WO2024135794A1 - 抗ヒトｃｘ３ｃｒ１抗体 - Google Patents

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WO2024135794A1
WO2024135794A1 PCT/JP2023/046028 JP2023046028W WO2024135794A1 WO 2024135794 A1 WO2024135794 A1 WO 2024135794A1 JP 2023046028 W JP2023046028 W JP 2023046028W WO 2024135794 A1 WO2024135794 A1 WO 2024135794A1
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WO
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antibody
amino acid
disease
acid sequence
cells
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PCT/JP2023/046028
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English (en)
French (fr)
Inventor
裕 佐藤
耕太郎 山本
亜希 武居
いづみ 坂口
隆 山村
伸司 大木
ベンジャミン ジョセフ エドワード レイバニー
Original Assignee
株式会社カイオム・バイオサイエンス
国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody or a fragment thereof against human CX3CR1, and uses thereof.
  • CX3CR1 is a G protein-coupled receptor that is a chemokine receptor. It is expressed on cytotoxic lymphocytes such as NK cells and cytotoxic T cells, and on immune cells such as mature macrophages and mucosal dendritic cells that are deeply involved in the elimination of pathogens and abnormal cells. Its specific ligand, CX3CL1 (fractalkine (FKN)), is known to be induced by treatment of vascular endothelial cells with the inflammatory cytokines TNF and IL-1, and is expressed on the surface of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in lesions, where it mediates leukocyte adhesion. FKN is also released into the circulatory system by proteolytic cleavage and functions as a chemotactic agent.
  • CX3CL1 fractalkine (FKN)
  • FKN is induced in vascular endothelial cells during inflammation
  • CX3CR1 is present in many types of leukocytes
  • FKN and CX3CR1 are strongly suggested to be involved in the pathogenesis and progression of inflammatory diseases.
  • FKN and CX3CR1 are involved in the onset and pathology of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, lupus nephritis, and multiple sclerosis (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 cardiovascular disease
  • Non-Patent Document 3 coronary artery disease (angiographic evidence of stenosis)
  • Non-Patent Document 4 carotid artery occlusive disease
  • Patent Document 1 anti-FKN antibodies
  • Patent Document 2 antibody-like substances
  • anti-CX3CR1 antibodies may be effective in treating multiple sclerosis (Patent Document 3).
  • One object of the present invention is to provide a preventive agent, a progression inhibitor, a therapeutic agent, etc. for diseases involving immune cells expressing human CX3CR1 by binding to human CX3CR1, for example, a preventive agent, a progression inhibitor, a therapeutic agent, etc. for progressive immune demyelinating diseases (preferably progressive immune demyelinating diseases of the central nervous system, for example, secondary progressive multiple sclerosis (SPMS)).
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • the present invention has been made in consideration of the above circumstances, and provides the following anti-CX3CR1 antibodies and antibody fragments thereof, as well as uses thereof (pharmaceutical compositions, etc.).
  • CDR-H1 complementarity determining regions
  • CDR2 CDR-H2
  • CDR3 CDR-H3
  • the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDR) 1 (CDR-H1), CDR2 (CDR-H2) and CDR3 (CDR-H3) of the heavy chain variable region (VH) are as follows, in order:
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4
  • amino acid sequences of CDR1 (CDR-L1), CDR2 (CDR-L2), and CDR3 (CDR-L3) of the light chain variable region (VL) are represented by the following sequence, respectively: The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 7 and 8, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 7 and 8, The antibody.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region (VH) consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 11, 12, 13, or 14, and
  • the amino acid sequence of the light chain variable region (VL) consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 9, or 15. The antibody.
  • amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and The amino acid sequence of VL consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5.
  • amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; and The amino acid sequence of VL consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9.
  • amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; and The amino acid sequence of VL consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; and The amino acid sequence of VL consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13; and
  • the amino acid sequence of the VL consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; or
  • the amino acid sequence of the VH consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and
  • the amino acid sequence of VL consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the antibody according to any one of [1] to [4] above which is a humanized antibody.
  • the antibody according to any one of [1] to [4] above which has an activity of inhibiting or suppressing the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine).
  • the antibody according to any one of [1] to [4] above which has an activity of inhibiting or suppressing the function of Th cells (helper T cells) expressing Eomes.
  • the present invention also encompasses the antibody according to any one of the above items [1] to [4], which has activity to inhibit or suppress the function of Th cells expressing granzyme B (GZMB), or Th cells expressing Eomes and granzyme B.
  • GZMB granzyme B
  • the antibody described in [7] above which has the activity of inhibiting or suppressing the infiltration of Eomes-expressing Th cells into the CNS (central nervous system).
  • the present invention also encompasses the antibody described in any one of [1] to [4] above, which has activity to inhibit or suppress infiltration of Th cells expressing granzyme B, or Th cells expressing Eomes and granzyme B, into the CNS.
  • the antibody according to any one of [1] to [4] above which has the function of ameliorating or suppressing the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) pathology.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • the antibody according to any one of [1] to [4] above which is used for the prevention, inhibition of progression, or treatment of a progressive immune demyelinating disease, preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system; an autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, or autoimmune myositis; a heart disease including atherosclerosis; chronic kidney disease; diabetic heart disease; diabetic kidney disease; interstitial lung disease; cancer, preferably breast cancer, prostate cancer, or colorectal cancer; a COVID-19-related central nervous system disease; or a neurodegenerative disease, preferably ALS, Alzheimer's disease
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of [1] to [4] above, or the antibody fragment according to [12] above.
  • a progressive immune demyelinating disease preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system
  • an autoimmune disease preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • the present invention also encompasses the pharmaceutical composition described in [13] above, which is used for inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing granzyme B, or Th cells expressing Eomes and granzyme B.
  • the pharmaceutical composition according to [17] above which is used for inhibiting or suppressing the infiltration of Eomes-expressing Th cells into the CNS.
  • the present invention also encompasses the pharmaceutical composition described in [13] above, which is used to inhibit or suppress the infiltration of Th cells expressing granzyme B, or Th cells expressing Eomes and granzyme B, into the CNS.
  • a method for preventing, inhibiting the progression of, or treating a progressive immune demyelinating disease preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system; an autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, or autoimmune myositis; a heart disease including atherosclerosis; chronic kidney disease; diabetic heart disease; diabetic kidney disease; interstitial lung disease; cancer, preferably breast cancer, prostate cancer, or colorectal cancer; a COVID-19-related central nervous disease; or a neurodegenerative disease, preferably ALS, Alzheimer's disease, or multiple system atrophy, comprising administering the pharmaceutical composition described in [13] above to a subject.
  • a progressive immune demyelinating disease preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system
  • an autoimmune disease preferably rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease,
  • the method according to [20] above, wherein the progressive immune demyelinating disease is secondary progressive multiple sclerosis (SPMS).
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • a method for inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing Eomes comprising administering the pharmaceutical composition according to [13] above to a subject.
  • the present invention also encompasses a method for inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing granzyme B, or Th cells expressing Eomes and granzyme B, comprising administering the pharmaceutical composition described in [13] above to a subject.
  • the method according to [23] above which is a method for inhibiting or suppressing infiltration of Eomes-expressing Th cells into the CNS, comprising administering the pharmaceutical composition according to [13] above to a subject.
  • the present invention also encompasses a method for inhibiting or suppressing the infiltration of Th cells expressing granzyme B, or Th cells expressing Eomes and granzyme B, into the CNS, which comprises administering the pharmaceutical composition described in [13] above to a subject.
  • a method for ameliorating or suppressing the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) pathology comprising administering the pharmaceutical composition described in [13] above to a subject.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • the present invention can provide an antibody or the like that binds to human CX3CR1.
  • the anti-human CX3CR1 antibody of the present invention can have, for example, activity to inhibit or suppress the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), or a function to improve or suppress the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) pathology. It can also be effective as a preventive agent, progression suppressant, or therapeutic agent for progressive immune demyelinating diseases (preferably progressive immune demyelinating diseases of the central nervous system, such as secondary progressive multiple sclerosis (SPMS)).
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • FIG. 1 shows the results of measuring the binding activity of m1F8 antibody to human CX3CR1-expressing Ba/F3 cells by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the inhibitory activity of m1F8 antibody against fractalkine-dependent cell migration of human CX3CR1-expressing Ba/F3 cells.
  • FIG. 1 shows the sequences of the heavy and light chain variable regions of m1F8-1 and m1F8-2 antibodies, which are modified versions of the m1F8 antibody, in which the underlined regions represent the CDR sequences.
  • FIG. 1 shows the results of a test in which m1F8-1 antibody or m1F8-2 antibody was administered to a human CX3CR1-KI mouse late EAE model, (A) shows the amount of free fractalkine in the blood, and (B) shows the EAE score.
  • FIG. 1 shows EAE scores in a study in which m1F8-2 or anti-CX3CR1-Nanobody (BII00313) was administered to a human CX3CR1-KI mouse late EAE model.
  • Figure 1 shows the sequences of the heavy and light chain variable regions of four humanized 1F8 antibodies (h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4).
  • FIG. 1 shows the results of measuring the binding activity of humanized 1F8 antibody (h1F8-2-2) or 306D-hFc to human, cynomolgus monkey, mouse or rat CX3CR1-expressing Ba/F3 cells by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the binding activity of h1F8-2-2 antibody or 306D-hFc by flow cytometry to Ba/F3 cells expressing chimeric CX3CR1 in which the extracellular domains of human and mouse CX3CR1 are swapped.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the in vitro inhibitory activity of h1F8-2-2 antibody or BII00313 in a Ca-influx assay using human CX3CR1-expressing CHO-K1 cells.
  • A shows the results of simultaneously measuring the inhibitory activity of h1F8-2-2 antibody, BII00313, or Synagis
  • B shows the results of measuring the concentration-dependent inhibitory activity of h1F8-2-2 antibody
  • C shows the results of measuring the concentration-dependent inhibitory activity of BII00313.
  • FIG. 1 shows the percentage of CD115-positive cells in peripheral blood ((A): m1F8-2 staining, (B): 66B02-mFc staining), the percentage of CD115-positive and CX3CR1-positive cells ((C): m1F8-2 staining, (D): 66B02-mFc staining), and the percentage of CX3CR1-positive cells relative to CD115-positive cells ((E): m1F8-2 staining, (F): 66B02-mFc staining) in human CX3CR1-KI mice administered h1F8-2-2 antibody or BII00313.
  • FIG. 1 shows EAE scores in a study in which h1F8-2-2 antibody was administered to a human CX3CR1-KI mouse late EAE model.
  • FIG. 1 shows arthritis scores in a test in which m1F8-2 antibody was administered to a human CX3CR1-KI mouse CAIA (anti-collagen antibody cocktail induced arthritis) model.
  • Antibody against human CX3CR1 (anti-human CX3CR1 antibody)
  • Preparation of antigen Information on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) of human CX3CR1 (hereinafter also referred to as hCX3CR1) is registered and published, for example, on the Uniprot website (https://www.uniprot.org/) under "Primary (citable) accession number: P49238-1" or on the NCBI (GenBank) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) under "Accession number: NP_001328.1”.
  • nucleotide sequence (SEQ ID NO: 16) encoding the amino acid sequence of hCX3CR1 is registered and published on the NCBI (GenBank) website under "Accession number: NM_001337.3" (note that the sequence consisting of bases 93 to 1160 in the registered nucleotide sequence corresponds to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16).
  • a polypeptide or peptide (hereinafter simply referred to as a peptide) containing all or a part of the amino acid sequence of hCX3CR1 can be used.
  • the peptide to be used as an antigen may be prepared by chemical synthesis or by synthesis using genetic engineering techniques using Escherichia coli or the like, and any method well known to those skilled in the art can be used. Chemical synthesis of peptides can be performed by well-known methods of peptide synthesis. Both solid-phase synthesis and liquid-phase synthesis can be used. Commercially available peptide synthesizers (e.g., CEM Japan: Parallel-type automated peptide synthesizer MultiPep 2, etc.) may also be used.
  • DNA encoding the peptide is designed and synthesized.
  • the design and synthesis can be carried out, for example, by PCR using a vector containing the full-length hCX3CR1 gene as a template and primers designed to synthesize the desired DNA region.
  • DNA can be synthesized based on the amino acid sequence of the peptide, with a Kozak translation initiation sequence inserted at the 5' end and a translation stop codon inserted at the 3' end (using services provided by GENEWIZ, etc.).
  • the DNA is then ligated to an appropriate vector to obtain a recombinant vector for protein expression, and this recombinant vector is introduced into a host so that the target gene can be expressed to obtain a transformant (Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • a phage or plasmid capable of autonomously replicating in a host microorganism is used as the vector.
  • animal virus and insect virus vectors can also be used.
  • purified DNA is cut with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate restriction enzyme site of vector DNA, and linked to the vector.
  • the host used for transformation There is no particular limit to the host used for transformation, so long as it can express the target gene. Examples include bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.), insect cells, or insects. It is also possible to use mammals such as goats as hosts. Methods for introducing recombinant vectors into hosts are known. Then, the transformant is cultured, and the peptide to be used as an antigen is collected from the culture.
  • the "culture” means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells or cultured bacteria, or their disrupted products.
  • the target peptide After cultivation, if the target peptide is produced intracellularly or intracellularly, the peptide is extracted by disrupting the cells or bacteria. If the target peptide is produced extracellularly or extracellularly, the culture medium is used as is, or the cells or bacteria are removed by centrifugation or the like. The target peptide can then be isolated and purified using general biochemical methods used for peptide isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., either alone or in appropriate combination.
  • general biochemical methods used for peptide isolation and purification such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., either alone or in appropriate combination.
  • the peptide to be used as an antigen can also be obtained by in vitro translation using a cell-free synthesis system.
  • two methods can be used: a method using RNA as a template and a method using DNA as a template (transcription/translation).
  • a cell-free synthesis system commercially available systems such as Expressway TM system (Invitrogen), PURESYSTEM (registered trademark; Post Genome Institute), and TNT system (registered trademark; Promega) can be used.
  • the peptides obtained as described above can also be bound to suitable carrier proteins, such as bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), human thyroglobulin, chicken gamma globulin, and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • human thyroglobulin chicken gamma globulin, and the like.
  • the antigen may also be a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of hCX3CR1 (SEQ ID NO: 17) or a partial sequence thereof.
  • genes to be introduced into cells include genes encoding hCX3CR1 protein or a partial fragment thereof, or mutant proteins or fragments thereof.
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or a partial sequence thereof can be used as such a gene.
  • a gene to be introduced into cells, etc. it is also possible to use a base sequence or a partial sequence thereof that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and encodes a protein having activity or function similar to that of hCX3CR1.
  • “Stringent conditions” refer to the conditions for washing after hybridization, in which the salt (sodium) concentration of the buffer is 10 to 500 mM and the temperature is 42°C to 72°C, preferably the salt concentration is 50 to 300 mM and the temperature is 55 to 68°C.
  • Mutations can be introduced into genes by known techniques such as the Kunkel method or the gapped duplex method, for example, using a mutation introduction kit that utilizes site-specific mutagenesis, such as the GeneArt TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen) or the TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio).
  • the prepared antigen is administered to a mammal for immunization.
  • the mammal is not particularly limited, and examples thereof include rats, mice, and rabbits, with mice being preferred.
  • the dose of antigen per animal can be appropriately set depending on the presence or absence of an adjuvant.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization can be mainly performed by injecting intravenously, into the footpad, subcutaneously, or intraperitoneally.
  • the interval between immunizations is not particularly limited, and immunization can be performed 1 to 10 times, preferably 2 to 3 times, at intervals of several days to several weeks, preferably one week.
  • the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA or EIA) or radioimmunoassay (RIA), and blood is collected on the day when the desired antibody titer is shown, to obtain antiserum.
  • ELISA or EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • blood is collected on the day when the desired antibody titer is shown, to obtain antiserum.
  • purification of the antibody is required, it can be purified by appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate salting out, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, or affinity chromatography, or by combining these methods. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by ELISA or the like.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably, but not limited to, a monoclonal antibody.
  • the prepared antigen is administered to a mammal, such as a rat, mouse, or rabbit, for immunization.
  • the dose of antigen per animal can be appropriately determined depending on the presence or absence of an adjuvant.
  • the adjuvant is the same as above.
  • the immunization technique is also the same as above.
  • 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days, after the final immunization, antibody-producing cells are harvested. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, with lymph node cells and spleen cells being particularly preferred.
  • hybridomas antibody-producing cell lines
  • antibody-producing cells are fused with myeloma cells.
  • myeloma cells Generally available established cell lines of animals such as mice can be used as myeloma cells to be fused with antibody-producing cells.
  • the cell lines used are preferably ones that have drug selectivity, cannot survive in HAT selection medium (containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, and can survive only when fused with antibody-producing cells.
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1 (P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1 (NS1), and Sp2/0-Ag14 (Sp2/0). Myeloma cells can be selected taking into account their compatibility with antibody-producing cells.
  • the myeloma cells and the antibody-producing cells are fused.
  • 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL of the antibody-producing cells are mixed with 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 cells/mL of the myeloma cells in a medium for animal cells such as serum-free DMEM or RPMI-1640 medium.
  • the cell ratio of the antibody-producing cells to the myeloma cells is not limited, but is usually preferably 1:1 to 10:1, more preferably 3:1.
  • the fusion reaction is carried out in the presence of a cell fusion promoter.
  • the cell fusion promoter for example, polyethylene glycol with an average molecular weight of 1,000 to 6,000 daltons (D) can be used.
  • the antibody-producing cells and the myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device that utilizes electrical stimulation (for example, electroporation).
  • hybridomas are selected from the cells after cell fusion. To do so, the cell suspension is appropriately diluted in, for example, RPMI-1640 medium containing fetal bovine serum, and then plated on a microtiter plate. Selection medium is added to each well, and the selection medium is then appropriately replaced and cultured. As a result, the cells that grow in the selection medium from about 14 days after the start of culture can be obtained as hybridomas.
  • the culture supernatant of the grown hybridoma is screened for the presence of an antibody that reacts with hCX3CR1. Screening of the hybridoma may be performed according to a conventional method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma has grown can be collected and screened by ELISA, EIA, RIA, etc. The fused cells can be cloned by limiting dilution etc. Antibodies showing strong reactivity to hCX3CR1 are identified by flow cytometry etc., and hybridomas producing these are selected and established as clones.
  • the ascites formation method In the case of the ascites formation method, about 1 x 107 hybridomas are administered into the abdominal cavity of an animal of the same species as the mammal from which the myeloma cells are derived, and the hybridomas are allowed to grow in large quantities. It is preferable to collect the ascites after 2 to 3 weeks.
  • the antibody collection method when purification of the antibody is required, the antibody can be purified by appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc., or a combination of these.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably an antibody having activity to inhibit or suppress the interaction (preferably binding) between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), for example.
  • the inhibitory or suppressive activity (%) of the interaction between hCX3CR1 and fractalkine can be calculated, for example, by the following formula.
  • Inhibitory or suppressive activity 100 - (background-corrected reactivity when antibody is added/background-corrected reactivity when antibody is not added) x 100
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably an antibody having an activity of inhibiting or suppressing the function of Th cells (helper T cells) expressing Eomes, for example.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is also preferably an antibody having an activity of inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing granzyme B, or an antibody having an activity of inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing Eomes and granzyme B, or an antibody having an activity of inhibiting or suppressing the function of Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ .
  • the function (the function of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or the function of Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ ) may, for example, be infiltration into the CNS (central nervous system).
  • the inhibitory or suppressive activity (%) of the function of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Eomes and/or IFN- ⁇ can be calculated, for example, by the following formula.
  • Inhibitory or suppressive activity 100 - (background-corrected reactivity when antibody is added/background-corrected reactivity when antibody is not added) x 100
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably an antibody having the function of ameliorating or suppressing the progression of the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), for example.
  • EAE pathology refers to the symptoms caused in C57BL/6 mice that are administered complete Freund's adjuvant (CFA) containing MOG peptide and killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra bacteria.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the EAE model is a model (test system) that reproduces the pathology of human MS in mice and evaluates its severity according to numerical criteria.
  • the symptoms and assessment criteria are defined as follows:
  • ⁇ EAE evaluation criteria> 0: no clinical signs; 1: partial paralysis of the tail; 2: flaccid tail; 3: partial paralysis of the hind legs; 4: paralysis of the entire hind legs; 5: paralysis of both the hind legs and the forelimbs.
  • the efficacy of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention in improving or inhibiting the progression of MS may be evaluated in an EAE model or a late EAE model described below.
  • the late EAE model used in this application is a special mouse model that experimentally reproduces only the symptoms of progressive MS, and is constructed by using NR4A2-deficient mice.
  • mice crossed with hCX3CR1 knock-in mice are used (human CX3CR1-KI mouse late EAE model).
  • the late EAE model may be used to evaluate progressive MS in particular, since in EAE tests using normal mice that are not NR4A2-deficient, there is no increase in EAE score observed early after EAE induction, whereas only an increase in EAE score due to progressive MS is observed after a certain period of time has passed after EAE induction (i.e., EAE pathology).
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably one that can be used, for example, for prevention, inhibition of progression, or treatment of progressive immune demyelinating diseases.
  • the progressive immune demyelinating disease is preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system, and can include progressive multiple sclerosis (MS), of which there are known types: primary progressive MS (PPMS), secondary progressive MS (SPMS) in which RRMS pathology continues for a certain period of time and then progresses to a progressive pathology, and progressive relapsing MS (PRMS) in which the disease progresses with repeated relapses (see Patent Document 3).
  • PPMS primary progressive MS
  • SPMS secondary progressive MS
  • PRMS progressive relapsing MS
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is not limited to these diseases, and may be used for the prevention, inhibition of progression, or treatment of one or more of the following: autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and autoimmune myositis; heart disease including atherosclerosis; chronic kidney disease, diabetic heart disease, diabetic kidney disease, interstitial lung disease, cancer (e.g., breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer), COVID-19 (novel coronavirus disease)-related central nervous system diseases, and neurodegenerative diseases such as ALS, Alzheimer's disease, and multiple system atrophy.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and autoimmune myositis
  • heart disease including atherosclerosis
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention preferably has a dissociation constant (Kd value) of, but not limited to, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less, more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 11 M or less, and even more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 12 M or less.
  • Kd value dissociation constant
  • affinity binding ability
  • the binding ability (affinity) of an antibody can be measured as the dissociation constant (Kd value), dissociation rate constant (Kdiss [1/Sec]), and binding rate constant (Kass [1/M.Sec]) by, for example, Scatchard analysis or a surface plasmon resonance sensor called Biacore.
  • Biacore devices include Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, and Biacore Q (all from Biacore).
  • An antibody having a smaller dissociation constant (Kd value) is preferred in that it has a higher binding ability (affinity).
  • the epitope (antigenic determinant) of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention may be at least a part of the region of the antigen hCX3CR1. Preferably, for example, it is at least a part of the region of the extracellular domain of hCX3CR1, but a region other than the extracellular domain may also be the epitope.
  • the present invention also encompasses antibodies capable of binding to the epitope region to which the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention binds (recognizes).
  • a preferred embodiment of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is a recombinant antibody.
  • the recombinant antibody include, but are not limited to, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody (fully human antibody).
  • Chimeric antibodies i.e., human chimeric antibodies
  • Chimeric antibodies are antibodies in which the variable regions of a mouse-derived antibody are linked (conjugated) to constant regions of human origin (see, e.g., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984)).
  • chimeras such linked antibodies can be easily constructed by genetic recombination techniques.
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • CDR grafting mouse-derived reconstructed human variable regions
  • Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (see Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Published Japanese Translation of PCT International Publication No. 4-502408 (Patent Publication No. 2828340; Queen et al.), etc.).
  • Human antibodies (fully human antibodies) generally have the same structure as human antibodies in the hypervariable region, which is the antigen-binding site in the V region, the other parts of the V region, and the constant region. However, the hypervariable region may be derived from other animals.
  • Technology for producing human antibodies is also known, and methods for producing gene sequences common to humans using genetic engineering techniques have been established. Human antibodies can be produced, for example, by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosomal fragment containing the heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc.
  • the human antibody may be an antibody produced (or even purified) from a clone that specifically binds to the desired antigen (hCX3CR1 in this invention) using human ADLib technology (the library described in WO 2015/167011), or an antibody whose amino acid sequence (particularly the amino acid sequence of VH or VL, preferably at least one CDR sequence in VH or VL) has been modified (preferably with amino acid substitution).
  • the above-mentioned chimeric antibody, humanized antibody and human antibody are not limited, but are preferably those in which the N-glycoside-linked complex glycan in the antibody Fc region is a glycan in which fucose is not bound to the N-acetylglucosamine at the reducing end of the glycan, and more specifically, an antibody consisting of a genetically engineered antibody molecule having a glycan in the Fc region of the antibody molecule in which the 1-position of the fucose is not ⁇ -bound to the 6-position of the N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex glycan.
  • Such an antibody can improve the ADCC activity.
  • This point (characteristics of the N-glycoside-linked complex glycan in the antibody Fc region) is also preferable for the above-mentioned polyclonal antibody and monoclonal antibody.
  • Examples of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention include The amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDR) 1 (CDR-H1), CDR2 (CDR-H2) and CDR3 (CDR-H3) of the heavy chain variable region (VH) are as follows, in order:
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, and the amino acid sequences of CDR1 (CDR-L1), CDR2 (CDR-L2), and CDR3 (CDR-L3) of the light chain variable region (VL) are represented by the following sequence, respectively:
  • Preferred examples include antibodies consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, or the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10, 7 and 8.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention includes, for example, (a) the amino acid sequences of CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 consist of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4, respectively, and (b) an antibody in which the amino acid sequences of CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 consist of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively, and (b) the amino acid sequences of CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 consist of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4, respectively, and Preferred examples of such antibodies include those in which the amino acid sequences of CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 are those shown in SEQ ID NOs: 10, 7 and 8, respectively.
  • a more preferred embodiment of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is, for example,
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region (VH) consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 11, 12, 13, or 14, and Preferred examples of such antibodies include those in which the amino acid sequence of the light chain variable region (VL) consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 9, or 15.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention includes, for example, (a) the amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; and An antibody, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO:5. (b) the amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; and An antibody comprising the amino acid sequence of VL set forth in SEQ ID NO:9.
  • the amino acid sequences of VH and VL, and CDR-H1 to CDR-H3, and CDR-L1 to CDR-L3 of the m1F8-1 antibody, m1F8-2 antibody, h1F8-2-1 antibody, h1F8-2-2 antibody, h1F8-2-3 antibody, and h1F8-2-4 antibody, respectively, consist of the amino acid sequences represented by the sequence numbers shown in Table A below.
  • Antibody Fragment Fragments (partial fragments) of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention are also included in the antibody of the present invention.
  • the antibody fragment of the present invention has a binding activity to hCX3CR1 (i.e., can bind to hCX3CR1) like the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention.
  • the antibody fragment has an activity to inhibit or suppress the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine) as described above, an activity to inhibit or suppress the function (e.g., infiltration into the CNS, etc.) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , a function to improve or suppress the progression of EAE pathology, or can be used for the prevention, suppression of progression, or treatment of progressive immune demyelinating diseases (preferably progressive immune demyelinating diseases of the central nervous system, such as secondary progressive multiple sclerosis (SPMS)).
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • the antibody fragment refers to a partial region of an anti-hCX3CR1 polyclonal antibody or anti-hCX3CR1 monoclonal antibody (i.e., an antibody fragment derived from the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention), and includes, for example, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv (variable fragment of antibody), single-chain antibody (H chain, L chain, H chain V region, L chain V region, etc.), scFv, diabody (scFv dimer), dsFv (disulfide-stabilized V region), and peptides comprising at least a portion of the complementarity determining region (CDR).
  • Fab fragment anti-hCX3CR1 polyclonal antibody or anti-hCX3CR1 monoclonal antibody
  • Fv variable fragment of antibody
  • single-chain antibody H chain, L chain, H chain V region, L chain V region, etc.
  • scFv diabody
  • Fab is an antibody fragment obtained by treating an antibody molecule with the protease papain, in which approximately half of the N-terminal end of the H chain is linked to the entire L chain via a disulfide bond, and has an antigen-binding activity with a molecular weight of approximately 50,000.
  • Fab can also be produced by inserting DNA encoding the Fab of an antibody into a prokaryotic or eukaryotic expression vector and expressing the vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • F(ab') 2 is an antibody fragment having an antigen-binding activity and a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than that of Fab bound via disulfide bonds in the hinge region, among fragments obtained by treating an antibody molecule with the protease pepsin. It can also be prepared by bonding Fab via thioether bonds or disulfide bonds, as described below.
  • Fab' is an antibody fragment having an antigen-binding activity and a molecular weight of about 50,000, obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of the above-mentioned F(ab') 2 .
  • Fab' can also be produced by inserting DNA encoding the Fab' fragment of an antibody into an expression vector for prokaryotes or eukaryotes, and expressing the fragment by introducing the vector into a prokaryote or eukaryote.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one heavy chain variable region (VH) and one light chain variable region (VL) are linked using an appropriate peptide linker (P), and is an antibody fragment with antigen-binding activity.
  • scFv can be produced by obtaining cDNA encoding the VH and VL of an antibody, constructing DNA encoding the scFv, inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and expressing the DNA by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized and has bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen-binding activity can be the same, or one of the two can have a different antigen-binding activity.
  • a diabody can be produced by obtaining cDNA encoding the VH and VL of an antibody, constructing DNA encoding the scFv so that the amino acid sequence of the peptide linker (P) is 8 residues or less in length, inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and expressing the DNA by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, and the cysteine residues are linked via a disulfide bond.
  • the amino acid residue to be replaced with a cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • dsFv can be produced by obtaining cDNA encoding the VH and VL of an antibody, constructing DNA encoding dsFv, inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and expressing the DNA by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a peptide containing CDR is composed of at least one region of the VH CDR (CDR-H1 to CDR-H3) and the VL CDR (CDR-L1 to CDR-L3), and more preferably contains all the VH CDRs and all the VL CDRs, and particularly preferably contains all the VH and VL CDRs (total of 6 regions).
  • Preferred examples of the amino acid sequence of the CDR include the various amino acid sequences of CDR-H1 to CDR-H3 and CDR-L1 to CDR-L3 described above.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • a peptide containing CDR can be produced by constructing DNA encoding the VH and VL CDRs of an antibody, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and expressing the DNA by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. Additionally, peptides containing CDRs can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the antibody fragment of the present invention may be an antibody fragment containing a part or all of an antibody Fc region in which the N-glycoside-linked complex type glycan is a glycan in which fucose is not bound to the N-acetylglucosamine at the reducing end of the glycan, or may be a fusion protein of the above-mentioned antibody fragment and a part or all of an antibody Fc region in which the N-glycoside-linked complex type glycan is a glycan in which fucose is not bound to the N-acetylglucosamine at the reducing end of the glycan.
  • Such antibody fragments are preferable because they can dramatically improve ADCC activity.
  • the above-mentioned antibody fragments are also included in the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention.
  • the present invention can also provide a polynucleotide (gene, DNA) encoding the above-mentioned anti-hCX3CR1 antibody of the present invention or its antibody fragment.
  • the polynucleotide is preferably a polynucleotide containing a base sequence encoding each of the amino acid sequences exemplified for the above-mentioned anti-hCX3CR1 antibody or antibody fragment of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be composed of only a polynucleotide encoding the anti-hCX3CR1 antibody or antibody fragment of the present invention, or may contain the polynucleotide as a part thereof and also contain known base sequences necessary for gene expression (transcription promoter, SD sequence, Kozak sequence, terminator, etc.), and is not limited thereto.
  • the codons corresponding to the individual amino acids after translation are not particularly limited, and may contain nucleotide DNA that indicates codons (preferably frequently used codons) that are commonly used in mammals such as humans after transcription, or may contain nucleotide DNA that indicates codons (preferably frequently used codons) that are commonly used in microorganisms such as Escherichia coli and yeast, plants, etc.
  • the present invention can also provide a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention, and a transformant containing the recombinant vector.
  • the polynucleotide (gene, DNA) to be incorporated into the expression vector used as a recombinant vector may, as necessary, have a transcription promoter, SD sequence (when the host is a prokaryotic cell), or Kozak sequence (when the host is a eukaryotic cell) linked upstream, or a terminator linked downstream.
  • enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selection markers, etc. may also be linked.
  • Each element necessary for gene expression, such as the transcription promoter may be included in the polynucleotide from the beginning, or if it is originally included in the expression vector, it may be used, and there are no particular limitations on the manner in which each element is used.
  • Methods for incorporating the polynucleotide into an expression vector include various methods utilizing known gene recombination techniques, such as a method using a restriction enzyme or a method using topoisomerase.
  • the expression vector is not limited, and may be, for example, a plasmid DNA, a bacteriophage DNA, a retrotransposon DNA, a retrovirus vector, an artificial chromosome DNA, or the like, as long as it is capable of retaining the polynucleotide (gene, DNA) encoding the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and a vector suitable for the host cell to be used can be appropriately selected and used.
  • transformant refers to a host into which a foreign gene has been introduced, and includes, for example, a host into which a foreign gene has been introduced by introducing a plasmid DNA or the like into the host (transformation), as well as a host into which a foreign gene has been introduced by infecting the host with various viruses and phages (transduction).
  • the host is not limited and can be selected appropriately as long as it is capable of expressing the anti-hCX3CR1 antibody or its antibody fragment of the present invention after the above-mentioned recombinant vector is introduced, and examples of such hosts include known hosts such as various animal cells such as human and mouse cells, various plant cells, bacteria, yeast, plant cells, etc.
  • animal cells for example, human fibroblasts, human fetal kidney cells, HEK293 cells, 293F cells, CHO cells, monkey cells COS-7, Vero, mouse L cells, rat GH3, human FL cells, etc.
  • Insect cells such as Sf9 cells and Sf21 cells can also be used.
  • bacterium for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. are used.
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, etc. are used.
  • plant cells for example, tobacco BY-2 cells and the like are used.
  • the method for obtaining a transformant is not limited and can be appropriately selected taking into consideration the combination of the host and the type of expression vector.
  • Preferred examples of the method include electroporation, lipofection, heat shock, PEG, calcium phosphate, DEAE-dextran, and methods of infection with various viruses such as DNA viruses and RNA viruses.
  • the codon type of the polynucleotide contained in the recombinant vector may be the same as or different from the codon type of the host used, and is not limited thereto.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention (including a fragment derived from said antibody) is useful as an active ingredient contained in a pharmaceutical composition.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is preferably used, for example, for the prevention, inhibition of progression, and/or treatment of progressive immune demyelinating diseases. Therefore, the pharmaceutical composition is useful as a pharmaceutical composition for the prevention, inhibition of progression, and/or treatment of progressive immune demyelinating diseases.
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention is useful as an active ingredient contained in a preventive agent, an inhibitor of progression, and/or a therapeutic agent for progressive immune demyelinating diseases.
  • the explanations of the specific examples and the like described above can be similarly applied to progressive immune demyelinating diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a composition used to inhibit or suppress the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), or a composition used to inhibit or suppress the function (e.g., infiltration into the CNS) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , or a composition used to improve or suppress the progression of EAE pathology.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition that contains the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention as an active ingredient and further contains a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used in combination with a known drug (such as a known drug used for the prevention, inhibition of progression, and/or treatment of progressive immune demyelinating diseases).
  • a known drug such as a known drug used for the prevention, inhibition of progression, and/or treatment of progressive immune demyelinating diseases.
  • the mode of combination is not limited, and may be, for example, a mode in which the pharmaceutical composition of the present invention further contains the known drug, or a mode in which it is used in combination with the known drug. Such combination can also provide even higher preventive, inhibitory, and/or therapeutic effects.
  • “Pharmaceutically acceptable carriers” include excipients, diluents, bulking agents, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, flavorings, colorings, sweeteners, thickening agents, flavorings, solubilizers, and other additives.
  • pharmaceutical compositions in the form of injections, liquids, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and the like can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections containing one or more active substances and formulated in the usual manner. Injections can be prepared by dissolving or suspending in a pharma- ceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.
  • colloidal dispersion systems When administering antibody fragments (especially low molecular weight ones) derived from the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention to the body, in addition to the above, a colloidal dispersion system can be used. Colloidal dispersion systems are expected to have the effect of increasing the stability of the compound (antibody fragment) in the body and to efficiently transport the compound to specific organs, tissues, or cells.
  • Colloidal dispersion systems include, but are not limited to, those commonly used, such as polyethylene glycols, polymer complexes, polymer aggregates, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based dispersion systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes, preferably liposomes, artificial membrane vesicles, which are effective in efficiently delivering compounds to specific organs, tissues, or cells (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
  • those commonly used such as polyethylene glycols, polymer complexes, polymer aggregates, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based dispersion systems including oil
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the age, sex, weight, and symptoms of the patient, the therapeutic effect, the administration method, the treatment time, or the type of anti-hCX3CR1 antibody of the present invention contained in the pharmaceutical composition.
  • an adult can be administered a single dose in the range of 600 ⁇ g to 6000 mg, but is not limited to this range.
  • a single dose of 100 ⁇ g to 100 mg per kg body weight may be administered to a human patient once or several times per day on average, preferably once every 3 days, 1 week, 10 days, or 2 weeks, or a single dose (total number of doses is 1).
  • the administration form may be intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection, with intravenous injection being preferred.
  • the injection may be prepared as a suspension or emulsion in some cases using a non-aqueous diluent (e.g., polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.).
  • a non-aqueous diluent e.g., polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • injections may be sterilized by filtration sterilization using a filter, blending of a bactericide, etc.
  • Injections may be manufactured in a form prepared at the time of use. That is, the injection may be made into a sterile solid composition by freeze-drying or the like, and dissolved in sterile distilled water for injection or other solvent before use.
  • the present invention also provides the use of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention and/or the complex of the present invention for producing a pharmaceutical (drug) for treating, preventing and/or diagnosing tumors or inflammatory diseases and/or autoimmune diseases (hereinafter also referred to as tumors, etc.), or for inhibiting or suppressing the interaction (preferably binding) between hCX3CR1 and human CX3CL1.
  • a pharmaceutical drug for treating, preventing and/or diagnosing tumors or inflammatory diseases and/or autoimmune diseases (hereinafter also referred to as tumors, etc.), or for inhibiting or suppressing the interaction (preferably binding) between hCX3CR1 and human CX3CL1.
  • the present invention also provides anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for preventing, inhibiting progression and/or treating progressive immune demyelinating diseases, anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., infiltration into the CNS) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , and anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for ameliorating and/or inhibiting progression of EAE pathology.
  • anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for preventing, inhibiting progression and/or treating progressive immune demyelinating diseases
  • anti-hCX3CR1 antibodies of the present invention for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL
  • the present invention provides a method for preventing, inhibiting the progression of, and/or treating a progressive immune demyelinating disease, characterized by using the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention (i.e., administering it to a subject (patient)), a method for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), a method for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., infiltration into the CNS, etc.) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , or a method for improving and/or inhibiting the progression of EAE pathology.
  • a method for preventing, inhibiting the progression of, and/or treating a progressive immune demyelinating disease characterized by using the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention (i.e., administering it to a subject (patient)), a method for inhibiting and/
  • the present invention also provides use of the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention for preventing, inhibiting and/or treating a progressive immune demyelinating disease, for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., infiltration into the CNS, etc.) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , or for ameliorating and/or inhibiting the progression of EAE pathology.
  • a progressive immune demyelinating disease for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., infiltration into the CNS, etc.) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , or for amelior
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention can be provided in the form of a kit for preventing, inhibiting and/or treating a progressive immune demyelinating disease, a kit for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), a kit for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., infiltration into the CNS) of Th cells expressing Eomes and/or granzyme B, or Th cells expressing Eomes and/or IFN- ⁇ , or a kit for improving and/or inhibiting the progression of EAE pathology.
  • a kit for preventing, inhibiting and/or treating a progressive immune demyelinating disease e.g., a kit for inhibiting and/or inhibiting the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine)
  • fractalkine e.g., a kit for inhibiting and/or inhibiting the function (e.g., in
  • the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention can also be provided in the form of a diagnostic kit capable of diagnosing a progressive immune demyelinating disease.
  • a diagnostic kit capable of diagnosing a progressive immune demyelinating disease.
  • the explanation of the specific examples and the like described above can be similarly applied to a progressive immune demyelinating disease.
  • the kit of the present invention may contain, in addition to the anti-hCX3CR1 antibody of the present invention, various buffers, sterile water, various cell culture vessels, various reaction vessels (Eppendorf tubes, etc.), blocking agents (serum components such as Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat serum, etc.), detergents, surfactants, various plates, preservatives such as sodium azide, and experimental operation manuals (instructions), etc.
  • various buffers such as Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat serum, etc.
  • the DNA was amplified using a forward primer with a Kozak translation initiation sequence added, a reverse primer with a translation termination codon added, and "Premix Ex Taq (Ex Taq version 2.0)" (Takara Bio Inc.), and inserted into the vector of "pEF6/V5-His TOPO TA Expression kit” (Takara Bio Inc.) to obtain the hCX3CR1 expression vector (hCX3CR1_pEF6/V5-His).
  • hCX3CR1_pEF6/V5-His was introduced into Ba/F3 cells by electroporation, cultured in a selective medium containing blasticidin, and hCX3CR1-expressing cells were isolated by a flow cytometer and used as a stable expression line (hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells).
  • mCX3CR1 expression vector (mCX3CR1_pEF6/V5-His) and mCX3CR1-expressing Ba/F3 cells were prepared using the amino acid sequence of mouse CX3CR1 (mCX3CR1) protein (Uniprot registration number: Q9Z0D9) as a template using "pUNO1-mCX3CR1" (Invivogen), and subjected to cross-reactivity and epitope analysis tests.
  • the hCX3CR1 gene sequence derived from hCX3CR1_pEF6/V5-His was introduced into pcDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific) to prepare an expression vector (hCX3CR1_pcDNA3.3). Then, hCX3CR1_pcDNA3.3 was used as an introduction plasmid in the "Expi293 expression system" (Thermo Fisher Scientific) to perform transient expression.
  • a membrane fraction was prepared from the cultured cells and suspended in PBS to prepare the hCX3CR1-expressing cell membrane fraction (using Seed Supply Co. service) and used as the antigen.
  • a fusion protein in which GST is bound to the N-terminus of the N-terminal extracellular domain sequence of hCX3CR1 protein (DQFPESVTENFEYDDLAEACYIGDIVVFGT (the 2nd to 31st amino acid sequence of SEQ ID NO: 17)) or a fusion protein in which the Fc region of a human or mouse antibody is bound was produced using Expi293 and purified to obtain a purified protein.
  • Animal Immunization Antibodies were produced by immunizing ICR mice (Sankyo Laboservices, Japan CLEA) with various hCX3CR1 antigens according to the following method. The antigen was mixed with the adjuvant "Titer MaxGold” (TiterMax) and administered to the footpad of each mouse at an antigen dose of 200 ⁇ g. Three days after administration, booster immunization was performed in the same manner as above without the adjuvant at approximately weekly intervals at an antigen dose of 10 to 50 ⁇ g per mouse.
  • Hybridoma production Monoclonal antibodies against hCX3CR1 were produced using lymph node cells or spleen cells isolated from immunized mice. After immunization, inguinal, iliac, popliteal, and other lymph nodes were collected from the mice to prepare cell suspensions, which were then mixed with SP2/0-Ag14 myeloma cells and subjected to electrical cell fusion using an electrical cell fusion device "ECFG21" (Neppa Gene Co., Ltd.). The fused cells were suspended in "ClonaCell TM -HY Medium D” (STEM CELL) and seeded on plastic petri dishes.
  • hybridoma medium used was RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 1/50 of Nutridoma-CS (Merck) and 1/50 of HAT Supplement (Thermo Fisher Scientific).
  • 1-4 Antibody screening using an in vitro test system Screening of the obtained hybridoma clones was performed using the following two methods. 1-4-1. Screening using binding activity as an index The reactivity of the hybridoma culture supernatant against plates seeded with hCX3CR1 expressing rat hematopoietic cells "HTS015C” or non-hCX3CR1 expressing cells "HTSCHEM-1" (both from Eurofins) was evaluated by Cell ELISA. For the positive clones in the Cell ELISA evaluation, the culture supernatant or its purified antibody was used to evaluate the reactivity against HTS015C or hCX3CR1 expressing Ba/F3 cells by flow cytometer.
  • Eurofins cells were seeded onto 384-well CellBIND plates (Corning) and cultured at 37°C 1 to 3 days before the measurement.
  • Eurofins cells were cultured in DMEM high Glucose (Nacalai Tesque) supplemented with 10% FBS (HyClone), 1% MEM NEAA (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco), and 1% Penicillin-Streptomycin (Nacalai Tesque).
  • Eurofins cell culture supernatant was removed, and 20 ⁇ L of hybridoma culture supernatant was added per well and incubated at 4°C for 1 hour.
  • the above Cell ELISA positive clones were further evaluated for reactivity against HTS015C or hCX3CR1 expressing Ba/F3 cells using a flow cytometer, using culture supernatants or purified antibodies.
  • Purified antibodies from positive clones were mainly prepared using rProtein A Sepharose Fast Flow.
  • HTS015C HTS015C (HTSCHEM-1 as a negative control) or hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells (Ba/F3 cells transfected with an empty vector as a negative control) were cultured at 37.0°C in the presence of 5% CO2 .
  • Ba/F3 cells were cultured in RPMI Medium 1640 (Sigma) supplemented with 10% FBS (HyClone), 1 ng/mL mouse IL-3 (R&D), and 1% Penicillin-Streptomycin (Nacalai Tesque).
  • Eurofins cells which are adherent cells, were collected with a non-enzymatic cell detachment solution (Thermo Fisher Scientific).
  • the cells were dispensed into a 96-well plate, the supernatant was removed by centrifugation, and 50 ⁇ L of hybridoma culture supernatant or purified antibody diluted with 1% BSA/PBS was added per well and suspended, and the cells were left to stand at 4°C for 30 minutes.
  • the cells were washed with 1% BSA/PBS, and 50 ⁇ L of PE-labeled secondary antibody diluted with 1% BSA/PBS was added per well and suspended, then left in the dark for 30 minutes at 4° C.
  • hCX3CR1 expressing cells were adjusted to 5.33 ⁇ 105 cells per 100 ⁇ L in culture medium containing 1% FBS, and cultured at 37°C for 3-6 hours, after which purified antibodies were added and cultured for another hour.
  • the cell suspension was added to the upper chamber (75 ⁇ L, 2 ⁇ 105 cells in the end), and culture medium containing 1% FBS alone or culture medium containing 10ng/mL human fractalkine was added to the lower chamber, and cultured at 37°C overnight.
  • the upper chamber was gently shaken to remove, and 100 ⁇ L of the culture medium in the lower chamber containing the migrated cells was mixed with an equal amount of CellTiter-Glo, left at room temperature for 10 minutes, and then luminescence was measured using an Enspire Alpha Plate Reader (PerkinElmer).
  • the 46 clones mentioned above were evaluated using the migration inhibitory activity of hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells, and a clone (m1F8) with nearly 100% cell migration inhibitory activity was selected. As mentioned in 1-4-1 above, this clone was only one functional clone initially screened from approximately 30,000 hybridoma clones, and it is extremely difficult to obtain, and cannot be said to be easily obtained by trial and error that a person skilled in the art would normally perform.
  • the sequence of the immunoglobulin gene variable region of the m1F8 antibody was analyzed.
  • the m1F8 hybridoma cells were expanded and cultured, and mRNA was extracted, reverse transcribed using the 5' RACE method, the antibody variable region sequences were amplified using the PCR method, cloned, and sequenced using the Sanger method (using the services of GENEWIZ).
  • amino acid sequences of the CDR regions, heavy chain variable region (VH), and light chain variable region (VL) of the obtained antibody (m1F8 antibody) were determined according to the method of Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, US, Department of Health and Human Services, 1991).
  • the fluorescence intensity of the negative antibody did not increase even when the antibody concentration was increased, and no binding to the hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells was observed.
  • the fluorescence intensity of the m1F8 antibody increased in an antibody concentration-dependent manner, and the m1F8 antibody showed clear reactivity to the hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells, although it was not saturated at the adjusted antibody concentration.
  • this reactivity was hardly observed in Ba/F3 cells into which an empty vector had been introduced, and it was considered to be a specific reaction dependent on hCX3CR1 expression.
  • the synthesized DNA was inserted into the pEF6/V5-His TOPO vector cleaved with restriction enzymes (BamHI, NotI) to obtain various CX3CR1 expression vectors (cynomolgus monkey: cCX3CR1_pEF6/V5-His, rat: rCX3CR1_pEF6/V5-His).
  • the reactivity (mean fluorescence intensity) under the condition of only secondary antibody in the presence of cells was subtracted as a background value for correction, and cross-reactivity was determined based on the reactivity % of m1F8 antibody at the same concentration when the reactivity of 200 nM 66B02-mFc against hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells or cCX3CR1-expressing Ba/F3 cells was set as 100%, or the reactivity of the same concentration of SA011F11 against mCX3CR1-expressing Ba/F3 cells or rCX3CR1-expressing Ba/F3 cells was set as 100%.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the chimeric CX3CR1 expression construct in which the extracellular domains of human and mouse CX3CR1 were swapped, which was prepared for epitope analysis. Gene sequences were synthesized in which one each of the four extracellular domains present in the CX3CR1 protein sequence was swapped between human and mouse (using the services of GENEWIZ).
  • the synthesized DNA was inserted into the pEF6/V5-His TOPO vector cleaved with restriction enzymes (BamHI, NotI), and a total of eight types of chimeric CX3CR1 expression vectors were prepared.
  • restriction enzymes BamHI, NotI
  • various CX3CR1 expression vectors were introduced into Ba/F3 cells by electroporation, cultured in a selection medium containing blasticidin, and CX3CR1-expressing cells were isolated by a flow cytometer and used as stable expression strains for binding domain analysis.
  • the reactivity (mean fluorescence intensity) of 200 nM of the control antibody for each cell was subtracted and corrected, and the binding domain was determined based on the reactivity % of the m1F8 antibody at the same concentration when the reactivity of the same concentration of 66B02-mFc for each expressing cell line having the extracellular domain 1 of hCX3CR1 was set to 100%, or the reactivity of the same concentration of SA011F11 for each expressing cell line having the extracellular domain 1 of mCX3CR1 was set to 100%.
  • m1F8 was reactive to cell lines expressing hCX3CR1 with extracellular domain 1 (hCX3CR1, hCX3CR1-2, 3, 4, mCX3CR1-1), but also showed a certain degree of reactivity to cell lines expressing hCX3CR1 without extracellular domain 1 (hCX3CR1-1, mCX3CR1-4).
  • another commercially available anti-hCX3CR1 antibody, K0124E1 was reactive only to cell lines expressing hCX3CR1 with extracellular domain 1, just like 66B02-mFc.
  • Antibody binning 6-1 Binning of 1F8 antibody and control antibody Table 4 shows the results of epitope binning of 1F8 and various antibodies using human CX3CR1 (hCX3CR1)-expressing Ba/F3 cells. 10 ⁇ M of the competing antibody shown on the left side of Table 4 and 100 nM of the detection antibody shown on the top side of the table were added to hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells, suspended, and left at 4°C for 30 minutes in the dark. The flow cytometry method thereafter was performed in the same manner as in 1-4-1 of Example 1. m/h1F8 represents a chimeric antibody having a mouse-derived Fab and a human-derived Fc.
  • 66B02-mFc equivalent, 306D-hFc equivalent (hFc fusion protein of anti-hCX3CR1-Nanobody), and K0124E1 were used.
  • a negative antibody a humanized IgG1 antibody equivalent to Synagis (palivizumab) (referred to as "Synagis” in this specification) was used.
  • the reactivity (mean fluorescence intensity) under the condition of cells with only secondary antibody was subtracted as a background value, and the reactivity of each detection antibody when Synagis was used as a competing antibody was set as 100%, and the binding competition was determined based on the reactivity of each detection antibody in the presence of each competing antibody.
  • 1F8 antibodies competed very strongly with each other, but did not compete significantly with the control antibodies 66B02-mFc, 306D-hFc, and K0124E1, while the control antibody 306D-hFc competed very strongly with 66B02-mFc and K0124E1 (commercially available antibodies).
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of the obtained m1F8-1 and m1F8-2 are shown in FIG. 4.
  • the underlined parts in each amino acid sequence indicate CDRs.
  • the binding activity (EC50) of m1F8 antibody, two types of activity-enhanced m1F8 antibodies (m1F8-1, m1F8-2), and anti-hCX3CR1-Nanobody to hCX3CR1-expressing Ba/F3 cells and the inhibitory activity (IC50) against fractalkine-dependent cell migration are shown in Table 5.
  • the enhanced m1F8 antibodies (m1F8-1 and m1F8-2) showed up to 70-fold or more improved binding activity and 15-fold or more improved inhibitory activity compared to the original m1F8 antibody. However, these activities were still higher for the anti-hCX3CR1-Nanobody than for these enhanced m1F8 antibodies.
  • 1F8 activity enhancing antibody binning The results of epitope binning of 1F8 activity enhancing antibodies (1F8-1, 1F8-2) and anti-hCX3CR1-Nanobody using hCX3CR1 expressing Ba/F3 cells are shown in Table 6. The method was the same as that described in 6-1 above.
  • NR4A2-deficient mice NR4A2-cKO mice were established using a targeting vector containing the NR4A2 gene flanked by loxp sequences. That is, the NR4A2 transgene flanked by loxp sequences was introduced into C57BL/6 embryonic stem cells by microinjection.
  • mice The established strain was crossed with C57BL/6 FLPe mice (RIKEN Bioresource Center) to remove the neomycin cassette, and the two strains were crossed to generate homozygous NR4A2 fl/fl C57BL/6 mice.
  • human CX3CR1-KI mice were established in which the mouse CX3CR1 gene was replaced with the human CX3CR1 gene by genome editing. That is, first, a Cas9 expression vector was constructed incorporating a guide RNA sequence targeting the exon2 protein coding region of the target gene (Cx3cr1 gene, GeneID: 13051).
  • a homologous recombination vector was constructed containing an artificial synthetic sequence including a knock-in sequence (CX3CR1 gene, Gene ID: 1524, NM_001337.3, CDS region, 1068 bp) and a homologous region cloned from the genome of the C57BL/6N-derived RENKA strain.
  • the guide Cas9 vector, homologous recombination vector, and transient drug (Puromycin) resistance gene expression vector were introduced into ES cells (C57BL/6N-derived RENKA strain) by electroporation, and colonies of ES cell clones formed by drug selection culture were isolated.
  • chimeric embryos were produced by aggregation method using ICR strain as recipient embryos, and transplanted into recipient mice to produce chimeric mice.
  • the first generation mice (KI heterozygous mice) were produced by natural mating of germline chimeric mice and wild-type mice (C57BL/6N), and KI heterozygous mice were crossed with each other to produce KI homozygous mice (human CX3CR1-KI mice).
  • NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice To generate NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice, NR4A2-cKO and human CX3CR1-KI mice were crossed, and finally, CD4-Cre +/ ⁇ /NR4A2 fl/fl /CX3CR1 human/human mice were used as KI-late EAE test mice.
  • EAE induction (monophasic EAE) A PBS solution containing 100 ⁇ g of a peptide corresponding to MOG35-55 residues (synthesized at Toray Research Center, hereafter referred to as "MOG peptide") was mixed with equal amounts of complete Freund's adjuvant (CFA) containing 1 mg of killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Kansas, USA) and emulsified using a sonicator to prepare an MOG emulsion. The resulting MOG emulsion was injected subcutaneously into one or two sites on the back of NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice to immunize them. In addition, on days 0 and 2 after immunization, 200 ⁇ L of a PBS solution containing 200 ng of pertussis toxin (List Biological Laboratories, USA) was injected intraperitoneally into each mouse.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • ⁇ EAE evaluation criteria> 0: no clinical signs; 1: partial paralysis of the tail; 2: flaccid tail; 3: partial paralysis of the hind legs; 4: paralysis of the entire hind legs; 5: paralysis of both the hind legs and the forelimbs.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal administration of a triple anesthetic mixture (medetomidine, midazolam, butorphanol), and the amount of free fractalkine in the blood was quantified using a commercially available ELISA kit (R&D systems, MCX310) using serum collected by incising the mouse's neck.
  • a triple anesthetic mixture medetomidine, midazolam, butorphanol
  • serum collected by incising the mouse's neck As shown in Figure 5 (A), the amount of free fractalkine in the blood was significantly increased in the BII00313-administered group compared to the control group and the NR4A2cKO group.
  • mice obtained from human CX3CR1-KI mouse late EAE model (comparison of m1F8 antibody; comparison of m1F8-1 and m1F8-2) NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice in which monophasic EAE was induced in the same manner as in Example 7 were administered 200 ⁇ g of anti-hCX3CR1 antibody (m1F8-1 or m1F8-2) or its isotype antibody (mIgG2a) 24 and 28 days after EAE induction. The EAE pathology of the mice was evaluated in the same manner as in Example 7. In addition, fractalkine in the blood was measured.
  • the m1F8-1 antibody While there are antibodies such as the m1F8-1 antibody whose favorable in vitro functional activity (increased amount of free fractalkine in the blood) does not necessarily correspond clearly to in vivo functional evaluation (improvement of EAE pathology), the m1F8-2 antibody not only has favorable in vitro functional activity but also exhibits excellent in vivo functional evaluation.
  • Anti-hCX3CR1 antibodies that are functionally excellent both in vitro and in vivo, such as the m1F8-2 antibody, are extremely difficult to obtain and cannot be easily obtained by the trial and error that one skilled in the art would normally perform.
  • mice were administered 200 ⁇ g of BII00313, m1F8-2, or its isotype antibody (mIgG2a) 24 and 27 days after EAE induction.
  • the EAE pathology of the mice was evaluated in the same manner as in Example 7. As shown in FIG. 7, the EAE pathology was improved particularly markedly in the group administered m1F8-2.
  • mice from each antibody administration group were further divided into two groups (pool 1 and pool 2), and the tissues were cut into small pieces and further digested in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 1.4 mg/mL collagenase H and 100 ⁇ g/mL DNase (Roche) at 37° C. for 40 minutes.
  • the tissue homogenate was passed through a 70 ⁇ m cell strainer (GE Healthcare Life Sciences) and leukocytes were enriched using discontinuous Percoll density gradient centrifugation (37%/80%).
  • CD45+TCR ⁇ +CD4+ T cells infiltrating the CNS (central nervous system) were then separated using a flow cytometer (FACS Aria II, BD Cytometry Systems).
  • the cells were further cultured for 5 hours in the presence of 5 ng/mL phorbol myristate acetate, 500 ng/mL ionomycin (Sigma) and GolgiPlug (BD Biosciences), fixed with Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience), permeabilized, stained with anti-IL-17 antibody and anti-IFN- ⁇ antibody, and analyzed using a FACS Canto II (BD Cytometry Systems).
  • the isolated CD4 positive T cells were stained with anti-CX3CR1 antibody, fixed with Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience), permeabilized, and then further stained with anti-Granzyme B antibody and analyzed.
  • the percentage of IL-17 negative and IFN- ⁇ positive cells (A) and the percentage of Granzyme B positive and CX3CR1 positive cells (B) among the CD45 positive TCR ⁇ positive CD4 positive cells are shown in Table 7.
  • Anti-CD45 antibody (Biolegend), anti-TCR ⁇ antibody (Biolegend), anti-CD4 antibody (Biolegend), anti-IL-17 antibody (Biolegend), anti-IFN- ⁇ antibody (Biolegend), anti-CX3CR1 antibody (Biolegend), and anti-Granzyme B antibody (Biolegend) were used for cell isolation and detection.
  • Humanized 1F8 (h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4) 10-1.
  • Humanization design of 1F8 antibody The m1F8-2 antibody, whose efficacy in vitro and in vivo was confirmed, was humanized. Humanization was performed by CDR grafting from the antibody variable region sequence. The humanized sequence was designed based on the method described in a known paper (Tsurushita et al., Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax. Methods, 36:69-83, 2005).
  • a three-dimensional molecular model of the mouse antibody was created by a standard method.
  • residues in the amino acid sequence of the framework region that are considered to be important for the formation of the CDR structure and residues that are considered to be essential for the reaction with the antigen were estimated.
  • sequences with high homology to the heavy chain variable region and light chain variable region of the anti-hCX3CR1 antibody were searched for in the cDNA sequence database of the heavy chain variable region and light chain variable region of human antibodies.
  • sequences were designed by linking the sequences of the framework part of the searched human antibody sequences with the CDR sequences of each hCX3CR1 antibody, and the sequences of residues that are considered to be essential for the formation of the CDR structure or the reaction with the antigen were further transplanted thereto to design a humanized antibody sequence.
  • the designed sequence is shown in Figure 8.
  • the CDR sequence of the humanized antibody sequence is the same as that of the original mouse antibody, and is the same sequence as the above-mentioned sequence numbers (i.e., sequence numbers 2 to 4 and sequence numbers 10, 7, and 8).
  • sequence numbers 2 to 4 and sequence numbers 10, 7, and 8 are the underlined parts in each amino acid sequence.
  • VH sequences Four types of VH sequences and one type of VL sequence were designed, resulting in four types of humanized 1F8 antibodies (h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4) as combinations of humanized sequences.
  • the humanized 1F8 antibodies (h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4) had binding activity and inhibitory activity similar to the aforementioned m1F8 antibody.
  • the m1F8-1 antibody and m1F8-2 antibody reacted with humans and cynomolgus monkeys, but did not react with mice or rats.
  • the m1F8-1 antibody and m1F8-2 antibody like the m1F8 antibody before activity enhancement, showed cross-reactivity to primate CX3CR1, but did not show cross-reactivity to rodent CX3CR1.
  • the h1F8-2-2 antibody and 306D-hFc reacted with humans and cynomolgus monkeys, but did not react with mice or rats.
  • the h1F8-2-2 antibody and 306D-hFc showed cross-reactivity to primate CX3CR1, but did not show cross-reactivity to rodent CX3CR1.
  • the m1F8-1 and m1F8-2 antibodies were reactive to the expressing cell lines (hCX3CR1, hCX3CR1-2,3,4, mCX3CR1-1) that have the hCX3CR1 extracellular domain 1, while also showing a certain degree of reactivity to hCX3CR1-1, which does not have the hCX3CR1 extracellular domain 1. Furthermore, the m1F8-2 antibody also showed a certain degree of reactivity to mCX3CR1-4, which does not have the hCX3CR1 extracellular domain 1. These results strongly suggested that the m1F8-1 and m1F8-2 antibodies may recognize the three-dimensional structure of CX3CR1, just like the m1F8 antibody before its activity was enhanced.
  • the h1F8-2-2 antibody was reactive to the expression cell lines (hCX3CR1, hCX3CR1-2,3,4, mCX3CR1-1) that have hCX3CR1 extracellular domain 1, but also showed a certain degree of reactivity to the expression cell lines (hCX3CR1-1, mCX3CR1-4) that do not have hCX3CR1 extracellular domain 1.
  • 306D-hFc was reactive only to the expression cell lines that have hCX3CR1 extracellular domain 1.
  • the detection antibody h1F8-2-2 (mFc type) represents a chimeric antibody having Fab of the h1F8-2-2 antibody, which is a humanized h1F8 antibody, and mouse Fc.
  • Synagis a humanized IgG1 antibody, was used as the negative antibody.
  • the reactivity (mean fluorescence intensity) under the condition of cells and secondary antibody only was subtracted and corrected as a background value, and the reactivity of each detection antibody when Synagis was used as a competing antibody was determined based on the reactivity % of each detection antibody in the presence of each competing antibody when the reactivity of each detection antibody was 100%.
  • the relative value to the competing negative antibody was indicated as "+++” if it was higher than 70%, "++” if it was 40-70%, "+” if it was 10-40%, and "-” if it was less than 10%.
  • Ca-influx assay of h1F8-2-2 antibody The in vitro inhibitory activity of h1F8-2-2 antibody against hCX3CR1 expressing cells was evaluated by FKN-induced Ca-influx assay. Ca-influx assay was performed using hCX3CR1 expressing CHO-K1 cells (AequoZen Human Chemokine CX3CR1 Cell Line, CHO-K1 Frozen Cells, PerkinElmer).
  • the cells were suspended in DMEM/F12 (Gibco) medium containing 5 ⁇ M Coelenterazine-h (Promega), 0.1% BSA, and 1% Penicillin-Streptomycin (Nacalai Tesque), and incubated at room temperature for 4 hours. After that, a 3-fold volume of culture medium without Coelenterazine-h was added, the cells were suspended, and incubated for another 30 minutes. Then, an equal volume (25 ⁇ L) of antibody solution was mixed in the wells of a 96-well white plate (Thermo Fisher Scientific), and incubated for 30 minutes.
  • Figure 11(A) shows the results of measuring Ca-influx in the presence of h1F8-2-2 antibody or BII00313 (anti-hCX3CR1-Nanobody) at final concentrations (cells, antibodies, and ligands all added) of 100, 10, and 1 nM. Synagis antibody was used as the negative antibody. Compared to BII00313, h1F8-2-2 antibody showed low Ca-influx inhibitory activity at low concentrations, but showed high inhibitory activity at high concentrations.
  • Figures 11(B) and (C) show the results of measuring Ca-influx in the presence of h1F8-2-2 antibody ( Figure 11(B)) or BII00313 ( Figure 11(C)) at a total of 10 concentrations, with a common ratio of 3 times, with the highest concentration being 300 nM.
  • BII00313 was lower than h1F8-2-2 antibody, while h1F8-2-2 showed a higher maximum inhibitory activity.
  • h1F8-2-2 antibody administration test to human CX3CR1-KI mice (assessment of CX3CR1-expressing cells in the blood)
  • Human CX3CR1-KI female mice aged 8 or 9 weeks were intraperitoneally administered with either untreated or 200 ⁇ g of h1F8-2-2 antibody, BII00313 or Synagis antibody per mouse, and peripheral blood (heparinized whole blood) was collected from the abdominal aorta 1, 3, 5 and 7 days later. 100 ⁇ L of peripheral blood was dispensed into a 96-well plate, and the detection antibody mixture was added and reacted at 4 ° C for 20 minutes.
  • the labeled cells were developed using forward and side scattered light, and the cell population (Singlet) from which cell debris and aggregated cells had been removed was defined as 100%.
  • the percentages of CD45-positive, CD11b-positive, and CD115-positive cells among the Singlet cells are shown in Figure 12 (A) and (B) (A: m1F8-2 staining, B: 66B02-mFc staining).
  • A: m1F8-2 staining, B: 66B02-mFc staining A: m1F8-2 staining, B: 66B02-mFc staining.
  • h1F8-2-2 antibody has the effect of reducing CD115-positive cells.
  • the h1F8-2-2 antibody has the function of reducing CX3CR1 (receptor) itself from the CD115-positive cell membrane, whereas BII00313 has the function of occupying the receptor, but its ability to reduce the amount of CX3CR1 is weaker than that of the h1F8-2-2 antibody.
  • Antibody administration study in human CX3CR1-KI mouse late stage EAE model 16-1 Evaluation of the number of cells infiltrating into the central nervous system by administration of m1F8-2 antibody NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice in which monophasic EAE was induced as in Example 7 were administered 200 ⁇ g of m1F8-2 or its isotype-negative antibody (mIgG2a) 24 and 31 days after EAE induction.
  • mIgG2a isotype-negative antibody
  • 9-2 of Example 9 32 days after EAE induction, the brain and spinal cord were collected and the number of cells infiltrating into the central nervous system was evaluated. Samples from three mice in each antibody administration group were pooled and used.
  • Table 12 shows the percentage of Eomes-positive and IFN- ⁇ -positive cells (A) and the percentage of Eomes-positive and Granzyme B (GZMB)-positive cells (B) among CD45-positive TCR ⁇ -positive CD4-positive cells.
  • Anti-CD45 antibody Biolegend
  • anti-TCR ⁇ antibody Biolegend
  • anti-CD4 antibody Biolegend
  • anti-IFN- ⁇ antibody Biolegend
  • anti-Eomes antibody eBioscience
  • Anti-Granzyme B antibody Biolegend
  • Eomes-positive cells As shown in Table 12A, a decrease in Eomes-positive cells (upper row) or Eomes-positive and IFN- ⁇ -positive cells (lower row) was observed in the group administered m1F8-2 antibody. In addition, as shown in Table 12B, a decrease in Eomes-positive cells (upper row) or Eomes-positive and GZMB-positive cells (lower row) was observed.
  • CD4-positive, Eomes-positive, IFN- ⁇ , or GZMB-positive cells represent toxic Th cells, and this series of results suggested the possibility that the m1F8-2 antibody acts on CX3CR1 to reduce toxic Th cells in the central nervous system, that is, by inhibiting or suppressing the infiltration of toxic Th cells into the CNS, thereby strongly improving the EAE pathology.
  • EAE score evaluation by administration of h1F8-2-2 antibody As in Example 7, monophasic EAE was induced in NR4A2-cKO/human CX3CR1-KI mice, and 24 and 28 days after EAE induction, 200 ⁇ g of h1F8-2-2 or its isotype antibody (Synagis) was administered to the mice, and the EAE pathology of the mice was evaluated. As shown in FIG. 13, EAE pathology was significantly improved in the group administered with h1F8-2-2 antibody.
  • Table 13 shows the percentage of CX3CR1 positive cells, Eomes positive cells, and Eomes positive and CX3CR1 positive cells among CD45 positive TCR ⁇ positive CD4 positive cells.
  • Anti-CD45 antibody Biolegend
  • anti-TCR ⁇ antibody Biolegend
  • anti-CD4 antibody Biolegend
  • anti-Eomes antibody eBioscience
  • anti-CX3CR1 antibody Biolegend
  • Score 0 Normal (no inflammation in any joint)
  • Score 1 Mild but noticeable redness and swelling of the ankle or wrist, or noticeable redness and swelling limited to individual fingers (inflammation in one of the joints)
  • Score 2 Moderate redness and swelling of the ankle or wrist (inflammation in two of any joint)
  • Score 3 Severe redness and swelling of the entire foot, including the fingers (all joints are inflamed)
  • Score 4 Severe inflammation of the limbs involving multiple joints (all joints are inflamed and the entire limb is red and swollen)
  • the present invention can provide an antibody or the like that binds to human CX3CR1.
  • the anti-human CX3CR1 antibody of the present invention can have, for example, activity to inhibit or suppress the interaction or binding between human CX3CR1 and human CX3CL1 (fractalkine), or a function to improve or suppress the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) pathology. It can also be effective as a preventive agent, progression suppressant, or therapeutic agent for progressive immune demyelinating diseases (preferably progressive immune demyelinating diseases of the central nervous system, such as secondary progressive multiple sclerosis (SPMS)).
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • SEQ ID NO:1 Synthetic peptide SEQ ID NO:3: Synthetic peptide SEQ ID NO:4: Synthetic peptide SEQ ID NO:5: Synthetic peptide SEQ ID NO:6: Synthetic peptide SEQ ID NO:9: Synthetic peptide SEQ ID NO:10: Synthetic peptide SEQ ID NO:11: Synthetic peptide SEQ ID NO:12: Synthetic peptide SEQ ID NO:13: Synthetic peptide SEQ ID NO:14: Synthetic peptide SEQ ID NO:15: Synthetic peptide

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、抗ヒトCX3CR1抗体等の提供を課題とする。本発明は、特定のCDR配列を有するヒトCX3CR1に対する抗体又はその抗体断片等に係るものである。

Description

抗ヒトＣＸ３ＣＲ１抗体
　本発明は、ヒトCX3CR1に対する抗体又はその断片、及びその用途に関する。
　CX3CR1は、ケモカイン受容体である、Gタンパク質共役型受容体である。CX3CR1は、NK細胞や細胞障害性T細胞などの細胞障害性リンパ球と成熟マクロファージや粘膜樹状細胞などの病原体や異常な細胞の排除に深く関わる免疫細胞に発現している。この固有のリガンドであるCX3CL1（フラクタルカイン（FKN））は、血管内皮細胞を炎症性サイトカインのTNFやIL-1で処理すると発現が誘導されることが知られており、病変における血管内皮細胞、及び平滑筋細胞の表面に発現して白血球接着を仲介する。FKNはまた、タンパク分解性切断により循環系に放出されて走化性物質として機能する。
　FKNは上記のように炎症時に血管内皮細胞に誘導され、CX3CR1は多種類の白血球に存在していることから、FKNとCX3CR1は、炎症性疾患における病態形成及び進展への関与も強く示唆されている。例えば、間接リウマチ、炎症性腸疾患、ループス腎炎、多発性硬化症などの自己免疫疾患において、その発症や病態に関与していることが示唆されている（非特許文献１）。
　また、ヒトにおいて、低減した活性を有するCX3CR1バリアント（V249I/T280M）は、心血管疾患（非特許文献２）、冠動脈疾患（狭窄の血管造影の証拠）（非特許文献３）、及び頸動脈閉塞性疾患（非特許文献４）のリスクと関連することが示されている。
　上述のように、FKNとCX3CR1との結合により引き起こされる、CX3CR1を発現する免疫細胞の遊走・浸潤抑制による抗炎症作用の治療剤として、これらの結合を阻害することで効果を奏する抗FKN抗体（特許文献１）、抗体類似物質（特許文献２）などが開発されている。また、抗CX3CR1抗体が、多発性硬化症の治療に効果を奏し得る可能性が示唆されている（特許文献３）。
国際公開第2006/046739号 国際公開第2013/130381号 国際公開第2018/101261号
Umehara H, Blood Et, Okazaki T, et al. : Fractalkine in Vascular Biology : From Basic Research to Clinical Disease, Arterioscler Thomb Vasc Biol 24:34-40, 2004. McDermott, 2001; Circ Res 89:401 McDermott, 2003; J. Clin. Invest. 111:1241 Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276
　しかしながら、これらの文献においては、有意な治療効果が示されている疾患はわずかである。
　このような状況下において、CX3CR1を発現する免疫細胞が関与する疾患に対する治療剤の更なる開発が望まれている。本発明の一つの目的は、ヒトCX3CR1に結合し、ヒトCX3CR1を発現する免疫細胞が関与する疾患に対する予防剤、進行抑制剤、治療剤等を提供することであり、例えば、進行型免疫性脱髄疾患（好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、例えば二次進行型多発性硬化症（SPMS））の予防剤、進行抑制剤、治療剤等を提供することである。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、抗CX3CR1抗体及びその抗体断片、並びにその用途（医薬組成物等）等を提供するものである。
［１］ヒトCX3CR1に対する抗体であって、
　重鎖可変領域（VH）の相補性決定領域（CDR）1（CDR-H1）、CDR2（CDR-H2）及びCDR3（CDR-H3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列
からなり、かつ
　軽鎖可変領域（VL）のCDR1（CDR-L1）、CDR2（CDR-L2）及びCDR3（CDR-L3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列、又は
配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列
からなる、
前記抗体。
［２］(a) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる、又は
　(b) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる、
上記［１］に記載の抗体。
［３］ヒトCX3CR1に対する抗体であって、
　重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列が、配列番号1、11、12、13、又は14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列が、配列番号5、9、又は15に示されるアミノ酸配列からなる、
前記抗体。
［４］(a) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる、
　(b) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号9に示されるアミノ酸配列からなる、
　(c) VHのアミノ酸配列が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
　(d) VHのアミノ酸配列が、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
　(e) VHのアミノ酸配列が、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、又は
　(f) VHのアミノ酸配列が、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
上記［３］に記載の抗体。
［５］抗体がヒト化抗体である、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体。
［６］ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する活性を有する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体。
［７］Eomesを発現するTh細胞（ヘルパーT細胞）の機能を阻害又は抑制する活性を有する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体。
　本発明においては、グランザイムB（Granzyme B；GZMB）を発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、機能を阻害又は抑制する活性を有する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体も包含される。
［８］
　Eomesを発現するTh細胞のCNS（中枢神経系、Central nervous system）への浸潤を阻害又は抑制する活性を有する、上記［７］に記載の抗体。
　本発明においては、グランザイムBを発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、CNSへの浸潤を阻害又は抑制する活性を有する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体も包含される。
［９］実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する機能を有する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体。
［１０］進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療に用いるものである、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体。
［１１］進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、上記［１０］に記載の抗体。
［１２］上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体に由来する抗体断片。
［１３］上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体、又は上記［１２］に記載の抗体断片を含む、医薬組成物。
［１４］進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療に用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、上記［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制するために用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１７］Eomesを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制するために用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物。
　本発明においては、グランザイムBを発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、機能を阻害又は抑制するために用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物も包含される。
［１８］Eomesを発現するTh細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制するために用いるものである、上記［１７］に記載の医薬組成物。
　本発明においては、グランザイムBを発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、CNSへの浸潤を阻害又は抑制するために用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物も包含される。
［１９］実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制するために用いるものである、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［２０］上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療方法。
［２１］進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、上記［２０］に記載の方法。
［２２］上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する方法。
［２３］上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、Eomesを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する方法。
　本発明においては、上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、グランザイムBを発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、機能を阻害又は抑制する方法も包含される。
［２４］上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、Eomesを発現するTh細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制する方法である、上記［２３］に記載の方法。
　本発明においては、上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、グランザイムBを発現するTh細胞、又はEomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の、CNSへの浸潤を阻害又は抑制する方法も包含される。
［２５］上記［１３］に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する方法。
［２６］上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体、若しくは上記［１２］に記載の抗体断片を含む、進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制若しくは治療用又は診断用キット。
［２７］進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、上記［２６］に記載のキット。
　本発明によれば、ヒトCX3CR1に結合する抗体等を提供することができる。本発明に係る抗ヒトCX3CR1抗体は、例えば、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する活性や、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する機能を有し得るものである。また、進行型免疫性脱髄疾患（好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、例えば二次進行型多発性硬化症（SPMS））の予防剤、進行抑制剤又は治療剤として効果を発揮し得るものである。
m1F8抗体のヒトCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合活性をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。 m1F8抗体のヒトCX3CR1発現Ba/F3細胞のフラクタルカイン依存性の細胞遊走に対する阻害活性を測定した結果を示す図である。 エピトープ解析のため作製したCX3CR1の細胞外ドメインを入れ替えたキメラCX3CR1発現コンストラクトの模式図である。(A)はヒトCX3CR1をベースにしたものを示す図であり、(B)はマウスCX3CR1をベースにしたものを示す図である。 m1F8抗体を改変したm1F8-1抗体及びm1F8-2抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す図である。各配列中の下線部の領域はCDR配列を示す。 単相型EAEを誘導したNR4A2 /CX3CR1遺伝子変異マウス（ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル）に対して抗CX3CR1-Nanobody（BII00313）を投与した試験結果を示す図である。(A)は血中遊離フラクタルカイン（CX3CL1）量を示す図であり、(B)はEAEスコアを示す図である。 ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデルに対してm1F8-1抗体又はm1F8-2抗体を投与した試験結果を示す図である。(A)は血中遊離フラクタルカイン量を示す図であり、(B)はEAEスコアを示す図である。 ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデルに対してm1F8-2又は抗CX3CR1-Nanobody（BII00313）を投与した試験におけるEAEスコアを示す図である。 ヒト化した４種の1F8抗体（h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す図である。各配列中の下線部の領域はCDR配列を示す。 ヒト、カニクイザル、マウス又はラットCX3CR1発現Ba/F3細胞へのヒト化1F8抗体（h1F8-2-2）又は306D-hFcの結合活性をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。 ヒトとマウスCX3CR1の細胞外ドメインを入れ替えたキメラCX3CR1発現Ba/F3細胞へのh1F8-2-2抗体又は306D-hFcの結合活性をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。 ヒトCX3CR1発現CHO-K1細胞を用いたCa-influxアッセイにおいて、h1F8-2-2抗体又はBII00313のin vitro阻害活性を測定した結果を示す図である。(A)は、h1F8-2-2抗体、BII00313又はSynagisによる阻害活性を同時に測定した結果を示す図であり、(B)は、h1F8-2-2抗体の濃度依存的な阻害活性を測定した結果を示す図であり、(C)は、BII00313の濃度依存的な阻害活性を測定した結果を示す図である。 h1F8-2-2抗体又はBII00313を投与したヒトCX3CR1-KIマウスにおける、末梢血中のCD115陽性細胞割合（(A)：m1F8-2染色,(B)：66B02-mFc染色）、CD115陽性かつCX3CR1陽性細胞割合（(C)：m1F8-2染色、(D)：66B02-mFc染色）、CD115陽性細胞に対するCX3CR1陽性細胞割合（(E)：m1F8-2染色、(F)：66B02-mFc染色）を示す図である。 ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデルに対してh1F8-2-2抗体を投与した試験におけるEAEスコアを示す図である。 ヒトCX3CR1-KIマウスCAIA（抗コラーゲン抗体カクテル誘導関節炎）モデルに対してm1F8-2抗体を投与した試験における関節炎スコアを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2022-205800号明細書（2022年12月22日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．ヒトCX3CR1に対する抗体（抗ヒトCX3CR1抗体）
(１) 抗原の調製
　ヒトCX3CR1（以下、hCX3CR1ともいう）のアミノ酸配列（配列番号17）の情報は、例えば、Uniprotのウェブサイト（https://www.uniprot.org/）に「Primary (citable) accession number：P49238-1」として登録及び公表されており、あるいは、NCBI（GenBank）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に「Accession number：NP_001328.1」として登録及び公表されている。なお、hCX3CR1のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号16）の情報は、NCBI（GenBank）のウェブサイトに「Accession number：NM_001337.3」として登録及び公表されている（なお、当該登録等されている塩基配列中の第93番目～第1160番目の塩基からなる配列が、配列番号16の塩基配列に相当する。）。
　抗原としては、hCX3CR1のアミノ酸配列の全部又は一部を含むポリペプチド又はペプチド（以下、単にペプチドともいう）を使用することができる。
　抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
　ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチド合成の周知方法によって行うことができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、CEM Japan：パラレル型自動ペプチド合成装置 MultiPep 2など）を使用してもよい。
　ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするDNAを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長hCX3CR1遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のDNA領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、PCR法により行うことができる。また当該ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、５’末端にKozak翻訳開始配列、３’側に翻訳終止コドンを挿入したDNAを遺伝子合成することもできる（GENEWIZ社のサービス等を利用）。そして、上記DNAを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）。
　ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、(ａ)培養上清、(ｂ)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
　培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
　抗原となるペプチドは、無細胞合成系を用いたin vitro翻訳により得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム（インビトロジェン社）、PURESYSTEM（登録商標；ポストゲノム研究所）、TNTシステム（登録商標；プロメガ社）等を用いることができる。
　上記のごとく得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
　また抗原は、hCX3CR1のアミノ酸配列（配列番号17）又はその部分配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、hCX3CR1のアミノ酸配列又はその部分配列のうち１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個～10個、さらに好ましくは１個～５個））のアミノ酸が欠失しており、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個～10個、さらに好ましくは１個～５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、１又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１個～10個、さらに好ましくは１個～５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。
　細胞等に導入するための遺伝子としては、hCX3CR1タンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号16に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
　また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号16に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つhCX3CR1と同様の活性や機能を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。
　「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩（ナトリウム）濃度が10～500mMであり、温度が42℃～72℃、好ましくは、上記塩濃度が50～300mMであり、温度が55～68℃での条件をいう。
　遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばGeneArtTM Site-Directed Mutagenesis System （インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
(２) ポリクローナル抗体の作製
　調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。
　抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１週間間隔で、１～10回、好ましくは２～３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３～７日後に、酵素免疫測定法（ELISA又はEIA）や放射性免疫測定法（RIA）等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。
(３) モノクローナル抗体の作製
　(3-1) 抗体産生細胞の採取
　本発明の抗hCX3CR1抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から１～60日後、好ましくは１～14日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。
　(3-2) 細胞融合
　ハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
　ミエローマ細胞としては、例えば、P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) 及びSp2/0-Ag14(Sp2/0)等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。
　次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM及びRPMI-1640培地などの動物細胞用培地中で、1×106～1×107個／mLの抗体産生細胞と2×105～2×106個／mLのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比（抗体産生細胞：ミエローマ細胞）は、限定はされないが、通常、１：１～１０：１とすることが好ましく、より好ましくは３：１である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量1,000～6,000ダルトン(D)のポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　(3-3) ハイブリドーマの選別及びクローニング
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、hCX3CR1に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ELISA、EIA及びRIAなどによってスクリーニングすることができる。
　融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。hCX3CR1に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。
　(3-4) モノクローナル抗体の採取
　樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
　細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、5％CO2濃度）で７～14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
　腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、２～３週間後に腹水を採取することが好ましい。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
　(3-5) クローンの活性及び機能
　(3-5-1)本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用（好ましくは結合）を阻害又は抑制する活性を有する抗体であることが好ましい。
　ここで、hCX3CR1とフラクタルカインとの相互作用の阻害又は抑制活性（％）は、例えば、下記式により算出することができる。
　　阻害又は抑制活性（％）＝ 100－(バックグラウンド補正した、抗体を添加したときの反応性／バックグラウンド補正した、抗体が未添加のときの反応性)×100
　(3-5-2)本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、Eomesを発現するTh細胞（ヘルパーT細胞）の機能を阻害又は抑制する活性を有する抗体であることが好ましい。また、本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、グランザイムBを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する活性を有する抗体、あるいは、Eomes及びグランザイムBを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する活性を有する抗体、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する活性を有する抗体であることも好ましい。ここで、当該機能（Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞の機能、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能）としては、例えば、CNS（中枢神経系、Central nervous system）への浸潤等が挙げられる。
　ここで、Eomes及び／又はグランザイムB、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能の阻害又は抑制活性（％）は、例えば、下記式により算出することができる。
　　阻害又は抑制活性（％）＝ 100－(バックグラウンド補正した、抗体を添加したときの反応性／バックグラウンド補正した、抗体が未添加のときの反応性)×100
　(3-5-3)本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する機能を有する抗体であることが好ましい。
　EAE病態とは、MOGペプチドと結核菌H37Ra死菌を含む完全フロイントアジュバント（CFA）を投与されたC57BL/6マウスに引き起こされる症状を示し、EAEモデルとはヒトにおけるMSの病態をマウスで再現し、その重症度を数値化した基準に則り評価するモデル（試験系）である。
その症状と評価基準は下記のように規定される。
＜EAE評価基準＞
　　0：臨床徴候なし
　　1：尾の部分的麻痺
　　2：弛緩した尾
　　3：後肢の部分的麻痺
　　4：全後肢の麻痺
　　5：後肢及び前肢の麻痺
　本発明の抗hCX3CR1抗体のMSに対する改善又は進行抑制する機能を有する効力は、EAEモデル又は後述する後期EAEモデルによって評価されても良い。
　ここで本願において使用される後期EAEモデルは、進行型MSの症状のみを試験的に再現した特別なマウスモデルであり、NR4A2欠損マウスを用いることにより構築される。さらに本願においては、hCX3CR1に結合する1F8の反応性を本モデルにて確認するために、hCX3CR1をノックインしたマウスと交配させたマウスを用いている（ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル）。
　更に詳しくは、後期EAEモデルはNR4A2欠損マウスではない通常のマウスを用いたEAE試験においてEAE誘導後の初期に見られるEAEスコアの上昇が無く、一方、EAE誘導後一定期間経過後に進行型ＭＳに起因したEAEスコアの上昇のみが観察される（すなわちEAE病態）ため、特に進行型MSを評価するために用いられてよい。
　(3-5-4) 本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制又は治療に用い得るものが好ましい。
　ここで、進行型免疫性脱髄疾患としては、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患が挙げられる。進行型免疫性脱髄疾患としては、進行型多発性硬化症（MS）を挙げることができ、進行型MSには、一次進行型MS（PPMS）と、RRMS病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型MS（SPMS）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型MS（PRMS）が知られている（特許文献３参照）。しかしながら、これら疾患には限定はされず、本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、及び自己免疫性筋炎等の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症を含む心疾患、慢性腎疾患、糖尿病性心疾患、糖尿病性腎疾患、間質性肺疾患、がん（例えば、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん）、COVID-19（新型コロナウイルス感染症）関連中枢神経疾患、並びに、ALS、アルツハイマー病、及び多系統萎縮症等の神経変性疾患等のうちの、いずれか１種又は２種以上の、予防、進行抑制又は治療に用い得るものであってもよい。
　(3-5-5) 本発明の抗hCX3CR1抗体は、限定はされないが、解離定数（Kd値）が1.0×10-10 M以下であることが好ましく、より好ましくは1.0×10-11 M以下であり、さらに好ましくは1.0×10-12 M以下である。
　ここで、抗体の結合能（親和性）は、例えば、スキャッチャード解析やBiacoreと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数(Kd値)、解離速度定数(Kdiss [1/Sec])、結合速度定数(Kass [1/M.Sec])として測定することができる。Biacore装置としては、例えばBiacore 3000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q（いずれもBiacore社）などが挙げられる。抗体は、解離定数（Kd値）が小さい値であるほど結合能（親和性）が高いという点で好ましい。Kd値は、Kdiss及びKassの２つのパラメーターにより決定され、例えば、式：Kd[M]＝Kdiss/Kass により表すことができる。
　(3-6) 抗hCX3CR1抗体のエピトープ
　本発明における抗hCX3CR1抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるhCX3CR1の少なくとも一部の領域であればよい。好ましくは、例えば、hCX3CR1の細胞外ドメインの少なくとも一部の領域であるが、細胞外ドメイン以外の領域もエピトープであってもよい。
　なお、本発明には、本発明における抗hCX3CR1抗体が結合（認識）するエピトープ領域に結合し得る抗体も包含される。
(４) 遺伝子組換え抗体、及び抗体断片
　(4-1) 遺伝子組換え抗体
　本発明の抗hCX3CR1抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体（ヒト化抗体）、及びヒト抗体（完全ヒト抗体）等が挙げられる。
　キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
　ヒト型化抗体を作製する場合は、例えば、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるCDRグラフティング（CDR移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；特表平4-502408号公報（特許第2828340号公報；クイーンら）等を参照）。
　ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（Hyper Variable region）、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431 等を参照）により取得することができる。
　また、ヒト抗体は、ヒトADLib技術（WO 2015/167011に記載されたライブラリー）を用いて、所望の抗原（本発明においてはhCX3CR1）に特異的に結合するクローンから産生された（さらには精製された）抗体や、当該抗体のアミノ酸配列（特に、ＶＨやＶＬのアミノ酸配列、好ましくはＶＨやＶＬ中の少なくとも１つのＣＤＲ配列）を改変したもの（好ましくはアミノ酸置換をしたもの）を用いることもできる。
　上述のキメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体は、限定はされないが、抗体Fc領域におけるN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるものが好ましく、詳しくは、該フコースの１位がN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体が挙げられる。このような抗体であれば、ADCC活性を向上させることができる。なお、この点（抗体Fc領域におけるN-グリコシド結合複合型糖鎖の特徴）は、前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても同様に好ましい。
　本発明の抗hCX3CR1抗体としては、例えば、
　重鎖可変領域（VH）の相補性決定領域（CDR）1（CDR-H1）、CDR2（CDR-H2）及びCDR3（CDR-H3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列
からなり、かつ
　軽鎖可変領域（VL）のCDR1（CDR-L1）、CDR2（CDR-L2）及びCDR3（CDR-L3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列、又は
配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列
からなる
抗体などが好ましく挙げられる。
　より具体的には、本発明の抗hCX3CR1抗体としては、例えば、
　(a) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる抗体、並びに
　(b) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる抗体
などが好ましく挙げられる。
　また、本発明の抗hCX3CR1抗体の、より好ましい態様としては、例えば、
　重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列が、配列番号1、11、12、13、又は14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列が、配列番号5、9、又は15に示されるアミノ酸配列からなる
抗体などが好ましく挙げられる。
　より具体的には、本発明の抗hCX3CR1抗体としては、例えば、
　(a) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる抗体、
　(b) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号9に示されるアミノ酸配列からなる抗体、
　(c) VHのアミノ酸配列が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる抗体、
　(d) VHのアミノ酸配列が、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる抗体、
　(e) VHのアミノ酸配列が、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる抗体、及び
　(f) VHのアミノ酸配列が、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる抗体
などが好ましく挙げられる。
　なお、本発明の抗hCX3CR1抗体として、後述する実施例に例示されている各抗体のうち、m1F8-1抗体、m1F8-2抗体、h1F8-2-1抗体、h1F8-2-2抗体、h1F8-2-3抗体、及びh1F8-2-4抗体それぞれの、VH及びVL、並びにCDR-H1～CDR-H3及びCDR-L1～CDR-L3のアミノ酸配列は、下記表Aに示す配列番号で表されるアミノ酸配列からなるものである。
　(4-2) 抗体断片
　本発明の抗hCX3CR1抗体の断片（部分断片）も、本発明の抗体に含まれるものとする。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗hCX3CR1抗体と同様に、hCX3CR1に対する結合活性を有するもの（すなわちhCX3CR1に結合し得るもの）である。好ましくは、前述した、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する活性を有するものや、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）を阻害又は抑制する活性を有するものや、EAE病態を改善又は進行抑制する機能を有するものや、進行型免疫性脱髄疾患（好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、例えば二次進行型多発性硬化症（SPMS））の予防、進行抑制又は治療に用い得るものである。
　当該抗体の断片としては、抗hCX3CR1ポリクローナル抗体又は抗hCX3CR1モノクローナル抗体の一部分の領域（すなわち、本発明の抗hCX3CR1抗体に由来する抗体断片）を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（H鎖、L鎖、H鎖V領域、及びL鎖V領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化V領域）、並びに、相補性決定領域（complementarity determining region：CDR）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
　Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することもできる。
　F(ab')2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
　Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することもできる。
　scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカー（P）を用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
　diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをペプチドリンカー（P）のアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
　dsFvは、VH及びVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
　CDRを含むペプチドは、VHのCDR（CDR-H1～CDR-H3）及びVLのCDR（CDR-L1～CDR-L3）の中の少なくとも１領域以上を含んで構成され、VHのCDRをすべて含むもの、及びVLのCDRをすべて含むものがより好ましく、VH及びVLのCDR（計6領域）をすべて含むものが特に好ましい。CDRのアミノ酸配列としては、前述したCDR-H1～CDR-H3及びCDR-L1～CDR-L3の各種アミノ酸配列が好ましく挙げられる。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体のVH及びVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
　本発明の抗体断片としては、そのままの形状でN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Fc領域の一部又は全部を含む抗体断片でもよく、また、上述した抗体断片とN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Fc領域の一部又は全部との融合タンパク質であってもよい。このような抗体断片であれば、ADCC活性を飛躍的に向上させることができるため、好ましい。
　以下、本明細書中の説明においては、上述した抗体断片も、本発明の抗hCX3CR1抗体に含まれるものとする。
２．ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体
　本発明においては、上述した本発明の抗hCX3CR1抗体やその抗体断片をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）も提供することができる。当該ポリヌクレオチドとしては、具体的には、上述した本発明の抗hCX3CR1抗体や抗体断片の例示として示した各アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗hCX3CR1抗体や抗体断片をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、当該ポリヌクレオチドを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
　本発明の抗hCX3CR1抗体や抗体断片をコードするポリヌクレオチドとしては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされず、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドDNAを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドDNAを含むものであってもよい。
　本発明においては、上記本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターや、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することもできる。
　組換えベクターとして用いる発現ベクターに組込むポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、SD配列（宿主が原核細胞の場合）及びKozak配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。
　発現ベクターに当該ポリヌクレオチドを組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、レトロウイルスベクター、人工染色体DNAなど、本発明の抗hCX3CR1抗体やその抗体断片をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
　次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明の抗hCX3CR1抗体やその抗体断片を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドDNA等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。
　宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の抗hCX3CR1抗体やその抗体断片を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等の公知の宿主が挙げられる。
　動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ヒト胎児腎細胞、HEK293細胞、293F細胞、CHO細胞、サル細胞COS-7、Vero、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。また、Sf9細胞、Sf21細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
　細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が用いられる。
　植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコBY-2細胞等が用いられる。
　形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、並びに、DNAウイルスやRNAウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
　得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれるポリヌクレオチドのコドン型は、用いた宿主のコドン型と一致していても異なっていてもよく、限定はされない。
３．医薬組成物等
　本発明の抗hCX3CR1抗体（当該抗体由来の断片を含む）は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
　本発明の抗hCX3CR1抗体は、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制及び／又は治療用に使用されることが好ましい。従って、当該医薬組成物は、進行型免疫性脱髄疾患の予防用、進行抑制用及び／又は治療用の医薬組成物として有用である。すなわち、本発明の抗hCX3CR1抗体は、進行型免疫性脱髄疾患の予防剤、進行抑制剤及び／又は治療剤に含まれる有効成分として有用なものである。本発明の医薬組成物の適応対象となる進行型免疫性脱髄疾患については、前述した具体例等の説明を同様に適用できる。
　さらに、本発明の医薬組成物は、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制するために用いる組成物であってもよいし、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）を阻害又は抑制するために用いる組成物であってもよいし、EAE病態を改善又は進行抑制するために用いる組成物であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗hCX3CR1抗体を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、既知の薬剤（進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制及び／又は治療用に使用される既知の薬剤など）と併用することもできる。併用の態様は、例えば、本発明の医薬組成物が、当該既知の薬剤をさらに含む態様であってもよいし、当該既知の薬剤と組み合わせて用いる態様であってもよく、限定はされない。このような併用によりさらに高い予防、進行抑制及び／又は治療効果を得ることもできる。
　「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解又は懸濁することにより製造することができる。
　本発明の抗hCX3CR1抗体由来の抗体断片（中でも低分子のもの）を生体内に投与する場合は、上記に加えて、コロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物（抗体断片）の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem.et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698）。
　本発明の医薬組成物の投与量は、対象となる患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗hCX3CR1抗体の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき600μgから6000mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
　例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１kg体重あたり、100μg～100mgの量を、１日平均あたり１回～数回投与してもよく、好ましくは３日、１週間、１０日又は２週間に１回投与したり、あるいは単回（合計投与回数が１回）投与する態様も採ることができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
　なお、本発明は、腫瘍又は炎症性疾患及び／若しくは自己免疫疾患（以下、腫瘍等ともいう）を治療、予防及び／又は診断する、あるいはhCX3CR1とヒトCX3CL1との相互作用（好ましくは結合）を阻害又は抑制する医薬（薬剤）を製造するための本発明の抗hCX3CR1抗体及び／又は本発明の複合体の使用を提供するものでもある。
　また、本発明は、進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制及び／又は治療用の本発明の抗hCX3CR1抗体、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合の阻害及び／又は抑制用の本発明の抗hCX3CR1抗体、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）の阻害及び／又は抑制用の本発明の抗hCX3CR1抗体、又は、EAE病態の改善及び／又は進行抑制用の本発明の抗hCX3CR1抗体を提供するものでもある。
　さらに本発明は、本発明の抗hCX3CR1抗体を用いる（すなわち対象（患者）に投与する）ことを特徴とする、進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制及び／又は治療方法、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合の阻害及び／又は抑制方法、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）の阻害及び／又は抑制方法、又は、EAE病態の改善及び／又は進行抑制方法を提供するものであり、また、進行型免疫性脱髄疾患を予防、進行抑制及び／又は治療するための、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害及び／又は抑制するための、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）を阻害及び／又は抑制するための、あるいは、EAE病態を改善及び／又は進行抑制するための、本発明の抗hCX3CR1抗体の使用を提供するものでもある。
４．キット
　本発明の抗hCX3CR1抗体は、進行型免疫性脱髄疾患の予防、進行抑制及び／又は治療用キット、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合の阻害及び／又は抑制用キット、Eomes及び／又はグランザイムBを発現するTh細胞、あるいは、Eomes及び／又はIFN-γを発現するTh細胞の機能（例えば、CNSへの浸潤等）の阻害及び／又は抑制用キット、又は、EAE病態の改善及び／又は進行抑制用キットの形態で提供されることもできる。また、本発明の抗hCX3CR1抗体は、進行型免疫性脱髄疾患の診断を行うことができる診断用キットの形態で提供されることもできる。進行型免疫性脱髄疾患については、前述した具体例等の説明を同様に適用できる。
　本発明のキットは、本発明の抗hCX3CR1抗体のほか、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
1.　ヒトCX3CR1（hCX3CR1）に対するモノクローナル抗体の樹立
1-1.　hCX3CR1発現ベクターと抗原の調整
　hCX3CR1タンパク質のアミノ酸配列（Uniprot登録番号：P49238-1）に基づき、当該アミノ酸配列をコードするDNA配列を合成（Genscript社のサービスを利用）し、「In-Fusion HD Cloning Kit」（タカラバイオ社）を用いてpCAGGSベクターに挿入した。Kozak翻訳開始配列を付加したフォワードプライマー、翻訳終止コドンを付加したリバースプライマーと「Premix Ex Taq（Ex Taq version 2.0）」（タカラバイオ社）を用いてDNAを増幅、「pEF6/V5-His TOPO TA Expression kit」（タカラバイオ社）のベクターに挿入し、hCX3CR1発現ベクター（hCX3CR1_pEF6/V5-His）を得た。細胞免疫用抗原及び活性評価細胞の作製のため、hCX3CR1_pEF6/V5-Hisを電気穿孔法によりBa/F3細胞に導入、ブラストサイジン入り選択培地にて培養、フローサイトメーターによりhCX3CR1発現細胞を分離し、安定発現株（hCX3CR1発現Ba/F3細胞）として使用した。また同様の方法で、マウスCX3CR1（mCX3CR1）タンパク質のアミノ酸配列（Uniprot登録番号：Q9Z0D9）に基づき、「pUNO1-mCX3CR1」（invivogen社）を鋳型として、mCX3CR1発現ベクター（mCX3CR1_pEF6/V5-His）及びmCX3CR1発現Ba/F3細胞を作成し、交叉性試験やエピトープ解析試験に供した。
　抗原発現細胞膜画分の調製のため、hCX3CR1_pEF6/V5-His由来のhCX3CR1遺伝子配列をpcDNA3.3（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）に導入した発現ベクター（hCX3CR1_pcDNA3.3）を作製した。次いで、hCX3CR1_pcDNA3.3を導入プラスミドとして「Expi293 expression system」（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）を用いて一過性発現を行った。この培養細胞から膜画分を調製し、PBSに懸濁したものをhCX3CR1発現細胞膜画分（シードサプライ社サービスを利用）とし、抗原として使用した。
　また、リコンビナントタンパク質抗原として、hCX3CR1タンパク質のN末側細胞外ドメイン配列（DQFPESVTENFEYDDLAEACYIGDIVVFGT（配列番号17のアミノ酸配列の第2番目～第31番目の配列））のN末側にGSTを結合させた融合タンパク質又は、ヒト又はマウス抗体のFc領域を結合させた融合タンパク質をExpi293を用いて生産し、精製を行い精製タンパク質を得た。
1-2.　動物免疫
　抗体作製は、以下の方法に基づき各種hCX3CR1抗原をICRマウス（三共ラボサービス社、日本クレア社）等に免疫し行った。
　抗原をアジュバント「Titer MaxGold」（TiterMax社）と混合し、マウス一匹あたりの抗原投与量が200μgとなるように足蹠部に行った。投与後3日後さらにおよそ一週間おきにマウス一匹あたりの抗原投与量が10～50μgとなるよう、アジュバントなしで上記と同様の方法で追加免疫を行った。
1-3.　ハイブリドーマ作製
　免疫後のマウスから単離したリンパ節細胞又は脾臓細胞を用いてhCX3CR1に対するモノクローナル抗体を作製した。免疫終了後、マウスから鼠径、腸骨、膝窩等のリンパ節を採取して細胞懸濁液を調製した後、これをSP2/0-Ag14ミエローマ細胞と混合し、電気式細胞融合装置「ECFG21」（ネッパジーン社）による電気式細胞融合を行った。
　融合後の細胞を「ClonaCell TM-HY MediumD」（STEM CELL社）に懸濁し、プラスチックシャーレに播種した。播種後、10日前後に形成されたコロニーを、予めハイブリドーマ用培地を分注した96ウェルプラスチックプレート中に単離し、その培養上清を用いて抗体のin vitroスクリーニングを行った。なお、ハイブリドーマ用培地としてはRPMI 1640（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）に対し、1/50量のNutridoma-CS（メルク社）及び1/50量のHAT Supplement（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）を添加したものを使用した。
1-4.　in vitro試験系による抗体のスクリーニング
　得られたハイブリドーマクローンのスクリーニングは下記2つの方法で行った。
1-4-1.　結合活性を指標にしたスクリーニング
hCX3CR1発現ラット造血細胞「HTS015C」又はhCX3CR1非発現細胞「HTSCHEM-1」（ともにEurofins社）を播種したプレートに対するハイブリドーマ培養上清の反応性をCell ELISAで評価した。Cell ELISA評価における陽性クローンについては、培養上清又はその精製抗体を使用し、HTS015C又はhCX3CR1発現Ba/F3細胞に対する反応性をフローサイトメーターで評価した。
　測定1～3日前にEurofins社細胞を384ウェルCellBINDプレート（コーニング社）に播種、37℃で培養した。Eurofins社細胞はDMEM high Glucose（ナカライテスク社）に10% FBS（HyClone社）、1% MEM NEAA（Gibco社）、10 mM Hepes（Gibco社）、1% Penicillin-Streptomycin（ナカライテスク社）を加えた培地で培養した。Eurofins細胞培養上清を除去し、ハイブリドーマ培養上清を１ウェルあたり20μLずつ加え、4℃で1時間静置した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-buffered saline；PBS）で洗浄し、ブロッキングバッファー（1%ウシ血清アルブミンを含んだPBS；1% BSA/PBS）で希釈したHRP標識二次抗体を１ウェルあたり20μLずつ加え、4℃で1時間静置した。細胞をPBSで洗浄後、発色基質液としてTMB（ナカイテスク社）を加え発色させ、15分後1N硫酸を加え反応を呈し、450nmの吸光度を測定した。
　上記Cell ELISA陽性クローンについてはさらに、培養上清又はその精製抗体を使用し、HTS015C又はhCX3CR1発現Ba/F3細胞に対する反応性をフローサイトメーターで評価した。陽性クローンの精製抗体は主にrProtein A Sepharose Fast Flowを用いて調整した。
　37.0℃、5% CO2存在下でHTS015C（陰性対照としてHTSCHEM-1）又はhCX3CR1発現Ba/F3細胞（陰性対照として空ベクターを遺伝子導入したBa/F3細胞）を培養した。Ba/F3細胞はRPMI Medium 1640（シグマ社）に10% FBS（HyClone社）、1 ng/mL マウスIL-3（R&D社）、1% Penicillin-Streptomycin（ナカライテスク社）を加えた培地で培養した。接着細胞であるEurofins細胞は非酵素性の細胞剥離液（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）で細胞を回収した。96ウェルプレートに細胞を分注し、遠心により上清を除去した後、ハイブリドーマ培養上清又は1% BSA/PBSで希釈した精製抗体を１ウェルあたり50μLずつ加えて懸濁、4℃で30分間静置した。細胞を1% BSA/PBSで洗浄し、1% BSA/PBSで希釈したPE標識二次抗体を１ウェルあたり50μLずつ加えて懸濁、4℃で30分間遮光静置した。細胞を1% BSA/PBSで洗浄後、1% BSA/PBSで希釈した死細胞検出試薬7-AADを加えて懸濁、FACS Canto II（Becton Dickinson）でハイブリドーマ培養上清又はその精製抗体のhCX3CR1発現細胞への反応性を測定した。
　約30,000ハイブリドーマクローンをスクリーニングした結果、hCX3CR1発現細胞に対して特異的な反応性を有する46クローンを陽性クローンとして選定した。
1-4-2.　細胞遊走（Chemotaxis）阻害活性を指標にしたスクリーニング
　hCX3CR1発現細胞に対する結合活性を有するクローンについて、hCX3CR1のリガンドであるフラクタルカイン（FKN，CX3CL1とも称する。）に対するhCX3CR1発現Ba/F3細胞の遊走阻害活性を評価した。
　細胞の走化性は、ボイデンチャンバー方式で測定した。HTS Transwell 96-well plate, 5μm（コーニング社）の上部にhCX3CR1発現Ba/F3細胞を播種し、下部にヒトFKN（PeproTech社）入り培地を添加し、遊走した細胞をCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社）で測定した。
　hCX3CR1発現細胞は、1% FBSを含む培養液にて100μLあたり5.33×105細胞に調整、37℃で3～6時間培養した後、精製抗体を添加、さらに1時間培養した。上部チャンバーに細胞懸濁液を加え（最終的に75μL、2×105細胞）、下部チャンバーには1% FBSを含む培養液のみ、又は10 ng/mLのヒトフラクタルカインを含む培養液を加え、37℃で一晩培養した。培養後、上部チャンバーを軽く振盪して外し、遊走した細胞を含む下部チャンバーの培養液100μLをCellTiter-Gloと等量混合し、室温で10分静置した後、Enspire Alpha Plate Reader（パーキンエルマー社）で発光を測定した。
　前述の46クローンをhCX3CR1発現Ba/F3細胞の遊走阻害活性を用いて評価した結果、100%近い細胞遊走阻害活性を有するクローン（m1F8）を選定した。当該クローンは、前記1-4-1で述べたように、当初約30,000種ものハイブリドーマクローンからスクリーニングされた、わずか１種の機能的クローンであり、当業者が通常行い得る試行錯誤では到底容易に取得できるとは言えない、極めて取得困難性の高いものである。
2.　抗体配列解析
　m1F8抗体の免疫グロブリン遺伝子可変領域の配列解析を行った。
　m1F8ハイブリドーマ細胞を拡大培養し、mRNAを抽出、5’ RACE法による逆転写、PCR法による抗体可変領域配列の増幅、クローニング、サンガー法による配列解析を行った（GENEWIZ社のサービスを利用）。
　得られた抗体（m1F8抗体）の配列について、Kabatらの方法（Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No.91-3242, US, Department of Health and Human Services, 1991）に従って、CDR領域並びに重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列を決定した。
3.　m1F8抗体の活性評価
3-1.　hCX3CR1発現Ba/F3への結合活性
　m1F8抗体又は陰性抗体を最高濃度500nMとして公比5倍で合計9濃度調整し、hCX3CR1発現Ba/F3細胞に対するm1F8抗体の結合活性をフローサイトメトリーにより測定した結果を図1に示した。陰性抗体としてマウスIgG2aアイソタイプコントロール抗体を使用した。フローサイトメトリーの方法は、実施例１の1-4-1と同様に実施した。図1に示したように、陰性抗体においては抗体濃度を高くしても蛍光強度が高くならず、hCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合が見られなかった。一方、m1F8抗体においては抗体濃度依存的に蛍光強度が高くなり、hCX3CR1発現Ba/F3細胞に対して、m1F8抗体は調整した抗体濃度では未飽和だったものの明らかな反応性を示した。またこの反応性は空ベクターを遺伝子導入したBa/F3細胞では殆ど認められないことから、hCX3CR1発現に依存した、特異的な反応であると考えられた。
3-2.　hCX3CR1発現Ba/F3への細胞遊走阻害活性
　m1F8抗体又は陰性抗体を最高濃度500nMとして公比5倍で合計9濃度調整し、hCX3CR1発現Ba/F3細胞のフラクタルカイン依存性の細胞遊走に対する阻害活性を測定した結果を図2に示した。陰性抗体としてマウスIgG2aアイソタイプコントロール抗体を使用した。細胞遊走試験の方法は、実施例１の1-4-2と同様に実施した。図2に示したように、陰性抗体においては抗体濃度を高くしても細胞遊走に対する阻害は見られなかった。一方、hCX3CR1発現Ba/F3細胞のFKN依存性の細胞遊走に対して、m1F8抗体は500nMで95％以上の阻害活性を示した。
4.　m1F8抗体の他動物種CX3CR1への交差性
　m1F8及び各種抗体のCX3CR1種間交差性（ヒト、カニクイザル、マウス、ラットCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合反応性）の結果を、下記表1に示す。カニクイザル（Uniprot登録番号：A0A2K5VJQ4）、ラット（P35411）に基づき、５’末端にKozak翻訳開始配列、３’側に翻訳終止コドンを挿入したDNAを遺伝子合成した（GENEWIZ社のサービスを利用）。In-Fusion HD Cloning Kitを用いて、制限酵素（BamHI、NotI）で切断したpEF6/V5-His TOPOベクターに合成したDNAを挿入し、各種CX3CR1発現ベクター（カニクイザル：cCX3CR1_pEF6/V5-His、ラット：rCX3CR1_pEF6/V5-His）を得た。hCX3CR1発現Ba/F3細胞の作製（1-1）と同様に、各種CX3CR1発現ベクターを電気穿孔法によりBa/F3細胞に導入、ブラストサイジン入り選択培地にて培養、フローサイトメーターによりCX3CR1発現細胞を分離し、安定発現株として交差性試験に使用した。フローサイトメトリーの方法は、実施例１の1-4-1と同様に実施した。陽性抗体として、本発明者が調製したBoehringer Ingelheim社の66B02-mFc相当品（抗ヒトCX3CR1-NanobodyのmFc融合型タンパク質）及び市販抗マウスCX3CR1抗体SA011F11（Biolegend社）を用いた。細胞あり二次抗体のみ条件での反応性（平均蛍光強度）をバックグランド値として減算補正し、200nMの66B02-mFcにおけるhCX3CR1発現Ba/F3細胞又はcCX3CR1発現Ba/F3細胞に対する反応性を100％とした時、又は同濃度のSA011F11におけるmCX3CR1発現Ba/F3細胞又はrCX3CR1発現Ba/F3細胞に対する反応性を100％とした時の、同濃度のm1F8抗体の反応性％を元にして交差性を判定した。表1の結果において、陽性抗体200nMに対する相対値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
 
　表1に示したように、SA011F11はヒト、カニクイザルには反応せず、マウス、ラットに反応を示した。66B02-mFc, m1F8は、ともに、ヒト、カニクイザルに反応を示し、マウス、ラットには反応を示さなかった。以上のように、m1F8は霊長類CX３CR1へ交差性を示す一方、齧歯類CX3CR1には交差性を示さなかった。
5.　m1F8抗体のエピトープ解析
5-1.　m1F8抗体の結合ドメイン解析
　エピトープ解析のため作製した、ヒトとマウスCX3CR1の細胞外ドメインを入れ替えたキメラCX3CR1発現コンストラクトの模式図を図3に示す。CX3CR1タンパク質配列に存在する4つの細胞外ドメインを一つずつ、ヒトとマウスで入れ替えた遺伝子配列を合成した（GENEWIZ社のサービスを利用）。In-Fusion HD Cloning Kitを用いて、制限酵素（BamHI、NotI）で切断したpEF6/V5-His TOPOベクターに合成したDNAを挿入し、合計8種類のキメラCX3CR1発現ベクターを作製した。hCX3CR1発現Ba/F3細胞の作製（1-1）と同様に、各種CX3CR1発現ベクターを電気穿孔法によりBa/F3細胞に導入、ブラストサイジン入り選択培地にて培養、フローサイトメーターによりCX3CR1発現細胞を分離し、安定発現株として結合ドメイン解析に使用した。
　m1F8及び各種抗体のキメラCX3CR１発現Ba/F3細胞への結合活性の結果を、下記表2、表3に示した。フローサイトメトリーの方法は、実施例１の1-4-1と同様に実施した。陽性抗体として、66B02-mFc相当品及びSA011F11を用いた。陰性抗体としてマウスIgG2aアイソタイプコントロール抗体を使用した。66B02-mFcがhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株（hCX3CR1、hCX3CR1-2,3,4、mCX3CR1-1）に明らかな反応性を示し、SA011F11がmCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株（mCX3CR1、hCX3CR1-1、mCX3CR1-2,3,4）に明らかな反応性を示すことを確認した。この結果を踏まえ、各細胞に対する200nMのコントロール抗体の反応性（平均蛍光強度）で減算補正し、同濃度の66B02-mFcにおける各hCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株に対する反応性を100％とした時、又は同濃度のSA011F11における各mCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株に対する反応性を100％とした時の、同濃度のm1F8抗体の反応性％を元にして結合ドメインを判定した。表2、3の結果において、陽性抗体200nMに対する相対値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
　表2、3に示したように、m1F8はhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株（hCX3CR1、hCX3CR1-2,3,4、mCX3CR1-1）に反応性を示す一方、hCX3CR1細胞外ドメイン1を有しない発現細胞株（hCX3CR1-1、mCX3CR1-4）にも一定の反応性を示した。一方で、別の市販抗hCX3CR1抗体であるK0124E1（Biolegend社）は66B02-mFc同様にhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株にのみ反応性を示した。以上の結果は、m1F8抗体が他の抗体と比して、CX3CR1の立体構造を認識している可能性を強く示唆した。
6.　抗体ビニング
6-1.　1F8抗体と対照抗体のビニング
　1F8及び各種抗体のヒトCX3CR1（hCX3CR1）発現Ba/F3細胞を用いたエピトープビニングの結果を表4に示す。
　表4の左側に示した競合抗体10μMと表上側に示した検出抗体100nMをhCX3CR1発現Ba/F3細胞に添加、懸濁し、4℃で30分間遮光静置した。以降のフローサイトメトリーの方法は、実施例１の1-4-1と同様に実施した。m/h1F8はマウス由来のFabとヒト由来のFcを有するキメラ抗体を表す。対照抗体として、66B02-mFc相当品、306D-hFc相当品（抗hCX3CR1-NanobodyのhFc融合型タンパク質）、K0124E1を用いた。陰性抗体としてヒト化IgG1抗体であるSynagis（palivizumab）相当品（本明細書において「Synagis」と記載する。）を使用した。細胞あり二次抗体のみ条件での反応性（平均蛍光強度）をバックグランド値として減算補正し、競合抗体としてSynagisを用いた際の各検出抗体の反応性をそれぞれ100％とした時の、各競合抗体存在下での各検出抗体の反応性％を元にして結合競合性を判定した。競合陰性抗体に対する相対値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
　表4に示したように、1F8抗体間では非常に強く競合し、対照抗体である66B02-mFc、306D-hFc、K0124E1に対しては顕著に競合しない一方で、対照抗体である306D-hFc抗体は66B02-mFcやK0124E1（市販抗体）と非常に強く競合することを示した。
6-2.　m1F8抗体の活性増強
　先の実施例での結果から、既知の抗CX3CR1抗体と比較して、m1F8抗体が特性面、特にエピトープ認識の点で大きく異なる可能性が高い一方で、CX3CR1への結合活性、阻害活性は非常に低いことが推測された。この欠点を克服するため、ADLib（登録商標）を用いた抗体配列の活性増強の知見を元に、m1F8抗体のCDR配列に人為的に変異を導入し、複数の活性増強m1F8抗体（m1F8-1、m1F8-2）を取得した。得られたm1F8-1とm1F8-2の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列を図4に示す。図4において、各アミノ酸配列中の下線部はCDRを示す。
　　m1F8抗体、2種類の活性増強m1F8抗体（m1F8-1、m1F8-2）、及び、抗hCX3CR1-NanobodyのhCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合活性（EC50）とフラクタルカイン依存性の細胞遊走に対する阻害活性（IC50）を表5に示す。
　表5に示したように、活性増強の結果として、活性増強m1F8抗体（m1F8-1及びm1F8-2）は、元のm1F8抗体と比して最大で70倍以上の結合活性と15倍以上の阻害活性の改善に至った。しかしながら、これらの活性において、依然として、これら活性増強m1F8抗体よりも抗hCX3CR1-Nanobodyの方が高かった。
6-3.　1F8活性増強抗体ビニング
　1F8の活性増強抗体（1F8-1、1F8-2）、及び、抗hCX3CR1-NanobodyのhCX3CR1発現Ba/F3細胞を用いたエピトープビニングの結果を表6に示す。方法は前記6-1と同様に実施した。
　表6に示したように、1F8抗体間又はNanobody間では非常に強く競合する一方、1F8とNanobodyは顕著な競合を示さなかった。
　表4、6の結果から、1F8と他抗体（既知抗体）のエピトープは異なると考えられた。
7.　ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル作製とBII00313投与試験結果
7-1.　遺伝子変異マウスの準備
　使用したマウスはすべて6～8週齢で、特定病原体不在条件下で飼育した。NR4A2欠損マウス（NR4A2-cKO）作製について、loxp配列でNR4A2遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、NR4A2fl/flマウスを樹立した。すなわち、loxp配列に挟まれたNR4A2導入遺伝子をC57BL/6胚性幹細胞にマイクロインジェクションにより導入した。樹立系統をC57BL/6 FLPeマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合NR4A2fl/flC57BL/6マウスを作製した。得られたマウスをC57BL/6 CD4-Cre（タコニック社）と交配させることにより、CD4特異的NR4A2-cKO C57BL/6マウス（C57BL/6 Cre-CD4/NR4A2fl/flマウス＝NR4A2-cKOマウス）を樹立した。マウスCX3CR1をヒトCX3CR1に置換したマウス（ヒトCX3CR1-KIマウス）の作製について、ゲノム編集によりマウスCX3CR1遺伝子をヒトCX3CR1遺伝子に置換した、ヒトCX3CR1-KIマウスを樹立した。すなわち、最初に標的遺伝子（Cx3cr1遺伝子、GeneID:13051）のexon2タンパク質コード領域を標的とするガイドRNA配列を組み込んだ、Cas9発現ベクターを構築した。次に、ノックイン配列（CX3CR1遺伝子、Gene ID:1524、NM_001337.3、CDS領域、1068 bp）を含む人工合成配列と、C57BL/6N由来RENKA株のゲノムからクローニングした相同領域を含んだ相同組換えベクターを構築した。
　次に、ガイドCas9ベクターと相同組換えベクター及び一過性薬剤（Puromycin）耐性遺伝子発現ベクターをエレクトロポレーションによりES細胞（C57BL/6N由来RENKA株）に導入し、薬剤選択培養により形成されたES細胞クローンのコロニーを単離した。次に、相同組換えが確認されたES細胞クローンを用い、ICR系統を受容胚としたアグリゲーション法によりキメラ胚を作製、レシピエント・マウスに移植し、キメラマウスを作製した。生殖系列キメラマウスと野生型マウス（C57BL/6N）を自然交配させて第1世代マウス（KIヘテロマウス）を作製、KIヘテロマウス同士を掛け合わせ、KIホモマウス（ヒトCX3CR1-KIマウス）を作製した。NR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスの作製について、NR4A2-cKOとヒトCX3CR1-KIマウスを交配させ、最終的にCD4-Cre+/-/NR4A2fl/fl/CX3CR1human/humanマウスをKI-後期EAE試験用マウスとして使用した。
7-2.　EAE誘導（単相型EAE）
　100μgのMOG35-55残基に相当するペプチド（東レリサーチセンターにて合成、以下、「MOGペプチド」ともいう。）を含むPBS溶液と1mgの結核菌H37Ra死菌（Difco，米国，カンザス州）を含む完全フロイントアジュバント（CFA）を等量混和し、ソニケーターを用いて乳化させ、MOGエマルジョンを調製した。得られたMOGエマルジョンを、NR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスの背部皮下に1～2か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与後0日目と2日目に、1匹あたり、200ngの百日咳毒素（List Biological Laboratories, 米国）のPBS溶液200μLを、マウスの腹腔内に注射した。
7-3.　KIマウス後期EAEモデル抗体投与試験結果（BII00313）
　単相型EAEを誘導したヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び28日後にPBSを投与した（図5(A), (B)においてそれぞれ、対照群、Controlと記載）。また、NR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び28日後にPBSまたは200μgの抗CX3CR1-Nanobody（BII00313）を投与した（図５(A), (B)においてNR4A2cKO、BII00313と記載）。以下に示すEAE評価基準にしたがい、マウスのEAE病態を評価した。
　＜EAE評価基準＞
　　0：臨床徴候なし
　　1：尾の部分的麻痺
　　2：弛緩した尾
　　3：後肢の部分的麻痺
　　4：全後肢の麻痺
　　5：後肢及び前肢の麻痺
　また、抗体がリガンドと受容体との結合を阻害していることを確認するために、血中内の遊離フラクタルカインを定量した。試験最終日に三種混合麻酔薬（メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール）を腹腔内投与することによりマウスを麻酔し、マウス頸部を切開して採取した血清を用いて血中遊離フラクタルカインを市販のELISAキット（R&D systems, MCX310）で定量した。
　図5（A）に示すように、対照群及びNR4A2cKO群に比して、BII00313投与群で血中遊離フラクタルカイン量は顕著に亢進していた。この変化は、BII00313の投与によってCX3CR1とフラクタルカインの結合が阻害された結果、血中の遊離フラクタルカイン量が増加したためと考えられる。図5（B）に示すように、PBSを投与した群と比較してBII00313を投与した場合、EAE病態の弱い改善が確認された。
8.　ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル抗体投与試験結果（m1F8抗体比較；m1F8-1とm1F8-2との比較）
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び28日後に200μgの抗hCX3CR1抗体（m1F8-1又はm1F8-2）又はそのアイソタイプ抗体（mIgG2a）を投与した。実施例7と同様にマウスのEAE病態を評価した。また、血中フラクタルカインを測定した。
　図6（A）に示すように、アイソタイプ抗体投与群に比して、m1F8抗体投与群で血中遊離フラクタルカイン量は顕著に亢進していた。またm1F8抗体間では（m1F8-1抗体とm1F8-2抗体とでは）有意な差が認められなかった。一方で、図6（B）に示すように、m1F8-2抗体を投与した場合のみ、EAE病態が明らかに改善された。m1F8-1抗体を投与した場合には、1回目の投与後、若干のEAEスコアの改善がみられたが、その後、アイソタイプ抗体投与群のEAEスコアに近くなった。m1F8-1抗体のように、in vitroでの機能的活性（血中遊離フラクタルカイン量の亢進）の良好な結果が、必ずしも、in vivoでの機能的評価（EAE病態の改善）と明確には相応しないものも存在する中で、m1F8-2抗体は、in vitroでの機能的活性も良好な結果でありながら、in vivoでの機能的評価にも優れているものである。m1F8-2抗体のように、in vitro及びin vivoのいずれにおいても機能的に優れた抗hCX3CR1抗体は、当業者が通常行い得る試行錯誤では到底容易に取得できない、極めて取得困難性の高いものである。
9.　ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル抗体投与試験結果（BII00313とm1F8-2抗体比較）
9-1.　EAEスコア
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び27日後に200μgのBII00313、m1F8-2又はそのアイソタイプ抗体（mIgG2a）を投与した。実施例7と同様にマウスのEAE病態を評価した。
　図7に示すように、m1F8-2を投与した群において、特に強くEAE病態が改善された。
9-2.　中枢神経系への浸潤細胞数評価
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後、28日後及び31日後に200μgのBII00313、m1F8-2又はそのアイソタイプ抗体を投与した。EAE誘導32日後、脳及び脊髄を採材し、中枢神経系に浸潤した細胞数を評価した。具体的には、各抗体投与群6匹のマウスをさらに2群に分け（プール1、プール2）、組織を小さい破片に切断した後、37℃で40分間、1.4 mg/mLのコラゲナーゼH及び100μg/mLのDNase（Roche社）を含有したRPMI 1640培地（Invitrogen社）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを70μm細胞濾過器（GEヘルスケアライフサイエンス社）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（37％/80％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、フローサイトメーターを用いて、CNS（中枢神経系、Central nervous system）へ浸潤したCD45陽性TCRβ陽性CD4陽性T細胞をFACS Aria II（BD Cytometry Systems社）を用いて分離した。表7（A）においては、さらに5 ng/mLのphorbol myristate acetate、500 ng/mLのionomycin（Sigma社）とGolgiPlug（BD Biosciences社）の存在下で5時間培養し、Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience）で固定、膜透過した後に抗IL-17抗体及び抗IFN-γ抗体で染色、FACS Canto II（BD Cytometry Systems社）を用いて解析した。表7（B）においては、分離したCD4陽性T細胞を先に抗CX3CR1抗体で染色、Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience）で固定、膜透過した後に、抗Granzyme B抗体でさらに染色、解析した。CD45陽性TCRβ陽性CD4陽性細胞の内、IL-17陰性かつIFN-γ陽性細胞の割合（A）とGranzyme B陽性かつCX3CR1陽性細胞の割合（B）を表7に示す。細胞の分離、検出には抗CD45抗体（Biolegend社）、抗TCRβ抗体（Biolegend社）、抗CD4抗体（Biolegend社）、抗IL-17抗体（Biolegend社）、抗IFN-γ抗体（Biolegend社）、抗CX3CR1抗体（Biolegend社）、抗Granzyme B抗体（Biolegend社）を使用した。
　表7Aに示したように、m1F8-2抗体を投与した群において、IL-17陰性かつIFN-γ陽性細胞の減少が見られた。加えて、表7Bに示したように、Granzyme B（GZMB）陽性細胞（上段）、及び、GZMB陽性かつCX3CR1陽性細胞（下段）の減少が見られた。CD4陽性IFN-γ陽性細胞やCD4陽性GZMB陽性細胞は傷害性Th細胞（傷害性ヘルパーT細胞）を意味しており、一連の結果はm1F8-2抗体がCX3CR1に作用し、中枢神経系内の傷害性Th細胞を減少させる、すなわち傷害性Th細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制することで、EAE病態を強く改善させた可能性を示唆する。
10.　ヒト化1F8（h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4）
10-1.　1F8抗体のヒト化設計
　in vitro及びin vivoでの薬効が確認されたm1F8-2抗体について、配列のヒト化を行った。抗体可変領域の配列から、CDR移植法によるヒト化を行った。ヒト化配列の設計は、既知の論文（Tsurushita et al., Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax. Methods, 36:69-83, 2005）に記載された方法に基づいて実施した。
　最初に、マウス抗体の3次元分子モデルを定法により作成した。次にこの分子モデルをもとに、フレームワーク領域のアミノ酸配列の中で、CDRの構造形成に重要と考えられる残基、また抗原との反応に必須であると考えられた残基を推定した。並行して、ヒト抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のcDNA配列データベースの中から、抗hCX3CR1抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域に相同性の高い配列を検索した。その後に、検索したヒト抗体配列のフレームワーク部分の配列と各hCX3CR1抗体のCDR配列を連結した配列をデザインし、そこにさらにCDR構造形成あるいは抗原との反応に必須であると考えられた残基の配列を移植して、ヒト化抗体配列をデザインした。デザインされた配列を図8に示す。ヒト化抗体配列の持つCDR配列は、元となったマウス抗体のものと同一であり、前掲の配列番号と同じ配列（すなわち、配列番号2～4並びに配列番号10、7及び8）である。図8において、各アミノ酸配列中の下線部はCDRを示す。
　4種のVH配列、1種のVL配列が設計されたことから、ヒト化配列の組み合わせとして4種のヒト化1F8抗体（h1F8-2-1、h1F8-2-2、h1F8-2-3、h1F8-2-4）が得られた。これらヒト化抗体のhCX3CR1発現Eurofins細胞への結合活性（EC50）とヒトCX3CR1発現Ba/F3細胞のフラクタルカイン依存性の細胞遊走に対する阻害活性（IC50）を評価した。その結果を表8に示した。
　表8に示したように、ヒト化1F8抗体（h1F8-2-1, h1F8-2-2, h1F8-2-3, h1F8-2-4）は、前述のm1F8抗体と同様に、結合活性と阻害活性を有していた。
11.　改変1F8抗体の他動物種CX3CR1への交差性
11-1.　活性増強m1F8抗体（m1F8-1、m1F8-2）の他動物種CX3CR1への交差性
　m1F8-1抗体又はm1F8-2抗体のCX3CR1種間交差性（ヒト、カニクイザル、マウス、ラットCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合反応性）の評価結果を下記表9に示す。実施例4と同様の方法で、フローサイトメトリー、定量を実施し、交差性を判定した。表9の結果において、陽性抗体200nMにおける測定値に対する相対的な測定値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
　表9に示したように、m1F8-1抗体又はm1F8-2抗体はヒト、カニクイザルに反応を示し、マウス、ラットには反応を示さなかった。以上のように、m1F8-1抗体及びm1F8-2抗体は活性増強前のm1F8抗体と同様に、霊長類CX3CR1へ交差性を示す一方、齧歯類CX3CR1には交差性を示さなかった。
11-2.　ヒト化1F8抗体（h1F8-2-2）の他動物種CX3CR1への交差性
　h1F8-2-2抗体又は306D-hFcのCX3CR1種間交差性（ヒト：Human、カニクイザル：Cyno、マウス：Mouse、ラット：Rat CX3CR1発現Ba/F3細胞への結合反応性）の評価結果を、図9に示した。実施例4と同様の方法で、フローサイトメトリーを実施した。陰性抗体であるSynagisの平均蛍光強度に対する相対値を示した。
　図9に示したように、h1F8-2-2抗体及び306D-hFcはヒト、カニクイザルに反応を示し、マウス、ラットには反応を示さなかった。以上のように、h1F8-2-2抗体及び306D-hFcは霊長類CX３CR1へ交差性を示す一方、齧歯類CX3CR1には交差性を示さなかった。
12.　改変1F8抗体のエピトープ解析
12-1.　活性増強m1F8抗体（m1F8-1、m1F8-2）の結合ドメイン解析
　m1F8-1抗体又はm1F8-2抗体のキメラCX3CR1発現Ba/F3細胞への結合活性の評価結果を下記表10に示す。実施例5と同様の方法で、フローサイトメトリー、定量を実施し、結合ドメインを判定した。表10の結果において、陽性抗体200nMにおける測定値に対する相対的な測定値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
　表10に示したように、m1F8-1抗体及びm1F8-2抗体はhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株（hCX3CR1、hCX3CR1-2,3,4、mCX3CR1-1）に反応性を示す一方、hCX3CR1細胞外ドメイン1を有しないhCX3CR1-1にも一定の反応性を示した。さらにm1F8-2抗体はhCX3CR1細胞外ドメイン1を有しないmCX3CR1-4にも一定の反応性を示した。以上の結果は、m1F8-1抗体及びm1F8-2抗体は活性増強前のm1F8抗体と同様に、CX3CR1の立体構造を認識している可能性を強く示唆した。
12-2.　ヒト化1F8抗体（h1F8-2-2）の結合ドメイン解析
　h1F8-2-2抗体又は306D-hFcの結合ドメイン解析の結果を、図10に示した。実施例5と同様の方法で、フローサイトメトリーを実施した。陰性抗体であるSynagisの平均蛍光強度に対する相対値を示した。
　図10に示したように、h1F8-2-2抗体はhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株（hCX3CR1、hCX3CR1-2,3,4、mCX3CR1-1）に反応性を示す一方、hCX3CR1細胞外ドメイン1を有しない発現細胞株（hCX3CR1-1、mCX3CR1-4）にも一定の反応性を示した。一方で、306D-hFcはhCX3CR1細胞外ドメイン1を有する発現細胞株にのみ反応性を示した。以上の結果は、h1F8-2-2抗体も他の1F8抗体と同様に、CX3CR1の立体構造を認識している可能性を強く示唆した。
13.　h1F8-2-2抗体を用いた競合試験
　ヒト化h1F8-2-2抗体又は抗hCX3CR1-NanobodyのhCX3CR1発現Ba/F3細胞を用いた結合競合性試験の結果を表11に示す。方法は実施例6と同様に実施した。
　表11の左側に示した競合抗体10μMと表上側に示した検出抗体100nMをhCX3CR1発現Ba/F3細胞に添加、懸濁し、4℃で30分間遮光静置した。以降のフローサイトメトリーの方法は、実施例6と同様に実施した。検出抗体h1F8-2-2（mFc型）はヒト化h1F8抗体であるh1F8-2-2抗体のFabとマウスFcを有するキメラ抗体を表す。陰性抗体としてヒト化IgG1抗体であるSynagisを使用した。細胞あり二次抗体のみ条件での反応性（平均蛍光強度）をバックグランド値として減算補正し、競合抗体としてSynagisを用いた際の各検出抗体の反応性をそれぞれ100％とした時の、各競合抗体存在下での各検出抗体の反応性％を元にして結合競合性を判定した。競合陰性抗体に対する相対値が、70％より高い場合に「＋＋＋」、40～70％の場合には「＋＋」、10～40％未満の場合には「＋」、10％未満の場合には「－」と示した。
　表11に示したように、h1F8-2-2抗体同士又は抗hCX3CR1-Nanobody同士では非常に強く競合する一方、h1F8-2-2抗体とNanobodyは顕著な競合を示さなかった。この結果から、h1F8-2-2抗体と抗hCX3CR1-Nanobodyのエピトープは異なると考えられた。
14.　h1F8-2-2抗体のCa-influxアッセイ
　h1F8-2-2抗体のhCX3CR1発現細胞に対するin vitroでの阻害活性をFKN誘導性のCa-influxアッセイで評価した。
　Ca-influxアッセイはhCX3CR1発現CHO-K1細胞（AequoZen Human Chemokine CX3CR1 Cell Line, CHO-K1 Frozen Cells、パーキンエルマー社）を用いた。細胞を融解、洗浄した後に、5μM Coelenterazine-h（プロメガ社）、0.1% BSA、1% Penicillin-Streptomycin（ナカライテスク社）を含んだDMEM/F12（Gibco社）培地で懸濁、4時間室温で培養した。その後に3倍量のCoelenterazine-h無しの培養液を添加、懸濁し、さらに30分間培養した後に抗体液を96ウェル白プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィクス社）のウェル内で等量（25μL）混合、30分間培養した。ヒトFKN（PeproTech社）を１ウェルあたり50μLずつ加え、Instrument Control and Evaluation softwareを付属したTriStar2S LB942 Multimode Reader（Berthold Technologies社）で経時的な発光を測定した。最終的な細胞数は１ウェルあたり20,000細胞、FKN濃度は10nM、抗体濃度は図11中に示したように使用した。細胞懸濁液にFKNを添加した後から30秒間、1秒ごとに相対発光量を測定し、FKN添加かつ抗体無しにおける測定間の最大値を100%とした時の各条件における測定間の最大値の相対値を図に示した。
　図11(A)では、最終濃度（細胞、抗体、リガンド全てを添加した状態）で100、10、1nMのh1F8-2-2抗体又はBII00313（抗hCX3CR1-Nanobody）の存在下におけるCa-influxを測定した結果を示す。陰性抗体としてSynagis抗体を使用した。BII00313と比較して、h1F8-2-2抗体は低濃度では低いCa-influx阻害活性を示す一方で、高濃度では高い阻害活性を示した。
　図11(B),(C)では、最高濃度300nMとして公比3倍で合計10濃度のh1F8-2-2抗体（図11(B)）又はBII00313（図11(C)）の存在下におけるCa-influxを測定した結果を示す。IC50の比較ではBII00313の方がh1F8-2-2抗体より低い一方で、最大阻害活性ではh1F8-2-2の方が高い阻害活性を示した。以上の結果から、両者の違いはエピトープのみならず活性面の特徴も異なることが示された。
15.　ヒトCX3CR1-KIマウスに対するh1F8-2-2抗体投与試験（血中CX3CR1発現細胞評価）
　8又は9週齢のヒトCX3CR1-KI雌マウスに対して、未処理（Untreated）又は1匹あたり200μgのh1F8-2-2抗体、BII00313又はSynagis抗体を腹腔内投与し、1、3、5及び7日後に腹部大動脈から末梢血（ヘパリン全血）を回収した。96ウェルプレートに100μLの末梢血を分注し、検出抗体混合物を添加、4℃で20分間反応させた。1×RBC Lysis/Fixation（Biolegend社）を添加、懸濁後に室温で20分間静置し、赤血球を溶解、染色した細胞を固定した。1% FBS/PBSで複数回細胞を洗浄した後、FACSLyricとFlowJo（BD Biosciences社）を用いて解析した。　検出抗体として、標識抗CD45抗体（BD Biosciences社）、抗CD11b抗体（Biolegend社）及び抗CD115抗体（Biolegend社）を使用した。また、抗hCX3CR1抗体については、エピトープの異なる2種の抗体（m1F8-2抗体又は66B02-mFc）をAlexa488標識し、使用した。
　標識細胞を前方散乱光と側方散乱光で展開し、細胞破片や凝集細胞を除去した細胞集団（Singlet）を100%とした。Singlet細胞の中で、CD45陽性、CD11b陽性かつCD115陽性細胞の割合を図12(A),(B)に示した（A：m1F8-2染色、B：66B02-mFc染色）。h1F8-2-2抗体及びBII00313投与群において、投与1日後に50%以上のCD115陽性細胞の減少が見られ、7日後に掛けて経時的に穏やかな回復が見られた。
　Singlet細胞の中で、CD45陽性、CD11b陽性、CD115陽性かつCX3CR1陽性細胞の割合を図12(C),(D)に示した（C：m1F8-2染色、D：66B02-mFc染色）。h1F8-2-2抗体投与群では、投与5日後までm1F8-2陽性及び66B02-mFc陽性細胞はほとんど観察されなかった。一方でBII00313投与群では、投与7日後まで66B02-mFc陽性細胞はほとんど観察されないものの、投与1日後でm1F8-2陽性細胞が認められた。
　さらに、CD115陽性細胞を100%とした時のCX3CR1陽性細胞の割合を図12(E),(F)に示した（E：m1F8-2染色、F：66B02-mFc染色）。h1F8-2-2抗体投与群では、投与5日後までCD115陽性細胞上のm1F8-2陽性及び66B02-mFc陽性細胞はほとんど観察されなかった。一方でBII00313投与群では、投与7日後までCD115陽性細胞上の66B02-mFc陽性細胞はほとんど観察されないものの、投与1日後でm1F8-2抗体陽性細胞が認められた。
　以上の結果から、h1F8-2-2抗体とBII00313は共にCD115陽性細胞を減少させる作用を持つ。加えて、h1F8-2-2抗体はCD115陽性細胞膜上からCX3CR1（受容体）そのものを減衰させる機能を有するのに対し、BII00313は受容体を占有する機能を有する一方でCX3CR1の量を減衰させる機能はh1F8-2-2抗体よりも弱い、という特性の違いを示唆する。
16.　ヒトCX3CR1-KIマウス後期EAEモデル抗体投与試験
16-1.　m1F8-2抗体投与による中枢神経系への浸潤細胞数評価
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び31日後に200μgのm1F8-2又はそのアイソタイプ陰性抗体（mIgG2a）を投与した。実施例9の9-2と同様にEAE誘導32日後、脳及び脊髄を採材し、中枢神経系に浸潤した細胞数を評価した。各抗体投与群3匹のサンプルをプールして使用した。実施例9の9-2と同様に細胞濃縮、刺激、染色、固定、解析した。CD45陽性TCRβ陽性CD4陽性細胞の内、Eomes陽性とIFN-γ陽性細胞の割合（A）と、Eomes陽性とGranzyme B（GZMB）陽性細胞の割合（B）を、表12に示す。細胞の分離、検出には抗CD45抗体（Biolegend社）、抗TCRβ抗体（Biolegend社）、抗CD4抗体（Biolegend社）、抗IFN-γ抗体（Biolegend社）、抗Eomes抗体（eBioscience社）、抗Granzyme B抗体（Biolegend社）を使用した。
　表12Aに示したように、m1F8-2抗体を投与した群において、Eomes陽性細胞（上段）、又はEomes陽性かつIFN-γ陽性細胞（下段）の減少が見られた。加えて、表12Bに示したように、Eomes陽性細胞（上段）、又はEomes陽性かつGZMB陽性細胞（下段）の減少が見られた。CD4陽性Eomes陽性IFN-γ又はGZMB陽性細胞は傷害性Th細胞を意味しており、一連の結果は、m1F8-2抗体がCX3CR1に作用し、中枢神経系内の傷害性Th細胞を減少させる、すなわち傷害性Th細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制することで、EAE病態を強く改善させた可能性を示唆していた。
16-2.　h1F8-2-2抗体投与によるEAEスコア評価
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び28日後に200μgのh1F8-2-2又はそのアイソタイプ抗体（Synagis）を投与し、マウスのEAE病態を評価した。
　図13に示すように、h1F8-2-2抗体を投与した群においてEAE病態が強く改善された。
16-3.　h1F8-2-2抗体投与による中枢神経系への浸潤細胞数評価
　実施例7と同様に単相型EAEを誘導したNR4A2-cKO/ヒトCX3CR1-KIマウスに対して、EAE誘導24日後及び28日後に200μgのh1F8-2-2又はそのアイソタイプ陰性抗体（Synagis）を投与した。上記16-1と同様にEAE誘導31日後、脳及び脊髄を採材し、中枢神経系に浸潤した細胞数を評価した。陰性対照抗体投与群7匹又はh1F8-2-2抗体投与群5匹のサンプルをプールして使用した。上記16-1と同様に細胞濃縮、刺激、染色、固定、解析した。CD45陽性TCRβ陽性CD4陽性細胞の内、CX3CR1陽性細胞の割合、Eomes陽性細胞の割合、Eomes陽性かつCX3CR1陽性細胞の割合を表13に示す。細胞の分離、検出には抗CD45抗体（Biolegend社）、抗TCRβ抗体（Biolegend社）、抗CD4抗体（Biolegend社）、抗Eomes抗体（eBioscience社）、抗CX3CR1抗体（Biolegend社）を使用した。
　表13に示したように、h1F8-2-2抗体を投与した群において、CX3CR1陽性細胞（上段）、Eomes陽性細胞（中段）、又はEomes陽性かつCX3CR1陽性細胞（下段）の減少が見られた。一連の結果から、m1F8-2抗体同様に、h1F8-2-2抗体がCX3CR1に作用し、中枢神経系内の傷害性Th細胞を減少させる、すなわち傷害性Th細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制することで、EAE病態を強く改善させた可能性を示唆していた。
17.　ヒトCX3CR1-KIマウスCAIA（抗コラーゲン抗体カクテル誘導関節炎）モデル抗体投与試験
17-1.　CAIAモデル誘導
　7週齢のヒトCX3CR1-KI雄マウスに1匹あたり5mgの抗コラーゲン抗体カクテル（Chondrex社）を腹腔内投与した。抗体カクテル投与3日後に1匹あたり50μgのLPS（Chondrex社）を腹腔内投与し、CAIAモデルを誘導した。未投与群（Untreated）はカクテル、LPSの替わりに生理食塩水を投与した。
17-2.　m1F8-2抗体投与による関節炎スコア評価
　抗コラーゲン抗体カクテルを投与したヒトCX3CR1-KIマウスに対して、抗体カクテル投与3日後及び10日後に400μgのm1F8-2抗体又はそのアイソタイプ陰性抗体であるmIgG2aを腹腔内投与した。デキサメタゾン（Dex、シグマ社）は陽性対照薬として、抗体カクテル投与3～14日後に毎日6μgを経口投与した。全動物について、四肢の関節炎スコアを抗体カクテル投与1～14日後まで毎日測定した。スコアは、下記の評価基準に従い、指、甲及び手首の3つの関節について観察及び記録し、四肢合計のスコアを示した。
＜関節炎評価基準＞
　スコア0：正常（いずれの関節にも炎症が認められない）
　スコア1：足首や手首の軽度だが明らかな発赤と腫れ、又は個々の指に限定された明らかな発赤と腫れ（いずれかの関節の1つで炎症が認められる）
　スコア2：足首又は手首の中程度の発赤と腫れ（いずれかの関節の2つで炎症が認められる）
　スコア3：指を含む足全体の重度の発赤と腫れ（すべての関節で炎症が認められる）
　スコア4：複数の関節を含む手足の重度の炎症（すべての関節で炎症が認められ肢全体が赤く腫れている）
　図14に示すように、CAIA投与群でヒトCX3CR1-KIマウスにおける関節炎スコアの上昇が確認された。陰性対照であるmIgG2a投与群と比して、陽性対照であるデキサメタゾン投与群で強い関節炎の緩和作用が確認された。また、m1F8-2投与群においても関節炎の緩和作用が確認された。
　本発明によれば、ヒトCX3CR1に結合する抗体等を提供することができる。本発明に係る抗ヒトCX3CR1抗体は、例えば、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する活性や、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する機能を有し得るものである。また、進行型免疫性脱髄疾患（好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、例えば二次進行型多発性硬化症（SPMS））の予防剤、進行抑制剤又は治療剤として効果を発揮し得るものである。
配列番号１：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド

Claims (27)

  1. 　ヒトCX3CR1に対する抗体であって、
    　重鎖可変領域（VH）の相補性決定領域（CDR）1（CDR-H1）、CDR2（CDR-H2）及びCDR3（CDR-H3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
    配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列
    からなり、かつ
    　軽鎖可変領域（VL）のCDR1（CDR-L1）、CDR2（CDR-L2）及びCDR3（CDR-L3）のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
    配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列、又は
    配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列
    からなる、
    前記抗体。
  2. 　(a) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号6、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる、又は
    　(b) CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号2、3及び4に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号10、7及び8に示されるアミノ酸配列からなる、
    請求項１に記載の抗体。
  3. 　ヒトCX3CR1に対する抗体であって、
    　重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列が、配列番号1、11、12、13、又は14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列が、配列番号5、9、又は15に示されるアミノ酸配列からなる、
    前記抗体。
  4. 　(a) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる、
    　(b) VHのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号9に示されるアミノ酸配列からなる、
    　(c) VHのアミノ酸配列が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
    　(d) VHのアミノ酸配列が、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
    　(e) VHのアミノ酸配列が、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、又は
    　(f) VHのアミノ酸配列が、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
    　VLのアミノ酸配列が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる、
    請求項３に記載の抗体。
  5. 　抗体がヒト化抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 　ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する活性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 　Eomesを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する活性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 　Eomesを発現するTh細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制する活性を有する、請求項７に記載の抗体。
  9. 　実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する機能を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  10. 　進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療に用いるものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 　進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、請求項１０に記載の抗体。
  12. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体に由来する抗体断片。
  13. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体、又は請求項１２に記載の抗体断片を含む、医薬組成物。
  14. 　進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療に用いるものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制するために用いるものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  17. 　Eomesを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制するために用いるものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  18. Eomesを発現するTh細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制するために用いるものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 　実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制するために用いるものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  20. 　請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制又は治療方法。
  21. 　進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、ヒトCX3CR1とヒトCX3CL1（フラクタルカイン）との相互作用又は結合を阻害又は抑制する方法。
  23. 　請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、Eomesを発現するTh細胞の機能を阻害又は抑制する方法。
  24. 　請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、Eomesを発現するTh細胞のCNSへの浸潤を阻害又は抑制する方法である、請求項２３に記載の方法。
  25. 　請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）病態を改善又は進行抑制する方法。
  26. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体、若しくは請求項１２に記載の抗体断片を含む、進行型免疫性脱髄疾患、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患；自己免疫疾患、好ましくは関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、又は自己免疫性筋炎；アテローム性動脈硬化症を含む心疾患；慢性腎疾患；糖尿病性心疾患；糖尿病性腎疾患；間質性肺疾患；がん、好ましくは乳がん、前立腺がん、又は結腸直腸がん；COVID-19関連中枢神経疾患；あるいは神経変性疾患、好ましくはALS、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症の予防、進行抑制若しくは治療用又は診断用キット。
  27. 　進行型免疫性脱髄疾患が、二次進行型多発性硬化症（SPMS）である、請求項２６に記載のキット。
     
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