avipox virus that is modified by the presence of non-fowlpox DNA sequences in a non-essential portion of its genome.
Ein besseres Verständnis der Erfindung und ihrer zahlreichen Vorteile wird man aus den folgenden Beispielen haben, die zur Veranschaulichung gegeben werden.A better understanding of the invention and its numerous advantages will be had from the following examples, which are given by way of illustration.
Beispiel 1example 1
Transiente Expressionsversuche zeigen die Erkennung von Vaccinia-Promotoren duch Geflü- aelpocken RNA-TranskriptionsfaktorenTransient expression experiments show the recognition of vaccinia promoters by poultry pox RNA transcription factors
Eine Anzahl von Plasmidkonstruktionen wurde hergestellt, die die codierende Sequenz für Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (HBSAg) verbunden mit Vacciniavirus-Promotorensequenzen enthielten. Mit Fünfzig μg jedes Plasmids wurden CEF-Zellen (Hühnerembryofibroblasten) transfiziert, die mit 10 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) Geflügelpockenvirus oder Vacciniavirus pro Zelle infiziert waren. Man ließ die Infektion 24 Stunden weiter laufen und lysierte dann die Zellen durch drei nachfolgende Zyklen von Einfrieren und Auftauen.A number of plasmid constructions were constructed that contained the coding sequence for hepatitis B virus surface antigen (HBSAg) linked to vaccinia virus promoter sequences. CEF (chicken embryofibroblast) cells infected with 10 plaque-forming units (pfu) of fowlpox virus or vaccinia virus per cell were transfected with fifty µg of each plasmid. The infection was allowed to continue for 24 hours and then the cells were lysed through three subsequent cycles of freezing and thawing.
Die Menge von HBSAg in dem Lysat wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen AUSRIAII - ß5J Kit von Abbott Laboratories, Diagnostic Division, abgeschätzt. Die Gegenwart oder Abwesenheit von HBSAg ist als Verhältnis der Nettowerte (Probe minus Hintergrund) der unbekannten Probe zu dem negativen, vom Hersteller vorbestimmten Ausschlußwert ausgedrückt. Das fuhrt zu einem P/N (Positiv/Negativ)-Verhältnis. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.The amount of HBSAg in the lysate was estimated using a commercially available AUSRIAII-β5J kit from Abbott Laboratories, Diagnostic Division. The presence or absence of HBSAg is expressed as the ratio of the net values (sample minus background) of the unknown sample to the negative exclusion value predetermined by the manufacturer. This leads to a P / N (positive / negative) ratio. The results are summarized in Table I.
Es wurden drei verschiedene Vaccinia-Promotorsequenzen benutzt; Der früh in der Vacciniain-fektion vor der DNA-Replikation erkannte Pi-Promotor; der 11 K-Promotor, der spät in der Vaccinia-infektion nach dem Einsetzen der DNA-Replikation erkannt wird; und der Hind III H (HH)-Promotor, der sowohl früh wie spät in der Vacciniainfektion erkannt wird. Diese Promotoren sind vorstehend beschrieben.Three different vaccinia promoter sequences were used; The pi promoter recognized early in the vacciniain infection before DNA replication; the 11 K promoter recognized late in vaccinia infection after the onset of DNA replication; and the Hind III H (HH) promoter, which is recognized both early and late in vaccinia infection. These promoters are described above.
Die Daten zeigen, daß das in den Lysaten von infizierten Zellen produzierte HBSAg das Ergebnis der Erkennung von Vaccinia-Promotoren entweder durch Geflügelpocken- oder Vaccinia-Transkriptionsfaktoren ist. 7The data show that the HBSAg produced in the lysates from infected cells is the result of recognition of vaccinia promoters by either fowlpox or vaccinia transcription factors. 7
AT 408 549 BAT 408 549 B
Tabelle ITable I
Plasmid Virus pMP 131piR2 Geflügelpocken Vaccinia PMPK22.13S Geflügelpocken Vaccinia pPDK 22.5 Geflügelpocken Vaccinia pRW 668 Geflügelpocken Vaccinia kein Plasmid kein Plasmid Geflügelpocken Vaccinia PMPK22.13S (kein Virus) P/N-Ver-Plasmid Virus pMP 131piR2 Chickenpox Vaccinia PMPK22.13S Chickenpox Vaccinia pPDK 22.5 Chickenpox Vaccinia pRW 668 Chickenpox Vaccinia no plasmid No plasmid Chickenpox Vaccinia PMPK22.13S (no virus) P / N-Ver
Beschreibuna hältnis SAg mit Pi-Promotor 1,8 verbunden 9,1 SAg mit 11 K-Promotor 14 verbunden 2 SAg mit 11 K-Promotor 92,6 verbunden 5,6 SAg mit HH-Promotor 77 verbunden 51,4 1,1 1.3 1.3Description ratio SAg connected to Pi promoter 1.8 9.1 SAg connected to 11 K promoter 14 2 SAg connected to 11 K promoter 92.6 5.6 SAg connected to HH promoter 77 51.4 1.1 1.3 1.3
Beispiel 2Example 2
Konstruktion eines das lac Z-Gen enthaltenden rekombinanten Geflüaelpockenvirus vFP-1Construction of a recombinant poultry pox virus vFP-1 containing the lac Z gene
Ein Fragment in einem nicht-essentiellen Abschnitt des Geflügelpockenvirus wurde wie folgt lokalisiert und isoliert.A fragment in a non-essential portion of the poxpox virus was located and isolated as follows.
Mit Nuclease Bai 31 wurde die einzelsträngige endständige Haarnadelstruktur von FP-5-DNA entfernt. Das Klenow (große) Fragment der DNA-Polymerase I wurde zur Bildung glatter Enden verwendet. Nach Entfernung der Haarnadelstruktur wurden Fragmente hergestellt durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease Bgl II. Dieser Verdau führt zu einer Reihe von FP-5-Fragmenten, die durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt wurden.The single-stranded terminal hairpin structure of FP-5-DNA was removed with Nuclease Bai 31. The Klenow (large) fragment of DNA polymerase I was used to form blunt ends. After removal of the hairpin structure, fragments were prepared by digestion with the restriction endonuclease Bgl II. This digestion leads to a series of FP-5 fragments, which were separated by agarose gel electrophoresis.
Ein stumpfendig 8.8 Kbp Bglll-Fragment wurde isoliert und mit dem kommerziell erhältlichen Plasmid pUC 9 ligiert, das mit Barn Hl und Sma I gespalten worden war. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde pRW 698 genannt.A blunt-ended 8.8 Kbp BglII fragment was isolated and ligated with the commercially available plasmid pUC 9, which had been digested with Barn HI and Sma I. The resulting plasmid was named pRW 698.
Um die Größe des Geflügelpockenfragments zu verringern, wurde dieses Plasmid mit Hind III gespalten, wobei zwei weitere Fragmente erzeugt wurden. Ein 6.7 Kbp-Fragment wurde verworfen und das übrig bleibende 4.7 Kbp-Fragment wurde mit sich selbst ligiert, so daß sich ein neues, als pRW 699 bezeichnetes Plasmid, ergab.To reduce the size of the fowlpox fragment, this plasmid was digested with Hind III, generating two more fragments. A 6.7 Kbp fragment was discarded and the remaining 4.7 Kbp fragment was ligated to itself to give a new plasmid, called pRW 699.
Um ein am 11 K-Promotor gestartetes lac Z-Gen in dieses Plasmid einzubauen, wurde pRW 699 mit Eco RV gespalten, das das Plasmid nur an einer Stelle spaltet. Das lac Z-Fragment unter der Kontrolle des 11 K-Promotors wurde danach als stumpf endiges Pst I-Bam Hl-Fragment inseriert und ergab ein neues Plasmid, das pRW 702 genannt wurde. Der lac Z-Clon stammt von pMC 1871, wie beschrieben von Casadaban et al., a.a.O.. Der 11 K-Promotor wurde an das achte Codon des lac Z-Gens mittels eines Barn Hl-Linkers ligiert.In order to incorporate a lac Z gene started at the 11 K promoter into this plasmid, pRW 699 was cleaved with Eco RV, which cleaves the plasmid only at one point. The lac Z fragment under the control of the 11 K promoter was then inserted as a blunt-ended Pst I-Bam HI fragment and resulted in a new plasmid called pRW 702. The lac Z clone is from pMC 1871, as described by Casadaban et al., Op. Cit. The 11 K promoter was ligated to the eighth codon of the lac Z gene using a Barn HI linker.
Mit Rekombinationstechniken, wie denjenigen, die für Vaccinia in der US-A-4,603,112 beschrieben sind, wurde das Plasmid pRW 702 mit dem Geflügelpockenvirus FP-5 rekombiniert, das auf CEF wuchs, wobei die folgenden Verfahren benutzt wurden um vFP-1 herzustellen. 50 pg pRW 702 DNA wurde in einem Endvolumen von 100 μ! mit 0,5 pg von Gesamtgenom-Geflügelpocken-DNA gemischt. Dazu wurden gefügt: 10 μΙ 2,5 molar CaC^ und 110 μ! 2 x HEBS-Puffer (pH 7), der hergestellt wurde ausUsing recombination techniques, such as those described for vaccinia in US-A-4,603,112, the plasmid pRW 702 was recombined with the fowlpox virus FP-5, which grew on CEF, using the following methods to produce vFP-1. 50 pg pRW 702 DNA was in a final volume of 100 μ! mixed with 0.5 pg of whole genome fowlpox DNA. The following were added: 10 μΙ 2.5 molar CaC ^ and 110 μ! 2 x HEBS buffer (pH 7), which was made from
40 mMol Hepes 300 mMol NaCI 1,4 mMol Na2HP04 10 mMol KCl 840 mmol Hepes 300 mmol NaCI 1.4 mmol Na2HP04 10 mmol KCl 8
AT 408 549 B 12 mMol Dextrose.AT 408 549 B 12 mmol dextrose.
Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 200 μΙ einer Geflügelpockenvirussuspension (verdünnt auf 5 pfu/Zelle) hinzugefügt und die Mischung auf 60 mm-Schalen, die einen primären CEF Monolayer enthielten, geimpft. Außerdem wurden 0,7 ml Eagles-Medium, das 2 % fötales Kälberserum (FBS) enthielt, zur gleichen Zeit hinzugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C bebrütet, danach wurden weitere 3 ml Eagles-Medium mit 2 % FBS zugesetzt und die Platten 3 Tage lang bebrütet. Die Zellen wurden lysiert durch drei folgende Zyklen von Einfrieren und Auftauen; die Virusnachkommenschaft wurde danach auf die Anwesenheit von Rekombinanten untersucht.After 30 minutes at room temperature, 200 μl of a poultrypox virus suspension (diluted to 5 pfu / cell) were added and the mixture was inoculated onto 60 mm dishes which contained a primary CEF monolayer. In addition, 0.7 ml of Eagles medium containing 2% fetal calf serum (FBS) was added at the same time. The plates were incubated for 2 hours at 37 ° C, then a further 3 ml of Eagles medium with 2% FBS was added and the plates were incubated for 3 days. The cells were lysed by three subsequent cycles of freezing and thawing; the virus progeny was then examined for the presence of recombinants.
Ein Nachweis einer erfolgreichen Einfügung des 11 K-Promotor-Iac Z-Gens durch Rekombination in das Genom von Geflügelpocken FP-5 wurde dadurch geführt, daß auf Expression des lac Z-Gens getestet wurde. Das lac Z-Gen codiert das Enzym ß-Galactosidase, das das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosidase (X-gal) spaltet und dabei ein blaues Indolyl-derivat freisetzt. Blaue Plaques wurden als positive Rekombinanten ausgewählt.Evidence of successful insertion of the 11 K promoter Iac Z gene by recombination into the genome of fowlpox FP-5 was made by testing for expression of the lac Z gene. The lac Z gene encodes the enzyme β-galactosidase, which cleaves the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase (X-gal) and thereby releases a blue indolyl derivative. Blue plaques were selected as positive recombinants.
Außerdem wurde die erfolgreiche Einführung von lac Z in das Genom von Geflügelpocken FP-5 und seine Expression bestätigt durch Immunpräzipitation des ß-Galactosidaseproteins mittels kommerziell verfügbarer Antiseren und Standardverfahren, die vFP-1 infizierte CEF, BSC (Affen-nierenzellinie - ATCC CCL26), VERO (Affennierenzellinie - ATCC CCL81) und MRC-5 (diploide menschliche Lungenzellinie-ATCC CCL171) benutzen.In addition, the successful introduction of lac Z into the genome of fowlpox FP-5 and its expression was confirmed by immunoprecipitation of the β-galactosidase protein by means of commercially available antisera and standard methods which infected CEF, BSF (monkey kidney cell line - ATCC CCL26), vFP-1, Use VERO (monkey kidney cell line - ATCC CCL81) and MRC-5 (diploid human lung cell line - ATCC CCL171).
Weiter wurde die Expression der ß-Galactosidase durch das rekombinante Virus vFP-1 ]n vivo bestätigt. Dazu wurden Kaninchen und Mäuse mit dem Virus geimpft. Der Anstieg in den Titern der gegen das ß-Galactosidaseprotein gerichteten Antikörper in dem Serum der geimpften Tiere wurde gemessen.The expression of the β-galactosidase by the recombinant virus vFP-1] was confirmed in vivo. Rabbits and mice were vaccinated with the virus. The increase in the titers of the antibodies directed against the β-galactosidase protein in the serum of the vaccinated animals was measured.
Insbesondere wurde das rekombinante vFP-1 von Wirtszellverunreinigungen gereinigt und intradermal an zwei Stellen auf jeder Seite von zwei Kaninchen eingeimpft. Jedes Kaninchen erhielt insgesamt 10® pfu.In particular, the recombinant vFP-1 was cleaned of host cell contaminants and inoculated intradermally at two sites on each side by two rabbits. Each rabbit received a total of 10® pfu.
Den Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen. Die Seren wurden für einen ELISA-Test benutzt, der eine kommerziell erhältliche Präparation von gereinigter ß-Galactosidase als Antigenquelle benutzt.Blood was drawn from the animals at weekly intervals. The sera were used for an ELISA test using a commercially available preparation of purified β-galactosidase as the source of the antigen.
Sowohl die mit dem rekombinanten vFP-1 geimpften Kaninchen als auch die Mäuse zeigten eine im ELISA-Test nachweisbare Immunantwort auf das ß-Galactosidaseprotein. In beiden Arten war die Antwort eine Woche nach der Impfung feststellbar.Both the rabbits vaccinated with the recombinant vFP-1 and the mice showed an immune response to the β-galactosidase protein which was detectable in the ELISA test. In both types, the response was found one week after vaccination.
Beispiel 3Example 3
Konstruktion des Tollwut G-Gen und lac Z enthaltenden rekombinanten Virus vFP-2 aus Geflü- aelpockenvirus FP-5Construction of the rabies G gene and lac Z-containing recombinant virus vFP-2 from poultry pox virus FP-5
Ein 0,9 Kbp Pvu Il-Fragment wurde aus FP-5 erhalten und mittels Standardverfahren zwischen die beiden Pvu Il-Stellen in pUC 9 eingefügt. Die daraus hervorgehende Konstruktion, als pRW 688.2 bezeichnet, besitzt asymmetrisch in dem Pvu Il-Fragment zwei etwa 30 bp voneinander entfernte Hinc Il-Stellen und bildet daher einen langen und einen kurzen Arm des Fragments.A 0.9 Kbp Pvu II fragment was obtained from FP-5 and inserted between the two Pvu II sites in pUC 9 using standard methods. The resulting construction, designated pRW 688.2, has two Hinc Il sites approximately 30 bp apart asymmetrically in the Pvu II fragment and therefore forms a long and a short arm of the fragment.
Unter Benutzung bekannter Techniken wurden zwischen diese Hinc Il-Stellen Oligonucleotid-adaptoren eingesetzt, um Pst I- und Bam Hl-Stellen einzuführen und auf diese Weise das Plasmid pRW 694 herzustellen.Using known techniques, oligonucleotide adapters were inserted between these Hinc II sites to introduce Pst I and Bam HI sites to produce plasmid pRW 694.
Dieses Plasmid wurde nun mit Pst I und Bam Hl gespalten und das mit dem vorstehend beschriebenen 11K Vacciniapromotor verbundene lac Z-Gen eingefügt. Man erhielt das neue Plasmid pRW 700.This plasmid was now digested with Pst I and Bam HI and the lac Z gene linked to the 11K vaccinia promoter described above was inserted. The new plasmid pRW 700 was obtained.
Zur Herstellung eines vom Pi-Promotor gesteuerten Tollwut G-Gens wurde die Bgl Il-Stelle, die 5'-proximal zum Tollwutgen liegt (vgl. Kieny et al„ a.a.O.), an den Enden glatt gemacht und an die aufgefüllte Eco Rl-Stelle des vorstehend beschriebenen Pi-Promotors ligiert.In order to produce a rabies G gene controlled by the Pi promoter, the Bgl II site, which is 5 'proximal to the rabies gene (cf. Kieny et al. Loc. Cit.), Was smoothed at the ends and at the filled-in Eco R1 site of the Pi promoter described above.
Diese Konstruktion wurde in die Pst I-Stelle von pRW 700 eingefügt und ergab das Plasmid pRW 735.1, das damit die fremde Gensequenz Pi-Tollwut G-11K-lac Z enthält. Dieses Insert ist so innerhalb des Plasmids angeordnet, daß der lange Pvu Il-Hinc Il-Arm der FP-5 Donorsequenz auf der 3'-Seite des lac Z-Gens liegt. 9This construction was inserted into the Pst I site of pRW 700 and resulted in the plasmid pRW 735.1, which thus contains the foreign gene sequence pi-rabies G-11K-lac Z. This insert is arranged within the plasmid so that the long Pvu Il-Hinc Il arm of the FP-5 donor sequence is on the 3 'side of the lac Z gene. 9
AT 408 549 BAT 408 549 B
Die so erzeugte fertige Konstruktion wurde mit Geflügelpockenvirus FP-5 durch Infektion/ Transfektion von Hühnerembryofibroblasten (durch Verfahren wie vorstehend beschrieben) rekom-biniert. Man erhielt das rekombinante Geflügelpockenvirus vFP-2. Dieses rekombinante Virus wurde nach Anfärbung mit X-gal ausgewählt.The final construction so created was recombined with fowlpox virus FP-5 by infection / transfection of chicken embryo fibroblasts (by methods as described above). The recombinant fowlpox virus vFP-2 was obtained. This recombinant virus was selected after staining with X-gal.
Die korrekte Insertion und Expression sowohl des lac Z-Marker-Gens wie des Tollwut G-Gens wurde mit einer Anzahl zusätzlicher, nachstehend beschriebener Verfahren, überprüft.The correct insertion and expression of both the lac Z marker gene and the rabies G gene was checked using a number of additional methods described below.
Ein Immunfluoreszenznachweis des Tollwutantigens durch spezifische Antikörper zeigte erfolgreich die Expression des Tollwutantigens auf der Oberfläche von vogelartigen und nicht-vogel-artigen, mit vFP-2 Virus infizierten Zellen an.Immunofluorescence detection of the rabies antigen by specific antibodies successfully indicated the expression of the rabies antigen on the surface of bird-like and non-bird-like cells infected with vFP-2 virus.
Wie zuvor wurde die Expression des Toiiwutantigens und der ß-Galactosidase durch vogelartige und nicht-vogelartige, mit vFP-2 Virus infizierte Zellen durch das Immunpräzipitationsverfahren bestätigt.As before, the expression of antioxidant and ß-galactosidase by bird-like and non-bird-like cells infected with vFP-2 virus was confirmed by the immunoprecipitation method.
Ein weiterer Nachweis, daß die Ausführungsform vFP-2 dieser Erfindung ein erfolgreiches re-kombinantes Virus ist, das die Gene für Tollwut G und ß-Galactosidase trägt, wurde durch Impfung von zwei Kaninchen mit vFP-2 Virus erreicht. Beide Kaninchen wurden intradermal mit 1x10® pfu vFP-2 pro Kaninchen beimpft. Beide Kaninchen entwickelten typische Pockenläsionen. Den Kaninchen wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen; die Seren wurden durch ELISA getestet, um die Anwesenheit der für das Tollwutglykoprotein und das ß-Galactosidaseprotein spezifischen Antikörper nachzuweisen.Further evidence that the vFP-2 embodiment of this invention is a successful recombinant virus carrying the rabies G and β-galactosidase genes was achieved by vaccinating two rabbits with vFP-2 virus. Both rabbits were inoculated intradermally with 1x10® pfu vFP-2 per rabbit. Both rabbits developed typical pox lesions. Blood was drawn from the rabbits at weekly intervals; the sera were tested by ELISA to detect the presence of antibodies specific for rabies glycoprotein and β-galactosidase protein.
Wie nachstehend in Tabelle II dargestellt, zeigte Kaninchen 205 nachweisbare Mengen von anti-ß-Galactosidase-Antikörper im ELISA-Test 1 Woche nach der Impfung. Diese Menge stieg nach 2 Wochen auf einen Titer von 1 in 4000, der 5 Wochen lang nach der Impfung aufrechterhalten wurde. Benutzte man einen Antigencapture ELISA-Test, zeigten Seren aus Kaninchen 205 nachweisbare Mengen von anti-Tollwut-Antikörpern zwischen 3 und 10 Wochen nach der Impfung.As shown in Table II below, rabbits showed 205 detectable levels of anti-ß-galactosidase antibody in the ELISA test 1 week after vaccination. This amount increased after 2 weeks to a titer of 1 in 4000, which was maintained for 5 weeks after vaccination. Using an antigen capture ELISA test, rabbit sera showed 205 detectable levels of anti-rabies antibodies between 3 and 10 weeks after vaccination.
Tabelle IITable II
Antikörperproduktion durch Kaninchen 205 gegen Tollwutantioen und ß-Galactosidase-ProteinAntibody production by rabbit 205 against rabies antioxidants and ß-galactosidase protein
Zeit Vorbluten anti ß-Galactosidase Antikörpertiter (Kehrwert der Serumverdünnung) 0 Woche 1 500 Wochen 2-5 Qede) 4000 Woche 6 500 Woche 9 250 Vorbluten anti-Tollwut 0 Woche 3 200 Woche 6 200 Woche 10 100Time pre-bleeding anti ß-galactosidase antibody titer (reciprocal of serum dilution) 0 week 1 500 weeks 2-5 Qede) 4000 week 6 500 week 9 250 pre-bleeding anti rabies 0 week 3 200 week 6 200 week 10 100
Beispiel 4AExample 4A
Konstruktion eines rekombinanten Virus vFP-3 mit einem Tollwut G-Gen unter Promotorkontrolle aus Geflüaeloockenvirus FP-1Construction of a recombinant virus vFP-3 with a rabies G gene under promoter control from poultry cam virus FP-1
Diese Ausführungsform zeigt, daß das Tollwut G-Gen vollständig auch durch andere Stämme von Geflügelpocken als FP-5, insbesondere durch einen anderen, als FP-1 bezeichneten Stamm von Geflügelpockenvirus exprimiert wird.This embodiment shows that the rabies G gene is also completely expressed by strains of fowlpox other than FP-5, in particular by another strain of fowlpox virus called FP-1.
Wie in Beispiel 3 wurde ein 0,9 Kbp Pvu Il-Fragment aus FP-1 unter der Annahme erhalten, daß, wie in FP-5, das Fragment einen nicht-essentiellen Abschnitt enthalten würde.As in Example 3, a 0.9 Kbp Pvu II fragment was obtained from FP-1, assuming that, as in FP-5, the fragment would contain a non-essential portion.
Dieses Fragment wurde zwischen die beiden Pvu Jl-Stellen von pUC 9 eingefügt und das Plasmid mit der Bezeichnung pRW 731.15R erzeugt.This fragment was inserted between the two Pvu JI sites of pUC 9 and the plasmid named pRW 731.15R was generated.
Dieses Plasmid besitzt asymmetrisch innerhalb des Pvu Il-Fragments zwei etwa 30 bp vonein 10This plasmid has two about 30 bp of a 10 asymmetrically within the Pvu II fragment
AT 408 549 B ander entfernte Hinc Il-Stellen und bildet so einen langen und einen kurzen Arm dieses Fragments.AT 408 549 B removed Hinc Il sites, forming a long and a short arm of this fragment.
Ein kommerziell erhältlicher Pst I-Linker (5') - CCTGCAGG - (3') wurde zwischen die beiden Hinc Il-Stellen eingefügt und ergab das Plasmid pRW 741.A commercially available Pst I linker (5 ') - CCTGCAGG - (3') was inserted between the two Hinc II sites and gave the plasmid pRW 741.
Ein von dem Promotor HH abhängiges Tollwut G-Gen wurde in dieses Plasmid in die Pst I-Stelle eingefügt und erzeugte das neue Plasmid pRW 742B. Durch Rekombination dieses Plasmids mit FP-1 nach Infektion/Transfektion von CEF-Zellen wurde das Virus vFP-3 erhalten.A rabies G gene dependent on the HH promoter was inserted into this plasmid at the Pst I site and generated the new plasmid pRW 742B. The virus vFP-3 was obtained by recombination of this plasmid with FP-1 after infection / transfection of CEF cells.
Das ATG Translationsstartcodon des von dem HH-Promotor gesteuerten offenen Leserahmens wurde dem Startcodon des Tollwut G-Gens überlagert, indem ein die Eco RV-Stelle in dem HH-Promotor und die Hind Ill-Stelle in dem Tollwut G-Gen überlagerndes synthetisches Oligonu-cleotid benutzt wurde. Das 5'-Ende dieses Tollwutgens unter dem HH-Promotor wurde in an sich bekannter Weise so modifiziert, daß es eine Pst I-Stelle enthielt. Die Konstruktion wurde danach mit der Pst I-Stelle von pRW 741 ligiert und ergab pRW 742B. Die Orientierung der Konstruktion in dem Plasmid ist die gleiche wie in dem vorher in Beispiel 3 diskutierten pRW 735.1.The ATG translation start codon of the open reading frame controlled by the HH promoter was superimposed on the start codon of the rabies G gene by a synthetic oligonucleotide overlaying the Eco RV site in the HH promoter and the Hind III site in the rabies G gene. cleotide was used. The 5 'end of this rabies gene under the HH promoter was modified in a manner known per se so that it contained a Pst I site. The construction was then ligated to the Pst I site of pRW 741 to give pRW 742B. The orientation of the construction in the plasmid is the same as in pRW 735.1 previously discussed in Example 3.
Die Rekombination wurde gemäß Beispiel 2 ausgeführt. Die daraus hervorgehende Rekombi-nante wurde vFP-3 genannt.The recombination was carried out according to Example 2. The resulting recombination was named vFP-3.
Die Expression von Tollwutantigen sowohl in vogelartigen wie in nicht-vogelartigen, mit vFP-3 Virus infizierten Zellen wurde durch Immunpräzipitation und Immunfluoreszenztechniken (wie weiter oben beschrieben) bestätigt.The expression of rabies antigen in both avian and non-avian cells infected with vFP-3 virus was confirmed by immunoprecipitation and immunofluorescence techniques (as described above).
Ein weiterer Beweis, daß die Ausführungsform vFP-3 dieser Erfindung ein erfolgreiches re-kombinantes, die Gene für Tollwut G exprimierendes Virus ist, wurde durch intradermale Impfung von Paaren von Kaninchen mit dem rekombinanten Virus erhalten. Zwei Kaninchen wurden intradermal geimpft mit jeweils 1x10® pfu vFP-3. Beide Kaninchen entwickelten typische Pockenläsionen, die eine maximale Größe 5 bis 6 Tage nach der Impfung erreichten. Den Kaninchen wurde in wöchtlichen Abständen Blut entnommen und die Seren durch ELISA getestet, um die Anwesenheit von für das Tollwutglykoprotein spezifischen Antikörpern nachzuweisen.Further evidence that the vFP-3 embodiment of this invention is a successful recombinant virus expressing the genes for rabies G was obtained by intradermally vaccinating pairs of rabbits with the recombinant virus. Two rabbits were vaccinated intradermally with 1x10® pfu vFP-3 each. Both rabbits developed typical pox lesions that reached a maximum size 5 to 6 days after vaccination. Blood was drawn from the rabbits at weekly intervals and the sera tested by ELISA to detect the presence of antibodies specific for rabies glycoprotein.
Außerdem wurden 5 Ratten intradermal jeweils mit 5 x 107 pfu vFP-3 geimpft. Alle Tiere entwickelten Läsionen.In addition, 5 rats were vaccinated intradermally each with 5 x 107 pfu vFP-3. All animals developed lesions.
Sowohl die Kaninchen als auch die Ratten entwickelten nachweisbare Mengen von für Tollwut spezifischen Antikörpern innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung. Zwei Kontrollkaninchen, die intradermal mit dem Ausgangs-FP-1-Virus geimpft waren, zeigten keine nachweisbaren Mengen an anti-Tollwut-Antikörpem.Both rabbits and rats developed detectable levels of rabies-specific antibodies within 2 weeks of vaccination. Two control rabbits vaccinated intradermally with the parent FP-1 virus showed no detectable levels of anti-rabies antibody.
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die Antikörperantwort auf die Einführung von Tollwutantigen zurückzuführen ist, das zufällig von dem Impfvirus mitgetragen wurde oder in die Membran des rekombinanten Geflügelpockenvirus integriert war, statt auf, wie vorgeschlagen, de novo Synthese von Tollwutantigen durch das rekombinante Virus in dem Tier, wurde das vFP-3-Virus chemisch inaktiviert, und damit wurden Kaninchen geimpft.In order to rule out the possibility that the antibody response is due to the introduction of rabies antigen which was coincidentally carried by the vaccine virus or was integrated into the membrane of the recombinant fowlpox virus, instead of, as suggested, de novo synthesis of rabies antigen by the recombinant virus in the Animal, the vFP-3 virus was chemically inactivated, and rabbits were vaccinated with it.
Das gereinigte Virus wurde über Nacht bei 4°C in Gegenwart von 0,001 % ß-Propiolacton inaktiviert und danach durch Zentrifugieren pelletiert. Das pelletierte Virus wurde in mit 10 mM Tris gepufferter Kochsalzlösung aufgenommen, ultraschallbehandelt und titriert, um sicherzustellen, daß kein infektiöses Virus übriggeblieben war. Zwei Ratten wurden intradermal mit inaktiviertem vFP-3 und zwei mit einer entsprechenden Menge von unbehandeltem rekombinantem Virus beimpft. Die Größe der Läsionen wurde festgestellt.The purified virus was inactivated at 4 ° C. overnight in the presence of 0.001% β-propiolactone and then pelleted by centrifugation. The pelleted virus was taken up in 10 mM Tris buffered saline, sonicated and titrated to ensure that no infectious virus was left. Two rats were inoculated intradermally with inactivated vFP-3 and two with an appropriate amount of untreated recombinant virus. The size of the lesions was determined.
Beide Kaninchen, die unbehandeltes vFP-3 erhalten hatten, entwickelten typische Pockenläsionen, die 5 Tage nach der Beimpfung als 4-5+ eingestuft wurden. Kaninchen, die mit inaktiviertem Virus beimpft waren, entwickelten ebenso Läsionen, doch diese wurden 5 Tage nach der Impfung als 2+ eingestuft.Both rabbits that received untreated vFP-3 developed typical pox lesions that were rated 4-5 + 5 days after inoculation. Rabbits vaccinated with inactivated virus also developed lesions, but these were classified as 2+ 5 days after vaccination.
Den Kaninchen wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen und die Seren durch ELISA auf die Gegenwart von für Tollwut spezifischen Antikörpern und für Geflügelpocken spezifischen Antikörpern getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. 11Blood was drawn from the rabbits at weekly intervals and the sera were tested by ELISA for the presence of antibodies specific for rabies and antibodies specific for fowlpox. The results are summarized in Table III. 11
AT 408 549 BAT 408 549 B
Tabelle IIITable III
Lebendes vFP-3 Inaktiviertes vFP-3 5 Kaninchen Antikörper No. 295 Tollwut FP No. 318 Tollwut FP No. 303 Tollwut FP No. 320 Tollwut FP 10 getestet: Woche P.l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 15 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 20 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000Live vFP-3 Inactivated vFP-3 5 Rabbit Antibody No. 295 Rabies FP No. 318 Rabies FP No. 303 Rabies FP No. 320 Rabies FP 10 tested: Week Pl 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 15 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 20 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000
In diesem Test wurde der Titer-Endwert (ausgedrückt als Kehrwert der Serumverdünnung) willkürlich als 0,2 gesetzt, nachdem die Absorptionswerte aller Seren vor der "Belastungsinfektion'’ abgezogen waren. Die Kaninchen 295 und 318, die das lebende Virus erhalten hatten, entwickel-25 ten eine Immunantwort auf das Tollwutglykoprotein und auf Geflügelpockenvirusantigene. Die Kaninchen 303 und 320 entwickelten ebenfalls eine Immunantwort auf Geflügelpockenvirusantigene; der Titer war jedoch niedriger. Keines dieser Kaninchen entwickelte eine nachweisbare Antwort auf das Tollwutglykoprotein.In this test, the final titer value (expressed as the reciprocal of the serum dilution) was arbitrarily set to 0.2 after the absorption values of all sera had been subtracted before the "stress infection". Rabbits 295 and 318, which had received the live virus, developed an immune response to the rabies glycoprotein and poultrypox virus antigens. Rabbits 303 and 320 also developed an immune response to chickenpox virus antigens; however, the titer was lower. None of these rabbits developed a detectable response to the rabies glycoprotein.
Dieser Befund bestätigt, daß die in dem Kaninchen hervorgerufene Immunantwort auf die de 30 novo Expression des in dem rekombinanten Virus enthaltenden Tollwutglykoproteingens zurückzuführen ist und nicht eine Antwort auf irgendein zufällig in dem Impfvirus mitgetragenes Glyko-protein ist.This finding confirms that the immune response elicited in the rabbit is due to the de 30 novo expression of the rabies glycoprotein gene contained in the recombinant virus and is not a response to any glyco-protein which is coincidentally carried in the vaccine virus.
Beispiel 4B 35Example 4B 35
Konstruktion des rekombinanten Virus vFP-5. das nicht-anaesteuerte Tollwut G-Gene enthält. aus Geflüaelpocken-virus FP-1Construction of the recombinant virus vFP-5. that contains non-controlled rabies G genes. from poultry pox virus FP-1
Die Expression eines fremden, durch Rekombination in das Geflügelpockengenom inserierten 40 Gens, erfordert die Anwesenheit eines Promotors. Dies wurde gezeigt durch die Herstellung einer weiteren Rekombinante vFP-5, die mit vFP-3 mit Ausnahme der Weglassung des HH-Promotors identisch ist. Die Gegenwart des Tollwutgens in dieser Rekombinante wurde durch Nucleinsäure-hybridisierung bestätigt. Kein Tollwutantigen wurde jedoch in mit dem Virus infizierten CEF-Zellkul-turen festgestellt. 45The expression of a foreign 40 gene inserted by recombination in the fowlpox genome requires the presence of a promoter. This has been demonstrated by producing another recombinant vFP-5 that is identical to vFP-3 except for the omission of the HH promoter. The presence of rabies gene in this recombinant was confirmed by nucleic acid hybridization. However, no rabies antigen was found in CEF cell cultures infected with the virus. 45
Beispiel 5Example 5
Versuche mit in vitro Passagieren zum Nachweis, ob Geflüaelpockenvirus in nicht-voaelartioenExperiments with in vitro passengers to prove whether poultry pox virus in non-voaelartioen
Zellen repliziert. 50Cells replicated. 50
Ein Versuch wurde durchgeführt, bei den drei Zellsysteme (eines vogelartig und zwei nicht-vogelartig) mit dem parentalen FP-1-Stamm oder mit rekombinanten vFP-3 beimpft wurden. Jeweils zwei Schalen mit CEF, MRC-5 oder VERO wurden mit FP-1 oder vFP-3 mit einer Eingangs-multiplizität von 10 pfu pro Zelle beimpft. 55 Nach 3 Tagen wurde jeweils eine Schale geerntet. Das Virus wurde durch drei aufeinanderfol- 12An experiment was carried out in which three cell systems (one bird-like and two non-bird-like) were inoculated with the parental FP-1 strain or with recombinant vFP-3. Two dishes with CEF, MRC-5 or VERO were inoculated with FP-1 or vFP-3 with an input multiplicity of 10 pfu per cell. 55 After 3 days, one bowl was harvested. The virus was diagnosed by three successive 12
AT 408 549 B gende Zyklen von Einfrieren und Auftauen freigesetzt und auf einen frischen Monolayer derselben Zellinie wieder geimpft. Dieses wurde über sechs aufeinanderfolgende Passagen wiederholt; am Ende des Experiments wurden Proben jeder Passage auf Virusinfektiosität auf CEF-Monolayern titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IVa zusammengefaßt. Sie zeigen, daß eine Reihenpassage sowohl von FP-1 als auch vFP-3 in CEF-Zellen möglich ist, aber in keiner der beiden nichtvogelartigen Zellinien. Infektiöses Virus konnte nicht in VERO- oder MRC-5-Zellen nach 3 oder 4 Passagen nachgewiesen werden.AT 408 549 B released cycles of freezing and thawing and inoculated on a fresh monolayer of the same cell line. This was repeated over six consecutive passages; at the end of the experiment, samples from each passage were titrated for viral infectivity on CEF monolayers. The results are summarized in Table IVa. They show that series passage of both FP-1 and vFP-3 is possible in CEF cells, but in neither of the two non-bird-like cell lines. Infectious virus could not be detected in VERO or MRC-5 cells after 3 or 4 passages.
Die zweite Schale wurde benutzt, um festzustellen, ob Virus, das nicht durch direkte Titration nachweisbar war, nach Amplifikation in permissiven CEF-Zellen nachgewiesen werden konnte. Nach 3 Tagen wurden Zellen aus der zweiten Schale durch Abschaben geerntet, ein Drittel dieser Zellen lysiert und auf einen frischen CEF-Monolayer geimpft. Wenn der volle cytopathische Effekt (CPE) erreicht war oder 7 Tage nach der Infektion, wurden die Zellen lysiert. Die Virusausbeute wurde titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IVB zusammengefaßt. Wurde Passage in CEF-Zellen benutzt, um ein etwa vorhandenes Virus zu vermehren, konnte kein Virus nach vier oder fünf Passagen nachgewiesen werden.The second dish was used to determine whether virus that was not detectable by direct titration could be detected after amplification in permissive CEF cells. After 3 days, cells from the second dish were harvested by scraping, a third of these cells were lysed and vaccinated on a fresh CEF monolayer. When the full cytopathic effect (CPE) was achieved or 7 days after infection, the cells were lysed. The virus yield was titrated. The results are summarized in Table IVB. If passage in CEF cells was used to multiply any virus present, no virus could be detected after four or five passages.
Versuche, eine permanent infizierte Zelle zu etablieren, schlugen fehl.Attempts to establish a permanently infected cell failed.
In einem weiteren Versuch, Hinweise einer andauernden viralen Expression in nicht-vogelartigen Zellen zu entdecken, wurden die vorstehend zur Virustiterbestimmung benutzten Proben in einem Standardimmunodottest eingesetzt, bei dem anti-Geflügelpocken-Antikörper und anti-Tollwut-Antikörper benutzt wurden, um die Anwesenheit des jeweiligen Antigens nachzuweisen. Die Ergebnisse dieser Tests bestätigen die Titrationsergebnisse.In a further attempt to detect evidence of sustained viral expression in non-avian cells, the samples used for virus titer assay were used in a standard immunodotam test using anti-fowlpox and anti-rabies antibodies to detect the presence of the to detect the respective antigen. The results of these tests confirm the titration results.
Virus zur Beimpfung Tabelle IVA Passaaierversuch FP-1 vFP-3 Zelltyp CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5 Passage 1 6.6a 4.8 4.9 6.6 5.4 6.2 2 6.7 2.9 3.7 6.5 4.2 5.1 3 6.4 1.4 1.0 6.4 1.7 4.4 4 6.1 N.Db N.D 6.2 N.D 1.0 5 6.4 N.D N.D 6.3 N.D N.D 6 5.7 a - Virustiter in log10 pfu pro ml. N.D N.D 5.9 N.D N.D b - nicht nachweisbar Virus zur Beimpfung Tabelle IVB Vermehrunasversuch FP-1 vFP-3 Zelltyp CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5 Passage 1 6.4a 6.2 6.4 6.5 6.3 6.4 2 7.5 6.3 6.0 6.5 6.3 5.5 13Inoculation virus Table IVA Passage experiment FP-1 vFP-3 Cell type CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5 Passage 1 6.6a 4.8 4.9 6.6 5.4 6.2 2 6.7 2.9 3.7 6.5 4.2 5.1 3 6.4 1.4 1.0 6.4 1.7 4.4 4 6.1 N. Db ND 6.2 ND 1.0 5 6.4 ND ND 6.3 ND ND 6 5.7 a - virus titer in log10 pfu per ml. ND ND 5.9 ND ND b - undetectable virus for inoculation Table IVB propagation test FP-1 vFP-3 cell type CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5 Passage 1 6.4a 6.2 6.4 6.5 6.3 6.4 2 7.5 6.3 6.0 6.5 6.3 5.5 13
AT 408 549 BAT 408 549 B
zur Beimpfung elltyp CEF FP-1 VERO MRC-5 CEF vFP-3 VERO Passage 3 6.2 6.7 5.3 5.9 6.1 MRC-5 6.3 4 5.6 4.6 3.9 5.7 4.8 5.8 5 6.3 4.1 N.D 6.1 4.7 4.7 6 6.2 N.Db N.D 6.2 N.D N.D a - Virustiter in log10 pfu pro ml. b - nicht nachweisbarfor inoculation elltyp CEF FP-1 VERO MRC-5 CEF vFP-3 VERO Passage 3 6.2 6.7 5.3 5.9 6.1 MRC-5 6.3 4 5.6 4.6 3.9 5.7 4.8 5.8 5 6.3 4.1 ND 6.1 4.7 4.7 6 6.2 N.Db ND 6.2 ND ND a - virus titer in log10 pfu per ml. b - undetectable
Beispiel 6Example 6
Zusätzliche Rekombinanten von Geflüqelpocken FP-1: vFP-6. vFP-7, vFP-8 und vFP-9Additional poultry pox recombinants FP-1: vFP-6. vFP-7, vFP-8 and vFP-9
Die rekombinanten Viren vFP-6 und vFP-7 wurden nach folgenden Verfahren hergestellt.The recombinant viruses vFP-6 and vFP-7 were produced by the following methods.
Ein 5,5 Kbp Pvu Il-Fragment von FP-1 wurde zwischen die beiden Pvu Il-Stellen in pUC 9 eingefügt und ergab das Plasmid pRW 731.13. Dieses Plasmid wurde anschließend an einer singulären Hinc Il-Stelle gespalten und an den Enden stumpf gemachtes, vom HH-Promotor abhängiges Tollwut G-Gen eingefügt, was die Plasmide pRW 748A und B ergab, die die beiden entgegengesetzten Orientierungen des Inserts darstellen. Die Plasmide pRW 748A und B wurden dann getrennt benutzt, um CEF-Zellen zusammen mit FP-1 Virus zu infizieren und ergaben durch Rekombination vFP-6 bzw. vFP-7. Dieser Genort wird nun als Genort f7 bezeichnet.A 5.5 kbp Pvu II fragment of FP-1 was inserted between the two Pvu II sites in pUC 9 and gave the plasmid pRW 731.13. This plasmid was then cleaved at a unique Hinc II site and blunt-ended rabies G gene dependent on the HH promoter inserted at the ends, resulting in plasmids pRW 748A and B, which represent the two opposite orientations of the insert. The plasmids pRW 748A and B were then used separately to infect CEF cells together with FP-1 virus and gave vFP-6 and vFP-7, respectively, by recombination. This locus is now referred to as locus f7.
Ein 10 Kbp Pvu Il-Fragment von FP-1 wurde zwischen die beiden Pvu Il-Stellen von pUC 9 eingefügt und ergab pRW 731.15. Dieses Plasmid wurde anschließend an einer singulären Barn Hl-Stelle gespalten und anschließend ein vom 11K-Promotor abhängiges lac Z-Genfragment eingefügt, was pRW 749A und B erzeugte, die die entgegensetzten Orientierungen des Inserts darstellen. Rekombination dieser Donorplasmide mit FP-1 führte zu vFP-8 bzw. vFP-9. Dieser Genort wird nun als Genort f8 bezeichnet. vFP-8 und vFP-9 exprimierten (wie mittels X-gal nachgewiesen) das lac Z-Gen. vFP-6 und vFP-7 exprimierten das Tollwut G-Gen, wie durch ein Tollwut-spezifisches Antiserum nachgewiesen wurde.A 10 Kbp Pvu II fragment of FP-1 was inserted between the two Pvu II sites of pUC 9, giving pRW 731.15. This plasmid was then digested at a unique Barn HI site and then an 11K promoter-dependent lac Z gene fragment was inserted, producing pRW 749A and B, which represent the opposite orientations of the insert. Recombination of these donor plasmids with FP-1 led to vFP-8 or vFP-9. This locus is now referred to as locus f8. vFP-8 and vFP-9 expressed the lac Z gene (as demonstrated by X-gal). vFP-6 and vFP-7 expressed the rabies G gene, as evidenced by a rabies-specific antiserum.
Beispiel 7Example 7
Immunisierung mit vFP-3 zum Schutz von Tieren gegen eine Belastunasinfektion mit lebendenImmunization with vFP-3 to protect animals against live infection
TollwutvirenRabies viruses
Gruppen von 20 weiblichen 4 bis 6 Wochen alten SPF-Mäusen wurden mit 50 μ! vFP-3 auf der Pfotenfläche mit Dosen im Bereich 0,7 bis 6,7 TCID50 pro Maus beimpft. (Die TCID® oder tissue culture infectious dose ist diejenige Dosis, bei der 50 % der Gewebekulturzellen einen cytopathi-schen Effekt erleiden). 14 Tage nach der Impfung wurden 10 Mäuse aus jeder Gruppe geopfert und Serumproben für RFFI-Tests gesammelt. Die übrigen 10 Mäuse wurden einer Belastungsinfektion durch Beimpfung mit 10 LD50 des Tollwutstamms CVS über den intracerebralen Weg ausgesetzt und die überlebenden 14 Tage nach der Belastungsinfektion berechnet.Groups of 20 female 4 to 6 week old SPF mice were challenged with 50 μ! Inoculated vFP-3 on the paw area with doses in the range 0.7 to 6.7 TCID50 per mouse. (The TCID® or tissue culture infectious dose is the dose at which 50% of the tissue culture cells suffer a cytopathic effect). 14 days after vaccination, 10 mice from each group were sacrificed and serum samples collected for RFFI tests. The remaining 10 mice were exposed to a stress infection by inoculation with 10 LD50 of the rabies strain CVS via the intracerebral route and the surviving 14 days after the stress infection were calculated.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VA zusammengefaßt. 14The results are summarized in Table VA. 14
AT 408 549 BAT 408 549 B
Dosis vFP-3 log« TCID50 6.7 4.7 2.7 0,7Dose vFP-3 log «TCID50 6.7 4.7 2.7 0.7
Tabelle VA Tollwutantikörper Titer log« Verdünnung* 1,91,8 0,4 0,4 Überlebensrate 8/10 0/10 0/10 0/10 * Gemessen als RFFI-(Rapid Fluorescent Focus Inhibition) Tests, Laboratory Techniques in Rabies, Third Ed., 354-357, WHO Genf.Table VA Rabies Antibody Titer log «Dilution * 1.91.8 0.4 0.4 Survival Rate 8/10 0/10 0/10 0/10 * Measured as RFFI (Rapid Fluorescent Focus Inhibition) tests, Laboratory Techniques in Rabies, Third Ed., 354-357, WHO Geneva.
Das Experiment wurde mit 12,5 LD50 des Tollwutvirus als Belastungsinfektion wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VB zusammengefaßt.The experiment was repeated with 12.5 LD50 of the rabies virus as a stress infection. The results are summarized in Table VB.
Tabelle VBTable VB
Dosis vFP-3 log« TCID50 6.7 4.7 2.7 0,7Dose vFP-3 log «TCID50 6.7 4.7 2.7 0.7
Tollwutantikörper Titer log« Verdünnung*2,82,10,60,6 Überlebensrate 5/10 2/10 0/8 0/8Rabies antibody Titer log «Dilution * 2.82,10.60.6 Survival rate 5/10 2/10 0/8 0/8
* Siehe Tabelle VA* See table VA
Zwei Hunde und zwei Katzen wurden mit einer einzigen subkutanen Impfung mit 8 log« TCIDso des rekombinanten vFP-3 immunisiert. Zusätzlich wurden 2 Hunde und 4 Katzen von entsprechendem Alter und Gewicht als nicht-geimpfte Kontrollen gehalten. Allen Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen. Am Tag 94 wurde jeder Hund einer Belastungsinfektion durch Beimp-fung in den Schläfenmuskel mit zwei Dosen von 0,5 ml eines Speicheldrüsenhomogenats des NY-Stamms von Tollwutvirus (vom Institute Merieux, Inc. erhältlich), ausgesetzt. Die Gesamtdosis entsprach 10 000 Mäuse LD50 über einen intrazerebralen Weg. Die sechs Katzen wurden auf ähnliche Weise einer Belastungsinfektion durch Beimpfung in den Nackenmuskel mit zwei Dosen von 0,5 ml der gleichen Virussuspension ausgesetzt. Die Gesamtdosis pro Tier entsprach 40 000 Mäuse LD50 über einen intrazerebralen Weg. Die Tiere wurden täglich beobachtet. Alle nichtgeimpften Tiere starben am in der Tabelle VI angezeigten Tag an Tollwutsymptomen. Die geimpften Tiere überlebten die Belastungsinfektion und wurden 3 Wochen lang nach dem Tod des letzten Kontrolltieres beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.Two dogs and two cats were immunized with a single subcutaneous vaccination with 8 log TCIDso of the recombinant vFP-3. In addition, 2 dogs and 4 cats of appropriate age and weight were kept as non-vaccinated controls. Blood was drawn from all animals at weekly intervals. On day 94, each dog was exposed to a strain infection by inoculation into the temporal muscle with two doses of 0.5 ml of NY salivary homogenate from rabies virus (available from Institute Merieux, Inc.). The total dose corresponded to 10,000 LD50 mice via an intracerebral route. The six cats were similarly exposed to a strain infection by inoculation into the neck muscle with two doses of 0.5 ml of the same virus suspension. The total dose per animal corresponded to 40,000 LD50 mice via an intracerebral route. The animals were observed daily. All unvaccinated animals died of rabies symptoms on the day shown in Table VI. The vaccinated animals survived the stress infection and were observed for 3 weeks after the death of the last control animal. The results are summarized in Table VI.
Tabelle VITable VI
Zeitpunkt c 0) ü £ Impfung Titer nach Impfung am Tag des Todes 0 14 21 : 28 94 7015 vFP-3a 0 2.2b 2.4 2.4 1.5 + 7016 vFP-3 0 1.7 1.9 2.0 1.3 + 8271 cc 0 0 0 0 0 d/13' T10 c 0 0 0 0 0 d/12 T41 c 0 0 0 0 0 d/13 Überleben/ Tier 15Time c 0) ü £ Vaccination titer after vaccination on the day of death 0 14 21: 28 94 7015 vFP-3a 0 2.2b 2.4 2.4 1.5 + 7016 vFP-3 0 1.7 1.9 2.0 1.3 + 8271 cc 0 0 0 0 0 d / 13 'T10 c 0 0 0 0 0 d / 12 T41 c 0 0 0 0 0 d / 13 survival / tier 15
AT 408 549 BAT 408 549 B
Zeitpunkt des Todes Überleben/Survival time of death /
Tier Impfung Titer nach Impfung am Tag 14 21 28 94 0 0 0 0 d/12 0.8 1.0 1.1 1.2 + 1.5 2.3 2.2 1.9 + 0 0 0 0 d/15 0 0 0 0 d/16 0 C 3 T42 C 0 426 vFP-3 0 <u 427 vFP-3 0 | 55 C 0 x 8240 c 0 a- Die mit vFP-3 geimpften Katzen und Hunde erhielten 8 logio TCID« über den subkutanen Weg. b- Titer ausgedrückt als logio der höchsten Serumverdünnung, die eine Reduktion von mehr als 50 % in der Anzahl der fluoreszierenden Vertiefungen in einem RFFI-Test ergibt, c- Nicht-geimpfte Konfrontiere. d- Tier starb/Tag des Todes nach der Belastungsinfektion.Animal vaccination Titer after vaccination on day 14 21 28 94 0 0 0 0 d / 12 0.8 1.0 1.1 1.2 + 1.5 2.3 2.2 1.9 + 0 0 0 0 d / 15 0 0 0 0 d / 16 0 C 3 T42 C 0 426 vFP -3 0 <u 427 vFP-3 0 | 55 C 0 x 8240 c 0 a- The cats and dogs vaccinated with vFP-3 received 8 logio TCID via the subcutaneous route. b- Titer expressed as logio of the highest serum dilution which results in a reduction of more than 50% in the number of fluorescent wells in an RFFI test, c- non-vaccinated confronters. d- animal died / day of death after the stress infection.
In weiteren Experimenten wurden die rekombinanten Viren vFP-2 und vFP-3 zur Beimpfung von Rindern über mehrere verschiedene Wege benutzt.In further experiments, the recombinant viruses vFP-2 and vFP-3 were used to inoculate cattle in several different ways.
Geimpfte Tiere wurden auf anti-Tollwutantikörper an den Tagen 6, 14, 21, 28 und 35 getestet. Alle Tiere zeigen eine serologische Antwort auf das Tollwutantigen. Dies ist in Tabelle VII A gezeigt.Vaccinated animals were tested for anti-rabies antibodies on days 6, 14, 21, 28 and 35. All animals show a serological response to the rabies antigen. This is shown in Table VII A.
Tabelle VIIATable VIIA
Antikörpertiter in mit vFP-3 geimpften Saugetieren (Rinder) anti-Tollwut neutralisierende Antikörper RFFI Test loo-m VerdünnungAntibody titers in mammals vaccinated with vFP-3 (cattle) anti-rabies neutralizing antibodies RFFI test loo-m dilution
Tag 0 6 14 21 28 35 Rind Nr. 7.3 logio TCID50 1420 (intradermal) negativ 0.6 2 1.7 1.8 1.7 8 logio TCIDso 1419 (subkutan) negativ 1.6 2.2 2.1 2.1 1.9 8 logio TCID50 1421 (intramuskulär) negativ 0.9 2.2 2.1 2.1 1.9 7.3 logio TCID50 1423 (intramuskulär) negativ 0.9 1.1 + 1 + 1 + 1.1 + + nicht signifikantDay 0 6 14 21 28 35 Cattle No. 7.3 logio TCID50 1420 (intradermal) negative 0.6 2 1.7 1.8 1.7 8 logio TCIDso 1419 (subcutaneous) negative 1.6 2.2 2.1 2.1 1.9 8 logio TCID50 1421 (intramuscular) negative 0.9 2.2 2.1 2.1 1.9 7.3 logio TCID50 1423 (intramuscular) negative 0.9 1.1 + 1 + 1 + 1.1 + + not significant
Alle Rinder wurden am Tag 55 nach der Impfung wieder geimpft mit 8 log10 TCID50. Sie zeigten eine anamnetische Antwort auf das Tollwutantigen. In der Verstärkernachimpfung wurden alle Rinder subkutan geimpft außer Nr. 1421, das wieder intramuskulär geimpft wurde. RFFI-Titer wurden bestimmt an den Tagen 55, 57, 63, 70, 77 und 86. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIIB zusammengefaßt. 16All cattle were re-vaccinated with 8 log10 TCID50 on day 55 after vaccination. They showed a history response to the rabies antigen. In the booster vaccination, all cattle were vaccinated subcutaneously except No. 1421, which was vaccinated again intramuscularly. RFFI titers were determined on days 55, 57, 63, 70, 77 and 86. The results are summarized in Table VIIB. 16
AT 408 549 BAT 408 549 B
Tabelle VIIBTable VIIB
Tag 55 57 63 70 77 86 Rind Nr. 1419 1.7 1.5 2.9 2.9 2.6 2.9 1420 1.0 0.5 1.9 2.3 2.2 2.0 1421 1.3 1.2 2.9 2.7 2.5 2.5 1423 1.0 0.7 2.4 2.5 2.5 2.2Day 55 57 63 70 77 86 Cattle No. 1419 1.7 1.5 2.9 2.9 2.6 2.9 1420 1.0 0.5 1.9 2.3 2.2 2.0 1421 1.3 1.2 2.9 2.7 2.5 2.5 1423 1.0 0.7 2.4 2.5 2.5 2.2
Alle Daten beziehen sich auf vFP-3 außer bei Tier 1423, wo sie sich auf vFP-2 beziehen.All data refer to vFP-3 except for Tier 1423 where they refer to vFP-2.
Rinder, Katzen und Kaninchen wurden auch intradermal mit bekannten Mengen von Geflügelpockenvirus geimpft. Wundschorf wurde von den Tieren nach etwa 1 Woche gesammelt. Dieser wurde zermahlen, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und zur Bestimmung der Virusmengen titriert.Cattle, cats and rabbits were also vaccinated intradermally with known amounts of chickenpox virus. Scab was collected from the animals after about 1 week. This was ground, suspended in physiological saline and titrated to determine the amount of virus.
Nur Restmengen an infektiösem Virus konnten nachgewiesen werden. Dies zeigt, daß keine Infektion unter Vermehrung in vivo erfolgte.Only residual amounts of infectious virus could be detected. This shows that there was no infection with proliferation in vivo.
Beispiel 8Example 8
Impfung von Hühnern mit vFP-3 Hühner wurden mit rekombinantem Geflügelpockenvirus vFP-3 geimpft, um die Expression von Fremd-DNA durch ein rekombinantes Geflügelpockenvirus in einem System zu zeigen, das eine repiikative Vermehrung des Vektors gestattet.VFP-3 Chickens Vaccination Chickens were vaccinated with recombinant fowlpox virus vFP-3 to demonstrate the expression of foreign DNA by a recombinant fowlpox virus in a system that allowed the vector to replicate reproducibly.
Weiße Leghornhühner wurden intramuskulär mit 9 log10 TCID50 vFP-3 oder durch Flügeldurchstechen mit 3 log10 TCID50 vPP-3 geimpft Blutproben wurden für einen RFFI-Test auf Tollwutantikörpertiter 21 Tage nach der Impfung entnommen. Titer am Tag 21 in geimpften Hühnern waren signifikant höher als Titer in den Kontrollen am Tag 21. Der Durchschnittstiter der nicht-infizierten Kontrollen betrug 0,6, derjenige der intramuskulär geimpften Vögel 1,9, derjenige der Flügeldurchstochenen Vögel 1,2.White chickens were vaccinated intramuscularly with 9 log10 TCID50 vFP-3 or by wing piercing with 3 log10 TCID50 vPP-3. Blood samples were taken for an RFFI test for rabies antibody titers 21 days after vaccination. Day 21 titers in vaccinated chickens were significantly higher than titers in day 21 controls. The mean titre of the non-infected controls was 0.6, that of intramuscularly vaccinated birds 1.9, that of winged birds 1.2.
Beispiel 9Example 9
Truthahninfluenza H5 HA-Antiaen exorimierende rekombinante Geflüaelpocken vFP-11Turkey flu influenza H5 HA antiaen exorimizing recombinant chickenpox vFP-11
Vogelarten können mit den rekombinanten Avipoxviren der Erfindung gegen Vogelpathogene immunisiert werden.Bird species can be immunized against avian pathogens with the recombinant avipox viruses of the invention.
So wurde das nachstehend beschriebene neue Plasmid pRW 759, das sich vom Geflügelpok-kenvirus FP-1 ableitet und ein Hämagglutiningen (H5) von A/Truthahn/lrland/1378/83 (TYHA) unter der Kontrolle des Hind III H-Promotors enthält, zur Transfektion von gleichzeitig mit dem Eltemvirus FP-1 infizierten CEF-Zellen, benutzt. Rekombinantes Geflügelpockenvirus vFP-11 wurde durch die weiter vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten.Thus, the new plasmid pRW 759 described below, which is derived from the fowl pox virus FP-1 and contains a hemagglutin gene (H5) from A / Turkey / Ireland / 1378/83 (TYHA) under the control of the Hind III H promoter, for the transfection of CEF cells infected simultaneously with the FP-1 parent virus. Recombinant fowlpox virus vFP-11 was obtained by the methods described above.
Die Synthese eines Hämagglutininmoleküls in mit VFP-11 infizierten Zellen wurde durch Immunpräzipitation von über den Stoffwechsel radiomarkierten, infizierten Zellysaten unter Benutzung eines spezifischen anti-H5-Antikörpers und Standardverfahren bestätigt. Die spezifische Immunpräzipitation von Vorstufen-Hämagglutinin mit einem Molekulargewicht von ca. 63 kd (Kilo-dalton) und zwei Spaltprodukten mit einem Molekulargewicht von 44 und 23 kd wurde gezeigt. Keine derartigen Proteine wurden aus einem Lysat von nicht-infizierten CEF-Zellen oder von mit Elternvirus FP-1 infizierten Zellen ausgefällt.The synthesis of a hemagglutinin molecule in cells infected with VFP-11 was confirmed by immunoprecipitation of metabolically labeled infected cell lysates using a specific anti-H5 antibody and standard procedures. The specific immunoprecipitation of precursor hemagglutinin with a molecular weight of approx. 63 kd (kilodalton) and two cleavage products with a molecular weight of 44 and 23 kd was shown. No such proteins were precipitated from a lysate of uninfected CEF cells or from parental virus FP-1 infected cells.
Zum Nachweis, daß das in den mit dem rekombinanten Geflügelpocken vFP-11 infizierten Zellen produzierte HA-Molekül an der Zelloberfläche exprimiert wurde, wurden Immunfluoreszenz-Untersuchungen durchgeführt. Mit dem rekombinanten Geflügelpockenvirus vFP-11 infizierte CEF-Zellen zeigten eine starke Fluoreszenzfärbung an der Oberfläche. In mit dem Eltemvirus FP-1 infizierten Zellen wurde keine Fluoreszenz gemessen. 17Immunofluorescence studies were carried out to demonstrate that the HA molecule produced in the cells infected with the recombinant pox pox vFP-11 was expressed at the cell surface. CEF cells infected with the recombinant fowlpox virus vFP-11 showed a strong fluorescence staining on the surface. No fluorescence was measured in cells infected with the FP-1 parent virus. 17th
AT 408 549 BAT 408 549 B
Das Plasmid pRW 759 wurde wie folgt hergestellt: pRW 742B (vgl. Beispiel 4) wird durch teilweisen Verdau mit Pst I linearisiert und das Fragment nachgespalten mit Eco RV, um das Tollwut G-Gen zu entfernen, wobei der HH-Promotor an dem verbleibendem Fragment von etwa 3,4 Kbp bleibt. Nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase wird ein synthetisches Oligonucleotid eingefügt, damit der HH-Promotor mit TYHA am ATG verbunden werden kann, was zu pRW 744 führt.The plasmid pRW 759 was prepared as follows: pRW 742B (see Example 4) is linearized by partial digestion with Pst I and the fragment was cleaved with Eco RV to remove the rabies G gene, the HH promoter being on the remaining one A fragment of about 3.4 Kbp remains. After treatment with alkaline phosphatase, a synthetic oligonucleotide is inserted so that the HH promoter can be linked to TYHA at the ATG, which leads to pRW 744.
Dieses Plasmid wurde durch teilweisen Verdau mit Dra I linearisiert; das linearisierte Fragment wurde mit Sal I gespalten und das größere Fragment wiedergewonnen und mit alkalischer Phosphatase behandelt.This plasmid was linearized by partial digestion with Dra I; the linearized fragment was digested with Sal I and the larger fragment recovered and treated with alkaline phosphatase.
Schließlich wurde pRW 759 erzeugt durch Einfügen des isolierten Sal I-Dra I-Fragments hergestellt, das die codierende Sequenz von TYHA enthält, in den pRW 744 Vektor, wie von Kawaoka etal., Virology, Bd. 158 (1987), Seiten 218-227 gezeigt wurde.Finally, pRW 759 was generated by inserting the isolated Sal I-Dra I fragment containing the coding sequence of TYHA into the pRW 744 vector as described by Kawaoka et al., Virology, Vol. 158 (1987), pages 218- 227 was shown.
Beispiel 10Example 10
Immunisierung mitvFP-11 zum Schutz von Vögeln gegen eine Belastunasinfektion mit lebendem InfluenzavirusImmunization with vFP-11 to protect birds against live infection with live influenza virus
Zum Nachweis der immunogenen Wirkung von rekombinantem Geflügelpockenvirus vFP-11, wurden Impf- und Belastungsinfektion-Experimente in Hühnern und Truthühnern durchgeführt.To demonstrate the immunogenic effect of recombinant poxpox virus vFP-11, vaccination and stress infection experiments were carried out in chickens and turkeys.
Spezifisch pathogenfreie (SPF) weiße Leghornhühner wurden im Alter von 2 Tagen und 5 Wochen durch Durchstechen der Flügelhaut mit einer Doppelnadel geimpft, wie sie für übliche Impfung von Hühnern mit Geflügelpockenvirus benutzt wird. Etwa 2 μΙ vFP-11 mit 6x105 pfu wurde jedem Vogel gegeben. Den älteren Vögeln wurde vor der Impfung Blut entnommen, und allen Vögeln wurde vor der Belastungsinfektion und 2 Wochen später Blut entnommen.Specifically pathogen-free (SPF) white leghorn chickens were vaccinated at the age of 2 days and 5 weeks by piercing the wing skin with a double needle as used for the usual vaccination of chickens with the chickenpox virus. Each bird was given approximately 2 μΙ of vFP-11 with 6x105 pfu. Blood was drawn from the older birds before vaccination and blood was drawn from all birds before the challenge infection and 2 weeks later.
Zu Vergleichszwecken wurde eine zweite Gruppe von Hühnern mit einen üblichen H5-lmpfstoff beimpft, der aus einem inaktiviertem H5N2-Stamm in einer Wasser-in-öl-Emulsion besteht.For comparison purposes, a second group of chickens was inoculated with a common H5 vaccine consisting of an inactivated strain of H5N2 in a water-in-oil emulsion.
Inaktiverter H5N2-lmpfstoff wurde aus A/Ma!lard/NY/189/82 (H5N2) Influenzavirus gewonnen, das in 11 Tage alten befruchteten Hühnereiern gezogen war; die infizierte Allantoisflüssigkeit mit einem HA-Titer von 800/0,1 ml und einem infektiösen Titer von108,5/0,1 ml wurde mit 0,1 % Propio-lacton inaktiviert und in einer Wasser-in-öl-Emulsion, wie bei Stone et al., Avian Dis., Bd. 22 (1978) Seiten 666-674 und Brugh et al., Proc. Second Inter. Sym. on Avian Influenza (1986), Seiten 283-292 beschrieben, suspendiert. In 0,2 ml Volumen wurde der Impfstoff 2 Tage und 5 Wochen alten SPF weißen Leghornhühnern über den subkutanen Weg unter die Haut auf der Innenseite des Schenkelmuskels verabreicht.Inactivated H5N2 vaccine was obtained from A / Maardard / NY / 189/82 (H5N2) influenza virus grown in 11-day-old fertilized chicken eggs; the infected allantoic fluid with a HA titer of 800 / 0.1 ml and an infectious titer of 108.5 / 0.1 ml was inactivated with 0.1% propiolactone and in a water-in-oil emulsion as in Stone et al., Avian Dis., Vol. 22 (1978) pages 666-674 and Brugh et al., Proc. Second Inter. Sym. on Avian Influenza (1986), pages 283-292. In 0.2 ml volume, the vaccine was administered to 2-day and 5-week-old SPF white leghorn chickens via the subcutaneous route under the skin on the inside of the thigh muscle.
Eine dritte und vierte Gruppe von Hühnern erhielt parenteral ursprüngliches Virus FP-1 bzw. keinen Impfstoff. Hühner wurden einer Belastungsinfektion unterworfen mit ca. 103 LDm des hochpathogenen A/Turkey/lreland/1378/83 (H5N8) oder A/Chick/Penn/1370/83 (H5N2) Influenzavirus durch Verabreichung von 0,1 ml auf die Nasenlöcher jedes Vogels. Zwei Tage alte Vögel wurde einer Belastungsinfektion 6 Wochen nach der Impfung ausgesetzt und 5 Wochen alte Vögel wurden einer Belastungsinfektion 5 Wochen nach der Impfung ausgesetzt. Die Vögel wurden täglich auf Krankheitssymptome beobachtet, die sich durch Anschwellen und Cyanose des Gesichts und des Kammes und durch Blutungen an den Füßen (solche Vögel konnten häufig nicht stehen), Lähmung und Tod anzeigten. Die meisten Todesfälle geschahen zwischen 4 und 7 Tagen nach der Infektion. 3 Tage nach der Infektion wurden Abstriche aus der Trachea und der Cloaca aus jedem lebenden Huhn auf Virus getestet durch Beimpfung von befruchteten Eiern. Die Hühner, die entweder mit Wildtyp oder rekombinantem Geflügelpockenvirus geimpft waren, entwickelten typische Läsionen am Flügelnetzgewebe. Einer Pustelbildung bis zum 3. Tag um jeden Nadelstich herum folgte eine zelluläre Infiltration mit Schorfbildung und Erholung nach 7 Tagen. Es wurden keine sekundären Läsionen gebildet und es gab keinen Hinweis auf eine Verbreitung auf nicht-geimpfte Hühner, die in Kontakt kamen. Die Ergebnisse des Belastungsinfektions-Experiments sind in Tabelle VIII und die damit verbundenen serologischen Befunde in Tabelle IX zusammengefaßt. 18A third and fourth group of chickens received parenterally original FP-1 virus or no vaccine. Chickens were challenged with approximately 103 LDm of the highly pathogenic A / Turkey / Ireland / 1378/83 (H5N8) or A / Chick / Penn / 1370/83 (H5N2) influenza virus by administering 0.1 ml to each bird's nostrils . Two-day-old birds were exposed to a stress infection 6 weeks after vaccination and 5-week-old birds were exposed to a stress infection 5 weeks after vaccination. The birds were observed daily for symptoms of the disease, which showed swelling and cyanosis of the face and crest and bleeding on the feet (such birds often could not stand), paralysis and death. Most deaths occurred between 4 and 7 days after infection. Three days after infection, smears from the trachea and cloaca from each live chicken were tested for virus by inoculating fertilized eggs. The chickens, vaccinated with either wild-type or recombinant fowlpox virus, developed typical lesions on the wing mesh. A pustule up to the 3rd day around each needle prick was followed by cellular infiltration with scab formation and recovery after 7 days. No secondary lesions were formed and there was no evidence of spread to non-vaccinated chickens that came into contact. The results of the stress infection experiment are summarized in Table VIII and the associated serological findings in Table IX. 18th
AT 408 549 BAT 408 549 B
Tabelle VliiTable Vlii
Durch in Geflügelpocken exprimiertes H5 vermittelter Schutz von HühnernProtection of chickens mediated by H5 expressed in chickenpox
Belastungs infektion Alter Schutz Virus der Impfstoff Hühner Krank/Tot/Gesamt Trachea Gloaca Ty/Ireland Geflügel- 2 Tage 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) pocken-H5 (vFP-11) 5 Wochen 0/0/5 0/5 0/5 inaktivierter H5N2 2 Tage 0/0/9 0/9 0/9 5 Wochen 0/0/5 0/5 0/5 Geflügel- 2 Tage 10/9/10 216 3/6 pocken- Kontrolle 5 Wochen 4/3/5 0/5 4/5 Kein 2 Tage 10/9/10 2/7 5/7 2 Tage1 2/1/2 2/2 2/2 5 Wochen 2/2/5 0/5 1/5 Ck/Penn Geflügel- 2 Tage 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) pocken-H5 (vFP-11) 5 Wochen 0/0/6 5/6 2/6 inaktivierter H5N2 2 Tage 0/0/8 2/8 0/8 5 Wochen 0/0/5 3/5 0/5 Geflügel- 2 Tage 10/1/10 10/10 10/10 pocken- Kontrolle 5 Wochen 5/0/5 5/5 5/5 Kein 2 Tage 9/3/9 9/9 9/9 2 Tage1 2/2/2 2/2 2/2 5 Wochen 5/2/5 5/5 5/5 19 1Stress Infection Age Protection Vaccine Virus Chickens Sick / Dead / Total Trachea Gloaca Ty / Ireland Poultry 2 days 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) smallpox H5 (vFP-11) 5 weeks 0/0 / 5 0/5 0/5 inactivated H5N2 2 days 0/0/9 0/9 0/9 5 weeks 0/0/5 0/5 0/5 poultry 2 days 10/9/10 216 3/6 smallpox Control 5 weeks 4/3/5 0/5 4/5 No 2 days 10/9/10 2/7 5/7 2 days 1 2/1/2 2/2 2/2 5 weeks 2/2/5 0 / 5 1/5 Ck / Penn poultry- 2 days 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) smallpox-H5 (vFP-11) 5 weeks 0/0/6 5/6 2/6 inactivated H5N2 2 days 0/0/8 2/8 0/8 5 weeks 0/0/5 3/5 0/5 poultry 2 days 10/1/10 10/10 10/10 smallpox control 5 weeks 5/0/5 5 / 5 5/5 No 2 days 9/3/9 9/9 9/9 2 days 1 2/2/2 2/2 2/2 5 weeks 5/2/5 5/5 5/5 19 1
Vier nicht geimpfte Vögel wurden zusammen mit der Geflügelpocken-H5-Gruppe von 10 Vögeln gehalten und aufgezogen, um die Ausbreitung von Geflügelpocken-H5 nachzuweisen.Four unvaccinated birds were kept and raised with the poultry pox H5 group of 10 birds to demonstrate the spread of poultry pox H5.
AT 408 549 BAT 408 549 B
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Durch Impfung mit vFP-11 oder einem inaktiviertem Influenzavirusimpfstoff hervoroerufene AntikörperbildunqAntibody production caused by vaccination with vFP-11 or an inactivated influenza virus vaccine
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AT 408 549 B (a) Den 5 Wochen alten Vögeln wurde vor der Impfung Blut entnommen, das in Hl- und Neutralisationstests geprüft wurde; keiner enthielt nachweisbare Mengen an Antikörper; die Ergebnisse sind nicht gezeigt. Den 2 Tage alten Hühnern wurde 6 Wochen nach Impfung (Post-1 und den 5 Wochen alten Vögeln wurde 5 Wochen nach Impfung (Post-1) Blut entnommen; beiden Gruppen wurde 2 Wochen nach der Belastungsinfektion (Post-2) Blut entnommen. Die Zahlen stellen gemittelte Antikörpertiter aus der gleichen wie in Tabelle I beschriebenen Gruppe von Hühnern dar. (b) Die Zahlen in Klammem geben an, wieviel die Belastungsinfektion überlebten. < = weniger als 10 (c) Hämagglutinationshemmungstests (Hl) wurden in Mikrotiterplatten ausgeführt, wobei Rezeptor-zerstörende-Enzymbehandelte Seren verwendet wurden (4 HA-Einheiten von Ty/Ire Virus, und 0,5 % Hühnererythrocyten wie beschrieben bei Palmer et al., Immun. Se-ries Nr. 6, 51-52, U.S. Dept. Health, Education and Welfare (1975)). Die Infektivitäts-Neutralisierungstests wurden ausgeführt, indem 103 EID50 von Ty/Ire-Virus mit Verdünnungen der Seren für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden, dem eine Imphing mit Aliquots in befruchtete Eier folgte. Viruswachstum wurde bestimmt durch Hämagglutinationstests nach Bebrütung der Eier für 2 Tage bei 33°C. Hühner, die mit dem rekombinanten Geflüge!pocken-H5 (vFP-11) oder dem inaktiviertem H5N2-lnfluenzaimpfstoff in Adjuvans beimpft wurden, waren vor der Belastungsinfektion mit dem homologen Ty/Ire (H5N8) Influenzavirus und dem verwandten, aber unterscheidbaren Ck/Penn (H5N2)-Influenzavirus geschützt. Im Gegensatz dazu zeigte die Mehrheit der Vögel, die mit dem Ausgangs-FPV beimpft waren oder keinen Impfstoff erhalten hatten, klinische Anzeichen von hochpathogener Influenza einschließlich einem Anschwellen und einer Cyanose im Gesicht und Kamm, Blutungen an den Füßen und Lähmungen. Die Mehrheit dieser Vögel starb. Die geimpften Vögel schieden keine nachweisbaren Mengen von Ty/Ire, aber Ck/Penn aus.AT 408 549 B (a) Blood was drawn from the 5-week-old birds before vaccination, which was tested in HIV and neutralization tests; none contained detectable levels of antibody; the results are not shown. Blood was drawn from the 2-day-old chickens 6 weeks after vaccination (Post-1) and the 5-week-old birds 5 weeks after vaccination (Post-1), and blood was drawn from both groups 2 weeks after the stress infection (Post-2) Numbers represent mean antibody titers from the same group of chickens as described in Table I. (B) Numbers in parentheses indicate how much survived the stress infection. <= Less than 10 (c) Hemagglutination inhibition (HI) tests were performed in microtiter plates, using receptor-destroying enzyme-treated sera (4 HA units of Ty / Ire Virus, and 0.5% chicken erythrocytes as described in Palmer et al., Immun. Seiros No. 6, 51-52, U.S. Dept. Health, Education and Welfare (1975). The infectivity neutralization tests were carried out by incubating 103 EID50 of Ty / Ire virus with dilutions of the sera for 30 minutes at room temperature, which was impregnated with aliquots in Eggs followed, virus growth was determined by hemagglutination tests after incubation of the eggs for 2 days at 33 ° C. Chickens inoculated with the recombinant poultry-H5 (vFP-11) or inactivated H5N2 influenza vaccine in adjuvant were prior to the challenge infection with the homologous Ty / Ire (H5N8) influenza virus and the related but distinguishable Ck / Penn (H5N2) influenza virus protected. In contrast, the majority of birds vaccinated or not vaccinated with the parent FPV showed clinical signs of highly pathogenic influenza including swelling and cyanosis of the face and crest, bleeding from the feet and paralysis. The majority of these birds died. The vaccinated birds excreted no detectable amounts of Ty / Irish, but Ck / Penn.
Sowohl die inaktivierten als auch die rekombinanten Impfstoffe induzierten Hl und neutralisierende Antikörper auf Ty/Ire, doch die Mengen an Antikörper, die von der Geflügelpocken-H5-Rekombinante vFP-11 vor der Belastungsinfektion induziert waren, hemmten nicht HA oder neutralisierten das heterologe Ck/Penn H5. Ungeachtet dessen waren die Hühner vor einer Belastungsinfektion sowohl mit Ty/Ire als auch mit Ck/Penn-Influenzaviren geschützt.Both the inactivated and recombinant vaccines induced Hl and neutralizing antibodies to Ty / Ire, but the levels of antibodies induced by poultry pox H5 recombinant vFP-11 prior to the stress infection did not inhibit HA or neutralized the heterologous Ck / Penn H5. Regardless, the chickens were protected from exposure infection with both Ty / Ire and Ck / Penn influenza viruses.
Durch Impfung mit vFP-11 induzierte Immunität gegen H5-Influenza dauerte mindestens 4 bis 6 Wochen und war kreuzreagierend. Zum Nachweis der Dauer und Spezifität der Antwort wurde eine Gruppe von 4 Wochen alten Hühnern in das Flügelnetzgewebe mit vFP-11 wie zuvor beschrieben geimpft und in monatlichen Abständen mit dem kreuzreagierenden Ck/Penn-Virus einer Belastungsinfektion ausgesetzt. Wiederum waren keine Hl-Antikörper vor der Belastungsinfektion nachweisbar. Ungeachtet dessen waren die Vögel auch nach 4 Monaten geschützt.VFP-11 vaccination-induced immunity to H5 influenza lasted at least 4 to 6 weeks and was cross-reactive. To demonstrate the duration and specificity of the response, a group of 4-week-old chickens were vaccinated with vFP-11 in the wing mesh as described above and exposed to the cross-reacting Ck / Penn virus at monthly intervals. Again, no HIV antibodies were detectable before the stress infection. Regardless, the birds were protected even after 4 months.
Außerdem induziert das durch vFP-11 exprimierte H5 eine schützende Immunantwort in Truthühnern. Weiße Outbread-Truthühner wurden im Alter von 2 Tagen und 4 Wochen durch Beimp-fung am Flügelnetzwerk wie vorbeschrieben beimpft. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt. 21In addition, the H5 expressed by vFP-11 induces a protective immune response in turkeys. White outbread turkeys were inoculated at the age of 2 days and 4 weeks by inoculation on the wing network as described above. The results are summarized in Table X. 21
AT 408 549 B ω c x: :3 -C *-* 3 H c o >ja 3 x: 0 CO1 Q) tsAT 408 549 B ω c x:: 3 -C * - * 3 H c o > ja 3 x: 0 CO1 Q) ts
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In beiden Altersgruppen wurde eine signifikante Überlebensrate gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Ty/Ire-Virus beobachtet. Nicht geimpfte Kontaktkontrollvögel wurden zusammen mit den geimpften Vögeln gehalten, um eine Verbreitung des rekombinanten Virus zu prüfen. Diese Vögel überlebten die Belastungsinfektion nicht.A significant survival rate against stress infection with the homologous Ty / Ire virus was observed in both age groups. Non-vaccinated contact control birds were kept with the vaccinated birds to test for the spread of the recombinant virus. These birds did not survive the stress infection.
Beispiel 11Example 11
Konstruktion der das Hühnerinfluenza-Nucleoprotein (NPI-Gen exprimierenden Geflüaelpok- kenvirus FP-1-Rekombinante vFP-12Construction of the chicken influenza nucleoprotein (NPI gene expressing poultry pox virus FP-1 recombinant vFP-12
Das Plasmid pNP33 enthält einen cDNA-Clon des Influenzavirus Hühner/Pennsylvania/1/83 Nucleoproteingens (NP). Nur die 5'-und 3-Enden des etwa 1,6 Kbp langen NP-Gens wurden sequenziert. NP wurde aus pNP 33 in mit Sma I verdautem pUC 9 überführt als ein stumpfendiges 5' Cla I-Xho I 3'-Fragment, wobei die pUC 9-Eco Rl-Stelle am 3'-Ende war, wodurch pRW 714 erzeugt wurde. Das Translationsstartcodon (ATG) von NP enthält die folgende unterstrichene Aha »-Stelle: ATGGCGTC. Der vorher beschriebene Vaccinia H6-Promotor wurde mit NP mittels eines doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids verbunden. Das synthetische Oligonucleotid enthielt die H6-Sequenz von der Eco RV-Stelle bis zum ATG und bis zur NP codierenden Sequenz an der Aha Il-Stelle. Das Oligonucleotid wurde mit Enden, die mit Barn Hl und Eco RI kompatibel waren, zur Insertion in pUC 9 synthetisiert und führte zu pRW 755. Beginnend an dem mit Barn Hl kompatiblen Ende, mit dem ATG unterstrichen, ist die Sequenz des doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids die folgende:The plasmid pNP33 contains a cDNA clone of the influenza virus Chicken / Pennsylvania / 1/83 nucleoprotein gene (NP). Only the 5 'and 3 ends of the approximately 1.6 kbp NP gene were sequenced. NP was converted from pNP 33 into pUC 9 digested with Sma I as a blunt-ended 5 'Cla I-Xho I 3' fragment with the pUC 9 Eco Rl site at the 3 'end, producing pRW 714. NP's translation start codon (ATG) contains the following underlined aha »position: ATGGCGTC. The Vaccinia H6 promoter previously described was linked to NP using a double stranded synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contained the H6 sequence from the Eco RV site to the ATG and to the NP coding sequence at the Aha II site. The oligonucleotide was synthesized with ends compatible with Barn HI and Eco RI for insertion into pUC 9 and led to pRW 755. Starting at the end compatible with Barn HI with the ATG underlined, the sequence of the double-stranded synthetic oligonucleotide is that the following:
GAT CCG ATAT CCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGT CG GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA Das lineare Produkt eines teilweisen Verdaus von pRW 755 mit Aha II wurde isoliert und nachgespalten mit Eco RI. Das pRW 755-Fragment, das einen einzigen Aha »-Schnitt am ATG enthielt und mit Eco RI nachgespalten war, wurde isoliert, mit Phosphatase behandelt, und als Vektor für das Verdauungsprodukt von pRW 714 (siehe nachstehend) benutztGAT CCG ATAT CCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGT CG GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA The linear product of a partial digestion of pRW 755 with Aha II was isolated and subsequently cleaved with Eco RI. The pRW 755 fragment, which contained a single Aha »section on the ATG and was cleaved with Eco RI, was isolated, treated with phosphatase and used as a vector for the digest of pRW 714 (see below)
Das isolierte, lineare Produkt eines Partialverdaus mit Aha II von pRW 714 wurde mit Eco RI nachgespalten. Ein die codierende Sequenz für NP enthaltendes isoliertes Aha Il-Eco RI Fragment von etwa 1,6 Kbp wurde in den pRW 755 Vektor eingesetzt und führte zu pRW 757. Der vollständige H6-Promotor wurde gebildet, indem die Sequenzen oberhalb (5') der Eco RV-Stelle hinzugefügt wurden. Das Plasmid pRW 742B (beschrieben in Beispiel 4) hatte die H6-Sequenz unterhalb (3‘) der Eco RV-Stelle mit den Sequenzen bis zu der Nde I Stelle in pUC 9 entfernt. Das mit Phosphatase behandelte Eco RV-Nde I Fragment von pRW 742B wurde als Vektor für das pRW 757-Frag-ment (siehe nachstehend) benutzt. Das isolierte lineare Produkt eines Partialverdaus von pRW 757 mit Eco RV wurde nach einer Spaltung mit Nde I wiedergewonnen; dieses Fragment enthält den H6-Promotor von der Eco RV-Stelle über NP bis zu der Nde I Stelle in pUC 9. Das pRW 757-Frag-ment wurde in den pRW 742B-Vektor inseriert und bildete pRW 758. Das Eco RI Fragment von pRW 758, das das vom H6-Promotor abhängige vollständige NP enthält, wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I an den Enden glatt gemacht und in die Hinc Il-Stelle von pRW 731.13 inseriert und ergab pRW 760. Die Hinc II Stelle von pRW 731.13 ist der FP-1-Genort, der in Beispiel 6 zur Konstruktion von vFP-6 und vFP-7 verwendet wurde.The isolated, linear product of a partial digest with Aha II from pRW 714 was cleaved with Eco RI. An isolated Aha Il-Eco RI fragment containing the coding sequence for NP of about 1.6 Kbp was inserted into the pRW 755 vector and led to pRW 757. The complete H6 promoter was formed by the sequences above (5 ') the Eco RV site were added. The plasmid pRW 742B (described in Example 4) had removed the H6 sequence below (3 ') the Eco RV site with the sequences up to the Nde I site in pUC 9. The phosphatase treated Eco RV-Nde I fragment of pRW 742B was used as a vector for the pRW 757 fragment (see below). The isolated linear product of a partial digest of pRW 757 with Eco RV was recovered after cleavage with Nde I; this fragment contains the H6 promoter from the Eco RV site via NP to the Nde I site in pUC 9. The pRW 757 fragment was inserted into the pRW 742B vector and formed pRW 758. The Eco RI fragment from pRW 758, which contains the complete NP dependent on the H6 promoter, was blunt-ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I and inserted into the Hinc II site of pRW 731.13 to give pRW 760. The Hinc II site pRW 731.13 is the FP-1 locus used in Example 6 to construct vFP-6 and vFP-7.
Unter Benutzung von Geflügelpocken FP-1 als auffangendem Virus wurde das Plasmid pRW 760 für einen jn vitro Rekombinationstest verwendet. Die Plaques der Nachkommenschaft wurden getestet und gereinigt mittels in sjtu Plaquehybridisierung. Expression des Gens wurde durch Immunpräzipitationsstudien unter Benutzung eines polyclonalen Ziegen-anti-NP-Antiserums bestätigt. Die Größe des Proteins, das insbesondere aus einem Lysat von mit vFP-12 infizierten CEF-Zellen präzipitiert wurde, war etwa 55 kD, was innerhalb des veröffentlichten Bereichs von Influen-zanucleoproteinen liegt.Using fowlpox FP-1 as a catching virus, the plasmid pRW 760 was used for an in vitro recombination test. The offspring's plaques were tested and cleaned using in sjtu plaque hybridization. Expression of the gene was confirmed by immunoprecipitation studies using a goat anti-NP polyclonal antiserum. The size of the protein that was particularly precipitated from a lysate of CEF cells infected with vFP-12 was about 55 kD, which is within the published range of influenza nucleoproteins.
Beispiel 12Example 12
Produktion einer Voaelinfluenza-Nucleoprotein (NP)- und Hämaoalutinin (HAI-Gene exprimierenden Doppelrekombinante vFP-15 von Geflüaelpockenvirus 23Production of a double recombinant vFP-15 from poultry pox virus 23 expressing Voaelinfluenza nucleoprotein (NP) - and haemoalutinin (HAI genes)
AT 408 549 BAT 408 549 B
Das Hämagglutinin (HA)-Gen aus A/Tyr/lre/1378/83 wurde im Zusammenhang mit der Konstruktion von vFP-1 1 (Beispiel 9) beschrieben. Bei der Herstellung der Doppelrekombinante wurde das HA-Gen zuerst in den zuvor bei der Herstellung von vFP-8 unter Benutzung des Plasmids pRW 731.15 beschriebenen Locus f8 gebracht.The hemagglutinin (HA) gene from A / Tyr / lre / 1378/83 has been described in connection with the construction of vFP-1 1 (Example 9). When producing the double recombinant, the HA gene was first brought into the locus f8 previously described in the production of vFP-8 using the plasmid pRW 731.15.
Das zur Konstruktion von vFP-11 benutzte Plasmid war pRW 759. Das mit den H6-Promotor verbundene Hämagglutiningen wurde aus diesem Plasmid durch einen partialen Verdau mit Pst I entfernt. Dieses Fragment wurde dann an den Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I glatt gemacht, in die glattgemachte Barn Hl-Stelle von pRW 731.15 inseriert und ergab so pRW 771.The plasmid used to construct vFP-11 was pRW 759. The hemagglutinin gene linked to the H6 promoter was removed from this plasmid by partial digestion with Pst I. This fragment was then blunt-ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I, inserted into the blunted Barn HI site of pRW 731.15 to give pRW 771.
Das Plasmid pRW 771 wurde dann in einen in vitro Rekombinationstest unter Benutzung von vFP-12 als auffangendem Virus eingesetzt. Das rekombinante Virus vFP-12 enthält das mit dem H6-Promotor verbundene Nucleoproteingen am Genort f7, wie er im Plasmid pRW 731.13 definiert ist. Rekombinante Plaques, die nun beide Insertionen enthielten, wurden ausgewählt und mittels in situ Hybridisierung und Oberflächenexpression des Hämagglutinins plaque-gereinigt, was durch einen protein-A-ß-galactosidase-verbundenen Immuntest bestätigt wurde. Die Expression beider Gene wurde durch Immunpräzipitation aus mit dem doppelrekombinanten Virus vFP-15 infizierten Zellysaten nachgewiesen.The plasmid pRW 771 was then used in an in vitro recombination test using vFP-12 as the trapping virus. The recombinant virus vFP-12 contains the nucleoprotein gene connected to the H6 promoter at the f7 locus as defined in the plasmid pRW 731.13. Recombinant plaques, which now contained both insertions, were selected and plaque-cleaned by in situ hybridization and surface expression of the hemagglutinin, which was confirmed by a protein-A-ß-galactosidase-linked immunoassay. The expression of both genes was detected by immunoprecipitation from cell lysates infected with the double recombinant virus vFP-15.
Beispiel 13Example 13
Konstruktion von rekombinanten KanarienpockenvirenConstruction of recombinant canarypox viruses
Das folgende Beispiel zeigt die Identifizierung von vier nicht-essentiellen Insertions-Loci in dem Kanarienpockengenom und die Konstruktion von vier rekombinanten Kanarienpockenviren vCP-16, vCP-17, vCP-19 und vCP-20.The following example shows the identification of four non-essential insertion loci in the canarypox genome and the construction of four recombinant canarypox viruses vCP-16, vCP-17, vCP-19 and vCP-20.
Die Kanarienpocken-Rekombinante vCP-16 wurde wie folgt hergestellt.The canarypox recombinant vCP-16 was prepared as follows.
Ein 3,4 Kbp Pvu II Fragment von Kanarienpocken-DNA wurde in pUC 9 cloniert und führte zu pRW 764.2. Es wurde eine singuläre Eco Rl-Stelle gefunden, die asymmetrisch in dem Fragment mit einem kurzen Arm von 700 bp und einem langen Arm von 7,2 Kbp liegt. Das Plasmid wurde mit Eco RI verdaut und unter Verwendung von Klenow-Fragment der DNA-Polymerase J glattendig gemacht. Das glattendige H6/Tollwut G-Gen wurde danach mit dieser Stelle ligiert und zur Transformation von E. coli benutzt. Das daraus hervorgehende Plasmid pRW 775 wurde für einen in vitro Rekombinationstest benutzt. In einem Immunoscreen-Verfahren positive Nachkommenplaques wurden ausgewählt und plaque-gereinigt. Die daraus hervorgehende Rekombinante wurde als vCP-16 und der Insertions-Locus als C3 bezeichnet.A 3.4 Kbp Pvu II fragment of canarypox DNA was cloned into pUC 9 and resulted in pRW 764.2. A unique Eco R1 site was found to be asymmetric in the fragment with a short arm of 700 bp and a long arm of 7.2 Kbp. The plasmid was digested with Eco RI and blunt-ended using Klenow fragment of DNA polymerase J. The blunt-ended H6 / rabies G gene was then ligated to this site and used to transform E. coli. The resulting plasmid pRW 775 was used for an in vitro recombination test. Offspring plaques positive in an immunoscreen method were selected and plaque-cleaned. The resulting recombinant was named vCP-16 and the insertion locus C3.
Das in der vorstehenden Konstruktion benutzte Plasmid pRW 764.2 enthielt außerdem eine singuläre Bgl Il-Stelle etwa 2,4 Kbp von der Eco Rl-Stelle entfernt. Unter Benutzung der gleichen Clonierungsstrategie wurde das H6/Tollwut G Gen mit dem Plasmid pRW 764.2 an dieser Stelle ligiert und führte zu pRW 774. Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion der Rekombinante vCP-17 mit dem als C4 bezeichneten insertionslocus benutzt.The plasmid pRW 764.2 used in the above construction also contained a singular Bgl II site approximately 2.4 Kbp from the Eco Rl site. Using the same cloning strategy, the H6 / rabies G gene was ligated to plasmid pRW 764.2 at this point and resulted in pRW 774. This plasmid was used to construct recombinant vCP-17 with the insertion locus designated C4.
Das Plasmid pRW 764.5 enthält ein 850 bp Pvu Il-Fragment von Kanarienpocken-DNA mit einer singulären Bgl Il-Stelle, die asymmetrisch in dem Fragment 400 bp von einem Ende liegt. Unter Benutzung der wie vorher beschriebenen Clonierungsstrategie wurde das mit dem H6-Promotor verbundene Tollwut G-Gen an dieser Stelle inseriert und ergab das Plasmid pRW 777. Das damit hergestellte stabile rekombinante Virus wurde als vCP-19 und der Insertionslocus als C5 bezeichnet.The plasmid pRW 764.5 contains an 850 bp Pvu II fragment of canarypox DNA with a unique Bgl II site which is asymmetrically located in the 400 bp fragment from one end. Using the cloning strategy as previously described, the rabies G gene linked to the H6 promoter was inserted at this point and yielded the plasmid pRW 777. The stable recombinant virus thus produced was designated as vCP-19 and the insertion locus as C5.
Plasmid pRW 764.7 enthält ein 1,2 Kbp Pvu Il-Fragment mit einer singulären Bgl Il-Stelle 300 Basen von einem Ende. Dieses Plasmid wurde mit Bgl II verdaut und mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I an den Enden glatt gemacht. Das an den Enden glatt gemachte lac Z-Gen mit dem 11K-Promotor wurde eingefügt und führte zu Plasmid pRW 778. Das unter Benutzung dieses Plasmids hergestellte stabile rekombinante Virus wurde als VCP-20 und der Insertionslocus als C6 bezeichnet. 24Plasmid pRW 764.7 contains a 1.2 Kbp Pvu II fragment with a unique Bgl II site 300 bases from one end. This plasmid was digested with Bgl II and blunt-ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I. The flattened lac Z gene with the 11K promoter was inserted and resulted in plasmid pRW 778. The stable recombinant virus produced using this plasmid was named VCP-20 and the insertion locus as C6. 24th
AT 408 549 BAT 408 549 B
Beispiel 14Example 14
Konstruktion eines das Fusionsprotein von Newcastle Disease Virus exprimierenden rekombi- nanten Geflüaelpockenvirus vFP-29Construction of a recombinant poultrypox virus vFP-29 expressing the Newcastle Disease Virus fusion protein
Plasmid pNDV 108, der cDNA-Clon des Fusionsgens von NDV-Stamm Texas, besteht aus einem Hpa I cDNA-Fragment von etwa 3,3 Kbp, das sowohl die codierende Sequenz für das Fusionsprotein als auch zusätzliche, in die Sca I-Stelle von pBR 322 clonierte, codierende NDV-Sequenzen enthält. Schritte zur Herstellung des Insertionsplasmids sind nachstehend beschrieben. (1) Herstellung von Plasmid pCE 11Plasmid pNDV 108, the cDNA clone of the NDV strain Texas fusion gene, consists of an Hpa I cDNA fragment of approximately 3.3 Kbp, which contains both the coding sequence for the fusion protein and additional into the Sca I site of pBR 322 contains cloned, coding NDV sequences. Steps to prepare the insertion plasmid are described below. (1) Preparation of plasmid pCE 11
Ein FPV-lnsertionsvektor, pCE 11, wurde durch Einfügen von Polylinkern an der Hinc Il-Stelle von pRW 731.13 hergestellt (bezeichnet als Locus f7). pRW 731.13 enthält ein 5,5 Kbp Pvu II-Fragment von FP-1-DNA. Ein nicht-essentieller Locus wurde vorstehend definiert an der Hinc Il-Stelle durch Konstruktion der in Beispiel 6 beschriebenen stabilen Rekombinante vFP-6. Die an der Hinc Il-Steile eingefügten Polylinker enthalten die folgenden Restriktionsenzym-Schnittstellen: Nru I, Eco RI, Sac I, Κρη I, Sma I, Barn Hl, Xba I, Hinc II, Sal I, Acc I, Pst 1, Sph I, Hind III und Hpa I. (2) Herstellung von Plasmid pCE 19An FPV insertion vector, pCE 11, was constructed by inserting polylinkers at the Hinc II site of pRW 731.13 (designated locus f7). pRW 731.13 contains a 5.5 Kbp Pvu II fragment of FP-1 DNA. A non-essential locus was defined above at the Hinc II site by constructing the stable recombinant vFP-6 described in Example 6. The polylinkers inserted on the Hinc Il steeple contain the following restriction enzyme sites: Nru I, Eco RI, Sac I, Κρη I, Sma I, Barn Hl, Xba I, Hinc II, Sal I, Acc I, Pst 1, Sph I, Hind III and Hpa I. (2) Preparation of plasmid pCE 19
Dieses Plasmid ist eine weitere Modifikation von pCE 11, in das das Vacciniavirus-Transkrip-tionstoppsignal AIIII I NT (L. Yuen und B. Moss, J. Virology, Bd. 60 (1986), Seiten 320-323) (in diesem Fall ist N ein A) zwischen die Sac I- und Eco Rl-Stellen von pCE 11 mit Verlust der Eco Rl-Stelle eingefügt worden ist. (3) Einfügung von codierenden NDV-SequenzenThis plasmid is a further modification of pCE 11 in which the vaccinia virus transcription stop signal AIIII I NT (L. Yuen and B. Moss, J. Virology, Vol. 60 (1986), pages 320-323) (in this case) N is an A) has been inserted between the Sac I and Eco Rl sites of pCE 11 with loss of the Eco Rl site. (3) Insertion of coding NDV sequences
Ein über ein Ge! gereinigtes 1,8 Kbp Bam Hl-Fragment, das mit Ausnahme von 22 Nucleotiden vom 5'-Ende des Fusionsproteingens alle Nucleotide enthielt, wurde in die Bam Hl-Stelle von pUC 18 eingefügt und bildete pCE 13. Dieses Plasmid wurde mit Sal I verdaut, das in dem Vektor 12 Basen oberhalb des 5'-Endes der codierenden Sequenz spaltet. Die Enden wurden mit dem Kie-now-Fragment der DNA Polymerase I aufgefüllt und das Plasmid anschließend mit Hind III verdaut, das 18 Basen oberhalb der Sal I-Stelle spaltet. Ein über ein Gel gereinigtes 146 bp Sma I - Hind lll-Fragment, das den in den bevorzugten Ausführungsformen beschriebenen Vacciniavirus-H6-Pro-motor sowie auch Polylinkersequenzen an jedem Ende enthielt, wurde mit dem Vektor ligiert und in E. coli Zellen transformiert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pCE 16 bezeichnet.One over a Ge! Purified 1.8 Kbp Bam HI fragment containing all of the nucleotides except 22 nucleotides from the 5 'end of the fusion protein gene was inserted into the Bam HI site of pUC 18 and formed pCE 13. This plasmid was digested with Sal I that cleaves 12 bases above the 5 'end of the coding sequence in the vector. The ends were filled in with the Kie-now fragment of DNA polymerase I and the plasmid was then digested with Hind III, which cleaves 18 bases above the Sal I site. A gel-purified 146 bp Sma I - Hind III fragment containing the vaccinia virus H6 promoter described in the preferred embodiments as well as polylinker sequences at each end was ligated to the vector and transformed into E. coli cells. The resulting plasmid was named pCE 16.
Um das ATG Startcodon des NDV-Fusionproteingens mit dem 3-Ende des H6-Promotors in Ablesephase zu bringen und die in pCE 16 vom NDV 5-Ende fehlenden 22 Nucleotide zu ersetzen, wurde ein komplementäres synthetisches Oligonucleotid mit Eco RV-und Kpn I-Stellen an den Enden entwickelt. Die Oligonucleotidsequenz war: 5' - ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC- AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3'.In order to bring the ATG start codon of the NDV fusion protein gene with the 3 end of the H6 promoter into reading phase and to replace the 22 nucleotides missing from the NDV 5 end in pCE 16, a complementary synthetic oligonucleotide with Eco RV and Kpn I Places developed at the ends. The oligonucleotide sequence was: 5 '- ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3'.
Die Konstruktion pCE 16 wurde anschließend mit Eco RV und Kpn I verdaut. Die Eco RV-Stelle liegt in dem H6 Promotor 24 Basen oberhalb des Initiations-ATG. Die Kpn I-Stelle liegt in der codierenden NDV Sequenz 29 Basen unterhalb des ATG.The construction pCE 16 was then digested with Eco RV and Kpn I. The Eco RV site is 24 bases above the initiation ATG in the H6 promoter. The Kpn I site is 29 bases below the ATG in the coding NDV sequence.
Die Oligonucleotide wurden miteinander hybridisiert, phosphoryliert und mit dem linearisierten Plasmid verbunden. Die daraus hervorgehende DNA wurde zur Transformation von E. coli Zellen benutzt. Dieses Plasmid wurde als pCE 18 bezeichnet.The oligonucleotides were hybridized, phosphorylated and linked to the linearized plasmid. The resulting DNA was used to transform E. coli cells. This plasmid was named pCE 18.
Zur Insertion codierender NDV-Sequenzen in einen FPV Insertionsvektor wurde ein über ein Gel gereinigtes 1,9 Kbp Sma I-Hind lll-Fragment von pCE 18 (wobei in der Polylinkerregion gespalten wird) mit einem 7,8 Kbp Sma I-Hind lll-Fragment von pCE 19 (wie vorstehend beschrieben) ligiert. Das Transkriptionsstartsignal liegt 16 Basen unterhalb der Sma I-Stelle. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pCE 20 bezeichnet. 25For insertion of coding NDV sequences into an FPV insertion vector, a gel-purified 1.9 Kbp Sma I-Hind III fragment of pCE 18 (which is cleaved in the polylinker region) was mixed with a 7.8 Kbp Sma I-Hind III. Fragment of pCE 19 ligated (as described above). The transcription start signal is 16 bases below the Sma I site. The resulting plasmid was named pCE 20. 25th
AT 408 549 BAT 408 549 B
Das Plasmid pCE 20 wurde in einem in vitro Rekombinationstest eingesetzt, wobei Geflügelpockenvirus FP-1 als auffangendes Virus benutzt wurde. Die daraus hervorgehende Nachkommenschaft wurde auf CEF-Monolayers plattiert und die Plaques wurden einem ß-Galactosidase-Protein-A Immuntest unter Verwendung eines polyclonalen Hühner-anti-NDV-serums unterworfen. In der Färbung positive Plaques wurden ausgewählt und 4 Runden einer Plaquereinigung unterzogen, um eine homogene Population zu erhalten. Die Rekombinante wurde vFP-29 genannt.The plasmid pCE 20 was used in an in vitro recombination test, using fowlpox virus FP-1 as the catching virus. The resulting progeny was plated on CEF monolayers and the plaques were subjected to a β-galactosidase protein A immunoassay using a chicken polyclonal anti-NDV serum. Plaques positive in staining were selected and plaque cleaning was performed for 4 rounds to obtain a homogeneous population. The recombinant was named vFP-29.
Beispiel 15Example 15
Konstruktion von Katzen leukämievirus-(FeLV1 Hüll-fENVT-GIvkoprotein exorimierende Avipox- virusrekombinantenConstruction of feline leukemia virus (FeLV1 envelope fENVT glucoprotein exorimizing Avipox virus recombinants
Das FeLV-env-Gen enthält die Sequenzen, welche das p70 + p15E Polyprotein codieren. Dieses Gen wurde zunächst in das Plasmid pSD467vC mit dem dem FeLV-env-Gen vorangestellten Vaccinia H6-Promotor eingefügt. Zuvor wurde das Plasmid pSD467vC durch die Einfügung eines 1802 bp Sal I/Hind Ill-Fragments, das das Vaccinia-Hämagglutinin (HA)-Gen enthält, in einen pUC 18 Vektor erhalten. Die Lage des HA-Gens wurde zuvor bestimmt (Shida, Virology, Bd. 150 (1988), Seiten 451-462). Die Mehrheit des das HA-Genprodukt codierenden offenen Leserahmens wurde deletiert (Nucleotid 443 bis Nucleotid 1311) und eine multiple Clonierungsstelle, die Bgl II-, Sma I-, Pst I- und Eag I-Restriktionsendonucleasesteilen enthielt, eingefügt. Das resultierende Plasmid pSD467vC enthält flankierende Arme aus Vaccinia von 442 bp aufwärts 5-seitig von der multiplen Clonierungsstelle und 491 bp 3-seitig von diesen Restriktions-Schnittstellen. Diese flankierenden Arme ermöglichen es, daß in die multiple Clonierungsregion eingefügtes Material in die HA-Region des Kopenhagen-Stamms von Vaccinavirus rekombiniert werden kann. Die daraus hervorgehende rekombinante Nachkommenschaft ist HA-negativ.The FeLV env gene contains the sequences encoding the p70 + p15E polyprotein. This gene was first inserted into the plasmid pSD467vC with the vaccinia H6 promoter preceding the FeLV env gene. Plasmid pSD467vC was previously obtained by inserting a 1802 bp Sal I / Hind III fragment containing the vaccinia hemagglutinin (HA) gene into a pUC 18 vector. The location of the HA gene was previously determined (Shida, Virology, Vol. 150 (1988), pages 451-462). The majority of the open reading frame encoding the HA gene product was deleted (nucleotide 443 to nucleotide 1311) and a multiple cloning site containing Bgl II, Sma I, Pst I and Eag I restriction endonuclease portions was inserted. The resulting plasmid pSD467vC contains flanking vaccinia arms from 442 bp upwards 5-sided from the multiple cloning site and 491 bp 3-sided from these restriction sites. These flanking arms allow material inserted into the multiple cloning region to be recombined into the HA region of the Copenhagen strain of vaccinia virus. The resulting recombinant progeny is HA negative.
Der H6-Promotor war synthetisiert worden durch das Aneinanderhängen von vier überlappenden Oligonucleotiden, die zusammen die vorstehend in den bevorzugten Ausführungsformen beschriebene vollständige Sequenz umfaßten. Das daraus hervorgehende 132 bp-Fragment enthielt eine Bgl ll-Restriktions-Schnittstelle am 5-Ende und eine Sma I-Stelle am 3'-Ende. Dieses wurde in pSD467vC über die Bgl ll-und Sma (-Restriktions-Schnittstellen eingefügt. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pPT15 bezeichnet. Das FeLV-env-Gen wurde in die unmittelbar 3'-seitig von dem H6-Promotor liegende singuläre Pst I-Stelle von pPT15 inseriert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pFeLVIA bezeichnet.The H6 promoter was synthesized by the attachment of four overlapping oligonucleotides, which together comprised the complete sequence described above in the preferred embodiments. The resulting 132 bp fragment contained a Bgl II restriction site at the 5 end and an Sma I site at the 3 'end. This was inserted into pSD467vC via the Bgl II and Sma (restriction sites. The resulting plasmid was named pPT15. The FeLV env gene was inserted into the unique Pst I located immediately 3 'to the H6 promoter Site of pPT15, and the resulting plasmid was named pFeLVIA.
Zur Konstruktion der FP-1 Rekombinante wurde die 2,4 Kbp H6/FeLV-env-Sequenz aus pFeLVIA durch Spaltung mit Bgl II und partielle Spaltung mit Pst I ausgeschnitten. Die Bgl Il-Stelle liegt an der 5'-Grenze der H6-Promotorsequenz. Die Pst I Stelle liegt 420 bp nach dem Terminationssignal der Translation für den offenen Leserahmen des Hüll-Glykoproteins.To construct the FP-1 recombinant, the 2.4 Kbp H6 / FeLV env sequence was cut out from pFeLVIA by cleavage with Bgl II and partial cleavage with Pst I. The Bgl II site is at the 5 'border of the H6 promoter sequence. The Pst I site is 420 bp after the termination signal of translation for the open reading frame of the envelope glycoprotein.
Die 2,4 Kbp H6/FeLV-env-Sequenz wurde in mit Barn Hl und Pst I gespaltenen pCE 11 eingefügt. Der FP-1-Insertionsvektor, pCE 11, leitet sich ab von pRW 731.13 durch Einfügung einer multiplen Clonierungsstelle in die nicht-essentielle Hinc Il-Stelle. Dieser Insertionsvektor gestattet die Herstellung von FP-1-Rekombinanten, die fremde Gene im Locus f7 des FP-1 Genoms enthalten. Das rekombinante FP-1/FeLV-lnsertionsplasmid wurde als pFeLVFI bezeichnet. Diese Konstruktion bietet kein vollständiges ATG zur ATG-Substitution.The 2.4 Kbp H6 / FeLV env sequence was inserted into pCE 11 digested with Barn HI and Pst I. The FP-1 insertion vector, pCE 11, is derived from pRW 731.13 by inserting a multiple cloning site into the non-essential Hinc II site. This insertion vector allows the production of FP-1 recombinants which contain foreign genes in the f7 locus of the FP-1 genome. The recombinant FP-1 / FeLV insertion plasmid was named pFeLVFI. This construction does not offer a complete ATG for ATG substitution.
Um eine vollständige ATG:ATG-Konstruktion zu erreichen, wurde ein Nru I/Sst Il-Fragment von etwa 1,4 Kbp aus dem Vacciniavirusinsertionsvektor pFeLVIC abgeleitet. Die Nru I-Stelle liegt innerhalb des H6-Promotors in einer Position von 24 bp oberhalb von dem ATG. Die Sst Il-Stelle liegt 1,4 Kbp 3'seitig des ATG und 1 Kbp 5’seitig von dem Terminationssignal der Translation. Dieses Nru l/Sst Il-Fragment wurde mit einem 9,9 Kbp-Fragment ligiert, das durch Verdau mit Sst II und partiellen Verdau mit Nru I erzeugt war. Dieses 9,9 Kbp-Fragment enthält die 5,5 Kbp der FP-1 flankierenden Arme, die pUC Vektorsequenzen, 1,4 Kbp an den dem 3'-Ende des env-Gens entsprechenden Abschnitten der FeLV-Sequenz und die Sequenz ganz am 5-Ende des H6-Promotors (ca. 100 bp). Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pFeFLVF2 bezeichnet Die ATG:ATG-Konstruktion wurde durch Nucleotidsequenzanalyse bestätigt.In order to achieve complete ATG: ATG construction, a Nru I / Sst II fragment of approximately 1.4 kbp was derived from the vaccinia virus insertion vector pFeLVIC. The Nru I site is within the H6 promoter at a position 24 bp above the ATG. The Sst Il site is 1.4 Kbp 3 on the ATG and 1 Kbp 5 on the translation termination signal. This Nru I / Sst II fragment was ligated to a 9.9 Kbp fragment generated by digestion with Sst II and partial digestion with Nru I. This 9.9 Kbp fragment contains the 5.5 Kbp of the FP-1 flanking arms, the pUC vector sequences, 1.4 Kbp at the sections of the FeLV sequence corresponding to the 3 'end of the env gene and the sequence at the very end 5-end of the H6 promoter (approx. 100 bp). The resulting plasmid was named pFeFLVF2. The ATG: ATG construction was confirmed by nucleotide sequence analysis.
Ein weiterer FP-1 Insertionsvektor, pFeLVF3, wurde aus pFeLVF2 durch Entfernen der dem wahrscheinlichen Inmunsuppressionsbereich entsprechenden FeLV-env-Sequenzen abgeleitet 26Another FP-1 insertion vector, pFeLVF3, was derived from pFeLVF2 by removing the FeLV env sequences corresponding to the likely immunosuppression region 26
AT 408 549 B (Cianciolo et al., Science, Bd. 230 (1985), Seiten 453-455) (Nucleotid 1548 bis 1628 der codierenden Sequenz). Dieses wurde erreicht durch Isolierung eines Sst Il/Pst I-Fragments (Stellen sind oben beschrieben) von etwa 1 Kbp aus dem Vacciniavirus-Insertionsvektor pFeLVID. Das Plasmid pFeLVID ist ähnlich dem Plasmid pFeLVIC mit der Ausnahme, daß die dem Immunsuppressionsbereich entsprechenden env-Sequenzen (Nucleotid 1548 bis 1628) durch Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 83 (1987), Seiten 7177-7181) entfernt worden waren. Das 1 Kbp Sst Il/Pst I-Fragment ohne die Nucleotide 1548 bis 1628 wurde in ein 10,4 Kbp Sst Il/Pst I-Fragment eingefügt, das das übrige aus pFeLVF2 abgeleitete H6:FeLV-env-Gen enthält.AT 408 549 B (Cianciolo et al., Science, Vol. 230 (1985), pages 453-455) (nucleotide 1548 to 1628 of the coding sequence). This was achieved by isolating a Sst II / Pst I fragment (sites described above) of approximately 1 Kbp from the vaccinia virus insertion vector pFeLVID. The plasmid pFeLVID is similar to the plasmid pFeLVIC with the exception that the env sequences corresponding to the immunosuppression region (nucleotides 1548 to 1628) by oligonucleotide-controlled mutagenesis (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83 (1987)) , Pages 7177-7181) had been removed. The 1 Kbp Sst Il / Pst I fragment without nucleotides 1548 to 1628 was inserted into a 10.4 Kbp Sst Il / Pst I fragment that contains the rest of the H6: FeLV env gene derived from pFeLVF2.
Die Insertionsplasmide, pFeLVF2 und pFeLVF3, wurden für in vitro Rekombinationstests mit FP-1 als dem auffangenden Virus benutzt. Nachkommenschaft der Rekombination wurde auf CEF Monolayer plattiert und rekombinante Viren wurden durch Plaque-Hybridisierung auf CEF Mono-layem ausgewählt. Mittels Hybridisierungsanalyse identifizierte rekombinante Nachkommenschaft wurde ausgewählt und 4 Runden einer Plaquereinigung unterworfen, um eine homogene Population zu erhalten. Eine FP-1-Rekombinante, die das vollständige FeLV-env-Gen enthielt, wurde als vFP-25 und eine FP-1-Rekombinante, die das vollständige Gen mit Ausnahme des Immunsuppressionsbereichs enthielt, als vFP-32 bezeichnet. Für beide Rekombinanten wurde durch Immunpräzipitation unter Benutzung eines polyclonalen Rinder-anti-FeLV polyclonalen Serums (Antibodies, inc., Davis, Ca) gezeigt, daß sie das richtige Genprodukt exprimieren. Es ist von Bedeutung, daß diese FP-1-Rekombinanten das fremde FeLV-env-Gen in der von Katzen stammenden CRFK-Zellinie (ATCC #CCL94) exprimieren.The insertion plasmids, pFeLVF2 and pFeLVF3, were used for in vitro recombination tests with FP-1 as the collecting virus. Progeny of the recombination was plated on CEF monolayer and recombinant viruses were selected by plaque hybridization on CEF monolayer. Recombinant progeny identified by hybridization analysis was selected and subjected to 4 rounds of plaque cleaning to obtain a homogeneous population. An FP-1 recombinant containing the full FeLV env gene was named vFP-25 and an FP-1 recombinant containing the complete gene except for the immunosuppression region was named vFP-32. Both recombinants were shown to express the correct gene product by immunoprecipitation using bovine polyclonal anti-FeLV polyclonal serum (Antibodies, inc., Davis, Ca). It is important that these FP-1 recombinants express the foreign FeLV env gene in the cat-derived CRFK cell line (ATCC # CCL94).
Zur Konstruktion von Kanarienpocken-(CP)-Rekombinanten, wurde ein H6:FeLV-env-Sequen-zen enthaltendes 2,2 Kbp-Fragment aus pFeLVF2 durch Spaltung mit Sma I und Hpa I ausgeschnitten. Die Sma I-Stelle liegt an der 5'-Grenze der H6-Promotorsequenz. Die Hpa I-Stelle liegt 180 bp 3'-seitig von dem Terminationssignal der Translation für den offenen Leserahmen des Hüll-Glykoproteins.To construct canarypox (CP) recombinants, a 2.2 Kbp fragment containing H6: FeLV env sequences was excised from pFeLVF2 by cleavage with Sma I and Hpa I. The Sma I site is at the 5 'border of the H6 promoter sequence. The Hpa I site is 180 bp on the 3 'side of the translation termination signal for the open reading frame of the envelope glycoprotein.
Die 2,2 Kbp H6:FeLV-env-Sequenz wurde in die nicht-essentielle Eco Rl-Stelle des Insertionsplasmids pRW 764.2 eingesetzt, nachdem die Enden der Eco Ri-Stelle glatt gemacht waren. Dieser Insertionsvektor gestattet die Erzeugung von CP-Rekombinanten, die fremde Gene im Locus C4 des CP-Genoms enthalten. Das rekombinante CP-lnsertionsplasmid wurde als pFeLVCP2 bezeichnet. Diese Konstruktion bietet eine perfekte ATG:ATG-Substitution.The 2.2 Kbp H6: FeLV env sequence was inserted into the non-essential Eco Rl site of the insertion plasmid pRW 764.2 after the ends of the Eco Ri site were smoothed. This insertion vector allows the generation of CP recombinants that contain foreign genes in the C4 locus of the CP genome. The recombinant CP insertion plasmid was named pFeLVCP2. This construction offers a perfect ATG: ATG substitution.
Das Insertionsplasmid, pFeLVCP2, wurde in einem in vitro Rekombinationstest mit CP als dem auffangenden Virus eingesetzt. Nachkommenschaft der Rekombinante wurde auf CEF Monolayer plattiert und rekombinantes Virus mittels eines mit Protein-A-verbundenen ß-Galactosidaseimmun-tests unter Verwendung eines kommerziellen polyclonalen Rinder-anti-FeLV Serums (Antibodies, Inc., Davis, CA.) ausgewählt. In der Färbung positive Plaques wurden ausgewählt und 4 Runden einer Plaque-Reinigung unterzogen, um eine homogene Population zu erhalten. Eine Rekombinante, die das gesamte FeLV-env-Gen exprimiert, wurde als vCP-36 bezeichnet.The insertion plasmid, pFeLVCP2, was used in an in vitro recombination test with CP as the catching virus. Progeny of the recombinant was plated on CEF monolayer and recombinant virus was selected using a protein A-linked β-galactosidase immunoassay using a commercial polyclonal bovine anti-FeLV serum (Antibodies, Inc., Davis, CA.). Plaques positive in staining were selected and plaque cleaning was performed for 4 rounds to obtain a homogeneous population. A recombinant that expresses the entire FeLV env gene was named vCP-36.
Beispiel 16Example 16
Konstrunktion von Rous-assoziiertem Virus Tvo 1-/RAV-1 i-Hüll-(env)-Gen exprimierendem rekombinantem Geflüaelpockenvirus vFP-22Construction of Rous-associated virus Tvo 1 / RAV-1 i-envelope (env) gene expressing recombinant poultry pox virus vFP-22
Der Clon penvRVIPT des RAV-1-Hüll-Gens enthält 1,1 Kbp der codierenden Sequenz von RAV-1-env-DNA, cloniert als Kpn I-Sac I-Fragment in M13mp18. Dieses am 5'-Ende vollständige Fragment, dem aber ein Teil der Sequenz am 3'-Ende fehlt, wurde in den folgenden Manipulationen benutzt. Ein über ein Gel gereinigtes 1,1 Kbp Eco Rl-Pst I-Fragment aus penvRVIPT wurde in die Eco RI- und Pst I-Stellen von pUC 9 eingefügt und ergab pRW 756. Dieses Plasmid wurde anschließend mit Kpn I und Hind III gespalten, wodurch der Vektor 59 Basen oberhalb des ATG gespalten wurde. Ein 146 bp Kpn I - Hind Ill-Fragment, das den vorher beschriebenen Vaccinia H6-Promotor enthielt, wurde zur Konstruktion von Plasmid pCE 6 eingefügt.The clon penvRVIPT of the RAV-1 envelope gene contains 1.1 Kbp of the coding sequence of RAV-1 env DNA, cloned as a Kpn I-Sac I fragment in M13mp18. This fragment complete at the 5 'end, but which lacks part of the sequence at the 3' end, was used in the following manipulations. A gel-purified 1.1 Kbp Eco Rl-Pst I fragment from penvRVIPT was inserted into the Eco RI and Pst I sites of pUC 9 and gave pRW 756. This plasmid was then digested with Kpn I and Hind III, whereby the vector was cleaved 59 bases above the ATG. A 146 bp Kpn I - Hind III fragment containing the previously described vaccinia H6 promoter was inserted to construct plasmid pCE 6.
Um sicherzustellen, daß das Initiations ATG des RAV-env-Gens unter Deletion überfälliger Se-quenzen neben dem 3-Ende des H6-Promotors war, wurden zwei komplementäre synthetische Oligonucleotide mit Eco RV- und Ban II-Stellen an den Enden hergestellt. Die Oligonucleotid- 27To ensure that the initiation ATG of the RAV env gene with deletion of overdue sequences was next to the 3 end of the H6 promoter, two complementary synthetic oligonucleotides with Eco RV and Ban II sites at the ends were made. The oligonucleotide 27
AT 408 549 B sequenz war 5’-AT C-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-AT G-AGG-CGA-GCC-3'.AT 408 549 B sequence was 5’-AT C-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-AT G-AGG-CGA-GCC-3 '.
Das Plasmid pCE 6 wurde mit Eco RV gespalten, das in dem H6 Promotor 24 Basen vor dem ATG spaltet, und mit Ban II, das in der RAV-env-codierenden Sequenz 7 Basen nach dem ATG spaltet. Die DNA-Abschnitte wurden ligiert und zur Transformation von E. coli Zellen benutzt. Das daraus hervorgehende Plasmid, pCE 7, stellte den H6-Promotor und die korrekte 5'-Sequenz für die abschließende Konstruktion zur Verfügung.The plasmid pCE 6 was digested with Eco RV, which cleaves 24 bases before the ATG in the H6 promoter, and with Ban II, which cleaves 7 bases after the ATG in the RAV env coding sequence. The DNA sections were ligated and used to transform E. coli cells. The resulting plasmid, pCE 7, provided the H6 promoter and the correct 5 'sequence for the final construction.
Durch Restriktionskartierung wurde gefunden, daß Clon mp19env (190) das vollständige RAV-1-env-Gen enthält. Ein das vollständige Gen enthaltendes 1,9 Kbp Kpn I-Sac I-Fragment von mp19env (190) wurde in die Kpn I- und Sac I-Stellen von pUC 18 eingesetzt und bildete pCE 3. Dieses Plasmid wurde mit Hpa 1, das 132 Basen nach dem Initiations-ATG in der RAV-1 codierenden Sequenz spaltet, und mit Sac I, das am 3'-Ende des Gens spaltet, verdaut. Der vorstehend beschriebene FPV-lnsertionsvektor pCE 11 wurde mit Sma I und Sac I gespalten, die das Plasmid in der Polylinkerregion schneiden. Das Hpa I - Sac I-Fragment von pCE 3 wurde mit pCE 11 ligiert und bildete pCE 14.By restriction mapping it was found that clone mp19env (190) contains the complete RAV-1 env gene. A 1.9 Kbp Kpn I-Sac I fragment from mp19env (190) containing the complete gene was inserted into the Kpn I and Sac I sites of pUC 18 and formed pCE 3. This plasmid was treated with Hpa 1, 132 Bases cleaved after the initiation ATG in the RAV-1 coding sequence, and digested with Sac I, which cleaves at the 3 'end of the gene. The FPV insertion vector pCE 11 described above was digested with Sma I and Sac I that cut the plasmid in the polylinker region. The Hpa I - Sac I fragment from pCE 3 was ligated to pCE 11 and formed pCE 14.
Das Plasmid pCE 7 wurde anschließend mit Xho I und Hind III gespalten, um den H6-Promotor und ein die korrekte 5-Sequenz enthaltendes 332 Basenpaar-Fragment zur Verfügung zu stellen. Plasmid pCE 14 wurde mit Hind III verdaut, das in der Polylinkerregion des Vektors spaltet, und mit Xho I, das in der codierenden Sequenz spaltet. Diese DNA wurde mit dem aus pCE 7 erhaltenen Hind III - Xho I-Fragment verknüpft und bildete pCE 15, die abschließende Konstruktion mit dem RAV-1-Hüll-Gen.The plasmid pCE 7 was then digested with Xho I and Hind III to provide the H6 promoter and a 332 base pair fragment containing the correct 5 sequence. Plasmid pCE 14 was digested with Hind III, which cleaves in the polylinker region of the vector, and with Xho I, which cleaves in the coding sequence. This DNA was linked to the Hind III - Xho I fragment obtained from pCE 7 and formed pCE 15, the final construction with the RAV-1 envelope gene.
Dieses Plasmid wurde in einem in vitro Rekombinationstest mit Geflügelpocken FP-1 als dem aufnehmenden Virus eingesetzt. Die Nachkommenschaft der Rekombination wurde auf CEF Monolayer plattiert und Plaques in einem immunassay mit einem mit ß-Galactosidase verbundenen Protein A unter Verwendung eines polyclonalen anti-RAV-1 Serums geprüft. In der Anfärbung positive Plaques wurden ausgewählt und vier Runden einer Plaque-Reinigung unterworfen, um eine homogene Population zu erzielen. Die hergestellte Rekombinante wurde als vFP-22 bezeichnet. Immunpräzipitationsexperimente unter Verwendung von mit vFP-22 infizierten CEF-Lysaten zeigten die spezifische Präzipitation von zwei Proteinen mit Molekulargewichten von 76,7 kD und 30 kD, die den beiden Genprodukten des Hüll-Gens entsprechen. Kein Vorläufer-Genprodukt war sichtbar. ln vorläufigen Tests wurde eine Immunantwort auf RAV-I Hüll-Genprodukt mit vFP-22 beimpften Hühnern induziert.This plasmid was used in an in vitro recombination test with fowlpox FP-1 as the receiving virus. The progeny of the recombination was plated on CEF monolayer and plaques were tested in an immunoassay with a protein A associated with β-galactosidase using a polyclonal anti-RAV-1 serum. Plaques positive in staining were selected and four rounds of plaque cleaning were performed to achieve a homogeneous population. The recombinant produced was named vFP-22. Immunoprecipitation experiments using CEF lysates infected with vFP-22 showed the specific precipitation of two proteins with molecular weights of 76.7 kD and 30 kD, which correspond to the two gene products of the envelope gene. No precursor gene product was visible. Preliminary tests induced an immune response to RAV-I envelope gene product with chickens vaccinated with vFP-22.
Beispiel 17Example 17
Konstruktion von das GP51.30 HülKenvI-Gen von Rinderieukämievirus-fBLVI-exprimierendenConstruction of the GP51.30 HülKenvI gene from bovine eukemia virus fBLVI expressing
Aviooxvirus-Rekombinanten (1) Konstruktion von pBLVF 1 und pBLVF 2Aviooxvirus Recombinants (1) Construction of pBLVF 1 and pBLVF 2
Die Plasmide pBLVF 1 und pBLVF 2 enthalten das gp51,30 env-Gen von BLV. In beiden Plasmiden ist das BLV-Gen unter der Transkriptionskontrolle des Vacciniavirus H6-Promotors und ist zwischen die flankierenden Arme von Geflügelpockenvirus (Locus f7) cloniert. Die Nucleotidse-quenz der beiden Plasmide ist identisch mit Ausnahme der Codonpositionen 268 und 269. (pBLVF 1 codiert ein Protein mit den Aminosäuren Arg-Ser an diesen beiden Positionen, während pBLVF 2 ein Protein codiert, das die Aminosäuren Gln-Thr enthält). pBLVF 1 und pBLVF 2 wurden nach folgenden Verfahren hergestellt: Das das vollständige BLV-env-Gen enthaltende Plasmid pNS97-1 wurde mit Barn Hl und partiell mit Mst II gespalten. Das das vollständige gp51,30 Gen enthaltende 2,3 Kbp-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und die überstehenden Enden (sticky ends) mit E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Frag-ment) aufgefüllt. Anschließend wurden Pst I-Linker an die Enden des Fragments ligiert, was nach Spaltung mit Pst I in die Pst I-Stelle von pTP 15 ligiert wurde (Beispiel 15). Dies bringt das BLV-Gen neben den Vaccinia H6-Promotor (pTP15 enthält den in einen im Vacciniagenom nicht-essentiellen Locus clonierten Vaccinia H6-Promotor). 28The plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 contain the gp51.30 env gene from BLV. In both plasmids, the BLV gene is under the transcriptional control of the vaccinia virus H6 promoter and is cloned between the flanking arms of fowlpox virus (locus f7). The nucleotide sequence of the two plasmids is identical with the exception of codon positions 268 and 269. (pBLVF 1 encodes a protein with the amino acids Arg-Ser at these two positions, while pBLVF 2 encodes a protein which contains the amino acids Gln-Thr). pBLVF 1 and pBLVF 2 were prepared by the following methods: The plasmid pNS97-1 containing the complete BLV env gene was cleaved with Barn HI and partially with Mst II. The 2.3 kbp fragment containing the complete gp51.30 gene was isolated from an agarose gel and the sticky ends were filled in with E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment). Pst I linkers were then ligated to the ends of the fragment, which was ligated into the Pst I site of pTP 15 after cleavage with Pst I (Example 15). This brings the BLV gene in addition to the vaccinia H6 promoter (pTP15 contains the vaccinia H6 promoter cloned into a locus that is not essential in the vaccinia genome). 28
AT 408 549 BAT 408 549 B
Anschließend wurde dieses Plasmid mit Eco RV und partiell mit Ava II gespalten. Das 5,2 Kbp-Fragment wurde isoliert und die Oligonucleotide 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3' und 5-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' benutzt, um das Plasmid zu rezirkularisieren. Dies entfernt unnötige Basen zwischen dem BLV-Gen und den H6-Promotor.This plasmid was then cleaved with Eco RV and partially with Ava II. The 5.2 Kbp fragment was isolated and the oligonucleotides 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3 'and 5-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' used to recircularize the plasmid. This removes unnecessary bases between the BLV gene and the H6 promoter.
Das daraus hervorgehende Plasmid wurde mit Pst I und partiell mit Bgl II gespalten und das das unter dem H6-Promotor stehende BLV-Gen enthaltende 1,7 Kbp-Fragment wurde in die Barn Hl-Pst I-Stelle von pCE 11, dem vorstehend beschriebenen Geflügelpocken-Insertionsvektor, unter Vervendung des Locus f7 cloniert. Dies bringt das BLV-Gen neben den H6-Promotor zwischen die flankierenden Arme aus Geflügelpockenvirus. Dieses Plasmid wurde als pBLVF 1 bezeichnet.The resulting plasmid was digested with Pst I and partially with Bgl II, and the 1.7 Kbp fragment containing the BLV gene under the H6 promoter was inserted into the Barn HI-Pst I site of pCE 11, described above Chickenpox insertion vector, cloned using locus f7. This brings the BLV gene in addition to the H6 promoter between the flanking arms of chickenpox virus. This plasmid was named pBLVF 1.
Ein identisches Verfahren wurde benutzt, um pBLVF 2 zu konstruieren, mit der Ausnahme, daß vor der Clonierung des BLV-Gens unter dem H6-Promotor in pCE 11 ein zusätzlicher in vitro Mutageneseschritt durchgeführt wurde. Diese Mutagenese wurde mit dem folgenden Verfahren durchgeführt. Plasmid pNS97-1 wurde mit Xma I und partiell mit Stu I gespalten. Das 5.2 Kbp-Fragment wurde isoliert und die Oligonucleotide 5’-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3' und 5'-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3' benutzt, um das Plasmid zu rezirkularisieren. Dies ändert die Nucleotidsequenz der Codons 268 und 269 von CGC-AGT nach CAA-ACT. (2) Konstruktion von rekombinanten VirenAn identical procedure was used to construct pBLVF 2, except that an additional in vitro mutagenesis step was performed before the BLV gene was cloned under the H6 promoter in pCE 11. This mutagenesis was carried out using the following procedure. Plasmid pNS97-1 was digested with Xma I and partially with Stu I. The 5.2 Kbp fragment was isolated and the oligonucleotides 5’-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3 'and 5'-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3' were used to recircularize the plasmid. This changes the nucleotide sequence of codons 268 and 269 from CGC-AGT to CAA-ACT. (2) Construction of recombinant viruses
Die Plasmide pBLVF 1 und pBLVF 2 wurden in einem in vitro Rekombinationstest eingesetzt unter Verwendung von FP-1 als auffangendem Virus. Rekombinante Nachkommenschaft wurde ausgewählt über in situ Plaquehybridisierung. Sobald die Population aufgrund dieser Kriterien als rein eingeschätzt wurde, wurde mit einem ß-Galactosidase-Protein A Immunoassay unter Verwendung einer Präparation eines für BLV gp spezifischen monoclonalen Antikörpers geprüft. Beide aus den Plasmiden pBLVF 1 bzw. pBLVF 2 hergestellten rekombinanten vFP 23 und vFP 24 zeigten eine positive Färbung in dem Immuntest. Dies zeigt, daß ein immunologisch nachweisbares Glyko-protein auf der Oberfläche der infizierten Zellen exprimiert wurde.The plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 were used in an in vitro recombination test using FP-1 as the collecting virus. Recombinant progeny was selected via in situ plaque hybridization. As soon as the population was judged to be pure based on these criteria, a β-galactosidase protein A immunoassay was carried out using a preparation of a monoclonal antibody specific for BLV gp. Both recombinant vFP 23 and vFP 24 produced from the plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 showed positive staining in the immunoassay. This shows that an immunologically detectable glyco-protein was expressed on the surface of the infected cells.
Die Plasmide pBLVK 4 und pBLVK 6 enthalten das BLV env gp51,30 Gen bzw. das BLV gp51,30 Gen minus einer Abspaltung. Beide Gene sind in die singuläre Eco Rl-Stelle von pRW 764.2 (Locus C3) cloniert (pRW 764.2 ist in Beispiel 13 beschrieben) und unter der Transkriptionskontrolle des Vaccinia H6-Promotors.The plasmids pBLVK 4 and pBLVK 6 contain the BLV env gp51.30 gene and the BLV gp51.30 gene minus one cleavage. Both genes are cloned into the unique Eco R1 site of pRW 764.2 (locus C3) (pRW 764.2 is described in Example 13) and under the transcriptional control of the vaccinia H6 promoter.
Die Plasmide wurden nach folgendem Verfahren erhalten: pBLVFI und pBLVF 2 wurden mit den Restriktionsenzym Hind III gespalten. Das Oligonucleotid BKL 1 (AGCTTGAATTCA) wurde in diese Stelle cloniert, wobei eine Eco Rl-Stelle auf der 3-Seite des BLV Gens erzeugt wurde. Da es außerdem eine Eco Rl-Stelle auf der 5’-Seite des BLV Gens gibt, wurden diese Plasmide (pBLVK 1 und pBLVK 2) mit Eco RI gespalten und das das BLV Gen unter dem H6-Promotor enthaltende Fragment in die Eco Rl-Stelle von pRW 764.2 cloniert. Die daraus hervorgehenden Plasmide wurden als pBLVK 4 bzw. pBLVK 6 bezeichnet. Diese Plasmide wurden in einem in vitro Rekombinationstest mit Kanarienpockenvirus als dem auffangenden Virus eingesetzt. Rekombinanten wurden ausgewählt und gereinigt aufgrund der Oberflächenexpression des Glykoproteins, die in einem Immunassay überprüft wurde. Rekombinanten wurden auf der Grundlage der Oberfiächen-expression des Glykoproteins ausgewählt und gereinigt, wie es im Immunassay nachgewiesen wurde. Die Rekombinanten wurden als vCP 27 und vCP 28 der Plasmide pBLVK 4 bzw. pBLVK 6 bezeichnet.The plasmids were obtained by the following procedure: pBLVFI and pBLVF 2 were digested with the restriction enzyme Hind III. The oligonucleotide BKL 1 (AGCTTGAATTCA) was cloned into this site, an Eco Rl site being generated on the 3 side of the BLV gene. Since there is also an Eco Rl site on the 5 'side of the BLV gene, these plasmids (pBLVK 1 and pBLVK 2) were digested with Eco RI and the fragment containing the BLV gene under the H6 promoter was inserted into the Eco Rl Cloned from pRW 764.2. The resulting plasmids were named pBLVK 4 and pBLVK 6, respectively. These plasmids were used in an in vitro recombination test with canarypox virus as the catching virus. Recombinants were selected and purified based on the surface expression of the glycoprotein, which was checked in an immunoassay. Recombinants were selected and purified based on the surface expression of the glycoprotein as demonstrated in the immunoassay. The recombinants were designated as vCP 27 and vCP 28 of the plasmids pBLVK 4 and pBLVK 6, respectively.
Mit den Geflügelpockenrekombinanten vFP 23 und vFP 24 wurden Schafe und Rinder über eine Anzahl von Wegen geimpft. Den Tieren wurden zwei Impfungen gegeben, die zweite 45 Tage nach der ersten. Serumproben wurden 5 Wochen nach der ersten Impfung und zwei Wochen nach der zweiten Impfung entnommen.Sheep and cattle were vaccinated with the poxpox recombinants vFP 23 and vFP 24 in a number of ways. The animals were given two vaccinations, the second 45 days after the first. Serum samples were taken 5 weeks after the first vaccination and two weeks after the second vaccination.
Antikörper gegen gp51 wurde in einem kompetitiven ELISA-Test bestimmt und der Titer als der Kehrwert der Verdünnung angegeben, die eine 50 %-ige Reduktion der Verdrängung gab. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengefaßt.Antibodies against gp51 were determined in a competitive ELISA test and the titer was given as the reciprocal of the dilution, which gave a 50% reduction in displacement. The results are summarized in Table XI.
Keine der getesteten Arten zeigte eine nachweisbare Immunantwort nach der ersten Impfung. 29None of the species tested showed a detectable immune response after the first vaccination. 29
AT 408 549 BAT 408 549 B
Sowohl Schafe als auch Rinder zeigten einen signifikanten Anstieg der Antikörper nach der zweiten Impfung.Both sheep and cattle showed a significant increase in antibodies after the second vaccination.
Tabelle XITable XI
Impfung von Schafen und Rindern mit vFP23 und vFP24Vaccination of sheep and cattle with vFP23 and vFP24
Tier Virus Dosis und Route ELISA Titer 1° 2° 1° 2« Rind B56 FP-1 108+108a 108+108 0 0 B59 FP-1 ID subkutan 0 0 Schaf M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0 Rind B62 vFP23 108+108 1 08+108 0 200b B63 VFP23 ID subkutan 0 80 Schaf M83 vFP23 0 80 M84 VFP23 0 500 M85 vFP23 0 100 Rind B52 VFP24 108+108 108+108 0 200 B53 VFP24 ID subkutan 0 60 Schaf M87 VFP24 0 200 M92 vFP24 0 20 M93 VFP24 0 20 8 Intradermales (ID) Spritzen erfolgte an zwei Stellen b Titer ausgedrückt als Kehrwert der Verdünnung, die 50 % Hemmung gibtAnimal virus dose and route ELISA titer 1 ° 2 ° 1 ° 2 «cattle B56 FP-1 108 + 108a 108 + 108 0 0 B59 FP-1 ID subcutaneously 0 0 sheep M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0 cattle B62 vFP23 108 + 108 1 08 + 108 0 200b B63 VFP23 ID subcutaneous 0 80 sheep M83 vFP23 0 80 M84 VFP23 0 500 M85 vFP23 0 100 cattle B52 VFP24 108 + 108 108 + 108 0 200 B53 VFP24 ID subcutaneous 0 60 sheep M87 VFP24 0 200 M92 vFP24 0 20 M93 VFP24 0 20 8 intradermal (ID) injections were carried out at two points b titer expressed as the reciprocal of the dilution, which gives 50% inhibition
Beispiel 18Example 18
Konstruktion der das infektiöses Bronchitisvirus Mass 41-Matrixaen exprimierende Geflüqel-pockenvirus vFP-1- Rekombinante vFP-26Construction of the poultry poxvirus vFP-1 recombinant vFP-26 expressing the infectious bronchitis virus Mass 41 matrixaen
Plasmid plBVM63 enthält einen infektiöses Bronchitisvirus (IBV) cDNA-Clon des Matrixgens vom Stamm Mass 41. Ein 8 Kbp Eco Rl-Fragment von plBVM63 enthält das Matrixgen mit dem Peplomergen oberhalb (5') und noch weiter oberhalb eine Eco RV-Stelle. Plasmid pRW 715 hat einen Eco Rl-Linker, der die beiden Pvu Il-Stellen von pUC 9 verbindet. Das 8 Kbp Eco Rl-Fragment aus plBVM63 wurde in die pRW 715 Eco Rl-Stelle eingefügt und führte zu pRW 763. Plasmid pRW 776 wurde erzeugt, um die 5'-seitige Eco Rl-Stelle vom pRW 763 herauszunehmen und so eine singuläre Eco Rl-Stelle unterhalb (3') des Matrixgens übrig zu lassen. Das isolierte lineare Produkt eines Eco Rl-Partialverdaus von pRW 763 wurde mit Eco RV nachgespalten. Das größte Fragment wurde isoliert, mit dem Klenow-Fragment von DMA-Polymerase I an den Enden glatt gemacht und mit sich selbst ligiert, wodurch pRW 776 erzeugt wurde. Die Konstruktion pRW 776 besitzt das komplette IBV Peplomer und die Matrixgene, gefolgt von einer singulären Eco Rl-Stelle.Plasmid plBVM63 contains an infectious bronchitis virus (IBV) cDNA clone of the matrix gene from strain Mass 41. An 8 kbp Eco Rl fragment of plBVM63 contains the matrix gene with the peplomer gene above (5 ') and still further above an Eco RV site. Plasmid pRW 715 has an Eco Rl linker that connects the two Pvu II sites of pUC 9. The 8 Kbp Eco Rl fragment from plBVM63 was inserted into the pRW 715 Eco Rl site and led to pRW 763. Plasmid pRW 776 was generated to take out the 5 'side Eco Rl site from pRW 763 and thus a unique Eco To leave the R1 position below (3 ') of the matrix gene. The isolated linear product of an Eco Rl partial digest of pRW 763 was cleaved with Eco RV. The largest fragment was isolated, blunt-ended with the Klenow fragment of DMA polymerase I, and ligated to itself to generate pRW 776. The pRW 776 construction has the complete IBV peplomer and the matrix genes, followed by a unique Eco Rl site.
Nur die 5'- und 3'-Enden des etwa 0,9 Kbp langen Matrixgens wurden sequenziert. Die 5'-Se-quenz des Matrixgens, die am Initiationscodon (ATG) der Translation beginnt, enthält die folgende unterstrichene Rsa I-Stelle: ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC. Der vorher beschriebene H6-Promotor wurde an das Matrixgen mit einem synthetischen Oligonucleotid gefügt. Das synthetische Oligonucleotid enthielt die H6-Sequenz von seiner Eco RV-Stelle bis zum ATG und bis hinein in die codierende Sequenz des Matrixgens bis zur ersten Rsa I-Stelle. Das Oligonucleotid wurde mit Barn Hl- und Eco Rl-kompa-tiblen Enden zur Insertion in pUC 9 synthetisiert und führte zu pRW 772. Das Eco Rl-Ende ist auf der 3-Seite von der Rsa I-Stelle. Anfangend mit dem Barn Hl-kompatiblen Ende ist die Sequenz 30Only the 5 'and 3' ends of the approximately 0.9 Kbp matrix gene were sequenced. The 5 'sequence of the matrix gene, which begins at the initiation codon (ATG) of translation, contains the following underlined Rsa I site: ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC. The H6 promoter previously described was added to the matrix gene with a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contained the H6 sequence from its Eco RV site to the ATG and into the coding sequence of the matrix gene up to the first Rsa I site. The oligonucleotide was synthesized with Barn HI and Eco Rl compatible ends for insertion into pUC 9 and resulted in pRW 772. The Eco Rl end is on the 3 side from the Rsa I site. Sequence 30 begins with the Barn HI compatible end
AT 408 549 B des doppelsträngigen, synthetischen Oligonucleotids die folgende, wobei das ATG unterstrichen ist:AT 408 549 B of the double-stranded synthetic oligonucleotide the following, the ATG being underlined:
GATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACGGATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACG
CGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCTTAACGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCTTAA
Das lineare Produkt des Rsa I-Partialverdaus von pRW 772 wurde isoliert und nachgespalten mit Eco RI. Das pRW 772-Fragment, das nur einmal an der vorstehend genannten Rsa I-Stelle und an der Eco Rl-Stelle gespalten war, wurde isoliert, mit Phosphatase behandelt und als Vektor für das Produkt des Verdaus von pRW 776 (siehe nachstehend) benutzt.The linear product of the Rsa I partial digest of pRW 772 was isolated and subsequently cleaved with Eco RI. The pRW 772 fragment, which was cleaved only once at the aforementioned Rsa I site and at the Eco Rl site, was isolated, treated with phosphatase and used as a vector for the product of the digestion of pRW 776 (see below).
Das lineare, isolierte Produkt des Rsa I-Partialverdaus mit Rsa I von pRW 776 wurde mit Eco RI nachgespalten. Die Eco Rl-Stelle liegt unmittelbar nach dem 3-Ende des Matrixgens. Ein isoliertes, die codierende Matrixsequenz ab der vorstehend genannten Rsa I-Stelle enthaltendes, etwa 0,8 Kbp langes Rsa I-Eco Rl-Fragment wurde in den vorstehend genannten Vektor pRW 772 eingefügt und führte zu pRW 783. Der vollständige H6-Promotor wurde gebildet durch Hinzufügen der Sequenzen, die auf der 5-Seite der Eco RV-Stelle liegen. Das 5'-Ende des H6-Promotors war eine Hinf I-Stelle, die mit glatt gemachten Enden in die Sal I-Stelle von pUC 9 eingefügt war und so zu einer Eco Rl-Stelle wurde; auf der 5'-Seite des H6-Promotors liegt die Hind Ill-Stelle von pUC 9. Das die 5'-Seite des H6-Promotors enthaltende Hind Ill-Eco RV-Fragment wurde zwischen die Hind III- und Eco RV-Stellen von pRW 783 inseriert und führte zu pRW 786. Das das vollständige, von dem H6-Promotor abhängige Matrixgen enthaltende Eco Rl-Fragment von pRW 786 wurde an den Enden mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glatt gemacht, in die an den Enden glatt gemachte Barn Hl-Stelle von pRW 731.15 (Locus f8) eingefügt und erzeugte so pRW 789. Die pRW 731.15 Barn Hl-Stelle ist der in Beispiel 6 zur Konstruktion von vFP-8 verwendete FP-1 Locus.The linear, isolated product of the Rsa I partial digest with Rsa I from pRW 776 was subsequently cleaved with Eco RI. The Eco Rl site is immediately after the 3-end of the matrix gene. An isolated Rsa I-Eco RI fragment containing the coding matrix sequence from the above Rsa I site and approximately 0.8 Kbp in length was inserted into the above-mentioned vector pRW 772 and led to pRW 783. The complete H6 promoter became formed by adding the sequences located on the 5 side of the Eco RV site. The 5 'end of the H6 promoter was a Hinf I site, which was inserted with blunted ends in the Sal I site of pUC 9, thus becoming an Eco Rl site; the Hind III site of pUC 9 is on the 5 'side of the H6 promoter. The Hind III Eco RV fragment containing the 5' side of the H6 promoter was inserted between the Hind III and Eco RV sites of pRW 783 inserted and resulted in pRW 786. The Eco RI fragment of pRW 786 containing the complete H6 promoter-dependent matrix gene was blunt-ended with Klenow fragment of DNA polymerase I, and blunt-ended at the ends made Barn Hl site from pRW 731.15 (locus f8) and thus generated pRW 789. The pRW 731.15 Barn Hl site is the FP-1 locus used in Example 6 to construct vFP-8.
Das Plasmid pRW 789 wurde zur Konstruktion von vFP-26 benutzt. Rekombinante Plaques wurden ausgewählt und einer in sjtu Piaquehybridisierung unterworfen.The plasmid pRW 789 was used to construct vFP-26. Recombinant plaques were selected and subjected to piaque hybridization in sjtu.
Vorläufige Tests ergaben, daß eine Immunantvort auf das IBV Matrixprotein in mit vFP-26 geimpften Hühnern induziert worden ist.Preliminary tests indicated that an immune response to the IBV matrix protein was induced in chickens vaccinated with vFP-26.
Beispiel 19Example 19
Konstruktion der das infektiöse Bronchitisvirus-flBV)-Peplomer exprimierenden Geflügelpok- kenvirus-FP-1 -Rekombinante vFP-31Construction of the fowl poxvirus virus FP-1 recombinant vFP-31 expressing the infectious bronchitis virus flBV) peplomer
Der infektiöses Bronchitisvirus (IBV) Mass 41 cDNA-Clon plBVM 63 und sein Subclon, pRW 776, wurden bei der Konstruktion von vFP-26 in Beispiel 18 beschrieben. Subclon pRW 776 enthält das 4 Kbp IBV Peplomergen, dem das Matrixgen mit einer singulären Eco Rl-Stelle am 3-Ende folgt. Nur die 5’- und 3'-Enden des ca. 4 Kbp langen IBV Peplomergens wurden sequenziert. Eine singuläre Xba I-Stelle trennt die beiden Gene. Das 5'-Ende des Peplomergens, das mit dem Initia-tionscodon (ATG) der Translation beginnt, enthält die folgende unterstrichene Rsa I-Stelle: ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC.The infectious bronchitis virus (IBV) Mass 41 cDNA clone plBVM 63 and its subclone, pRW 776, were described in the construction of vFP-26 in Example 18. Subclone pRW 776 contains the 4 Kbp IBV peplomer gene, which is followed by the matrix gene with a unique Eco Rl site at the 3 end. Only the 5 'and 3' ends of the approx. 4 Kbp IBV peplomer gene were sequenced. A unique Xba I site separates the two genes. The 5 'end of the peplomer gene, which begins with the initiation codon (ATG) of translation, contains the following underlined Rsa I site: ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC.
Der vorstehend beschriebene H6-Promotor wurde mit dem Peplomergen über ein synthetisches Oligonucleotid verknüpft. Das synthetische Oligonucleotid enthält die H6-Promotorsequenz von seiner Nru I-Stelle bis zum ATG und in die codierende Peplomersequenz bis zu ihrer ersten Rsa I-Stelie. Das Oligonucleotid wurde mit Barn Hl- und Eco Rl-kompatiblen Enden zur Insertion in pUC 9 synthetisiert und führte zu pRW 768. Das Eco Rl-Ende liegt auf der 3'-Seite der Rsa I-Stelle. Beginnend mit dem Bam Hl-kompatiblen Ende ist die Sequenz des doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids wie folgt, wobei das ATG unterstrichen ist: GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAACCATTGTGGAGAAThe H6 promoter described above was linked to the peplomer gene via a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contains the H6 promoter sequence from its Nru I site to the ATG and into the coding peplomer sequence to its first Rsa I site. The oligonucleotide was synthesized with Barn HI and Eco Rl compatible ends for insertion into pUC 9 and resulted in pRW 768. The Eco Rl end is on the 3 'side of the Rsa I site. Starting with the Bam HI compatible end, the sequence of the double stranded synthetic oligonucleotide is as follows, with the ATG underlined: GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGACACATT
TTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACGTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG
AATGATCACTGAGAAAACACACATGCTTAAAATGATCACTGAGAAAACACACATGCTTAA
Das isolierte lineare Produkt eines Partialverdaus mit Rsa I von pRW 768 wurde mit Eco RI nachgespalten. Das einen einzelnen Schnitt an der vorstehend genannten Rsa I-Stelie und einen Nachschnitt mit Eco RI enthaltende pRW 7 68-Fragment wurde isoliert, mit Phosphatase behandelt und als Vektor für das nachstehend beschriebene Verdauungsprodukt von pRW 776 verwendet. 31The isolated linear product of a partial digest with Rsa I from pRW 768 was cleaved with Eco RI. The pRW 7 68 fragment containing a single cut at the aforementioned Rsa I site and a post cut with Eco RI was isolated, treated with phosphatase and used as a vector for the digest of pRW 776 described below. 31
AT 408 549 BAT 408 549 B
Das isolierte lineare Produkt eines Rsa I-Partialverdaus von pRW 776 wurde mit Eco RI nachgespalten. Das 5 Kbp pRW 776-Fragment bis zu der Eco Rl-Stelle, das einen einzelnen Schnitt an der vorgenannten Rsa I-Stelle enthielt, isoliert; das Fragment enthält IBV-Sequenzen von de vorgenannten Peplomer Rsa I-Stelle bis zu der Eco Rl-Stelle am 3'-Ende des Matrixgens. Die Insertion des pRW 776-Fragments in den vorgenannten Vektor pRW 768 führte zu pRW 788. Das Matrixgen wurde an der vorgenannten Xba I-Stelle entfernt. Die 5'-Seite des H6-Promotors wurde durch Insertion des an den Enden glatt gemachten 4 Kbp langen pRW 788 Nru I-Xba I-Fragments in den an den Enden Nru I-Bam Hl glatt gemachten Vektor pRW 760 an der Nru I-Stelle eingefügt und führte zu pRW 790. Der Vektor pRW 760 ist in Beispiel 11 beschrieben; kurz gesagt handelt es sich um ein Influenzanucleoprotein unter Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors, das von dem nichtessentiellen FP-1 Locus f7 flankiert ist. Der Vektor pRW 760 wurde erzeugt durch Entfernen der H6-Sequenzen auf der 3'-Seite von der Nru I-Stelle bis zum Ende des Nucleoproteins an Bam Hl. pRW 790 ist ein IBV Peplomer unter dem Promotor H6 in der Hinc Il-Stelle von pRW 731.13. Rekombination des Donorplasmids pRW 790 mit FP-1 führte zu vFP-31. Immunpräzipitationsexperimente unter Benutzung von CEF-Lysaten, die aus mit vFP-31 infizierten Zellen gewonnen wurden, zeigten spezifische Präzipitation einer kleinen Menge von Vorläuferprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 180 kD und von Spaltprodukten von 90 kD.The isolated linear product of an Rsa I partial digest of pRW 776 was cleaved with Eco RI. The 5 Kbp pRW 776 fragment was isolated up to the Eco Rl site, which contained a single cut at the aforementioned Rsa I site; the fragment contains IBV sequences from the aforementioned peplomer Rsa I site to the Eco Rl site at the 3 'end of the matrix gene. The insertion of the pRW 776 fragment into the aforementioned vector pRW 768 led to pRW 788. The matrix gene was removed at the aforementioned Xba I site. The 5 'side of the H6 promoter was inserted into the vector pRW 760 on the Nru I- by inserting the 4 Kbp pRW 788 Nru I-Xba I fragment which had been smoothed at the ends. Place inserted and led to pRW 790. The vector pRW 760 is described in Example 11; in short, it is an influenza nucleoprotein under the control of the vaccinia H6 promoter, which is flanked by the non-essential FP-1 locus f7. The vector pRW 760 was generated by removing the H6 sequences on the 3 'side from the Nru I site to the end of the nucleoprotein at BamHl. PRW 790 is an IBV peplomer under the H6 promoter in the Hinc II site of pRW 731.13. Recombination of the donor plasmid pRW 790 with FP-1 led to vFP-31. Immunoprecipitation experiments using CEF lysates obtained from cells infected with vFP-31 showed specific precipitation of a small amount of precursor protein with a molecular weight of approximately 180 kD and of cleavage products of 90 kD.
Beispiel 20Example 20
Konstruktion der Herpes Simplex aD exprimierenden GeflüaelPOCkenvirus-FP-1-Rekombinante vFP-30Construction of the herpes simplex aD expressing poultry POckenvirus-FP-1 recombinant vFP-30
Das Herpes Simplex Virus (HSV) Typ 1 Giykoprotein D-Gen (gD) vom Stamm KOS wurde in die Bam Hl-Stelle von pUC 9 als ein am 5'-Bam Hl-Ende mit Hpa Il-Nrul-Fragment, das mit dem am 3'-Bam Hl-Ende verknüpft wurde, cloniert; das 5'-Ende liegt unmittelbar neben der Pst I-Stelle von pUC 9. Die 5-Sequenz von HSV gD, die mit dem Initiationscodon (ATG) der Translation beginnt, enthält die folgende unterstrichene Nco I Stelle: ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTG- GGCCTCCATGG.The herpes simplex virus (HSV) type 1 glycoprotein D gene (gD) from the KOS strain was inserted into the Bam HI site of pUC 9 as one at the 5'-Bam HI end with Hpa II-Nrul fragment which was associated with the was linked at the 3'-Bam HI end, cloned; the 5 'end is immediately adjacent to the Pst I site of pUC 9. The 5 sequence of HSV gD, which begins with the initiation codon (ATG) of translation, contains the following underlined Nco I site: ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGGGGTCATTGATTTGTTTGGGGTCATAGT.
Der vorstehend beschriebene Vaccinia H6-Promotor wurde an das HSV gD-Gen über ein synthetisches Oligonucleotid verknüpft. Das synthetische Oligonucleotid enthält den 3’-Abschnitt des H6-Promotors von der Nru I-Stelle zum ATG und weiter zur codierenden Sequenz von gD bis zur Nco I-Stelle. Das Oligonucleotid wurde mit einem Pst l-kompatiblen Ende auf der 5’-Seite synthetisiert. Der gD Clon in pUC 9 wurde mit Pst I und Nco I gespalten und die HSV-Sequenz am 5'-Ende zum Austausch mit dem synthetischen Oligonucleotid entfernt, was zu pRW 787 führte. Die Sequenz des doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids ist: GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC-The vaccinia H6 promoter described above was linked to the HSV gD gene via a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contains the 3 ′ section of the H6 promoter from the Nru I site to the ATG and further to the coding sequence from gD to the Nco I site. The oligonucleotide was synthesized with a Pst 1 compatible end on the 5’ side. The gD clone in pUC 9 was digested with Pst I and Nco I and the HSV sequence at the 5 'end was removed for exchange with the synthetic oligonucleotide, resulting in pRW 787. The sequence of the double-stranded synthetic oligonucleotide is: GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC-
CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC GT CG AT CTAAT CC ACG AC AATAAAATAAAC AT C AATATC ATCCT GAGGTACCAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC GT CG AT CTAAT CC ACG AC AATAAAATAAAC AT C AATATC ATCCT GAGGTAC
Verdau von pRW 787 mit Nru I und Bam Hl erzeugt ein Fragment von etwa 1,3 Kbp, das die 3'-Seite des H6-Promotors von der Nru I-Stelle durch die codierende Sequenz von HSV gD hindurch bis zur Bam Hl-Stelle enthält. Der mit Nru I und Bam Hl gespaltene Vektor pRW 760 wurde in Beispiel 11 beschrieben. Die Insertion eines 1,3 Kbp Fragments in den Vektor pRW 760 führte zu pRW 791. Der Vektor pRW 791 enthält das vollständige HSV gD Gen unter den Vaccinia H6-Pro-motor in der nicht-essentiellen Hinc Il-Stelle in FP-1 in pRW 731.13 (Locus f7).Digestion of pRW 787 with Nru I and Bam Hl produces a fragment of approximately 1.3 kbp that extends the 3 'side of the H6 promoter from the Nru I site through the coding sequence from HSV gD to the Bam Hl site contains. The vector pRW 760 digested with Nru I and Bam HI was described in Example 11. The insertion of a 1.3 Kbp fragment into the vector pRW 760 led to pRW 791. The vector pRW 791 contains the complete HSV gD gene among the vaccinia H6-Pro-motor in the non-essential Hinc II site in FP-1 in pRW 731.13 (locus f7).
Rekombination des Spenderplasmids pRW 791 mit FP-1 führte zu vFP-30. Oberflächenexpression des Glykoproteins wurde in rekombinanten Plaques nachgewiesen unter Verwendung von mit ß-Galactosidase verknüpftem Protein A und für HSV-1 spezifischen Seren.Recombination of the donor plasmid pRW 791 with FP-1 led to vFP-30. Surface expression of the glycoprotein was detected in recombinant plaques using ß-galactosidase linked protein A and HSV-1 specific sera.
Beispiel 21Example 21
Verwendung von Entomopockenpromotoren zur Regulation der Expression von Fremdaenen inUse of entomopox promoters to regulate the expression of foreign dunes in
Pockenvirenvektoren 32Smallpox virus vectors 32
AT 408 549 B (a) HintergrundAT 408 549 B (a) background
Pockenviren von Insekten (Entomopocken) werden gegenwärtig in der Unterfamilie Entomo-poxvirinae eingeordnet, die weiter unterteilt wird in drei Gattungen (A, B und C), die Entomopok-kenviren entsprechen, die aus den Insektenordnungen Coleoptera, Lepidoptera bzw. Orthoptera isoliert wurden. Entomopockenviren haben in der Natur einen engen Wirtsbereich und es ist nicht bekannt, daß sie in irgendeiner Vertebratenart replizieren.Smallpox viruses from insects (entomopox) are currently classified in the subfamily Entomo-poxvirinae, which is further divided into three genera (A, B and C), which correspond to Entomopok-kenviruses isolated from the insect orders Coleoptera, Lepidoptera and Orthoptera, respectively. Entomopox viruses have a narrow host range in nature and are not known to replicate in any vertebrate species.
Das in den vorliegenden Untersuchungen benutzte Virus wurde ursprünglich aus infizierten Larven von Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) aus Indien isoliert; vgl. Roberts und Granados, J. Invertebr. Pathol. Bd. 12, (1968), Seiten 141-143. Das Virus, bezeichnet als AmEPV, ist die Leitart für Genus B.The virus used in the present studies was originally isolated from infected larvae of Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) from India; see. Roberts and Granados, J. Invertebr. Pathol. Vol. 12, (1968), pages 141-143. The virus, known as AmEPV, is the leading species for genus B.
Wildtyp AmEPV wurde von Dr. R. Granados (Boyce Thomson Institute, Comell University) als infektiöse Hämolymphe von infizierten Estiamene acrea-Larven erhalten. Es wurde gefunden, daß das Virus in der Invertebraten-Zeilinie IPLB-LD652Y repliziert, die aus Ovariumgeweben von Lymantria dispar (Schwammspinner) (beschrieben bei Goodwin et al., In Vitro Bd. 14 (1978) Seiten 485-494) gewonnen wurde. Diese Zellen wurden bei 28°C in IPL-528-Medium gezogen, das mit 4 % fötalem Kälber- und 4 % Hühnerserum supplementiert war.Wild-type AmEPV was developed by Dr. R. Granados (Boyce Thomson Institute, Comell University) obtained as an infectious hemolymph from infected Estiamene acrea larvae. The virus was found to replicate in the invertebrate line, IPLB-LD652Y, derived from Lymantria dispar (sponge spinner) ovarian tissues (described by Goodwin et al., In Vitro Vol. 14 (1978) pages 485-494). These cells were grown at 28 ° C in IPL-528 medium supplemented with 4% fetal calf and 4% chicken serum.
Das Wildtyp-Virus wurde auf Plaques auf LD652Y-Zellen geprüft und ein Plaque, als V1 bezeichnet, wurde für weitere Experimente ausgewählt. Dieses Isolat ruft zahlreiche Einschlußkörperchen (OBs) im Cytoplasma der infizierten Zellen gegen Ende des Infektionszyklus hervor. (b) PromotorindentifizierunqThe wild-type virus was checked for plaques on LD652Y cells and a plaque, designated V1, was selected for further experiments. This isolate causes numerous inclusion bodies (OBs) in the cytoplasm of the infected cells towards the end of the infection cycle. (b) Promoter identification
Die Identifizierung und Kartierung eines AmEPV-Promotors wurde wie folgt erreicht. Gesamt-RNA aus infizierten LD652Y-Zellen (48 Stunden nach der Infektion; späte Phase) wurde isoliert und benutzt, um mit 32P-markierte erste Strang-cDNA zu erzeugen. Die cDNA wurde dann benutzt, um "Blots" zu prüfen, die Restriktionsverdaus von AmEPV-Genom enthielten. Dieser Southern Blot führte zur Aufdeckung eines starken Signals auf einem 2,6 kb Cla I-Fragment, was anzeigte, daß dieses Fragment ein stark exprimiertes Gen codierte. Das Fragment wurde in einen Plasmidvektorcloniert und seine DNA-Sequenz bestimmt.The identification and mapping of an AmEPV promoter was accomplished as follows. Total RNA from infected LD652Y cells (48 hours post infection; late phase) was isolated and used to generate first strand cDNA labeled with 32P. The cDNA was then used to " blots " to check that contained restriction digests of the AmEPV genome. This Southern blot revealed a strong signal on a 2.6 kb Cla I fragment, indicating that this fragment encoded a highly expressed gene. The fragment was cloned into a plasmid vector and its DNA sequence determined.
Analyse der Sequenzdaten ergab einen offenen Leserahmen, der in der Lage war, ein 42 kD Polypeptid zu codieren. In vitro Translation der Gesamt-RNA zum Zeitpunkt 48 Stunden nach der Infektion und Auftrennung der Produkte über SDS-PAGE führte zu einem Polypeptid von ca. 42 kD. (c) Konstruktion eines rekombinanten Vacciniavirus mit der Expression eines Fremdaens unter der Kontrolle des Entomopockenvirus-Promotors·Analysis of the sequence data revealed an open reading frame that was able to encode a 42 kD polypeptide. In vitro translation of the total RNA at 48 hours after infection and separation of the products via SDS-PAGE resulted in a polypeptide of approximately 42 kD. (c) Construction of a recombinant vaccinia virus with the expression of a stranger under the control of the entomopox virus promoter
Um zu bestimmen, ob ein Entomopockenvirus-Promotor in einem Vertebraten-Pockenvirussy-stem funktionieren würde, wurde das folgende Plasmid konstruiert: ein Oligonucleotid wurde chemisch synthetisiert, das 107 Basen von der 5-Seite des Translationsstartsignals des 42K Gens (nachfolgend als AmEPV 42K-Promotor bezeichnet) enthielt und von einer Bgl Il-Stelle am 5-Ende und am 3'-Ende von den ersten 14 Basen der codierenden, an einer Eco Rl-Stelle aufhörenden Region von Hepatitis B-Virus pre-S2 flankiert ist. Die AmEPV 42K-Promotorsequenz ist im folgenden beschrieben:To determine whether an entomopox virus promoter would work in a vertebrate pox virus system, the following plasmid was constructed: an oligonucleotide was chemically synthesized that contains 107 bases from the 5 side of the translation start signal of the 42K gene (hereinafter AmEPV 42K- Designated promoter) and is flanked by a Bgl II site at the 5 end and at the 3 'end of the first 14 bases of the coding region which stops at an Eco Rl site of hepatitis B virus pre-S2. The AmEPV 42K promoter sequence is described below:
TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA ATAT GATAATATTTT GGGATTT CAAA ATT GAAAATAT ATAATTACAATATAAAATGTCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA ATAT GATAATATTTT GGGATTT CAAA ATT GAAAATAT ATAATTACAATATAAAATG
Der AmEPV 42K-Promotor wurde mit dem Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAG) wie folgt ligiert. Ein das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen und den codierenden Bereich von pre-S2 (Typ ayw wie beschrieben bei Galibert et al., Nature Bd. 281 (1979), Seiten 646-650) enthaltendes pUC-Plasmid wurde erzeugt, das von den Vacciniavirusarmen in der nicht-essientiellen Region des Vacciniavirusgenoms, das das Hämagglutinin-(HA)-Molekül codiert (HA-Arme beschrieben in Beispiel 15; HA-Region beschrieben von Shida, Virology Bd. 150 (1986), Seiten 451-462) flankiert 33The AmEPV 42K promoter was ligated to the hepatitis B virus surface antigen (HBVsAG) as follows. A pUC plasmid containing the hepatitis B virus surface antigen and the coding region of pre-S2 (type ayw as described by Galibert et al., Nature Vol. 281 (1979), pages 646-650) was generated, which was described by the Flanked vaccinia virus arms in the non-essential region of the vaccinia virus genome encoding the hemagglutinin (HA) molecule (HA arms described in Example 15; HA region described by Shida, Virology Vol. 150 (1986), pages 451-462) 33
AT 408 549 B war. Das vorstehend beschriebene Oligonucleotid wurde in dieses Plasmid eingefügt, indem die singuläre Eco Rl-Stelle in den HBVsAg codierenden Bereich und die singuläre Bgl Il-Stelle in dem HA-Vacciniaarm benutzt wurde. Das daraus hervorgehende rekombinante Vacciniavirus wurde als vP 547 bezeichnet.AT 408 549 B. The oligonucleotide described above was inserted into this plasmid using the unique Eco Rl site in the HBVsAg coding region and the singular Bgl II site in the HA vaccine arm. The resulting recombinant vaccinia virus was named vP 547.
Die Expression der codierenden HBVsAg-Sequenz unter der Kontrolle des Entomopocken 42K-Promotors wurde mit einem Immunoassay nachgewiesen. Entsprechende Kulturen der Säu-getierzellinie BSC-40 wurden mit Ausgangsvacciniavirus oder der Rekombinante vP 547 infiziert. 24 Stunden nach Infektion wurden die Zellen lysiert und das Lysat in Reihen Verdünnungen auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht. Die Membran wurde zuerst mit einem Ziegen-anti-HBV-Serum und anschließend mit 125J-Protein A inkubiert. Nach dem Waschen wurde ein Röntgenfilm mit der Membran belichtet. Positive Signale wurden in mit vP 547 infizierten Kulturen, jedoch nicht in mit Eltemvirus infizierten Kulturen gefunden, was eine Erkennung des AmEPV 42K-Promotors durch Vacciniavirus in Säugetierzellen andeutet.The expression of the coding HBVsAg sequence under the control of the entomopox 42K promoter was detected using an immunoassay. Appropriate cultures of the mammalian cell line BSC-40 were infected with starting vaccinia virus or the recombinant vP 547. 24 hours after infection, the cells were lysed and the lysate was applied in serial dilutions to a nitrocellulose membrane. The membrane was first incubated with a goat anti-HBV serum and then with 125J protein A. After washing, an X-ray film was exposed to the membrane. Positive signals were found in cultures infected with vP 547, but not in cultures infected with parent virus, which indicates recognition of the AmEPV 42K promoter by vaccinia virus in mammalian cells.
Die vorstehenden Ergebnisse wurden bestätigt durch Verwendung eines Ausria-Assays (vgl. Beispiel 1 für Details), um HBVsAg in infizierten Säugetierzellen nachzuweisen. Vacciniavirusre-kombinanten, die entweder das HBVsAg-Gen an AmEPV42K oder an den Vacciniavirus H6-Promotor gekoppelt hatten, wurden verwendet, um BSC-40 Zellen zu infizieren; das Ausmaß der Expression von sAg wurde in einem Ausria-Test ermittelt Wie in Tabelle XII dargestellt, zeigen die Daten, daß die Menge an Expression von HBVsAg bei Verwendung des 42K-Promotors signifikant war.The above results were confirmed using an Ausria assay (see Example 1 for details) to detect HBVsAg in infected mammalian cells. Vaccinia virus re-combinants that had either the HBVsAg gene linked to AmEPV42K or the vaccinia virus H6 promoter were used to infect BSC-40 cells; the extent of expression of sAg was determined in an Ausria test. As shown in Table XII, the data show that the amount of expression of HBVsAg was significant when using the 42K promoter.
Tabelle XIITable XII
Expression von HBVsAg in rekombinantem VacciniavirusExpression of HBVsAg in recombinant vaccinia virus
Ausria P/N-Verhältnis 1,0 24,3 44,9Ausria P / N ratio 1.0 24.3 44.9
Promotor Kontrolle H6 42KPromoter control H6 42K
RekombinantesVirus vP-410 vP-481 VP-547Recombinant Virus vP-410 vP-481 VP-547
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die zeitabhängige Natur der Regulation des AmEPV 42K Promotors in einem Vertebraten-Pockenvirussystem zu bestätigen. Gleichartige Kulturen von BSC-40 Zellen wurden mit vP 547 in Gegenwart oder Abwesenheit von 40 pg/ml Cytosin Arabinosid, einem deshalb die späte virale Transkription blockierenden Inhibitor der DNA-Replikation infiziert. Die Mengen der Expression wurden in einem Ausria-Test 24 Stunden nach Infektion überprüft, Die Ergebnisse zeigen, daß der 42K Promotor als ein früher Promotor in einem Vacciniavirus-Replikationssystem erkannt wurde.Further experiments were carried out to confirm the time-dependent nature of the regulation of the AmEPV 42K promoter in a vertebrate pox virus system. Similar cultures of BSC-40 cells were infected with vP 547 in the presence or absence of 40 pg / ml cytosine arabinoside, an inhibitor of DNA replication which therefore blocks late viral transcription. The levels of expression were checked in an Ausria test 24 hours after infection. The results show that the 42K promoter was recognized as an early promoter in a vaccinia virus replication system.
Die Verwendung des AmEPV 42K-Promotors zur Expression von Fremdgenen in einem Säugetiersystem ist ersichtlich verschieden von der Verwendung des Autographa californica NPV Polyhedrin-Promotors zur Genexpression in Invertebraten-Systemen (Luckow und Summers, Biotechnology, Bd. 6 (1988), Seiten 47-55). Der Polyhedrinpromotor wird nicht durch den Transkriptionsapparat in Säugetierzeilen erkannt (Tjla et al., Virology, Bd. 125 (1983), Seiten 107-117). Die Verwendung des AmEPV 42K-Promotors in Säugetierzellen zeigt erstmals, daß ein Insektenviruspromotor zur Expression von fremden Genen in einem nicht-insektenviralen Vektor in Nicht-Invertebratenzellen benutzt worden ist.The use of the AmEPV 42K promoter for the expression of foreign genes in a mammalian system is evidently different from the use of the Autographa californica NPV polyhedrin promoter for gene expression in invertebrate systems (Luckow and Summers, Biotechnology, Vol. 6 (1988), pages 47- 55). The polyhedrin promoter is not recognized by the transcription apparatus in mammalian cells (Tjla et al., Virology, Vol. 125 (1983), pages 107-117). The use of the AmEPV 42K promoter in mammalian cells shows for the first time that an insect virus promoter has been used to express foreign genes in a non-insect viral vector in non-invertebrate cells.
Um festzustellen, ob Avipoxviren ebenfalls den 42K-Entomopockenpromotor erkennen würden, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Identische Kulturen von CEF-Zellen wurde mit 10 pfu pro Zelle entweder von Geflügelpockenvirus, Kanarienpockenvirus oder Vacciniavirus geimpft und gleichzeitig mit 25 pg eines der folgenden Plasmide transfiziert: 1) Plasmid 42K.17, das die HBV pre-S2 + sAg codierende Sequenz mit dem 42K-Promotor verknüpft enthielt oder 2) Plasmid pMP15.spsP, das die identische HBVsAg codierende Sequenz mit dem Vacciniavirus H6-Promotor verknüpft enthält. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gefroren und lysiert und die Lysate unter Verwendung eines Ausria-Tests (siehe Beispiel 1) auf die Gegenwart von HBVsAg überprüft.The following experiment was carried out to determine whether avipox viruses would also recognize the 42K entomopox promoter. Identical cultures of CEF cells were inoculated with 10 pfu per cell from either poultrypox virus, canarypox virus or vaccinia virus and simultaneously transfected with 25 pg of one of the following plasmids: 1) Plasmid 42K.17, which contains the sequence coding for the HBV pre-S2 + sAg 42K promoter linked or 2) plasmid pMP15.spsP, which contains the identical HBVsAg coding sequence linked to the vaccinia virus H6 promoter. After 24 hours, the cells were frozen and lysed and the lysates checked for the presence of HBVsAg using an Ausria test (see Example 1).
Die in Tabelle XIII gezeigten Ergebnisse sollten in einem qualitativen Sinn betrachtet werden. Sie deuten an, daß der Transkriptionsapparat sowohl von Geflügelpockenvirus als auch von Kana- 34The results shown in Table XIII should be viewed in a qualitative sense. They indicate that the transcription apparatus is made up of both poultrypox virus and Kana-34
AT 408 549 B rienpockenvirus in der Lage ist, den 42K-Promotor zu erkennen und die Transkription der damit verbundenen codierenden HBVsAg-Sequenz gestattet. Obwohl die Mengen an Expression niedriger sind als die mit dem Vacciniavirus H6-Promotor, liegen die Mengen deutlich über den Hintergrundmengen, die man mit den negativen Kontrollen erhalt.AT 408 549 Brienpockenvirus is able to recognize the 42K promoter and allows the transcription of the associated coding HBVsAg sequence. Although the levels of expression are lower than those with the vaccinia virus H6 promoter, the levels are well above the background levels obtained with the negative controls.
Tabelle XIIITable XIII
Erkennung des 42K Entomooockenvirusoromotors durch Aviooxviren Virus Promotor Verhältnis PIN Geflügelpocken 42K 39,1 H6 356,8 Kanarienpocken 42 K 90,2 H6 222,2 Vaccinia 42K 369,4 H6 366,9 Kein 42K 7,8 Kein H6 7,2 Vaccinia - 7,2Detection of the 42K Entomooockenvirusoromotor by Aviooxviren Virus Promoter Ratio PIN Chickenpox 42K 39.1 H6 356.8 Canarypox 42 K 90.2 H6 222.2 Vaccinia 42K 369.4 H6 366.9 None 42K 7.8 No H6 7.2 Vaccinia - 7.2
Beispiel 22Example 22
Immunisierung mit VCP-16 zum Schutz von Mausen gegen eine Belastunqsinfektion mit lebendem TollwutvirusImmunization with VCP-16 to protect mice against an infection with live rabies virus
Gruppen von 20 vier bis sechs Wochen alten Mausen wurden in der Pfotenfläche mit 50 bis 100 μΙ einer Reihe von Verdünnungen von einer der beiden folgenden Rekombinanten beimpft: (a) vFP-6 - der in Beispiel 6 beschriebenen Geflügelpocken-Tollwutrekombinante - und (b) vCP-16 -der in Beispiel 13 beschriebenen - Kanarienpocken-Tollwut-Rekombinante.Groups of 20 four to six week old mice were inoculated in the paw area with 50 to 100 μl of a series of dilutions from one of the following two recombinants: (a) vFP-6 - the fowlpox rabies recombinant described in Example 6 - and (b) vCP-16 - the canarypox rabies recombinant described in Example 13.
Nach 14 Tagen wurden 10 Mäuse aus jeder Gruppe geopfert und das Serum gesammelt. Der anti-Tollwuttiter in dem Serum wurde mit dem in Beispiel 7 beschriebenen RFFI-Test berechnet. Die verbleibenden 10 Mäuse aus jeder Gruppe wurden einer Belastungsinfektion durch intrazerebrale Impfung mit dem CVS-Stamm von Tollwutvirus, das in Beispiel 7 benutzt wurde, ausgesetzt. Jede Maus erhielt 30 μΙ, was 16 Maus-LDso entsprach. Nach 28 Tagen wurde die Zahl der überlebenden Mäuse bestimmt und die schützende Dosis 50 (PDso) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIV zusammengefaßt.After 14 days, 10 mice from each group were sacrificed and the serum collected. The anti-rabies titer in the serum was calculated using the RFFI test described in Example 7. The remaining 10 mice from each group were challenged by intracerebral vaccination with the rabies virus CVS strain used in Example 7. Each mouse received 30 μΙ, which corresponded to 16 mouse LDso. After 28 days, the number of surviving mice was determined and the protective dose 50 (PDso) was calculated. The results are summarized in Table XIV.
Der bei mit vFP-6 geimpften Mäusen gefundene Schutzgrad bestätigte das in Beispiel 7 diskutierte Ergebnis der Impfung mit rekombinanten Geflügelpockenviren vFP-3. Der mit der Impfung mit vCP-16 erreichte Schutzgrad ist beträchtlich höher. Auf der Basis des berechneten PD50 ist die Kanarienpocken-Tollwut-Rekombinante 100 mal wirksamer beim Schutz gegen eine Belastungsinfektion mit Tollwut als die Geflügelpocken-Tollwut-Rekombinante.The degree of protection found in mice vaccinated with vFP-6 confirmed the result of vaccination with recombinant fowlpox virus vFP-3 discussed in Example 7. The level of protection achieved with vaccination with vCP-16 is considerably higher. Based on the calculated PD50, the canarypox rabies recombinant is 100 times more effective in protecting against a rabies infection than the poultry pox rabies recombinant.
Tabelle XIVTable XIV
Die durch zwei Avipox-Tollwut-Rekombinanten erzielte schützende Immunität gegen eineProtective immunity against one achieved by two Avipox rabies recombinants
Belastungsinfektion mit Tollwutvirus 35Stress infection with rabies virus 35
AT 408 549 BAT 408 549 B
Geflügelpocken vFP-6 Kanarienpocken vCP-16Chicken pox vFP-6 Canary pox vCP-16
Impf dosis RFFI Titer Überlebens rate Impf dosis RFFI Titer Überlebens rate 7.5a 2.3b 7/10 6.5 2.5 10/10 5.5 1.8 5/10 4.5 1.9 8/10 3.5 0.7 0/10 2.5 1.1 1/10 1.5 0.6 0/10 0.5 0.4 0/10 1 PD50 = 6.17 1 PDso = 4.18 a Virus-Titer, ausgedrückt als log10 TCID«, b RFFI-Titer, ausgedrückt als log10 der höchsten Serumverdünnung, die eine Reduktion um mehr als 50 % in der Anzahl der fluoreszierenden Vertiefungen in einem RFFI-Test ergibt.Vaccine dose RFFI titer survival rate Vaccine dose RFFI titer survival rate 7.5a 2.3b 7/10 6.5 2.5 10/10 5.5 1.8 5/10 4.5 1.9 8/10 3.5 0.7 0/10 2.5 1.1 1/10 1.5 0.6 0/10 0.5 0.4 0/10 1 PD50 = 6.17 1 PDso = 4.18 a virus titer expressed as log10 TCID «, b RFFI titer expressed as log10 of the highest serum dilution, showing a reduction of more than 50% in the number of fluorescent wells an RFFI test.
Beispiel 23Example 23
Verwendung von Geflügelpockenpromotorelementen zur Expression von Fremdaenen I. Identifizierung des ein 25.8 Kilodalton (kPl Genprodukt codierenden GeflügelpockengensUse of fowlpox promoter elements for the expression of foreign dunes I. Identification of the fowlpox gene coding for a 25.8 kilodalton (kPl gene product)
Sichtbarmachen von in mit Geflügelpocken (FP-1) infizierten CEF-Lysaten vorhandenen Proteintypen mittels Coomassie Brilliantblau-Anfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen zeigte einen reichlich vorhandenen Typ mit einem offenbaren Molekulargewicht von 25,8 kD. Dieses Protein fehlte in nicht-infizierten Zellysaten. Puls-Experimente unter Verwendung von “S-Methionin zur Radiomarkierung synthetisierter Proteine zu bestimmten Zeiten nach der Infektion zeigten wiederum die große Menge an FP-1-induziertem Protein und zeigten, daß es 6 bis 54 Stunden nach Infektion synthetisiert wird. An seinem Spitzenwert macht dieses FP-1 25,8 kD Protein ca. 5 bis 10 % des in dem Zellysat vorhandenen Gesamtproteins aus.Visibility of protein types present in CEF lysates infected with fowlpox (FP-1) by means of Coomassie brilliant blue staining of SDS-polyacrylamide gels showed an abundant type with an apparent molecular weight of 25.8 kD. This protein was missing in uninfected cell lysates. Pulse experiments using "S-methionine to radiolabel synthesized proteins at certain times after infection again showed the large amount of FP-1-induced protein and showed that it is synthesized 6 to 54 hours after infection. At its peak, this FP-1 25.8 kD protein makes up approximately 5 to 10% of the total protein present in the cell lysate.
Die große Menge an durch FP-1 induziertem 25,8 kD Protein legte nahe, daß das dieses Genprodukt codierende Gen von einem starken FP-1 Promotorelement reguliert wird. Um dieses Promotorelement zur nachfolgenden Verwendung bei der Expression von Fremdgenen in Pockenvirenrekombinanten zu lokalisieren, wurde eine Polysomen-Präparation aus mit FP-1 infizierten CEF-Zellen 54 Stunden nach Infektion gewonnen. RNA aus dieser Polysomenpräparation wurde isoliert und führte dann, wenn man sie zur Programmierung eines Kaninchenreticulocyten-in vitro-Translationssystem benutzte, vorwiegend zur Bildung von 25,8.8 kD FP-1 Protein.The large amount of 25.8 kD protein induced by FP-1 suggested that the gene encoding this gene product is regulated by a strong FP-1 promoter element. In order to localize this promoter element for subsequent use in the expression of foreign genes in smallpox virus recombinants, a polysome preparation was obtained from CEF cells infected with FP-1 54 hours after infection. RNA from this polysome preparation was isolated and, when used to program a rabbit reticulocyte in vitro translation system, resulted primarily in the formation of 25.8.8 kD FP-1 protein.
Die Polysomen-RNA wurde außerdem als Matrize zur cDNA-Synthese des ersten Strangs unter Verwendung eines Oligo (dT)12-18 als Primer benutzt. Der erste Strang der cDNA wurde als eine Hybridisierungssonde in einer Southern-Blot-Analyse mit genomischen Verdaus von FP-1 benutzt. Ergebnisse aus diesen Hybridisierungsanalysen legten nahe, daß das für das 25,8 kD Protein codierende Gen in einem 10.5 Kbp Hind Ill-Fragment enthalten war. Dieses genomische Hind Ill-Fragment wurde anschließend isoliert und mit einem kommerziellen Vektor, pBS (Strata-gene, La Jolla, CA.), cloniert und der Clon als pFP23k-1 bezeichnet. Weitere Hybridisierungsanalysen unter Verwendung des ersten Strangs der cDNA als Sonde gegen Verdaus von pFP23k-1 führten zur Lokalisierung des 25.8 kD Gens auf einem 3.2 Kbp Eco RV-Sub-Fragment. Dieses Fragment wurde in pBS subcloniert und als pFP23k-2 bezeichnet.The polysome RNA was also used as a template for first strand cDNA synthesis using an oligo (dT) 12-18 as a primer. The first strand of the cDNA was used as a hybridization probe in a Southern blot analysis with FP-1 genomic digests. Results from these hybridization analyzes suggested that the gene coding for the 25.8 kD protein was contained in a 10.5 Kbp Hind III fragment. This Hind III genomic fragment was then isolated and cloned with a commercial vector, pBS (Strata-gene, La Jolla, CA.) and the clone designated pFP23k-1. Further hybridization analyzes using the first strand of the cDNA as a probe against digestion of pFP23k-1 led to the localization of the 25.8 kD gene on a 3.2 Kbp Eco RV sub-fragment. This fragment was subcloned into pBS and designated pFP23k-2.
Etwa 2.4 Kbp dieses FP-1 Eco RV-Fragments wurden mit der Sanger-Didesoxy-Kettenab-bruchsmethode (Sänger et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), Seiten 5463-5467) sequenziert. Die Analyse der Sequenz ergibt einen offenen Leserahmen (ORF), der ein Genprodukt mit einem Molekulargewicht von 25.8 kD codiert. ]n vitro run-off-Transkription dieses ORF 36About 2.4 kbp of this FP-1 Eco RV fragment were sequenced using the Sanger dideoxy chain termination method (Sänger et al “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977), pages 5463-5467). Analysis of the sequence reveals an open reading frame (ORF) that encodes a gene product with a molecular weight of 25.8 kD. ] n vitro run-off transcription of this ORF 36
AT 408 549 B durch Polymerase des Bakteriophagen T7 (Stratagene, La Jolla, CA) in einem pBS Vektor erzeugt eine RNA-Art, die bei Benutzung zur Programmierung eines Kaninchenreticulocvten in vitro-Trans-lationssystems (Promega Biotec, Madison, Wl) eine Polypeptidart mit einem offenbaren Molekulargewicht von 25.8 kD ergibt. Dieses Polypeptid wandert auf einem SDS-Polyacrylamidge! gemeinsam mit dem reich vorhandenen 25.8 kD Protein, das in mit FP-1 infizierten CEFs beobachtet wird. Diese Ergebnisse legen nahe, daß es sich um das codierende Gen für das durch FP-1 induzierte, reich vorhandene 25.8 kD Genprodukt handelt. II. Verwendung von Upstream-Promotorelementen des FP-1 25.8 kD Gens zur Expression des Katzenleukämievirus (FeLV) env-Gens in FP-1 und Vacciniarekombinanten.AT 408 549 B by polymerase of bacteriophage T7 (Stratagene, La Jolla, CA) in a pBS vector generates an RNA type which, when used to program a rabbit riculocyte in vitro translation system (Promega Biotec, Madison, Wl), generates a type of polypeptide with an apparent molecular weight of 25.8 kD. This polypeptide migrates on an SDS polyacrylamide! together with the abundant 25.8 kD protein observed in CEFs infected with FP-1. These results suggest that it is the coding gene for the rich, 25.8 kD gene product induced by FP-1. II. Use of upstream promoter elements of the FP-1 25.8 kD gene for expression of the feline leukemia virus (FeLV) env gene in FP-1 and vaccinia recombinants.
Ein den regulatorischen Bereich des FP-1 25.8 kD Gens enthaltendes 270 bp Eco RV/Eco Rl-Fragment (FP25.8K Promotor) und 21 bp der codierenden Sequenz des 25.8 kD Gens wurden aus pFP23k-2 isoliert. Nachstehend wird die Nucleotidsequenz der FP 25.8K Promotorregion vorgestellt, die benutzt wurde, um pFeLV25.8F1 und pFeLV25.81A zu erzeugen. Diese 270 Nucleotide lange Sequenz stellt 249 Nucleotide des 5-Bereichs vor dem Initiationscodon (ATG) für das 25.8 kD Genprodukt und die ersten 21 bp der codierenden Sequenz zur Verfügung. 5'-GAT AT CCCCAT CT CT CC AG AACAGC AGCATAGTGTTAGG ACAAT CAT CTAA-T GC AATAT CATATAT G AAT CT C ACTCCG ATAGG ATACTTACC AC AGCTATTATA-CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT-AT GAT GTCTAT ATTATAGT G AGT ATATTATAAGT AT GCG GG AATAT CTTT GATT -TAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAA-TTC-3’A 270 bp Eco RV / Eco R1 fragment (FP25.8K promoter) containing the regulatory region of the FP-1 25.8 kD gene and 21 bp of the coding sequence of the 25.8 kD gene were isolated from pFP23k-2. The following is the nucleotide sequence of the FP 25.8K promoter region used to generate pFeLV25.8F1 and pFeLV25.81A. This 270 nucleotide long sequence provides 249 nucleotides of the 5 region in front of the initiation codon (ATG) for the 25.8 kD gene product and the first 21 bp of the coding sequence. 5'-GAT AT CCCCAT CT CT CC AG AACAGC AGCATAGTGTTAGG ACAAT CAT CTAA T GC G AAT CT AATAT CATATAT C ACTCCG ATAGG ATACTTACC AC AGCTATTATA-CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT-AT GAT AGT G GTCTAT ATTATAGT ATATTATAAGT AT GCG GG AATAT CTTT GATT -TAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAA-TTC- 3 '
Dieses Fragment wurde an den Enden glatt gemacht und dann in einen mit Sma I verdauten FeLV env-Sequenzen enthaltenden FP-1 Insertionsvektor (pFeLVFI; siehe Beispiel 15) eingefügt. Dieser Insertionsvektor ermöglichte Rekombination mit dem f7 Locus des FP-1 Genom. Die Einfügung der FP25.8K Promotor upstream-Sequenzen auf der 5'-Seite des FeLV env-Gens und die richtige Orientierung wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Diese Insertion stellt kein perfektes ATG für die ATG-Substitution zur Verfügung, da das von dem 25.8 kD Gen bereitgestellte ATG sich nicht im Leseraster des FeLV env ATG befindet und daher kein Fusionsprotein gebildet wird. Das FP-1 Insertionsplasmid, das den FP25.8 kD Promotor oberhalb des FeLV env Gens enthielt, wurde als pFeLV25.8F1 bezeichnet.This fragment was flattened at the ends and then inserted into an FP-1 insertion vector (pFeLVFI; see Example 15) containing FeLV env sequences digested with Sma. This insertion vector allowed recombination with the f7 locus of the FP-1 genome. The insertion of the FP25.8K promoter upstream sequences on the 5 'side of the FeLV env gene and the correct orientation was confirmed by sequence analysis. This insertion does not provide a perfect ATG for ATG substitution, since the ATG provided by the 25.8 kD gene is not in the reading frame of the FeLV env ATG and therefore no fusion protein is formed. The FP-1 insertion plasmid, which contained the FP25.8 kD promoter above the FeLV env gene, was named pFeLV25.8F1.
Eine ähnliche Konstruktion wurde hergestellt unter Verwendung des das FeLV Gen enthaltenden Vacciniavirus-Insertionsvektors pFeLVIA (siehe Beispiel 15). Der H6-Promotor wurde aus pFeLVIA ausgeschnitten durch Verdau mit Bgl II und Sma I. Nachdem die Bgl il-Restriktionsstelle am Ende glatt gemacht war, wurde das den FP25.8K Promotor enthaltende, am Ende glatt gemachte 270 bp Eco RV/Eco Rl-Fragment neben dem 5'-Ende des FeLV env-Gens bestätigt. Diese Konstruktion wurde durch Sequenzanalyse überprüft. Auch in dieser Rekombinante gibt es kein perfektes ATG für ATG Substitution, da das ATG und das 25.8 kD Gen nicht im Leseraster mit dem ATG des FeLV-Gens ist. Der die 25.8KD Gen upstream-Region neben dem 5'-Ende des FeLV-Gens enthaltende Vaccinia-Insertionsvektor (Kopenhagen-Stamm) wurde als pFeLV25.81A bezeichnet.A similar construction was made using the vaccinia virus insertion vector pFeLVIA containing the FeLV gene (see Example 15). The H6 promoter was excised from pFeLVIA by digestion with Bgl II and Sma I. After the Bgl II restriction site was blunted at the end, the 270 bp Eco RV / Eco Rl containing the FP25.8K promoter was blunted at the end. Fragment confirmed next to the 5 'end of the FeLV env gene. This construction was checked by sequence analysis. In this recombinant, too, there is no perfect ATG for ATG substitution, since the ATG and the 25.8 kD gene are not in reading frame with the ATG of the FeLV gene. The vaccinia insertion vector (Copenhagen strain) containing the 25.8KD gene upstream region next to the 5 'end of the FeLV gene was named pFeLV25.81A.
Die Insertionsplasmide pFeLV25.8F1 und pFeLV25.81A wurden zur in vitro Rekombination mit FP-1 (pFeLV25.8F1) und dem Kopenhagen-Stamm des Vacciniavirus (pFeLV25.81A) als den auffangenden Viren benutzL Die Nachkommenschaft der Rekombination wurde auf passende Zell-monolayer plattiert und rekombinante Viren wurden nach einen Immuntest mit mit ß-Galactosidase verbundenem Protein A und einem Rinder-anti-FeLV-Serum (Antibodies, Inc., Davis, CA.) ausgewählt. Vorläufige Ergebnisse legen nahe, daß der FP25.8K Promotor die Expression von Fremdgenen in Pockenviren-Rekombinanten steuern kann.The insertion plasmids pFeLV25.8F1 and pFeLV25.81A were used for in vitro recombination with FP-1 (pFeLV25.8F1) and the Copenhagen strain of the vaccinia virus (pFeLV25.81A) as the catching virus. The progeny of the recombination was used on suitable cell monolayers plated and recombinant viruses were selected after an immunoassay with β-galactosidase-linked protein A and bovine anti-FeLV serum (Antibodies, Inc., Davis, CA.). Preliminary results suggest that the FP25.8K promoter can control the expression of foreign genes in smallpox virus recombinants.
Beispiel 24Example 24
Sicherheit und Wirksamkeit von vFP-6 und vCP-16 bei GeflügelSafety and effectiveness of vFP-6 and vCP-16 in poultry
Mit den beiden Avipoxrekombinanten vFP-6 und vCP-16 (beschrieben in den Beispielen 6 und 37With the two Avipox recombinants vFP-6 and vCP-16 (described in Examples 6 and 37
AT 408 549 B 13) wurden 18 Tage alte Hühnerembryonen, Eintagsküken und 28 Tage alte Küken beimpft und die Reaktion der Vögel nach drei Kriterien ausgewertet: 1) Effekt der Impfung auf das Ausschlüpfen, Impfreaktionen und Sterblichkeit 2) die von dem Tollwutglykoprotein hervorgerufene Immunantwort und 3) die von den Geflügelpockenantigenen hervorgerufene Immunantwort. Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt. A. Sicherheitstests·AT 408 549 B 13) 18 day old chicken embryos, day old chicks and 28 day old chicks were inoculated and the response of the birds was evaluated according to three criteria: 1) effect of vaccination on hatching, vaccination reactions and mortality 2) the immune response caused by rabies glycoprotein and 3) the immune response elicited by the chickenpox antigens. The experiments were carried out as follows. A. Security tests
Gruppen von zwanzig 18 Tage alten Embryonen wurden in die Allantoishöhle mit 3,0 oder 4,0 log-ιο TCID50 entweder von vFP-6 oder vCP-16 beimpft. Nach den Ausschlüpfen wurden die Küken 14 Tage beobachtet, danach wurde ihnen einzeln Blut entnommen und die Seren gesammelt. Die beiden Rekombinanten, mit denen die Hühnerembryonen beimpft wurden, hatten keinen Effekt auf die Ausschlüpfrate der Eier und die Küken blieben gesund während der 14-tägigen Beobachtungsphase.Groups of twenty 18 day old embryos were inoculated into the Allantoic Cave with 3.0 or 4.0 log-TCO50 from either vFP-6 or vCP-16. After hatching, the chicks were observed for 14 days, after which blood was taken individually and the sera collected. The two recombinants used to inoculate the chicken embryos had no effect on the egg hatching rate and the chicks remained healthy during the 14-day observation period.
Gruppen von zehn SPF-Eintagsküken wurden mit 3,0 log10 TCID50 einer jeden der Rekombinanten intramuskulär geimpft. Die Küken wurden 28 Tage lang beobachtet und Serumproben 14 und 28 Tage nach der Impfung gesammelt. Mit keiner der beiden Rekombinanten wurde eine Impfreaktion an der Impfstelle beobachtet und die Küken blieben gesund während der 28 Tage der Beobachtungsphase.Groups of ten SPF day-old chicks were vaccinated intramuscularly with 3.0 log10 TCID50 of each of the recombinants. The chicks were observed for 28 days and serum samples were collected 14 and 28 days after vaccination. No vaccination reaction was observed at the vaccination site with either recombinant and the chicks remained healthy during the 28 days of the observation phase.
Gruppen von zehn 28 Tage alten Küken wurden mit einem der beiden rekombinanten Viren beimpft, wobei sie entweder 3,0 log10 TCID50 intramuskulär oder 3,0 log10 TCID50 über die Hautroute (Geflügelnetzwerk) erhielten. Die Küken wurden 28 Tage lang beobachtet und Serumproben 14 und 28 Tage nach der Impfung gesammelt. Bei keiner der beiden Rekombinanten wurde eine Reaktion auf die intramuskuläre Impfung beobachtet. Impfung in die Haut führte zu einer sehr kleinen Impfreaktion auf Geflügelpocken mit Läsionen, die in der Größe heterogen waren. Kanarien-pockenimpfung führte zur Ausbildung einer normalen Läsion auf der Haut an der Impfstelle. Alle Läsionen waren bis zum Ende des Experiments zurückgegangen. B. Immunantwort.Groups of ten 28 day old chicks were inoculated with one of the two recombinant viruses, receiving either 3.0 log10 TCID50 intramuscularly or 3.0 log10 TCID50 via the skin route (poultry network). The chicks were observed for 28 days and serum samples were collected 14 and 28 days after vaccination. No response to intramuscular vaccination was observed in either recombinant. Vaccination into the skin resulted in a very small vaccination response to chickenpox with lesions that were heterogeneous in size. Canary pox vaccination resulted in the formation of a normal lesion on the skin at the vaccination site. All lesions had decreased by the end of the experiment. B. Immune response.
Der in Beispiel 7 beschriebene RFFI-Test wurde benutzt, um die Mengen an Antikörper gegen das Tollwutglykoprotein festzustellen. Für jede Gruppe wurden die Ergebnisse als der geometrisch gemittelte Titer der individuellen Seren ausgedrückt, die auf Internationale Einheiten (IU) entsprechend einem Standardserum umgerechnet wurden, das 23,4 IU enthielt Der kleinste positive Wert wurde als ein IU festgelegt und benutzt, um die Prozentzahl positiver Vögel zu bestimmen. Antikörper gegen Avipoxviren wurden mit einer ELISA-Methode unter Verwendung eines Geflügelpok-kenvirusstamms als Antigen getestet. Jede Serumprobe wurde 1/20 und 1/80 verdünnt. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung der positiven und negativen Seren aufgestellt. Der kleinste positive Wert wurde berechnet, indem das Mittel der verschiedenen Werte der negativen Seren mit zweifacher Standardabweichung hinzugefügt wurde.The RFFI test described in Example 7 was used to determine the levels of antibody to the rabies glycoprotein. For each group, the results were expressed as the geometric mean titer of the individual sera converted to International Units (IU) according to a standard serum containing 23.4 IU. The smallest positive value was set as an IU and used to calculate the percentage to determine positive birds. Antibodies against avipox viruses were tested by an ELISA method using a poultry pox virus strain as the antigen. Each serum sample was diluted 1/20 and 1/80. A standard curve was drawn up using the positive and negative sera. The smallest positive value was calculated by adding the mean of the different values of the negative sera with twice the standard deviation.
Die Ergebnisse der serologischen Beobachtungen werden in Tabelle XV für vFP-6 und Tabelle XVI für vCP-16 gezeigt.The results of the serological observations are shown in Table XV for vFP-6 and Table XVI for vCP-16.
Eine begrenzte Antikörperbildung sowohl auf Tollwut wie auf Geflügelpockenantigene wurde beobachtet bei Embryonen, die entweder mit vFP-6 oder vCP-16 beimpft waren. Der Geflügelpockenvektor rief eine Antikörperbildung auf beide Antigene in einer größeren Anzahl von Vögeln hervor als der Kanarienpockenvektor, doch die Antwort war immer noch heterogen.Limited antibody formation on both rabies and fowlpox antigens was observed in embryos inoculated with either vFP-6 or vCP-16. The fowlpox vector raised antibodies to both antigens in a larger number of birds than the canarypox vector, but the response was still heterogeneous.
Mit vFP-6 beimpfte Eintagsküken zeigten eine gute Antikörperbildung, wobei alle Küken auf Tollwut und Geflügelpockenantigene seropositiv 28 Tage nach der Impfung waren. Die Antwort auf die Impfung mit vCP-16 war sehr viel niedriger, wobei 40 % der Küken seropositiv für Tollwutglykoprotein nach 28 Tagen und 10 % seropositiv für Avipoxantigene waren.Day-old chicks inoculated with vFP-6 showed good antibody formation, with all chicks seropositive for rabies and fowlpox antigens 28 days after vaccination. The response to vaccination with vCP-16 was much lower, with 40% of the chicks seropositive for rabies glycoprotein after 28 days and 10% seropositive for avipoxantigens.
Mit vFP-6 intramuskulär geimpfte, 28 Tage alte Küken zeigten 100 % Serokonversion auf beide Antigene 14 Tage nach der Impfung. Obwohl die Mehrzahl der Küken ebenso Serokonversion nach Impfung in die Haut zeigte, waren die erreichten Titer sowohl für Tollwut- wie für Avipoxantigene viel niedriger. Wie zuvor zeigten mit vCP-16 sowohl über den intramuskulären als auch den kutanen Weg geimpfte Küken eine uneinheitliche Antwort mit einem Maximalwert von 70 % Serokonversion auf Tollwut über intramuskuläre Beimpfung. Der niedrige Wert einer Serokonversion für Avipoxantigene nach Impfung mit Kanarienpocken könnte den Grad der serologischen Verwandt- 3828 day old chicks vaccinated intramuscularly with vFP-6 showed 100% seroconversion to both antigens 14 days after vaccination. Although the majority of chicks also showed seroconversion after inoculation into the skin, the titers achieved were much lower for both rabies and avipox antigens. As before, vCP-16 vaccinated chicks vaccinated both intramuscularly and cutaneously gave a non-uniform response with a maximum of 70% seroconversion to rabies via intramuscular inoculation. The low level of seroconversion for avipoxantigens after vaccination with canarypox could indicate the level of serological 38
AT 408 549 B schaft zwischen den Viren widerspiegeln.AT 408 549 B between the viruses.
Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl vFP-6 wie vCP-16 sicher für die Impfung von Hühnern in einem weiten Altersbereich sind. Der Geflügelpockenvektor vFP-6 scheint effizienter bei der Auslösung einer Immunantwort in Hühnern zu sein. Für die beiden rekombinanten Avipoxviren Geflügelpocken und Kanarienpocken wurde aber signifikant gezeigt, daß sie für eine Impfung |n ovum nützlich sind.The results show that both vFP-6 and vCP-16 are safe for vaccinating chickens in a wide range of ages. The chickenpox vector vFP-6 appears to be more efficient in triggering an immune response in chickens. However, the two recombinant avipox viruses, poultry pox and canary pox, were shown to be significantly useful for vaccination | n ovum.
Tabelle XVTable XV
Immunantwort aeaen Geflüaeloocken/Tollwut-GIvkoDrotein (vFP-6! bei Hühnern verschiedenen Alters Antikörper Dosis Zeit nach Impfung Tollwut Glykoprotein Geflügelpocken Positive Gruppen (TCIDso) (Tage) 0 IU Titer %Vögel/1IU 0 Elisa OD %Immune response to poultry loocks / rabies glucodrotein (vFP-6! In chickens of different ages Antibody dose time after vaccination rabies glycoprotein poultry pox positive groups (TCIDso) (days) 0 IU titer% birds / 1IU 0 Elisa OD%
Embryonen 103 3 + 14 0.28 15% 0.125 54% 18 Tage alt 104 3 + 14 0.87 30% 0.129 46% Eintagsküken i.m. 103 14 1.8 90% 0.109 70% 28 4.2 100% 0.234 100% 28 Tage alte 103 14 3.7 100% 0.317 100% Küken, i.m. 28 2.7 100% 0.378 100% 28 Tage alte 103 14 1.6 100% 0.191 100% Küken, 28 0.54 90% 0.161 80%Embryos 103 3 + 14 0.28 15% 0.125 54% 18 days old 104 3 + 14 0.87 30% 0.129 46% day-old chicks i.m. 103 14 1.8 90% 0.109 70% 28 4.2 100% 0.234 100% 28 days old 103 14 3.7 100% 0.317 100% chick, i.m. 28 2.7 100% 0.378 100% 28 day old 103 14 1.6 100% 0.191 100% chicks, 28 0.54 90% 0.161 80%
DurchstechungPuncture
Tabelle XVITable XVI
Immunantwort gegen Kanarienvogelpocken/Tollwut-Glykoprotein (vCP-16) von Hühnern bei verschiedenem AlterImmune response to canary pox / rabies glycoprotein (vCP-16) from chickens at various ages
Antikörperantibody
Dosis Zeit nach Impfung Tollwut Glykoprotein Kanarienpocken Positive Gruppen (TCIDso) (Tage) 0 IU Titer %Vögel/1IU 0 Elisa OD %Dose time after vaccination rabies glycoprotein canarypox positive groups (TCIDso) (days) 0 IU titer% birds / 1IU 0 Elisa OD%
Embryonen 103 3+14 0.14 0% 0.068 25% 18 Tage alt 104 3 + 14 0.19 8% 0.059 25% Eintagsküken i.m. 103 14 0.18 10% 0.027 0% 28 0.21 40% 0.059 10% 39Embryos 103 3 + 14 0.14 0% 0.068 25% 18 days old 104 3 + 14 0.19 8% 0.059 25% day-old chicks i.m. 103 14 0.18 10% 0.027 0% 28 0.21 40% 0.059 10% 39
AT 408 549 BAT 408 549 B
Antikörper Dosis Zeit nach Impfung Tollwut Glykoprotein Geflügelpocken Positive Gruppen (TCIDso) (Tage) 0 IU Titer %Vögel/1IU 0 Elisa OD % 28 Tage alte 103 14 0.61 70% 0.093 60% Küken i.m. 28 0.24 30% 0.087 30% 28 Tage alte Küken 10 14 0.34 40% 0.071 30% Durchstechung 28 0.11 10% 0.061 10%Antibody Dose Time after vaccination Rabies Glycoprotein Chickenpox Positive groups (TCIDso) (days) 0 IU titer% birds / 1IU 0 Elisa OD% 28 days old 103 14 0.61 70% 0.093 60% chick i.m. 28 0.24 30% 0.087 30% 28 day old chicks 10 14 0.34 40% 0.071 30% puncture 28 0.11 10% 0.061 10%
Beispiel 25Example 25
Sicherheit und immunoaene Wirkung einer Impfung von Ferkeln mit vFP-6Safety and immunogenic effects of vaccination of piglets with vFP-6
Zwei Gruppen von drei Ferkeln wurden mit der Rekombinante vFP-6 beimpft über einen der beiden Wege: a) drei Tiere erhielten 8,1 log10TCID50 durch eine intramuskuläre Impfung; und b) drei Tiere erhielten die gleiche Dosis durch orale Impfung.Two groups of three piglets were vaccinated with the recombinant vFP-6 in one of two ways: a) three animals received 8.1 log10TCID50 by intramuscular vaccination; and b) three animals received the same dose by oral vaccination.
Allen Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen und alle Tiere erhielten eine Auffrisch im pfung der gleichen Dosis über den gleichen Weg am Tag 35. Die Ferkel wurden täglich auf klinische Symptome beobachtet. Die Seren wurden auf anti-Geflügelpocken-Antikörper mit einem ELISA-Test und einen Serumneutralisationstest geprüft. Tollwutantikörper wurden in einem RFFl-Test bestimmt.Blood was drawn from all animals at weekly intervals and all animals were refreshed at the same dose by the same route on day 35. The piglets were observed daily for clinical symptoms. The sera were checked for anti-fowlpox antibody with an ELISA test and a serum neutralization test. Rabies antibodies were determined in an RFFL test.
Alle Ferkel blieben bei guter Gesundheit und keine Läsionen wurden nach der Impfung beobachtet. Die Temperaturkurven waren normal, wobei kein Unterschied zwischen geimpften und nicht geimpften Tieren zutage trat. Sowohl die über den intramuskulären als auch oralen Weg geimpften Ferkel entwickelten eine Antikörperbildung auf Geflügelpockenantigene, wie durch ELISA- und Serumneutralisation bestimmt wurde. Eine zweite Antwort war offenkundig nach der Auffrischimpfung. (Ergebnisse nicht gezeigt). Alle Ferkel entwickelten außerdem eine Immunantwort auf Tollwutglykoprotein, wie in einem RFFl-Test bestimmt, und ein Auffrischeffekt war bei beiden Wegen offenkundig. Diese Ergebnisse sind in Tabelle XVII zusammengefaßt.All piglets remained in good health and no lesions were observed after vaccination. The temperature curves were normal with no difference between vaccinated and non-vaccinated animals. Both piglets vaccinated via the intramuscular and oral route developed antibody formation on poultry pox antigens as determined by ELISA and serum neutralization. A second answer was evident after the booster shot. (Results not shown). All piglets also developed an immune response to rabies glycoprotein, as determined in an RFFL test, and a refreshing effect was evident in both routes. These results are summarized in Table XVII.
Die Ergebnisse zeigen an, daß die Impfung mit Geflügelpocken/Tollwutrekombinanten unschädlich für Ferkel ist und daß die Rekombinante in der Lage ist, eine signifikante Immunantwort auf das Tollwutglykoprotein nach oraler oder intramuskulärer Impfung hervorzurufen.The results indicate that vaccination with poultry pox / rabies recombinants is harmless to piglets and that the recombinant is able to elicit a significant immune response to rabies glycoprotein after oral or intramuscular vaccination.
Tabelle XVIITable XVII
Gegen Tollwutglykoprotein erzeugte Antikörper in mit vFP-6 geimpften FerkelnAntibodies raised against rabies glycoprotein in piglets vaccinated with vFP-6
Impfweg Tier Tollwut Antikörper nach (RFFI Titer)Vaccination route animal rabies antibody according to (RFFI titer)
Nr. Tagen 14 21 28 35b 42 49 984 2.4a 2.2 2.1 2.2 3 3 I.M. 985 2.5 2.7 2.6 2.4 3 3 986 2.2 2.0 2.1 2.3 3 3 40Days 14 21 28 35b 42 49 984 2.4a 2.2 2.1 2.2 3 3 I.M. 985 2.5 2.7 2.6 2.4 3 3 986 2.2 2.0 2.1 2.3 3 3 40
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