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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine unter Verwendung Fluoreszenzmarkierter Lipoproteine sowie entsprechende Sets zur Durchführung der Bestimmung.
Zellen besitzen Membranrezeptoren für Lipoproteine, beispielsweise für LDL, welche die zelluläre Aufnahme der Lipoproteine vermitteln. Anschliessend erfolgt der Einschluss dieser Lipoproteine in Lysosomen, in denen dann auch der Abbau der Lipoproteine erfolgt.
Bestimmte Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, besitzen Rezeptoren zur Aufnahme "modifizierter" Lipoproteine, beispielsweise Rezeptoren für azetylierte LDL. Die Aufnahme dieser modifizierten Lipoproteine wird über sogenannte Scavenger-Rezeptoren vermittelt.
Untersuchungen zur Zellrezeptor-vermittelten Aufnahme der Plasmalipoproteine und auch modifizierter Lipoproteine gewinnen zunehmend an Bedeutung, da die Rezeptorfunktion (LDL-Rezeptor, Scavenger-Rezeptor) bei der Entstehung von Arteriosklerose eine wichtige Rolle spielt.
Insbesondere ist heute bekannt, dass LDL-Cholesterin ein kausaler Risikofaktor für die Entstehung der Arteriosklerose ist. Eine hohe Aktivität des LDL-Rezeptors kann das Risiko einer Arteriosklerose also minimieren. Modifizierte Formen der Lipoproteine, beispielsweise oxidierte LDL, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle in der Entstehung der Arteriosklerose. Die Bestimmung der für die Aufnahme dieser modifizierten Stoffe entscheidenden Rezeptoraktivität lässt sich durch die Verwendung azetylierter oder oxidierter LDL unter standardisierten Bedingungen verfolgen. Untersuchungen der Scavenger-Rezeptoraktivität sind Gegenstand der Forschung und können in Zukunft zur Beurteilung der individuellen Arteriosklerosedisposition möglicherweise auch klinisch an Bedeutung gewinnen.
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Aus dem Stand der Technik sind beispielsweise mehrere in vitro Untersuchungen zum zellulären Metabolismus von Lipoproteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Tracer bekannt (siehe z. B. Goldstein J. L. et al., 1974, J. Biol. Chem., 249, p. 5133- 5162). Ein Nachteil solcher Methoden, die auf der Verwendung radioaktiver Substanzen beruhen, liegt allerdings in den hohen Sicherheitsanforderungen für das Personal, ein weiterer Nachteil im Problem der Abfallentsorgung radioaktiver Substanzen. Die Methoden sind im allgemeinen äusserst zeitaufwendig und teuer und daher für routinemässige Untersuchungen nur für Speziallaboratorien geeignet.
Neuere Ansätze zielen darauf hin, die radioaktiven Substanzen, die zur Markierung der Lipoproteine verwendet werden, durch Fluorochrome zu ersetzen. Als ein solches geeignetes Fluorochrom
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al., 1981, Arteriosclerosis, 1, p. 177-185). Dabei wird angenommen, dass diese Verbindungen, ähnlich wie dies bei Phospholipiden der Fall ist, mit der Oberfläche der Lipoproteine assoziieren.
Die Verwendung dieser Labels ist u. a. für natives und modifiziertes LDL bekannt, wobei sowohl LDL als auch Scavenger-Rezeptoraktivität mittels Fluoreszenz-Mikroskopie in kultivierten Zellen in vitro und in vivo untersucht worden sind. Die zelluläre Aufnahme der Lipoproteine erfolgt über die für Lipoproteine spezifischen Membranrezeptoren. Das Fluorochrom DiI wird beim Abbau des markierten Lipoproteins quantitativ in den Lysosomen festgehalten und von den Zellen sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen wieder abgegeben. Daher ist die Menge von aufgenommenem DiI proportional zur Menge des zellulär aufgenommenen Lipoproteins. Mittels FACS (= Fluorescence activated cell
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Lymphozyten durchgeführt.
Wie u. a. von Stephan et al., J. Lip. Res. 34,325-330, 1993, beschrieben, ist es für die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz-markierten Lipoproteine notwendig, nach erfolgter Inkuba-
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tion der Zellen mit dem Fluorochrom markiertem Lipoprotein eine Extraktion des Fluorochroms unter Verwendung organischer Lösungsmittel vor der eigentlichen Bestimmung durchzuführen. Die Verwendung solcher Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln ist sehr arbeit-un zeitaufwendig. Die geringe Reproduzierbarkeit, beispielsweise aufgrund unvollständiger Extraktion, Pipettierfehlern oder dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels, und die mangelhafte Präzision schränken den Einsatz solcher Methoden insbesondere für routinemässige Untersuchungen ein.
Ein entscheidender Nachteil der Extraktion mit organischen Lösungsmittel ist die Notwendigkeit einer zweiten Extraktionsphase zur Bestimmung des Zellproteins. Die Messung des Zellproteins ist zur quantitativen Bestimmung der Lipoproteinaufnahme und der Zellrezeptoraktivität jedoch zwingend notwendig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein quantitatives Verfahren zur Erfassung der zellulären Lipoproteinaufnahme, welches eine hohe Präzision, Sensitivität und Geschwindigkeit aufweist, sowie verschiedene Sets zur Durchführung dieses Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass eine Bestimmung der Fluoreszenzintensität der in die Zellen aufgenommen Fluoreszenz-markierten Lipoproteine sowie gegebenenfalls eine Bestimmung des Zellproteins in einem wässrigen Zellextrakt, also unter Vermeidung organischer Lösungsmittel, ohne zusätzliche Extraktionsschritte durchgeführt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Lipoprotein-Rezeptoraktivität durch isolierte und kultivierte Zellen umfasst die Inkubation der Zellen mit einem Fluoreszenzmarkierten Lipoprotein, wobei das Lipoprotein entsprechend der Rezeptoraktivität in die Zellen aufgenommen wird, sowie das nachfolgende Extrahieren der Zellen mit einem wässrigen Extraktionsmittel, sodass zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in einem einphasigen Zellextrakt (bzw. Zell-Lysat) erhalten wird, aus dem die Fluoreszenzintensität im Zellextrakt und gegebenenfalls auch das Zellprotein bestimmt werden können.
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Damit wird eine Quantifizierung der zellulären Lipoproteinaufnahme durch die Bestimmung der spezifischen Fluoreszenzintensität des eingesetzten Lipoproteins im wässrigen Zellextrakt möglich.
Die Vermeidung eines organischen Lösungsmittels bei der Extraktion führt dazu, dass ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird.
Damit ist es erstmals möglich, eine spektrofluorometrische Bestimmung des entsprechenden Lipoproteins bzw. der entsprechenden Lipoprotein-Rezeptoraktivität direkt in dem erhaltenen Zellextrakt durchzuführen, ohne dass weitere Aufbereitungsschritte notwendig sind. Mittels des erfindungsgemässen Verfahrens ist es auch möglich, in demselben Zellextrakt, an dem auch die Fluoreszenzmessung erfolgt, die Bestimmung des Zellproteins durchzuführen.
Die verwendeten Zellen können humanen und/oder tierischen Ursprungs sein. Es kann sich dabei um adhärent wachsende Zellen oder um nicht adhärent wachsende Zellen handeln. Auch Zellsuspensionen, beispielsweise Suspensionen isolierter Blutzellen wie Monozyten oder Lymphozyten, kommen in Frage. Die Inkubation der Zellen wird entsprechend den ausgewählten Zellen beispielsweise in einer Zellsuspension an adhärent wachsenden Zellen vorgenommen. Zur Bestimmung der LDL-Rezeptoraktivität werden bevorzugterweise glatte Muskelzellen oder Fibroblasten verwendet, für die Bestimmung der Scavenger-Rezeptoraktivität vorzugsweise Makrophagen, glatte Muskelzellen nach Stimulation oder Endothelzellen.
Gewinnung und Kultivierung der Zellen erfolgen gemäss den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden, die Inkubation mit Fluoreszenz-markierten Lipoproteinen zur Bestimmung der zellulären Lipoproteinaufnahme und/oder Zellrezeptoraktivität erfolgt entsprechend der jeweiligen Fragestellung, und die genauen experimentellen Parameter können von jedem Fachmann ohne grösseren experimentellen Aufwand anhand der Fragestellung gewählt werden.
Beispielsweise wird zur Bestimmung der zellulären LDL-Rezeptoraktivität das Lipoprotein in einer Konzentration zwischen 0-
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100 /m1 zugesetzt. Die Inkubationsdauer beträgt mindestens 30 Minuten bis mehrere Stunden bei einer Temperatur zwischen 20 bis 40oC, vorzugsweise wird 5 Stunden bei 370C inkubiert.
Mittels des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens ist es erstmals möglich, eine direkte quantitative Bestimmung der Aufnahme und der Bindung Fluoreszenz-markierter Lipoproteine durchzuführen. Das Verfahren ist grundsätzlich für alle humanen und/oder tierischen Zellen anwendbar und eignet sich zur Quantifizierung der Rezeptoraktivität von Zellen für verschiedene, mit einem fluoreszierenden Mittel markierte Lipoproteine. Die zu bestimmenden Lipoproteine können beispielsweise LDL, HDL, Chylomikronen oder VLDL Partikel sein. Es können aber auch chemisch modifizierte, denaturierte oder metabolisierte Lipoproteine oder Derivate davon sein. Beispielsweise können oxidierte LDL, azetylierte LDL, acetoazetylierte LDL und weitere bestimmt werden.
Zur Bestimmung der LDL-Rezeptoraktivität von Säuger-Zellen wird bevorzugterweise Fluoreszenz-markiertes natives LDL mit den entsprechenden Zellen inkubiert.
Will man die Scavenger-Rezeptoraktivität bestimmen, so inkubiert man modifiziertes, vorzugsweise azetyliertes Fluoreszenz-markiertes LDL mit den entsprechenden Zellen.
Das für die Bestimmung der Rezeptoraktivität verwendete Lipoprotein kann aus unterschiedlichen Quellen stammen, vorzugsweise ist es humanen Ursprungs. Grundsätzlich können aber Lipoproteine auch aus tierischem Plasma gewonnen und mit dem Fluoreszenzmarker markiert werden.
Die Markierung erfolgt vorzugsweise mit einem für biologische Zwecke bewährten fluoreszierenden Mittel. Es kann sich um ein Fluorochrom oder um einen Fluorphor handeln, vorzugsweise wird mit 1, 1'-Dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanin- perchlorat (DiI) markiert.
Während der Markierung des Lipoproteins mit dem fluoreszierenden
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Mittel kann eine unerwünschte Oxidation des Lipoproteins durch die Anwesenheit von Ascorbinsäure, EDTA oder Kombinationen davon verhindert werden. Die Markierung des entsprechenden Lipoproteins mit dem fluoreszierenden Mittel erfolgt in einer wässrigen Lösung vorzugsweise in Anwesenheit geringer Mengen an organischen Lösungsmitteln z. B. DMSO und wird bevorzugterweise unter Schütteln durchgeführt. Gegebenenfalls ist ein an dem Lipoprotein defizientes Serum (LPDS) in der wässrigen Lösung enthalten.
Unter den bevorzugten erfindungsgemässen Bedingungen bei der Markierung der Lipoproteine bleibt beispielsweise der a-TocopherolGehalt des Lipoproteins konstant.
Das wässrige Extraktionsmittel zum Extrahieren der Zellen bewirkt das Ablösen zumindest eines Anteils der Fluoreszenz-markierten Lipoproteine von den Rezeptoren. Dabei kann jegliches wässrige Extraktionsmittel, das dieses Ablösen bewirkt und bei welchem ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird, eingesetzt werden.
Vorzugsweise enthält das wässrige Extraktionsmittel ein kationisches, anionisches oder ampholytisches Tensid, weist bevorzugt einen alkalischen pH Wert auf und löst die Zelle zumindest teilweise auf, wobei das fluoreszierende Mittel in Lösung bleibt.
Beispielsweise enthält das Mittel SDS in verdünnter Natronlauge, vorzugsweise wird 0, 1 N NaOH mit 0, 1% Natriumdodecylsulfat verwendet.
Die Extraktion des fluoreszierenden Mittels aus den Zellen erfolgt durch Zugabe des wässrigen Extraktionsmittels, welches vorzugsweise auch eine zumindest teilweise Lyse der Zellen bewirkt, vorzugsweise unter leichtem Schütteln für etwa eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Durch die erfindungsgemässe Benutzung eines wässrigen Extraktionsmittels kann das fluoreszierende Mittel überraschenderweise vollständig und in reproduzierbarer Weise aus den Zellen extrahiert werden, sodass die Fluoreszenz direkt in dem Zellextrakt bestimmt werden kann. Unter Vermeidung organischer Lösungsmittel entfällt daher der Verfahrensschritt, dass eine organische Phase,
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die das extrahierte fluoreszierende Mittel enthält, vom verbleibenden Zellrest abgetrennt werden muss. Gerade hiedurch werden entscheidend grobe und systematische Fehler, beispielsweise durch Pipettierungenauigkeit und durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels, vermieden.
Der grosse Vorteil der erfindungsgemässen Methode liegt auch in der Möglichkeit, dass eine Bestimmung des Zellproteins in demselben Zellextrakt, an dem auch die Fluroeszenzmessung erfolgt, durchgeführt werden kann.
Dies war bisher aufgrund des zweiphasigen Systems nicht möglich.
Somit wird durch das erfindungsgemässe Verfahren erstmals eine quantitative Bestimmung der zellulären Bindung und Aufnahme Fluoreszenz-markierter Lipoproteine mit hoher Sensitivität und Präzision zur Verfügung gestellt.
Die Fluoreszenzintensität wird mittels hierfür gängiger Methoden bestimmt. Beispielsweise erfolgt die Messung unter Verwendung eines Fluorometers als Einzelküvettenmessung oder mittels Mikrotiterplatte bei einer Anregungswellenlänge von 520 nm und bei einer Emissionswellenlänge von 580 nm. Die jeweilige Wahl der Wellenlänge richtet sich nach dem verwendeten fluoreszierenden Mittel.
Die Detektionsgrenze für die spezifische Fluoreszenz liegt unter den erfindungsgemässen Bedingungen zur Durchführung der Bestimmung etwa bei 5 ng Dil-LDL-Protein/ml. Das erfindungsgemässe Verfahren ist damit um einen Faktor 20-30 x sensitiver als andere im Stand der Technik beschriebene Verfahren.
Bevorzugterweise wird neben der Bestimmung der für die entsprechenden Lipoproteine bzw. der für die modifizierten Lipoproteine spezifischen Rezeptoraktivität im selben Zellextrakt auch eine Proteinbestimmung durchgeführt. Diese Proteinbestimmung erfolgt mittels der gängigen Methoden, beispielsweise gemäss der Methode von Lowry et al., 1951 (J. Biol. Chem. 193, p. 265-275).
Erfindungsgemäss werden auch verschiedene Sets zur erfindungsgemässen Bestimmung der Zellrezeptoraktivität für Lipoproteine in Zellen zur Verfügung gestellt. Ein Set enthält neben einem
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Fluoreszenz-markierten Lipoprotein ein wässriges Extraktionsmittel, welches zur Herstellung eines einphasigen Zellextrakts geeignet ist. Dieses Extraktionsmittel ist auch, zumindest teilweist, zum Lysieren der Zellen geeignet. Das Extraktionsmittel enthält eine mit Wasser mischbare Substanz und bewirkt, dass zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in dem einphasigen Zellextrakt erhalten wird.
In einem weiteren Set ist zusätzlich ein Mittel zur Markierung des Lipoproteins mit einem fluoreszierenden Mittel enthalten.
Das Mittel für die Zell-Lyse und Extraktion des fluoreszierenden Mittels kann in seiner Zusammensetzung bereits früher beschriebenen Zusammensetzungen entsprechen. Bevorzugterweise wird mittels des erfindungsgemässen Sets LDL als Lipoprotein zur Verfügung gestellt, um die LDL-Rezeptoraktivität zu bestimmen. Zur Bestimmung der Scavenger-Rezeptoraktivität stellt ein bevorzugtes erfindungsgemässes Set ein azetyliertes LDL zur Verfügung.
Das entsprechende Lipoprotein ist vorzugsweise mit DiI markiert bzw. enthält das Mittel zur Markierung des Lipoproteins vorzugsweise DiI. Zur Verhinderung der Oxidation des Lipoproteins während der Markierung mit dem fluoreszierenden Mittel kann das erfindungsgemässe Set weiters Ascorbinsäure, EDTA oder eine Kombination davon enthalten. Die im Set enthaltenen nicht-markierten Lipoproteine werden zur Bestimmung der unspezifischen Lipoprotein-Aufnahme im Zellrezeptorassay verwendet.
Das Fluoreszenz-markierte Lipoprotein kann erfindungsgemäss auch zur Bestimmung des in vivo-Abbaus des betreffenden Lipoproteins verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem zu bestimmenden Lipoprotein um LDL, welches beispielsweise mit Dir markiert ist. Grundsätzlich ist die Verwendung der Markierung für jede Lipoproteinklasse möglich. Dies eröffnet auch die Möglichkeit der Untersuchung des Abbaus anderer Lipoproteine in vivo.
Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte Lipoprotein dem zu untersuchenden Tier injiziert und nach bestimmten Zeitintervallen über eine Dauer von mehreren Tagen
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Blutproben entnommen. Die Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Plasmaproben bestimmt. Aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen Verfahren (siehe Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med. Biol. 2, 36- 53,1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag berechnet und die sogenannte "fractional catabolic rate" ermittelt werden.
Erfindungsgemäss wird auch ein Set zur Bestimmung der Aufnahme eines Lipoproteins in Blutzellen bzw. Organen eines Säugers unter Verwendung einer Vorrichtung zur Detektion der Fluoreszenz zur Verfügung gestellt. Dieses Set enthält ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein gemäss den bereits beschriebenen Ausführungsformen, eine Injektionsvorrichtung zur Verabreichung des markierten Lipoproteins sowie eine Vorrichtung, die für die Abnahme von Blut bzw. Plasma geeignet ist.
Aus der Messung der Fluoreszenzintensität bzw. der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins nach bestimmten Zeitintervallen kann die aufgenommene Menge an Lipoprotein bzw. dessen Umsatzrate in vivo, wie bereits früher beschrieben, ermittelt werden.
Erfindungsgemäss wird weiters eine Präparation enthaltend ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein geeignet zur Verabreichung an einen Säuger für diagnostische Zwecke zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren noch näher erläutert werden, ohne sie auf diese zu beschränken : Es zeigen : Fig. 1 : Ein Flussschema zum spektrofluorometrischen Assay zur Bestimmung der DiI-LDL-Aufnahme durch kultivierte Zellen ; Fig. 2 : Die Fluoreszenzintensität von DiI-LDL in Lysereagenz
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gelöst (die Fluoreszenzintensität ist über einen Bereich von 0, 005 bis 14 g LDL Protein/ml linear (r2 = 0, 999) ; die spezifische Markierung beträgt 27 ng DiI/gg LDL Protein) ; Fig. 3a :
Die konzentrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch normale humane Hautfibroblasten in 35 mm Schälchen (die Zellen wurden mit 0 bis 100 g DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert und anschliessend in 1000 gl Lyse-Reagenz lysiert ; die angegebenen Werte sind bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen ; der Proteingehalt betrug im Mittel 0, 16 mg/Schälchen ; das Insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse der Daten ; der Km-Wert beträgt etwa 10,2 g/ml und die maximale Aufnahmegeschwindigkeit als Mass für die LDL-Rezeptoraktivität 9, 4 /mg Zellprotein/5 Stunden) ; Fig. 3b :
Die konzentrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch U-937 Zellen (die Zellsuspensionen (3 x 106 Zellen/ml) wurden mit 0 bis 100 g DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; nach Waschen wurden die Zellen in 1 ml Lysereagenz ge- löst ; die Werte wurden bezüglich der unspezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen ; der zelluläre Proteingehalt betrug 0,25 g/Schälchen); das Insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse und ergibt einen Km-Wert von etwa 53 g/ml ; die maximale Aufnahmekapazität beträgt 2,1 g/ml Zellprotein/5 Stunden) ; Fig. 4a : Die Abbildung zeigt die konzentrationsabhängige Aufnahme und den Metabolismus von 125J-DiI-LDL durch humane Hautfibroblasten.
Verglichen werden die Daten, die durch Bestimmung der DiI-Fluoreszenz und der 125J-Radioaktivität erhalten worden sind ; die Zellen wurden mit 125J-DiI-LDL in einer Konzentration von 0 bis 100 ag/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; die Ana-
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der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Versuchen ; der mittlere Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 10 mg/Schälchen) ; Fig. 4b :
Die konzentrationsabhängige Bindung von 125J-DiI-LDL durch humane Haut-Fibroblasten (die Inkubation mit unterschied-
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bei 40C für 2 Stunden durchgeführt ; die geschlossene Quadrate zeigen die 125J-Radioaktivität und die gefüllten Quadrate repräsentieren die Dil-Fluoreszenzintensität von doppelt markiertem, gebundenem LDL ; die Resultate sind als Durchschnittswerte aus 3 Versuchen dargestellt ; der durchschnittliche Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 17 mg/Schälchen) ;
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Daten aus der Bestimmung der DiI-Fluoreszenz und der 125J-Radio- aktivität werden verglichen ; die Zellen wurden mit 0 bis 100 g/ml 125J-DiI-acLDL für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; die nicht
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gefüllten Quadrate dargestellt ;
die Werte wurden bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Versuchen ; der mittlere Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 33 mg/Schälchen) ;
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pämischen Patienten und Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (FH) (die Plasmacholesterinkonzentrationen der Kontrollpersonen betrugen 98 69 mg/dl, die der Patienten mit heterozygoter FH 310 43 mg/dl und die der Patienten mit homozygoter FH 651 69 mg/dl ; die durchschnittliche Aufnahmekapazität von
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DiI-LDL der analysierten Fibroblasten ist durch die horizontalen Linien dargestellt ; die individuellen Werte, die 2 bis 3 Experimente repräsentieren, sind durch die Punkte dargestellt) ; Fig. 7 :
Eine charakteristische Abbaukurve für DiI-LDL in einem normalen Kaninchen (Kontrolle) und einem Kaninchen mit einem LDL-Rezeptordefekt (WHHL-Kaninchen). Das markierte LDL wurde zu diesem Zweck den Kaninchen injiziert, und nach bestimmten Zeitintervallen wurden über eine Dauer von 3 Tagen Blutproben entnommen ; die Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins in entnommenem Plasma ist in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.
Beispiel 1 : Isolierung und Markierung der Lipoproteine LDL wurde aus frisch gewonnenem CDP-Plasma gesunder menschlicher Blutspender nach der Methode von Havel et al. (J. Clin. Invest.
1955,34, 1345-1353) wie folgt gewonnen. Plasma wurde mit einer
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019 g/mlAnschliessend wurde der Unterstand auf eine Dichte von 1, 060 g/ml eingestellt und LDL (d-1, 019-1, 060 g/ml) wurde nach nochmaliger Ultrazentrifugation (150000 x g 24 Stunden, 10 C) aus dem Überstand gewonnen. Um Oxidation zu verhindern wurde die Lipoproteinfraktionierung in Anwesenheit von 0, 1 g/l EDTA durchgeführt. Lipoprotein-armes Serum (LPDS) wurde durch Ultrazentrifugation bei einer Dichte von 1, 25 g/ml (150000 x g, 48 Stunden) aus dem Überstand gewonnen. LDL und LPDS wurden gegen 5 mM Tris, 154 mM NaCl, 0, 1 g/l EDTA bei pH 7, 4 und 40C dialysiert.
Der Fluoreszenzfarbstoff 1, 1-Dioctadecyl-3, 3, 3'3'-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) fluoresziert im Rhodamin-Bereich. Aufgrund seiner strukturellen Analogie zu den Phospholipiden wird DiI relativ stabil in die Phospholipidhülle von Lipoproteinen eingebaut. Die Markierung von LDL mit dem Farbstoff erfolgte nach der von Innerarity et al. (Methods of Enzy-
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EDTA) auf eine Konzentration von 1, 5 mg Lipoprotein/ml eingestellt. 3 ml dieser Verdünnung wurden mit 9 ml LPDS (4 g Protein/ml) gemischt. Als Oxidationsschutz wurden 12 gl einer 100 mM Ascorbinsäurelösung zugegeben und das Gemisch über einen 0, 45 am Filter sterilfiltriert.
DiI (D282, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 6 mg/ml bei 370C gelöst. 2251 dieser Stammlösung wurden unter vorsichtigem Rühren in das LDL-LPDS-Gemisch gegeben (50 1 Dil [3 ng/ml] pro mg LDL). Der Ansatz wurde mit Argon oder Stickstoff überschichtet und 8 Stunden lichtgeschützt bei 370C unter leichtem Schütteln inkubiert.
Die DiI-markierten Lipoproteine wurden durch Ultrazentrifugation reisoliert. Dazu wurde das Gemisch mit kristallinem NaCl auf die Dichte d-1, 065 g/ml eingestellt, in Quick seal centrifuge tubes (5/8 x 3 inch, Beckman, Irvine, CA, USA) überführt und in
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Puffer (pH 7, 4 ; 154 mM NaCl ; 0, 25 mM EDTA) dialysiert.
LDL und DiI-LDL wurden gemäss der Methode von Fraenkel-Conrat (1957, Methods in Enzymology, Academic Press New York, 247-269), die von Basu et al. (1976, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 73,3178- 3182) für Lipoproteine modifiziert worden ist, azetyliert. Alle
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Beispiel 2 : Zellkulturen Humane Hautbiopsien wurden von 4 normocholesterinämischen Spendern und von 11 Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (FH) gewonnen ; 9 Patienten waren phänotypisch heterozygot und 2 homozygot für die FH. Von den Hautbiopsien auswachsende Fibroblasten wurden in DMEM (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS (Fa. Biochrom, Berlin, Germany), 100 U/ml Penizillin und 100 jjg/ml Streptomyzin kultiviert. P388 D1 (IL-1) (Monozyten-Makrophage von der Maus, ATCC TIB61) und U-937 (Histiocytic lymphoma, human, ATCC CRL 1593) Zellinie wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, USA) bezogen und in RPMI 1640 (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS, 100 U/ml Penizillin und 100 g/m1 Streptomyzin kultiviert.
Alle Zellen wurden bei 37oC, 5 % CO. in einem befeuchteten Inkubator gehalten.
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5 bis 10 Mal passagierte humane Haut-Fibroblasten, hergestellt nach Beispiel 2, wurden in 35 mm Plastikschalen (Nunc, Wiesbaden) kultiviert und in DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penizillin und 100 g/ml Streptomyzin kultiviert. Nach 72 Stunden wurde das Medium durch DMEM mit 10% LPDS ersetzt und die Zellen für weitere 48 Stunden inkubiert.
Um die Aufnahme des DiI-LDL zu untersuchen, wurden Fibroblasten für 5 Stunden bei 37 C mit zunehmenden Konzentrationen von DiILDL (0, 5,10, 20,50, 100 g Protein/ml) inkubiert. Die Spezifität der Aufnahme wurde bei einem Gehalt von 10 gg DiI-LDL/ml mit einem 50ig-fachen Überschuss an unmarkiertem LDL bestimmt.
Alle Inkubationen wurden dreifach durchgeführt.
Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS enthaltend 0, 4% BSA und dreimal mit PBS alleine gewaschen. Anschliessend wurde 1 ml des Zell-Lyse-Reagens (1 g/l SDS gelöst in 0, 1 N NaOH) zugegeben. Die Inkubation der Zellen wurde unter leichtem Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt.
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1000 microplate reader" (Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) bei einer Anregungswellenlänge von 520nm und einer Emissionswellenlänge von 580 nm durchgeführt. Zelluläres Protein wurde in einer Doppelbestimmung von 40 gl Proben gemäss der Methode von Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem., 193, p. 265-275, die für Mikrotiterplatten adaptiert wurde, durchgeführt. Als Standard diente in Lyse-Reagens gelöstes Rinderserum-Albumin.
Parallel dazu wurde die Fluoreszenz von mit Lyse-Reagens (1 : 2000) verdünntem DiI markiertem Lipoprotein ermittelt, um die spezifische Fluoreszenzintensität der DiI-LDL-Präparation zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden in ng Zell-assoziiertem DiI-LDL/mg Zellprotein dargestellt (Fig. 1). Eine Scatchard Plot-Analyse der fluorimetrischen Daten wurde zur Berechnung der Km und der maximalen Geschwindigkeit der DiI-LDL-Aufnahme durchgeführt.
Die Aufnahme des DiI-LDL folgt, wie aus der Fig. 3 ersichtlich ist, einer typischen Sättigungskurve und zeigt eine hohe Affi-
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:DiI-Lipoprotein durch nicht adhärente Zellen Für die Experimente mit nicht adhärenten Zellen (U 937) wurden 35 mm Plastikschalen für die Kultivierung verwendet (3 x 106 Zellen/Schälchen). Die Zellen wurden mit DiI-LDL (0, 5,10, 20, 50,100 g/ml) bei 37 C für 5 Stunden inkubiert. Die Spezifität der Aufnahme wurde wiederum unter Verwendung von 10 g DiI-
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stimmt. Alle Inkubationen wurden in 2 ml RPMI 1640 mit 100 U/ml Penizillin und 100 ug/ml Streptomyzin durchgeführt.
Nach 5 Stunden Inkubation wurden die Zellen in Zentrifugenröhrchen überführt und 2 x mit PBS (37 C) enthaltend 0, 4% BSA und 0, 25 g/l EDTA gewaschen und anschliessend 2 x mit PBS-EDTA alleine. Nach jedem Waschschritt wurden die Zellen bei 690 x g für 5 Minuten
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zentrifugiert und in 5 ml Puffer resuspendiert. Die Zentrifugenröhrchen wurden vor dem letzten Waschschritt gewechselt, um Verunreinigungen durch freies DiI-LDL zu reduzieren. Nach der letzten Zentrifugation wurde der Puffer entfernt, und das ZellPellet wurde in 1 ml Zell-Lyse-Reagens aufgelöst. Die weiteren Verfahrensschritte entsprechen genau jenen, die für die Fibroblasten angewandt worden sind.
Fig. 3b zeigt die Aufnahme von DiI-LDL durch die nicht adhärente humane Monozyten-Zellinie U-937. Im Vergleich zu humanen Fibroblasten zeigen diese Zellen eine geringere Affinität und eine geringere Aufnahme von DiI-LDL.
Beispiel 5 : Untersuchungen der mit Dil und 125J markierten Lipoproteine DiI-LDL und DiI-acLDL wurden nach der Methode von Goldstein J.
L. et al., 1974, J. Biol. Chem., 249,5133-5162, und Drevon C. et al., 1981, J. Lip. Res. 22,37-46 mit 125J (Amersham-Buchler, Braunschweig, Germany) markiert. Anschliessend wurden die Zellen mit den doppelt markierten Lipoproteinen inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurde das Medium abgenommen und separiert, die Zellen gewaschen und, wie bereits in Beispiel 3. beschrieben, lysiert. In ein und derselben Probe des Zell-Lysats wurde die Fluoreszenz, die Radioaktivität und der Zellproteingehalt bestimmt. Die Fluoreszenzmessungen wurden zur Berechnung der Aufnahme von DiI-Lipoproteinen verwendet. Mittels der Radioaktivitätsmessung im Zell-Lysat wurde die Menge an Zell-assoziiertem 125J-Lipoprotein bestimmt. Der Lipoproteinabbau wurde über die nicht-Jodid-TCA-lösliche Radioaktivität des Zellüberstandes ermittelt.
Hiefür wurden 800 cl des Zellüberstandes mit 400 1 eisgekühlter Trichloressigsäure (20% w/v TCA) gemischt, für 10 Minuten stark geschüttelt und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. 800 p. l des TCA-Überstandes wurden mit 400 1 AgN03 (5% w/v) gemischt, für 10 Minuten geschüttelt und für weitere 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Die Radioaktivität von 1 ml des Überstandes wurde bestimmt.
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Beispiel 6 : Spezifität des fluorometrischen Assay bei der Bestimmung der LDL- und der Scavenger Rezeptoraktivität Die zelluläre Aufnahme von jeweils lOug Protein/ml DiI-LDL und von DiI-acLDL in normalen humanen Fibroblasten und in P388D1 Zellen mit einem 50-fachen Überschuss an nicht markiertem Lipoprotein wurde bestimmt (siehe Tabelle 1).
Wie erwartet, war die Aufnahme von DiI-acLDL durch P388-Zellen entsprechend der hohen Scavenger-Rezeptoraktivität hoch. Durch gleichzeitige Inkubation mit einem Überschuss an nicht markiertem acLDL wurde die Aufnahme des markierten acLDL merklich inhibiert, während nicht modifiziertes LDL in dieser Hinsicht nicht effizient war. Die Aufnahme von DiI-LDL war gering und wurde durch einen Überschuss an nicht markiertem acLDL nicht beeinflusst.
Im Gegensatz dazu steht das Resultat bei der Aufnahme der entsprechenden Lipoproteine durch Fibroblasten : es wurde keine spezifische Aufnahme von DiI-acLDL in normalen humanen Fibroblasten beobachtet. DiI-LDL hingegen wurde von Fibroblasten mit hoher Geschwindigkeit aufgenommen. Nicht markiertes LDL wirkte im Überschuss als effizienter Kompetitor, nicht hingegen unmarkiertes acLDL.
Beispiel 7 : Bestimmung des Lipoprotein-Abbaus in vivo Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte Lipoprotein dem zu untersuchenden Tier injiziert und nach bestimmten Zeitintervallen über eine Dauer von 3 Tagen Blutproben (ca. 0, 6 ml EDTA Blut) entnommen. Die Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Plasmaproben bestimmt. Das Plasma wird hierzu 1 : 40 mit 0, 9%-iger NaCl-Lösung verdünnt. Aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen Verfahren (siehe Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med.
Biol. 2 : 36-53, 1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag
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berechnet werden (fractional catabolic rate). Eine charakteristische Abbaukurve für DiI-LDL in einem normalen Kaninchen und einem Kaninchen mit LDL-Rezeptordefekt (WHHL) ist in Fig. 7 dargestellt.
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Tabelle 1:
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<tb> Zelltyp <SEP> DiI-acLDL <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-LDL <SEP> DiI-LDL <SEP> + <SEP> Dil-LDL <SEP> +
<tb> LDL <SEP> acLDL <SEP> LDL <SEP> acLDL
<tb> P388D1 <SEP> 10,73 <SEP> +/-0,60 <SEP> 10,73 <SEP> +/-0,13 <SEP> 1,25 <SEP> +/- <SEP> 0,09 <SEP> 2,22 <SEP> +/- <SEP> 0,03 <SEP> 0,36 <SEP> +/- <SEP> 0,05 <SEP> 1,84 <SEP> +/- <SEP> 0,04
<tb> humane <SEP> Haut
<tb> Fibroblasten <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> +/- <SEP> 0,02 <SEP> 0,08 <SEP> +/- <SEP> 0,01 <SEP> 0,105 <SEP> +/-0,03 <SEP> 4,79 <SEP> +/- <SEP> 0,14 <SEP> 0,40 <SEP> +/- <SEP> 0,05 <SEP> 4,85 <SEP> +/- <SEP> 0,47
<tb>
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The invention relates to a method for determining the receptor activity for lipoproteins using fluorescence-labeled lipoproteins and corresponding sets for carrying out the determination.
Cells have membrane receptors for lipoproteins, for example for LDL, which mediate the cellular uptake of the lipoproteins. These lipoproteins are then enclosed in lysosomes, in which the lipoproteins are then also broken down.
Certain cells, such as macrophages, have receptors for the uptake of "modified" lipoproteins, for example receptors for acetylated LDL. The uptake of these modified lipoproteins is mediated via so-called scavenger receptors.
Studies on the cell receptor-mediated uptake of plasma lipoproteins and also modified lipoproteins are becoming increasingly important, since the receptor function (LDL receptor, scavenger receptor) plays an important role in the development of arteriosclerosis.
In particular, it is known today that LDL cholesterol is a causal risk factor for the development of arteriosclerosis. High LDL receptor activity can therefore minimize the risk of arteriosclerosis. Modified forms of lipoproteins, such as oxidized LDL, also play an important role in the development of arteriosclerosis. The determination of the receptor activity which is decisive for the uptake of these modified substances can be followed by using acetylated or oxidized LDL under standardized conditions. Studies of scavenger receptor activity are the subject of research and may also become clinically important in the future for assessing individual atherosclerosis disposition.
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For example, several in vitro studies on the cellular metabolism of lipoproteins using radioactively labeled tracers are known from the prior art (see, for example, Goldstein JL et al., 1974, J. Biol. Chem., 249, p. 5133-5162 ). However, one disadvantage of such methods, which are based on the use of radioactive substances, is the high safety requirements for the personnel, and another disadvantage of the problem of waste disposal of radioactive substances. The methods are generally extremely time-consuming and expensive and are therefore only suitable for routine examinations for special laboratories.
More recent approaches aim to replace the radioactive substances used to label the lipoproteins with fluorochromes. As such a suitable fluorochrome
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al., 1981, Arteriosclerosis, 1, p. 177-185). It is assumed that these compounds, similar to the case with phospholipids, associate with the surface of the lipoproteins.
The use of these labels is u. a. known for native and modified LDL, wherein both LDL and scavenger receptor activity have been investigated by means of fluorescence microscopy in cultured cells in vitro and in vivo. The cellular uptake of the lipoproteins takes place via the membrane receptors specific for lipoproteins. When the labeled lipoprotein is broken down, the fluorochrome DiI is quantitatively retained in the lysosomes and released by the cells very slowly over a period of several days. Therefore, the amount of DiI ingested is proportional to the amount of cellular lipoprotein ingested. Using FACS (= Fluorescence activated cell
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Lymphocytes performed.
How u. a. by Stephan et al., J. Lip. Res. 34,325-330, 1993, it is necessary for the quantitative determination of the fluorescence-labeled lipoproteins after incubation
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tion of the cells with the fluorochrome-labeled lipoprotein, an extraction of the fluorochrome using organic solvents before the actual determination. The use of such extraction methods with organic solvents is very labor-un time-consuming. The low reproducibility, for example due to incomplete extraction, pipetting errors or the evaporation of the organic solvent, and the poor precision limit the use of such methods, particularly for routine examinations.
A crucial disadvantage of extraction with organic solvents is the need for a second extraction phase to determine the cell protein. The measurement of the cell protein is absolutely necessary for the quantitative determination of the lipoprotein uptake and the cell receptor activity.
It is an object of the present invention to provide a quantitative method for detecting cellular lipoprotein uptake, which has high precision, sensitivity and speed, and various sets for carrying out this method. This object is achieved according to the invention in that a determination of the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled lipoproteins absorbed into the cells and optionally a determination of the cell protein in an aqueous cell extract, ie while avoiding organic solvents, is carried out without additional extraction steps.
The method according to the invention for the quantitative determination of the lipoprotein receptor activity by isolated and cultivated cells comprises the incubation of the cells with a fluorescence-labeled lipoprotein, the lipoprotein being absorbed into the cells in accordance with the receptor activity, and the subsequent extraction of the cells with an aqueous extractant so that at least a proportion of the lipoprotein taken up is obtained in a single-phase cell extract (or cell lysate), from which the fluorescence intensity in the cell extract and, if appropriate, also the cell protein can be determined.
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This makes it possible to quantify cellular lipoprotein uptake by determining the specific fluorescence intensity of the lipoprotein used in the aqueous cell extract.
The avoidance of an organic solvent during the extraction leads to the fact that a single-phase cell extract is obtained.
This makes it possible for the first time to carry out a spectrofluorometric determination of the corresponding lipoprotein or the corresponding lipoprotein receptor activity directly in the cell extract obtained, without further processing steps being necessary. By means of the method according to the invention, it is also possible to carry out the determination of the cell protein in the same cell extract on which the fluorescence measurement is also carried out.
The cells used can be of human and / or animal origin. These can be adherently growing cells or non-adherently growing cells. Cell suspensions, for example suspensions of isolated blood cells such as monocytes or lymphocytes, are also suitable. The cells are incubated in accordance with the selected cells, for example in a cell suspension on adherently growing cells. Smooth muscle cells or fibroblasts are preferably used to determine the LDL receptor activity, and macrophages, smooth muscle cells after stimulation or endothelial cells are preferably used to determine the scavenger receptor activity.
The cells are obtained and cultivated according to the methods known from the prior art, the incubation with fluorescence-labeled lipoproteins for determining the cellular lipoprotein uptake and / or cell receptor activity takes place in accordance with the particular question, and the exact experimental parameters can be obtained by any person skilled in the art without major experimental Effort can be chosen based on the question.
For example, to determine cellular LDL receptor activity, the lipoprotein is used in a concentration between 0-
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100 / m1 added. The incubation period is at least 30 minutes to several hours at a temperature between 20 to 40oC, preferably 5 hours at 370C.
The determination method according to the invention makes it possible for the first time to carry out a direct quantitative determination of the uptake and binding of fluorescence-labeled lipoproteins. The method is basically applicable to all human and / or animal cells and is suitable for quantifying the receptor activity of cells for different lipoproteins labeled with a fluorescent agent. The lipoproteins to be determined can be, for example, LDL, HDL, chylomicrons or VLDL particles. However, it can also be chemically modified, denatured or metabolized lipoproteins or derivatives thereof. For example, oxidized LDL, acetylated LDL, acetoacetylated LDL and others can be determined.
To determine the LDL receptor activity of mammalian cells, fluorescence-labeled native LDL is preferably incubated with the corresponding cells.
If one wants to determine the scavenger receptor activity, one incubates modified, preferably acetylated, fluorescence-labeled LDL with the corresponding cells.
The lipoprotein used for the determination of the receptor activity can come from different sources, preferably it is of human origin. In principle, however, lipoproteins can also be obtained from animal plasma and labeled with the fluorescent marker.
The marking is preferably carried out using a fluorescent agent which has been proven for biological purposes. It can be a fluorochrome or a fluorophore, preferably 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used for labeling.
During the labeling of the lipoprotein with the fluorescent
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An undesirable oxidation of the lipoprotein can be prevented by the presence of ascorbic acid, EDTA or combinations thereof. The labeling of the corresponding lipoprotein with the fluorescent agent is carried out in an aqueous solution, preferably in the presence of small amounts of organic solvents, e.g. B. DMSO and is preferably carried out with shaking. If appropriate, a serum deficient in the lipoprotein (LPDS) is contained in the aqueous solution.
Under the preferred conditions according to the invention when labeling the lipoproteins, for example, the a-tocopherol content of the lipoprotein remains constant.
The aqueous extracting agent for extracting the cells causes the detachment of at least a portion of the fluorescence-labeled lipoproteins from the receptors. Any aqueous extractant that causes this detachment and in which a single-phase cell extract is obtained can be used.
The aqueous extracting agent preferably contains a cationic, anionic or ampholytic surfactant, preferably has an alkaline pH and at least partially dissolves the cell, the fluorescent agent remaining in solution.
For example, the agent contains SDS in dilute sodium hydroxide solution, preferably 0.1 N NaOH with 0.1% sodium dodecyl sulfate is used.
The fluorescent agent is extracted from the cells by adding the aqueous extractant, which preferably also causes at least partial lysis of the cells, preferably with gentle shaking, for about one to two hours at room temperature.
By using an aqueous extracting agent according to the invention, the fluorescent agent can surprisingly be extracted completely and reproducibly from the cells, so that the fluorescence can be determined directly in the cell extract. Avoiding organic solvents, the process step that an organic phase,
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which contains the extracted fluorescent agent, must be separated from the remaining cell residue. In this way crude and systematic errors, for example due to pipetting inaccuracies and evaporation of the organic solvent, are avoided.
The great advantage of the method according to the invention also lies in the possibility that the cell protein can be determined in the same cell extract on which the fluorescence measurement is also carried out.
This was previously not possible due to the two-phase system.
Thus, the method according to the invention provides for the first time a quantitative determination of the cellular binding and uptake of fluorescence-labeled lipoproteins with high sensitivity and precision.
The fluorescence intensity is determined using standard methods for this. For example, the measurement is carried out using a fluorometer as a single cuvette measurement or using a microtiter plate at an excitation wavelength of 520 nm and at an emission wavelength of 580 nm. The respective choice of wavelength depends on the fluorescent agent used.
The detection limit for the specific fluorescence under the conditions according to the invention for carrying out the determination is approximately 5 ng Dil-LDL protein / ml. The method according to the invention is thus a factor of 20-30 times more sensitive than other methods described in the prior art.
In addition to the determination of the receptor activity specific for the corresponding lipoproteins or for the modified lipoproteins, a protein determination is preferably also carried out in the same cell extract. This protein determination is carried out using the usual methods, for example according to the method of Lowry et al., 1951 (J. Biol. Chem. 193, p. 265-275).
According to the invention, various sets are also provided for the determination of the cell receptor activity for lipoproteins in cells according to the invention. A set contains next to one
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Fluorescence-labeled lipoprotein is an aqueous extractant that is suitable for the production of a single-phase cell extract. This extractant is also, at least in part, suitable for lysing the cells. The extractant contains a water-miscible substance and has the effect that at least a portion of the lipoprotein taken up is obtained in the single-phase cell extract.
A further set additionally contains a means for labeling the lipoprotein with a fluorescent agent.
The composition for the cell lysis and extraction of the fluorescent agent can correspond in its composition to compositions previously described. The set according to the invention is preferably used to provide LDL as lipoprotein in order to determine the LDL receptor activity. A preferred set according to the invention provides an acetylated LDL for determining the scavenger receptor activity.
The corresponding lipoprotein is preferably labeled with DiI or preferably contains the agent for labeling the lipoprotein DiI. To prevent the oxidation of the lipoprotein during the labeling with the fluorescent agent, the set according to the invention can further contain ascorbic acid, EDTA or a combination thereof. The unlabeled lipoproteins contained in the set are used to determine the non-specific lipoprotein uptake in the cell receptor assay.
According to the invention, the fluorescence-labeled lipoprotein can also be used to determine the in vivo degradation of the lipoprotein in question. The lipoprotein to be determined is preferably LDL, which is labeled with you, for example. In principle, the label can be used for any lipoprotein class. This also opens up the possibility of studying the degradation of other lipoproteins in vivo.
In order to determine the lipoprotein turnover rate, the labeled lipoprotein is injected into the animal to be examined and after certain time intervals over a period of several days
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Blood samples taken. The fluorescence intensity of the labeled lipoprotein is determined directly in the corresponding plasma samples. From the decrease in the fluorescence intensity of the labeled lipoprotein in plasma, the turnover amount of the lipoprotein can be determined using an established mathematical method (see Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med. Biol. 2, 36-53, 1957) calculated per day and the so-called "fractional catabolic rate" determined.
According to the invention, a set for determining the uptake of a lipoprotein in blood cells or organs of a mammal is also provided using a device for detecting the fluorescence. This set contains a fluorescence-labeled lipoprotein according to the previously described embodiments, an injection device for administering the labeled lipoprotein and a device which is suitable for taking blood or plasma.
From the measurement of the fluorescence intensity or the decrease in the fluorescence intensity of the labeled lipoprotein after certain time intervals, the amount of lipoprotein taken up or its conversion rate in vivo can be determined, as already described earlier.
According to the invention, a preparation comprising a fluorescence-labeled lipoprotein suitable for administration to a mammal for diagnostic purposes is also provided.
The present invention is to be explained in more detail by the following examples and the drawing figures, without restricting them to these: FIG. 1: A flow diagram for the spectrofluorometric assay for determining the DiI-LDL uptake by cultivated cells; Fig. 2: The fluorescence intensity of DiI-LDL in lysis reagent
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dissolved (the fluorescence intensity is linear over a range from 0.005 to 14 g LDL protein / ml (r2 = 0.999); the specific labeling is 27 ng DiI / gg LDL protein); Fig. 3a:
The concentration-dependent uptake of DiI-LDL by normal human skin fibroblasts in 35 mm dishes (the cells were incubated with 0 to 100 g of DiI-LDL protein / ml for 5 hours at 370C and then lysed in 1000 gl of lysis reagent; the values given are corrected for non-specific uptake and represent an average of 3 determinations; the protein content was on average 0.16 mg / dish; the insert shows a Scatchard plot analysis of the data; the Km value is about 10.2 g / ml and the maximum uptake rate as a measure of the LDL receptor activity 9.4 / mg cell protein / 5 hours); 3b:
The concentration-dependent uptake of DiI-LDL by U-937 cells (the cell suspensions (3 x 106 cells / ml) were incubated with 0 to 100 g of DiI-LDL protein / ml for 5 hours at 370C; after washing, the cells were in 1 ml Lysis reagent dissolved; the values were corrected with regard to the non-specific uptake and represent an average of 3 determinations; the cellular protein content was 0.25 g / dish); the insert shows a Scatchard plot analysis and gives a Km of about 53 g / ml; the maximum absorption capacity is 2.1 g / ml cell protein / 5 hours); Fig. 4a: The figure shows the concentration-dependent uptake and the metabolism of 125J-DiI-LDL by human skin fibroblasts.
The data obtained by determining the DiI fluorescence and the 125J radioactivity are compared; the cells were incubated with 125J-DiI-LDL in a concentration of 0 to 100 ag / ml for 5 hours at 370C; the ana-
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corrected the non-specific admission and represent an average of 3 attempts; the average cellular protein content is 0.10 mg / dish); Fig. 4b:
The concentration-dependent binding of 125J-DiI-LDL by human skin fibroblasts (the incubation with different
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performed at 40C for 2 hours; the closed squares show 125J radioactivity and the filled squares represent the dil fluorescence intensity of double-labeled, bound LDL; the results are presented as average values from 3 experiments; the average cellular protein content is 0.17 mg / dish);
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Data from the determination of the DiI fluorescence and the 125J radioactivity are compared; the cells were incubated with 0 to 100 g / ml 125J-DiI-acLDL for 5 hours at 370C; they don't
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filled squares;
the values were corrected with regard to the non-specific uptake and represent an average of 3 experiments; the mean cellular protein content is 0.33 mg / dish);
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premature patients and patients with familial hypercholesterolaemia (FH) (the plasma cholesterol concentrations of the control persons were 98 69 mg / dl, that of the patients with heterozygous FH 310 43 mg / dl and that of the patients with homozygous FH 651 69 mg / dl; the average absorption capacity of
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DiI-LDL of the analyzed fibroblasts is represented by the horizontal lines; the individual values representing 2 to 3 experiments are shown by the dots); Fig. 7:
A characteristic degradation curve for DiI-LDL in a normal rabbit (control) and a rabbit with an LDL receptor defect (WHHL rabbit). The labeled LDL was injected into the rabbits for this purpose and blood samples were taken at 3 minute intervals; the decrease in the fluorescence intensity of the labeled lipoprotein in removed plasma is shown as a function of time.
Example 1: Isolation and labeling of lipoproteins LDL was obtained from freshly obtained CDP plasma from healthy human blood donors by the method of Havel et al. (J. Clin. Invest.
1955.34, 1345-1353) as follows. Plasma was with a
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The shelter was then adjusted to a density of 1,060 g / ml and LDL (d-1,019-1,060 g / ml) was removed from the supernatant after repeated ultracentrifugation (150,000 xg 24 hours, 10 C) won. To prevent oxidation, the lipoprotein fractionation was carried out in the presence of 0.1 g / l EDTA. Low lipoprotein serum (LPDS) was obtained from the supernatant by ultracentrifugation at a density of 1.25 g / ml (150,000 x g, 48 hours). LDL and LPDS were dialyzed against 5 mM Tris, 154 mM NaCl, 0.1 g / l EDTA at pH 7, 4 and 40C.
The fluorescent dye 1, 1-dioctadecyl-3, 3, 3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) fluoresces in the rhodamine range. Due to its structural analogy to the phospholipids, DiI is built into the phospholipid shell of lipoproteins in a relatively stable manner. The labeling of LDL with the dye was carried out according to the method described by Innerarity et al. (Methods of Enzy-
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EDTA) to a concentration of 1.5 mg lipoprotein / ml. 3 ml of this dilution was mixed with 9 ml LPDS (4 g protein / ml). As protection against oxidation, 12 μl of a 100 mM ascorbic acid solution were added and the mixture was sterile filtered on a 0.45 on the filter.
DiI (D282, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) in a concentration of 6 mg / ml at 370C. 2251 of this stock solution were added to the LDL-LPDS mixture with gentle stirring (50 1 dil [3 ng / ml] per mg LDL). The mixture was overlaid with argon or nitrogen and incubated for 8 hours protected from light at 370C with gentle shaking.
The DiI-labeled lipoproteins were reisolated by ultracentrifugation. For this purpose, the mixture was adjusted to the density d-1,065 g / ml with crystalline NaCl, transferred into Quick seal centrifuge tubes (5/8 x 3 inch, Beckman, Irvine, CA, USA) and in
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Buffer (pH 7.4; 154mM NaCl; 0.25mM EDTA) dialyzed.
LDL and DiI-LDL were determined according to the method of Fraenkel-Conrat (1957, Methods in Enzymology, Academic Press New York, 247-269), which was developed by Basu et al. (1976, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 73,3178-3182) for lipoproteins has been acetylated. All
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Example 2: Cell Cultures Human skin biopsies were obtained from 4 normocholesterolemic donors and from 11 patients with familial hypercholesterolemia (FH); 9 patients were phenotypically heterozygous and 2 homozygous for FH. Fibroblasts growing out of the skin biopsies were cultured in DMEM (Sigma, St. Louis, USA) with 10% FBS (Biochrom, Berlin, Germany), 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. P388 D1 (IL-1) (mouse monocyte macrophage, ATCC TIB61) and U-937 (Histiocytic lymphoma, human, ATCC CRL 1593) cell line were obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, USA) and in RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, USA) with 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin.
All cells were at 37oC, 5% CO. kept in a humidified incubator.
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Human skin fibroblasts passaged 5 to 10 times, produced according to Example 2, were cultured in 35 mm plastic dishes (Nunc, Wiesbaden) and cultured in DMEM with 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin. After 72 hours, the medium was replaced with DMEM with 10% LPDS and the cells incubated for an additional 48 hours.
To study the uptake of the DiI-LDL, fibroblasts were incubated for 5 hours at 37 C with increasing concentrations of DiILDL (0, 5.10, 20.50, 100 g protein / ml). The specificity of the uptake was determined at a content of 10 μg DiI-LDL / ml with a 50-fold excess of unlabeled LDL.
All incubations were performed in triplicate.
After the incubation, the cells were washed twice with PBS containing 0.4% BSA and three times with PBS alone. Then 1 ml of the cell lysis reagent (1 g / l SDS dissolved in 0.1 N NaOH) was added. The cells were incubated with gentle shaking for 1 hour at room temperature.
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1000 microplate reader "(Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) at an excitation wavelength of 520 nm and an emission wavelength of 580 nm. Cellular protein was determined in a double determination of 40 μl samples according to the method of Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem., 193, p. 265-275, which was adapted for microtiter plates, and bovine serum albumin dissolved in lysis reagent was used as standard.
In parallel, the fluorescence of DiI-labeled lipoprotein diluted with lysis reagent (1: 2000) was determined in order to determine the specific fluorescence intensity of the DiI-LDL preparation. The results were presented in ng cell-associated DiI-LDL / mg cell protein (Fig. 1). A Scatchard plot analysis of the fluorometric data was performed to calculate the km and the maximum speed of the DiI-LDL uptake.
The uptake of the DiI-LDL follows, as can be seen from FIG. 3, a typical saturation curve and shows a high affinity
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: DiI-lipoprotein through non-adherent cells For the experiments with non-adherent cells (U 937) 35 mm plastic dishes were used for the cultivation (3 x 106 cells / small bowl). The cells were incubated with DiI-LDL (0, 5.10, 20, 50.100 g / ml) at 37 C for 5 hours. The specificity of the uptake was again determined using 10 g of diol.
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Right. All incubations were carried out in 2 ml RPMI 1640 with 100 U / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin.
After 5 hours of incubation, the cells were transferred to centrifuge tubes and washed twice with PBS (37 C) containing 0.4% BSA and 0.25 g / l EDTA and then twice with PBS-EDTA alone. After each wash, the cells were at 690 x g for 5 minutes
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centrifuged and resuspended in 5 ml buffer. The centrifuge tubes were changed before the last washing step to reduce contamination by free DiI-LDL. After the last centrifugation, the buffer was removed and the cell pellet was dissolved in 1 ml of cell lysis reagent. The further process steps correspond exactly to those that have been used for the fibroblasts.
3b shows the uptake of DiI-LDL by the non-adherent human monocyte cell line U-937. Compared to human fibroblasts, these cells show a lower affinity and a lower uptake of DiI-LDL.
Example 5: Investigations of the lipoproteins DiI-LDL and DiI-acLDL labeled with Dil and 125J were carried out according to the method of Goldstein J.
L. et al., 1974, J. Biol. Chem., 249.5133-5162, and Drevon C. et al., 1981, J. Lip. Res. 22,37-46 marked with 125J (Amersham-Buchler, Braunschweig, Germany). The cells were then incubated with the double-labeled lipoproteins. After the incubation had ended, the medium was removed and separated, the cells washed and, as already described in Example 3, lysed. The fluorescence, the radioactivity and the cell protein content were determined in one and the same sample of the cell lysate. The fluorescence measurements were used to calculate the uptake of diI lipoproteins. The amount of cell-associated 125J lipoprotein was determined by means of the radioactivity measurement in the cell lysate. The lipoprotein breakdown was determined via the radioactivity of the cell supernatant which is not soluble in iodide TCA.
For this purpose, 800 cl of the cell supernatant were mixed with 400 l of ice-cooled trichloroacetic acid (20% w / v TCA), shaken vigorously for 10 minutes and centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. 800 p. l of the TCA supernatant were mixed with 400 l AgN03 (5% w / v), shaken for 10 minutes and centrifuged for another 10 minutes at 4000 rpm. The radioactivity of 1 ml of the supernatant was determined.
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Example 6: Specificity of the Fluorometric Assay in the Determination of the LDL and Scavenger Receptor Activity The cellular uptake of lOug protein / ml DiI-LDL and of DiI-acLDL in normal human fibroblasts and in P388D1 cells with a 50-fold excess of not labeled lipoprotein was determined (see Table 1).
As expected, the uptake of DiI-acLDL by P388 cells was high due to the high scavenger receptor activity. Incubation of the labeled acLDL was markedly inhibited by simultaneous incubation with an excess of unlabeled acLDL, while unmodified LDL was not efficient in this regard. The uptake of DiI-LDL was low and was not affected by an excess of unlabeled acLDL.
In contrast, the result is the uptake of the corresponding lipoproteins by fibroblasts: no specific uptake of DiI-acLDL was observed in normal human fibroblasts. In contrast, diI-LDL was taken up by fibroblasts at high speed. Unlabeled LDL acted in excess as an efficient competitor, but unlabeled acLDL did not.
Example 7: Determination of Lipoprotein Degradation in Vivo In order to determine the lipoprotein turnover rate, the labeled lipoprotein is injected into the animal to be examined and blood samples (approx. 0.6 ml EDTA blood) are taken over a period of 3 days after certain time intervals. The fluorescence intensity of the labeled lipoprotein is determined directly in the corresponding plasma samples. The plasma is diluted 1:40 with 0.9% NaCl solution. The decrease in the fluorescence intensity of the labeled lipoprotein in plasma can be determined using an established mathematical method (see Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med.
Biol. 2: 36-53, 1957) the turnover amount of the lipoprotein per day
<Desc / Clms Page number 18>
are calculated (fractional catabolic rate). A characteristic degradation curve for DiI-LDL in a normal rabbit and a rabbit with an LDL receptor defect (WHHL) is shown in FIG. 7.
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Table 1:
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<tb>
<tb> cell type <SEP> DiI-acLDL <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-LDL <SEP> DiI-LDL <SEP> + <SEP> Dil-LDL <SEP> +
<tb> LDL <SEP> acLDL <SEP> LDL <SEP> acLDL
<tb> P388D1 <SEP> 10.73 <SEP> +/- 0.60 <SEP> 10.73 <SEP> +/- 0.13 <SEP> 1.25 <SEP> +/- <SEP> 0.09 <SEP> 2.22 <SEP> +/- <SEP> 0.03 <SEP> 0.36 <SEP> +/- <SEP> 0.05 <SEP> 1.84 <SEP> +/- <SEP> 0.04
<tb> humane <SEP> skin
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