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Verfahren zur Herstellung von Va15-Hypertensin-II
Von den biologisch wirksamen synthetischen Peptiden haben in der Therapie bisher nur das Oxytocin und das Hypertensin praktische Anwendung gefunden. Neben dieser praktischen Anwendung haben die auf diesem Gebiet arbeitenden Forscher auch zahlreiche Fragen von theoretischem Interesse untersucht. Es wurde z. B. festgestellt, dass der aus dem Blutplasma der Pferde und Rinder isolierte blutdrucksteigernde Stoff durch Einwirkung des Enzyms Renin aus dem Angiotensin entsteht. Die Strukturaufklärung hat gezeigt, dass dieser Stoff ein Dekapeptid ist ; es wurde ferner festgestellt, dass das aus Pferdeplasma gewonnene sogenannte Angiotensin I oder Hypertensin I sich dadurch vom aus Rinderplasma hergestellten gleichgenannten Produkt unterscheidet, dass in Stellung 5 der Peptidkette Isoleucin anstatt von Valin steht.
Das Hypertensin I wird durch Einwirkung des in fast jedem Teil des lebendigen Organismus vorkommenden "Converting" Enzyms unter Abspaltung des Dipeptids Histidyl-leucin in ein Octapeptid übergeführt, welches Hypertensin II oder Angiotensin II genannt wurde. Die Wirkungen von Hypertensin I und Hypertensin II sind nahezu identisch ; ein gewisser Unterschied konnte nur bei mit verschiedenen isolierten Organen durchgeführten genauen Messungen festgestellt werden. Nach Aufklärung der Struktur dieser Produkte wurden sie auch synthetisch hergestellt ; die synthetischen Produkte zeigten mit denen der natürlichen Hypertensine vollständig identische Wirkungen.
Der Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Vals Hypertensin-II. Diese VerbindungwurdesowohlvonR. Schwyzer usw./Chimia 10, [1956J S. 265 ; 11, [1957J S. 335 ; 12, [1958]
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der Synthese geschützt wurde. Die Entfernung dieser schützenden Gruppe kann dann im letzten Schritt der Synthese durch saure oder alkalische Hydrolyse erfolgen. Es ist aber eben aus den eingehenden Untersuchungen von R. Schwyzer usw./Helv. 41, [1958] S. 1273/bekannt, dass während dieser hydrolytischen FreisetzungderCarboxylgruppeauchdieCarboxamidgruppe desin der Stellung 1 befindlichen Asparaginylrestes eine partielle Hydrolyse erleidet.
Wenn man noch in Betracht zieht, dass auch die gewünschte Hydrolyse nicht quantitativ verläuft und dadurch im Reaktionsprodukt auch unveränderter Methylester nachgewiesen werden kann, sieht man, dass das auf diese Weise erhaltene Reaktionsgemisch ausser dem gewünschten Produkt noch drei andere Verbindungen enthält von denen es noch isoliert werden muss.
Es wurde gefunden, dass dieser Nachteil des bekannten Verfahrens vermieden werden kann und praktisch reines Hypertensin II als Reaktionsprodukt erhalten wird, wenn man zum Schutz der Carboxylgruppe des Phenylalanins die Benzylgruppe verwendet ; auf diese Weise kann nämlich die Anwendung von Hydrolyse überhaupt vermieden werden und sämtliche schützende Gruppen können in einem einzigen Reaktionsschritt, durch katalytische Hydrierung entfernt werden.
Es wurde ferner gefunden, dass auch die Wahl der zum vorübergehenden Schutz der N-terminalen
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Aminogruppen dienenden Gruppe von entscheidender Wichtigkeit sei. Wenn man zu diesem Zweck die zu Peptidsynthesen zuerst von uns verwendete p-Chlor-benzyloxycarbonyl-gruppe verwendet, dann wird es möglich auch solche Intermediärverbindungen in kristalliner Form, also in der praktisch maximalen Reinheit zu erhalten, welche bisher überhaupt nicht in reiner Form hergestellt werden konnten.
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des Hexapeptids verwendet und das aus diesem hergestellte Azid mit dem Tetrapeptidester kondensiert wird.
Der Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Va15 -Hypertensin-II (L-Aspa- raginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-propyl-L-phenylalanin, durch stufenweises Kondensieren von kupplungsfähigen Derivaten von L-Propyl-L-phenylalanin mit L-Valyl-L-histidin, L-Valyl-L-tyrosin und L-Asparaginyl-L-arginin, wobei die nicht reagierenden Carboxyl-und Amino-Gruppen durch Veresterung bzw.
Acylierung geschützt werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure, des L-Phenylalanins durch Veresterung mit einer Benzylgruppe und die N-terminalenAminogruppen sämtlicher Intermediäre durch Acylieren mit p-Chlorbenzyloxycarbonylgruppen bei den Kondensationen geschützt werden, wobei die N-geschützten Dipeptide L-Valyl-L-histidin und L-Valyl-L-tyrosin in Form von Aziden zur Kondensation verwendet werden, und die am erhaltenen, geschützten Octapeptidester als abzuspaltende Schutzgruppen anwesenden Benzyl-, Nitro-und p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppen in einem einzigen Verfahrensschritt durch katalytische Hydrierung abgespaltet werden.
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Durch die Anwendung der erwähnten, bisher zu diesem Zweck nicht verwendeten Schutzgruppen zur vorübergehenden Beschützung der C-terminalen und der N-terminalen Gruppen und durch die oben er-
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Reinheitsgrad hergestellt und dadurch auch das Endprodukt ohne besonderen Reinigungsoperationen, in bisher unmittelbar unerreichbarer Reinheit erhalten wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch das nachfolgende Beispiel näher veranschaulicht. Die im Beispiel angegebenen Schmelzpunkte wurden mit der Kapillarmethode bestimmt. Die Bestimmung der Rf-Werte erfolgte entweder (1) in einem Lösungsmittelsystem von n-Butanol-Eisessig-Wasser 4 : 1 : 5 oder (2) von Isoamylalkohol-Pyridin-Wasser 1 : 1 : 2 ; die Papierchromatogramme wurden mit Chlor und Benzydin entwickelt.
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wird bei -200C unter starkem Rühren tropfenweise mit 8, 4 ml Triäthylamin und dann nach 5min weiterem Rühren 5,7 ml Chlorkohlensäure-äthylester versetzt.
Separat werden 12,9 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid in 170 ml abs. Tetrahydrofuran suspendiert und mit 8,4 ml Triäthylamin versetzt. Nach 15 min schütteln wird das abgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat wird bei -200C tropfenweise der auf obige Weise bereiteten Lösung des gemischten Anhydrids zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 1, 5 h weiter gerührt, dann über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand in einem Gemisch von Äthylacetat und Wasser (2 : 1 Vol) gelöst. Die organische Phase wird abgetrennt, mit verdünnter Salzsäure, dann mit wässeriger Natriumhydrocarbonatlösung und endlich
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mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann wird das Äthylacetat abdestilliert.
Das als Rückstand erhaltene farblose Öl wird aus einem Gemisch von abs. Äther und Petroläther kristallisiert. Es werden 18,0 g
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in Äthanol) : Rf (1) = 0,89, Rf (2) = 0,95.
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<tb>
<tb> Analyse: <SEP> C23H25N2O5Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 444,9
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> N <SEP> 5,1% <SEP> Cl <SEP> 8,0%
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> N <SEP> 5, <SEP> 2% <SEP> Cl <SEP> 8, <SEP> 0%
<tb>
b) p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-phenylalanin-benzylester.
9, 94g p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-prolin werden in abs. Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung wird bei -200C tropfenweise mit 4, 9 ml Triäthylamin, dann mit 3, 34 ml Chlorkohlensäure-äthylester versetzt. Mit der so hergestellten gemischten Anhydrid werden dann 10, 15 g L-Phenylalanyl-benzylester aus dem Hydrochlorid frisch hergestellt in der im Beispiel l beschriebenen Weise acyliert. Das nach
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(72, 6% d. Th.) Dipeptid-benzylester(c = 1) in Chloroform); Rf (1) = 0, 92 ; Rf (2) = 0,96.
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<tb>
<tb>
Analyse <SEP> : <SEP> C29H29N2O5Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 520,94
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 66, <SEP> 9% <SEP> H <SEP> 5. <SEP> 6% <SEP> N <SEP> 5, <SEP> 40/0 <SEP> Cl <SEP> 6, <SEP> 8% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 66, <SEP> 0% <SEP> H <SEP> 5,6% <SEP> N <SEP> 5, <SEP> 7% <SEP> Cl <SEP> 6, <SEP> 9%.
<tb>
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14g Histidin-methylester- carbodiimid versetzt. Es beginnt sofort die Abscheidung des Carbamid-derivats. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehen gelassen, dann wird die gelartige Lösung aufgewärmt, das abgeschiedene Carbamidderivat wird abfiltriert und das Filtrat mit 600 ml Wasser versetzt.
Der gefällte Dipeptidester wird filtriert und getrocknet. werden 21,5 g (81,0% d.Th.) Dipeptidester erhalten; Schmp.159 - 162 C;
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<tb>
<tb> 00 <SEP> (c <SEP> = <SEP> 1 <SEP> in <SEP> Äthanol).Anaylse: <SEP> C20H25O5N4Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 436,89
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 55, <SEP> 0'% <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 8% <SEP> N <SEP> 12, <SEP> 8% <SEP> Cl <SEP> 8, <SEP> 1% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 55, <SEP> 0% <SEP> H <SEP> ss, <SEP> 2% <SEP> N <SEP> 12, <SEP> 8% <SEP> Cl <SEP> 8, <SEP> 3%
<tb>
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warm gelöst, dann mit 9,0 ml Hydrazinhydrat versetzt. Die Lösung wird 2 hunter Rückfluss gekocht. dann über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Das abgeschiedene Hydrazid wird filtriert, mit Methanol gewaschen und getrocknet.
Es werden 10,5 g Dipeptidhydrazid erhalten ; Smp. nach Umkristallisieren
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> : <SEP> C <SEP> H <SEP> ONCl <SEP> Molgewicht <SEP> 436, <SEP> 89 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 52, <SEP> 4% <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 8% <SEP> N <SEP> 19, <SEP> 2% <SEP> Cl <SEP> 8, <SEP> 10/0
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 52, <SEP> 5% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 1% <SEP> N <SEP> 19, <SEP> 0% <SEP> ci <SEP> 8, <SEP> 410. <SEP>
<tb>
e) p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-benzylester.
10. 44 g des nach d) erhaltenen Hydrazids werden in 72 ml N Salzsäure gelöst und die Lösung wird bei -50C mit 160 ml Äthylacetat und dann bei derselben Temperatur tropfenweise, unter Rühren mit der wässerigen Lösung von 1, 68 g Natriumnitrit versetzt. Nach 5 min weiterem Rühren wird der PH-Wert der Lösung mit gesättigter Natriumcarbonatlösung auf 8 gestellt, die wässerige Phase abgetrennt und mit Äthylacetat dreimal ausgeschüttelt. Die Äthylacetat-Extrakte werden vereinigt und unter stetigem Kühlen mit Wasser dreimal ausgeschüttelt. Das im Äthylacetat gelöste Wasser wird dann durch Ausfrieren entfernt und die auf diese Weise hergestellte Azidlösung wird einer mit Äthylacetat bereiteten Lösung von
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mit Triäthylamin zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehen gelassen, dann mit 3% iger Natriumhydrocarbonatlösung und mit Wasser ausgeschüttelt und das Lösungsmittel wird in Vakuum abdestilliert. Der erhaltene schaumige Rückstand wird mit Petroläther verrieben und getrocknet. Es werden
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> : <SEP> C40H45O7N6Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 757,26
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> N <SEP> 11, <SEP> 1%
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> N <SEP> 11, <SEP> 3%
<tb>
Der in gleicher Weise hergestellte p-Chlorbenzyloxycarbonyl-tetrapeptid-methylester schmilzt
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> : <SEP> C34H41O7N6Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 681, <SEP> 17 <SEP>
<tb> bereichnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 60, <SEP> 0% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 1% <SEP> N <SEP> 12, <SEP> 4% <SEP> Cl <SEP> 5, <SEP> 2%
<tb> gefunden <SEP> :
<SEP> C <SEP> 59, <SEP> 7% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 4% <SEP> N <SEP> 12, <SEP> 3% <SEP> Cl <SEP> 5, <SEP> 2%.
<tb>
f) L-Valyl-histidyl-L-prolyl-L-phenyl-alanin-benzylester.
8, 0 g des nach e) erhaltenen geschützten Tetrapeptid-benzylesters werden in 40 ml Eisessig gelöst und die Lösung wird mit 40 ml zuiger Eisessig-Bromwasserstofflösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei 200C gehalten, dann wird das Tetrapeptid-benzylester-hydrobromid durch Zugabe von 300 ml abs. Äther gefällt, mit abs. Äther mehrmals gewaschen und in 120 ml Wasser gelöst. Der PH-Wert der wässerigen Lösung wird durch Zugabe von festem Natriumcarbonat auf 8 gestellt und der ausgeschiedene Niederschlag wird mit einem 1 : 1 Gemisch von n-Butanol und Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und in Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben und filtriert.
Es werden auf diese Weise 4, 1 g (62, l% d. Th.) freier Tetrapeptid-benzylester erhalten. Dieses Produkt erweist sich bei chromatographischer Analyse als einheit-
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g) p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosin-methylester.
7, 8g p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-valin und 5, 3g L-tyrosin-methylester werden in 60 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung wird mit 6,3 g Dichclohexyl-carbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen, dann wird das abgeschiedene Dicyclohexylcarbamid durch Filtrieren entfernt, die Lösung wird mit Tetrahydrofuran gewaschen, dann wird das Tetrahydrofuran in Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 2n-Salzsäure, mit 5%iger Natriumhydrocarbonatlösung und zuletzt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird verdampft, der weisse pulverförmige Rückstand mit Petroläther verrieben und abgenutscht. Es werden 9, 6 g (76, 2% d.
Th.) geschützter Dipeptidester erhalten, welcher aus Methanol
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Rf (2) = 0, 97.
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<tb>
<tb>
Analyse <SEP> : <SEP> C23H27O6N2Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 462, <SEP> 92 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 59, <SEP> 7% <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 9% <SEP> N <SEP> 6,1% <SEP> Cl <SEP> 7,7%
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 59, <SEP> 9% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 0% <SEP> N <SEP> 6, <SEP> 30/0 <SEP> Cl <SEP> 7,8%.
<tb>
h) p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosin-hydrazid.
9, 45 g des nach g) erhaltenen geschützten Dipeptidesters werden in 94, 5 ml abs. Methanol gelöst, und die Lösung wird mit 4, 7 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 h unter Rückfluss gekocht. Die abgeschiedenen Kristalle werden nach Abkühlen abgenutscht, mit abs. Methanol gewaschen und getrocknet.
Es werden 8, 25 g (87,2% d. Th.) geschütztes Dipeptid-hydrazid erhalten; Schmp. 230 bis 2310Ci das aus 50%item Dioxan oder aus abs. Äthanol umkristallisierte Produkt schmilzt bei 240-2420C.
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> : <SEP> C22H27O5N4Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 462, <SEP> 94 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 57, <SEP> 0% <SEP> H <SEP> 5, <SEP> 9% <SEP> N <SEP> 11, <SEP> 9% <SEP> Cl <SEP> 7, <SEP> 7% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 56, <SEP> 8% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 1% <SEP> N <SEP> 11,5% <SEP> Cl <SEP> 8,0%.
<tb>
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ester.
1, 4 g des nach h) erhaltenen Hydrazids werden im Gemisch von 0, 72 ml konz. Salzsäure und 7mlDimethylformamidgelöst. NachvollständigerAuflösungwirdeinemitminimalerWassermengebereitete und mit 2 ml Dimethylformamid verdünnte Lösung von 0, 21 g Natriumnitrit bei -50C tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wird bei derselben Temperatur 20 min gerührt, dann mit 1, 26 ml Triäthylamin
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versetzt (PH = 8).
1, 77 g L-Valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-benzylester werden in 5ml Dimethylformamid gelöst und der auf obige Weise hergestellten Azidlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei
Zimmertemperatur stehen gelassen, dann wird das Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand in einem 1 : 1 Gemisch von Butanol und Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Natriumhydro- carbonatlösung, dann mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und in Vakuum zur Trockene verdampft.
Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und getrocknet. Es werden 2, 8 g (91, 5% d. Th.) geschützter Hexapeptid-benzylester erhalten, welcher bei 1130C unter Aufschäumung schmilzt ; [α]20 = -32,5 (c = 2 in Äthanol); Rf (1) = 0. 94 ; rif (2) = 0, 93.
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<tb>
Analyse <SEP> : <SEP> CS4 <SEP> H63 <SEP> 010 <SEP> Ns <SEP> Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 1019, <SEP> 56 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> N <SEP> 11, <SEP> 2% <SEP> Cl <SEP> 3, <SEP> 5% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> N <SEP> 10, <SEP> 7% <SEP> Cl <SEP> 3, <SEP> 50/0. <SEP>
<tb>
j) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-benzylester.
5, 3 g des nach i) hergestellten geschützten Hexapeptid-benzylesters werden mit 26, 5 ml in Eisessig gelöster Bromwasserstoffsäure behandelt. Nach 1 h Schütteln wird das Hexapeptidester-dihydrobromid mit abs. Äther gefällt, mit abs. Äther mehrmals gewaschen und dann in 120 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der wässerigen Lösung wird mit festem Natriumcarbonat auf 7, 5 gestellt und das ausgeschiedene Produkt wird in einem 1 : 1 Gemisch von Butanol und Chloroform extrahiert. Die abgetrennte organische Lösung wird mit verdünnter Natriumhydrocarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und in Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und getrocknet. Es werden 3,4 g (77,0% d. Th.) Hexapeptid-benzylester erhalten.
Das chromatographisch einheitliche Produkt
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<tb> -1030C. <SEP> [ci. <SEP> JAnalyse <SEP> : <SEP> C46H58O8N <SEP> Molgewicht <SEP> 850, <SEP> 99 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 64, <SEP> 8% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> Wo <SEP> N <SEP> 13, <SEP> 2% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 64, <SEP> 6% <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 90/0 <SEP> N <SEP> 13, <SEP> 2%. <SEP>
<tb>
k) p-Chlrobenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-#-NO2-arginin-methylester.
5, 4 g w-NO -Arginin-methylester-hydrochlorid werden in 54 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2, 8 ml Triäthylamin versetzt. Die Lösung wird 1/2 h in Eiswasser gestellt, das abgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat mit 6, 0 g p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-asparagin und
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gewaschen. Die getrocknete Lösung wird in Vakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand mit abs. Äther verrieben und filtriert. Es werden 4, 26 g (41,2% d.Th.) geschützter Dipeptidester erhalten ; Schmp. 80 - 90 C; Rf (1) = 0, 84 : Rf (2) = 0, 93.
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<tb>
<tb>
Analyse: <SEP> C19H25O8N7Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 515, <SEP> 91 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> N <SEP> 19,0% <SEP> Cl <SEP> 6,9% <SEP> OCH <SEP> 6,0%
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> N <SEP> 18, <SEP> 7% <SEP> Cl <SEP> 7, <SEP> 1% <SEP> OCH <SEP> 6, <SEP> 4%. <SEP>
<tb>
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p-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-w-NOtriumhydroxydlösung versetzt und das Gemisch wird 1 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wird das Lösungsmittel in Vakuum bei 250C abdestilliert, der Rückstand in Wasser gelöst, filtriert und das Filtrat mit konz. Salzsäure zu PH = 3 angesäuert. Das abgeschiedene etwas zähe Produkt wird nach
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;in Eisessig); Rf (1) = -0,77; Rf (2) = 0, 40.
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<tb>
Analyse <SEP> : <SEP> C18H24O8N7Cl <SEP> Molgewicht <SEP> 501, <SEP> 89 <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> 43, <SEP> 0'% <SEP> H <SEP> 4, <SEP> 8% <SEP> N <SEP> 19, <SEP> 5% <SEP> Cl <SEP> 7. <SEP> 1% <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 42, <SEP> 9% <SEP> H <SEP> 5. <SEP> 1% <SEP> N <SEP> 19, <SEP> 2% <SEP> Cl <SEP> 7, <SEP> 1%. <SEP>
<tb>
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L-prolyl-L-phenylalanin-benzylester.0, 6 g des nach l) hergestellten p - Chlorbenzyl-oxycarbonyl-L -asparaginyl-w-nitro-arginin und 1, 0 g des nach Beispiel 10 hergestellten freien L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- - benzylester werden in 5 ml abs. Dimethylformamid gelöst und mit 0, 27 g Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt.
Das Gemisch wird 24 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann wird das abgeschiedene Carbamidderivat abfiltriert und das Filtrat in Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird mit abs. Äthylacetat verrieben, dann filtriert, mit Aceton und mit Methanol gewaschen und getrocknet. Es werden 1, 4g (87, 5% d. Th.) roher geschützter Octapeptid -benzylester erhalten ; Schmp. 218 - 2220C.
Das Produkt ist chromatographisch rein ; Rf (1) = 0,91; Rf (2) = 0, 91. n) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L -prolyl-L -phenylalanin (Va15 -Hyper- tension-11).
0, 32 g des nach m) erhaltenen geschützten Octapeptid werden in 20 ml 50% iger Essigsäure gelöst und nach Zugabe von 0, 4 Kuhn-Katalysator (Pd + BaSO) 11 h bei Atmosphärendruck hydriert. Nach Ab- filtrieren des Katalysators wird die Lösung in Vakuum zur Trockene verdampft, mit Benzol-Äthanol (l : l vol) Gemisch entwässert der Rückstand in Methanol gelöst und das Produkt durch Zugabe von abs. Äther gefällt. Es wird ein chromatographisch reines Produkt erhalten ; Rf (1) = 0, 16 ; Rf (2) = 0, 19.
Das Produkt zeigt bei biologischer Wertmessung an Ratten eine blutdruckerhöhende Wirkung, die mehr- fach grösser ist, als diejenige des Nor-Adrenalins.
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Analyse <SEP> : <SEP> C49H70N <SEP> . <SEP> CH3 <SEP> COOH. <SEP> 5H <SEP> O <SEP> Molgewicht <SEP> 1181, <SEP> 294. <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> c <SEP> 51, <SEP> 8 <SEP> 510 <SEP> H <SEP> 7, <SEP> 2% <SEP> N <SEP> 16,6%
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 52, <SEP> 42% <SEP> H <SEP> 7, <SEP> 20/0 <SEP> N <SEP> 16, <SEP> 40/0.
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PATENT ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Val -Hypertensin-II (L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl- - L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin, durch stufenweises Kondensieren von kupplungsfähigen Derivaten von L-Prolyl-L-phenylalanin mit L-Valyl-L-histidin, L-Valyl-L-tyrosin und L-Asparaginyl- - L-arginin, wobei die nicht reagierenden Carboxyl-und Amino-Gruppen durch Veresterung bzw.
Acylierung geschützt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylgruppe der C-termi- nalen Aminosäure, des L-Phenylalanins durch Veresterung mit einer Benzylgruppe und die N-terminalen Aminogruppen sämtlicher Intermediäre durch Acylieren mit p-Chlorbenzyloxycarbonylgruppen bei den Kondensationen geschützt werden, wobei die N-geschützten Dipeptide L-Valyl-L-histidin und L-Valyl- - L-tyrosin in Form von Aziden zur Kondensation verwendet werden, und die am erhaltenen, geschützten Octapeptidester als abzuspaltende Schutzgruppen anwesenden Benzyl-, Nitro- und p- Chlorbenzyloxy- carbonyl-Gruppen in einem einzigen Verfahrensschritt durch katalytische Hydrierung abgespaltet werden.
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