WO2024146891A1 - Optical system - Google Patents

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WO2024146891A1
WO2024146891A1 PCT/EP2024/050060 EP2024050060W WO2024146891A1 WO 2024146891 A1 WO2024146891 A1 WO 2024146891A1 EP 2024050060 W EP2024050060 W EP 2024050060W WO 2024146891 A1 WO2024146891 A1 WO 2024146891A1
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WO
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nanoparticles
imaged
nanoparticle
field
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PCT/EP2024/050060
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Inventor
Pierre Bon
Minh Chau Nguyen
Original Assignee
Myriade
Institut D'optique Théorique Et Appliquée
Université De Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/0005—Adaptation of holography to specific applications
    • G03H2001/005—Adaptation of holography to specific applications in microscopy, e.g. digital holographic microscope [DHM]

Definitions

  • the present application relates to an optical system.
  • Such a system makes it possible, in particular, to measure the concentration of nanoparticles without a priori knowledge of the nanoparticles and without having to modify the particles or their environment.
  • - “CT temporal coherence” of a light source the ratio of the wavelength range of the source divided by its central wavelength.
  • CS spatial coherence of a light source in an optical system: the ratio of the illumination numerical aperture of an optical system to the collection numerical aperture.
  • Self-referenced phase imaging system a self-referenced detection system, or detector, providing, in addition to the optical intensity, the phase of an incident wave. The system is self-referenced because it does not use a separate optical arm as a reference.
  • “Real image” image of the intensity and phase of the wavefield in an object plane, captured by the self-referenced phase imaging system used.
  • the signal-to-noise ratio of an imaged nanoparticle depends on its size and its nature.
  • the digital depth of field depends on the size and nature of the nanoparticles.
  • the present application relates to an optical system comprising a microscope admitting an optical axis, an illumination source for the microscope and a self-referenced phase imaging system.
  • the lighting source is configured to illuminate an object space.
  • the microscope is configured to conjugate an object plane of the object space with an image plane, the self-referenced phase imaging system being disposed in the image plane or in the vicinity of the image plane.
  • the self-referenced phase imaging system is configured to produce a true intensity and phase image of the object plane.
  • the temporal coherence of the illumination source is between 0.4% and 6% and the spatial coherence of the illumination source, at the self-referenced phase imaging system, is between 0.4% and 10%.
  • the optical system further comprises a processing unit configured to digitally propagate the real image along the optical axis.
  • the lighting source is configured to illuminate an object space in a nanoparticle solution
  • the processing unit is configured to: count the number of nanoparticles imaged in the real image, digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness, count the number of nanoparticles imaged in digitally propagated images, calculate the size of the object volume corresponding to the image volume, calculate the nanoparticle concentration based on the number (N) of imaged nanoparticles counted and the size of the object volume.
  • the predetermined thickness is less than or equal to the digital depth of field.
  • the processing unit is configured to: counting the number of nanoparticles in a real image of a nanoparticle solution, obtained with the self-referenced phase imaging system; digitally propagate the real image into image volumes of increasing variable thickness; count the number of nanoparticles imaged in the digitally propagated images; analyze the variation in the number of imaged particles counted as a function of the variable thickness of the image volume and identify a limiting thickness of the image volume for which the number of imaged nanoparticles no longer increases with the variable thickness of the image volume and reaches a plateau, determine the digital depth of field based on the identified thickness limit.
  • the optical system further comprises a computer memory in which a chart is recorded indicating, for different types of nanoparticle, the correspondence between the amplitude, hereinafter referred to as "amplitude R", of a field formed from the information of the real and/or imaginary parts of the wavefield generated by an imaged nanoparticle and a digital depth of field.
  • the amplitude R can correspond, in particular, to the amplitude of a Rytov field.
  • the processing unit refers to the chart to determine the digital depth of field from the amplitude R of a nanoparticle imaged in the real image.
  • the lighting source is configured to illuminate an object space in the solution and the processing unit is configured to: count the nanoparticles imaged in the real image, measure the amplitudes R of these imaged nanoparticles and determine, by referring to a chart as previously described, the digital depths of field associated with each of these imaged particles; digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness, denoted D, for each of the nanoparticles imaged in the images digitally propagated in planes of the image volume, check using the chart whether the amplitude R of the nanoparticle corresponds to a digital depth of field, denoted H, greater than or equal to twice the distance between the digitally propagated image in which the nanoparticle is imaged and the real image, if so retaining the particle for counting and if not not retaining it for counting; for each nanoparticle counted, calculate the associated object volume corresponding, if H ⁇ D, to
  • the spatial CS and temporal CT coherence domain of the source is chosen to make it possible to carry out a faithful digital propagation from the real image of a solution of nanoparticles so as to determine the position of the nanoparticles in the object volume.
  • Digital propagation consists of digitally propagating the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness less than or equal to the digital depth of field.

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Abstract

Disclosed is an optical system comprising a microscope admitting an optical axis, a light source for the microscope and a self-referenced phase-imaging system. The light source is configured to illuminate an object space. The microscope is configured to conjugate an object plane of the object space with an image plane, the self-referenced phase-imaging system being placed in or in the vicinity of the image plane. The self-referenced phase-imaging system is configured to produce a real intensity and phase image of the object plane. The temporal coherence (CT) of the light source is between 0.4% and 6% and the spatial coherence (CS) of the light source, at the self-referenced phase-imaging system, is between 0.4% and 10%. The optical system further includes a processing unit configured to digitally propagate the real image along the optical axis.

Description

Système optiqueOptical system
La présente demande concerne un système optique. Un tel système permet, notamment, de mesurer la concentration de nanoparticules sans connaissance a priori des nanoparticules et sans avoir à modifier les particules ou leur milieu.The present application relates to an optical system. Such a system makes it possible, in particular, to measure the concentration of nanoparticles without a priori knowledge of the nanoparticles and without having to modify the particles or their environment.
Arrière-planBackground
Dans l’art antérieur, la mesure optique d’une concentration en nanoparticules se heurte à la disposition d’un outil pour déterminer un volume de mesure dans lequel les nanoparticules sont imagées. En effet le volume dans lequel les nanoparticules sont détectables dépend de la taille et de la nature des nanoparticules ainsi que du système optique. La mesure optique d’une concentration en nanoparticules, sans connaissance a priori de la nature physique des nanoparticules, est donc difficile et il existe un besoin pour un système optique permettant de faciliter cette mesure.In the prior art, the optical measurement of a concentration of nanoparticles comes up against the provision of a tool to determine a measurement volume in which the nanoparticles are imaged. Indeed, the volume in which the nanoparticles are detectable depends on the size and nature of the nanoparticles as well as the optical system. The optical measurement of a nanoparticle concentration, without a priori knowledge of the physical nature of the nanoparticles, is therefore difficult and there is a need for an optical system to facilitate this measurement.
Au sens de la présente demande, on entend par :
- « Cohérence temporelle CT » d’une source lumineuse : le rapport de l’étendue en longueur d’onde de la source divisée par sa longueur d’onde centrale.
- « Cohérence spatiale CS » d’une source lumineuse dans un système optique : le rapport de l’ouverture numérique d’illumination d’un système optique sur l’ouverture numérique de collection.
- « Système d’imagerie de phase auto-référencé » : un système de détection, ou détecteur, auto-référencé fournissant, en plus de l’intensité optique, la phase d’une onde incidente. Le système est auto-référencé car il n'utilise pas de bras optique séparé comme référence.
« Image réelle » : image de l’intensité et de la phase du champ d’onde dans un plan objet, capturée par le système d’imagerie de phase auto-référencé utilisé.
« Image propagée numériquement » : image de l’intensité et de la phase du champ d’onde dans un plan parallèle au plan objet, elle est calculée numériquement à partir de l’image réelle en utilisant des méthodes classiques de propagation pour résoudre l’équation d’onde.
« Volume image » : volume imagé par propagation numérique de l'image réelle.
« Nanoparticule imagée » ou « particule imagée »: nanoparticule qui forme une image nette ou de densité spatiale d’énergie maximum dans l’image réelle (c'est notamment le cas pour une nanoparticule dans le plan objet) ou dans des images propagées numériquement (c'est notamment le cas pour une nanoparticule en dehors du plan objet).
« Profondeur de champ numérique » : épaisseur, selon la direction de l’axe optique, du volume imagé par propagation numérique, notamment centrée sur l'image réelle, dans laquelle des nanoparticules peuvent être imagées de manière fidèle. C’est l'épaisseur dans laquelle la reconstruction du volume imagé par propagation numérique, à partir de l’image réelle, est valide. C’est-à-dire que les images propagées numériquement sont le reflet de la réalité de l’espace objet. Les objets physiquement présents dans l’espace objet, et seulement ces objets, sont imagés sur les images propagées numériquement considérées comme fidèles.
« Laser blanc » ou « laser de super-continuum » : une source à forte cohérence spatiale et à cohérence temporelle quasi-nulle.For the purposes of this application, we mean:
- “CT temporal coherence” of a light source: the ratio of the wavelength range of the source divided by its central wavelength.
- “CS spatial coherence” of a light source in an optical system: the ratio of the illumination numerical aperture of an optical system to the collection numerical aperture.
- “Self-referenced phase imaging system”: a self-referenced detection system, or detector, providing, in addition to the optical intensity, the phase of an incident wave. The system is self-referenced because it does not use a separate optical arm as a reference.
“Real image”: image of the intensity and phase of the wavefield in an object plane, captured by the self-referenced phase imaging system used.
“Digitally propagated image”: image of the intensity and phase of the wave field in a plane parallel to the object plane, it is calculated digitally from the real image using conventional propagation methods to resolve the wave equation.
“Image volume”: volume imaged by digital propagation of the real image.
“Imaged nanoparticle” or “imaged particle”: nanoparticle which forms a clear image or maximum spatial energy density in the real image (this is particularly the case for a nanoparticle in the object plane) or in digitally propagated images (this is particularly the case for a nanoparticle outside the object plane).
“Digital depth of field”: thickness, according to the direction of the optical axis, of the volume imaged by digital propagation, in particular centered on the real image, in which nanoparticles can be imaged faithfully. This is the thickness in which the reconstruction of the volume imaged by digital propagation, from the real image, is valid. That is to say, digitally propagated images are a reflection of the reality of object space. The objects physically present in the object space, and only these objects, are imaged on the digitally propagated images considered faithful.
“White laser” or “super-continuum laser”: a source with strong spatial coherence and almost zero temporal coherence.
La profondeur de champ numérique définie plus haut dépend du rapport signal sur bruit de détection des objets imagés. En outre, la profondeur de champ numérique est inférieure ou égale à la profondeur de champ (appelée ci-après profondeur de champ "optique" par souci de clarté) du système optique utilisé. La profondeur de champ optique dépend, quant à elle, de la cohérence spatiale et temporelle de la lumière permettant l'imagerie.The digital depth of field defined above depends on the signal-to-noise ratio of detection of the imaged objects. Furthermore, the digital depth of field is less than or equal to the depth of field (hereinafter called "optical" depth of field for clarity) of the optical system used. The optical depth of field depends, for its part, on the spatial and temporal coherence of the light allowing imaging.
Ainsi, pour un système optique de cohérence spatiale et temporelle (CS, CT) tendant vers (0, 0), la limite à la profondeur de champ optique imposée par ces deux paramètres tend vers l'infini mais le niveau de bruit augmente, ce qui rend difficile, voire impossible, toute propagation numérique de l'image réelle et limite donc la profondeur de champ numérique. A l’opposé, pour un système optique à CS et/ou CT tendant vers l’infini, le bruit chute mais la profondeur de champ optique tend vers 0. Sur l'image réelle n'apparaissent que les objets parfaitement focalisés. Ceci rend également difficile, voire impossible, toute propagation numérique de l'image réelle et limite donc la profondeur de champ numérique.Thus, for an optical system of spatial and temporal coherence (CS, CT) tending towards (0, 0), the limit to the optical depth of field imposed by these two parameters tends towards infinity but the noise level increases, this which makes any digital propagation of the real image difficult, if not impossible, and therefore limits the digital depth of field. On the other hand, for an optical system with CS and/or CT tending towards infinity, the noise drops but the optical depth of field tends towards 0. On the real image only perfectly focused objects appear. This also makes any digital propagation of the real image difficult, if not impossible, and therefore limits the digital depth of field.
En outre, à système optique fixé, le rapport signal sur bruit d’une nanoparticule imagée dépend de sa taille et de sa nature. Ainsi la profondeur de champ numérique dépend de la taille et de la nature des nanoparticules. In addition, with a fixed optical system, the signal-to-noise ratio of an imaged nanoparticle depends on its size and its nature. Thus the digital depth of field depends on the size and nature of the nanoparticles.
Il existe donc un besoin pour un système optique qui puisse être utilisé pour produire une image réelle de nanoparticules, idéalement sans besoin de connaissance a priori sur la taille et ou la nature des nanoparticules, et qui soit tel que, pour cette image réelle, la profondeur de champ numérique soit satisfaisante.There is therefore a need for an optical system which can be used to produce a real image of nanoparticles, ideally without the need for a priori knowledge on the size and/or nature of the nanoparticles, and which is such that, for this real image, the digital depth of field is satisfactory.
Présentation généraleGeneral presentation
Dans ce contexte, la présente demande concerne un système optique comprenant un microscope admettant un axe optique, une source d'éclairage pour le microscope et un système d'imagerie de phase auto-référencé. La source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet. Le microscope est configuré pour conjuguer un plan objet de l'espace objet avec un plan image, le système d'imagerie de phase auto-référencé étant disposé dans le plan image ou au voisinage du plan image. Le système d'imagerie de phase auto-référencé est configuré pour produire une image réelle en intensité et en phase du plan objet. La cohérence temporelle de la source d’éclairage est comprise entre 0,4% et 6% et la cohérence spatiale de la source d’éclairage, au niveau du système d’imagerie de phase auto-référencé, est comprise entre 0,4% et 10%. Le système optique comprend, en outre, une unité de traitement configurée pour propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique.In this context, the present application relates to an optical system comprising a microscope admitting an optical axis, an illumination source for the microscope and a self-referenced phase imaging system. The lighting source is configured to illuminate an object space. The microscope is configured to conjugate an object plane of the object space with an image plane, the self-referenced phase imaging system being disposed in the image plane or in the vicinity of the image plane. The self-referenced phase imaging system is configured to produce a true intensity and phase image of the object plane. The temporal coherence of the illumination source is between 0.4% and 6% and the spatial coherence of the illumination source, at the self-referenced phase imaging system, is between 0.4% and 10%. The optical system further comprises a processing unit configured to digitally propagate the real image along the optical axis.
Dans certains modes de réalisation, la cohérence temporelle de la source d’éclairage est voisine de 2,2% et la cohérence spatiale de la source d’éclairage, au niveau du système d’imagerie de phase auto-référencé, est voisine de 2,5%. In certain embodiments, the temporal coherence of the lighting source is close to 2.2% and the spatial coherence of the lighting source, at the level of the self-referenced phase imaging system, is close to 2 .5%.
Dans certains modes de réalisation, la source d’éclairage est un laser blanc éclairant un filtre passe-bande. En variante, la source d’éclairage peut-être une source blanche à plasma éclairant un filtre passe-bande ou encore une diode laser.In some embodiments, the illumination source is a white laser illuminating a band-pass filter. Alternatively, the lighting source may be a white plasma source illuminating a band-pass filter or even a laser diode.
Dans certains mode de réalisation, la source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet dans une solution de nanoparticules, et l’unité de traitement est configurée pour:
compter le nombre de nanoparticules imagées dans l'image réelle,
propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique, dans un volume image d'épaisseur prédéterminée,
compter le nombre des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement,
calculer la taille du volume objet correspondant au volume image,
calculer la concentration des nanoparticules sur la base du nombre (N) de nanoparticules imagées comptées et de la taille du volume objet.In some embodiments, the lighting source is configured to illuminate an object space in a nanoparticle solution, and the processing unit is configured to:
count the number of nanoparticles imaged in the real image,
digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness,
count the number of nanoparticles imaged in digitally propagated images,
calculate the size of the object volume corresponding to the image volume,
calculate the nanoparticle concentration based on the number (N) of imaged nanoparticles counted and the size of the object volume.
Dans certains modes de réalisation, l'épaisseur prédéterminée est inférieure ou égale à la profondeur de champ numérique.In some embodiments, the predetermined thickness is less than or equal to the digital depth of field.
Dans certains modes de réalisation, pour déterminer la profondeur de champ numérique, l'unité de traitement est configurée pour:
compter le nombre de nanoparticules dans une image réelle d'une solution de nanoparticules, obtenue avec le système d'imagerie de phase auto-référencé;
propager numériquement l’image réelle dans des volumes image d'épaisseur variable croissante;
compter le nombre des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement;
analyser la variation du nombre de particules imagées comptées en fonction de l'épaisseur variable du volume image et identifier une épaisseur limite du volume image pour laquelle le nombre de nanoparticules imagées ne croit plus avec l'épaisseur variable du volume image et atteint un plateau,
déterminer la profondeur de champ numérique en fonction de l'épaisseur limite identifiée.In some embodiments, to determine the digital depth of field, the processing unit is configured to:
counting the number of nanoparticles in a real image of a nanoparticle solution, obtained with the self-referenced phase imaging system;
digitally propagate the real image into image volumes of increasing variable thickness;
count the number of nanoparticles imaged in the digitally propagated images;
analyze the variation in the number of imaged particles counted as a function of the variable thickness of the image volume and identify a limiting thickness of the image volume for which the number of imaged nanoparticles no longer increases with the variable thickness of the image volume and reaches a plateau,
determine the digital depth of field based on the identified thickness limit.
Dans certains modes de réalisation, le système optique comprend, en outre, une mémoire informatique dans laquelle est enregistré un abaque indiquant, pour différents types de nanoparticule, la correspondance entre l'amplitude, désignée ci-après "amplitude R", d’un champ formé des informations des parties réelles et/ou imaginaires du champ d’onde généré par une nanoparticule imagée et une profondeur de champ numérique. L'amplitude R peut correspondre, notamment, à l'amplitude d'un champ de Rytov. In certain embodiments, the optical system further comprises a computer memory in which a chart is recorded indicating, for different types of nanoparticle, the correspondence between the amplitude, hereinafter referred to as "amplitude R", of a field formed from the information of the real and/or imaginary parts of the wavefield generated by an imaged nanoparticle and a digital depth of field. The amplitude R can correspond, in particular, to the amplitude of a Rytov field.
Dans certains modes de réalisation, l'unité de traitement se réfère à l’abaque pour déterminer la profondeur de champ numérique à partir de l’amplitude R d’une nanoparticule imagée dans l'image réelle.In certain embodiments, the processing unit refers to the chart to determine the digital depth of field from the amplitude R of a nanoparticle imaged in the real image.
Dans certains modes de réalisation, pour une solution comprenant un mélange de nanoparticules, la source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet dans la solution et l'unité de traitement est configurée pour :
compter les nanoparticules imagées dans l’image réelle, mesurer les amplitudes R de ces nanoparticules imagées et déterminer, en se referrant à un abaque tel que précédemment décrit, la profondeurs de champ numériques associée à chacune de ces particules imagées;
propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique, dans un volume image d'épaisseur prédéterminée, notée D,
pour chacune des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement dans des plans du volume image, vérifier en utilisant l’abaque si l'amplitude R de la nanoparticule correspond à une profondeur de champ numérique, notée H, supérieure ou égale au double de la distance entre l’image propagée numériquement dans laquelle la nanoparticule est imagée et l’image réelle, dans l'affirmative conserver la particule pour le comptage et dans la négative ne pas la retenir pour le comptage;
pour chaque nanoparticule comptée, calculer le volume objet associé correspondant, si H≥D, au volume image d'épaisseur D ou, si H<D, à un volume image d'épaisseur égale à la profondeur de champ numérique H associée à la nanoparticule; et
calculer la concentration des nanoparticules qui est égale à la somme, sur toutes les nanoparticules comptées, des inverses des volumes objet associés.In certain embodiments, for a solution comprising a mixture of nanoparticles, the lighting source is configured to illuminate an object space in the solution and the processing unit is configured to:
count the nanoparticles imaged in the real image, measure the amplitudes R of these imaged nanoparticles and determine, by referring to a chart as previously described, the digital depths of field associated with each of these imaged particles;
digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness, denoted D,
for each of the nanoparticles imaged in the images digitally propagated in planes of the image volume, check using the chart whether the amplitude R of the nanoparticle corresponds to a digital depth of field, denoted H, greater than or equal to twice the distance between the digitally propagated image in which the nanoparticle is imaged and the real image, if so retaining the particle for counting and if not not retaining it for counting;
for each nanoparticle counted, calculate the associated object volume corresponding, if H≥D, to the image volume of thickness D or, if H<D, to an image volume of thickness equal to the digital depth of field H associated with the nanoparticle ; And
calculate the concentration of the nanoparticles which is equal to the sum, over all the nanoparticles counted, of the reciprocals of the associated object volumes.
Les caractéristiques et avantages précités, ainsi que d'autres, apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit. Cette description détaillée fait référence aux dessins annexés.The aforementioned features and advantages, as well as others, will become apparent upon reading the detailed description which follows. This detailed description refers to the accompanying drawings.
Cette figure est un graphique représentant le nombre N de particules imagées dans un volume image d’épaisseur variable Dv, en micromètre (µm).
Cette figure est un graphique représentant la profondeur de champ numérique H, en micromètre (µm), en fonction de l’amplitude R, en unité arbitraire (a.u.), des pics de Rytov des nanoparticules imagées.
Cette figure représente un exemple de domaine de cohérence spatiale CS et temporelle CT. This figure is a graph representing the number N of particles imaged in an image volume of variable thickness Dv, in micrometers (µm).
This figure is a graph representing the digital depth of field H, in micrometers (µm), as a function of the amplitude R, in arbitrary units (au), of the Rytov peaks of the imaged nanoparticles.
This figure represents an example of a spatial CS and temporal CT coherence domain.
Description détailléedetailed description
Un exemple de système optique selon l'invention comprend un microscope admettant un axe optique, une source d'éclairage, un système d'imagerie de phase auto-référencé appelé plus simplement "détecteur", et une unité de traitement configurée pour propager numériquement l’image réelle. La source d'éclairage éclaire le microscope qui conjugue un plan objet et un plan image contenant le détecteur. Le détecteur produit des images en phase et en intensité.An example of an optical system according to the invention comprises a microscope admitting an optical axis, a lighting source, a self-referenced phase imaging system called more simply "detector", and a processing unit configured to digitally propagate the 'real picture. The lighting source illuminates the microscope which combines an object plane and an image plane containing the detector. The detector produces images in phase and intensity.
Le domaine de cohérence spatiale CS et temporelle CT de la source est choisi pour permettre de réaliser une propagation numérique fidèle à partir de l’image réelle d’une solution de nanoparticules de manière à déterminer la position des nanoparticules dans le volume objet. La propagation numérique consiste à propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique, dans un volume image d'épaisseur prédéterminée inférieure ou égale à la profondeur de champ numérique. The spatial CS and temporal CT coherence domain of the source is chosen to make it possible to carry out a faithful digital propagation from the real image of a solution of nanoparticles so as to determine the position of the nanoparticles in the object volume. Digital propagation consists of digitally propagating the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness less than or equal to the digital depth of field.
La propagation numérique est fidèle seulement pour une certaine épaisseur du volume image, répartie symétriquement de part et d’autre de l'image réelle. Au-delà de cette épaisseur limite, les images propagées numériquement présentent des artefacts et ne représentent plus la réalité de l’échantillon de solution. Cette épaisseur limite correspond à la profondeur de champ numérique.Digital propagation is faithful only for a certain thickness of the image volume, distributed symmetrically on either side of the real image. Beyond this thickness limit, the digitally propagated images present artifacts and no longer represent the reality of the solution sample. This limiting thickness corresponds to the digital depth of field.
En particulier, on utilise une source d'éclairage dont la cohérence spatiale CS et temporelle CT est choisie ou modifiée pour faire opérer la source dans le domaine de cohérence souhaité. La représente le domaine de cohérence (CS et CT) choisi pour la source d'éclairage. Ce domaine est limité comme suit : de 0,4% à 6% en cohérence temporelle CT et de 0,4% à 10% en cohérence spatiale CS. Ce domaine englobe le mode de fonctionnement CT=2,2% et CS=2,5%, considéré comme optimal. In particular, a lighting source is used whose spatial coherence CS and temporal coherence CT is chosen or modified to make the source operate in the desired coherence domain. There represents the coherence domain (CS and CT) chosen for the lighting source. This domain is limited as follows: from 0.4% to 6% in CT temporal coherence and from 0.4% to 10% in CS spatial coherence. This domain includes the operating mode CT=2.2% and CS=2.5%, considered optimal.
Pour la mise en œuvre de l’invention, l’homme du métier pourra considérer notamment les sources d'éclairage suivantes :
- une diode laser (Thorlabs L405P150 : longueur d’onde 405nm et puissance 150mW), de cohérence temporelle estimée à CT= 0,25% (1nm de largeur spectrale sur une longueur d’onde centrale de 405nm). Une modulation de la longueur d’onde pendant l’intervalle d’intégration du détecteur utilisé (par exemple 1 ms) peut être appliquée pour se rapprocher de la cohérence temporelle CT=2,2% considérée comme optimale;
- un laser blanc aussi désigné par « laser de super continuum », filtré par un filtre passe-bande (laser super-continuum de référence Leukos ELECTRO VIS 430) ;
- une source blanche à plasma, suffisamment puissante pour que le signal des nanoparticules soit supérieur au bruit, filtrée par un filtre passe-bande ;
- une source d’éclairage qui est une source de cohérence temporelle CT tendant vers 0 (e.g.une diode laser), en combinaison avec une méthode d’ajustement de la cohérence temporelle par la variation à haute-fréquence de longueur d’onde (trigger électronique) ;
- une source d’éclairage qui est une source de cohérence spatiale CS tendant vers 0 (e.g. une source avec un système de collimation), en combinaison avec une méthode d’ajustement de la cohérence spatiale comme notamment : par un système pour focaliser ou diversifier le faisceau, par le couplage avec une fibre optique multimode, par le mouvement à haute-fréquence (rotation/vibration/balayage) des éléments optiques ;
- une diode superluminescente. For the implementation of the invention, those skilled in the art may consider in particular the following lighting sources:
- a laser diode (Thorlabs L405P150: wavelength 405nm and power 150mW), with temporal coherence estimated at CT = 0.25% (1nm spectral width on a central wavelength of 405nm). A modulation of the wavelength during the integration interval of the detector used (for example 1 ms) can be applied to approach the temporal coherence CT=2.2% considered optimal;
- a white laser also designated as a “super continuum laser”, filtered by a band-pass filter (super-continuum laser reference Leukos ELECTRO VIS 430);
- a white plasma source, powerful enough so that the signal from the nanoparticles is greater than the noise, filtered by a band-pass filter;
- a lighting source which is a source of temporal coherence CT tending towards 0 (eg a laser diode), in combination with a method of adjusting the temporal coherence by high-frequency variation of wavelength (electronic trigger ) ;
- a lighting source which is a source of spatial coherence CS tending towards 0 (eg a source with a collimation system), in combination with a method of adjusting the spatial coherence such as in particular: by a system for focusing or diversifying the beam, by coupling with a multimode optical fiber, by the high-frequency movement (rotation/vibration/scanning) of the optical elements;
- a superluminescent diode.
On notera qu'une cohérence spatiale de l’ordre de 2% (donc proche de la valeur CS=2,5% considérée comme optimale) avec des microscopes connus s'avère satisfaisante pour mettre en œuvre l’invention.
L’enseignement de la présente demande, lorsqu’il présente un domaine de cohérence spatiale et temporelle n’établit pas de lien d’équivalence entre ces deux notions différentes par nature. Les contraintes d’appartenance à des intervalles de cohérence temporelle et spatiale s’entendent donc comme des conditions cumulatives devant être simultanément remplies.It should be noted that a spatial coherence of the order of 2% (therefore close to the value CS=2.5% considered optimal) with known microscopes proves satisfactory for implementing the invention.
The teaching of the present application, when it presents a domain of spatial and temporal coherence, does not establish a link of equivalence between these two notions which are different by nature. The constraints of belonging to temporal and spatial coherence intervals are therefore understood as cumulative conditions that must be simultaneously fulfilled.
En outre, il est entendu qu’un point de cohérence spatiale nulle (CS=0) ou de cohérence temporelle nulle (CT=0) est sans signification physique. Par conséquent, dans la présente demande, un intervalle de cohérence spatiale ou temporelle s’étendant entre 0 et une borne supérieure est un intervalle ouvert ne comprenant pas la valeur 0. Furthermore, it is understood that a point of zero spatial coherence (CS=0) or zero temporal coherence (CT=0) is without physical meaning. Consequently, in the present application, a spatial or temporal coherence interval extending between 0 and an upper limit is an open interval not including the value 0.
Le domaine de cohérence spatiale et temporelle représenté sur la est appelé ci-après « domaine principal ». Comme précédemment indiqué, le mode de fonctionnement considéré comme optimal pour l’invention, à l’intérieur du domaine principal, est obtenu pour CT=0,022 (2,2%) et CS=0,025 (2,5%).The domain of spatial and temporal coherence represented on the is hereinafter called “main domain”. As previously indicated, the operating mode considered optimal for the invention, within the main domain, is obtained for CT=0.022 (2.2%) and CS=0.025 (2.5%).
Faire tendre CT ou CS vers 0 n’est pas un mode réalisation à privilégier car la présence de bruit optique dû à la cohérence spatiale et temporelle (tavelure, speckle ou granularité laser) dégrade la détection des particules en relevant le niveau de bruit du fond, ce qui fait décroître le nombre de particules détectées et le volume de propagation possible. Un domaine adapté à la mise en œuvre de l'invention est donc un domaine excluant CT=0 ou CS=0.Bringing CT or CS towards 0 is not a preferred embodiment because the presence of optical noise due to spatial and temporal coherence (speckle, speckle or laser granularity) degrades particle detection by raising the background noise level. , which decreases the number of particles detected and the volume of possible propagation. A domain suitable for the implementation of the invention is therefore a domain excluding CT=0 or CS=0.
Dans la présente demande, la cohérence temporelle CT de la source d’éclairage est considérée comme voisine de 2,2% et la cohérence spatiale CS de la source d’éclairage au niveau du système d’imagerie de phase auto-référencé, est considérée comme voisine de 2,5%, si ces deux paramètres CT, CS sont respectivement dans un intervalle contenant la valeur CT=2,2% et dans un intervalle contenant la valeur CS=2,5%, ces deux intervalles étant strictement inclus, respectivement, dans les intervalles du domaine principal précité et représenté sur la , c'est à dire entre 0,4% et 6% pour CT et entre 0,4% et 10% pour CS. En d'autres termes, la combinaison CT=2,2% et CS=2,5% étant considérée comme un « point optimum » de fonctionnement du système, un voisinage du point optimum au sens de la présente demande est un sous-domaine quelconque du domaine principal qui contient le point optimum. On peut citer, par exemple, un sous-domaine avec une plage de 1,7% à 2,7% pour CT et une plage de 2% à 3% pour CS.In the present application, the temporal coherence CT of the lighting source is considered to be close to 2.2% and the spatial coherence CS of the lighting source at the level of the self-referenced phase imaging system is considered as close to 2.5%, if these two parameters CT, CS are respectively in an interval containing the value CT=2.2% and in an interval containing the value CS=2.5%, these two intervals being strictly included, respectively, in the intervals of the aforementioned main domain and represented on the , that is to say between 0.4% and 6% for CT and between 0.4% and 10% for CS. In other words, the combination CT=2.2% and CS=2.5% being considered as an “optimum point” of operation of the system, a neighborhood of the optimum point within the meaning of the present application is a subdomain any of the main domain which contains the optimum point. We can cite, for example, a subdomain with a range of 1.7% to 2.7% for CT and a range of 2% to 3% for CS.
Dans l’art antérieur, une valeur basse mais relativement courante pour la cohérence spatiale est typiquement CS = 0,1%. Un document de l'art antérieur qui enseignerait de minimiser la cohérence spatiale ou de la faire tendre vers 0 doit donc être interprété comme enseignant de choisir des valeurs de CS inférieures à 0,1%. Ceci ne correspondrait donc pas aux conditions de mise en œuvre de l’invention dans l'intervalle [0,4% ; 10%] de cohérence spatiale CS.In the prior art, a low but relatively common value for spatial coherence is typically CS = 0.1%. A document of the prior art which would teach to minimize spatial coherence or to make it tend towards 0 must therefore be interpreted as teaching to choose CS values less than 0.1%. This would therefore not correspond to the conditions for implementing the invention in the interval [0.4%; 10%] of CS spatial coherence.
Dans l’art antérieur, une valeur basse mais relativement courante pour la cohérence temporelle est typiquement CT = 0,02% (sans que cette valeur soit reliée à la valeur basse courante de cohérence spatiale CS mentionnée plus haut). Un document de l'art antérieur qui enseignerait de minimiser la cohérence temporelle CT doit donc être interprété comme enseignant de choisir des valeurs de CT inférieures à 0,02%. Ceci ne correspondrait donc pas aux conditions de mise en œuvre de l’invention dans l'intervalle [0,4% ; 6%] de cohérence temporelle CT.In the prior art, a low but relatively common value for temporal coherence is typically CT = 0.02% (without this value being linked to the current low value of spatial coherence CS mentioned above). A document of the prior art which would teach to minimize the temporal coherence CT must therefore be interpreted as teaching to choose CT values less than 0.02%. This would therefore not correspond to the conditions for implementing the invention in the interval [0.4%; 6%] of CT temporal coherence.
Pour réaliser un tel système optique, il suffira pour une source d'éclairage donnée, soit de vérifier qu’elle correspond au domaine de cohérence spatiale et temporelle précité, soit de vérifier que le rapport signal sur bruit qu’elle procure sur un détecteur permet la détection des nanoparticules et la propagation numérique de l'image réelle. To create such an optical system, it will be sufficient for a given lighting source, either to verify that it corresponds to the aforementioned spatial and temporal coherence domain, or to verify that the signal-to-noise ratio that it provides on a detector allows nanoparticle detection and digital propagation of the real image.
Dans la présente demande, un détecteur produisant des images en phase et en intensité est entendu comme un détecteur produisant une mesure de phase proprement dite mais aussi de façon équivalente une grandeur apte à reconstruire l’information de phase comme une grandeur proportionnelle à la phase, comme une différence de chemin optique, ou comme un ou des gradients de la phase qui permettent de la reconstruire par intégration.In the present application, a detector producing images in phase and intensity is understood as a detector producing a phase measurement itself but also equivalently a quantity capable of reconstructing the phase information as a quantity proportional to the phase, as a difference in optical path, or as one or more gradients of the phase which allow it to be reconstructed by integration.
A titre d'exemple, les dispositifs suivants peuvent être utilisés comme détecteur::
-un dispositif d’interférométrie à décalage multi-latéral utilisant un masque de Hartmann modifié, par exemple par superposition d’un réseau d’amplitude de période p donnée et d’un réseau de phase de période 2.p comme par exemple un détecteur référencé sous le nom « SID4 » et commercialisé par la société « Phasics »;
- des analyseurs de front d’onde, permettant d’établir une cartographie en phase d’un front d’onde, combinés à un détecteur d’intensité pour analyser simultanément et avec une référence spatiale commune, la phase et l’intensité d’une onde;
- un analyseur ou imageur de front d’onde connu de l’art antérieur comme un analyseur de courbure, un capteur de Shack-Hartmann, un montage de microscopie de phase quantitative comme par exemple un dispositif d’holographie numérique auto-référencé. As an example, the following devices can be used as a detector::
-a multi-lateral shift interferometry device using a modified Hartmann mask, for example by superposition of an amplitude network of given period p and a phase network of period 2.p such as for example a detector referenced under the name “SID4” and marketed by the company “Phasics”;
- wavefront analyzers, making it possible to establish a phase map of a wavefront, combined with an intensity detector to analyze simultaneously and with a common spatial reference, the phase and intensity of a wave;
- a wavefront analyzer or imager known from the prior art such as a curvature analyzer, a Shack-Hartmann sensor, a quantitative phase microscopy assembly such as for example a self-referenced digital holography device.
La détermination de la profondeur de champ numérique pour calculer la concentration de nanoparticules est basée sur la propagation numérique de l’image réelle pour calculer le champ d’onde dans le volume objet. Pour résoudre l’équation d’onde dans un milieu inhomogène (comme c’est le cas d’un milieu contenant une population de nanoparticules) et effectuer une propagation numérique, plusieurs approches ou méthodes connues de l’art antérieur peuvent être appliquées, parmi elles notamment : la méthode des rayons (ou l’optique géométrique), la méthode des faibles perturbations de Born, l’approche de Rytov, l’approximation parabolique et l’équation de transfert en intensité.The determination of the digital depth of field to calculate the concentration of nanoparticles is based on the digital propagation of the real image to calculate the wavefield in the object volume. To solve the wave equation in an inhomogeneous medium (as is the case of a medium containing a population of nanoparticles) and carry out digital propagation, several approaches or methods known from the prior art can be applied, among they include: the ray method (or geometric optics), Born's weak disturbance method, Rytov's approach, the parabolic approximation and the intensity transfer equation.
Dans certains modes de réalisation, on utilise un microscope de révolution autour d’un axe optique confondu avec l’axe des z d’un repère orthonormé (O, x, y, z) dans un espace image, et un détecteur de surface S, disposé dans le plan image z=0 et fournissant une mesure de l’intensité et de la phase du champ complexe incident sur ce détecteur. On forme ainsi sur le détecteur une image réelle en intensité et en phase, appelée également holographique, de nanoparticules disposées dans le volume objet autour d’un plan objet conjugué optiquement du plan du détecteur. In certain embodiments, a microscope of revolution around an optical axis coincident with the z axis of an orthonormal reference frame (O, x, y, z) is used in an image space, and a surface detector S , arranged in the image plane z=0 and providing a measurement of the intensity and phase of the complex field incident on this detector. We thus form on the detector a real image in intensity and phase, also called holographic, of nanoparticles arranged in the object volume around an object plane optically conjugated to the plane of the detector.
On peut compter le nombre de nanoparticules imagées n(z=0) dans l’image réelle, puis par propagation numérique par pas d'épaisseur d, de façon symétrique par rapport au plan image (i.e., le plan de l'image réelle), obtenir des images de plans distants de d/2 du détecteur et distants entre eux de d. On peut alors compter le nombre de nanoparticules imagées n(-d/2) et n(d/2) dans ces deux plans. Par addition on obtient un nombre de particules imagées N(d) = n(0) + n(-d/2) + n(d/2) dans le volume, image d’épaisseur d, c’est-à-dire en sommant les particules imagées dans des plans intérieurs au volume image (ici, le plan du détecteur) et en surface du volume image d’épaisseur d.We can count the number of imaged nanoparticles n(z=0) in the real image, then by digital propagation in steps of thickness d, symmetrically with respect to the image plane (i.e., the plane of the real image) , obtain images of planes distant d/2 from the detector and distant from each other d. We can then count the number of imaged nanoparticles n(-d/2) and n(d/2) in these two planes. By addition we obtain a number of imaged particles N(d) = n(0) + n(-d/2) + n(d/2) in the volume, image of thickness d, that is to say by summing the particles imaged in interior planes of the image volume (here, the plane of the detector) and on the surface of the image volume of thickness d.
Il est aisé de démontrer qu’en propageant de même progressivement l’image en –d/2 dans le plan en –d et l’image en +d/2 dans le plan en +d, c’est-à-dire en augmentant symétriquement par rapport à l’image, le volume image par pas d’épaisseur d, on peut compter le nombre de particules imagées par deux propagations numériques dans deux nouveaux plans situés en dehors du volume image pour lequel le nombre de particules est antérieurement connu. On ajoute le nombre des particules imagées connu dans le volume intérieur aux nouveaux plans et le nombre de particules imagées dans ces nouveaux plans, de proche en proche. Ainsi pour une épaisseur variable Dv=k*d (k étant un nombre entier positif) de volume image, on a: N((k+1)*d)=N(k*d)+n(k*d/2)+n(-k*d/2).It is easy to demonstrate that by progressively propagating the image in –d/2 in the plane in –d and the image in +d/2 in the plane in +d, that is to say in increasing symmetrically with respect to the image, the image volume in steps of thickness d, we can count the number of particles imaged by two digital propagations in two new planes located outside the image volume for which the number of particles is previously known . We add the known number of particles imaged in the interior volume to the new planes and the number of particles imaged in these new planes, step by step. Thus for a variable thickness Dv=k*d (k being a positive integer) of image volume, we have: N((k+1)*d)=N(k*d)+n(k*d/2 )+n(-k*d/2).
On peut tracer alors le graphe ou la courbe N(Dv) représentative du nombre N de particules imagées en fonction de l'épaisseur variable Dv pour une expérience ou une courbe moyenne pour plusieurs expériences (plusieurs images réelles d’une même solution de nanoparticules).We can then draw the graph or curve N(Dv) representative of the number N of particles imaged as a function of the variable thickness Dv for an experiment or an average curve for several experiments (several real images of the same solution of nanoparticles) .
Pour une population de nanoparticules données (taille et nature fixées), on observe pour une source de cohérence spatiale et temporelle contrôlées, que le nombre N des particules imagées (qui peut être un nombre moyen si plusieurs expériences sont faites) présentes dans un volume image de plus en plus grand ne croît pas linéairement mais plafonne à une valeur constante sur un plateau ou zone de plateau P qui s’étend en projection sur l’axe des épaisseurs Dv, sur une plage d’épaisseurs k1*d ≤ Dv ≤ k2*d avec k1<k2 et sur l’axe des N en gardant une valeur sensiblement constante aux erreurs de mesure près. Il est alors possible de déterminer la valeur H=k1*d comme étant la profondeur de champ numérique pour le dispositif expérimental utilisé et pour la population de nanoparticules imagées. For a population of given nanoparticles (fixed size and nature), we observe for a source of controlled spatial and temporal coherence, that the number N of imaged particles (which can be an average number if several experiments are carried out) present in an image volume increasingly larger does not grow linearly but reaches a constant value on a plateau or plateau zone P which extends in projection on the thickness axis Dv, over a range of thicknesses k1*d ≤ Dv ≤ k2 *d with k1<k2 and on the N axis keeping a value substantially constant up to measurement errors. It is then possible to determine the value H=k1*d as being the digital depth of field for the experimental device used and for the population of nanoparticles imaged.
Les explications qui précèdent sont illustrées par l'exemple de la . Dans cet exemple, les particules utilisées sont des particules de polystyrène de 100nm de diamètre. La est un graphe représentant le nombre N de particules imagées dans un volume image V d’épaisseur variable Dv en micromètre (µm) après la propagation numérique de l’image réelle dans le volume image V. Ce volume image V est centré sur le plan de l'image réelle et son épaisseur Dv croit symétriquement de part et d’autre de l'image réelle. Les particules imagées sont comptées dans des images propagées numériquement et espacées les unes des autres pour reconstituer le volume image V. Cette opération a été réalisée pour plusieurs images réelles d’un même échantillon (traits clairs), les relations sont ensuite moyennées pour obtenir la courbe N(Dv) en trait épais. Cette courbe N(Dv) présente une croissance monotone jusqu’à un plafonnement sur une zone de plateau P (entourée de pointillés sur la ) à l’intérieur de laquelle le nombre N de particules imagées est sensiblement stable avec Dv. Il existe ainsi une épaisseur limite à partir de laquelle le nombre N de particules imagées plafonne dans la zone P à une certaine valeur notée N(H). Dans l'exemple de la figure, N(H) est proche de 16. La profondeur de champ numérique H correspond à ladite épaisseur limite. Dans l'exemple de la figure, la profondeur de champ numérique H est estimée être égale à 25 µm.The preceding explanations are illustrated by the example of the . In this example, the particles used are polystyrene particles 100 nm in diameter. There is a graph representing the number N of particles imaged in an image volume V of variable thickness Dv in micrometers (µm) after the digital propagation of the real image in the image volume V. This image volume V is centered on the plane of the real image and its thickness Dv increases symmetrically on either side of the real image. The imaged particles are counted in digitally propagated images and spaced from each other to reconstruct the image volume V. This operation was carried out for several real images of the same sample (light lines), the relationships are then averaged to obtain the N(Dv) curve in thick line. This curve N(Dv) presents a monotonous growth until a plateau on a plateau zone P (surrounded by dotted lines on the ) inside which the number N of imaged particles is substantially stable with Dv. There is thus a limit thickness from which the number N of imaged particles peaks in zone P at a certain value denoted N(H). In the example in the figure, N(H) is close to 16. The digital depth of field H corresponds to said limiting thickness. In the example in the figure, the digital depth of field H is estimated to be equal to 25 µm.
Pour des épaisseurs Dv supérieures à H, la reconstruction du volume par propagation numérique est considérée comme n’étant plus fidèle de la réalité du volume objet. En effet, le plafonnement de N puis sa croissance avec Dv (pour Dv>H) ne correspondent pas à une réalité physique pour un échantillon homogène de nanoparticules (pour lequel N doit croitre constamment avec Dv). Pour Dv>H, la propagation numérique ne permet donc plus de reconstituer les images des objets physiquement présents dans le volume objet mais crée des images d’objets non présents dans le volume objet.For thicknesses Dv greater than H, the reconstruction of the volume by digital propagation is considered to no longer be faithful to the reality of the object volume. Indeed, the plateauing of N then its growth with Dv (for Dv>H) does not correspond to a physical reality for a homogeneous sample of nanoparticles (for which N must constantly increase with Dv). For Dv>H, digital propagation therefore no longer makes it possible to reconstruct the images of objects physically present in the object volume but creates images of objects not present in the object volume.
Pour éviter ou limiter au maximum des artefacts de comptage, une propagation numérique sur une distance (i.e. une épaisseur prédéterminée D de volume image) choisie inférieure ou égale à la profondeur de champ numérique H déterminée avec des nanoparticules de référence sera un mode privilégié de mise en œuvre pour déterminer la concentration d’une population de nanoparticules sans connaissance a priori de celles-ci. To avoid or limit counting artifacts as much as possible, digital propagation over a distance (i.e. a predetermined thickness D of image volume) chosen less than or equal to the digital depth of field H determined with reference nanoparticles will be a preferred method of implementation. implemented to determine the concentration of a population of nanoparticles without a priori knowledge of them.
Le pas d est choisi pour être inférieur à la résolution axiale du microscope et permettre un échantillonnage fidèle du volume.The step d is chosen to be lower than the axial resolution of the microscope and to allow faithful sampling of the volume.
La valeur de la profondeur de champ numérique pour une nanoparticule dépend du volume de la particule et du module de la différence d’indice complexe entre la particule et le milieu environnant à une longueur d’onde donnée, à une CS et une CT données, et un système d’imagerie donné (ouverture numérique d’illumination et de collection). The value of the numerical depth of field for a nanoparticle depends on the volume of the particle and the modulus of the complex index difference between the particle and the surrounding medium at a given wavelength, at a given CS and CT, and a given imaging system (numerical aperture of illumination and collection).
Les inventeurs ont découvert que l’approche de Rytov était d’application particulièrement pertinente pour le calcul de concentration de nanoparticules. En effet le calcul du champ complexe de Rytov et notamment de son intensité, facilite la détection des nanoparticules imagées dans l’image réelle et dans les images propagées numériquement. The inventors discovered that Rytov's approach was particularly relevant for calculating the concentration of nanoparticles. Indeed, the calculation of the complex Rytov field and in particular its intensity, facilitates the detection of the nanoparticles imaged in the real image and in the digitally propagated images.
L‘approche de Rytov décrite ici est valable dans les domaines de cohérence spatiale CS et temporelle CT de la source d'éclairage mentionnés plus tôt.The Rytov approach described here is valid in the spatial CS and temporal CT coherence domains of the lighting source mentioned earlier.
On forme à partir de l’intensité I(x,y,zi) et la phase phi(x,y,zi) dans le plan du détecteur (image réelle) (zi=0) ou dans le plan d’une image propagée numériquement (zi différent de zéro), le champ complexe de Rytov r(x,y,zi) par des formules connues de l’art antérieur, dans d’autres domaines d’application.We form from the intensity I(x,y,zi) and the phase phi(x,y,zi) in the plane of the detector (real image) (zi=0) or in the plane of a propagated image numerically (zi different from zero), the complex Rytov field r(x,y,zi) by formulas known from the prior art, in other fields of application.
On forme ensuite une image de Rytov en intensité R(x,y,zi) dans le plan zi par le carré du module dans ce plan de l’amplitude complexe de Rytov selon la formule : R(x,y,zi)=|r(x,y,zi)|2. Alternativement une image en amplitude de Rytov peut être obtenue aux mêmes fins, en formant la racine carrée de R en fonction de x, y dans le plan zi.We then form a Rytov image in intensity R(x,y,zi) in the plane zi by the square of the module in this plane of the complex Rytov amplitude according to the formula: R(x,y,zi)=| r(x,y,zi)|2. Alternatively a Rytov amplitude image can be obtained for the same purposes, by forming the square root of R as a function of x, y in the zi plane.
Utiliser l’intensité de Rytov est particulièrement efficace pour détecter les nanoparticules imagées que ce soit dans les images réelles ou propagées. En effet, l’intensité ou l’amplitude de Rytov permettent d’obtenir pour une nanoparticule, nette dans le plan considéré, un signal positif sur fond nul, quel que soit la nature de la nanoparticules (que le signal soit contenu dans la partie réelle ou imaginaire de l’image réelle ou propagée, il sera visible dans l’intensité ou l’amplitude du champ de Rytov).Using Rytov intensity is particularly effective for detecting imaged nanoparticles whether in real or propagated images. Indeed, the Rytov intensity or amplitude makes it possible to obtain for a nanoparticle, clear in the plane considered, a positive signal on zero background, whatever the nature of the nanoparticle (whether the signal is contained in the part real or imaginary of the real or propagated image, it will be visible in the intensity or amplitude of the Rytov field).
Utiliser l'intensité de Rytov est donc une manière privilégiée pour identifier et compter les nanoparticules imagées dans le volume image après propagation numérique (en calculant le champ de Rytov pour chaque image propagée numériquement dans le volume image et en réalisant la détection sur l’image correspondante de l’intensité ou de l’amplitude de Rytov), tel que décrit plus haut. Le calcul du champ de Rytov est donc utile pour compter les nanoparticules imagées. De plus, les inventeurs ont découvert que l’intensité ou l'amplitude du champ de Rytov est caractéristique de la profondeur de champ numérique associée. En effet, lorsque l’information d’amplitude complexe est exprimée sous la forme du champ de Rytov, pour un système optique adapté au régime de cohérence CT et CS, on obtient le résultat que la profondeur de champ numérique n’est plus fonction que de l’intensité ou de l’amplitude de Rytov, au sens où des nanoparticules ayant la même intensité ou amplitude de Rytov sont détectables dans une même profondeur de champ numérique même si leur indice optique ou leur volume sont différents. Ce résultat est illustré par la . Cette figure est un graphique représentant la profondeur de champ numérique H, en micromètre (µm), en fonction de l’amplitude moyenne R des pics de Rytov, en unité arbitraire (a.u.), des nanoparticules imagées. Ici, l’observable choisie est l’amplitude du champ de Rytov du champ complexe propagé numériquement, dans le volume image d’épaisseur égale à la profondeur de champ numérique H. Chaque point et sa statistique associée correspondent à des échantillons homogènes de nanoparticules différentes, les nanoparticules de chaque échantillon ayant un diamètre et une nature fixés.Using the Rytov intensity is therefore a preferred way to identify and count the nanoparticles imaged in the image volume after digital propagation (by calculating the Rytov field for each image digitally propagated in the image volume and performing the detection on the image corresponding to the Rytov intensity or amplitude), as described above. The calculation of the Rytov field is therefore useful for counting the imaged nanoparticles. Furthermore, the inventors discovered that the intensity or amplitude of the Rytov field is characteristic of the associated digital depth of field. Indeed, when the complex amplitude information is expressed in the form of the Rytov field, for an optical system adapted to the CT and CS coherence regime, we obtain the result that the digital depth of field is no longer a function that of the Rytov intensity or amplitude, in the sense that nanoparticles having the same Rytov intensity or amplitude are detectable in the same digital depth of field even if their optical index or their volume are different. This result is illustrated by the . This figure is a graph representing the digital depth of field H, in micrometers (µm), as a function of the average amplitude R of the Rytov peaks, in arbitrary units (au), of the imaged nanoparticles. Here, the chosen observable is the amplitude of the Rytov field of the numerically propagated complex field, in the image volume of thickness equal to the digital depth of field H. Each point and its associated statistic correspond to homogeneous samples of different nanoparticles , the nanoparticles of each sample having a fixed diameter and nature.
Ainsi, la présente la valeur de l’amplitude moyenne R de Rytov pour des échantillons de nanoparticules différentes (chaque échantillon est homogène en composition et en taille) en fonction de la profondeur de champ numérique H déterminée par la méthode de détermination du plateau P (voir ) précédemment décrite. Chaque point correspond à un échantillon différent, c’est-à-dire à un couple (diamètre moyen, matériaux) différent. Les échantillons suivants sont représentés :
- Polystyrène (PS) 60nm, PS 80nm, PS 100nm, PS 150 nm, PS 200nm,
- Or 60 nm, Or 100 nm
- Argent 100 nm et
- Diamant 80 nm. Thus, the presents the value of the average Rytov amplitude R for samples of different nanoparticles (each sample is homogeneous in composition and size) as a function of the digital depth of field H determined by the plateau determination method P (see ) previously described. Each point corresponds to a different sample, that is to say to a different pair (average diameter, materials). The following samples are represented:
- Polystyrene (PS) 60nm, PS 80nm, PS 100nm, PS 150 nm, PS 200nm,
- Gold 60 nm, Gold 100 nm
- 100 nm silver and
- Diamond 80nm.
On observe qu’il existe une relation entre la profondeur de champ numérique H et l’amplitude R des pics de Rytov, ou amplitude de Rytov. Cette relation peut être approximée par la ligne en pointillé du graphe. Ce graphe peut donc être utilisé comme abaque dans la mesure où, pour un système optique donné, fonctionnant dans un régime de CS et CT donné, il est possible de déterminer la profondeur de champ numérique H associée à une nanoparticule inconnue par une simple mesure de l’amplitude R de Rytov de cette nanoparticule. Ceci évite d’avoir à réaliser systématiquement le procédé de détermination de la profondeur de champ numérique H par propagation de l’image réelle, comptage des nanoparticules imagées et détermination du plateau P (voir ). Un tel abaque permet de déterminer une calibration de la profondeur de champ numérique d’un système optique fixé en fonction de l’amplitude de Rytov des objets imagés par ce système.It is observed that there is a relationship between the digital depth of field H and the amplitude R of the Rytov peaks, or Rytov amplitude. This relationship can be approximated by the dotted line in the graph. This graph can therefore be used as an abacus to the extent that, for a given optical system, operating in a given CS and CT regime, it is possible to determine the digital depth of field H associated with an unknown nanoparticle by a simple measurement of the Rytov R amplitude of this nanoparticle. This avoids having to systematically carry out the process of determining the digital depth of field H by propagation of the real image, counting of the imaged nanoparticles and determination of the plateau P (see ). Such a chart makes it possible to determine a calibration of the digital depth of field of an optical system fixed as a function of the Rytov amplitude of the objects imaged by this system.
Ainsi, grâce à l’approche de Rytov, la profondeur de champ numérique peut être déterminée directement par la mesure de l'amplitude de Rytov en se référant à un abaque, c’est-à-dire un graphique ou un tableau indiquant la correspondance entre l'amplitude R de Rytov et la profondeur de champ numérique H. L’amplitude de Rytov est donc une mesure de choix de la profondeur de champ numérique pour un type de nanoparticule dans un système optique en vue d’une mesure de concentration des nanoparticules.Thus, thanks to the Rytov approach, the digital depth of field can be determined directly by measuring the Rytov amplitude by referring to an abacus, that is to say a graph or table indicating the correspondence between the Rytov amplitude R and the digital depth of field H. The Rytov amplitude is therefore a measure of choice of the digital depth of field for a type of nanoparticle in an optical system with a view to measuring the concentration of nanoparticles.
Il en résulte que pour un système optique dont la correspondance entre l'amplitude R de Rytov et la profondeur de champ numérique H est connue par un abaque tel que précédemment décrit, on peut pour une seule nanoparticule imagée en intensité et en phase sur le détecteur connaître en formant l’image de l’amplitude de Rytov, et en cherchant un pic de signal dans l’image de Rytov, à la fois localiser la nanoparticule imagée et en déduire la profondeur de champ numérique associée à cette nanoparticule.It follows that for an optical system whose correspondence between the Rytov amplitude R and the digital depth of field H is known by an abacus as previously described, it is possible for a single nanoparticle imaged in intensity and phase on the detector know by forming the image of the Rytov amplitude, and by looking for a signal peak in the Rytov image, both locate the imaged nanoparticle and deduce the numerical depth of field associated with this nanoparticle.
Le champ de Rytov peut être remplacé par une autre combinaison des informations des parties réelles et imaginaires du champ d’onde ou, si une connaissance a priori sur la réponse des particules est connue, par uniquement la composante réelle ou la composante imaginaire. En d'autres termes, à la place du champ de Rytov, d'autres champs formés des informations des parties réelles et/ou imaginaires du champ d’onde, peuvent être utilisés.The Rytov field can be replaced by another combination of information from the real and imaginary parts of the wavefield or, if a priori knowledge about the particle response is known, by only the real component or the imaginary component. In other words, instead of the Rytov field, other fields formed from information from the real and/or imaginary parts of the wave field can be used.
Le système optique et la méthode de mesure proposés permettent donc d’obtenir une mesure de la concentration de n’importe quelles nanoparticules indépendamment de la nature physique des nanoparticules et de leur taille et sans avoir besoin de calibrer le système avec des échantillons de concentrations connues.The proposed optical system and measurement method therefore make it possible to obtain a measurement of the concentration of any nanoparticles independently of the physical nature of the nanoparticles and their size and without the need to calibrate the system with samples of known concentrations. .
En effet, déterminer la profondeur de champ numérique permet de délimiter le volume image dans lequel la reconstruction par propagation numérique à partir de l’image réelle est fidèle de la réalité de l’échantillon imagé. La propagation numérique est donc effectuée pour ce volume, les nanoparticules imagées sont comptées pour ce volume et la concentration des nanoparticules est calculée comme étant égale au nombre de nanoparticules comptées divisé par le volume. Ce volume est contrôlé et défini numériquement et n’est pas le résultat d’une hypothèse ou de calibration pour définir ce volume. Cette mesure de concentration est réalisée uniquement à partir du signal optique provenant de l’échantillon et ne nécessite pas de calibration préalable avec des échantillons de concentrations connues. Indeed, determining the digital depth of field makes it possible to delimit the image volume in which the reconstruction by digital propagation from the real image is faithful to the reality of the imaged sample. The digital propagation is therefore carried out for this volume, the imaged nanoparticles are counted for this volume and the concentration of the nanoparticles is calculated to be equal to the number of nanoparticles counted divided by the volume. This volume is controlled and defined digitally and is not the result of an assumption or calibration to define this volume. This concentration measurement is carried out solely from the optical signal coming from the sample and does not require prior calibration with samples of known concentrations.
La connaissance de la profondeur de champ numérique permet d’éviter de propager numériquement l’image réelle sur des épaisseurs de volume image trop importantes ce qui donne une meilleure mesure de la concentration (les artéfacts de propagation ne sont pas comptabilisés comme des nanoparticules imagées) tout en limitant le temps de calcul numérique de propagation.Knowing the digital depth of field makes it possible to avoid digitally propagating the real image over excessive image volume thicknesses, which gives a better measurement of the concentration (propagation artifacts are not counted as imaged nanoparticles) while limiting the digital propagation calculation time.
L’utilisation de l’abaque, caractéristique d’un système optique donné, permet de déterminer la profondeur de champ numérique à partir de la mesure de l’amplitude de Rytov d’une nanoparticule imagée dans l’image réelle. Ceci limite encore plus le temps de calcul dans la mesure où l’étape initiale de propagation, sur une épaisseur Dv croissante ( ) qui sert à déterminer la profondeur de champ numérique H, n’est pas nécessaire. Seule la propagation sur une épaisseur D inférieure ou égale à la profondeur H est effectuée pour permettre le comptage. The use of the chart, characteristic of a given optical system, makes it possible to determine the digital depth of field from the measurement of the Rytov amplitude of a nanoparticle imaged in the real image. This further limits the calculation time to the extent that the initial propagation step, over an increasing thickness Dv ( ) which is used to determine the digital depth of field H, is not necessary. Only propagation over a thickness D less than or equal to depth H is carried out to allow counting.
Pour des échantillons de nanoparticules hétérogènes (en composition et en taille) il est également possible de calculer la concentration de l’échantillon par les méthodes précédemment décrites. Dans un tel mélange les nanoparticules possèdent des profondeurs de champ numériques différentes. Il faut veillez à ce que les particules imagées du volume image qui contribuent au calcul de la concentration ne soient pas des artefacts de propagation numérique. Ceci est réalisé en vérifiant grâce à l’abaque, pour chacune des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement successives du volume image (d’épaisseur D), que l'amplitude R de la nanoparticule correspond à une profondeur de champ numérique H supérieure ou égale au double de la distance entre l’image propagée numériquement dans laquelle la nanoparticule est imagée et l’image réelle. Si cette condition est vérifiée la particule est conservée, si elle n’est pas vérifiée, la nanoparticule n’est pas retenue. Il faut également veillez dans le calcul de la concentration à considérer, pour chaque nanoparticule, le volume image dans lequel elle a été comptabilisée. Pour les nanoparticules retenues :
- si H<D alors ce volume a pour épaisseur H;
- si H≥D alors ce volume a pour épaisseur D.For heterogeneous nanoparticle samples (in composition and size) it is also possible to calculate the concentration of the sample by the methods previously described. In such a mixture the nanoparticles have different numerical depths of field. Care must be taken to ensure that the imaged particles of the image volume which contribute to the calculation of the concentration are not digital propagation artifacts. This is achieved by checking using the chart, for each of the nanoparticles imaged in the successive digitally propagated images of the image volume (of thickness D), that the amplitude R of the nanoparticle corresponds to a digital depth of field H greater than or equal to twice the distance between the digitally propagated image in which the nanoparticle is imaged and the real image. If this condition is verified, the particle is retained, if it is not verified, the nanoparticle is not retained. When calculating the concentration, you must also take care to consider, for each nanoparticle, the image volume in which it was counted. For the nanoparticles selected:
- if H<D then this volume has thickness H;
- if H≥D then this volume has thickness D.
La concentration finale est égale à la somme, sur les particules retenues, de l’inverse de ces volumes.The final concentration is equal to the sum, over the particles retained, of the reciprocal of these volumes.
Sous l’hypothèse que le grandissement latéral et axial est connu entre l’espace objet et l’espace image, la relation suivante donne la correspondance entre le volume objet V1 et le volume image V2 =V1.gx.gy.gz où gx=gy est le grandissement latéral du système optique entre le plan objet et le plan image et gz le grandissement axial au voisinage du plan du détecteur dans la direction z de l’axe optique du système optique utilisé pour la conjugaison, supposé de révolution.Under the hypothesis that the lateral and axial magnification is known between the object space and the image space, the following relation gives the correspondence between the object volume V1 and the image volume V2 =V1.gx.gy.gz where gx= gy is the lateral magnification of the optical system between the object plane and the image plane and gz the axial magnification in the vicinity of the plane of the detector in the z direction of the optical axis of the optical system used for the conjugation, assumed to be of revolution.
Pour calculer un volume objet à partir du volume image, on pourra utilement utiliser la surface du détecteur et le grandissement latéral et axial du système optique pour compléter les dimensions du volume image puis obtenir le volume objet. To calculate an object volume from the image volume, we can usefully use the surface of the detector and the lateral and axial magnification of the optical system to complete the dimensions of the image volume and then obtain the object volume.
La présente demande est susceptible d’application industrielle notamment dans le domaine de la mesure de concentration de nanoparticules. The present application is capable of industrial application, particularly in the field of measuring the concentration of nanoparticles.
Le dispositif et la méthode proposés sont particulièrement adaptés à la mesure de la concentration de nanoparticules en solution, soumises à un mouvement brownien, car la disponibilité de l’intensité et de la phase de façon auto-référencée au cours du temps (réalisation d’un film) permet d’envisager un suivi et une refocalisation des nanoparticules dans les images propagées en dehors du plan de l’image réelle au sens de la présente demande et d’obtenir un rapport signal sur bruit apte à mettre en œuvre l’enseignement de la présente demande, en moyennant les images propagées numériquement successives d’une même particule.The proposed device and method are particularly suitable for measuring the concentration of nanoparticles in solution, subjected to Brownian motion, because the availability of the intensity and the phase in a self-referenced manner over time (realization of a film) makes it possible to consider tracking and refocusing the nanoparticles in the images propagated outside the plane of the real image within the meaning of the present application and to obtain a signal-to-noise ratio capable of implementing the teaching of the present application, by means of successive digitally propagated images of the same particle.

Claims (10)

  1. Système optique comprenant un microscope admettant un axe optique, une source d'éclairage pour le microscope et un système d'imagerie de phase auto-référencé,
    dans lequel la source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet,
    dans lequel le microscope est configuré pour conjuguer un plan objet de l'espace objet avec un plan image, le système d'imagerie de phase auto-référencé étant disposé dans ou au voisinage du plan image, et
    dans lequel le système d'imagerie de phase auto-référencé est configuré pour produire une image réelle en intensité et en phase du plan objet,
    dans lequel la cohérence temporelle (CT) de la source d’éclairage est comprise entre 0,4% et 6% et la cohérence spatiale (CS) de la source d’éclairage, au niveau du système d’imagerie de phase auto-référencé, est comprise entre 0,4% et 10 %,
    le système optique comprenant, en outre, une unité de traitement configurée pour propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique.    Optical system comprising a microscope having an optical axis, an illumination source for the microscope and a self-referenced phase imaging system,
    in which the lighting source is configured to illuminate an object space,
    in which the microscope is configured to conjugate an object plane of the object space with an image plane, the self-referenced phase imaging system being disposed in or near the image plane, and
    in which the self-referenced phase imaging system is configured to produce a real image in intensity and phase of the object plane,
    in which the temporal coherence (CT) of the illumination source is between 0.4% and 6% and the spatial coherence (CS) of the illumination source, at the level of the self-referenced phase imaging system , is between 0.4% and 10%,
    the optical system further comprising a processing unit configured to digitally propagate the real image along the optical axis.
  2. Système optique selon la revendication 1, dans lequel la cohérence temporelle (CT) de la source d’éclairage est voisine de 2,2% et la cohérence spatiale (CS) de la source d’éclairage, au niveau du système d’imagerie de phase auto-référencé, est voisine de 2,5%. Optical system according to claim 1, in which the temporal coherence (CT) of the lighting source is close to 2.2% and the spatial coherence (CS) of the lighting source, at the level of the imaging system of self-referenced phase, is close to 2.5%.
  3. Système optique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la source d’éclairage est un laser blanc éclairant un filtre passe-bande. Optical system according to any one of claims 1 or 2, in which the lighting source is a white laser illuminating a band-pass filter.
  4. Système optique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la source d’éclairage est une source blanche à plasma éclairant un filtre passe-bande.Optical system according to any one of claims 1 or 2, in which the lighting source is a white plasma source illuminating a band-pass filter.
  5. Système optique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la source d’éclairage est une diode laser.Optical system according to any one of claims 1 or 2, in which the lighting source is a laser diode.
  6. Système optique selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet dans une solution de nanoparticules, et dans lequel l’unité de traitement est configurée pour:
    compter le nombre de nanoparticules imagées dans l'image réelle,
    propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique, dans un volume image d'épaisseur prédéterminée,
    compter le nombre des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement,
    calculer la taille du volume objet correspondant au volume image,
    calculer la concentration des nanoparticules sur la base du nombre (N) de nanoparticules imagées comptées et de la taille du volume objet.    Optical system according to any one of claims 1 to 5, in which the lighting source is configured to illuminate an object space in a solution of nanoparticles, and in which the processing unit is configured to:
    count the number of nanoparticles imaged in the real image,
    digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume of predetermined thickness,
    count the number of nanoparticles imaged in digitally propagated images,
    calculate the size of the object volume corresponding to the image volume,
    calculate the nanoparticle concentration based on the number (N) of imaged nanoparticles counted and the size of the object volume.
  7. Système optique selon la revendication 6, dans lequel l'unité de traitement est configurée pour:
    - compter le nombre de nanoparticules dans une image réelle d'une solution de nanoparticules, obtenue avec le système d'imagerie de phase auto-référencé;
    - propager numériquement l’image réelle dans des volumes image d'épaisseur variable (Dv) croissante;
    - compter le nombre des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement;
    - analyser la variation du nombre (N) de nanoparticules imagées comptées en fonction de l'épaisseur variable (Dv) du volume image et identifier une épaisseur limite du volume image pour laquelle le nombre (N) de nanoparticules imagées ne croit plus avec l'épaisseur variable (Dv) du volume image et atteint un plateau (P), et
    - déterminer une profondeur de champ numérique (H) en fonction de l'épaisseur limite identifiée; et
    dans lequel l'épaisseur prédéterminée est inférieure ou égale à la profondeur de champ numérique (H).    Optical system according to claim 6, in which the processing unit is configured to:
    - count the number of nanoparticles in a real image of a nanoparticle solution, obtained with the self-referenced phase imaging system;
    - digitally propagate the real image in image volumes of increasing variable thickness (Dv);
    - count the number of nanoparticles imaged in the digitally propagated images;
    - analyze the variation in the number (N) of imaged nanoparticles counted as a function of the variable thickness (Dv) of the image volume and identify a limiting thickness of the image volume for which the number (N) of imaged nanoparticles no longer increases with the variable thickness (Dv) of the image volume and reaches a plateau (P), and
    - determine a digital depth of field (H) according to the identified limiting thickness; And
    wherein the predetermined thickness is less than or equal to the digital depth of field (H).
  8. Système optique selon la revendication 6 ou 7 dans lequel le système comprend, en outre, une mémoire informatique dans laquelle est enregistré un abaque indiquant pour différents types de nanoparticule, la correspondance entre une profondeur de champ numérique (H) et l'amplitude, notée amplitude R, d’un champ formé des informations des parties réelles et/ou imaginaires du champ d’onde généré par une nanoparticule imagée.Optical system according to claim 6 or 7 in which the system further comprises a computer memory in which is recorded a chart indicating for different types of nanoparticle, the correspondence between a digital depth of field (H) and the amplitude, denoted amplitude R, of a field formed from information from the real and/or imaginary parts of the wavefield generated by an imaged nanoparticle.
  9. Système optique selon la revendication 8 dans lequel l'unité de traitement se réfère à l’abaque pour déterminer une profondeur de champ numérique (H) à partir de l’amplitude R d'une nanoparticule imagée dans l'image réelle, et
    dans lequel l'épaisseur prédéterminée est inférieure ou égale à la profondeur de champ numérique (H).    Optical system according to claim 8 in which the processing unit refers to the chart to determine a digital depth of field (H) from the amplitude R of a nanoparticle imaged in the real image, and
    wherein the predetermined thickness is less than or equal to the digital depth of field (H).
  10. Système optique selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant, en outre, une mémoire informatique dans laquelle est enregistré un abaque indiquant, pour différents types de nanoparticule, la correspondance entre une profondeur de champ numérique et l'amplitude, notée amplitude R, d’un champ formé des informations des parties réelles et/ou imaginaires du champ d’onde généré par une nanoparticule imagée,
    dans lequel la source d'éclairage est configurée pour éclairer un espace objet dans une solution comprenant un mélange de nanoparticules,
    dans lequel l'unité de traitement est configurée pour :
    compter les nanoparticules imagées dans l’image réelle, mesurer leur amplitude R et déterminer en se référant à l’abaque la profondeur de champ numérique associée à chacune de ces nanoparticules imagées;
    propager numériquement l’image réelle, le long de l'axe optique, dans un volume image, d'épaisseur prédéterminée, notée D;
    pour chacune des nanoparticules imagées dans les images propagées numériquement du volume image, vérifier en utilisant l’abaque, si l'amplitude R de la nanoparticule correspond à une profondeur de champ numérique, notée H, supérieure ou égale au double de la distance entre l’image propagée numériquement dans laquelle la nanoparticule est imagée, et l’image réelle, dans l'affirmative conserver la nanoparticule pour le comptage et dans la négative ne pas la retenir pour le comptage;
    pour chaque nanoparticule comptée, calculer un volume objet associé correspondant, si H≥D, au volume image d'épaisseur D ou, si H<D, à un volume image d'épaisseur égale à la profondeur de champ numérique H associée à la nanoparticule; et
    calculer la concentration des nanoparticules qui est égale à la somme, sur toutes les nanoparticules comptées, des inverses des volumes objet associés.    Optical system according to any one of claims 1 to 6, further comprising a computer memory in which is recorded a chart indicating, for different types of nanoparticle, the correspondence between a digital depth of field and the amplitude, denoted amplitude R, a field formed from information from the real and/or imaginary parts of the wavefield generated by an imaged nanoparticle,
    in which the lighting source is configured to illuminate an object space in a solution comprising a mixture of nanoparticles,
    in which the processing unit is configured to:
    count the nanoparticles imaged in the real image, measure their amplitude R and determine, with reference to the chart, the digital depth of field associated with each of these imaged nanoparticles;
    digitally propagate the real image, along the optical axis, in an image volume, of predetermined thickness, denoted D;
    for each of the nanoparticles imaged in the digitally propagated images of the image volume, check using the chart, if the amplitude R of the nanoparticle corresponds to a digital depth of field, denoted H, greater than or equal to twice the distance between the the digitally propagated image in which the nanoparticle is imaged, and the real image, if so retaining the nanoparticle for counting and if not not retaining it for counting;
    for each nanoparticle counted, calculate an associated object volume corresponding, if H≥D, to the image volume of thickness D or, if H<D, to an image volume of thickness equal to the digital depth of field H associated with the nanoparticle ; And
    calculate the concentration of the nanoparticles which is equal to the sum, over all the nanoparticles counted, of the reciprocals of the associated object volumes.
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