FR2827959A1 - DEVICE AND METHOD FOR MEASURING A SAMPLE BY CORRELATION SPECTROSCOPY - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation. The present invention relates to a device and a method for measuring a sample by correlation spectroscopy.
La spectroscopie par corrélation de fluorescence ("Fluorescence correlation spectroscopy"-FCS) consiste en l'observation de la fluorescence émise par un très petit volume d'un échantillon comprenant un milieu liquide dans lequel est placé un ensemble de particules à analyser. Ce volume est défini par l'interaction entre un faisceau lumineux d'excitation et l'échantillon et est connu sous le terme de"volume de collection". En moyenne, seulement un nombre très faible de particules fluorescentes se trouvent comprises dans ce volume de collection. Le nombre de particules varie d'ailleurs statistiquement autour de cette valeur moyenne soit par diffusion thermique dans le cas d'un liquide statique soit par déplacement collectif dans le cas d'un liquide en mouvement. Le nombre variable de particules fluorescentes dans le volume de collection se traduit par des variations de l'intensité de fluorescence avec le temps. Fluorescence correlation spectroscopy ("Fluorescence correlation spectroscopy" -FCS) consists in observing the fluorescence emitted by a very small volume of a sample comprising a liquid medium in which a set of particles to be analyzed is placed. This volume is defined by the interaction between an excitation light beam and the sample and is known as the "collection volume". On average, only a very small number of fluorescent particles are included in this collection volume. The number of particles also varies statistically around this average value either by thermal diffusion in the case of a static liquid or by collective displacement in the case of a moving liquid. The variable number of fluorescent particles in the collection volume results in variations in the fluorescence intensity over time.
Dans la spectroscopie FCS, un microscope confocal comprenant un système optique de focalisation reçoit un faisceau lumineux émis par un laser et le focalise sur un échantillon. Ce microscope comprend un sténopé placé dans un plan intermédiaire image de sorte que le microscope conjugue le plan de focalisation du faisceau d'excitation avec l'ouverture variable du sténopé. Ainsi le volume de collection est-il restreint à un très petit volume de l'échantillon. L'obtention de grandeurs physiques liées aux particules à analyser (coefficient de diffusion D de l'espèce d'intérêt relié au temps de diffusion 'Cd observé, concentration liée au nombre M de particules dans le volume de collection) nécessite un calibrage précis de ce volume de collection. Or, ce calibrage est réalisé par l'emploi de solutions de référence et fluctue dans le temps et d'une machine sur l'autre. In FCS spectroscopy, a confocal microscope comprising a focusing optical system receives a light beam emitted by a laser and focuses it on a sample. This microscope includes a pinhole camera placed in an intermediate image plane so that the microscope combines the focusing plane of the excitation beam with the variable aperture of the pinhole camera. Thus the volume of collection is limited to a very small volume of the sample. Obtaining physical quantities linked to the particles to be analyzed (diffusion coefficient D of the species of interest linked to the diffusion time 'Cd observed, concentration linked to the number M of particles in the collection volume) requires precise calibration of this collection volume. However, this calibration is carried out by the use of reference solutions and fluctuates over time and from one machine to another.
D'autre part, la collection de la luminescence est limitée par l'ouverture numérique du système optique de focalisation du On the other hand, the collection of luminescence is limited by the digital aperture of the optical focusing system of the
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microscope utilisé. Cette collection définie le signal mesuré par molécule et fixe le temps d'intégration (durée de la mesure) pour obtenir un signal exploitable. Le nombre de particules dans le volume de collection étant très faible, les temps d'acquisition des données sont très longs. microscope used. This collection defines the signal measured by molecule and fixes the integration time (duration of the measurement) to obtain an exploitable signal. The number of particles in the collection volume being very low, the data acquisition times are very long.
L'objectif de la présente invention est donc de proposer un dispositif optique et un procédé de mesure, simples dans leur conception et dans leur mode opératoire permettant la mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation en un temps court par augmentation significative du signal collecté par molécule d'une part et permettant, d'autre part, de résoudre le problème de la définition du volume de collection. The objective of the present invention is therefore to propose an optical device and a measurement method, simple in their design and in their operating mode allowing the measurement of a sample by correlation spectroscopy in a short time by significant increase in the collected signal. by molecule on the one hand and allowing, on the other hand, to solve the problem of the definition of the volume of collection.
A cet effet, l'invention concerne un dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation comprenant un microscope confocal comportant un système optique de focalisation dont le champ définit un volume de collection, des moyens aptes à produire un faisceau d'excitation et à le diriger sur l'échantillon au travers du microscope, des moyens de détection de l'intensité du flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon et collecté par le microscope, des moyens de traitement du signal produit par les moyens de détection. To this end, the invention relates to a device for measuring a sample by correlation spectroscopy comprising a confocal microscope comprising an optical focusing system whose field defines a collection volume, means capable of producing an excitation beam and directing it onto the sample through the microscope, means for detecting the intensity of the light flux produced by the interaction of the excitation beam on the sample and collected by the microscope, means for processing the signal produced by the detection means.
Selon l'invention, le dispositif comporte une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, placée au foyer du système optique de focalisation du microscope et formant des franges d'interférence dans le volume de collection. According to the invention, the device comprises a photonic structure increasing the collected luminous flux, placed at the focus of the optical focusing system of the microscope and forming interference fringes in the collection volume.
Dans différents modes de réalisation possibles, la présente invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles : - la structure photonique est un miroir diélectrique résistant à l'eau, - le miroir diélectrique comprend un empilement de couches en Ta20s et en Si02, In different possible embodiments, the present invention also relates to the characteristics which will emerge during the description which follows and which will have to be considered in isolation or in all their technically possible combinations: - the photonic structure is a dielectric mirror resistant to water, - the dielectric mirror comprises a stack of layers of Ta20s and Si02,
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- la structure photonique est un miroir métallique résistant à l'eau, - le miroir métallique est en aluminium, - le miroir métallique est en argent, - la structure photonique a un coefficient de réflexion r d'au moins 99% pour le faisceau d'excitation et le flux lumineux produit par l'interaction, - les moyens pour diriger ledit faisceau lumineux d'excitation comprennent un dispositif optique pour réfléchir le faisceau lumineux issu de la source de lumière vers le système optique de focalisation du microscope, ledit dispositif optique ayant un facteur de transmission 1 : maximal pour le flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon, - le dispositif optique pour réfléchir le faisceau lumineux issu de la source de lumière est un miroir dichroïque placé à 45 du faisceau incident, - la source de lumière est un laser. - the photonic structure is a water-resistant metallic mirror, - the metallic mirror is made of aluminum, - the metallic mirror is made of silver, - the photonic structure has a reflection coefficient r of at least 99% for the beam d excitation and the light flux produced by the interaction, the means for directing said excitation light beam comprise an optical device for reflecting the light beam coming from the light source towards the optical focusing system of the microscope, said optical device having a transmission factor 1: maximum for the light flux produced by the interaction of the excitation beam on the sample, - the optical device for reflecting the light beam coming from the light source is a dichroic mirror placed at 45 from incident beam, - the light source is a laser.
L'invention concerne également un procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation dans lequel un volume de collection est délimité par le champ d'un microscope confocale comportant un système optique de focalisation
Selon l'invention : - une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, est placée au foyer du système optique de focalisation du microscope pour former des franges d'interférence dans le volume de collection, - on mesure l'intensité du flux lumineux produite par l'échantillon au travers du microscope en fonction du temps, - on réalise une autocorrélation temporelle de cette intensité pour produire un signal de corrélation, - on extrait un premier et un deuxième temps caractéristique du signal de corrélation The invention also relates to a method of measuring a sample by correlation spectroscopy in which a collection volume is delimited by the field of a confocal microscope comprising an optical focusing system.
According to the invention: - a photonic structure increasing the collected luminous flux, is placed at the focus of the optical focusing system of the microscope to form interference fringes in the collection volume, - the intensity of the luminous flux produced by the sample through the microscope as a function of time, - a temporal autocorrelation of this intensity is produced to produce a correlation signal, - a first and a second characteristic time of the correlation signal are extracted
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* le premier temps dépendant du volume de mesure défini par le champ du microscope, 'le deuxième temps dépendant de l'interfrange des franges d'interférence, - on produit la mesure à partir du deuxième temps caractéristique. * the first time depending on the measurement volume defined by the field of the microscope, 'the second time depending on the inter-fringe of the interference fringes, - the measurement is produced from the second characteristic time.
L'invention sera décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de mesure d'un échantillon, selon l'invention ; - la figure 2 est une étude théorique démontrant l'existence d'un temps de diffusion associé à la présence de franges créées par une structure photonique : Fig. 2a) représente la courbe de diffusion théorique attendue de la
Cyanine 5 en l'absence de franges d'interférence et Fig.
2b) représente la fonction de corrélation g2 en fonction du temps, en présence de franges d'interférence ; - la figure 3 est un exemple de mise en oeuvre de l'invention à la diffusion en solution aqueuse de microsphères Crimson. Elle représente la fonction de corrélation g2 en fonction du temps obtenue expérimentalement dans deux cas distincts : en l'absence d'une structure photonique (absence de franges d'interférence) (Fig. 3a) et en présence d'une telle structure (présence de franges d'interférence) (Fig. 3b) ;
Le dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation, selon l'invention, comprend un microscope confocal 1. On entend par-échantillon 2-un milieu liquide, gazeux ou objet biologique contenant des particules 3 à analyser. Le microscope confocal 1 est un arrangement comprenant un microscope comportant un système optique de focalisation 4 et un sténopé 5 ayant une ouverture variable 6 placé dans un plan intermédiaire image de sorte que le microscope conjugue le plan de focalisation 7 d'un faisceau d'excitation 8 avec l'ouverture variable 6 du sténopé 5. Ainsi le The invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings in which: - Figure 1 is a schematic representation of a device for measuring a sample, according to the invention; FIG. 2 is a theoretical study demonstrating the existence of a diffusion time associated with the presence of fringes created by a photonic structure: FIG. 2a) represents the expected theoretical diffusion curve of the
Cyanine 5 in the absence of interference fringes and FIG.
2b) represents the correlation function g2 as a function of time, in the presence of interference fringes; - Figure 3 is an example of implementation of the invention in the diffusion in aqueous solution of Crimson microspheres. It represents the correlation function g2 as a function of time obtained experimentally in two distinct cases: in the absence of a photonic structure (absence of interference fringes) (Fig. 3a) and in the presence of such a structure (presence interference fringes) (Fig. 3b);
The device for measuring a sample by correlation spectroscopy, according to the invention, comprises a confocal microscope 1. The term “sample 2” means a liquid, gaseous medium or biological object containing particles 3 to be analyzed. The confocal microscope 1 is an arrangement comprising a microscope comprising a focusing optical system 4 and a pinhole 5 having a variable aperture 6 placed in an intermediate image plane so that the microscope conjugates the focusing plane 7 of an excitation beam 8 with the variable aperture 6 of the pinhole 5. Thus the
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volume de collection 9 crée par l'interaction entre le faisceau d'excitation 8 et l'échantillon 2 est-il restreint à un très petit volume de l'échantillon 2. Ce volume de collection 9 est placé dans le plan de focalisation 7 du système optique de focalisation 4. Dans un mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est un objectif. Dans un autre mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est une lentille. collection volume 9 created by the interaction between the excitation beam 8 and the sample 2 is it restricted to a very small volume of the sample 2. This collection volume 9 is placed in the focusing plane 7 of the focusing optical system 4. In one embodiment, the focusing optical system 4 is a lens. In another embodiment, the focusing optical system 4 is a lens.
Le faisceau d'excitation 8 est émis par une source de lumière 10. Cette source 10 est avantageusement un laser. Dans un mode de réalisation préféré, cette source 10 est un laser HeNe opérant à une longueur d'onde À = 633nm. Le dispositif comprend également des moyens 11 aptes à diriger le faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2 au travers du microscope. Ces moyens 11 pour diriger ledit faisceau lumineux d'excitation 8 comprennent des lentilles et un dispositif optique 12 pour réfléchir le faisceau lumineux 8 issu de la source de lumière 10 vers le système optique de focalisation 4 du microscope. Dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope, l'interaction du faisceau d'excitation 8 avec l'échantillon 2 crée un volume de collection 9. Chaque particule 3 d'intérêt qui diffuse dans le volume de collection 9 émet par fluorescence un flux lumineux 13. Le système optique de focalisation 4 du microscope permet également de collecter le flux lumineux 13 résultant de l'interaction du faisceau d'excitation 8 avec l'échantillon 2. Ce flux lumineux 13 est envoyé vers des moyens de détection 14 au travers du microscope. Le dispositif optique 12 a, dans un mode de réalisation préféré, un facteur de transmission T maximal pour le flux lumineux 13 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2. Le dispositif optique 12 est avantageusement un miroir dichroïque et passe-bande placé à 45 du faisceau incident. Dans un mode de réalisation, la largeur de bande est centrée sur une longueur d'onde Ài de façon à transmettre le flux lumineux 13 produit par l'interaction du The excitation beam 8 is emitted by a light source 10. This source 10 is advantageously a laser. In a preferred embodiment, this source 10 is a HeNe laser operating at a wavelength λ = 633nm. The device also includes means 11 capable of directing the excitation beam 8 on the sample 2 through the microscope. These means 11 for directing said excitation light beam 8 comprise lenses and an optical device 12 for reflecting the light beam 8 coming from the light source 10 towards the focusing optical system 4 of the microscope. In the focal plane 7 of the focusing optical system 4 of the microscope, the interaction of the excitation beam 8 with the sample 2 creates a collection volume 9. Each particle 3 of interest which diffuses into the collection volume 9 emits by fluorescence a light flux 13. The focusing optical system 4 of the microscope also makes it possible to collect the light flux 13 resulting from the interaction of the excitation beam 8 with the sample 2. This light flux 13 is sent to means of detection 14 through the microscope. The optical device 12 has, in a preferred embodiment, a maximum transmission factor T for the light flux 13 produced by the interaction of the excitation beam 8 on the sample 2. The optical device 12 is advantageously a dichroic mirror and bandpass placed at 45 from the incident beam. In one embodiment, the bandwidth is centered on a wavelength λ i so as to transmit the light flux 13 produced by the interaction of the
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faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2 mais à bloquer le flux lumineux d'excitation 8. excitation beam 8 on the sample 2 but to block the excitation light flux 8.
Les moyens de détection 14 de l'intensité du flux lumineux 13 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2 et collecté par le microscope comprennent dans un mode de réalisation des photodétecteurs. Ces photodétecteurs sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanche. Le signal issu des moyens de détection 14 est envoyé vers des moyens de traitement 15 du signal. Ces moyens 15 comportent avantageusement un compteur et un correlateur 16 qui permet de traiter numériquement les données reçues. The means 14 for detecting the intensity of the light flux 13 produced by the interaction of the excitation beam 8 on the sample 2 and collected by the microscope include in one embodiment photodetectors. These photodetectors are advantageously photodiodes operating in an avalanche regime. The signal from the detection means 14 is sent to signal processing means 15. These means 15 advantageously include a counter and a correlator 16 which makes it possible to digitally process the data received.
Le dispositif comprend également des moyens de positionnement 17 précis dudit échantillon 2. Dans un mode de réalisation, ces moyens de positionnement 17 comportent un ensemble de platines de translation (x, y, z) permettant de déplacer l'échantillon 2 par rapport au plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope. The device also comprises precise positioning means 17 for said sample 2. In one embodiment, these positioning means 17 comprise a set of translation plates (x, y, z) making it possible to move the sample 2 relative to the plane focal 7 of the focusing optical system 4 of the microscope.
L'échantillon 2 est enfermé dans une boîte étanche 18 dont les parois latérales 19-22 sont formées par des cales autocollantes d'épaisseur d résistantes à l'eau. L'épaisseur d de ces cales est comprise entre 50 et 100 ; j. m. Le sommet de ladite boite 18 comporte avantageusement une lamelle de microscope 23 d'épaisseur d et d'indice optique no. L'épaisseur d de la lamelle 23 est comprise entre 100 et 200 Il m. Le fond de la boîte 18 est réalisé par une structure photonique 24. Dans un mode de réalisation préféré, cette structure photonique 24 a un coefficient de réflexion r d'au moins 99% pour le faisceau d'excitation 8 et le flux lumineux 13 produit par l'interaction. The sample 2 is enclosed in a sealed box 18 whose side walls 19-22 are formed by self-adhesive shims of thickness d resistant to water. The thickness d of these shims is between 50 and 100; j. m. The top of said box 18 advantageously comprises a microscope slide 23 of thickness d and of optical index no. The thickness d of the strip 23 is between 100 and 200 μm. The bottom of the box 18 is produced by a photonic structure 24. In a preferred embodiment, this photonic structure 24 has a reflection coefficient r of at least 99% for the excitation beam 8 and the light flux 13 produced through interaction.
Elle est placée avantageusement au plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope par déplacement de la boite étanche 18 grâce aux moyens de positionnement de précision 17. Des franges d'interférence 25 sont alors créées dans le volume de collection 9. Les particules d'intérêt 3 voyageant dans ces franges d'interférences 25 vont donc émettre It is advantageously placed at the focal plane 7 of the optical focusing system 4 of the microscope by displacement of the sealed box 18 thanks to the precision positioning means 17. Interference fringes 25 are then created in the collection volume 9. The particles of interest 3 traveling in these interference fringes 25 will therefore emit
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un flux lumineux 13 dont la durée dépend de l'interfrange. Le dispositif de mesure permet de définir très précisément ce volume de collection qui est directement relié à l'interfrange de la figure d'interférence créée et vaut (,/2n) où A est la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation 8 et n indice du milieu. Ceci conduit à l'apparition d'un temps de diffusion dans la correlation temporelle des particules d'intérêts 3 dans le volume de collection 9 ne dépendant que de la longueur d'onde A du faisceau d'excitation 8 utilisé et du coefficient de diffusion des particules 3. D'autre part, la structure photonique 24 permet d'exalter le flux lumineux 13 produit par l'interaction dans l'ouverture numérique du système optique de focalisation 4. On augmente ainsi d'un facteur supérieur à deux le flux lumineux 13 collecté par particule 3. L'exaltation du flux lumineux 13 correspond à une augmentation du flux collectée provenant de la source. a luminous flux 13 whose duration depends on the interfringe. The measuring device makes it possible to very precisely define this collection volume which is directly connected to the interfringe of the interference figure created and is equal to (, / 2n) where A is the wavelength of the excitation light beam 8 and n middle index. This leads to the appearance of a diffusion time in the temporal correlation of the particles of interest 3 in the collection volume 9 depending only on the wavelength A of the excitation beam 8 used and the diffusion coefficient particles 3. On the other hand, the photonic structure 24 makes it possible to enhance the light flux 13 produced by the interaction in the digital aperture of the focusing optical system 4. The flux is thus increased by a factor of more than two luminous 13 collected by particle 3. The enhancement of the luminous flux 13 corresponds to an increase in the collected flux originating from the source.
Dans un premier mode de réalisation, la structure photonique 24 est un miroir diélectrique résistant à l'eau. In a first embodiment, the photonic structure 24 is a water-resistant dielectric mirror.
Avantageusement, le miroir 24 est constitué d'un empilement de 16 couches de type (HB) B où H désigne une couche de Tas d'épaisseur optique Ao/4 et B une couche de Si02 d'épaisseur optique Ao/4. Le miroir 24 est constitué dans d'autres modes de réalisation et à titre d'exemples, à partir d'un empilement de couches prises parmi les couples suivants : TiOz/SiOz, Hf02/Si02. o est une longueur d'onde de contrôle utilisée lors de la fabrication du miroir diélectrique. AO est ajustée pour que la structure photonique 24 soit réfléchissante pour le faisceau d'excitation 8 et pour le flux lumineux 13 produit par l'interaction. Advantageously, the mirror 24 consists of a stack of 16 layers of type (HB) B where H denotes a heap layer of optical thickness Ao / 4 and B a layer of SiO 2 of optical thickness Ao / 4. The mirror 24 is constituted in other embodiments and by way of examples, from a stack of layers taken from the following pairs: TiOz / SiOz, Hf02 / Si02. o is a control wavelength used during the manufacture of the dielectric mirror. AO is adjusted so that the photonic structure 24 is reflective for the excitation beam 8 and for the light flux 13 produced by the interaction.
Dans un deuxième mode de réalisation, la structure photonique 24 est un miroir métallique résistant à l'eau. Le miroir est réalisé, à titre d'exemples, dans un matériau pris parmi l'aluminium (Al), l'argent (Ag) et le tungstène (W). In a second embodiment, the photonic structure 24 is a water-resistant metal mirror. The mirror is produced, by way of example, from a material chosen from aluminum (Al), silver (Ag) and tungsten (W).
L'invention ne saurait être limitée à la description qui précède et est susceptible de modifications avec l'évolution des The invention cannot be limited to the above description and is subject to modification with the development of
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technologies. Des substitutions et/ou des modifications dans la structure générale et dans les détails du présent dispositif peuvent être réalisées par un homme du métier sans s'écarter de l'esprit de la présente invention. Ainsi les particules 3 à analyser ne sont pas forcement luminescentes mais présentent dans d'autres modes de réalisation un pouvoir réfléchissant pour le flux lumineux d'excitation 8 (cas de la granulométrie). technologies. Substitutions and / or modifications in the general structure and in the details of the present device can be made by a person skilled in the art without departing from the spirit of the present invention. Thus the particles 3 to be analyzed are not necessarily luminescent but in other embodiments have a reflecting power for the excitation light flux 8 (case of particle size).
L'invention concerne également un procédé de mesure d'un échantillon 2 par spectroscopie par corrélation dans lequel un volume de collection 9 est délimité par le champ d'un microscope confocal 1 comportant un système optique de focalisation 4. Dans un mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est une lentille. Dans un mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est un objectif. On place une structure photonique 24 augmentant le flux lumineux 13 collecté, au foyer du système optique de focalisation 4 d'un microscope pour former des franges d'interférence 25 dans le volume de collection 9. Chaque particule d'intérêt 3 qui diffuse dans le volume de collection 9 éclairé émet un flux lumineux 13 suite à son interaction avec le flux lumineux d'excitation 8. La durée de ce flux lumineux 13 indique le temps passé par la particule 3 dans le volume de collection 9. On mesure l'intensité du flux lumineux 13 produite par l'échantillon 2 au travers du microscope en fonction du temps au moyen de photodétecteurs 14. Ces photodétecteurs 14 sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanches. The invention also relates to a method for measuring a sample 2 by correlation spectroscopy in which a collection volume 9 is delimited by the field of a confocal microscope 1 comprising an optical focusing system 4. In one embodiment, the focusing optical system 4 is a lens. In one embodiment, the focusing optical system 4 is a lens. A photonic structure 24 is placed, increasing the luminous flux 13 collected, at the focal point of the focusing optical system 4 of a microscope to form interference fringes 25 in the collection volume 9. Each particle of interest 3 which diffuses in the illuminated collection volume 9 emits a luminous flux 13 following its interaction with the excitation luminous flux 8. The duration of this luminous flux 13 indicates the time spent by the particle 3 in the collection volume 9. The intensity is measured of the light flux 13 produced by the sample 2 through the microscope as a function of time by means of photodetectors 14. These photodetectors 14 are advantageously photodiodes operating in avalanche regime.
Comme la diffusion des particules 3 est un processus aléatoire, les événements de diffusion doivent être moyennes pour fournir une information statistiquement fiable. C'est le rôle du corrélateur 16 qui construit la fonction de corrélation à partir de l'intensité I (t). Cette dernière s'écrit :
As the scattering of particles 3 is a random process, the scattering events must be average to provide statistically reliable information. It is the role of the correlator 16 which constructs the correlation function from the intensity I (t). The latter is written:
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On a donc réalisé une autocorrélation temporelle de cette intensité I (t) pour produire un signal de corrélation. On extrait ensuite un premier et un deuxième temps caractéristique du signal de corrélation . le premier temps dépendant du volume de mesure défini par le champ du microscope, * le deuxième temps dépendant de l'interfrange des franges d'interférence, On produit enfin la mesure à partir du deuxième temps caractéristique. A time autocorrelation of this intensity I (t) was therefore carried out to produce a correlation signal. A first and a second characteristic time of the correlation signal are then extracted. the first time depending on the measurement volume defined by the microscope field, * the second time depending on the interfringe of the interference fringes, Finally, the measurement is produced from the second characteristic time.
Dans le cas d'un volume de collection confocal 9 sans structure photonique 24, la fonction de corrélation permet de déterminer le temps de diffusion'Cd de l'espèce d'intérêt 3 et le nombre M de particules 3 dans le volume de collection 9. Si l'on connaît les caractéristiques géométriques du volume de collection 9, on peut alors déterminer le coefficient de diffusion translationnel D et le nombre de molécules M. Le coefficient de diffusion est un paramètre permettant de distinguer les différentes espèces 3 émettant un flux lumineux 13 en solution (ligands libres ou liés par exemple). Dans le cas d'un volume de collection 9 gaussien allongé dans la direction parallèle à l'axe optique, on peut montrer que T : d=w/4D où Wi désigne l'extension transverse (waist) du faisceau d'excitation 8 dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4. In the case of a confocal collection volume 9 without photonic structure 24, the correlation function makes it possible to determine the diffusion time'Cd of the species of interest 3 and the number M of particles 3 in the collection volume 9 If we know the geometrical characteristics of the collection volume 9, we can then determine the translational diffusion coefficient D and the number of molecules M. The diffusion coefficient is a parameter making it possible to distinguish the different species 3 emitting a light flux 13 in solution (free or bound ligands for example). In the case of a Gaussian collection volume 9 elongated in the direction parallel to the optical axis, it can be shown that T: d = w / 4D where Wi denotes the transverse extension (waist) of the excitation beam 8 in the focal plane 7 of the optical focusing system 4.
Une approche théorique a été développée pour démontrer l'existence d'un temps de diffusion Tf associée à la diffusion dans les franges 25, lesdites franges 25 étant produites par un microscope confocal 1 comportant une structure photonique 24. A theoretical approach has been developed to demonstrate the existence of a diffusion time Tf associated with the diffusion in the fringes 25, said fringes 25 being produced by a confocal microscope 1 comprising a photonic structure 24.
Considérons en premier lieu que le volume de collection 9 est gaussien d'extension spatiale du type
Let us first consider that the volume of collection 9 is Gaussian with spatial extension of the type
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où Wt (respectivement Wi) désigne le waist transverse (respectivement longitudinal). where Wt (respectively Wi) denotes the transverse waist (respectively longitudinal).
Dans le cas d'une diffusion brownienne sans structure photonique, la fonction de corrélation s'écrit
où M désigne le nombre moyen de particules 3 dans le volume de collection 9 et te le temps de diffusion transverse (Td = Wt2/4D). La figure 2a) montre la courbe théorique attendue pour la diffusion de la Cyanine 5 (avec wt= 0,6 um, Wl = 6 m et M=1). L'axe des abscisses 26 représente l'axe des temps (s) et l'axe des ordonnées 27 représente la fonction de corrélation g2. In the case of a Brownian scattering without photonic structure, the correlation function is written
where M denotes the average number of particles 3 in the collection volume 9 and te the transverse diffusion time (Td = Wt2 / 4D). Figure 2a) shows the theoretical curve expected for the diffusion of Cyanine 5 (with wt = 0.6 µm, W1 = 6 m and M = 1). The abscissa axis 26 represents the time axis (s) and the ordinate axis 27 represents the correlation function g2.
Plaçons à présent dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope une structure photonique 24. Now put in the focal plane 7 of the focusing optical system 4 of the microscope a photonic structure 24.
Ladite structure 24 réfléchit le faisceau lumineux d'excitation 8 et produit des franges d'interférences 25 d'interfrange À/ (2n) (À longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation 8 et n l'indice du milieu), qui modulent longitudinalement la répartition d'intensité du volume de collection 9 confocal
Said structure 24 reflects the excitation light beam 8 and produces interfringe interference fringes 25 A / (2n) (At wavelength of the excitation light beam 8 and n the index of the medium), which longitudinally modulate the intensity distribution of the collection volume 9 confocal
Nous avons déterminé numériquement la fonction de corrélation résultant d'une telle modulation. La courbe numérique obtenue peut être ajustée à l'aide de la fonction :
We have numerically determined the correlation function resulting from such modulation. The resulting digital curve can be adjusted using the function:
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Cette expression fait clairement apparaître un temps de diffusion 11 associé à la diffusion dans les franges 25 (Figure 2b)). On montre que :
This expression clearly shows a diffusion time 11 associated with the diffusion in the fringes 25 (FIG. 2b)). We show that:
Le procédé de mesure selon l'invention a fait l'objet de plusieurs mises en oeuvre présentées dans les exemples suivants et faisant ressortir la qualité des résultats obtenus. The measurement method according to the invention has been the subject of several implementations presented in the following examples and showing the quality of the results obtained.
EXEMPLE 1
Le procédé a été mis en oeuvre afin d'étudier par FCS la diffusion en solution aqueuse de microsphères fluorescentes de 100 nm de rayon (Crimson Molecular Probes FluoSpheres). Une source laser 10 He-Ne a été utilisée pour obtenir la fluorescence des microsphères Crimson (longueurs d'onde d'excitation/émission = 625/645 u, m). La figure 3 montre les fonctions de corrélation obtenues en l'absence (3a)) et en présence d'une structure photonique 24 (3b)). Les courbes ont été ajustées (traits noirs pleins 28) afin d'en déduire le temps de diffusion 11. Ces ajustements ont été réalisés à l'aide des fonctions (1) et (2). L'axe des abscisses 26 représente l'axe des temps (, us) et l'axe des ordonnées 27 représente la fonction de corrélation g2. En l'absence de la structure photonique 24 (ou en sa présence si le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 est"loin"de ladite structure 24-quelques dizaines de p, m) le temps de diffusion 11 vaut 2,6 ms (à 0.1 ms près). En présence d'une structure photonique 24 et si le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 est confondu avec la surface de ladite structure photonique 24, un second temps de diffusion 11 apparaît : 11 vaut 57 s (à 5 ilS près). Nous pouvons déduire de 11 le coefficient de diffusion des microsphères dans l'eau (n=1. 33) : EXAMPLE 1
The method was implemented in order to study by FCS the diffusion in aqueous solution of fluorescent microspheres of 100 nm radius (Crimson Molecular Probes FluoSpheres). A 10 He-Ne laser source was used to obtain the fluorescence of the Crimson microspheres (excitation / emission wavelengths = 625/645 u, m). FIG. 3 shows the correlation functions obtained in the absence (3a)) and in the presence of a photonic structure 24 (3b)). The curves were adjusted (solid black lines 28) in order to deduce the diffusion time 11. These adjustments were made using the functions (1) and (2). The abscissa axis 26 represents the time axis (, us) and the ordinate axis 27 represents the correlation function g2. In the absence of the photonic structure 24 (or in its presence if the focal plane 7 of the optical focusing system 4 is "far" from said structure 24-a few tens of p, m) the diffusion time 11 is 2.6 ms (to the nearest 0.1 ms). In the presence of a photonic structure 24 and if the focal plane 7 of the optical focusing system 4 is coincident with the surface of said photonic structure 24, a second diffusion time 11 appears: 11 is 57 s (to within 5 ilS). We can deduce from 11 the diffusion coefficient of microspheres in water (n = 1.33):
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Ce résultat est en excellent accord avec la valeur donnée par la formule de Stokes, qui relie le coefficient de diffusion d'une sphère de rayon R à la viscosité du milieu et à l'énergie thermique :
This result is in excellent agreement with the value given by Stokes' formula, which relates the diffusion coefficient of a sphere of radius R to the viscosity of the medium and to thermal energy:
En outre les temps de diffusion Td et Tf sont dans le rapport attendu :
EXEMPLE 2
Cette seconde expérience démontre qu'il est possible d'utiliser une structure photonique pour étudier finement la diffusion de protéines. Une série d'expériences a été conduite sur la streptavidine marquée par la cyanine 5. Les résultats marquants sont les suivants. In addition, the diffusion times Td and Tf are in the expected report:
EXAMPLE 2
This second experiment demonstrates that it is possible to use a photonic structure to study finely the diffusion of proteins. A series of experiments was carried out on streptavidin labeled with cyanine 5. The striking results are as follows.
Détection exaltée - Le taux de comptage est augmenté par un facteur 3 : pour une puissance au point focal de 1 Mwatt/cm2, le taux de comptage par molécule passe de 2,3 kHz en l'absence de la structure photonique à 6,8 kHz en sa présence. Cette augmentation de signal permet une construction plus rapide de la fonction de corrélation (gain de temps dans l'analyse). Exalted detection - The counting rate is increased by a factor of 3: for a power at the focal point of 1 Mwatt / cm2, the counting rate per molecule goes from 2.3 kHz in the absence of the photonic structure to 6.8 kHz in its presence. This signal increase allows a faster construction of the correlation function (saving time in the analysis).
Analyse de la diffusion Diffusion analysis
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- En l'absence de la structure photonique 24 la fonction de corrélation présente deux temps caractéristiques : un est associé à la diffusion de la streptavidine dans le volume confocal (#d=5700 s), le second est lié aux propriétés photophysiques intrinsèques de la Cyanine 5 (état triplet et isomérisation 1d =
18 plus). - In the absence of the photonic structure 24 the correlation function has two characteristic times: one is associated with the diffusion of streptavidin in the confocal volume (# d = 5700 s), the second is linked to the intrinsic photophysical properties of the Cyanine 5 (triplet state and 1d isomerization =
18 more).
- En présence de la structure photonique 24, la fonction de corrélation montre un troisième temps-cf (-cf = 135 iis) associé aux franges d'interférences 25, qui peut être déterminé avec précision dès lors que le temps triplet est caractérisé. A nouveau, ces résultats présentent un bon accord avec la théorie :
- In the presence of the photonic structure 24, the correlation function shows a third time-cf (-cf = 135 iis) associated with the interference fringes 25, which can be determined with precision as soon as the triplet time is characterized. Again, these results are in good agreement with the theory:
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Legal Events
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ST | Notification of lapse |