JP6710772B2 - 細胞移動装置及び細胞移動方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞を保持するディッシュから細胞を受け入れるウェルを有するプレートへ細胞を移動させる細胞移動装置及び方法に関する。
例えば医療や生物学的な研究の用途では、単細胞、或いは細胞が三次元的に凝集してなる細胞凝集塊、或いは細胞の断片から塊化培養した細胞塊(以下、これらを本明細書では単に細胞という)が、観察、薬効確認、検査若しくは培養等の処理作業のために、マトリクス配列されたウェルを有するマイクロプレートの、前記ウェルに収容されることがある。ウェルに収容される細胞は、細胞を収容可能な凹部を有するディッシュ上において選別される。この選別に先立ち、ディッシュ上には多量の細胞を含有する細胞培養液が分散され、前記凹部に細胞が保持される。そして、細胞を保持したディッシュの画像が撮像され、画像処理技術によって使用可能な細胞と、使用不可の細胞及び夾雑物とが区分される。しかる後、使用可能な細胞が、吸引チップによって前記凹部から吸引されると共に、吸引された細胞がマイクロプレートのウェルに吐出される(例えば、特許文献1参照)。
マイクロプレートが備える複数のウェルは、特定の目的のグループに区分される場合がある。例えば、第1のグループのウェル群には第1の化合物を配合した細胞培養液が、第2のグループのウェル群には第2の化合物を配合した細胞培養液が各々注液され、第1及び第2の化合物がそれぞれ細胞に如何なる作用を与えるかが観察される。この場合、各グループには、各化合物の感受性を平等に評価するために、同等品質の細胞が均等に配分されることが望ましい。しかしながら、ディッシュ上で使用可能と判定される細胞は、大きさ、形状、性質などがまちまちである。このため、ディッシュ上で単純なナンバリングを細胞に付し、順に吸引チップで吸引してウェルに移動させる手法では、同等品質の細胞を複数のグループに均等に配分するのは困難であった。
WO2015/087371A1
本発明は、細胞を保持するディッシュから細胞を受け入れるウェルを有するマイクロプレートへ細胞を移動させる細胞移動装置及び方法において、同等品質の細胞を複数のグループのウェルに均等に配分することを可能にすることを目的とする。
本発明の一局面に係る細胞移動装置は、移動対象の細胞を保持する複数の保持部を有するディッシュと、前記細胞を受け入れる複数のウェルを有し、これらウェルが複数のグループに区分されるマイクロプレートと、前記細胞を、前記ディッシュから前記マイクロプレートへ移動させる移動部と、前記細胞が前記保持部に保持された状態の前記ディッシュの画像を撮像する撮像部と、前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞を使用可能な細胞として選別すると共に、予め定められた複数段階の評価レベルを参照し、前記使用可能な細胞の各々に対して評価レベルを付与する評価部と、同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定する振り分け処理部と、前記振り分け処理部によって設定された前記移動先に従って、前記ディッシュの前記保持部に保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるよう、前記移動部を制御する移動制御部と、を備える。
本発明の他の局面に係る細胞移動方法は、ディッシュに保持された細胞を、複数のウェルが複数のグループに区分されているマイクロプレートへ移動させる細胞移動方法であって、移動対象の細胞を保持するディッシュの画像を撮像するステップと、前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞を使用可能な細胞として選別するステップと、予め定められた細胞の複数段階の評価レベルを参照し、前記使用可能な細胞の各々に対して評価レベルを付与するステップと、同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定するステップと、前記移動先の設定に従って、前記ディッシュに保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるステップと、を含む。
本発明の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明と添付図面とによって、より明白となる。
図1は、本発明の実施形態に係る細胞移動装置の構成を示す概略図である。 図2は、前記細胞移動装置に使用される選別容器の斜視図である。 図3は、前記選別容器が備えるディッシュの上面図である。 図4は、図3のIV−IV線断面図である。 図5は、複数のディッシュ及び撮影範囲を示す上面図である。 図6は、前記細胞移動装置に使用されるマイクロプレートの上面図である。 図7は、前記マイクロプレートが具備する多数のウェルが、複数のグループに区分されている例を示す上面図である。 図8は、複数本のチップにより、細胞が前記マイクロプレートのウェルに同時吐出されている例を説明するための図である。 図9は、上記細胞移動装置の電気的構成を示すブロック図である。 図10は、ディッシュに保持されている細胞と、その評価レベルとを模式的に示す図である。 図11(A)は、ディッシュに保持されている細胞へのナンバリングの例、図11(B)は、比較例に係るマイクロプレートへの細胞の吐出順を示す図、図11(C)は、比較例に係るマイクロプレートへの細胞の吐出状況を示す図である。 図12(A)は、ディッシュに保持されている細胞を示す平面図、図12(B)は、本実施形態に係るマイクロプレートへの細胞の移動先を示す図、図12(C)は、本実施形態に係るマイクロプレートへの細胞の吐出状況を示す図である。 図13は、本実施形態の第1変形例を説明するための図である。 図14は、本実施形態の第2変形例を説明するための図である。 図15Aは、前記細胞移動装置の動作を示すフローチャートである。 図15Bは、前記細胞移動装置の動作を示すフローチャートである。 図16は、ディッシュに保持されている細胞及びそのレベルを模式的に示す図である。 図17は、マイクロプレートへの細胞の均等振り分けの例を示す模式図である。 図18は、本実施形態の第3変形例を説明する図である。 図19は、本実施形態の第3変形例を説明する図である。
以下、本発明の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。本発明において移動対象とされるのは、生体由来の細胞、特に細胞凝集塊(スフェロイド;spheroid)、或いは細胞の断片から塊化培養した細胞塊である。生体由来の細胞凝集塊は、細胞が数個〜数十万個凝集して形成されている。そのため、細胞凝集塊の大きさは様々である。生きた細胞が形成する細胞凝集塊は略球形であるが、細胞凝集塊を構成する細胞の一部が変質したり、死細胞となっていたりすると、細胞凝集塊の形状は歪になる、あるいは密度が不均一となる場合がある。細胞移動装置は、バイオ関連技術や医薬の分野における試験において、選別ステージ上のディッシュに担持された種々の形状を呈する複数の細胞凝集塊の中から、使用可能な細胞凝集塊をピッキッングし、これをマイクロプレートまで移動する。マイクロプレートでは、細胞凝集塊に対して、観察、薬効確認、検査、培養等の各種の処理が実行される。以下の説明では、上記のような細胞凝集塊を含む意味で、簡略的に細胞Cと表現する。
[細胞移動装置の全体構成]
図1は、細胞移動装置Sの全体構成を概略的に示す図である。ここでは、細胞Cを2つの容器間で移動させる細胞移動装置Sを例示している。細胞移動装置Sは、ディッシュ10を備えた選別容器1、マイクロプレート4、カメラユニット5(撮像部)、及びチップ6が搭載されたヘッドユニット61(移動部)を備えている。
選別容器1は、細胞Cの移動元となる容器であり、培地Lを貯留し、細胞選別用のディッシュ10を培地Lに浸漬される状態で保持している。ディッシュ10は、細胞Cを担持するプレートであり、細胞Cを個別に収容することが可能な保持凹部3を上面に複数有している。
培地Lは、細胞Cの性状を劣化させないものであれば特に限定されず、細胞Cの種類により適宜選定することができる。培地Lとしては、たとえば基本培地、合成培地、イーグル培地、RPMI培地、フィッシャー培地、ハム培地、MCDB培地、血清などの培地のほか、冷凍保存前に添加するグリセロール、セルバンカー(十慈フィールド株式会社製)等の細胞凍結液、ホルマリン、蛍光染色のための試薬、抗体、精製水、生理食塩水などを挙げることができる。たとえば、細胞Cとして生体由来の細胞であるBxPC−3(ヒト膵臓腺癌細胞)を用いる場合には、培地LとしてはRPMI−1640培地に牛胎児血清FBS(Fetal Bovine Serum)を10%混ぜたものに、必要に応じて抗生物質、ピルビン酸ナトリウムなどのサプリメントを添加したものを用いることができる。
選別容器1は、円柱形の形状を備え、その上面側に矩形の上部開口1Hを備えている。上部開口1Hは、細胞Cの投入、並びに、選別された細胞Cをピックアップするための開口である。ディッシュ10は、上部開口1Hの下方に配置されている。選別容器1及びディッシュ10は、透光性の樹脂材料やガラスで作製されたものが用いられる。これは、選別容器1の下方に配置されたカメラユニット5により、ディッシュ10に担持された細胞Cを観察可能とするためである。
選別容器1には、図略の分注チップから、細胞培養液に分散された状態の複数の細胞Cが注入される。前記分注チップは、多量の細胞Cを含む細胞培養液を貯留する容器から、細胞Cと共に細胞培養液を吸引し、当該分注チップ内に保持する。その後、前記分注チップは、選別容器1の上空位置へ移動され、上部開口1Hを通してディッシュ10の上面にアクセスする。そして、前記分注チップの先端開口が選別容器1の培地Lに浸漬された状態で、チップ内に保持された細胞Cが細胞培養液と共に吐出される。
マイクロプレート4は、細胞Cの移動先となる容器であり、細胞Cを受け入れる複数のウェル41を有する。1つのウェル41には、培地Lと共に必要個数(通常は1個)の細胞Cが収容される。マイクロプレート4もまた、透光性の樹脂材料やガラスで作製されたものが用いられる。これは、マイクロプレート4の下方に配置されたカメラユニット5により、マイクロプレート4に担持された細胞Cを観察可能とするためである。
カメラユニット5は、カメラレンズ51を備え、選別容器1においてディッシュ10に担持されている細胞C、或いはマイクロプレート4においてウェル41に保持されている細胞Cの画像を撮像する。カメラユニット5は、CCDイメージセンサのような撮像素子を備える。カメラレンズ51は、前記撮像素子の受光面に、細胞Cの光像を結像させる。
カメラユニット5は、カメラレンズ51が選別容器1及びマイクロプレート4の各下面と対向するように、これらの下方に配置されている。つまり、カメラユニット5は、選別容器1又はマイクロプレート4に担持されている細胞Cの画像を、これらの下面側から撮像する。カメラユニット5は、図中に矢印X2で示すように、ガイドレール52に沿って、選別容器1の下方とマイクロプレート4の下方との間を水平方向に移動可能である。
チップ6は、先端開口6Hを備えたチューブ状の部材であり、細胞Cを含む培地Lの吸引及び吐出を行う。具体的にはチップ6は、選別容器1のディッシュ10から細胞Cを、より詳しくはディッシュ10の保持凹部3に担持されている細胞Cを培地Lと共に吸引し、これらをマイクロプレート4のウェル41へ吐出する。また、図示は省いているが、必要に応じてチップ6は試薬液等を吸引し、細胞Cを担持しているウェル41内へこれを吐出する。
ヘッドユニット61は、細胞Cをディッシュ10からマイクロプレート4へ移動させるために設けられ、ヘッド本体62とヘッド63とを備える。ヘッド本体62は、ヘッド63を上下方向に進退可能に保持し、ガイドレール61Rに沿って図中に矢印X1で示すように左右方向に移動可能である。なお、図1では図示していないが、ヘッド本体62は、図1の紙面と直交する方向(前後方向)にも移動可能である。ヘッド63は、中空のロッドからなる。チップ6は、ヘッド63の下端に装着されている。ヘッド63の中空部内にはピストン機構が搭載されており、該ピストン機構の動作によってチップ6の先端開口6Hに吸引力及び吐出力が与えられる。ヘッド本体62には、前記ピストン機構の動力部と、ヘッド63を上下方向に移動させる昇降機構及びその動力部が内蔵されている。
[ディッシュ及びマイクロプレートの詳細]
図2は、選別容器1の斜視図、図3は、ディッシュ10の上面図、図4は、図3のIV−IV線断面図である。選別容器1は、底皿11、外周壁12、内周壁13及び天壁14を備える。底皿11は、選別容器1の底部を構成する上面開口の円柱型の皿部材である。外周壁12、内周壁13及び天壁14は、底皿11に被せられる蓋部材を構成している。外周壁12は底皿11の側周壁よりも径大の部分、内周壁13は、外周壁12の内部に配置された角筒状の部分である。天壁14は、選別容器1の上面側において、上部開口1H以外の領域を覆う板部材である。
内周壁13は、上部開口1Hを区画する壁であり、上部開口1Hから下方に向けて開口面積が徐々に縮小するように傾斜している。天壁14には、上下方向への貫通孔からなる作業孔15が穿孔されている。この作業孔15を通して、選別容器1のキャビティへの培地Lの注液、薬品類の注液、若しくは培地Lの吸液又は廃液などの作業が行われる。さらに天壁14には、選別容器1のキャビティ内の気圧調整を行うための配管接続口16が設置されている。
ディッシュ10は、ディッシュ本体2と、該ディッシュ本体2に形成される複数の保持凹部3(保持部)とを備えている。ディッシュ本体2は、所定の厚みを有する平板状の部材からなり、上面21と下面22とを有する。上面21には、移動対象となる細胞Cを保持する複数の保持凹部3が設けられている。ディッシュ10は、下面22が選別容器1の底皿11に対して間隔を置いた状態で、内周壁13の下端部において保持される。ディッシュ10は、選別容器1内の培地L中に浸漬されている。つまり、ディッシュ10の上面21が培地Lの液面よりも下方に位置するよう、選別容器1に培地Lが注液される。
保持凹部3の各々は、開口部31、底部32、筒状の壁面33、孔部34及び境界部35を含む。本実施形態では、上面視で正方形の保持凹部3がマトリクス状に配列されている例を示している。開口部31は、上面21に設けられた正方形の開口であり、選別用のチップ6の先端開口6Hの進入を許容するサイズを有する。底部32は、ディッシュ本体2の内部であって、下面22の近くに位置している。底部32は、中心(前記正方形の中心)に向けて緩く下り傾斜する傾斜面である。筒状の壁面33は、開口部31から底部32に向けて鉛直下方に延びる壁面である。孔部34は、底部32の前記中心と下面22との間を鉛直に貫通する貫通孔である。孔部34の形状は上面視で正方形であり、開口部31と同心である。境界部35は、上面21に位置し、各保持凹部3の開口縁となる部分であって、保持凹部3同士を区画する稜線である。なお、保持凹部3の上面視形状は、丸形、三角形、五角形、六角形等であってもよく、これらがハニカム状、直線状、ランダムにディッシュ本体2へ配置されていても良い。或いは、一つの保持凹部3だけが備えられているディッシュ10としても良い。
各保持凹部3の底部32及び筒状の壁面33は、細胞Cを収容する収容空間3Hを区画している。収容空間3Hには、一般的には1個の細胞Cが収容されることが企図されている。従って、保持凹部3は、ターゲットとする細胞Cのサイズに応じて設定される。但し、多数の細胞Cを含む細胞培養液を選別容器1に分注する作業では、一つの保持凹部3に複数の細胞Cが入り込んでしまう場合がある。孔部34は、所望のサイズ以外の小さな細胞や夾雑物を収容空間3Hから逃がすために設けられている。従って、孔部34のサイズは、所望のサイズの細胞Cは通過できず、所望のサイズ以外の小さな細胞や夾雑物を通過させるサイズに選ばれている。これにより、選別対象となる細胞Cは保持凹部3にトラップされる一方で、夾雑物等は孔部34から選別容器1の底皿11に落下する。
図5は、選別容器1における実際のディッシュ10の配置例を示す図である。ここでは、4枚の四角形の小ディッシュ10A、10B、10C、10Dが、1つの大きな四角形を作るように配列されてなるディッシュ10を例示している。ミクロンオーダーの細胞Cを保持させるディッシュ10の保持凹部3は微小サイズとなり、ディッシュ本体2としても自ずと薄肉のプレートが用いられることとなる。この場合、プレートサイズを大きくするとプレートの平面度が出難くなるため、小サイズの小ディッシュ10A〜10Dを集合させて所要のサイズのディッシュ10を形成することが多い。マイクロプレート4についても同様である。
図5には、カメラユニット5によるディッシュ10の撮影範囲AVの一例も示されている。ミクロンオーダーの細胞Cを撮像する光学系の画角は、自ずと小さくなる。一般的には、画角=2mm程度のカメラが用いられる。従って、カメラユニット5による1回の撮像では、到底ディッシュ10の全域をカバーすることはできない。このため、ディッシュ10の一部を順次カメラユニット5で撮像する手法が採られる。図5では、小ディッシュ10Aの約1/4程度をカバーする撮影範囲AVが描かれているが、実際は1枚の小ディッシュ10Aの全域をカバーするだけで、数十回〜100回程度の撮像が必要となる。従って、図5の例では4枚の小ディッシュ10A〜10Dが用いられているので、その4倍の撮像動作が必要となる。
図6は、マイクロプレート4の上面図である。マイクロプレート4は、上面が開口した多数のウェル41が、マトリクス状に配列されたプレートである。図1にも示されているように、それぞれのウェル41は、テーパ部42と、該テーパ部42の下方に連なる筒状部43とを含む。テーパ部42は、マイクロプレート4の上面に円形の開口部を有し、前記上面から下方に向けて径小となるテーパ形状を有する。筒状部43は、上下方向に内径が均一な部分であり、その下端に底部を備える。図5に示したディッシュ10の例と同様に、複数枚の小マイクロプレートを例えばフレーム部材の中に集積する等して、1つのマイクロプレート4を形成するようにしても良い。
マイクロプレート4として基準プレートが用いられる場合、その縦×横のサイズは、85.48mm×127.76mmである(ANSI(American National Standards Institute)のSLAS(Society for Laboratory Automation and Screening)によって2004年に規定された「Footprint Dimensions−for Microplates」参照)。この場合、一般的なウェル41の数は、24×16個であり、これらウェル41が所定のピッチでマトリクス配列される。なお、図6では、14×10個のウェル41がマトリクス配列されている例を示している。
本実施形態では、マイクロプレート4が備える複数のウェル41が、特定の目的の複数のグループに区分されて用いられる。図7は、マイクロプレート4のウェル41が、グループI、II、III、IV及びVの5つグループに区分されている例を示している。各グループI〜Vは、2行×14列のウェル41を備えている。例えば、グループIのウェル41群には第1の化合物を配合した細胞培養液が、グループIIのウェル41群には第2の化合物を配合した細胞培養液が、というように各々異なる細胞培養液が注液され、第1、第2・・・の化合物がそれぞれ細胞Cに如何なる作用を与えるかが観察される。もちろん、図7のグループ区分は一例であり、ウェル41のグループ区分の態様は、目的に応じて任意に設定される事項である。なお、本発明において「ウェルが複数のグループに区分される」とは、上記の通りマイクロプレート4上において視覚的に区分されることのほか、後述の制御部7(図9)において仮想的に区分されることも含む。
好ましい実施形態では、複数のチップ6から複数のウェル41に対して、細胞Cが同時に吐出される態様が採られる。図8は、複数本(3本)のチップにより、細胞Cがマイクロプレート4のウェル41に同時吐出されている例を説明するための図である。マイクロプレート4のウェル41が、x方向に均等なピッチx1で配列されている。ヘッドユニット61は、3本のヘッド63A、63B、63Cを備え、それぞれチップ6A、6B、6Cが各ヘッドに装着されている。チップ6A、6B、6C(各々の先端開口6H)は、x方向に前記ピッチx1の2倍のピッチx2で配列されている。チップ6A〜6Cのピッチx2は、ピッチx1の2倍に限らず、x1の整数倍であれば良い。
選別容器1において、チップ6A〜6Cに所望の細胞Cを吸引させる。その後、ヘッドユニット61をマイクロプレート4の上に移動させると共に、例えばチップ6Aの先端開口6Hを、吐出ターゲットとする1つのウェル41と位置合わせする。チップ6A〜6Cのピッチx2がウェル41のピッチx1の2倍であるので、チップ6B、6Cは、順次x方向の一つ飛ばしのウェル41に各々位置合わせされる。その後、ヘッド63A〜63Cを下降させ、各先端開口6Hが各ウェル41に対して所定位置まで接近したら、各チップ6A〜6Cから同時に細胞Cを吐出させる。このような同時吐出を実行させることで、ヘッドユニット61の移動時間やヘッド63A〜63Cの昇降の回数を減らすことができ、細胞Cの移動に要する時間を短縮することができる。
本実施形態では、上述したようなディッシュ10からマイクロプレート4に細胞Cを移動させる細胞移動装置Sにおいて、図7に示すように、マイクロプレート4が備える複数のウェル41が、特定の目的の複数のグループI〜Vに区分されて用いられる場合に、各グループI〜Vに同等品質の細胞Cが均等に配分される機能を有する細胞移動装置Sを示す。この細胞均等配分のため、細胞移動装置Sは、
(1)細胞Cが保持凹部3に保持された状態のディッシュ10の画像を撮像する機能、
(2)前記ディッシュ10の画像に基づいて、ディッシュ10に保持されている複数の細胞Cの各々に対して評価レベルを付与する機能、
(3)同じ評価レベルの細胞Cが、マイクロプレート4の複数のグループの各々に均等に配分されるように、ディッシュ10に保持された各細胞Cの移動先を振り分ける機能、
(4)前記振り分けに従って、ディッシュ10の細胞Cをマイクロプレート4の各グループの各ウェル41へ移動させる機能、
を有する。以下、細胞移動装置Sの上記機能(1)〜(4)に関わる構成を説明する。
[細胞移動装置の電気的構成]
図9は、細胞移動装置Sの電気的構成を示すブロック図である。細胞移動装置Sは、ヘッドユニット61(図1)の移動、ヘッド63の位置決め及び昇降、ヘッド63による細胞Cの吸引及び吐出動作、並びにカメラユニット5の動作を制御する制御部7を備える。また、細胞移動装置Sは、カメラユニット5を水平移動させる機構としてカメラ軸駆動部53、ヘッドユニット61を水平移動させる機構としてヘッドユニット軸駆動部64(移動部の一部)、ヘッド63を昇降させる機構並びに吸引及び吐出動作を行わせる機構としてヘッド駆動部65(移動部の一部)、及び表示部66を備えている。
カメラ軸駆動部53は、ガイドレール52に沿ってカメラユニット5を移動させる駆動モータを含む。好ましい態様は、ガイドレール52に沿ってボールねじが敷設され、該ボールねじに螺合されたナット部材にカメラユニット5が取り付けられ、前記駆動モータが前記ボールねじを正回転又は逆回転させることにより、カメラユニット5を目標位置へ移動させる態様である。なお、図1では図示を省いているが、カメラユニット5はガイドレール52(X方向)と水平面で直交する方向(Y方向)にも移動可能とされている。すなわち、カメラ軸駆動部53は、カメラユニット5をXY方向に移動させる。
ヘッドユニット軸駆動部64は、ガイドレール61Rに沿ってヘッドユニット61(ヘッド本体62)を移動させる駆動モータを含む。好ましい態様は、カメラ軸駆動部53と同様に、ボールねじ及びナット部材を具備し、前記駆動モータが前記ボールねじを正回転又は逆回転させる態様である。なお、ヘッド本体62をXYの2方向に移動させる場合は、ガイドレール61Rに沿った第1ボールねじ(X方向)と、第1ボールねじに螺合された第1ナット部材に装着された移動板に搭載された第2ボールねじ(Y方向)とを用いる。この場合、ヘッド本体62は第2ボールねじに螺合された第2ナット部材に装着される。
ヘッド駆動部65は、先に説明したヘッド63を上下方向に移動させる昇降機構のための動力部、中空ロッドからなるヘッド63の中空部内に組み付けられるピストン機構を駆動するための動力部(例えばモータ)が相当する。上述の通り、昇降機構はヘッド本体62からヘッド63が下方に延び出した下降位置と、ヘッド本体62に大部分が収容された上昇位置との間で、ヘッド63を上下移動させる。ピストン機構の動力部は、ヘッド63内に配置されたピストン部材を昇降させることで、ヘッド63に装着されたチップ6の先端開口6Hに、吸引力及び吐出力を発生させる。
表示部66は、液晶ディスプレイ等からなり、カメラユニット5により撮影された画像や、制御部7によって画像処理等がなされた画像などを表示する。
制御部7は、マイクロコンピュータ等からなり、機能的に、撮像制御部71、画像メモリ72、画像処理部73、評価部74、振り分け処理部75、軸制御部76(移動制御部の一部)及びヘッド制御部77(移動制御部の一部)を備えている。
撮像制御部71は、カメラユニット5の撮像動作及び移動動作を制御する。本実施形態では撮像制御部71は、少なくとも細胞Cが保持凹部3に保持された状態のディッシュ10の画像をカメラユニット5に撮像させる動作を制御する。既述の通り、カメラユニット5の画角はディッシュ10のサイズに比べて相当に小さいので、撮像制御部71は、カメラ軸駆動部53を制御してカメラユニット5をXY方向に微小移動させつつ、カメラユニット5にディッシュ10の撮像動作を実行させる。この他、撮像制御部71は、カメラ軸駆動部53を制御してカメラユニット5をガイドレール52に沿って移動させる動作、及びマイクロプレート4の画像をカメラユニット5に撮像させる動作を制御する。
画像メモリ72は、前記マイクロコンピュータに具備されている記憶領域や外部ストレージ等からなり、カメラユニット5により取得された画像データを一時的に格納する。
画像処理部73は、カメラユニット5が撮像し、画像メモリ72に格納された画像データを画像処理する。画像処理部73は、例えば、細胞Cが分注された後のディッシュ10の画像に基づき、ディッシュ10上における細胞Cの存在を画像上で認識する処理、細胞Cの分布を認識する処理、認識された細胞Cの形状を認識する処理などを、画像処理技術を用いて実行する。また、画像処理部73は、ディッシュ10の上面21の画像に基づき、上面21における保持凹部3の枠(境界部35)の位置を認識する処理等を実行する。
評価部74は、画像処理部73により画像処理された画像データに基づき、ディッシュ10に担持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞Cと、前記基準を満たさない細胞及び夾雑物とを区分し、前記基準を満たす細胞Cについて評価レベルを付与する処理を行う。前記所定の基準は、具体的には使用可能な細胞C(マイクロプレート4において実験等に供することが可能な細胞)であるか否かである。評価部74は、このような使用可能な細胞Cと、使用不可の細胞や夾雑物とを区別する処理を行う。さらに評価部74は、予め定められた複数段階の評価レベルを参照し、使用可能な細胞Cの各々に評価レベルを付与する。
使用不可の細胞は、例えば死亡している細胞、形状が極端に歪な細胞、2つの細胞が融合しているような細胞、色合いが明らかに正常とは異なる細胞などである。例えば、大きく括れた部分が存在する細胞は、2つの細胞が1つに融合したものである可能性が高い。また、細胞の一部又は内部が濃い色の細胞は、その一部又は内深部が死んでいる細胞である可能性が高い。これらは、画像処理部73によって認識された細胞の形状と所定のテンプレートとの乖離度、認識された細胞の縦横比などの基準値からの乖離度等に基づき評価される。細胞の色は色調認識によって特定され、例えば基準色との対比において評価がなされる。一方、使用可能と判定された細胞Cの評価に際しては、予め定められた評価基準が参照される。この評価基準は、細胞の種別、実験目的などに応じて適宜設定される。例えば、細胞のサイズ、形状、色合いなどが評価要素となる。この点については、図10の例に基づき後述する。なお、使用不可の細胞の画像上の特徴、並びに、使用可能と判定された細胞Cの評価レベルを定める画像上の特徴を評価部74に細かく教示する機械学習の手法を採用しても良い。
振り分け処理部75は、評価部74によって評価レベルが付与された細胞Cを、マイクロプレート4が備えるウェル41群のグループ(例えば、図7に示したグループI〜V)の各々に振り分ける処理を行う。この際、振り分け処理部75は、ディッシュ10上における使用可の細胞Cの配列順等に基づき振り分けを行うのではなく、同じ評価レベルの細胞Cが、各グループに均等に配分されるように、各細胞Cの移動先を設定する。なお、本発明における「均等な配分」とは、完全な均等配分が実質的に不可能な場合においては、より均等に近いように配分されることを含む。
軸制御部76は、ヘッドユニット軸駆動部64の動作を制御する。すなわち、軸制御部76は、ヘッドユニット軸駆動部64を制御することで、ヘッドユニット61を水平方向の所定の目標位置へ移動させる。ヘッド63(チップ6)の、吸引対象となるディッシュ10の保持凹部3の鉛直上空での位置決め、並びに吐出対象となるマイクロプレート4のウェル41の鉛直上空での位置決めは、軸制御部76によるヘッドユニット軸駆動部64の制御によって実現される。
ヘッド制御部77は、ヘッド駆動部65を制御する。ヘッド制御部77は、ヘッド駆動部65の前記昇降機構のための動力部を制御することにより、制御対象とするヘッド63を所定の目標位置に向けて昇降させる。また、ヘッド制御部77は、制御対象とするヘッド63についての前記ピストン機構の動力部を制御することにより、所定のタイミングで当該ヘッド63に装着されているチップ6の先端開口6Hに吸引力又は吐出力を発生させる。つまり、軸制御部76及びヘッド制御部77は、振り分け処理部75の前記設定に従って、ディッシュ10の保持凹部3に保持された細胞Cを、マイクロプレート4の各グループの各ウェル41へ移動させるよう、ヘッドユニット61を制御する。
[細胞の評価と振り分け]
図10は、ディッシュ10に保持されている細胞Cと、その評価レベルの例とを模式的に示す上面図である。図10に示すディッシュ10は、選別容器1内において細胞培養液に浸漬され、細胞Cを含む細胞培養液の分注が行われた後の状態を、カメラユニット5にて撮像して得られた画像に相当する。ここでは、使用不可の細胞や夾雑物、及び1つの保持凹部3に2以上の細胞Cが収容されている状態(これらの細胞Cは吸引対象とはならない)の記載は省かれている。図10では、8行(m1〜m8)×8列(n1〜n8)の保持凹部3を有するディッシュ10が例示されている。64個の保持凹部3の一部には、評価部74により使用可能と判定された細胞Cが収容されている。
図10において、ディッシュ10の右側には、使用可能な細胞Cの評価レベルの一例が示されている。ここでは、レベルG1、G2、G3、G4及びG5の5段階からなる評価レベルを例示している。レベルG1が最も品質が高い細胞C(最良)であり、レベルG5が使用可能なもののうち最も品質が低い細胞C(可)である。レベルG1は、細胞のサイズ、形状及び色合いが、ある実験目的の試料の細胞Cにおいて最適と認定されるものに付与される評価レベルである。一般に健全な細胞C(細胞凝集塊)は略球形であるので、前記サイズは細胞Cの直径で設定することができる。また、前記形状も、球形に対する変形度にてグレードを設定することができる。前記色合いは、健全な細胞Cの自然色に対する離間度などに基づいてグレードを設定することができる。
レベルG2は、そのサイズが、レベルG1と認定される範囲よりも大きく、使用可能な細胞サイズとして予め設定された範囲の上限よりも小さい範囲にある細胞Cに付与される評価レベルである。レベルG3は、そのサイズが、レベルG1と認定される範囲よりも小さく、使用可能な細胞サイズとして予め設定された範囲の下限よりも大きい範囲にある細胞Cに付与される評価レベルである。レベルG4は、その形状が、レベルG1と認定される形状(例えば球形に近い形状)の範囲からは逸脱するが、使用可能な範囲の歪な形状の細胞Cに付与される評価レベルである。レベルG5は、その色合いが、レベルG1と認定される色合い(例えば当該細胞の自然色)の範囲からは逸脱するが、使用可能な範囲の色合いの細胞Cに付与される評価レベルである。
評価部74は、ディッシュ10に保持されている各細胞Cの各々に、上記のような評価レベルテーブルを参照して、レベルG1〜G5のいずれかの評価レベルを割り当てる。これに続き振り分け処理部75は、細胞Cの移動先となるマイクロプレート4のウェル41を、各々の細胞Cについて設定する振り分け処理を実行する。
<振り分け処理の比較例>
先ず、前記振り分け処理について、本実施形態に対する比較例を図11(A)〜(C)に基づいて説明する。図11(A)は、ディッシュ10に保持されている細胞Cへのナンバリングの例、図11(B)は、マイクロプレート4(ウェル41)への細胞Cの吐出順を示す図、図11(C)は、マイクロプレート4への細胞Cの吐出状況を示す図である。図11(A)のディッシュ10及び担持されている細胞Cの分布は、先に図10に示したものと同じである。図11(B)及び(C)では、3行(p1〜p3)×7列(q1〜q7)のウェル41を有するマイクロプレート4が例示されている。
振り分けに先立ち、図11(A)に示すように、ディッシュ10上の各細胞Cにナンバリングが施される。ここでは、m1行のn1列からn8列、次いでm2行のn1列からn8列という順に、保持凹部3を走査してゆき、保持されている細胞Cが存在したら、その細胞Cに通し番号を順次付与するという例を示している。図11(A)の例では、21個の使用可能な細胞Cがディッシュ10に担持されており、これらに1〜21番のナンバリングが付されている。これは、チップ6による細胞Cの吸引順を示す番号でもある。
図11(B)に示すように、比較例では、マイクロプレート4の3行×7列のウェル41の並びの順に、21個の細胞Cの移動先が設定される。すなわち、p1行のq1列からq7列、次いでp2行のq1列からq7列、最後にp3行のq1列からq7列という順に、ナンバリングの順列通りに各細胞Cの移動先が設定される。そして、図11(C)に示すように、設定された移動先に、保持凹部3の各細胞Cがウェル41に移動される。例えば、アドレス=p1,q1のウェル41には「1」が割り当てられているので、「1番」にナンバリングされた細胞Cが移動される。アドレス=p2,q3のウェル41ならば、「10番」の細胞Cが移動される。
比較例のような細胞Cの移動が行われると、評価レベルの異なる細胞Cがランダムにマイクロプレート4上に配列されることになる。実際のマイクロプレート4の使用態様においては、例えばp1行の各ウェル41には化合物Aが配合された細胞培養液が、p2行の各ウェル41には別の化合物Bが配合された細胞培養液が、p3行の各ウェル41にはさらに別の化合物Cが配合された細胞培養液が、それぞれ注液されるような場合がある。これにより、細胞Cについて、化合物A、B、Cの各々に対する反応を試験することができる。
しかしながら、p1行、p2行及びp3行に、同じ品質の細胞Cが均等に配分されていないと、化合物に対する感受性を平等に評価することができなくなる。例えば、p1行にはレベルG1の細胞Cが2個含まれているものの、レベルG5の細胞Cが3個含まれている。これに対し。p2行にはレベルG5の細胞Cが含まれていない等、p1行〜p3行間における細胞Cの品質のバラツキが大きい。このため、化合物A、B、Cに対する反応の相違が、細胞本来の性質に由来するものであるのか、或いは、品質のバラツキに伴う感受性の相違に由来するものなのか、判別できない場合が生じ得る。
<本実施形態に係る振り分け処理>
本実施形態によれば、このような不具合を解消することができる。図12(A)は、ディッシュに保持されている細胞Cを示す平面図、図12(B)は、本実施形態に係るマイクロプレート4への細胞Cの移動先を示す図、図12(C)は、本実施形態に係るマイクロプレート4への細胞Cの吐出状況を示す図である。図12(A)に示すディッシュ10及び担持されている細胞Cの分布は図11(A)と同じであり、図12(B)及び(C)におけるマイクロプレート4のウェル41の配置も、図11(B)及び(C)と同じである。
図12(A)の例では、21個の使用可能な細胞Cがディッシュ10に担持されている。図示は省いているが、図11(A)と同様に、各細胞Cには1〜21番のナンバリングが付されている。本実施形態では、このナンバリングは各細胞Cの管理ナンバーとなる。そして、これらの細胞Cには、図10に示した評価基準に従い、評価部74によってレベルG1〜G5の評価レベルが付されている。評価部74は、制御部7が備える図略の記憶部に、次の表1に示すようなテーブルを格納する。なお、ディッシュ10の作業ステージ上における配置位置がXY座標系で既知であれば、ディッシュアドレスに代えてXY寸法を用いるようにしても良い。
Figure 0006710772
続いて、振り分け処理部75により、各細胞Cをマイクロプレート4のどのウェル41に収容させるかの振り分けが決定される。本実施形態では、予めマイクロプレート4が有する複数のウェル41が複数のグループに区分され、これらグループに同じ評価レベルの細胞Cが均等に配分されるように、各細胞Cの移動先が設定される。図12(B)に示す例では、p1行のウェル41が「グループI」、p2行が「グループII」、p3行が「グループIII」というようにグループ分けが為されている。これら、グループI、II、IIIの各々のウェル41に、細胞Cの評価レベル別の移動枠が設定される。
図12(B)の例では、q1列〜q3列のウェル41についてはレベルG1が割り当てられている。つまり、グループI〜IIIのいずれもが、最も品質の良いレベルG1の細胞Cが割り当てられる移動枠を3つずつ保有することになる。また、q4列のウェル41にはレベルG2、q5列にはレベルG3、q6列にはレベルG4、q7列にはレベルG5がそれぞれ割り当てられている。つまり、グループI〜IIIのいずれもが、レベルG2〜G5の細胞Cが割り当てられる移動枠を1つずつ保有することになる。これにより、グループI〜IIIが各々備えるウェル群に、レベルG1〜G5の細胞Cを均等に配分することが可能となる。
このような配分に際しては、ディッシュ10上において使用可能な細胞Cが特定され、これら細胞Cについて評価レベルが付与された後、各評価レベルの細胞Cの個数が求められる。そして、評価レベル毎の細胞Cの個数をウェル41のグループ数で除算することによって、各グループへの割当数が設定される。当然、細胞Cの個数がグループ数で割り切れない場合も生ずるが、その際の処理例については図14に基づき後述する。なお、図12(A)で示している細胞Cの評価レベル毎の個数と、図12(B)の評価レベルの割当数とは一致していない。つまり、図12(A)ではレベルG1の細胞Cは5個しか存在しないが、図12(B)での説明を簡略化するため、レベルG1の細胞Cが9個存在することを前提に記載している。
振り分け処理部75は、以上のような演算を行った後、表1のテーブルに、各細胞Cの移動先となるウェル41のアドレスとを紐付けする処理を行う。振り分け処理部75は、制御部7が備える図略の記憶部に、次の表2に示すようなテーブルを格納する。
Figure 0006710772
軸制御部76は、上記表2のテーブルを参照して、ヘッドユニット61を移動させ、各細胞Cを指定された移動先アドレスのウェル41へ移動させる。図12(C)は、表2のテーブルに沿って細胞Cがマイクロプレート4に移動された後の状態を示している。グループI〜IIIには、それぞれレベルG1の細胞Cが3個、レベルG2〜5の細胞Cが各1個ずつ配分されている。つまり、同じ評価レベルの細胞Cが均等に配分されている。グループI〜IIIは、典型的にはウェル41に注液する細胞培養液の条件によって区分される。例えば、グループIのウェル41群には化合物Aを含む細胞培養液が、グループIIには化合物Bを、グループIIIには化合物Cを含む細胞培養液が、各々注液される。この場合、各グループのウェル41群には同じ評価レベルの細胞Cが均等に配分されているので感受性が平等となり、化合物A〜Cに対する細胞Cの反応等を的確に評価することができる。なお、各グループI〜IIIのウェル41は、必ずしも物理的に近接した位置に存在していなくとも良く、同じ化合物A〜Cが割り当てられ得る限りにおいて、物理的に離間していても良い。さらに、グループI〜IIIの区別は、同一の化合物で濃度が異なるもので区別されるものでも良い。
次に、複数のチップ6から複数のウェル41に細胞Cを同時吐出する場合の振り分け例を示す。ここでは、図8に示したように、3本のヘッド63A、63B、63Cに、それぞれチップ6A、6B、6Cが装着されているヘッドユニット61を想定する。3本のチップ6A〜6Cから細胞Cの同時吐出を行い、且つ、図12(C)に例示の通りに各レベルの細胞Cが配列された状態とするには、下記の表3の通りにチップ6A〜6Cの吸引順番を設定すれば良い。表3において、ヘッド番号1=ヘッド63A、ヘッド番号2=ヘッド63B、ヘッド番号3=ヘッド63Cである。また、ヘッドユニット61がディッシュ10の左側からアプローチするケースを想定して、吸引順番はヘッド63C→ヘッド63B→ヘッド63A(チップ6C→チップ6B→チップ6A)の順としている。
Figure 0006710772
表3のシーケンスによれば、3つのヘッド63C〜63Aの各チップ6C〜6Aの全てに細胞Cを順次吸引させる1サイクル目の吸引(吸引順番1〜3)では、チップ6CにはレベルG3、チップ6B及びチップ6AにはレベルG1の細胞Cが各々吸引される。表3の移動先アドレスは、チップ6A〜6Cのピッチx2がウェル41のピッチx1の2倍であることが考慮されている。従って、1サイクル目で吸引された細胞Cをマイクロプレート4に同時吐出させると、p1行のq1、q3、q5のウェル41には図12(C)の配列に沿った各レベルの細胞Cが収容される。また、2サイクル目の吸引(吸引順番4〜6)では、チップ6CにはレベルG4、チップ6BにはレベルG2、チップ6AにはレベルG1の細胞Cが各々吸引される。これら細胞Cをマイクロプレート4に同時吐出させると、p1行のq2、q4、q6のウェル41には図12(C)の配列に沿った各レベルの細胞Cが収容される。以下のサイクルでも同様である。図12(C)のように、各レベルの細胞Cが順列通りに配列されていると、薬効などを細胞Cのレベル別に一見で確認できる利点がある。
<変形例>
図13は、本実施形態の第1変形例を説明するための図である。ここでは、マイクロプレート4が備える複数のウェル41をグループ分けする際、上述のようなグループI〜IIIに加えて、コントロールグループが追加された例を示している。図13の例では、p1行〜p3行のウェル41群がグループI〜IIIにグループ分けされると共に、pr行のウェル41群がコントロールグループに区分されている例を示している。グループI〜IIIについては、上記実施形態と同様に、同じ評価レベルの細胞Cが均等に配分されている。一方、コントロールグループについては、最良のレベルG1の細胞Cだけ配分されている。
コントロールグループは、例えば化合物を含有させないエリア(無化合物エリア)として利用される。これにより、例えば細胞Cを死滅させる薬効をグループI〜IIIに注液する各化合物にて確認する実験を行う場合において、無化合物エリアを設けることで、細胞Cが薬効により死滅したのか、細胞Cが自然死したのかを確認することが可能となる。或いは、薬効が強力と推定される配合の薬剤化合物をコントロールグループのウェル41に注液することで、細胞Cを確実に死滅させ得る配合量や組成等を知見するためのエリアとして、コントロールグループを利用することもできる。逆に、薬効が不作用と推定される配合の薬剤化合物を注液することで、細胞Cの生存を確保できる配合量や組成等を確認するエリア等として、コントロールグループを利用することもできる。コントロールグループに如何なる品質の細胞Cを収容させるかは、実験目的等により任意に決定され、例えば図13に示すように、最良レベルG1の細胞Cを移動させることに代えて、平均レベル(例えばレベルG2〜G3の細胞C)を収容させるようにしても良い。勿論、グループI〜IIIと同じレベルの細胞Cをコントロールグループに配分することもできる。
図14は、本実施形態の第2変形例を説明するための図である。図12(B)、(C)では、各評価レベルの細胞群の数がグループ数で割り切れる単純な例を示した。すなわち、評価レベルとして、第1レベル(レベルG1)と、該第1レベルよりもグレードの低い第2レベル(G2)とを含み、前記グループがnグループだけ存在するとした場合に、振り分け処理部75は、前記第1レベルの細胞Cがa個存在し、前記第2レベルの細胞Cがb個存在するとき、a/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てると共に、b/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てる例を示した。具体的には、レベルG1の細胞Cが9個、レベルG1よりもグレードの低いレベルG2〜G5の細胞Cが各3個、マイクロプレート4上のグループが3グループだけ存在し、レベルG1の細胞Cについて9/3個の移動先アドレスが、またレベルG2〜G5の細胞Cについて3/3個の移動先アドレスが、各グループI〜IIIに割り当てられる例を示した。
これに対し、図14では、細胞Cの個数がグループ数で割り切れない場合における細胞Cの均等配分の処理例を示している。この場合、振り分け処理部75は、第1レベル(レベルG1)の細胞Cがa/nの商の個数だけ配分される第1グループ(図14ではp3行のグループIII)と、a/nの剰余を1個ずつ商に加算した個数が配分される第2グループ(p1、p2行のグループI、II)とを設定する。そして、振り分け処理部75は、第2レベル(レベルG2)の細胞Cを、前記第1グループにおける前記第1レベルの細胞Cの不足分の移動先アドレス(p3、q4)へ優先的に割り当てる。下位グレードのレベル(レベルG2〜G5)間においても、同様な割り当て処理が行われる。
図14では、細胞Cの個数が、レベルG1=11個、レベルG2=8個、レベルG3=9個、レベルG4=6個、レベルG5=8個、そして、マイクロプレート4のグループ数n=3である例を示している。細胞Cの配分は、アドレスp1、q1から開始し、q1列、q2列・・・q14列という順で決定されるものとする。上記の配分手法に従うと、最良のレベルG1の細胞Cの配分は、
a/n=11/3=3余り2
の演算結果で設定される。まず、商の個数である3個のレベルG1が配分されるグループが1つ設けられる。そして、剰余=2個のうちの1個ずつを、商の個数である3個にそれぞれ加算した4個のレベルG1が配分されるグループが2つ設けられる。ここでは、グループI、IIに4個のレベルG1が配分され、残りのグループIIIに3個のレベルG1が配分されている例を示している。
グループIIIは、最良のレベルG1の割り当てが他のグループI、IIに比べて一つ少ない。このため、グループIIIには、レベルG1に次いでグレードが高いレベルG2の細胞Cが優先的に割り当てられるようにする。つまり、最もレベルG2を多く割り当てることができるようにする。従って、アドレス=p3、q4には、レベルG2が割り当てられる。q5列以降も、グループIIIのp3行に先ずレベルG2が割り当てられる。レベルG2=8個であるので、q7列においてはp3行だけにレベルG2が割り当てられている。このような割り当て手法によれば、グループIIIにおけるレベルG1の不足分を、レベルG2の優先割り当てによって補い、グループ間の均等化を図ることができる。
レベルG3の配分については、グループI又はIIが優先される。図14では、グループIIのp2行が優先される例を示しており、q10列ではp2行だけにレベルG3が配分されている。続くレベルG4の配分については、グループIのp1行が優先され、q12列ではp1行だけにレベルG4が配分されている。残余のウェル41については、残りのレベルG5が割り当てられている。このように、レベルG2以降の配分についても、レベルG1−G2間と同様な均等化処理が為されている。
上記の、細胞Cの個数がグループ数で割り切れない場合の処理は、細胞Cの個数がグループ数よりも少ない場合にも適用できる。例えば、レベルG1の細胞C=11個である一方で、マイクロプレート4のグループ数n=13のような場合である。この場合、2つのグループにはレベルG1が割り当てられないことになる。このため、前記2つのグループにはレベルG2を優先的に割り当てる(最もレベルG2を多く割り当てる)ようにすれば良い。
[細胞移動装置の動作フローの説明]
図15A及び図15Bは、細胞移動装置Sの動作の一例を示すフローチャートである。ここでは、図1に示すように、細胞培養液に分散された複数の細胞Cが選別容器1に注入され、ディッシュ10上に細胞Cが保持されている状態が形成されているものとする。まず、細胞Cを保持しているディッシュ10の撮像が行われる。撮像制御部71がカメラ軸駆動部53を制御し、カメラユニット5を選別容器1の下方の撮影位置、つまりn番目の画像のキャプチャ位置へ移動させる。例えば、カメラユニット5が有する撮影範囲AV(図5)では、ディッシュ10の撮影要の面積の全てを撮像するのに100回の撮像を要する場合、1/100番目(n=1)の画像のキャプチャ位置へカメラユニット5が移動される。そして、撮像制御部71はカメラユニット5に撮像動作を実行させる(ステップS1)。撮像により取得された画像データは、画像メモリ72に格納される。
次に、ディッシュ10に担持されている物体のうち、使用可能な細胞Cを特定する処理が実行される(ステップS2)。具体的には、画像処理部73によるディッシュ10の画像データに画像処理と、評価部74による細胞Cの判定処理とが実行される。画像処理部73は、ディッシュ10上における細胞Cの存在を画像上で認識する処理、及び、認識された細胞Cの形状を認識する処理などを行う。評価部74は、画像処理部73による認識処理後の画像データに基づき、ディッシュ10に担持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞Cと、前記基準を満たさない細胞及び夾雑物とを区分する処理を行う。
続いて評価部74は、所定の基準を満たす使用可能なディッシュ10上の細胞Cについて、管理ナンバーとなる通し番号を付与するナンバリングを行う(ステップS3)。このナンバリングについては、先に図11(A)に基づき説明した通りである。ここで、夾雑物を除き、使用不能と判定された細胞にもナンバリングを行い、例えばディッシュ10上に分散された細胞Cの使用可能率などの統計処理を行うようにしても良い。
続いて、マイクロプレート4に移動させる細胞Cの数が目的数に達したか否かが確認される(ステップS4)。つまり、細胞Cの受け入れ先となるマイクロプレート4のウェル41の全てに対し、目的とするレベルの細胞Cを供給できるだけの数の細胞Cを取得できたか否かが確認される。目的数の細胞Cが未だ確保できていない場合(ステップS4でNO)、次のステップS5へ移行し、目的数の細胞Cが確保できた場合(ステップS4でYES)、ステップS7へスキップする。
その後、評価部74は、管理ナンバーが付与された細胞Cの各々に対して、例えば図10に示した評価基準に従い、レベルG1〜G5の評価レベルを付与する処理を行う(ステップS5)。さらに評価部74は、管理ナンバー、細胞Cの保持位置である保持凹部3のディッシュアドレスと評価レベルとを関連付けた、先に表1に示したようなテーブルを作成する。
以上の動作により、1つのキャプチャ画像についての評価処理が終了となる。その後、画像のキャプチャ回数nが所定回数(Max)に達したか否かが確認される(ステップS6)。Max回数に達していない場合(ステップS6でNO)は、ステップS1に戻り、次のキャプチャ位置において撮像が実行され、同じ処理が繰り返される。上述のように、ディッシュ10の全てをカバーするのに100回の撮像が必要な場合は、同じ動作が100回繰り返される。
キャプチャ回数nがMaxに達した場合(ステップS6でYES)、評価部74は、個々のキャプチャ位置において得られたテーブルを統合し、これらテーブルのデータをレベルG1〜G5別に細胞Cをソートする処理を行う(ステップS7)。これにより、例えば100回の撮像及び画像処理によって使用可能と判定された細胞Cの全てについて、レベルG1〜G5別にソートされたテーブルが作成される。この時点に至れば、ディッシュ10上におけるレベルG1〜G5毎の細胞Cの個数が把握される。
続いて、振り分け処理部75が、細胞Cの移動先となるマイクロプレート4の各グループの各ウェル41に、移動先アドレスを付与するアドレス設定を行う(ステップS8)。このアドレス設定は、例えば、図12(B)に例示しているようなp行×q列のアドレス設定とすることができる。なお、図12(B)では、1行単位でグループI〜IIIの区分が為されている例を示しているが、所定のp行×q列のエリア単位で、グループ分けを行ってもよい。この場合、前記エリア単位で通し番号を付与するようなアドレス設定が行われても良い。
引き続き、振り分け処理部75により、レベルG1〜G5別にソートされた細胞Cを、マイクロプレート4の各グループに同じ評価レベルの細胞Cが均等に配分されるように、各細胞Cの移動先を設定する振り分け処理が実行される(ステップS9)。この振り分け処理は、図12(B)、(C)、或いは図13に基づき説明した通りである。また、各評価レベルの細胞群の数がグループ数で割り切れない場合において、完全均等配分に可及的に近づける振り分け処理は、図14に基づき説明した通りである。
振り分け処理部75は、前記振り分け処理を終えると、使用可能な細胞Cの管理ナンバーと、各細胞Cの移動先となるウェル41のアドレスとを紐付けする処理を行い、先に表2に示したようなテーブルを作成する(ステップS10)。そして、軸制御部76及びヘッド制御部77が、振り分け処理部75が作成した前記テーブルを参照して、ディッシュ10からの細胞Cの吸引、及びヘッドユニット61の移動を行う(ステップS11)。
図15Bを参照して、マイクロプレート4の所定位置へのヘッドユニット61の移動が完了すると、ヘッド制御部77が、チップ6から指定された移動先アドレスのウェル41への当該細胞Cの吐出を実行させる(ステップS12)。
続いて、撮像制御部71がカメラユニット5に、マイクロプレート4へ移動された細胞Cの画像を取得する撮像動作を実行させる(ステップS13)。取得された画像データは画像処理部73により画像処理され、指定されたレベルの細胞Cが、指定されたアドレスのウェル41へ収容されているか否かが判定される(ステップS14)。これは、細胞Cの吸引ミスや吐出ミスが発生し得ることに対応するためである。
予定通りに各レベルの細胞Cが指定アドレスに収容されている場合(ステップS14でYES)、ナンバリングした全ての細胞Cの移動が完了したか否かが確認される(ステップS15)。全細胞Cの移動が完了していれば(ステップS15でYES)、制御部7は処理を終える。
予定通りに各レベルの細胞Cが指定アドレスに収容されていなかった場合(ステップS14でNO)、マイクロプレート4の細胞収容データが、実際の収容状況に応じて更新される(ステップS16)。細胞収容データは、マイクロプレート4のどのウェル41に、どのレベルの細胞Cが実際に収容されたかを示すデータである。このため、予定通りの細胞Cの移動が行われた場合であって(ステップS14でYES)、全細胞Cの移動が完了していない場合(ステップS15でNO)においても、予定通りに細胞Cの移動が実行されたことを反映するために、前記細胞収容データが更新される(ステップS16)。その後、処理はステップS8に戻り、更新された細胞収容データをベースとして、ステップS8以下の処理が実行される。
<細胞の同時吐出の変形例>
続いて、第3変形例として、ヘッドユニット61が細胞Cを吸引及び吐出するチップ6を複数本備え、これらチップ6からマイクロプレート4の複数のウェル41へ同時に吐出させる例について説明する。例えば、図8に示したような、3本のチップ6A、6B、6Cが一列(所定の配列状態)に装着されたヘッドユニット61を用いて同時吐出を行えれば、細胞Cの移動に要する時間を大幅に短縮することが可能となる。
図16は、ディッシュ10の保持凹部3に保持されている細胞C及びその評価レベルを模式的に示す図である。ここでは、保持されている細胞Cの各々に、チップ6で吸引される順に通し番号が振られ、且つ、評価レベルG1〜G4が表示されている。例えば、「1−G1」は、1番目に吸引されるレベルG1の細胞C、「7−G2」は、7番目に吸引されるレベルG2の細胞Cを意味する。
3本のチップ6A、6B、6Cを備えたヘッドユニット61が用いて当該ディッシュ10から細胞Cの吸引が行われる場合、1回の吸引当たり、各チップ6A〜6Cによって吸引される細胞Cは、
・1回目の吸引=「1−G1」、「2−G3」、「3−G4」
・2回目の吸引=「4−G1」、「5−G2」、「6−G2」
・3回目の吸引=「7−G2」、「8−G1」、「9−G4」
となる。
図17は、マイクロプレート4への細胞Cの均等振り分けの例を示す模式図である。ここでは、3行(p1〜p3)×8列(q1〜q8)のウェル41を有するマイクロプレート4において、p1行のウェル41が「グループI」、p2行が「グループII」、p3行が「グループIII」にグループ分けされている例を示している。そして、例えば図15のステップS8の振り分け処理により、各グループI〜IIIのq1及びq2列がレベルG1、q3及びq4列がレベルG2、q5及びq6列がレベルG3、q7及びq8列がレベルG4の細胞Cに割り当てられたとする。
ここで、図8に例示したように、一列に配列された3本のチップ6A、6B、6Cの配列ピッチx2が、ウェル41の配列ピッチx1の2倍である場合を想定する。この場合、上記の1回目の吸引によってチップ6A〜6Cに保持させた「1−G1」、「2−G3」、「3−G4」の細胞Cをマイクロプレート4に同時吐出させようとしても、図17の割り当てにマッチする箇所は存在しない。例えば図18に示すように、グループIのp1行に1回目に吸引された細胞Cを同時吐出させると、アドレス=p1,q1のウェル41にはG1が、p1,q3にはG3が、p1,q5にはG4の細胞Cが各々吐出されることとなり、図17のレベル割り当てには合致しなくなる。
このため、1回目の吸引で保持させた細胞Cを吐出する場合、先ずチップ6Aとアドレス=p1,q1のウェル41とを位置合わせし、ヘッド63Aの下降、チップ6Aからの吐出、上昇の動作を行い、次いでチップ6Bとp1,q5のウェル41とを位置合わせするようヘッドユニット61を移動させ、ヘッド63Bの下降、チップ6Bからの吐出、上昇の動作を行い、最後に、チップ6Cとp1,q7のウェル41とを位置合わせするようヘッドユニット61を移動させ、ヘッド63Cの下降、チップ6Cからの吐出、上昇の動作を行う、といった動作が必要となる。このような各チップ6A〜6Cからの細胞Cの個別吐出動作は、時間を要してしまう。
そこで、各チップ6A〜6Cからの細胞Cの同時吐出が可能なように、振り分け処理部75は、同じ評価レベルの細胞CがグループI〜IIIの各々に均等に配分される設定の範囲内において、細胞Cの移動先を再設定する処理を行う。具体的には、振り分け処理部75は、図16に示すような細胞Cの吸引順及びその評価レベルが把握されたら、図17に示した均等振り分けの枠の範囲内で、各グループ内のレベル別の割り当てを同時吐出が可能なように変更する。
図17の均等振り分けの例では、各グループI〜III共、q1列からq8列まで、G1〜G4の順に2個ずつ割り当てられている。これを、例えばグループIならば、図18に示すように、p1,q3のアドレスをレベルG2からレベルG3に変更し、p1,q5のアドレスをレベルG3からレベルG4に変更する(p1,q1はレベルG1のまま変更不要)。
2回目の吸引では、チップ6A〜6Cに「4−G1」、「5−G2」、「6−G2」の細胞Cが保持される。このため、2回目の吐出もグループIのウェル41に行わせる場合は、図19(A)に示すように、p1,q6のアドレスをレベルG3からレベルG2に変更する(p1,q2はレベルG1のまま、p1,q4はレベルG2のまま変更不要)。2回目の吐出をグループIIのウェル41に行わせる場合は、図19(B)に示すように、p2,q6のアドレスをレベルG3からレベルG2に変更する(p2,q1はレベルG1のまま、p2,q3はレベルG2のまま変更不要)。このように、各レベルの細胞Cの移動先を再設定することによって、チップ6A〜6Cからの同時吐出が行えるようになり、作業効率を高めることができる。
細胞Cの移動先の再設定は、各グループI〜IIIについて均等振り分けで割り当てられた各レベルの個数の範囲内において、3つ(複数)のチップ6A〜6Cからなるべく同時吐出が可能となるように行えば良い。同時吐出でカバーできないアドレスのウェル41については、個別吐出で対応する。例えば、図19(A)の例であれば、グループIに割り当てられたレベルG1〜G4の中で、各個数=2を満たしていないのはレベルG3,G4の各1個である。従って、例えばp1,q7のアドレスにはレベルG3、p1,q8のアドレスにはレベルG4が割り当てられ、これらについては個別吐出で細胞Cが吐出されることになる。なお、同時吐出は同じグループ内には限られず、複数のグループに跨って同時吐出を行わせても良い。
以上説明した本実施形態に係る細胞移動装置Sによれば、先ず制御部7の評価部74が、細胞Cの移動元であるディッシュ10上において、保持凹部3に保持されている複数の細胞Cの各々に対して評価レベルを付与する。これにより、ディッシュ10に、如何なる品質の細胞Cが何個保持されているかを把握することができる。続いて、振り分け処理部75が、同じ評価レベルの細胞Cが、マイクロプレート4に設定されたグループI〜IIIの各々に均等に配分されるように、ディッシュ10上の各細胞Cの移動先を設定する。従って、例えば評価レベルの高い細胞C、或いは評価レベルの低い細胞Cが、結果的にマイクロプレート4の特定のグループに偏在することが回避される。このため、細胞移動装置Sを用いることで、グループI〜III間において品質の格差のない細胞Cを対象として、各種の処理を行えるようになる。
なお、本発明において「評価レベル」は多様な意味を持ち得る。上記実施形態では、専ら細胞Cの形状や色合い等に基づく経験則的な品質良否に従って、評価レベルがレベルG1〜G5の5段階に設定されている例を示した。評価レベルは、細胞Cに対する物理的な計測値自体としても良い。例えば、細胞Cの球形度や色合い等の計測値自体を評価レベルと扱っても良い。このケースは、計測値の分解能がさほど高くない場合に有用である。一方、前記計測値の分解能が比較的高い場合、計測値自体を評価レベルと扱うと、「同じ評価レベル」が細分化されすぎてしまう。このようなケースでは、複数の細胞Cの計測値を所定範囲単位で区分し、一つの所定範囲に入る細胞Cの群を「同じ評価レベル」と扱うようにすることができる。つまり、「同じ評価レベル」の概念は、細胞Cの状況に応じて適宜設定することができる。
なお、上述した具体的実施形態には以下の構成を有する発明が主に含まれている。
本発明の一局面に係る細胞移動装置は、移動対象の細胞を保持する複数の保持部を有するディッシュと、前記細胞を受け入れる複数のウェルを有し、これらウェルが複数のグループに区分されたマイクロプレートと、前記細胞を、前記ディッシュから前記マイクロプレートへ移動させる移動部と、前記細胞が前記保持部に保持された状態の前記ディッシュの画像を撮像する撮像部と、前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている複数の細胞の各々に対して評価レベルを付与する評価部と、同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定する振り分け処理部と、前記振り分け処理部によって設定された前記移動先に従って、前記ディッシュの前記保持部に保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるよう、前記移動部を制御する移動制御部と、を備える。
本発明の他の局面に係る細胞移動方法は、ディッシュに保持された細胞を、複数のウェルが複数のグループに区分されているマイクロプレートへ移動させる細胞移動方法であって、移動対象の細胞を保持するディッシュの画像を撮像するステップと、予め定められた細胞の複数段階の評価レベルを参照し、前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている複数の細胞の各々に対して評価レベルを付与するステップと、同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定するステップと、前記移動先の設定に従って、前記ディッシュに保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるステップと、を含む。
この細胞移動装置又は方法によれば、先ず評価部が、細胞の移動元であるディッシュ上において、保持されている複数の細胞の各々に対して評価レベルを付与する。これにより、ディッシュに、如何なる品質の細胞が何個保持されているかを把握することができる。続いて、振り分け処理部が、同じ評価レベルの細胞が、マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定する。従って、例えば評価レベルの高い細胞、或いは評価レベルの低い細胞が、結果的にマイクロプレートの特定のグループに偏在することが回避される。このため、グループ間において品質の格差のない細胞を対象として、各種の処理を行えるようになる。
上記の細胞移動装置において、前記評価部は、前記ディッシュの画像に基づいて、所定の基準を満たす細胞と、前記基準を満たさない細胞及び夾雑物とを区分し、前記基準を満たす細胞について前記評価レベルを付与することが望ましい。
この細胞移動装置によれば、前記評価レベルを付与する前に、移動対象とする細胞の判別、つまり使用可能な細胞とその他の細胞類との篩い分けが行われる。従って、マイクロプレートに移動する細胞の品質のバラツキを抑制することができる。
上記の細胞移動装置において、前記マイクロプレートの前記ウェルには培養液が注液され、前記複数のグループは、前記培養液の条件によって区分されていることが望ましい。
この細胞移動装置によれば、培養液の条件、例えば添加する化合物を異ならせることで前記複数のグループが形成されている場合に、グループ間の細胞品質が均質化されているので、各化合物に対する感受性を平等に評価することができる。
上記の細胞移動装置において、前記評価レベルとして、第1レベルと、該第1レベルよりもグレードの低い第2レベルとを含み、前記グループがnグループ有る場合に、前記振り分け処理部は、前記第1レベルの細胞がa個存在し、前記第2レベルの細胞がb個存在するとき、a/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てると共に、b/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てることが望ましい。
この細胞移動装置によれば、グレードの異なる第1、第2レベルの細胞を、マイクロプレートのn個のグループの各々に対して均等に配分する処理を、簡易なロジックで実行させることができる。
上記の細胞移動装置において、aがnで割り切れない場合、前記振り分け処理部は、前記第1レベルの細胞がa/nの商の個数だけ配分される第1グループと、a/nの剰余を1個ずつ商に加算した個数が配分される第2グループとを設定し、前記第2レベルの細胞を、前記第1グループにおける前記第1レベルの細胞の不足分の移動先アドレスへ優先的に割り当てることが望ましい。
この細胞移動装置によれば、aがnで割り切れず(aがnよりも少ない場合を含む)、グレードの高い第1レベルの細胞が他のグループに比べて1個不足するグループには、第1レベルに続くグレードを有する第2レベルの細胞が優先的に割り当てられる。従って、aがnで割り切れない場合でも、グループ間の品質を可及的に均一化することができる。
上記の細胞移動装置において、前記移動部は、細胞を吸引及び吐出することが可能なチップを、所定の配列状態で複数個備え、前記チップは前記保持部において細胞を吸引し、前記ウェルにおいて細胞を吐出するものであって、前記振り分け処理部は、同じ評価レベルの細胞が前記グループの各々に均等に配分される設定の範囲内において、複数個の前記チップから複数の前記ウェルへ同時に吐出が可能なように、細胞の移動先を再設定することが望ましい。
この細胞移動装置によれば、複数個のチップによりディッシュから吸引された細胞を、当該複数個のチップからマイクロプレートのウェルへ同時に吐出させることができる。従って、細胞移動の作業効率を高めることができる。
以上説明した本発明によれば、細胞を保持するディッシュから細胞を受け入れるウェルを有するマイクロプレートへ細胞を移動させる細胞移動装置において、同等品質の細胞を複数のグループのウェルに均等に配分することができる。従って、グループ間において品質の格差のない細胞を対象として各種の処理を行えるので、より精度の高い処理結果を得ることができる。

Claims (7)

  1. 移動対象の細胞を保持する複数の保持部を有するディッシュと、
    前記細胞を受け入れる複数のウェルを有し、これらウェルが複数のグループに区分されるマイクロプレートと、
    前記細胞を、前記ディッシュから前記マイクロプレートへ移動させる移動部と、
    前記細胞が前記保持部に保持された状態の前記ディッシュの画像を撮像する撮像部と、
    前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞を使用可能な細胞として選別すると共に、予め定められた複数段階の評価レベルを参照し、前記使用可能な細胞の各々に対して評価レベルを付与する評価部と、
    同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定する振り分け処理部と、
    前記振り分け処理部によって設定された前記移動先に従って、前記ディッシュの前記保持部に保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるよう、前記移動部を制御する移動制御部と、
    を備える細胞移動装置。
  2. 請求項1に記載の細胞移動装置において、
    前記評価部は、前記ディッシュの画像に基づいて、前記所定の基準を満たす細胞と、前記基準を満たさない細胞及び夾雑物とを区分することで、前記使用可能な細胞を選別する、細胞移動装置。
  3. 請求項1又は2に記載の細胞移動装置において、
    前記マイクロプレートの前記ウェルには培養液が注液され、
    前記複数のグループは、前記培養液の条件によって区分されている、細胞移動装置。
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞移動装置において、
    前記評価レベルとして、第1レベルと、該第1レベルよりもグレードの低い第2レベルとを含み、前記グループがnグループ有る場合に、
    前記振り分け処理部は、前記第1レベルの細胞がa個存在し、前記第2レベルの細胞がb個存在するとき、a/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てると共に、b/n個の移動先アドレスを各グループに割り当てる、細胞移動装置。
  5. 請求項4に記載の細胞移動装置において、aがnで割り切れない場合、
    前記振り分け処理部は、
    前記第1レベルの細胞がa/nの商の個数だけ配分される第1グループと、a/nの剰余を1個ずつ商に加算した個数が配分される第2グループとを設定し、
    前記第2レベルの細胞を、前記第1グループにおける前記第1レベルの細胞の不足分の移動先アドレスへ優先的に割り当てる、細胞移動装置。
  6. 請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞移動装置において、
    前記移動部は、細胞を吸引及び吐出することが可能なチップを、所定の配列状態で複数個備え、前記チップは前記保持部において細胞を吸引し、前記ウェルにおいて細胞を吐出するものであって、
    前記振り分け処理部は、同じ評価レベルの細胞が前記グループの各々に均等に配分される設定の範囲内において、複数個の前記チップから複数の前記ウェルへ同時に吐出が可能なように、細胞の移動先を再設定する、細胞移動装置。
  7. ディッシュに保持された細胞を、複数のウェルが複数のグループに区分されているマイクロプレートへ移動させる細胞移動方法であって、
    移動対象の細胞を保持するディッシュの画像を撮像するステップと、
    前記ディッシュの画像に基づいて、前記ディッシュに保持されている物体のうち、所定の基準を満たす細胞を使用可能な細胞として選別するステップと、
    予め定められた細胞の複数段階の評価レベルを参照し、前記使用可能な細胞の各々に対して評価レベルを付与するステップと、
    同じ評価レベルの細胞が、前記マイクロプレートの前記グループの各々に均等に配分されるように、前記ディッシュ上の各細胞の移動先を設定するステップと、
    前記移動先の設定に従って、前記ディッシュに保持された細胞を、前記マイクロプレートの各グループの各ウェルへ移動させるステップと、
    を含む細胞移動方法。
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