WO2024127890A1 - 組換えタンパク質産生細胞の培養方法 - Google Patents

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WO2024127890A1
WO2024127890A1 PCT/JP2023/040999 JP2023040999W WO2024127890A1 WO 2024127890 A1 WO2024127890 A1 WO 2024127890A1 JP 2023040999 W JP2023040999 W JP 2023040999W WO 2024127890 A1 WO2024127890 A1 WO 2024127890A1
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WO
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recombinant protein
single cell
culturing
plate
cell
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PCT/JP2023/040999
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裕一 引地
額郎 原田
一也 辻岡
寛 田原
Original Assignee
ヤマハ発動機株式会社
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing cells that produce recombinant proteins.
  • Patent Document 1 discloses a culture method using alginate gel, which is a spheroid culture technique.
  • the object of the present invention is to provide a method for culturing recombinant protein-producing cells that can efficiently identify cell lines that produce large amounts of recombinant protein.
  • a method for culturing recombinant protein-producing cells includes the steps of injecting a cell suspension containing a large number of single cells capable of producing recombinant protein in a medium into a plate having a large number of storage compartments partitioned into microscopic sizes, and causing each of at least some of the storage compartments to retain the medium and one single cell, gelling the medium in the storage compartment, allowing the single cell in the storage compartment to produce a recombinant protein, and adding to the plate a liquid containing a detection protein capable of binding to the recombinant protein produced by the single cell in the gelled medium.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process flow of a method for culturing antibody-producing cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a plan view with an enlarged view showing the structure of the first plate.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along line IIB-IIB of FIG. 2A.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing a state in which cells are seeded onto a first plate.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing a process of gelling the culture medium in the microgrid.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing the steps of primary culture, which allows a single cell to produce an antibody.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process flow of a method for culturing antibody-producing cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a plan view with an enlarged view showing the structure of the first plate.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view
  • FIG. 6A is a schematic cross-sectional view showing a state in which a liquid medium containing a detection antibody is added to a first plate.
  • FIG. 6B is a schematic cross-sectional view showing a cleaning state.
  • FIG. 7A is a plan view showing a process of identifying a microgrid that retains a single cell with a high antibody production.
  • FIG. 7B is a plan view showing a step of identifying a microgrid that retains a single cell with a high antibody production.
  • FIG. 8(A) is a schematic cross-sectional view showing the situation of picking a single cell with a suction tip.
  • FIG. 8B is a schematic diagram showing a step of transferring the picked single cell onto a second plate.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional view showing a process of discharging a single cell from the suction tip onto a second plate and holding the single cell on a microgrid.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view showing a process of establishing a microculture environment by medium aspiration.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view showing a state in which the opening of the microgrid is sealed with a sealing liquid.
  • FIG. 12 is an image showing the proliferation status of a single cell in the second culture on the second plate.
  • FIG. 13 shows images of the proliferation status of a single cell using the culture method of the comparative example.
  • FIG. 14 shows images of the proliferation status of a single cell using the culture method of the comparative example.
  • the subject of culturing in the present invention is a single cell that produces a recombinant protein.
  • a single cell such as a CHO cell or a B cell, that is expected to be used in the manufacture of antibody pharmaceuticals or to produce antibodies.
  • the culturing method shown in this embodiment is, roughly speaking, a method for mass-producing antibodies by culturing prepared single cells for a certain period of time, selecting single cells with excellent antibody production ability, and further culturing and growing the single cells.
  • the culture method of this embodiment includes steps S1 to S9, which are performed in sequence.
  • a large amount of single cells capable of producing antibodies are produced using a predetermined technique (step S1).
  • the produced single cells are seeded together with culture medium onto a first plate 1 ( Figures 2A and 2B) equipped with a large number of cell-containing sections (step S2).
  • a predetermined technique step S1
  • the produced single cells are seeded together with culture medium onto a first plate 1 ( Figures 2A and 2B) equipped with a large number of cell-containing sections
  • primary culture is performed in which the single cells are cultured in the cell-containing sections for a predetermined number of days (step S3/ Figure 5).
  • a detection antibody that binds to the antibody produced by the single cells is added (FIG. 6A), and screening is performed to identify high antibody-producing cell lines (FIGS. 7A, 7B) (step S4).
  • the identified high antibody-producing cell line is picked up with the suction tip 23 and transferred to a second plate 5 equipped with a large number of cell storage sections (step S5/FIGS. 8A, 8B). Then, the picked single cell, which is a high antibody-producing cell line, is discharged from the suction tip 23 onto the second plate 5 filled with liquid medium (step S6/FIG. 9).
  • the liquid medium is aspirated from the second plate 5 to establish a very small culture environment in which single cells are cultured in individual cell storage sections, i.e., a culture environment with an extremely small culture area (step S7/ Figure 10). Furthermore, the upper surface of the second plate 5 is sealed with a sealing liquid to prevent evaporation of the medium (step S8/ Figure 11). Thereafter, a secondary culture is performed in which single cells are cultured in the cell storage sections for a predetermined number of days (step S9/ Figure 12). Each of the above steps S1 to S9 is described in detail below.
  • Step S1 Preparation of antibody-producing single cells
  • a specific gene is introduced into a single cell to be cultured, thereby imparting the single cell with the ability to produce an antibody.
  • An example of the single cell is a B cell, which is an immune cell, and an example of the antibody produced is a monoclonal antibody produced by a single type of B cell.
  • the gene can be introduced by a chemical method such as transfection, a physical method such as electroporation, or a biological method such as a viral vector. It is desirable to adopt a method in which the single cell into which the gene has been introduced is cultured in a normal culture medium for two days, and then the culture medium is replaced with a selective medium suitable for the single cell to be cultured. Of course, the single cell may be cultured in a selective medium immediately after the gene introduction.
  • Step S2 Seeding cells onto the first plate
  • the single cells prepared in step S1 are seeded on a culture plate for primary culture.
  • Fig. 2A is a plan view with an enlarged view showing the structure of a first plate 1 (plate) as an example of the culture plate
  • Fig. 2B is a cross-sectional view taken along line IIB-IIB in Fig. 2A.
  • the first plate 1 includes a grid 11 consisting of recesses arranged in a matrix on one side of a flat substrate, and a microgrid 12 (receiving portion) consisting of minute recesses arranged in a matrix within each grid 11.
  • the grid 11 is a large partition that divides a relatively large area of the first plate 1.
  • FIG. 2 shows an example of a grid 11 that is rectangular in top view and divided by vertical and horizontal grid plates.
  • a structure in which well-shaped grids 11 that are circular in top view are arranged in a honeycomb or matrix shape may be used.
  • the microgrid 12 is a small partition that further divides the inside of each grid 11.
  • the microgrid 12 is a rectangular recess in top view that is formed on the bottom plate of the grid 11 and is divided by side plates that are lower than the grid plates that divide the grid 11. This microgrid 12 may also be a circular well-shaped structure in top view.
  • the microgrid 12 serves as a container for holding a single cell.
  • An example of the size of the microgrid 12 is a side of 200 ⁇ m and a depth of 100 ⁇ m.
  • the first plate 1 is a plate having a large number of containers partitioned into such minute sizes.
  • the microgrid 12 is desirably set to a size capable of forming a minute culture space, and can be set to a size selected from the range of an opening area of 4.0 ⁇ 10 ⁇ 2 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 mm 2 and a volume of 4.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mm 3 , more desirably, an opening area of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 mm 2 and a volume of 2.0 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mm 3 .
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing the situation in which single cells C are seeded on the first plate 1.
  • a cell suspension 2L is prepared in which a large number of single cells C capable of producing antibodies, which were prepared in step S1, are contained in a liquid medium LA.
  • the cell suspension 2L is contained in a dispensing container 21 and is poured into each grid 11 of the first plate 1.
  • the microgrids 12 among the many microgrids 12 in the grid 11 hold the liquid medium LA and one single cell C.
  • the 2 L cell suspension contains the liquid medium LA and a gelling agent that immobilizes the liquid medium LA.
  • the liquid medium LA may be a normal culture medium that contains growth factors such as inorganic salts, glucose, and amino acids in an aqueous medium, and additives such as antibiotics and growth-promoting factors.
  • CH150 medium product name of G-MEP Co., Ltd.
  • the liquid medium LA containing alginate has the property of gelling quickly when a gelling agent containing, for example, calcium ions or magnesium ions is added, so that it has the advantage that the subsequent gelling process can be completed quickly.
  • Step S3 Primary culture
  • the liquid medium LA in the microgrid 12 is gelled, and then a single cell C is cultured in the microgrid 12 for a certain period of time to allow the single cell to produce an antibody.
  • Fig. 4 is an enlarged cross-sectional view of the microgrid 12, and is a schematic diagram showing the step of gelling the liquid medium LA in the microgrid 12.
  • Each microgrid 12 is partitioned by a bottom plate 121 and a side plate 122.
  • a gelling agent is added.
  • CaCl 2 can be used as the gelling agent.
  • the liquid medium LA in the microgrid 12 becomes a gel medium LB.
  • the single cell C in the microgrid 12 is immobilized by the gel medium LB. It is desirable to adjust the height of the gel medium LB to the same height as the top 123 of the side plate 122 or to a height slightly lower. This allows a state in which one single cell C is confined in the gel medium LB of one microgrid 12. Note that the height of the gel medium LB may be slightly higher than the top 123, or the gel media LB of adjacent microgrids 12 may be connected to each other.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing the process of primary culture to give single cells an antibody production period.
  • a gelling agent e.g., 30 minutes
  • the liquid medium LA is poured into the first plate 1.
  • the upper part of the microgrid 12 equipped with the gel medium LB is covered with the liquid medium LA.
  • single cells C are subjected to primary culture for a predetermined antibody production period, whereby single cells C can be made to proliferate and produce antibodies for each microgrid 12.
  • a camera 13 is disposed on the upper surface of the first plate 1.
  • the microgrid 12 of the first plate 1 is photographed by the camera 13, and the state is monitored.
  • the primary culture period is, for example, about 4 to 8 days.
  • FIG. 6A is a schematic diagram showing the state several days after the primary culture.
  • a single cell C in the microgrid 12 has produced antibody 3.
  • the liquid medium LA is replaced.
  • the replacement liquid medium LA contains a detection antibody 4 capable of binding to the antibody 3 produced by the single cell C in the gel medium LB.
  • FIG. 6A shows the state in which the liquid medium LA containing the detection antibody 4 has been added to the first plate 1, and some of the detection antibody 4 has bound to the antibody 3.
  • FIG. 6B is a schematic cross-sectional view showing the above-mentioned cleaning state.
  • the initial liquid medium LA shown in FIG. 5 is sucked up by the suction tip (not shown).
  • replacement liquid medium LA containing the detection antibody 4 is prepared.
  • the replacement liquid medium LA is held in the medium supply tip 22 and is poured onto the gel medium LB of the microgrid 12 as shown in FIG. 6B. This type of cleaning is performed about 1 to 3 times during the primary culture period.
  • the dilution rate of the detection antibody 4 in the replacement liquid medium LA should be selected within a range that does not result in an excessive amount of antibody that cannot bind to the antibody 3. If an excess of the detection antibody 4 is contained, a large amount of the detection antibody 4 will float in the liquid medium LA on top of the gel medium LB, and it may not be possible to accurately evaluate the amount of antibody 3 produced by each single cell C.
  • Step S4 is a step of providing a trigger for the reaction of the detection antibody 4 added in step S3, and identifying a microgrid 12 holding single cells C with a high antibody production.
  • the trigger is to irradiate the first plate 1 with light to cause the detection antibody 4 to fluoresce.
  • the detection antibody 4 that binds to those antibodies 3 also increases, and the degree of fluorescence increases. Therefore, a cell line with a high antibody production can be identified simply by evaluating the degree of fluorescence of the detection antibody 4 on a microgrid 12 basis.
  • FIGS. 7A and 7B are plan views showing the process of identifying a microgrid 12 holding single cells C with high antibody production.
  • FIG. 7A shows the state of holding single cells C in the microgrid 12 during the initial stage of primary culture, which is the antibody production period.
  • the matrix-arranged microgrid 12 is assigned addresses of n rows and m columns. Of the n rows and m columns of microgrids 12, grid G1 at n1m4, grid G2 at n2m1, grid G3 at n2m3, grid G4 at n3m3, and grid G5 at n5m4 each hold one single cell C.
  • Grid G6 at n4m1 holds multiple (2) single cells C from the beginning of primary culture.
  • Figure 7B shows the state after the end of the primary culture. With the exception of grid G4, single cells C are proliferating. Figure 7B also shows the state in which light of a specific wavelength is irradiated onto the first plate 1 from a light source (not shown) and fluorescence FL is generated from the detection antibody 4.
  • fluorescence FL is generated with an emission area that exceeds the opening area of the microgrid 12, indicating that single cells C with high antibody production are being cultured.
  • grid G1 although the single cells C have proliferated to four, only fluorescence FL is generated with an emission area that is small compared to the opening area of the microgrid 12.
  • the fluorescence FL in grids G2 and G4 is also small.
  • the amount of antibody production is evaluated based on the degree of generation of fluorescence FL for each microgrid 12.
  • evaluation indices include (1) the generation range of fluorescence FL, (2) the average brightness of fluorescence FL, and (3) the maximum brightness of fluorescence FL.
  • the generation range of fluorescence FL is the ratio of the emission area of fluorescence FL generated from the microgrid 12 to the opening area of the microgrid 12.
  • the fluorescence FL of grids G3 and G5 has an emission area that exceeds the opening area of each microgrid 12, and is evaluated as a high antibody production amount.
  • the emission area of fluorescence FL of grids G1, G2, and G4 is narrow, and the antibody production amount of these is evaluated as low.
  • grids G3 and G5 can be identified as "microgrids 12 in which high antibody-producing cell lines are held.”
  • grid G6 which has held multiple single cells C since the beginning of the antibody production period, is excluded from the above-mentioned specific target.
  • an over-holding grid where multiple single cells C are held in one microgrid 12
  • the first plate 1 is monitored by the camera 13 (FIG. 5) from the beginning of the primary culture, and over-holding grids such as grid G6 are excluded from the evaluation target for the antibody production amount even if they emit a high level of fluorescence FL. This makes it possible to accurately identify the microgrid 12 holding single cells C with high antibody production amounts.
  • Step S5 Picking high antibody-producing cell lines
  • step S5 a single cell C contained in the microgrid 12 identified in the previous step S4 as a grid with a high antibody production amount is picked by the suction tip 23 and transferred to the second plate 5. That is, picking is performed in units of microgrid 12.
  • Fig. 8A is a schematic cross-sectional view showing the state of picking of a single cell C by the suction tip 23, and
  • Fig. 8B is a schematic view showing the step of transferring the picked single cell C to the second plate 5.
  • the suction tip 23 has a tip opening 23T at its lower end for suctioning and discharging the single cell C.
  • the tip opening 23T of the suction tip 23 is aligned in the XY direction with respect to the single cell C as the suction target, and the suction tip 23 is lowered so that the tip opening 23T enters the microgrid 12. Thereafter, negative pressure is generated at the tip opening 23T, so that the single cell C as the suction target is sucked into the suction tip 23 together with the gel medium LB.
  • the XY coordinates of the single cell C can be obtained based on the image of the first plate 1 captured by the camera 13 (FIG. 5). In the suction by the suction tip 23, all the single cells C present in one microgrid 12 identified as having a high antibody production amount may be sucked in one suction operation, or only a portion of them may be sucked in.
  • the suction tip 23 is attached to the head 61 of the head unit 6.
  • the head unit 6 is a unit that can move horizontally (XY directions) along guide rails (not shown).
  • the head 61 is attached to the main body of the head unit 6 so that it can be raised and lowered, and has a lower end where the suction tip 23 is attached.
  • a mechanism for generating negative and positive pressure is built into the lower end of the head 61.
  • the head unit 6 moves in the XY direction to align the tip opening 23T of the suction tip 23 with the single cell C of the suction target.
  • the head 61 moves up and down to move the tip opening 23T toward and away from the microgrid 12 holding the single cell C of the suction target.
  • the head 61 moves up and down to suck or discharge the single cell C from the tip opening 23T.
  • the head 61 generates negative or positive pressure at the lower end of the head 61. After the single cell C of the suction target is sucked by the suction tip 23 attached to each head 61 in the first plate 1, the head unit 6 moves above the second plate 5 (another container) where the second culture is performed.
  • a CELL HANDLER product name of Hyundai Motor Co., Ltd.
  • the operator may manually perform cell picking and cell transfer using a cell suction/discharge tool such as a micropipette.
  • Step S6 Discharge of cells into second plate
  • Step S6 is a step of retaining the single cell C picked by the suction tip 23 in step S5 in a predetermined storage portion of the second plate 5.
  • Fig. 9 is a schematic cross-sectional view showing the step of retaining the single cell C on the second plate 5 by the ejection in step S6.
  • Step S6 includes a step of injecting a predetermined amount of liquid medium into the second plate 5 in advance, and a step of ejecting the single cell C picked on the first plate 1 onto the second plate 5.
  • the second plate 5 is a container with multiple storage sections with openings on the upper surface.
  • a plate with a structure similar to that of the first plate 1 described above with reference to FIG. 2 can be used.
  • FIG. 9 illustrates an example of a second plate 5 with a grid 51 that divides a relatively large area of the second plate 5 and a microgrid 52 that further divides the inside of the grid 51.
  • Each microgrid 52 is the storage section that holds a single cell C.
  • FIG. 9 shows a cross-sectional view of one grid 51.
  • the grid 51 has a grid bottom plate 511 that forms the bottom surface and grid side plates 512 that form the sides.
  • Each microgrid 52 is partitioned by a common grid bottom plate 511 and side plates 521 that form individual sides.
  • the microgrid 52 which serves as a container for holding the single cells C, desirably has a size similar to that of the microgrid 12 of the first plate 1.
  • the microgrid 52 is desirably set to a size capable of forming a minute culture space, and can be set to a size selected, for example, from the range of an opening area of 4.0 ⁇ 10 -2 to 1.0 ⁇ 10 -1 mm 2 and a volume of 4.0 ⁇ 10 -3 to 1.0 ⁇ 10 -2 mm 3 , more desirably from the range of an opening area of 1.0 ⁇ 10 -3 to 1.0 ⁇ 10 -1 mm 2 and a volume of 2.0 ⁇ 10 -5 to 1.0 ⁇ 10 -2 mm 3 .
  • a predetermined amount of liquid medium LA is poured into the second plate 5.
  • the amount of liquid medium LA poured is an amount that causes the liquid level to reach above the tops 522 of the side plates 521 that divide the microgrid 52, as shown in FIG. 9.
  • an amount of liquid medium LA that causes the liquid level to be located above the top opening of the microgrid 52 is poured into the grid 51 of the second plate 5 in advance.
  • the tops 522 of each microgrid 52 are at the same height.
  • the single cells C from one microgrid 12 selected as being a high antibody-producing cell line are discharged from the suction tip 23 onto the second plate 5.
  • this discharge is achieved by facing the tip opening 23T of the suction tip 23 to the opening of the grid 51 and generating a positive discharge pressure at the tip opening 23T.
  • the discharge may be performed by inserting the tip opening 23T into the upper layer of the liquid medium LA in the grid 51, or by inserting the tip opening 23T into the inside of the microgrid 52.
  • This discharge causes one or more single cells C to be held on at least some of the microgrids 52 among the multiple microgrids 52 provided on one grid 51.
  • Step S7 Establishment of a microculture environment by aspirating medium
  • Step S7 is a step of aspirating the liquid medium LA in the second plate 5 to establish a culture environment for an independent single cell C in units of the microgrid 52.
  • the culture environment established here has an extremely small culture area.
  • Fig. 10 is a schematic cross-sectional view showing the operation of step S7.
  • Fig. 10 shows the liquid medium LA in the grid 51 being aspirated by the liquid suction tip 24.
  • the suction by the suction tip 24 is performed from the state shown in FIG. 9 until the liquid level of the liquid medium LA on the grid 51 reaches a state where the top 522 of the side plate 521 of the microgrid 52 is exposed. That is, the liquid medium LA on the grid 51 is removed until the liquid level of the liquid medium LA is approximately equal to the height position of the opening 52H of the microgrid 52.
  • This suction prevents the liquid medium LA in one microgrid 52 from mixing with the liquid medium LA in another microgrid 52. That is, a culture environment is formed in which the culture area for the single cell C is extremely small, consisting of the liquid medium LA in each microgrid 52.
  • the amount of liquid medium LA in one microgrid 52 is, for example, 4 nanoliters.
  • the single cells C are difficult to grow.
  • the grid 51 from which the side plate 521 has been removed and the partitions of the microgrid 52 are eliminated is filled with liquid medium LA, and single cells C are introduced and allowed to grow for a predetermined period of time, the single cells C are difficult to grow.
  • the liquid medium LA is about 4 nanoliters and cultured
  • the proliferation of the single cells C tends to be promoted, coupled with the fact that the cells tend to be adjacent to each other.
  • step S6 it is advantageous for the liquid level of the liquid medium LA to be above the opening 52H, since the single cells C can be held on the microgrid 52 with one discharge operation.
  • medium suction in the subsequent step S7 a culture environment suitable for the culture and proliferation of a small number of single cells C isolated in units of the microgrid 52 can be established.
  • Step S8 is a step of injecting the sealing liquid 7 into the second plate 5 to seal the upper part of the opening 52H of the microgrid 52.
  • Fig. 11 is a schematic cross-sectional view showing a state in which the opening 52H of the microgrid 52 is sealed with the sealing liquid 7. The lower surface of the sealing liquid 7 contacts the top 522 of the side plate 521 of the microgrid 52, closing the opening 52H. In other words, the liquid medium LA and the single cell C are confined within one microgrid 52 by the sealing liquid 7.
  • the sealing liquid 7 for example, an embryo culture oil made of light liquid paraffin or the like can be used.
  • the function required of the sealing liquid 7 is to prevent evaporation of the liquid medium LA in the microgrid 52. Since the liquid medium LA contains moisture, the moisture will evaporate if the sealing liquid 7 is not present. This causes problems such as a decrease or depletion of the amount of liquid medium LA in the microgrid 52 and changes in the medium conditions such as osmotic pressure and pH during the secondary culture period in step S9.
  • the sealing liquid 7 which has an evaporation prevention function, evaporation of the liquid medium LA during the secondary culture period can be suppressed.
  • the sealing liquid 7 is breathability. If the sealing liquid 7 is breathable, the liquid medium LA in the microgrid 52 can be connected to the atmosphere even if the opening 52H of the microgrid 52 is sealed. Therefore, the culture environment of the single cell C in the microgrid 52 can be maintained in a healthy state.
  • the above-mentioned embryo culture oil has both the evaporation prevention function and the breathability, and is therefore suitable as the sealing liquid 7.
  • other liquids and semi-liquids (gels) that have at least an evaporation prevention function may be used as the sealing liquid 7. Needless to say, it is necessary that the specific gravity is lighter than that of the liquid medium LA.
  • the extremely small culture environment established in step S7 can be maintained during the second culture period.
  • the liquid medium LA in the microgrid 52 prevents foreign matter contained in the outside air, such as minute dust particles, mold spores, and bacteria.
  • Another advantage is that the diffusion of active substances emitted by the single cells C cultured in the microgrid 52 can be prevented, promoting the proliferation of the single cells C.
  • Step S9 is a step of culturing single cells C for a predetermined culture period in a state in which openings 52H of microgrid 52 are sealed with sealing liquid 7 as shown in Fig. 11. In other words, this is a step of further culturing the single cells C identified as high antibody-producing cell lines in step S4 for a predetermined period of time in a secondary culture to proliferate them, thereby producing a large amount of antibody 3.
  • liquid medium containing growth factors is filled into grid 51.
  • Figure 12 is an image showing the proliferation status of single cell C in the second culture on the second plate 5.
  • Day 1 in the figure means the state on the first day from the start of the second culture.
  • Figure 12 shows images of a part of the microgrid 52 included in one grid 51 on the first, fourth, fifth, sixth, eighth, eleventh, and eighteenth days from the start of the second culture. Looking at the mutation status of single cell C in the focus grid GA among the multiple microgrids 52, it can be seen that it is proliferating with each passing day.
  • FIGS. 13 and 14 are images of the proliferation status of a single cell using the culture method of the comparative example.
  • FIG. 13 is an image of Comparative Example 1, in which the medium suction in step S7 (FIG. 10) is not performed and the sealing with embryo culture oil in step S8 (FIG. 11) is not performed, that is, the secondary culture is performed immediately after the cell discharge in step S6 (FIG. 9).
  • FIG. 13 shows images from the 1st, 6th, and 11th days after the start of the secondary culture. Looking at the proliferation status of a single cell C in the focus grid GA1 of the multiple microgrids 52, it can be seen that no significant proliferation occurred between the 1st and 11th days.
  • Figure 14 shows an image of Comparative Example 2 in which sealing with embryo culture oil was performed in step S8 without medium suction in step S7 ( Figure 10), i.e., after cell discharge in step S6 ( Figure 9), sealing liquid 7 was poured in a state in which the liquid level of the liquid medium LA was higher than the top 522, and secondary culture was performed.
  • Figure 14 also shows images from the 1st, 6th, and 11th days after the start of secondary culture. Looking at the proliferation status of a single cell C in grid GA2 of interest among multiple microgrids 52, it can be seen that no significant proliferation occurred between the 1st and 11th days.
  • the microgrid 12 in which the detection antibody 4 is detected in large amounts holds a high antibody-producing cell line. In this way, it is possible to culture the single cell C, produce the antibody 3, and detect the antibody production amount for each microgrid 12, so that a cell line with a high antibody production amount can be efficiently identified.
  • the single cell C is held on the microgrid 52 of the second plate 5, the liquid medium LA is removed, and the opening 52H is sealed with sealing liquid 7.
  • a method for culturing recombinant protein-producing cells includes the steps of injecting a cell suspension containing a large number of single cells capable of producing recombinant protein in a medium into a plate having a large number of storage compartments partitioned into microscopic sizes, and causing each of at least some of the storage compartments to retain the medium and one single cell, gelling the medium in the storage compartment, allowing the single cell in the storage compartment to produce a recombinant protein, and adding to the plate a liquid containing a detection protein capable of binding to the recombinant protein produced by the single cell in the gelled medium.
  • the medium in the storage section is gelled.
  • the gelling creates a state in which one single cell is confined in one storage section.
  • the single cell is cultured for a predetermined recombinant protein production period, allowing cell growth and recombinant protein production in each storage section.
  • the amount of recombinant protein production can be evaluated for each storage section. Since the gelling of the medium prevents the single cell from floating, a storage section in which a large amount of the detection protein is detected holds a cell line with high recombinant protein production ability.
  • the single cell capable of producing the recombinant protein is a single cell capable of producing an antibody
  • the detection protein is a detection antibody
  • This embodiment makes it possible to culture single cells, produce antibodies, and detect the amount of antibody produced in each storage section, making it possible to efficiently identify cell lines that produce large amounts of antibodies.
  • a trigger is applied, for example by irradiating the plate with light to cause the detection antibody to fluoresce, and the amount of detection antibody per storage section is detected based on the degree of fluorescence, etc., to identify cell lines that produce a large amount of antibodies.
  • the above culture method may further include a step of picking a single cell held in the identified container and transferring it to another container.
  • the overholding storage sections may contain a mixture of high antibody-producing cell lines and non-producing or low antibody-producing cell lines. According to the above embodiment, the overholding storage sections are excluded from the specific target, so that storage sections that hold single cells with high antibody production can be accurately identified.
  • the container has an opening area of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 mm 2 and a volume of 2.0 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mm 3 .
  • the single cell culture area can be sufficiently miniaturized, making it possible to independently culture a large number of single cells in a limited plate area. This makes it possible to improve the efficiency of culture and the evaluation of antibody production levels.
  • the plate includes a large partition that divides a relatively large area of the plate, and a small partition that further divides the inside of the large partition, and that the small partition is the storage section.
  • This embodiment makes it possible to change the cell type or culture medium for each large compartment, thereby diversifying the culture.
  • Culture media containing alginate have the property of quickly gelling when calcium ions or magnesium ions are added, for example. Therefore, according to the above embodiment, the gelling process can be completed quickly.
  • the above culture method preferably includes a step of introducing a gene into the single cell to impart antibody production ability, and after culturing the gene-introduced single cell in a normal medium for a predetermined period of time, the normal medium is replaced with a selective medium suitable for culturing the single cell.
  • single cells capable of producing antibodies can be successfully proliferated, although the cause has not yet been identified.
  • the present invention described above provides a culture method that can efficiently identify cell lines that produce large amounts of recombinant proteins.

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Abstract

組換えタンパク質産生細胞の培養方法は、微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、前記収容部内の培地をゲル化する工程と、前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む。

Description

組換えタンパク質産生細胞の培養方法
　本発明は、組換えタンパク質を産生する細胞を培養する方法に関する。
　ウィルス感染細胞やがん細胞などの異物の抗原に特異的に結合して前記異物を除去する効能を有する抗体医薬品の開発に当たっては、抗体を産生可能な細胞の培養が不可欠である。細胞の培養方法としては、種々の先行技術が存在する。例えば特許文献１には、スフェロイドの培養技術ではあるが、アルギン酸のゲルを用いた培養方法が開示されている。
　培養した細胞の中から、抗体産生量の高い細胞を特定するスクリーニングが必要となる。特許文献２には、多数のウェル内で培養されている細胞に光を照射し、ウェルから発生する蛍光量に基づいて抗体産生量を評価するスクリーニング方法が開示されている。しかし、汎用のウェルに細胞を播種して培養し、蛍光量を求める方法では、スクリーニングを効率的に行うことが難しい場合があった。
特表２０２１－５１１０７８号公報 特許第６４６１５８０号公報
　本発明の目的は、組換えタンパク質産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能な組換えタンパク質産生細胞の培養方法を提供することにある。
　本発明の一局面に係る組換えタンパク質産生細胞の培養方法は、微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、前記収容部内の培地をゲル化する工程と、前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む。
図１は、本発明の実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法の工程フローを示す図である。 図２Ａは、第１プレートの構造を示す拡大図付きの平面図である。 図２Ｂは、図２ＡのＩＩＢ－ＩＩＢ線断面図である。 図３は、第１プレートへ細胞を播種する状況を示す模式的な断面図である。 図４は、マイクログリッド内の培地をゲル化する工程を示す模式的な断面図である。 図５は、単一細胞に抗体産生期間を与える第１次培養の工程を示す模式的な断面図である。 図６Ａは、第１プレートへ検出用抗体を含有する液体培地を添加した状況を示す模式的な断面図である。 図６Ｂは洗浄の状況を示す模式的な断面図である。 図７Ａは、抗体産生量の多い単一細胞が保持されたマイクログリッドを特定する工程を示す平面図である。 図７Ｂは、抗体産生量の多い単一細胞が保持されたマイクログリッドを特定する工程を示す平面図である。 図８（Ａ）は、吸引チップによる単一細胞のピッキングの状況を示す模式的な断面図である。 図８Ｂは、ピッキングした単一細胞を第２プレートへ移載する工程を示す模式図である。 図９は、吸引チップから第２プレートへ単一細胞を吐出し、マイクログリッドに当該単一細胞を保持させる工程を示す模式的な断面図である。 図１０は、培地吸引により極小培養環境を確立する工程を示す模式的な断面図である。 図１１は、マイクログリッドの開口部を封止液で封止した状況を示す模式的な断面図である。 図１２は、第２プレートでの第２次培養における単一細胞の増殖状況を示す画像である。 図１３は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。 図１４は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。
　以下、本発明に係る組換えタンパク質産生細胞の培養方法の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。本発明で培養対象とされるのは、組換えタンパク質を産生する単一細胞である。以下に示す実施形態では、組換えタンパク質産生細胞の一例として、ＣＨＯ細胞やＢ細胞のような、抗体医薬品製造での使用や抗体産生が期待される単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ）を例示する。本実施形態で示す培養方法は、大略的には、準備した単一細胞を一定期間培養した上で抗体産生能に優れる単一細胞を選別し、当該単一細胞をさらに培養して増殖させることで、抗体を大量に産生させる方法である。
　［培養工程の全体フロー］
　先ず、本実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法の全体フローを、図１に示す工程フローを参照して説明する。本実施形態の培養方法は、順次実施される工程Ｓ１～工程Ｓ９を含む。最初に、所定の手法を用いて抗体を産生可能な単一細胞を大量に作成する（工程Ｓ１）。次に、作成した単一細胞を、培地と共に多数の細胞収容部を備えた第１プレート１（図２Ａ、図２Ｂ）へ播種する（工程Ｓ２）。そして、培地をゲル化（図４）した上で、前記細胞収容部内で単一細胞を所定日数培養する第１次培養を行う（工程Ｓ３／図５）。
　第１次培養の後、前記単一細胞が産生する抗体と結合する検出用抗体を添加し（図６Ａ）、高抗体産生細胞株を特定するスクリーニング（図７Ａ、図７Ｂ）を行う（工程Ｓ４）。特定された高抗体産生細胞株を吸引チップ２３でピッキングし、多数の細胞収容部を備えた第２プレート５へ移動する（工程Ｓ５／図８Ａ、図８Ｂ）。そして、吸引チップ２３から液体培地を張った第２プレート５へ、ピッキングした高抗体産生細胞株である単一細胞を吐出する（工程Ｓ６／図９）。
　続いて、第２プレート５から液体培地を吸引して、単一細胞を個々の細胞収容部内で培養する極小培養環境、すなわち培養エリアが極めて小さい培養環境を確立する（工程Ｓ７／図１０）。さらに、第２プレート５の上面を、培地の蒸発防止用の封止液で封止する（工程Ｓ８／図１１）。しかる後、前記細胞収容部内で単一細胞を所定日数培養する第２次培養を行う（工程Ｓ９／図１２）。以下、上記の工程Ｓ１～Ｓ９の各々について詳述する。
　［工程Ｓ１；抗体産生単一細胞の作成］
　工程Ｓ１では、例えば培養対象の単一細胞に所定の遺伝子を導入することで、当該単一細胞に抗体産生能を付与する。単一細胞としては免疫細胞のＢ細胞を例示でき、産生する抗体としては単一種類のＢ細胞が作るモノクロナール抗体を例示できる。遺伝子の導入は、例えばトランスフェクション等の化学的手法、エレクトロポレーション等の物理的手法、あるいはウィルスベクター等の生物学的手法により行うことができる。遺伝子を導入した単一細胞は、例えば通常の培養培地にて２日間培養し、その後に前記培養培地を培養対象の単一細胞に適した選択培地に置換する手法を採用することが望ましい。もちろん、遺伝子導入の後、直ちに選択培地で単一細胞を培養しても良い。
　［工程Ｓ２；第１プレートへの細胞播種］
　工程Ｓ２では、工程Ｓ１で作成した単一細胞を、第１次培養を行うために培養プレートへ播種する。図２Ａは、前記培養プレートの一例としての第１プレート１（プレート）の構造を示す拡大図付きの平面図、図２Ｂは、図２ＡのＩＩＢ－ＩＩＢ線断面図である。第１プレート１は、平板状の基材の片面にマトリクス配列された凹部からなるグリッド１１と、個々のグリッド１１内にマトリクス配列された微小サイズの凹部からなるマイクログリッド１２（収容部）とを含む。
　グリッド１１は、第１プレート１の比較的大サイズの領域を区分する大区画部である。図２では、縦横のグリッド板で区画された上面視で矩形のグリッド１１を例示している。これに代えて、上面視で円形のウェル型のグリッド１１をハニカム状またはマトリクス状に配列した構造としても良い。マイクログリッド１２は、個々のグリッド１１の内側をさらに細区分する小区画部である。マイクログリッド１２は、グリッド１１の底板上に形成され、グリッド１１を区画するグリッド板よりも低い側板で区画された、上面視で矩形の凹部である。このマイクログリッド１２も、上面視で円形のウェル型としても良い。
　マイクログリッド１２は、単一細胞を保持する収容部となる。マイクログリッド１２のサイズの一例を挙げると、一辺が２００μｍ、深さが１００μｍである。第１プレート１は、このような微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートである。マイクログリッド１２は、微小な培養空間を形成できるサイズに設定することが望ましく、例えば開口面積が４．０×１０－２～１．０×１０－１ｍｍ２、容積が４．０×１０－３～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズ、より望ましくは開口面積が１．０×１０－３～１．０×１０－１ｍｍ２、容積が２．０×１０－５～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズに設定することができる。
　図３は、第１プレート１へ単一細胞Ｃを播種する状況を示す模式的な断面図である。播種に際しては、工程Ｓ１で作成された、抗体を産生可能な単一細胞Ｃの多数個を液体培地ＬＡに含有させた細胞懸濁液２Ｌが準備される。細胞懸濁液２Ｌは分注容器２１に収容され、第１プレート１の各グリッド１１に対して注液される。この注液により、グリッド１１内の多数のマイクログリッド１２のうち、少なくとも一部のマイクログリッド１２には、液体培地ＬＡおよび一個の単一細胞Ｃが保持される。もちろん、複数個の単一細胞Ｃが入り込んでしまったり、単一細胞Ｃが保持されなかったりするマイクログリッド１２も生じる。例えば、一つのグリッド１１に４７５個のマイクログリッド１２が存在する場合に、当該グリッド１１に４００個の単一細胞を播種すると、確率論的には約１／３のマイクログリッド１２が、一個の単一細胞Ｃを保持するグリッドとなる。
　細胞懸濁液２Ｌには、液体培地ＬＡに加え、当該液体培地ＬＡを固定化するゲル材が配合される。液体培地ＬＡとしては、水性媒体に無機塩、ブドウ糖、アミノ酸等の成長因子と、抗生物質、成長促進因子などの添加成分とを含む通常の培養液を用いて良い。例えば、ＣＨ１５０培地（ジーメップ株式会社商品名）を、液体培地ＬＡとして好適に用いることができる。ゲル材としては、液体培地ＬＡを固定化可能である限りにおいて特に制限はないが、アルギン酸塩を用いることが望ましい。アルギン酸塩を含ませた液体培地ＬＡは、例えばカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含むゲル化剤を添加することで、俊敏にゲル化する性質があるので、後続のゲル化の工程を迅速に完遂することができる利点がある。
　［工程Ｓ３；第１次培養］
　工程Ｓ３は、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡをゲル化させた上で、マイクログリッド１２内で単一細胞Ｃを一定期間培養し、当該単一細胞に抗体産生期間を与える工程である。図４は、マイクログリッド１２の拡大断面図であって、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡをゲル化する工程を示す模式図である。各々のマイクログリッド１２は、底板１２１と側板１２２とにより区画されている。
　アルギン酸塩を含む液体培地ＬＡを第１プレート１に注液した後、ゲル化剤が添加される。ゲル化剤としては、例えばＣａＣｌ２を用いることができる。ゲル化剤の添加により、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡはゲル培地ＬＢとなる。マイクログリッド１２内の単一細胞Ｃは、ゲル培地ＬＢにより固定化されることになる。ゲル培地ＬＢの高さは、側板１２２の頂部１２３と同じ高さ、あるいは若干低い高さに調整されることが望ましい。これにより、一つのマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢ内に一つの単一細胞Ｃが閉じ込められた状態を形成できる。なお、ゲル培地ＬＢの高さが、頂部１２３よりも若干高い位置にあっても良いし、隣接するマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢ同士が連なっていても良い。
　図５は、単一細胞に抗体産生期間を与える第１次培養の工程を示す模式的な断面図である。ゲル化剤を添加して一定時間（例えば３０分）静置し、液体培地ＬＡをゲル培地ＬＢに転換させた後、第１プレート１には液体培地ＬＡが注液される。つまり、ゲル培地ＬＢを備えたマイクログリッド１２の上方が液体培地ＬＡで覆われる。この状態で、単一細胞Ｃを所定の抗体産生期間だけ第１次培養することで、マイクログリッド１２毎に単一細胞Ｃに細胞増殖ならびに抗体産生を行わせることができる。第１プレート１の上面にはカメラ１３が配置されている。第１次培養の期間中、第１プレート１のマイクログリッド１２は、カメラ１３によって撮像され、状態監視が行われる。第１次培養の期間は、例えば４日～８日程度である。
　図６Ａは、第１次培養から数日が経過した状態を模式的に示す図である。ここでは、マイクログリッド１２内の単一細胞Ｃが抗体３を産生した状態を示している。第１次培養の期間中には、液体培地ＬＡの交換作業が行われる。交換用の液体培地ＬＡには、ゲル培地ＬＢ内の単一細胞Ｃが産生する抗体３と結合可能な検出用抗体４が含有されている。図６Ａは、第１プレート１へ検出用抗体４を含有する液体培地ＬＡが添加され、その検出用抗体４の一部が抗体３と結合した状態を示している。
　液体培地ＬＡの交換は、第１プレート１へ既に注液されている液体培地ＬＡを吸液し、新たに検出用抗体４入りの液体培地ＬＡを注液する洗浄の態様で行われる。図６Ｂは前記洗浄の状況を示す模式的な断面図である。まず、図５に示した初回の液体培地ＬＡが、図略の吸引チップで吸引される。その後、検出用抗体４入りの交換用液体培地ＬＡが調製される。交換用液体培地ＬＡは培地供給チップ２２に保持され、図６Ｂに示すようにマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢの上へ注液される。このような洗浄は、第１次培養の期間中に１～３回程度行われる。
　交換用液体培地ＬＡにおける検出用抗体４の希釈率は、抗体３と結合できない過剰分が生じ過ぎない範囲に選定することが望ましい。過剰に検出用抗体４を含有していると、ゲル培地ＬＢの上層の液体培地ＬＡ中に多くの検出用抗体４が浮遊し、個々の単一細胞Ｃの抗体３の産生量を正確に評価できないことがある。
　［工程Ｓ４；高抗体産生細胞株のスクリーニング］
　工程Ｓ４は、工程Ｓ３で添加した検出用抗体４を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を特定する工程である。本実施形態では、前記トリガとして第１プレート１に光を照射し、検出用抗体４を蛍光させる例を示す。抗体３の産生量が多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２では、それらの抗体３に結合する検出用抗体４も多くなり、蛍光度合いが大きくなる。従って、マイクログリッド１２単位で検出用抗体４の蛍光度合いを評価するだけで、抗体産生量の多い細胞株を特定できる。
　図７Ａおよび図７Ｂは、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を特定する工程を示す平面図である。図７Ａは、抗体産生期間である第１次培養の初期段階における、マイクログリッド１２での単一細胞Ｃの保持状況を示している。マトリクス配列されたマイクログリッド１２には、ｎ行ｍ列のアドレスが付与されている。ｎ行ｍ列のマイクログリッド１２のうち、ｎ１ｍ４のグリッドＧ１、ｎ２ｍ１のグリッドＧ２、ｎ２ｍ３のグリッドＧ３、ｎ３ｍ３のグリッドＧ４およびｎ５ｍ４のグリッドＧ５には、それぞれ一個の単一細胞Ｃが保持されている。ｎ４ｍ１のグリッドＧ６には、第１次培養の当初から複数個（２個）の単一細胞Ｃが保持されている。
　図７Ｂは、第１次培養の終了後の状態を示している。グリッドＧ４を除いて、単一細胞Ｃは増殖している。また、図７Ｂは、図略の光源から所定波長の光を第１プレート１に照射し、検出用抗体４から蛍光ＦＬを発生させた状態を示している。グリッドＧ３およびグリッドＧ５では、マイクログリッド１２の開口面積を上回る程度の発光面積の蛍光ＦＬが発生しており、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが培養されていることが判る。一方、グリッドＧ１については、単一細胞Ｃは４個に増殖しているものの、マイクログリッド１２の開口面積に対して小さい発光面積の蛍光ＦＬしか発生していない。グリッドＧ２、Ｇ４の蛍光ＦＬも小さい。
　抗体産生量の多少は、マイクログリッド１２毎の蛍光ＦＬの発生度合いによって評価される。評価指標としては、例えば（１）蛍光ＦＬの発生範囲、（２）蛍光ＦＬの平均輝度、（３）蛍光ＦＬの最大輝度、を例示できる。蛍光ＦＬの発生範囲は、マイクログリッド１２の開口面積に対して、そのマイクログリッド１２から発生している蛍光ＦＬの発光面積の占める割合である。図７Ｂの例では、グリッドＧ３、Ｇ５の蛍光ＦＬは、各々のマイクログリッド１２の開口面積を上回る発光面積を有しており、高抗体産生量と評価される。一方、グリッドＧ１、Ｇ２、Ｇ４の蛍光ＦＬの発光面積は狭く、これらの抗体産生量は低評価となる。このような蛍光ＦＬの発生範囲をベースとして、平均輝度および最大輝度がさらに考慮される。平均輝度および最大輝度がより高いグリッドの抗体産生量は高評価となる。ここでは、グリッドＧ３、Ｇ５が「高抗体産生細胞株が保持されたマイクログリッド１２」として特定され得る。
　なお、抗体産生期間の当初から複数個の単一細胞Ｃが保持されていたグリッドＧ６は、前記特定の対象から除外される。一つのマイクログリッド１２に複数個の単一細胞Ｃが保持されてしまった過保持グリッドでは、高抗体産生細胞株と非産生または低抗体産生細胞株とが混在している可能性がある。この場合、後者を後の工程Ｓ５でピッキングしてしまうことが生じ得る。このため、第１次培養の当初からカメラ１３（図５）で第１プレート１を監視し、グリッドＧ６のような過保持グリッドは、たとえ発生度合いの高い蛍光ＦＬを発生していても、抗体産生量の評価対象から除外される。これにより、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を正確に特定することができる。
　［工程Ｓ５；高抗体産生細胞株のピッキング］
　工程Ｓ５では、先の工程Ｓ４で高抗体産生量の多いグリッドとして特定されたマイクログリッド１２に収容された単一細胞Ｃを吸引チップ２３でピッキングし、これを第２プレート５へ移動する。すなわち、ピッキングは、マイクログリッド１２単位で行われる。図８Ａは、吸引チップ２３による単一細胞Ｃのピッキングの状況を示す模式的な断面図、図８Ｂは、ピッキングした単一細胞Ｃを第２プレート５へ移載する工程を示す模式図である。
　吸引チップ２３は、下端に単一細胞Ｃの吸引および吐出を行う先端開口２３Ｔを備える。図８Ａに示すように、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔが吸引ターゲットの単一細胞Ｃに対してＸＹ方向に位置合わせされ、先端開口２３Ｔがマイクログリッド１２内へ進入するよう吸引チップ２３が下降される。その後、先端開口２３Ｔに負圧を発生させることで、吸引ターゲットの単一細胞Ｃがゲル培地ＬＢと共に吸引チップ２３内に吸引される。単一細胞ＣのＸＹ座標は、カメラ１３（図５）による第１プレート１の撮影画像に基づき求めることができる。この吸引チップ２３による吸引では、高抗体産生量と特定された一つのマイクログリッド１２に存在する全ての単一細胞Ｃを１ターンの吸引動作で吸引させても良いし、一部を吸引させても良い。
　図８Ｂに示すように、吸引チップ２３はヘッドユニット６のヘッド６１に装着される。ヘッドユニット６は、図略のガイドレールに沿って水平方向（ＸＹ方向）へ移動可能なユニットである。ヘッド６１は、ヘッドユニット６の本体に昇降可能に取り付けられ、吸引チップ２３が装着される下端部を有している。ヘッドユニット６の本体内には、ヘッド６１の前記下端部に、負圧および正圧を発生させるための機構が内蔵されている。
　ヘッドユニット６のＸＹ移動により、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔと吸引ターゲットの単一細胞Ｃとの位置合わせが行われる。吸引ターゲットの単一細胞Ｃを保持しているマイクログリッド１２に対する先端開口２３Ｔの進退は、ヘッド６１の昇降により実現される。先端開口２３Ｔから単一細胞Ｃの吸引または吐出は、ヘッド６１の前記下端部に負圧または正圧を発生させることで実現される。第１プレート１において、吸引ターゲットの単一細胞Ｃを各ヘッド６１に装着された吸引チップ２３で吸引させたら、ヘッドユニット６が第２次培養を行う第２プレート５（他の容器）の上空へ移動される。以上のような細胞ピッキング並びに細胞移動を自動的に行う装置として、例えばＣＥＬＬ　ＨＡＮＤＬＥＲ（ヤマハ発動機株式会社商品名）を好適に用いることができる。このような自動化装置に代えて、作業者がマイクロピペットなどの細胞吸引・吐出具を用いて、細胞ピッキング並びに細胞移動をマニュアル操作で実行する態様としても良い。
　［工程Ｓ６；第２プレートへの細胞吐出］
　工程Ｓ６は、工程Ｓ５において吸引チップ２３でピッキングした単一細胞Ｃを、第２プレート５の所定の収容部へ保持させる工程である。図９は、工程Ｓ６の前記吐出により、第２プレート５へ単一細胞Ｃを保持させる工程を示す模式的な断面図である。工程Ｓ６は、予め第２プレート５へ所定量の液体培地を注液する工程と、第１プレート１でピッキングした単一細胞Ｃを第２プレート５へ吐出させる工程とを含む。
　第２プレート５は、上面に開口部を有する複数の収容部を備えた容器である。第２プレート５としては、先に図２に基づいて説明した第１プレート１と同様の構造を備えるプレートを用いることができる。図９では、第２プレート５の比較的大サイズの領域を区分するグリッド５１と、このグリッド５１の内側をさらに細区分するマイクログリッド５２とを備える第２プレート５を例示している。各マイクログリッド５２が、単一細胞Ｃを保持する前記収容部である。図９に示されているのは、一つのグリッド５１の断面図である。グリッド５１は、底面を形成するグリッド底板５１１と、側面を形成するグリッド側板５１２とを有している。各マイクログリッド５２は、共通のグリッド底板５１１と、個々の側面を形成する側板５２１とで区画されている。
　単一細胞Ｃを保持する収容部となるマイクログリッド５２は、第１プレート１のマイクログリッド１２と同様なサイズを有していることが望ましい。すなわち、マイクログリッド５２は、微小な培養空間を形成できるサイズに設定することが望ましく、例えば開口面積が４．０×１０－２１．０×１０－１ｍｍ２、容積が４．０×１０－３～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズ、より望ましくは開口面積が１．０×１０－３～１．０×１０－１ｍｍ２、容積が２．０×１０－５～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズに設定することができる。
　単一細胞Ｃの吐出に先立ち、第２プレート５には所定量の液体培地ＬＡが投入される。液体培地ＬＡの投入量は、図９に示すように、マイクログリッド５２を区画する側板５２１の頂部５２２よりも上方に液面が達する量である。換言すると、マイクログリッド５２の上面開口部よりも上方に液面が位置する量の液体培地ＬＡが、予め第２プレート５のグリッド５１に注液される。なお、各マイクログリッド５２の頂部５２２は同じ高さ位置にある。
　その後、吸引チップ２３から、高抗体産生細胞株であるとして選別された一つのマイクログリッド１２分の単一細胞Ｃが、第２プレート５へ吐出される。この吐出は、図９に示すように、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔをグリッド５１の開口に対向させ、先端開口２３Ｔに正の吐出圧を発生させることで実現される。もちろん、先端開口２３Ｔをグリッド５１内の液体培地ＬＡの上層部に突入させて前記吐出を行っても良いし、先端開口２３Ｔをマイクログリッド５２の内部まで進入させて前記吐出を行っても良い。この吐出により、一つのグリッド５１が備える複数のマイクログリッド５２のうち、少なくとも一部のマイクログリッド５２に１個または複数個の単一細胞Ｃが保持される。
　［工程Ｓ７；培地吸引による極小培養環境の確立］
　工程Ｓ７は、第２プレート５の液体培地ＬＡを吸引して、マイクログリッド５２単位で独立した単一細胞Ｃの培養環境を確立する工程である。ここで確立される培養環境は、培養エリアが極めて小さい培養環境である。図１０は、工程Ｓ７の動作を示す模式的な断面図である。図１０では、吸液チップ２４により、グリッド５１内の液体培地ＬＡが吸引されている様子が示されている。
　吸液チップ２４による前記吸引は、図９の状態から、グリッド５１の液体培地ＬＡの液面が、マイクログリッド５２の側板５２１の頂部５２２が露出した状態となるまで行われる。すなわち、液体培地ＬＡの液面が、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈの高さ位置と略一致するまで、グリッド５１の液体培地ＬＡが除去される。このような吸引により、一つのマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡと他のマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡとが混ざり合うことが無くなる。つまり、個々のマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡからなる、単一細胞Ｃのための培養エリアが極めて小さい培養環境が形成される。一つのマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの量は、例えば４ナノリットルである。
　広大な培養環境に１個～１０個程度の少数の単一細胞Ｃを投入する極少培養環境では、当該単一細胞Ｃは増殖し難い。例えば、図１０において側板５２１を取り除いてマイクログリッド５２の区画を無くしたグリッド５１に液体培地ＬＡを注液し、単一細胞Ｃを投入して所定の培養期間を与えても、当該単一細胞Ｃは増殖し難い。一方、液体培地ＬＡが４ナノリットル程度の培養環境に１個～１０個程度の単一細胞Ｃを投入して培養すると、細胞同士が隣接し易いことも相俟って、当該単一細胞Ｃの増殖が促進される傾向が出る。工程Ｓ６の細胞吐出では、液体培地ＬＡの液面が開口部５２Ｈよりも上位にある方が、１回の吐出動作でマイクログリッド５２に単一細胞Ｃを保持させ得るので好都合である。その後の工程Ｓ７で培地吸引を行うことにより、マイクログリッド５２単位で隔離された、少数の単一細胞Ｃの培養・増殖に適した培養環境を確立することができる。
　［工程Ｓ８；マイクログリッドの封止］
　工程Ｓ８は、封止液７を第２プレート５に注液して、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈの上方を封止する工程である。図１１は、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈが、封止液７で封止された状況を示す模式的な断面図である。封止液７の下面は、マイクログリッド５２の側板５２１の頂部５２２に接し、開口部５２Ｈを塞いでいる。すなわち、封止液７によって、液体培地ＬＡおよび単一細胞Ｃが一つのマイクログリッド５２内に閉じ込められた状態となっている。封止液７としては、例えば軽質流動パラフィン等からなる胚培養オイルを用いることができる。
　封止液７として求められる機能は、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発防止機能である。液体培地ＬＡは水分を含むので、封止液７が存在しない場合は前記水分が蒸発してしまう。このため、工程Ｓ９の第２次培養の期間中に、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの量が減少ないしは枯渇する、浸透圧やｐＨなどの培地状態が変化するなどの不具合が生じる。蒸発防止機能を有する封止液７によって開口部５２Ｈを封止することにより、第２次培養期間中における液体培地ＬＡの蒸発を抑制できる。
　封止液７の他の望ましい機能は、通気性である。通気性を有する封止液７であれば、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈを封止しても、当該マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡを大気と連通させることができる。従って、マイクログリッド５２内の単一細胞Ｃの培養環境を健全に維持できる。上掲の胚培養オイルは、前記蒸発防止の機能と前記通気性との双方を備えているので、封止液７として好適である。胚培養オイル以外に、少なくとも蒸発防止機能を有する他の液体、半液体（ゲル）を封止液７として用いても良い。言うまでもないが、液体培地ＬＡよりも比重が軽いことは必要である。
　封止液７の層が形成されることで、工程Ｓ７で確立した極小培養環境を第２次培養期間中において維持できるようになる。すなわち、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発が防止されるだけでなく、外気に含まれる異物、例えば微小な塵埃やカビの胞子、細菌などがマイクログリッド５２内へ侵入することを抑止できる。また、マイクログリッド５２内で培養されている単一細胞Ｃが発する活性物質の拡散を防止し、単一細胞Ｃの増殖を促進できる利点もある。
　［工程Ｓ９；第２次培養］
　工程Ｓ９は、図１１の通り封止液７でマイクログリッド５２の開口部５２Ｈを封止した状態で、所定の培養期間だけ単一細胞Ｃの培養を行う工程である。つまり、工程Ｓ４で高抗体産生細胞株として特定された単一細胞Ｃを、さらに所定期間だけ第２次培養して増殖させることで、抗体３を多量に産生させる工程である。第２次培養の期間中、成長因子を含む液体培地がグリッド５１に補填される。
　図１２は、第２プレート５での第２次培養における、単一細胞Ｃの増殖状況を示す画像である。図中の「Ｄａｙ１」は、第２次培養の開始から１日目の状態を意味する。図１２では、一つのグリッド５１が備えるマイクログリッド５２の一部の、第２次培養の開始から１日目、４日目、５日目、６日目、８日目、１１日目および１８日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうち、注目グリッドＧＡにおける単一細胞Ｃの変異状況を見ると、日を追う毎に増殖していることが判る。なお、１１日目～１８日目の間で急激に注目グリッドＧＡの周囲の単一細胞Ｃも増殖しているのは、単純に培養日数が長いことに加え、前記液体培地の補填の際に注目グリッドＧＡから増殖した単一細胞Ｃが隣接するグリッドに入り込んだことも要因である。
　図１３および図１４は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。図１３は、工程Ｓ７の培地吸引（図１０）を行わず、且つ、工程Ｓ８の胚培養オイルによる封止（図１１）を行わない状態、つまり工程Ｓ６の細胞吐出（図９）の後、直ちに第２次培養を行うようにした、比較例１の画像である。図１３では、第２次培養の開始から１日目、６日目および１１日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうちの注目グリッドＧＡ１における単一細胞Ｃの増殖状況を見ると、１日目～１１日目の間で有意な増殖は生じていないことが判る。
　図１４は、工程Ｓ７の培地吸引（図１０）を行わずに、工程Ｓ８の胚培養オイルによる封止を行った状態、つまり工程Ｓ６の細胞吐出（図９）の後、液体培地ＬＡの液面が頂部５２２よりも高い位置にある状態で封止液７を注液し、第２次培養を行った比較例２の画像である。図１４でも、第２次培養の開始から１日目、６日目および１１日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうちの注目グリッドＧＡ２における単一細胞Ｃの増殖状況を見ると、１日目～１１日目の間で有意な増殖は生じていないことが判る。
　［作用効果］
　以上説明した本実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法によれば、次のような作用効果を奏する。先ず、工程Ｓ５のピッキング前の第１次培養において、一個の単一細胞Ｃを第１プレート１の一つのマイクログリッド１２に保持させた後、当該マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡがゲル化される。液体培地ＬＡのゲル化により、一つのマイクログリッド１２内に一つの単一細胞Ｃが閉じ込められた状態を形成できる。この状態で、単一細胞Ｃを所定の抗体産生期間だけ第１次培養することで、マイクログリッド１２毎に細胞増殖ならびに抗体３の産生を行わせることができる。そして、第１プレート１に検出用抗体４を添加することで、マイクログリッド１２単位で抗体産生量を評価できる。培地のゲル化によって単一細胞Ｃの浮遊が抑止されているので、検出用抗体４が多く検出されるマイクログリッド１２には、高抗体産生細胞株が保持されていることになる。このように、マイクログリッド１２単位で単一細胞Ｃの培養、抗体３の産生ならびに抗体産生量の検出が可能となるので、抗体産生量の高い細胞株を効率的に特定することができる。
　次に工程Ｓ５のピッキング後の第２次培養においては、第２プレート５のマイクログリッド５２に単一細胞Ｃを保持させた後、液体培地ＬＡを除去して封止液７で開口部５２Ｈを封止する。これにより、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発を防ぎつつ、マイクログリッド５２単位で閉じられた極めて小さい培養環境を構築できる。狭小な培養領域で単一細胞Ｃを培養することで、当該単一細胞Ｃの増殖が促進される。従って、優れた抗体産生能を有する単一細胞Ｃをピッキングして上記の通り第２次培養することで、単一細胞Ｃの増殖の効率化を図ることができ、ひいては抗体３を多量に産生させることができる。
　［上記実施形態に含まれる発明］
　以上説明した実施形態には、以下の構成を有する発明が含まれている。
　本発明の一局面に係る組換えタンパク質産生細胞の培養方法は、微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、前記収容部内の培地をゲル化する工程と、前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む。
　この態様によれば、一個の単一細胞を一つの収容部に保持させた後、当該収容部内の培地がゲル化される。ゲル化により、一つの収容部内に一つの単一細胞が閉じ込められた状態を形成できる。この状態で、前記単一細胞を所定の組換えタンパク質産生期間だけ培養することで、収容部毎に細胞増殖ならびに組換えタンパク質産生を行わせることができる。そして、プレートに検出用タンパク質を添加することで、収容部単位で組換えタンパク質産生量を評価できる。培地のゲル化によって単一細胞の浮遊が抑止されているので、検出用タンパク質が多く検出される収容部には、組換えタンパク質産生能が高い細胞株が保持されていることになる。このように、上記の態様によれば、収容部単位で単一細胞の培養、組換えタンパク質産生ならびに組換えタンパク質産生量の検出が可能となるので、組換えタンパク質産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能となる。
　上記の培養方法において、前記組換えタンパク質を産生可能な単一細胞が、抗体を産生可能な単一細胞であり、前記検出用タンパク質が検出用抗体であることが望ましい。
　この態様によれば、収容部単位で単一細胞の培養、抗体産生ならびに抗体産生量の検出が可能となるので、抗体産生量の多い細胞株を効率的に特定できる。
　上記の培養方法において、前記検出用抗体を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を特定する工程をさらに含むことが望ましい。
　この態様によれば、例えばプレートに光を照射して検出用抗体を蛍光させるといったトリガを与え、蛍光度合い等に基づいて収容部単位で検出用抗体の量を検出するだけで、抗体産生量の多い細胞株を特定できる。
　上記の培養方法において、前記特定された収容部に保持された単一細胞をピッキングし、他の容器に移載する工程をさらに含んでいても良い。
　この態様によれば、高抗体産生細胞株をピッキングして他の容器に移載することで、例えば当該細胞株をさらに培養し、多量の抗体を産生させることが可能となる。
　上記の培養方法において、前記抗体の産生期間において前記プレートを監視し、当該産生期間の当初から複数個の単一細胞が保持されていた前記収容部は、前記特定の対象から除外することが望ましい。
　細胞懸濁液をプレートに注液すると、多数の収容部のうち、確率論的に概ね一定の割合で一個の単一細胞だけを保持した収容部が発現する。残りの収容部は、単一細胞を保持していない無保持収容部か、あるいは複数個の単一細胞を保持する過保持収容部となる。前記過保持収容部には、高抗体産生細胞株と非産生または低抗体産生細胞株とが混在している可能性がある。上記の態様によれば、前記過保持収容部が特定の対象から除外されるので、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を正確に特定することができる。
　上記の培養方法において、前記収容部は、開口面積が１．０×１０－３～１．０×１０－１ｍｍ２、容積が２．０×１０－５～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズを有することが望ましい。
　この態様によれば、単一細胞の培養領域を十分に微小化でき、限られたプレート面積で多量の単一細胞の独立的な培養が可能となる。従って、培養の効率化、抗体産生量評価の効率化を図ることができる。
　上記の培養方法において、前記プレートは、当該プレートの比較的大サイズの領域を区分する大区画部と、この大区画部の内側をさらに細区分する小区画部とを含み、前記小区画部が前記収容部であることが望ましい。
　この態様によれば、大区画部の単位で細胞種や培養液を変更する等の活用が可能となり、培養の多様化を図ることが可能となる。
　上記の培養方法において、アルギン酸塩を含む培地が、前記プレートに注液されることが望ましい。
　アルギン酸塩を含む培地は、例えばカルシウムイオンやマグネシウムイオンを添加することで、俊敏にゲル化する性質がある。従って、上記の態様によれば、ゲル化の工程を迅速に完遂することができる。
　上記の培養方法において、前記単一細胞に遺伝子を導入して抗体産生能を付与する工程を含み、前記遺伝子を導入した単一細胞を通常培地で所定期間培養した後、前記通常培地を前記単一細胞の培養に適した選択培地に置換することが望ましい。
　この態様によれば、原因は突き止められていないものの、抗体産生能を有する単一細胞を良好に増殖させることができる。
　以上説明した本発明によれば、組換えタンパク質の産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能な培養方法を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、
    　前記収容部内の培地をゲル化する工程と、
    　前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、
    　前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  2. 　請求項１に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記組換えタンパク質を産生可能な単一細胞が、抗体を産生可能な単一細胞であり、
    　前記検出用タンパク質が検出用抗体である、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  3. 　請求項２に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記検出用抗体を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を特定する工程をさらに含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  4. 　請求項３に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記特定された収容部に保持された単一細胞をピッキングし、他の容器に移載する工程をさらに含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  5. 　請求項３に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記抗体の産生期間において前記プレートを監視し、当該産生期間の当初から複数個の単一細胞が保持されていた前記収容部は、前記特定の対象から除外する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記収容部は、開口面積が１．０×１０－３～１．０×１０－１ｍｍ２、容積が２．０×１０－５～１．０×１０－２ｍｍ３の範囲から選ばれるサイズを有する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  7. 　請求項６に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記プレートは、当該プレートの比較的大サイズの領域を区分する大区画部と、この大区画部の内側をさらに細区分する小区画部とを含み、
    　前記小区画部が前記収容部である、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  8. 　請求項２～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　アルギン酸塩を含む培地が、前記プレートに注液される、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
  9. 　請求項２～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
    　前記単一細胞に遺伝子を導入して抗体産生能を付与する工程を含み、
    　前記遺伝子を導入した単一細胞を通常培地で所定期間培養した後、前記通常培地を前記単一細胞の培養に適した選択培地に置換する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。
     
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