WO2024085640A1 - 치료 유도 노화 세포 사멸용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2024085640A1
WO2024085640A1 PCT/KR2023/016121 KR2023016121W WO2024085640A1 WO 2024085640 A1 WO2024085640 A1 WO 2024085640A1 KR 2023016121 W KR2023016121 W KR 2023016121W WO 2024085640 A1 WO2024085640 A1 WO 2024085640A1
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WO
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pim
cells
kinase
treatment
senescence
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PCT/KR2023/016121
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최용원
박태준
이동현
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아주대학교산학협력단
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treatment-induced senescent cell death and its use, and more specifically, to a composition for treatment-induced senescent cell death containing a Pim-1 kinase inhibitor and its use for preventing or treating age-related diseases or cancer. will be.
  • Senescence refers to a state of cells that exhibits stable cell cycle arrest. Aging is characterized by a senescence-associated secretory phenotype (SASP), such as secretion of pro-inflammatory cytokines, growth factors, and matrix metalloproteinases (MMPs) (Kopp, H. G. et al ., Histopathol 22, 971-976 (2007). From an oncological perspective, aging is known to be a powerful protective mechanism against tumorigenesis. Oncogene Induced Senescence (OIS) induced by oncogenes such as HRASV12 suppresses the development of malignant tumors by inhibiting the growth and proliferation of cells at risk of malignant transformation. Loss of aging function due to mutations in these aging-related oncogenes can cause tumors (Serrena, M, et al., Cell 88, 593-602 (1997).
  • SASP senescence-associated secretory phenotype
  • MMPs matrix metalloprotein
  • Senescence of tumor cells is used as a major mechanism for various anticancer therapies, such as chemotherapy and radiotherapy, for the treatment of tumors (Wang, B., Kohli, J. & Demaria, M. Trends Cancer 6, 838-857 (2020)).
  • Various chemotherapy and radiotherapy treatments reported in academia and clinical practice induce cellular aging as a primary response to the treatment regimen. For example, treatments such as hyperactive oncogenic signaling, radiotherapy, conventional chemotherapy, CDC7 inhibitors, and telomerase inhibitors induce aging through DNA damage and p53-p21 signaling.
  • This p53-p21 signaling-mediated senescence can be induced by drugs such as PTEN inhibitors such as VO-OHpi, MDM2-p53 interaction disruptors such as nutlin 3, RG7112 or UBX0101, and histone deacetylase inhibitors such as vorinostat. You can. Additionally, DNA methyltransferase inhibitors such as Desitabine, CDK inhibitors, Aurora Kinase inhibitor (AURK), and PLK1 inhibitors induce senescence by blocking G2/M progression of the cell cycle.
  • PTEN inhibitors such as VO-OHpi
  • MDM2-p53 interaction disruptors such as nutlin 3, RG7112 or UBX0101
  • histone deacetylase inhibitors such as vorinostat. You can.
  • DNA methyltransferase inhibitors such as Desitabine, CDK inhibitors, Aurora Kinase inhibitor (AURK), and PLK1 inhibitors induce senescence by blocking G2/M progression of
  • TIS treatment-induced senescence
  • TIS-derived SASP Therapy-Induced Senescence
  • TIS-derived SASP TIS-derived SASP
  • SASP factors can promote angiogenesis, growth and invasion of cancer cells (Open Biol. 11, 200360 (2021)), and IL-6 and IL-8 form a chronic inflammatory microenvironment to promote tumor growth. formation and may cause various side effects.
  • One-Two punch therapy induces the senescence of tumor cells through recent chemotherapy and radiation therapy to induce a primary treatment effect through an initial anti-tumor effect and subsequent treatment. It is a new treatment therapy that prevents tumor recurrence and long-term side effects caused by senescent cells through senolytic therapy (Nature Reviews Cancer volume 22, pages340-355 (2022)).
  • One-Two punch therapy is not based on the combined administration of drugs but is based on sequential treatment using each drug, so it can avoid combination toxicity that occurs due to the combination of drugs, thus avoiding existing existing drugs. There is an advantage in that various senolytic drugs reported in can be used.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for killing senescent cells containing a Pim-1 kinase inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating tumors containing a Pim-1 kinase inhibitor and a method of administering the same.
  • the purpose of the present invention is to provide a use of a Pim-1 kinase inhibitor for killing senescent cells.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a Pim-1 kinase inhibitor for the prevention or treatment of tumors.
  • the purpose of the present invention is to provide the use of a Pim-1 kinase inhibitor for producing a composition for killing senescent cells.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a Pim-1 kinase inhibitor for manufacturing a pharmaceutical composition for preventing or treating tumors.
  • Another object of the present invention is a method for killing senescent cells using a Pim-1 kinase inhibitor; and providing methods for preventing or treating tumors.
  • the present invention provides a composition for killing senescent cells containing a Pim-1 Kinase inhibitor.
  • the present invention also provides the use of a Pim-1 Kinase inhibitor for preparing a composition for killing senescent cells.
  • the present invention also provides a use of a Pim-1 kinase inhibitor for killing senescent cells.
  • the present invention also provides a method of killing senescent cells comprising administering a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating age-related diseases or age-related diseases, including a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention also provides the use of a Pim-1 kinase inhibitor for the prevention or treatment of age-related diseases or age-related diseases, or the production of a pharmaceutical composition therefor.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an age-related disease or age-related disease, including the step of administering a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating tumors, which contains a Pim-1 kinase inhibitor and is administered after therapy to induce senescence of tumor cells.
  • the present invention also provides use for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tumors, which is administered following senescence-inducing therapy of tumor cells with a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention also includes the steps of inducing senescence of tumor cells; and killing aged tumor cells by administering a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention also includes the steps of detecting senescent cells in a sample isolated from a subject; Provided is a method for preventing or treating a tumor comprising administering a Pim-1 kinase inhibitor to a subject when senescent cells are detected.
  • Figure 1 shows treatment-induced senescence (TIS) by treating breast cancer cell lines (MCF7, ZR75-1, Hs578T, MDA-MB-231) with 100 nM of adriamycin, followed by an increase in cell size and SA- ⁇ - The results of gal staining (1a), the ratio of SA- ⁇ -gal positive cells (1b, left), and the amount of p21 mRNA expression (1b, right) are shown.
  • TIS treatment-induced senescence
  • Figure 2a shows a Venn diagram showing changes in mRNA expression levels confirmed through next-generation sequencing (NGS) in MCF7 and MDA-MB-231 after treatment-induced senescence (TIS).
  • NGS next-generation sequencing
  • TIS treatment-induced senescence
  • Figure 2b shows that among the genes whose expression was commonly and statistically significantly increased in MCF7 and MDA-MB-231 cell lines after treatment-induced senescence compared to before senescence, 28 genes that are targets of FDA-approved drugs were selected, respectively. This is a volcano plot showing changes in expression during TIS in cell lines.
  • Figure 2c shows the results of confirming expression changes of 28 previously selected genes after treatment-induced senescence in other breast cancer cell lines (BT474, Hs578T, T47D, HCC1937) that did not undergo RNAseq.
  • Figure 3a shows inhibition of cell division in control (Ctrl) and treatment-induced senescent cells (TIS) after treatment of MCF7 control cells and TIS cells with inhibitors (low-molecular-weight compounds excluding antibodies) targeting the finally selected genes at different concentrations. and apoptotic ability were confirmed through CCK8 assay.
  • Figure 3b shows the treatment of MCF7 cell line with PIM1 Kinase Inhibitor VI (PIM1/2 Kinase Inhibitor VI, Calbiochem, CAS 587852-28-6) and ABT-263, which has been reported as a senescent cell selective killing drug (Senolytic drug), to induce treatment compared to the control group.
  • PIM1 Kinase Inhibitor VI PIM1/2 Kinase Inhibitor VI, Calbiochem, CAS 587852-28-6) and ABT-263, which has been reported as a senescent cell selective killing drug (Senolytic drug), to induce treatment compared to the control group.
  • Figure 3c shows the results of microscopic confirmation of the cell death effect after treating the control and treatment-induced senescent cell groups of the MCF7 cell line with various concentrations of PIM1/2 Kinase Inhibitor VI (Calbiochem, CAS 587852-28-6).
  • Figures 3d and 3e show the cell death effect after treating MCF7 cell lines (Ctrl and TIS) with another PIM1 kinase inhibitor, SGI-1776 (Selleckhem, Catalog No.S2198, CAS 1025065-69-3), using CCK8 assay and microscopy. This is a result confirmed by .
  • Figure 4 shows that in addition to breast cancer cells, various cancer cell lines (MKN1, MKN74, SNU601: stomach cancer, SNU478, SNU1196, SNU869: biliary tract cancer, Hct116, SW480: colon cancer, BxPC3: pancreatic cancer, HeLa S3: cervical cancer, PC3: prostate Cancer, HSC4: Head and neck cancer) Treatment-induced aging (TIS) was progressed and the expression of PIM1 kinase protein was confirmed.
  • TIS Treatment-induced aging
  • Figure 4a shows the results of treatment-induced senescence with Adriamycin in the indicated cancer cell lines and confirmation of changes in mRNA expression of PIM kinase family genes, including PIM1.
  • Figure 4b shows the results confirmed in various cell lines showing quantitative changes in PIM1 protein under the same conditions.
  • Figure 4c shows the results of treatment-induced senescence (TIS) by treating various cancer cells with cisplatin and confirming changes in PIM1 kinase mRNA expression.
  • Figures 5a and 5b show the death of control (Ctrl) and treatment-induced senescent cells (TIS) after treatment with PIM 1/2 inhibitor VI in each cancer cell (HSC4: head and neck cancer, SNU601: stomach cancer, SW480: colon cancer). This is the result of confirming the function using a microscope and CCK8 assay.
  • Figure 6a shows changes in the expression of PIM1 kinase protein 48 hours after treatment of MCF7 cell line with siRNA targeting the Pim1 kinase gene.
  • Figures 6b and 6c show the killing ability for control (Ctrl) and treatment-induced senescent cells (TIS) when the expression of PIM1 kinase protein is inhibited by treatment with siRNA targeting the Pim1 kinase gene at the corresponding concentration for 48 hours. This is a result confirmed through a microscope and CCK8 assay.
  • Senescence of tumor cells is a major mechanism of various anticancer therapies, such as chemotherapy and radiotherapy, for the treatment of tumors.
  • SASP of senescent cells has been reported to primarily exhibit anti-tumor effects, but in the long term, senescent cells may exhibit pro-neoplastic effects, promoting tumor formation, recurrence, and metastasis and causing various side effects.
  • a senescent cell killing drug (senolytic drug) is administered to selectively kill treatment-induced senescent cells (TIS cells) to prevent long-term side effects.
  • TIS cells treatment-induced senescent cells
  • the gene expression profile of treatment-induced senescent cells was analyzed and the senolytic effects of senescent cells were analyzed based on this.
  • Pim was found in treatment-induced senescent cells (TIS cells). It was confirmed that the expression of -1 kinase was significantly improved and that inhibition of Pim-1 kinase activity or gene expression showed selective high toxicity to treatment-induced senescent cells.
  • the present invention relates to a composition for killing senescent cells comprising a Pim-1 kinase inhibitor.
  • Pim-1 kinase is a serine/threonine protein kinase encoded by the PIM-1 kinase gene. Pim-1 kinase is known to be involved in pathways such as MYC transcriptional activity regulation cell cycle progression, apoptosis, and transcriptional activation. Pim-1 kinase is also well known as an oncogene (The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 37 (4): 726-30).
  • Pim-1 kinase inhibitor refers to any chemical or biological agent that can inhibit Pim-1 kinase gene expression or inhibit the activity of Pim-1 kinase protein. It is used as.
  • the Pim-1 kinase inhibitor may be an inhibitor of Pim-1 kinase gene expression or an inhibitor of PIM1 kinase protein activity.
  • the term “gene expression inhibitor” of the present invention refers to any agent that inhibits or inhibits the expression of a target gene through transcription and translation. Any type of agent that specifically inhibits the expression of a target gene may be included, and includes both inhibitors by transcriptional regulation and post-transcriptional translation regulation such as RNAi.
  • the Pim-1 kinase gene expression inhibitor includes, for example, antisense nucleotides, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), ribozyme, and pressure targeting the PIM-1 kinase gene.
  • Nucleases such as aptamers, anti-microRNAs, MicroRNA mimics, Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), CRISPR-Cas9 system agents (e.g. gRNA, sgRNA), polycistronic tRNA- There are gRNA system preparations and self-ribozyme-flanked RNAs using them (Gao & Zhao 2014, Xie et al. 2015, Zetsche et al. 2017), but they are not limited to these.
  • the Pim-1 kinase gene expression inhibitor may preferably be an siRNA targeting the Pim-1 kinase gene, and more preferably, the siRNA has the sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may include, but is not limited to this.
  • the antisense nucleotide binds (hybridizes) to the complementary base sequence of DNA, immature-mRNA, or mature mRNA, thereby interfering with the flow of genetic information from DNA to protein.
  • the siRNA has a similar operating principle to antisense, but is a double strand of 21 to 25 nucleotides, and destroys mRNA through enzyme complexes called RISCs (RNA-induced silencing complexes) rather than RNase H.
  • RISCs RNA-induced silencing complexes
  • the CRISPR-Cas9 CRISPR gene scissors
  • protein activity inhibitor refers to any agent that inhibits or inhibits the activity of a target protein.
  • the protein activity inhibitor may be characterized by directly inhibiting the activity of the target protein or by interfering with its interaction with other proteins, inhibiting its function, and blocking downstream signaling pathways.
  • the Pim-1 kinase protein activity inhibitor may be, for example, a compound that specifically binds to the Pim-1 kinase protein, a peptide, a peptide mimetic, a substrate analog, an aptamer, or an antibody, but is not limited thereto.
  • the Pim-1 kinase inhibitor may be selected and used without limitation from various Pim-1 kinase inhibitors known in the art.
  • the compound as a Pim-1 kinase inhibitor includes any compound capable of inhibiting the activity of the target protein, Pim-1 kinase.
  • Pim-1 kinase inhibitors include flavonoid inhibitors, isoxazolo[3,4-b]quinoline-3,4(1H,9H)-dione, ETP-45299, and imidazopyridazine-based compounds (SGI). -1776), Thiazolidinedione-based compound (AZD1208), Fluoropicolinamidine-based compound (PIM447), PIM1/2 Kinase Inhibitor VI, etc., but are not limited thereto.
  • the aptamer is a single-stranded DNA or RNA molecule that can be used as a specific chemical molecule or biological agent by an evolutionary method using an oligonucleotide library called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment). It can be obtained by separating oligomers that bind to molecules with high affinity and selectivity. Aptamers can specifically bind to a target protein and regulate the activity of the target protein, for example, they can block the activity of the target protein through binding.
  • the antibody refers to a collection of antibody protein molecules containing one or more complementarity-determining regions, a single antibody protein molecule, binding fragment, or derivative thereof.
  • the “inhibitor” may be used interchangeably with an “antagonist” or “inhibitor.”
  • target used in the terms “target protein”, “target gene”, “targeting”, etc. of the present invention refers to an object whose activity is to be controlled, and in particular, in the present invention, an inhibitor refers to the expression of the target gene. Or, it is characterized by being able to control the activity.
  • the target protein is Pim-1 kinase.
  • the term “Senescence” refers to the progression from actively dividing cells to metabolically active, non-dividing cells.
  • the term “senescent cell” is used to include both intermediate senescent cells in the aging process and fully senescent cells that are completely inactive in division.
  • the senescent cells may be characterized as exhibiting the following characteristics, but are not limited thereto:
  • aging can be non-limitingly classified as follows.
  • Replicative cellular senescence refers to a limitation of the number of cell divisions in differentiated cells due to telomere deterioration.
  • Premature cellular senescence refers to the arrest of the cell cycle caused by various stresses such as ultraviolet rays, reactive oxygen species, chemotherapy, environmental toxins, ionizing radiation, smoking, and oncogenic mutation without deterioration of telomeres.
  • Oncogene induced senescence is an example of premature cellular aging and refers to cellular aging caused by enhanced expression or mutation of oncogenes.
  • “Therapy induced senescence” means that cells are forced into a senescent state by a therapeutic agent administered to treat a specific disease.
  • treatment-induced aging occurs due to the administration of anticancer drugs or anticancer therapy for the treatment of tumors. From an oncological perspective, the treatment-induced aging is generally reported to be caused by anticancer treatments such as various chemotherapy, biological therapy, and radiotherapy (Nature Reviews Cancer volume 22, pages340-355 (2022)).
  • the senescent cells may be characterized as cells in a state of suspended growth and/or division. In the present invention, the senescent cells may be characterized by maintaining metabolic activity. In the present invention, the senescent cells may be characterized as cells that have permanently stopped growing and/or dividing, but are not limited thereto, and may re-enter the division cycle due to external factors. In the present invention, the senescent cells may be characterized as being senescent by replicative cell senescence, premature cell senescence, or treatment-induced senescence.
  • the senescent cells may be characterized as being present in or isolated from regenerative tissues including the vascular system, hematopoietic system, epithelial organs, and stroma.
  • the senescent cells may be present in or separated from an age-related lesion site.
  • age-related lesion sites include, but are not limited to, chronic age-related diseases, inflammatory diseases, osteoarthritis, arteriosclerosis, immune diseases, neoplastic diseases, and pre-tumor or tumor tissues.
  • treatment-induced senescence was induced by treating cancer cells with adriamycin, and senescent cells were isolated through SA-b-gal staining and p21 mRNA expression level. Therefore, in the present invention, the senescent cells may be characterized as senescent cancer cells.
  • the cancer may be, for example, breast cancer, stomach cancer, colon cancer, head and neck cancer, cervical cancer, biliary tract cancer, lung cancer, or pancreatic cancer, but is not limited thereto.
  • the senescent cells are preferably oncogene-induced senescence cells (OIS cells) or treatment-induced senescence cells (TIS cells). , More preferably, it can be characterized as a treatment induced senescence cell (TIS cell).
  • OIS cells oncogene-induced senescence cells
  • TIS cells treatment-induced senescence cells
  • the treatment-induced senescent cells may be characterized in that senescence is induced by chemotherapy, biological therapy, and/or radiation therapy.
  • the treatment-induced senescent cells may be cancer cells or normal cells in which senescence is induced by treatment.
  • composition for killing senescent cells of the present invention can be manufactured in unit dosage form by formulating it using one or more carriers or excipients, or can be manufactured by placing it in a multi-dose container.
  • the term “carrier” may mean a carrier or diluent that does not irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the injected compound.
  • the type of carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, etc. These may be used individually or in combination of two or more types.
  • the carrier may include a non-naturally occurring carrier.
  • antioxidants such as antioxidants, buffers, and/or bacteriostatic agents
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. can be additionally added to form solutions such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc. It can be formulated and used in dosage form, pills, capsules, granules, or tablets.
  • composition When formulating the composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • composition for killing senescent cells according to the present invention can be formulated and used in various forms according to conventional methods.
  • Suitable dosage forms include oral dosage forms such as tablets, pills, powders, granules, dragees, hard or soft capsules, solutions, suspensions or emulsions, injections, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions. It is not limited to this.
  • composition for killing senescent cells can be prepared in a suitable formulation using a pharmaceutically inert organic or inorganic carrier. That is, if the dosage form is a tablet, coated tablet, dragee, or hard capsule, it may contain lactose, sucrose, starch or a derivative thereof, talc, calcium carbonate, gelatin, stearic acid, or a salt thereof. Additionally, when the dosage form is a soft capsule, it may contain vegetable oil, wax, fat, semi-solid and liquid polyol. Additionally, when the formulation is in the form of a solution or syrup, it may include water, polyol, glycerol, and vegetable oil.
  • composition for killing senescent cells according to the present invention may further include preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, solubilizers, sweeteners, colorants, osmotic pressure regulators, antioxidants, etc.
  • administration means introducing the composition of the present invention to a subject by any appropriate method, and the route of administration of the composition of the present invention is through various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited and may follow a method commonly used in the art.
  • the mode of administration may be, for example, via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal route. It can be administered in a conventional manner and is not limited to the above examples.
  • composition for killing senescent cells of the present invention is determined according to the type of drug that is the active ingredient, along with various related factors such as the purpose of administration, route of administration, age, gender and weight of the subject, and severity of the disease.
  • the senescent cells may be characterized as showing positive SA-b-gal staining. In the present invention, the senescent cells may be characterized by improved p21 expression.
  • gene expression of treatment-induced senescent tumor cells was analyzed to identify genes with improved expression.
  • the senescent cells include ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT, S1PR3, SLC6A8.
  • UGCG, and VEGFA may be characterized in that the expression of one or more genes selected from the group is increased compared to normal control cells.
  • the senescent cells may preferably be characterized by increased expression of the PIM1 gene compared to normal control cells.
  • composition for killing senescent cells of the present invention may be characterized by selectively killing senescent cells, preferably senescent cells with enhanced expression of Pim-1 kinase.
  • the composition for killing senescent cells may be characterized as having a killing effect on senescent cells, preferably a selective killing effect on senescent cells.
  • Killing senescent cells can be performed to prevent or treat various diseases related to aging. Therefore, the composition for killing senescent cells of the present invention can be used for the prevention or treatment of age-related diseases.
  • the composition for killing senescent cells of the present invention can selectively kill senescent cells, strengthen the immune system, extend lifespan, and improve the subject's quality of life.
  • the aging-related disease is meant to include any disease or condition that is partially or completely mediated by the induction or maintenance of a non-proliferative or senescent state in each cell entity or cell population (e.g., tissue). It is used.
  • Age-related diseases include, for example, non-visibly age-related diseases, degeneration of tissues or organs, and visibly identifiable diseases such as degenerative diseases or functional decline disorders.
  • More specific examples include Alzheimer's, Parkinson's, cataracts, macular degeneration, glaucoma, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, myocardial infarction, stroke, hypertension, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), osteoarthritis, and Type 1 or 2 diabetes, obesity, cancer, tumor, fatty dysfunction, coronary artery disease, cerebrovascular disease, periodontal disease, abnormalities in various tissues, cancer treatment-related disorders such as fibrosis, brain and heart damage, and myelodysplasia. syndrome, etc., but is not limited thereto.
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • osteoarthritis Type 1 or 2 diabetes
  • obesity cancer
  • tumor fatty dysfunction
  • coronary artery disease cerebrovascular disease
  • periodontal disease periodontal disease
  • abnormalities in various tissues cancer treatment-related disorders such as fibrosis, brain and heart damage,
  • Age-related diseases include, for example, Hutchinson-Gilford progeria, Werner syndrome, Bloom syndrome, Rothmund-Thomson syndrome, Cockayne syndrome, xeroderma pigmentosum, trichothiodystrophy, and Cockayen syndrome.
  • Premature aging diseases such as combined xeroderma pigmentosum-Cockayne syndrome, restrictive dermopathy, ataxia telangiectasia, Fanconi anemia, Friedreich's ataxia, congenital Examples include, but are not limited to, dyskeratosis congenital, aplastic anemia, and IPF.
  • aging-related diseases can be identified by detecting the presence or absence of senescent cells.
  • the aging-related disease may be cancer or a tumor, and more preferably, it may be an aging cancer or a tumor.
  • the aging-related disease can be diagnosed by detecting senescent cells, and the diagnosis of the aging-related disease can be performed by detecting insufficient DNA replication by incorporation of BrdU or 3H-thyrividin, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • proteins such as Ki-67, SA- ⁇ -gal histochemical staining, p16, p19, Pai1, Igfbp2, IL-6, Mmp13, Nrg1, differentiated embryo-chondrocyte expressed-1 (DEC1), p15, Detection of expression of CDK1 and decoy death receptor-2 (DCR2), senescence-associated heterochromatin foci (SAHFs) and/or senescence-associated DNA-damage foci (SDFs).
  • Ki-67 Ki-67
  • SA- ⁇ -gal histochemical staining p16, p19, Pai1, Igfbp2, IL-6, Mmp13, Nrg1, differentiated embryo-chondrocyte expressed-1 (DEC1), p15, Detection of expression of CDK1 and decoy death receptor-2 (DCR2), senescence-associated heterochromatin foci (SAHFs) and/or senescence-associated DNA-damage foci (SDFs).
  • the SAHFs can be detected through specific heterochromatin-related histone modifications such as H3 Lys9 methylation and/or the presence of HP-1 (heterochro-matin protein-1) and preferential binding of DNA dyes such as DAPI.
  • senescent cells can be detected by the same method as described in U.S. Patent No. 5,491,069 and U.S. Patent Application No. 2010/0086941, but are not limited thereto.
  • the composition for killing senescent cells Can be prepared in the form of a pharmaceutical composition, food composition, food supplement composition, cosmetic composition or cosmetic.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating age-related diseases or age-related diseases, including a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention relates to the use of a Pim-1 kinase inhibitor for the prevention or treatment of age-related diseases or age-related diseases, or to the production of a pharmaceutical composition therefor.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating an age-related disease or age-related disease, including the step of administering a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the present invention relates to senolytics comprising Pim-1 kinase inhibitors.
  • senolytics or senolytic drug refers to an agent or pharmaceutical composition that can selectively kill senescent cells.
  • the present invention relates to the use of a Pim-1 kinase inhibitor to kill senescent cells.
  • the present invention relates to the use of a Pim-1 kinase inhibitor for preparing a composition for killing senescent cells.
  • the present invention relates to a method of killing senescent cells or a method of selectively killing senescent cells, including the step of administering a Pim-1 kinase inhibitor to a subject.
  • the subject may be characterized as having received an anticancer agent that induces tumor aging or radiation therapy before administration of a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the term “selective killing of senescent cells” refers to targeting senescent cells and causing them to reach a state of cell death.
  • the selective killing is used to mean that in addition to specifically killing only senescent cells, the cell death effect on senescent cells is significantly superior to that of non-senescent cells.
  • each component and term may have the same characteristics as those described in terms of the composition for killing senescent cells.
  • a chemotherapy agent when tumor cells induced by senescence with a chemotherapy agent are treated with a Pim-1 kinase activity inhibitor (PIM1/2 Kinase Inhibitor VI) or siRNA targeting the PIM-1 kinase gene is treated, normal tumor cells Compared to , it showed a significant killing effect on treatment-induced senescent tumor cells, confirming that it could selectively kill treatment-induced senescent cells.
  • a Pim-1 kinase activity inhibitor PIM1/2 Kinase Inhibitor VI
  • siRNA targeting the PIM-1 kinase gene siRNA targeting the PIM-1 kinase gene
  • the Pim-1 kinase inhibitor of the present invention and the composition for killing senescent cells containing the same are used to prevent long-term tumor recurrence and side effects by killing senescent tumor cells after senescence of tumor cells by primary anticancer therapy. It can be used as a senolytic drug in One-Two punch therapy.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating tumors, which includes a Pim-1 kinase inhibitor and is administered after therapy to induce senescence of tumor cells.
  • Pim-1 As pim-1 was discovered to be an oncogene, various Pim-1 kinase inhibitors were developed to treat tumors, and combination therapy with anticancer drugs such as doxorubicin was also reported (Jeffrey D. Altenburg et al. Blood (2014) 124 (21) 4505).
  • anticancer drugs such as doxorubicin
  • Pim-1 kinase As Pim-1 kinase is known to be involved in oncogene-induced senescence, inhibition of Pim-1 kinase expression can induce tumor formation in normal cells, and from a long-term perspective, Pim-1 It has been reported that senescence of tumor cells induced by kinases can be helpful in treating tumors, and that inhibition of Pim-1 kinase can cause tumor creation and proliferation (Bo Jin et al.
  • Pim-1 kinase inhibitors may be half effective or cause unexpected side effects when used as monotherapy for the treatment of tumors or in combination with other anticancer therapies or radiotherapy that induce cell aging. It means you can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered after therapy to induce senescence of tumor cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a senescent cell that selectively kills treatment-induced senescent tumor cells formed by anticancer therapy that induces senescence in one-two punch therapy for the treatment of tumors. It may be characterized as being used as a senolytic drug.
  • one-two punch therapy refers to a treatment method that selectively kills senescent cells after primary treatment using existing anticancer therapies that induce tumor aging, such as chemotherapy, biological agents, and radiation therapy. It refers to a therapy that selectively kills treatment-induced senescent tumor cells formed by the treatment by administering a senolytic drug. Since one-two punch therapy is not based on the combined administration of drugs but is based on sequential treatment with each drug, combination toxicity that occurs due to the combination of drugs can be avoided, and long-term damage caused by treatment-induced senescent tumor cells can be avoided. Side effects can be prevented.
  • the Pim-1 kinase inhibitor may be an inhibitor of Pim-1 kinase gene expression or an inhibitor of PIM1 kinase protein activity.
  • the Pim-1 kinase gene expression inhibitor is, for example, antisense nucleotide, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), ribozyme targeting the PIM-1 kinase gene.
  • Nucleases such as (ribozyme), aptamer, anti-microRNA, MicroRNA mimic, Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), CRISPR-Cas9 system agents (e.g.
  • gRNA, sgRNA gRNA, sgRNA
  • polycistronic tRNA-gRNA system preparations polycistronic tRNA-gRNA system preparations
  • self-ribozyme-flanked RNAs Gao & Zhao 2014, Xie et al. 2015, Zetsche et al. 2017
  • the Pim-1 kinase gene expression inhibitor may preferably be an siRNA targeting the Pim-1 kinase gene, and more preferably, the siRNA has the sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may include, but is not limited to this.
  • the Pim-1 kinase protein activity inhibitor is characterized by directly inhibiting the activity of the target protein or interfering with its interaction with other proteins, thereby inhibiting its function and blocking the downstream signaling pathway. can do.
  • the Pim-1 kinase protein activity inhibitor may be, for example, a compound that specifically binds to the Pim-1 kinase protein, a peptide, a peptide mimetic, a substrate analog, an aptamer, or an antibody, but is not limited thereto.
  • the Pim-1 kinase inhibitor may be selected and used without limitation from various Pim-1 kinase inhibitors known in the art.
  • the compound as a Pim-1 kinase inhibitor includes any compound capable of inhibiting the activity of the target protein, Pim-1 kinase.
  • Pim-1 kinase inhibitors include flavonoid inhibitors, isoxazolo[3,4-b]quinoline-3,4(1H,9H)-dione, ETP-45299, and imidazopyridazine-based compounds (SGI). -1776), Thiazolidinedione-based compound (AZD1208), Fluoropicolinamidine-based compound (PIM447), PIM1/2 Kinase Inhibitor VI, etc., but are not limited thereto.
  • tumor cell senescence induction therapy refers to inducing senescence of tumor cells to inhibit the growth and proliferation of tumor cells, and to induce effects such as arrest of adjacent cancer cells and recruitment of immune cells by SASP secreted by senescent cells. It means anti-cancer therapy through .
  • conventional anti-cancer treatments such as conventional chemotherapy and radiotherapy, are known to induce aging of tumor cells (Faget, D. V. et al., Nat. Rev. Cancer 19, 439-453 ( 2019); Krizhanovsky, Cell 134, 657-667 (2008); Chang, B. D. et al. -4818 (1999), aging caused by such anticancer therapy is called “therapy induced senescence.”
  • the therapy for inducing senescence of tumor cells may be characterized as causing treatment-induced senescence of tumor cells.
  • aging induction therapy may be characterized as anticancer drug administration or radiation therapy.
  • the anticancer agent may be a chemotherapy agent.
  • the anticancer agent may preferably be a chemical or biological substance known to prevent or treat cancer.
  • the anticancer agent is actinomycin D, adriamycin, amsacrine, Ara-C, 9-(3-D-arabinosyl2-fluoroadenine, BCNU, bleomycin, camptothecin, carboplatin, 2-chloro-2-deoxyadenosine, CPT-11, cyclophosphamide, docetaxel, doxorubicin, edotecarin, etoposide, fludarabine, 5-fluorouracil (5-FU), gemcitabine, HU-Gemza, irinotecan, methotrexate, 6-empurine, mitomycin-C, paclitaxel, cis-platin, SN-38, taxol, thiotepa, 6-thioguanine, trimetrexate, vinblastine , vincristine, and VP-16, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent may be characterized as a DNA damaging agent.
  • the DNA damaging agent may be selected from the group consisting of, for example, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, platinum analogues, topoisomerase I inhibitors, and topoisomerase II inhibitors, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent may be characterized as a mitosis inhibitor.
  • the anticancer agent may be a targeted anticancer agent.
  • the targeted anticancer agents include, for example, CDC7 inhibitors (e.g., XL413, TAK-931), telomerase inhibitors (e.g., GRN163L, BIBR15), epigenetic regulators (e.g., Decitabine, Vorinostat), and CDK inhibitors (e.g., Palbociclib). , Abemaciclib, Ribociclib, PF-06873600), AURK inhibitors (e.g. Alisertib, barasertib), PLK1 inhibitors (e.g.
  • MDM-p53 signaling disruptor e.g. Nitlin3, RG7112, UBX0101
  • PTEN inhibitors e.g. VO-OHpic
  • the anti-cancer agent may include an anti-hormone agent, an aromatase inhibitor, an anti-androgen agent, a protein kinase inhibitor, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, a tumor vaccine, etc.
  • the anticancer agent may be a therapeutic antibody or antibody-drug conjugate.
  • the therapeutic antibodies include, for example, alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN, Genentech); cetuximab (Imclone); panitumumab (Amgen), rituximab (Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARGTM, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN, Genentech), and tositumomab, Corixia), etc., but are not limited thereto.
  • Alkylating agents “metabolites”, “anti-tumor antibiotics”, “platinum analogues”, “topoisomerase I inhibitors”, “topoisomerase II inhibitors”, “mitotic inhibitors”, etc. are illustratively listed in the present invention.
  • Terms such as “targeted anticancer agent” and “therapeutic antibody” are used to include, without limitation, clinically used chemical or biological anticancer agents as long as they can induce cell aging.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be characterized in that it selectively kills treatment-induced senescent tumor cells induced by tumor cell senescence induction therapy.
  • the treatment-induced senescent tumor cells can be characterized as showing positive SA-b-gal staining.
  • the senescent cells may be characterized by improved p21 expression.
  • gene expression of treatment-induced senescent tumor cells was analyzed to identify genes with improved expression.
  • the treatment-induced senescent tumor cells include ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT. , S1PR3, SLC6A8, UGCG, and VEGFA may be characterized in that the expression of one or more genes selected from the group is increased compared to normal control cells.
  • the treatment-induced senescent tumor cells may preferably be characterized by increased expression of the PIM1 gene compared to normal control cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered sequentially after senescence-inducing therapy for tumor cells, preferably after administration of an anticancer agent and/or radiation therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at regular intervals after the tumor cell senescence-inducing therapy is applied to the subject.
  • the pharmaceutical composition may preferably be administered after treatment-induced senescent cells are sufficiently formed by senescence induction therapy for tumor cells.
  • the pharmaceutical composition may be administered preferably at intervals of several hours, days, weeks, months or years after the aging induction therapy, more preferably from about 1 hour to about 24 hours. It may be characterized as being administered at intervals of time, about 1 day to about 6 days, about 1 week to about 4 weeks, about 1 month to 11 months, or about 1 year or more, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be administered after confirming the presence of senescent cells in a sample separated from the subject.
  • the pharmaceutical composition may further include, in addition to the active ingredient Pim-1 kinase inhibitor, another senolytic drug.
  • Senolytic drugs used in the treatment of cancer or tumors are well known in the art (Wang, L., Lankhorst, L. & Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nat Rev Cancer 22 , 340-355 (2022)).
  • the present invention relates to a method of administering the pharmaceutical composition comprising administering a Pim-1 kinase inhibitor after senescence-inducing therapy of tumor cells.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tumors comprising a Pim-1 kinase inhibitor, wherein the pharmaceutical composition is administered after therapy to induce senescence of tumor cells. You can do this.
  • the present invention relates to the use of Pim-1 kinase inhibitors as senolytic drugs in a one-two punch therapy for the prevention or treatment of tumors.
  • the present invention provides a method comprising: inducing senescence of tumor cells; and killing senescent tumor cells by administering a Pim-1 kinase inhibitor.
  • the step of inducing senescence of tumor cells may be performed through senescence induction therapy of tumor cells in the subject.
  • the therapy for inducing senescence of tumor cells may share the same characteristics as those described in terms of the pharmaceutical composition.
  • the Pim-1 kinase inhibitor may be administered directly as a Pim-1 kinase dilution, or may be administered as a composition for killing senescent cells or a pharmaceutical composition of the present invention.
  • tumor cells in addition to senescence-inducing therapy for tumor cells and sequential administration of a Pim-1 kinase inhibitor, tumor cells can be treated by killing senescent cells existing in the subject.
  • the present invention in another aspect, includes detecting senescent cells in a subject or a sample isolated from the subject; It relates to a method for preventing or treating a tumor comprising administering a Pim-1 kinase inhibitor to a subject when senescent cells are detected.
  • the step of detecting the senescent cells may be performed in vivo or in vitro.
  • the step of detecting the senescent cells may be characterized by detection through the naked eye or a microscope, such as an increase in cell size or cell number.
  • the step of detecting senescent cells may be performed by detecting various senescent cell markers known in the art.
  • the step of detecting senescent cells includes detection of insufficient DNA replication by incorporation of BrdU or 3H-thyrividin, immunostaining for proteins such as proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67, and SA- ⁇ .
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • SAHFs senescence-associated heterochromatin foci
  • SDFs senescence-associated DNA-damage foci
  • the SAHFs can be detected through specific heterochromatin-related histone modifications such as H3 Lys9 methylation and/or the presence of HP-1 (heterochro-matin protein-1) and preferential binding of DNA dyes such as DAPI.
  • senescent cells can be detected by methods such as those described in US Patent No. 5,491,069 and US Patent Application No. 2010/0086941, but are not limited thereto.
  • the step of detecting the senescent cells includes ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT , S1PR3, SLC6A8, UGCG, and VEGFA can be performed by confirming the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of.
  • senescent cells may be detected when the expression level of one or more genes selected from the above group is increased compared to normal control cells.
  • the step of detecting the senescent cells may include the step of checking the expression level of the PIM1 gene.
  • the expression level of the PIM-1 kinase gene when the expression level of the PIM-1 kinase gene is increased compared to normal control cells, senescent cells can be detected.
  • a PIM-1 kinase inhibitor when senescent cells are detected in a subject or a sample separated from the subject, a PIM-1 kinase inhibitor is administered.
  • the PIM-1 kinase inhibitor may be administered by the same administration route and administration method as described in the composition or pharmaceutical composition for killing senescent cells.
  • prevention of the present invention may refer to any action that suppresses or delays the onset of a tumor by administering the composition or pharmaceutical composition for killing senescent cells of the present invention to a subject suspected of having a disease.
  • treatment may refer to any act of administering the composition or pharmaceutical composition for killing senescent cells of the present invention to an individual with a disease to improve the symptoms of the disease or to benefit the patient.
  • the term “individual” or “subject” may refer to any animal, including humans, that has developed or is likely to develop a disease.
  • the animal may be not only a human, but also a mammal such as a cow, horse, sheep, pig, goat, camel, antelope, dog, or cat that requires treatment for similar symptoms, but is not limited thereto.
  • the “subject” may be characterized as having senescent cells. In the present invention, the “subject” may be characterized as having treatment-induced senescent cells.
  • the “subject” may have cells aged by tumor cell senescence induction therapy.
  • the subject may be characterized as having received anti-cancer therapy, and may be characterized as having senescent cells treatment-induced by the anti-cancer therapy.
  • administration means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any appropriate method, and the route of administration of the composition of the present invention can be various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. It can be administered through
  • the method of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited and may follow a method commonly used in the art.
  • the mode of administration may be, for example, via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal route. It can be administered in a conventional manner and is not limited to the above examples.
  • the sample isolated from the subject may include tissue, cells, whole blood, serum, plasma, or saliva, etc. isolated from the subject, and preferably may include tumor tissue or tumor spheroids. It is not limited.
  • Example 1 Preparation of senescent tumor cells
  • Adriamycin (Selleckhem, Catalog No.S1208, CAS 25316-40-9) was used to produce treatment-induced senescent tumor cells in breast cancer cell lines with contrasting characteristics (positive for female hormone receptor expression and relatively less malignant).
  • Treatment-induced senescent tumor cells were prepared by day-culture.
  • Example 2 Gene expression analysis of treatment-induced senescent breast cancer cells and drug target selection
  • Example 3 Confirmation of senolytic effect of drugs on senescent cells for each target
  • the cell death ability was confirmed by treating control and treatment-induced senescent tumor cells with FDA-approved drugs known to inhibit the targets in Table 1, and only when treated with a PIM-1 kinase inhibitor. It was confirmed that it had a selective killing effect on treatment-induced senescent tumor cells.
  • PIM-1 kinase was selected as the final target, and its selective killing effect on senescent cells was compared with ABT-263, which has been reported as a senolytic drug used in existing one-two punch therapy.
  • ABT-263 showed an almost complete killing effect on both control and TIS cells, although there was a significant difference in the killing effect on control and TIS cells, whereas PIM-1 kinase inhibitor showed a significant difference in killing effect on control and TIS cells. It was confirmed that at high concentrations, it reduces cell growth but does not kill TIS cells effectively, and its selective killing ability against senescent cells is significantly superior to that of ABT-263.
  • Example 4 Induction of senescence by treatment of various cancer cell lines, expression analysis of PIM 1 kinase, and analysis of selective apoptosis ability of senescent cells
  • PIM kinases Unlike PIM kinases, secondary changes that regulate their activity, such as phosphorylation, are not well known, and overall activity is reported to be proportional to the expression level of PIM kinases.
  • MCF7 and MDA-MB231 gastric cancer (SNU601, MKN1, MKN74), colorectal cancer (SW480, Hct116), head and neck cancer (HSC4), cervical cancer (HeLa S3), bile duct cancer (SNU308, SNU478, SNU1196), Treatment-induced senescence was induced in pancreatic adenocarcinoma (BxPC3) and prostate cancer (PC3) cell lines using the same method as in Example 1, and treatment-induced senescence cells were obtained.
  • BxPC3 pancreatic adenocarcinoma
  • PC3 prostate cancer
  • TIS treatment-induced senescence
  • 10uM of cisplatin Selleckhem Catalog No.S1166 CAS 15663-27-1 was used in various cancer cell lines (MCF7, MDA).
  • Treatment-induced senescence also occurred when treated with -MB 231, MKN1, HSC4, SNU869), and the mRNA expression of the PIM-1 kinase gene was confirmed to be significantly increased ( Figure 4c).
  • Example 3 Shown in Example 3 to confirm the selective killing effect of senescent cells when treating gastric cancer (SNU601), head and neck cancer (HSC4), and colon cancer (SW480) cell lines in which senescence was induced by treatment with a Pim-1 kinase inhibitor.
  • SNU601 gastric cancer
  • HSC4 head and neck cancer
  • SW480 colon cancer
  • Example 4 Analysis of selective apoptosis ability of senescent cells through inhibition of Pim-1 gene expression
  • siRNA (GUAUGAUAUGGUGUGUGGAGAUAUUC, SEQ ID NO: 1) targeting the Pim-1 gene was treated. Expression of the Pim-1 gene was suppressed and cytotoxicity was confirmed.
  • treatment with various compounds that inhibit the activity of the Pim-1 kinase protein or siRNA that selectively inhibits the Pim-1 kinase gene consistently inhibits the growth of senescent cells and inhibits the growth of senescent cells.
  • inhibition of the expression or activity of Pim-1 kinase has been proven to be a novel operating mechanism that can induce growth inhibition and death of senescent cells.
  • the Pim-1 kinase gene expression inhibitor or Pim-1 kinase protein activity inhibitor regardless of its type and form, is inhibited through inhibition of the Pim-1 key (Ajudae) PP-B2966.docxase. It can be clearly understood that it can be used for various senolytic uses of senescent cells.
  • the composition for killing senescent cells containing a Pim-1 kinase inhibitor according to the present invention exhibits a selective killing effect on senescent cells, especially senescent cells with enhanced Pim-1 kinase expression.
  • the composition for killing senescent cells of the present invention can be usefully used in the prevention or treatment of aging-related diseases through its selective killing effect on senescent cells. In particular, it can be used as a follow-up to anticancer therapy based on inducing senescence in tumor cells. By administering a Pim-1 kinase inhibitor to selectively kill therapy-induced senescence cells, excellent tumor prevention or treatment effects can be achieved.

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Abstract

Pim-1 kinase 억제제를 포함하는 치료 유도 노화 세포 사멸용 조성물 및 이를 이용한 노화 관련 질환 또는 암의 예방 또는 치료용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포, 특히 Pim-1 키나아제 발현이 향상된 노화 세포에 선택적인 사멸효과를 나타낸다. 본 발명의 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포에 대한 선택적 사멸효과를 통해 노화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히, 종양 세포의 노화 유도를 기반으로 하는 항암요법에 후속적으로 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하여 치료 유도된 노화 세포(Therapy induced senescence cell)를 선택적 사멸시킴으로써 뛰어난 종양의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

치료 유도 노화 세포 사멸용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 치료 유도 노화 세포 사멸용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Pim-1 kinase 억제제를 포함하는 치료 유도 노화 세포 사멸용 조성물 및 이를 이용한 노화 관련 질환 또는 암의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
노화(Senescence)는 안정적인 세포 주기 정지를 나타내는 세포의 상태를 의미한다. 노화는 전염증성 사이토카인, 성장인자 및 기질 금속단백분해효소 (matrix metalloproteinases; MMPs)의 분비와 같은 노화 관련 분비 표현형(senescence-associated secretory phenotype; SASP)을 나타내는 것을 특징으로 한다(Kopp, H. G. et al., Histol. Histopathol. 22, 971-976 (2007)). 종양학적 관점에서, 노화는 종양형성에 대한 강력한 보호 메커니즘으로 알려져 있다. HRASV12와 같은 종양유전자(Oncogene)에 의해 유도된 노화(Oncogene Induced Senescence; OIS)는 악성 형질전환의 위험이 있는 세포의 성장 및 증식을 억제하여 악성 종양으로의 발전을 억제한다. 이러한 노화 관련 종양유전자(Oncogene)의 변이로 인한 노화 기능의 상실은 종양을 유발할 수 있다(Serrena, M, et al., Cell 88, 593-602 (1997).
종양 세포의 노화는 종양의 치료를 위한 다양한 항암요법, 예를 들어 화학요법 및 방사선요법의 주요한 기전으로 사용된다 (Wang, B., Kohli, J. & Demaria, M. Trends Cancer 6, 838-857 (2020)). 학계 및 임상에서 보고된 다양한 화학요법 및 방사선 요법은 치료 요법의 1차 반응으로 세포의 노화를 유도한다. 예를 들어 과활성 발암 신호, 방사선 요법, 전통적인 화학요법, CDC7 억제제, 및 텔로머라제 억제제와 같은 치료는 DNA의 손상 및 p53-p21 신호전달을 통한 노화를 유도한다. 이러한 p53-p21 신호 전달 매개 노화는 VO-OHpi와 같은 PTEN 억제제, nutlin 3, RG7112 또는 UBX0101와 같은 MDM2-p53 상호작용 교란제, 및 vorinostat와 같은 히스톤 데아세틸라아제 억제제와 같은 약물에 의해서 유발될 수 있다. 또한 Desitabine과 같은 DNA 메틸트렌스퍼라제 억제제, CDK 억제제, 오로라 키나아제 억제제(AURK) 및 PLK1 억제제는 세포 주기의 G2/M 진행을 차단하여 노화를 유도한다.
이러한 치료에 의해 유도된 노화(Therapy-Induced Senescence; TIS) 암세포는 SASP를 통해 인접 암세포를 어레스트하고, 약물전달을 위한 혈관 구조를 개선하며, 면역세포를 모집하는 등 다양한 기전을 통해 종양 미세 환경에 영향을 미침으로써, 종양세포의 성장 및 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(Faget, D. V. et al., Nat. Rev. Cancer 19, 439-453 (2019); Krizhanovsky, V. et al. Cell 134, 657-667 (2008); Ritschka, B. et al., Genes Dev. 31, 172-183 (2017); Chang, B. D. et al. Oncogene 18, 4808-4818 (1999)).
한편, 치료 유도된 노화(Therapy-Induced Senescence; TIS) 및 TIS 유래 SASP에 의한 초기 항종양 효과에도 불구하고, 장기적으로는 오히려 염증의 유발, 면역 억제 미세 환경의 조성, 혈관 신생 촉진, 인접 암세포의 전이와 같은 친종양성 특징을 나타낼 수 있는 것으로 보고된다(Coppe, J. P. et al. PLoS Biol. 6, 2853-2868 (2008); Yang, L., Discov. 3, 17049 (2017); Watanabe, S., et al., Cancer Sci. 108, 563-569 (2017)). 구체적으로, SASP 인자로 알려진 MMP는 혈관 신생, 암세포의 성장 및 침습을 촉진할 수 있으며(Open Biol. 11, 200360 (2021)), IL-6 및 IL-8은 만성 염증 미세환경을 형성하여 종양 형성 및 다양한 부작용을 유발할 수 있다.
이에, 치료 유도된 노화 세포를 선택적으로 사멸시킴으로써, 노화세포의 장기적인 부작용을 방지하는 치료 요법이 보고되었다. 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)이라고도 명명되는 본 방법은 최근 화학 요법 및 방사선 치료를 통해 종양 세포의 노화를 유도하여 초기 항 종양효과를 통한 1차 치료효과를 유도하고, 후속적으로 노화 세포의 선택적 사멸 요법(senolytic therapy)을 통해 노화 세포에 의한 종양의 재발 및 장기적인 부작용을 방지하는 새로운 치료요법이다(Nature Reviews Cancer volume 22, pages340-355 (2022)). 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)은 약물의 병용 투여를 기반으로 하지 않고 각 약물을 사용한 순차적 치료를 기반으로 하기 때문에, 약물의 조합으로 발생하는 조합 독성을 회피할 수 있으며, 따라서 기존에 보고된 다양한 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)을 사용할 수 있다는 장점이 있다.
현재, 종양의 치료를 위한 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)에 기존에 보고된 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)을 사용하려는 시도가 다양하게 연구되고 있다. 구체적으로, Navitoclax(ABT-263) 및 BCL-2, BCL-XL 및 BCL-W의 선택적 억제제가 노화 암세포를 포함한 광범위한 유형의 노화 세포를 효과적으로 제거할 수 있는 것으로 보고되었다(Aging Cell 15, 428-435 (2016); Nat. Med. 22, 78-83 (2016); US11331328B). 종양 노화 유도제인 리툭시맙과 Navitoclax의 병용 요법은 2상 연구에서, 높은 효과를 나타내었으며, 내약성이 우수한 것으로 나타났다(Leuk. Lymphoma 56, 2826-2833 (2015).).
원-투 펀치 요법의 뛰어난 효과에도 불구하고, 지금까지 보고된 종양의 치료에 사용될 수 있는 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)의 종류는 현저히 부족하다(Nature Reviews Cancer volume 22, pages340-355 (2022)). 특히, 현재 보고된 Navitoclax, ABT737, NAav-Gal등은 모두 BCL-2/XL/W 기반의 약리기전을 통한 노화 세포 사멸 약물이기 때문에, 치료 유도된 노화 세포 외의 다양한 노화세포에 무분별하게 작용하여 예상치 못한 부작용을 유발할 수 있다. 이에, 다양한 기전을 통한 노화 세포 사멸 약물의 개발, 치료 유도된 노화 종양 세포에 특이적인 바이오마커의 발굴 및 이에 기반한 치료 유도된 노화 세포 특이적 사멸 약물의 개발의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 치료 유도된 노화 종양 세포의 신규 바이오마커를 발굴하고 원-투 펀치 요법에 사용될 수 있는 신규 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)을 개발하기 위해 예의 노력한 결과 다양한 항 종양 요법에 의해 유도된 치료 유도된 노화 종양 세포에서 Pim-1 Kinase의 발현이 공통적으로 향상되어 치료 유도된 노화 종양 세포의 신규 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인하였으며, 나아가 Pim-1 kinase 억제제를 처리하는 경우, 치료 유도된 노화 종양세포에 특이적인 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 투여 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 Pim-1 키나아제 억제제의 노화 세포의 사멸 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Pim-1 키나아제 억제제의 종양의 예방 또는 치료용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 Pim-1 키나아제 억제제의 노화 세포의 사멸용 조성물의 제조용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Pim-1 키나아제 억제제의 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Pim-1 키나아제 억제제를 이용한 노화 세포의 사멸 방법; 및 종양의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Pim-1 키나아제(Pim-1 Kinase) 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제(Pim-1 Kinase) 억제제의 노화 세포의 사멸용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제의 노화 세포 사멸용도를 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 노화 세포의 사멸방법을 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제의 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료용도 또는 이를 위한 약학적 조성물의 제조용도를 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하고, 종양 세포의 노화 유도 요법 뒤에 투여되는, 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Pim-1 키나아제 억제제의 종양 세포의 노화 유도 요법 뒤에 투여되는, 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 종양 세포의 노화를 유도하는 단계; 및 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하여 노화된 종양 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 대상에게서 분리한 샘플에서 노화 세포를 검출하는 단계; 노화 세포가 검출된 경우 대상에게 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
도 1은 유방암 세포주(MCF7, ZR75-1, Hs578T, MDA-MB-231)에 아드리아마이신 100nM를 처리하여 치료 유도 노화(TIS)를 진행시킨 뒤, 각 암 세포주의 세포 크기 증가 및 SA-β-gal 염색 결과(1a), SA-β-gal 양성 세포의 비(1b, 왼쪽) 및 p21 mRNA 발현 양(1b, 오른쪽)을 나타낸 것이다.
도 2a는 치료 유도 노화(TIS) 후, MCF7 및 MDA-MB-231에서의 차세대 염기서열 분석 (NGS)를 통해 확인 한 mRNA 발현량 변화를 나타낸 벤다이어그램을 나타낸 것이다.
도 2b는 치료 유도 노화 후, 노화 전과 비교하여 MCF7과 MDA-MB-231 세포 주에서도 공통으로 통계적으로 의미있게 발현이 증가된 유전자 중, FDA 승인된 약물의 표적이 되는 유전자 28종을 선정하여 각각의 세포주에서 TIS 시 발현 변화를 나타낸 volcano plot이다.
도 2c는 RNAseq를 진행하지 않은 다른 유방암 세포주(BT474, Hs578T, T47D, HCC1937)의 치료 유도 노화 후, 앞서 선정된 28종 유전자의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 3a는 최종 선정된 유전자를 표적으로 하는 억제제(항체를 제외한 저분자 화합물)를 MCF7 대조군 세포와 TIS 세포에 농도 별로 처리 후, 대조군(Ctrl) 및 치료 유도 노화된 세포(TIS)에 대한 세포 분열 억제 및 사멸능을 CCK8 assay를 통하여 확인한 결과이다.
도 3b는 MCF7 세포주에서 PIM1 키나아제 억제제(PIM1/2 Kinase Inhibitor VI, Calbiochem, CAS 587852-28-6) 및 노화 세포 선택적 사멸 약물(Senolytic drug)으로 보고된 ABT-263를 처리하여 대조군에 비해 치료 유도 노화된 세포군에서 세포 생존이 유의하게 억제됨을 CCK8 assay를 통해 확인한 결과이다.
도 3c는 MCF7 세포주의 대조군과 치료 유도 노화된 세포군에 다양한 농도의 PIM1/2 Kinase Inhibitor VI (Calbiochem, CAS 587852-28-6)를 처리한 뒤 세포의 사멸 효과를 현미경으로 확인한 결과이다.
도 3d 및 3e는 MCF7 세포주(Ctrl 및 TIS)에 대해 다른 PIM1 키나아제 억제제인 SGI-1776(Selleckhem, Catalog No.S2198, CAS 1025065-69-3)을 처리한 뒤 세포의 사멸 효과를 CCK8 assay와 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 유방암 세포를 이외에도 다양한 암 세포 주에 (MKN1, MKN74, SNU601: 위암, SNU478, SNU1196, SNU869: 담도암, Hct116, SW480: 대장암, BxPC3: 췌장암, HeLa S3: 자궁경부암, PC3: 전립선암, HSC4: 두경부암) 치료 유도 노화(TIS)를 진행시키고, PIM1 키나아제 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 4a는 표기된 암세포주에서 아드리아마이신으로 치료 유도 노화를 진행하고 PIM1를 포함한 PIM 키나아제 패밀리 유전자의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4b는 동일한 조건에서 PIM1의 단백질의 양적 변화를 표기한 다양한 세포주에서 확인한 결과이다.
도 4c는 다양한 암 세포에 시스플라틴을 처리하여 치료 유도 노화(TIS)를 진행시키고, PIM1 키나아제 mRNA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5a 및 5b는 각 암세포(HSC4: 두경부암, SNU601: 위암, SW480: 대장암)에서, PIM 1/2 inhibitor VI를 처리한 뒤 대조군(Ctrl) 및 치료 유도 노화된 세포(TIS)에 대한 사멸능을 현미경과 CCK8 assay로 확인한 결과이다.
도 6a는 MCF7 세포주에 Pim1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 처리후 48시간 경과 뒤, PIM1 키나아제 단백질의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 6b 및 6c는 Pim1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 해당 농도로 48시간 처리하여, PIM1 키나아제 단백질의 발현을 억제하는 경우에 대조군(Ctrl) 및 치료 유도 노화된 세포(TIS)에 대한 사멸능을 현미경과 CCK8 assay 를 통해 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
종양 세포의 노화는 종양의 치료를 위한 다양한 항암요법, 예를 들어 화학요법 및 방사선요법의 주요한 기전이다. 노화된 세포의 SASP는 1차적으로 항종양 효과를 나타내는 것으로 보고되었으나, 장기적인 관점에서 노화 세포는 전종양성 효과를 나타내어, 종양의 형성, 재발 및 전이를 촉진하고 다양한 부작용을 나타낼 수 있다. 이러한 관점에서, 최근 종양의 노화 유도에 의한 1차 치료 이후, 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)을 투여하여, 치료 유도된 노화 세포(TIS cell)를 선택적으로 사멸시켜 장기적인 부작용을 예방하는 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)이 주목받고 있으나, 보고된 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)의 종류가 현저히 부족하다.
본 발명의 일 실시예에서는 치료 유도된 노화 세포(TIS cell)의 유전자 발현 프로파일을 분석하여 이를 기반으로 노화 세포 사멸 효과(senolytic effects)를 분석한 결과, 치료 유도된 노화 세포(TIS cell)에서 Pim-1 키나아제의 발현이 현저히 향상되고 Pim-1 키나아제의 활성 억제제 또는 유전자 발현을 억제한 결과 치료 유도된 노화 세포에 선택적으로 높은 독성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어, “Pim-1 키나아제(Pim-1 kinase)”는 PIM-1 키나아제 유전자에 의해 암호화된 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. Pim-1 키나아제는 MYC 전사활성 조절 세포 주기 진행, 세포 자멸사 및 전사활성화 등의 경로에 관여하는 것으로 알려져 있으다. Pim-1 키나아제는 종양유전자(oncogene)로도 잘 알려져 있다(The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 37 (4): 726-30).
본 발명의 용어, “Pim-1 키나아제 억제제(Pim-1 kinase inhibitor)”는 Pim-1 키나아제 유전자 발현의 억제 또는 Pim-1 키나아제 단백질의 활성을 억제할 수 있는 모든 화학적 또는 생물학적 제제를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제, 또는 PIM1 키나아제 단백질 활성 억제제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "유전자 발현 억제제"는 표적 유전자가 전사 및 번역을 통해 발현되는 것을 억제 또는 저해하는 모든 제제를 의미한다. 표적 유전자 특이적으로 발현을 억제하는 모든 유형의 제제가 포함될 수 있으며, 전사단계의 조절 및 RNAi와 같은 전사 후 번역 조절에 의한 억제제를 모두 포함한다. 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 예를 들어, PIM-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), anti-microRNA, MicroRNA mimic, Zinc Finger Nucleases(ZFNs) 및 Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)와 같은 뉴클라아제, CRISPR-Cas9 시스템 제제(예, gRNA, sgRNA), polycistronic tRNA-gRNA 시스템 제제, 이용한 self-ribozyme-flanked RNAs 등이 있으나(Gao ＆ Zhao 2014, Xie et al. 2015, Zetsche et al. 2017), 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 바람직하게는 Pim-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 siRNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 안티센스 뉴클레오타이드는 DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 상기 siRNA는 안티센스와 작동 원리는 유사하나 21~25개의 뉴클레오타이드가 연결된 두 가닥(double strand)으로, RNase H가 아닌 RISCs(RNA-induced silencing complexes)라는 효소복합체를 통해 mRNA를 파괴한다. 상기 CRISPR-Cas9(크리스퍼 유전자 가위)은 특정 염기서열을 인지해 해당 부위의 DNA를 절단하는 제한효소로 작용한다.
본 발명의 용어 "단백질 활성 억제제"는 표적 단백질의 활성을 억제 또는 저해하는 모든 제제를 의미한다. 상기 단백질 활성 억제제는 표적단백질의 활성을 직접적으로 억제하거나, 다른 단백질과의 상호작용을 방해하여, 이의 기능을 억제하고, 하위 신호 전달 경로를 차단하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제는 예를 들어, Pim-1 키나아제 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 압타머 및 항체 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 당업계에 공지된 다양한 Pim-1 키나아제 억제제로부터 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, Pim-1 키나아제 억제제로서 상기 화합물은 표적 단백질인 Pim-1 키나아제의 활성을 억제할 수 있는 임의의 화합물을 모두 포함한다. 예를 들어, Pim-1 키나아제 억제제로 플라보노이드 억제제, isoxazolo[3,4-b]quinoline-3,4(1H,9H)-dione, ETP-45299, 이미다조피리다진(imidazopyridazine) 기반의 화합물(SGI-1776), 티아졸리다인다이온(Thiazolidinedione) 기반의 화합물(AZD1208), 플루오로피콜린아마이드(Fluoropicolinamidine) 기반의 화합물(PIM447), PIM1/2 Kinase Inhibitor VI 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합하고 표적 단백질의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적 단백질의 활성을 차단할 수 있다. 상기 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 단백질 분자의 집합, 하나의 항체 단백질 분자, 결합 단편 또는 이의 유도체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 "억제제"는 "길항제(antagonist)" 또는 "저해제"와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "표적 단백질", "표적 유전자", "표적으로 하는" 등에서 사용되는 "표적"은 활성을 조절하고자 하는 대상을 의미하며, 특히 본 발명에서, 억제제는 표적으로 하는 대상 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 표적 단백질은 Pim-1 키나아제이다.
본 발명의 용어, “노화(Senescence)”는 활발하게 분열하는 세포에서, 대사적으로 활성화된 비분열 세포로의 진행을 의미한다. 본 발명의 용어 “노화 세포”는 노화 과정에 있는 중간 노화 세포 및 완전히 분열이 비활성화된 완전 노화 세포를 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 다음과 같은 특징을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
i) 성장의 억제;
ii) 생리학적 유사분열제(physiological mitogens)의 처리에도 세포 주기로의 재진입 억제;
iii) 세포 사멸에 대한 내성; 및/또는
iv) 차별화된 기능의 획득.
본 발명에 있어서, 노화는 다음과 같이 비제한적으로 분류될 수 있다.
“복제 세포 노화(replicative cellular senescence)”는 텔로미어의 열화로 인한 분화 세포의 세포 분열 횟수의 제한을 의미한다.
“조기 세포 노화 (premature cellular senescence)"는 텔로미어의 열화 없이 자외선, 활성산소종, 화학요법, 환경 독소, 이온화 방사선, 흡연, 종양유전자 돌연변이(Oncogenic mutation) 등의 다양한 스트레스에 의한 세포 주기의 정지를 의미한다. “종양유전자 유도된 노화(Oncogene induced senescence)는 조기 세포 노화의 한 예로서, 종양유전자의 발현 향상 또는 변이에 의한 세포 노화를 의미한다.
“치료 유도된 노화(Therapy induced senescence)는 특정 질병의 치료를 위해 투여된 치료제에 의해 세포가 노화 상태로 강제되는 것을 의미한다. 일반적으로 치료 유도된 노화는 종양의 치료를 위한 항암제의 투여 또는 항암 요법으로 인해 발생된다. 종양학적 관점에서, 상기 치료 유도된 노화는 일반적으로 다양한 화학 요법, 생물학적 요법, 및 방사선 요법 등과 같은 항암 치료에 의해 발생하는 것으로 보고된다(Nature Reviews Cancer volume 22, pages340-355 (2022)).
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 성장 및/또는 분열이 중단된 상태의 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 대사 활성이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 노화 세포는 영구적으로 성장 및/또는 분열이 중단된 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 외부적인 요인에 의해 다시 분열 주기에 재진입할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 복제 세포 노화, 조기 세포 노화, 또는 치료 유도 노화에 의해 노화된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화세포는 혈관계, 조혈 시스템, 상피기관 및 기질을 포함하는 재생 가능한 조직에 존재하는 것 또는 이로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화세포는 노화 관련 병변 부위에 존재하는 것 또는 이로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어 노화 관련 병변 부위는, 만성 노화 관련 질환, 염증성 질환, 골관절염, 동맥경화증, 면역 질환, 신생물성 질환, 및 전종양 또는 종양 조직 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 암 세포에 아드리아마이신을 처리하여 치료 유도된 노화를 유도하였으며, SA-b-gal 염색 및 p21 mRNA 발현 수준을 통해 노화세포를 분리하였다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 노화 암 세포 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 예를 들어, 유방암, 위암, 대장암, 두경부암, 자궁경부암, 담도암, 폐암 또는 췌장암인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 바람직하게는 종양유전자 유도된 노화 세포(Oncogene-induced senescence cell; OIS cell) 또는 치료 유도된 노화 세포(Therapy induced senescence cell; TIS cell)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 치료 유도된 노화 세포(Therapy induced senescence cell; TIS cell)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 세포는 화학요법, 생물학적 요법, 및/또는 방사선 요법에 의해 노화가 유도된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 세포는 치료에 의해 노화가 유도된, 암세포 또는 정상세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 노화 세포 사멸용 조성물은 하나 이상의 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 노화 세포 사멸용 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 노화 세포 사멸용 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 노화세포 사멸용 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 노화 세포 사멸용 조성물은 투여 목적, 투여 경로, 대상의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 SA-b-gal 염색에 양성을 타나내는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 p21의 발현이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 치료 유도 노화된 종양 세포의 유전자 발현을 분석하여 발현이 향상된 유전자를 동정하였다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT, S1PR3, SLC6A8, UGCG 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 정상 대조군 세포에 비해 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 바람직하게는 PIM1 유전자의 발현이 정상대조군 세포에 비해 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포, 바람직하게는 Pim-1 키나아제의 발현이 향상된 노화 세포를 선택적으로 사멸시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포의 사멸, 바람직하게는 노화 세포의 선택적 사멸 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
노화 세포의 사멸은 노화와 관련한 다양한 질병의 예방 또는 치료를 위해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포를 선택적으로 사멸 시켜, 면역체계를 강화하고, 수명을 연장하며, 대상의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 각 세포 개체 또는 세포의 집단(예, 조직)에서 비증식 또는 노화상태의 유도 또는 유지에 의해 부분적으로 또는 완전히 매개되는 임의의 질병 또는 상태를 포함하는 의미로 사용된다. 노화 관련 질환은 예를 들어, 가시적으로 드러나지 않은 연령 관련 질환, 조직 또는 기관의 퇴화, 및 퇴행성 질환 또는 기능 감소 장애와 같은 가시적으로 확인 가능한 질환이 포함된다. 보다 구체적인 예를 들어, 알츠하이머, 파킨슨, 백내장, 황반변성, 녹내장, 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 심근경색, 뇌졸중, 고혈압, 특발성 폐섬유증(IPF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 골관절염, 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만, 암, 종양, 지방기능장애, 관상동맥질환, 뇌혈관 질환, 치주질환, 각종 조직의 위측, 섬유증과 같은 암 치료 관련 장애, 뇌 및 심장의 손상, 골수이형성증후군 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 연령 관련 질환은 예를 들어, Hutchinson-Gilford 조로증, Werner 증후군, Bloom 증후군, Rothmund-Thomson 증후군, Cockayne 증후군, 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum), 탈유황이상증(trichothiodystrophy), 색소성건피증-Cockayen 증후근의 복합증(combined xeroderma pigmentosum-Cockayne syndrome), 제한성 피부병(restrictive dermopathy)과 같은 조기 노화 질환, 모세혈관확장성 실조증(ataxia telangiectasia), 판고니 빈혈(Fanconi anemia), 프리드리히 실조(Friedreich's ataxia), 선천성각화부전증(dyskeratosis congenital), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), IPF 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 노화 관련 질환은 노화 세포의 존재 여부를 검출하여 동정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 암 또는 종양인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 노화 암 또는 노화 종양인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 노화 세포를 검출하여 진단될 수 있으며, 상기 노화 관련 질환의 진단은 BrdU 또는 3H-티리비딘의 혼읩에 의한 DNA 복제 부족 검출, 증식 세포 핵 항원(PCNA) 및 Ki-67과 같은 단백질에 대한 면역 염색, SA-β-gal 조직화학 염색, p16, p19, Pai1, Igfbp2, IL-6, Mmp13, Nrg1, DEC1(differentiated embryo-chondrocyte expressed-1), p15, CDK1 및 DCR2(decoy death receptor-2)의 발현 검출, 노화 관련 이질염색질 병소(senescence-associated heterochromatin foci, SAHFs) 및/또는 노화 관련 DNA 손상 병소(senescence-associated DNA-damage foci, SDFs)의 검출을 통해 수행될 수 있다. 상기 SAHFs의 검출은 H3 Lys9 메틸화와 같은 특정 이질염색질 관련 히스톤 변형 및/또는 HP-1(heterochro-matin protein-1)의 존재 및 DAPI와 같은 DNA 염료의 우선적 결합 등을 통해 검출될 수 있다. 또 다른 예로서, 노화세포는 미국특허 제5,491,069호 및 미국 특허출원제2010/0086941호에 기재된 것과 같은 방법으로 검출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.본 발명에 있어서, 상기 노화 세포 사멸용 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 식품 보충제 조성물, 화장료 조성물 또는 화장품의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제의 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료용도 또는 이를 위한 약학적 조성물의 제조용도에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 노화 관련 질환 또는 연령 관련 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 세놀리틱스(senolytics)에 관한 것이다.
본 발명의 용어, 세놀리틱스(senolytics) 또는 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)은 노화 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 제제 또는 약학적 조성물을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제의 노화 세포의 사멸용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제의 노화 세포 사멸용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 노화 세포의 사멸 방법 또는 노화 세포의 선택적 사멸 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 대상은 Pim-1 키나아제 억제제의 투여 전, 종양의 노화를 유도하는 항암제의 투여 또는 방사선 요법의 처치를 받은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “노화세포의 선택적 사멸”이란 노화 세포를 표적으로 세포 죽음 상태에 이르도록 하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 선택적 사멸은 노화 세포만을 특이적으로 사멸시키는 것 이외에도, 비 노화 세포에 비해 노화 세포에 대한 세포 사멸 효과가 현저하게 뛰어난 것을 포함하는 의미로 사용된다.
별도로 언급되지 않는 한, 본 발명의 상기 관점들에서, 각 구성 및 용어는 노화 세포의 사멸용 조성물의 관점에서 설명한 것과 동일한 특징을 가질 수 있다.
일 실시예에서, 화학요법제로 노화가 유도된 종양 세포에 Pim-1 키나아제 활성 억제제(PIM1/2 Kinase Inhibitor VI)를 처리하거나, PIM-1 키나아제 유전자를 표적으로하는 siRNA를 처리하는 경우 정상 종양세포에 비해 치료 유도된 노화 종양 세포에 대해 현저한 사멸효과를 나타내어, 선택적으로 치료 유도된 노화세포를 사멸시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 Pim-1 키나아제 억제제 및 이를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물은 1차적인 항암 요법에 의한 종양 세포의 노화 후, 노화된 종양 세포를 사멸시켜 장기적인 종양의 재발 및 부작용을 방지하는 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)의 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하고, 종양 세포의 노화 유도 요법 후 투여되는, 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
pim-1이 종양유전자로 밝혀지면서 종양을 치료하기 위한 다양한 Pim-1 키나아제 억제제가 개발되었으며, 독소루비신과 같은 항암제와의 병용요법도 보고된 바 있다(Jeffrey D. Altenburg et al. Blood(2014) 124 (21) 4505). 그러나, Pim-1 키나아제가 종양유전자 유도된 노화(Oncogene-induced senescence)에 관여하는 것으로 알려지면서, Pim-1 키나아제의 발현 억제가 정상세포에서 종양 형성을 유도할 수 있으며, 장기적인 관점에서 Pim-1 키나아제에 의해 유도된 종양 세포의 노화가 종양의 치료에 도움이 될 수 있다고 보고되었으며, Pim-1 키나아제의 억제가 종양의 생성 및 증식을 유발할 수 있다는 점이 보고되었다(Bo Jin et al. Aging cell 2014, 13, pp879-889; Wu Wu et al. Med Sci Monit, 2019, 25: 8651-8659). Pim-1 키나아제의 위와 같은 특성은 Pim-1 키나아제 억제제가 종양의 치료를 위한 단독요법 또는 세포의 노화를 유도하는 다른 항암요법, 방사선 요법 등과의 병용 요법에서, 효과가 반감되거나 예기치 못한 부작용을 나타낼 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 종양 세포의 노화 유도 요법 뒤에 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 종양의 치료를 위한 원-투 펀치 요법(One-Two punch theraphy)에 있어서, 노화를 유도하는 항암 요법에 의해 형성되는 치료 유도된 노화 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 노화세포 사멸 약물(Senolytic drug)의 용도로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “원-투 펀치 요법”은 종양의 노화를 유도하는 기존의 항암요법, 예를 들어 화학요법, 생물학적 제제, 방사선 요법 등을 이용한 1차 치료 후, 노화 세포를 선택적으로 사멸시키는 세놀리틱 약물을 투여하여 상기 치료에 의해 형성되는 치료 유도된 노화 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 요법을 의미한다. 원-투 펀치 요법은 약물의 병용 투여를 기반으로 하지 않고 각 약물을 사용한 순차적 치료를 기반으로 하기 때문에, 약물의 조합으로 발생하는 조합 독성을 회피할 수 있으며, 치료 유도된 노화 종양 세포에 의한 장기적 부작용을 예방할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제, 또는 PIM1 키나아제 단백질 활성 억제제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 예를 들어, PIM-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), anti-microRNA, MicroRNA mimic, Zinc Finger Nucleases(ZFNs) 및 Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)와 같은 뉴클라아제, CRISPR-Cas9 시스템 제제(예, gRNA, sgRNA), polycistronic tRNA-gRNA 시스템 제제, 이용한 self-ribozyme-flanked RNAs 등이 있으나(Gao ＆ Zhao 2014, Xie et al. 2015, Zetsche et al. 2017), 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 바람직하게는 Pim-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 siRNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제는 표적단백질의 활성을 직접적으로 억제하거나, 다른 단백질과의 상호작용을 방해하여, 이의 기능을 억제하고, 하위 신호 전달 경로를 차단하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제는 예를 들어, Pim-1 키나아제 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 압타머 및 항체 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 당업계에 공지된 다양한 Pim-1 키나아제 억제제로부터 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, Pim-1 키나아제 억제제로서 상기 화합물은 표적 단백질인 Pim-1 키나아제의 활성을 억제할 수 있는 임의의 화합물을 모두 포함한다. 예를 들어, Pim-1 키나아제 억제제로 플라보노이드 억제제, isoxazolo[3,4-b]quinoline-3,4(1H,9H)-dione, ETP-45299, 이미다조피리다진(imidazopyridazine) 기반의 화합물(SGI-1776), 티아졸리다인다이온(Thiazolidinedione) 기반의 화합물(AZD1208), 플루오로피콜린아마이드(Fluoropicolinamidine) 기반의 화합물(PIM447), PIM1/2 Kinase Inhibitor VI 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “종양 세포의 노화 유도 요법”은 종양 세포의 노화를 유도하여 종양 세포의 성장과 증식을 억제하고, 노화 세포에서 분비되는 SASP에 의해 인접 암세포의 어레스트, 면역세포 모집과 같은 영향을 통한 항암 요법을 의미한다. 본 기술분야에서 통상적인 항암요법, 예를 들어 통상의 화학요법 및 방사선 요법 등은 종양 세포의 노화를 유도하는 것으로 알려져 있으며(Faget, D. V. et al., Nat. Rev. Cancer 19, 439-453 (2019); Krizhanovsky, V. et al. Cell 134, 657-667 (2008); Ritschka, B. et al., Genes Dev. 31, 172-183 (2017); Chang, B. D. et al. Oncogene 18, 4808-4818 (1999)), 이러한 항암 요법에 의한 노화를 “치료 유도된 노화(Therapy induced Senescence)”라 한다.
본 발명에 있어서, 상기 종양 세포의 노화 유도 요법은 종양 세포의 치료 유도된 노화를 유발하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 노화 유도 요법은 항암제 투여 또는 방사선 요법인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 화학 요법제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 바람직하게는 암을 예방 또는 치료하는 것으로 알려진 화학적 또는 생물학적 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 액티노마이신 D, 아드리아마이신, 암사크린, 아라-C, 9-(3-D-아라비노실2-플루오로아데닌, BCNU, 블레오마이신, 캄토테신, 카보플라틴, 2-클로로-2-데옥시아데노신, CPT-11, 사이클로 포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 에도테카린, 에토포시드, 플루다라빈, 5-플루오로유라실(5-FU), 젬시타빈, HU-젬자, 이리노테칸, 메토트렉세이트, 6-엠퓨린, 마이토미신-C, 패클리탁셀, 시스-플라틴, SN-38, 탁솔, 티오테파, 6-티오구아닌, 트라이메트렉세이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 VP-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 DNA 손상제인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 DNA 손상제는 예를 들어 알킬화제, 대사길항제, 항종양 항생제, 백금 동족체, 국소이성질화효소 I 억제제 및 국소이성질화효소 II 억제제로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 유사 분열 억제제인 것을 특징으로 할수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 표적 항암제인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 표적 항암제는 예를 들어, CDC7 억제제(예, XL413, TAK-931), 텔로머라아제 억제제(예, GRN163L, BIBR15), 후성유전학적 조절제(예, Decitabine, Vorinostat), CDK 억제제(예, Palbociclib, Abemaciclib, Ribociclib, PF-06873600), AURK 억제제(예, Alisertib, barasertib), PLK1 억제제(예, BI-2535, BI-6727), MDM-p53 신호전달 붕괴제(MDM2-p53 disruptor)(예, Nitlin3, RG7112, UBX0101), PTEN 억제제(예, VO-OHpic) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 항호르몬제, 아로마타제 억제제, 항안드로겐제, 단백질키나아제 억제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 종양백신 등을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 치료적 항체 및 항체-약물 접합체(Antibody-Drug conjugates)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 치료적 항체는 예를 들어, 알렘투주마브 (alemtuzumab, Campath), 베바시주마브 (AVASTIN, Genentech); 세툭시마브 (cetuximab, Imclone); 파니투무마브 (panitumumab, Amgen), 리툭시마브 (rituximab, Genentech/Biogen Idec), 페르투주마브 (OMNITARG™, 2C4, Genentech), 트라스투주마브(HERCEPTIN, Genentech), 및 토시투모마브 (tositumomab, Corixia) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 예시적으로 나열된 "알킬화제", "대사길항제", "항종양 항생제", "백금 동족체", "국소이성화효소 I 억제제", "국소이성화효소 II 억제제", "유사분열 억제제", “표적 항암제”, “치료용 항체”와 같은 용어는 세포의 노화를 유도할 수 있는 것이라면 임상적으로 사용되는 화학적 또는 생물학적 항암제를 제한없이 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물은 종양 세포의 노화 유도 요법에 의해 유도된 치료 유도된 노화 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 종양 세포는 SA-b-gal 염색에 양성을 타나내는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포는 p21의 발현이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 치료 유도 노화된 종양 세포의 유전자 발현을 분석하여 발현이 향상된 유전자를 동정하였다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 종양 세포는 ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT, S1PR3, SLC6A8, UGCG 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 정상 대조군 세포에 비해 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 종양 세포는 바람직하게는 PIM1 유전자의 발현이 정상대조군 세포에 비해 증가한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 종양 세포의 노화 유도 요법, 바람직하게는 항암제의 투여 및/또는 방사선 요법 이후에 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 종양 세포의 노화 유도 요법이 대상에게 적용되고 난 이후 일정한 간격을 두고 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 종양 세포의 노화 유도 요법에 의해 치료 유도된 노화 세포가 충분히 형성된 후 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 노화 유도 요법 이후, 수시간, 수 일, 수 주, 수 개월 또는 수년의 간격을 두고 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1일 내지 약 6일, 약 1주일 내지 약 4주일, 약 1개월 내지 11개월, 또는 약 1년 이상의 간격을 두고 투여되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직한 원-투 펀치 요법의 적용을 위해 상기 약학적 조성물은 대상으로부터 분리된 샘플에서, 노화 세포의 존재를 확인한 뒤 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 유효성분인 Pim-1 키나아제 억제제외에도, 다른 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 암 또는 종양의 치료에 사용되는 노화 세포 사멸 약물(senolytic drug)은 당업계에 잘 알려져 있다(Wang, L., Lankhorst, L. & Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nat Rev Cancer 22, 340-355 (2022)).
본 발명은 또 다른 관점에서, 종양 세포의 노화 유도 요법 이후, Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 약학적 조성물의 투여방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 종양 세포의 노화 유도 요법 뒤에 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, Pim-1 키나아제 억제제의 종양의 예방 또는 치료를 위한 원-투 펀치 요법에서, 세놀리틱 약물로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 종양 세포의 노화를 유도하는 단계; 및 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하여 노화된 종양 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 종양 세포의 노화를 유도하는 단계는 대상에게 종양 세포의 노화 유도 요법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 별도로 언급되지 않는 한 상기 종양 세포의 노화 유도 요법은 상기 약학적 조성물의 관점에서 서술된 것과 동일한 특징을 공유할 수 있음은 통상의 기술자에게 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제의 투여는 직접적인 Pim-1 키나아제 희석액으로 투여될 수 있으며, 본 발명의 노화 세포 사멸용 조성물 또는 약학적 조성물로 제조되어 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 종양 세포의 노화 유도 요법과 Pim-1 키나아제 억제제의 순차적 투여 이외에도, 대상에 존재하는 노화 세포의 사멸을 통해 종양 세포를 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 대상 또는 대상에게서 분리한 샘플에서 노화 세포를 검출하는 단계; 노화 세포가 검출된 경우 대상에게 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 세포의 크기 증가, 세포 수 증가와 같이 육안 또는 현미경을 통해 검출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 검출은 당업계에 공지된 다양한 노화 세포 마커를 검출하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 BrdU 또는 3H-티리비딘의 혼읩에 의한 DNA 복제 부족 검출, 증식 세포 핵 항원(PCNA) 및 Ki-67과 같은 단백질에 대한 면역 염색, SA-β-gal 조직화학 염색, p16, p19, Pai1, Igfbp2, IL-6, Mmp13, Nrg1, DEC1(differentiated embryo-chondrocyte expressed-1), p15, CDK1 및 DCR2(decoy death receptor-2)의 발현 검출, 노화 관련 이질염색질 병소(senescence-associated heterochromatin foci, SAHFs) 및/또는 노화 관련 DNA 손상 병소(senescence-associated DNA-damage foci, SDFs)의 검출을 통해 수행될 수 있다. 상기 SAHFs의 검출은 H3 Lys9 메틸화와 같은 특정 이질염색질 관련 히스톤 변형 및/또는 HP-1(heterochro-matin protein-1)의 존재 및 DAPI와 같은 DNA 염료의 우선적 결합 등을 통해 검출될 수 있다. 또 다른 예로서, 노화세포는 미국특허 제5,491,069호 및 미국 특허출원제2010/0086941호에 기재된 것과 같은 방법으로 검출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT, S1PR3, SLC6A8, UGCG 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 확인하여 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 세포에 비해 증가한 경우 노화 세포로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 노화 세포를 검출하는 단계는 PIM1 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PIM-1 키나아제 유전자의 발현 수준이 정상대조군 세포에 비해 증가한 경우, 노화 세포로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 대상 또는 대상으로부터 분리된 샘플에서 노화세포가 검출되는 경우 PIM-1 키나아제 억제제를 투여하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, PIM-1 키나아제 억제제는 상기 노화 세포의 사멸용 조성물 또는 약학적 조성물에서 기재된 것과 동일한 투여 경로, 투여 방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "예방"이란, 본 발명의 노화 세포 사멸용 조성물 또는 약학적 조성물을 질환 의심 개체에 투여하여 종양의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"란, 본 발명의 노화 세포 사멸용 조성물 또는 약학적 조성물을 질환 발병 개체에 투여하여 상기 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체" 또는 “대상”은 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 “대상”은 노화 세포를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 “대상”은 치료 유도된 노화 세포를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “대상”은 종양 세포의 노화 유도 요법에 의해 노화된 세포를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 대상은 항암 요법을 적용받은 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항암 요법에 의해 치료 유도된 노화 세포를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 대상으로부터 분리된 샘플은 상기 대상으로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 또는 타액 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 종양 조직 또는 종양 스페로이드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 노화 종양 세포의 제조
치료 유도된 노화 종양 세포를 제조하기 위해 아드리아마이신(Selleckhem, Catalog No.S1208, CAS 25316-40-9)을 대조적인 성격을 나타내는 유방암 세포주 (여성 호르몬 수용체 발현 양성이면서 상대적으로 덜 악성이 성격을 보이는 MCF7, ZR75-1와 호르몬수용체 및 HER2 수용체 음성의 삼중응성 유방암 세포주로 상대적으로 좀더 공격적인 성격을 보이는 Hs578T, MDA-MB-231)에 100nM를 처리 후 48시간 후에 세포배양액을 교환한 후 5-7일 배양하여 치료 유도된 노화 종양 세포를 제조하였다.
도 1에 도시된 것과 같이, 아드리아마이신에 의한 치료 유도 노화 후, 각 유방암 세포주의 세포 크기 증가하는 것을 확인하였으며, 노화 마커인 SA-b-gal 양성 세포의 수가 증가한 것을 확인하였다. 또한 각 세포주에서 세포주기 억제 인자인 p21의 mRNA 발현도 현저히 증가함을 확인하여 치료 유도 노화된 유방암 세포를 수득하였다.
실시예 2: 치료 유도된 노화 유방암 세포의 유전자 발현 분석 및 약물의 표적 선정
다음으로, 실시예 1에서 제조된 치료 유도된 노화 유방암세포의 유전자 발현을 RNASeq를 통해 분석한 뒤, 두 세포주 모두에서 발현이 향상된 322개의 유전자를 동정하였다(도 2A).
발현이 향상된 322개의 유전자 중, FDA 승인된 약물에 의해 표적이 가능한 유전자 28개를 선정하였으며 MCF7 및 MDA-MB 231 세포주에서 치료에 의한 노화를 유도하는 경우 28개 유전자의 발현 수준 변화를 확인하였다(도 2B).
MCF7 및 MDA-MB 231 세포주 이외에도, BT474, Hs578t, T47D, HCC1937과 같은 다른 유방암 세포주에 대해 실시예 1과 동일한 방법으로 치료에 의한 노화를 유도하고, 상기 28개의 유전자 발현 변화를 확인하여 적어도 2가지 이상의 세포주에서 동일한 발현 향상 패턴을 나타내는 다음의 유전자 23종을 표적으로 최종 선정하였다:
ATP2B4, CPE, CXCR4, DGAT2, F2R, FYN, ICAM1, IL6, INSR, KDM7A, MAOA, MAP2, MAST4, PDE4B, PIM1, PINK1, PLD1, PSMB9, QPRT, S1PR3, SLC6A8, UGCG 및 VEGFA.
실시예 3: 각 표적에 대한 약물의 노화 세포 선택적 사멸효과(senolytic effect) 확인
실시예 2에서 최종 선정된 23종의 유전자에 대한 FDA 승인 억제제(표 1)를 치료 유도된 노화 유방암 세포에 처리하는 경우에 노화 세포 선택적 세포 분열 억제 및 사멸효과(senolyric effct)를 CCK8 assay (D-Plus CCK, cell viability assay kit, Cat CCK-3000, 동인LS)를 통하여 확인하였다(도 3A). 이 때 대조군(치료 유도되지 않은 암세포)의 경우는 해당 억제제를 48시간 표기된 농도로 처리한 후에 측정을 하였으며, 치료 유도 노화 세포군의 경우 실시예 1과 같이 암세포에 아드리아마신을 48시간 처리하여 치료 유도 노화를 진행시킨 후에 배양액을 교환하면서 해당 억제제를 표기된 농도로 48시간 동안 처리하고 측정하였다.
Figure PCTKR2023016121-appb-img-000001
Figure PCTKR2023016121-appb-img-000002
도 3A에 도시된 것과 같이, 표 1의 표적을 억제하는 것으로 알려진 FDA 승인된 약물을 대조군 및 치료 유도된 노화 종양 세포에 처리하여 세포 사멸능을 확인한 결과, PIM-1 키나아제 억제제를 처리하는 경우 만이 치료 유도된 노화 종양 세포에 선택적인 사멸효과를 나타내는 것을 확인하였다.
PIM-1 키나아제를 최종 표적으로 선정하고, 기존의 원-투 펀치 요법에 사용되는 노화 세포 선택적 사멸 약물(Senolytic drug)으로 보고된 ABT-263과의 노화 세포 선택적 사멸 효과를 비교 하였다. 그 결과, 도 3B 및 3C에 도시된 것과 같이, ABT 263은 대조군과 TIS 세포의 사멸 효과에 유의미한 차이는 있었으나, 대조군과 TIS 세포 모두에 거의 완전한 사멸효과를 나타낸 반면, PIM-1 키나아제 억제제는 대조군은 고농도에서 세포 성장을 저하하지만, 거의 사멸시키지 않는데 반해 TIS 세포는 효과적으로 사멸시켜, 노화 세포에 대한 선택적 사멸능이 ABT-263에 비해 현저히 뛰어난 것을 확인하였다.
또한, PIM1/2 Kinase Inhibitor VI외의 PIM-1 키나아제 억제제를 사용하는 경우에도, 위에서 확인한 것과 동일한 노화 세포 선택적 사멸능을 나타내는지 확인하기 위해, SGI-1776(Selleckhem, Catalog No.S2198, CAS 1025065-69-3)을 사용하여, 동일한 방법으로 노화 세포 선택적 사멸 효과를 비교 하였다. 도 3D에 도시된 것과 같이, SGI-1776 (CAS 1025065-69-3)를 처리한 경우에도, TIS 세포에서 대조군에 비애 높은 세포 독성을 나타내어 PIM1 키나아제 억제제의 종류에 관계없이 뛰어난 노화 세포에 대한 선택적 사멸효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 다양한 암 세포주에 대한 치료에 의한 노화 유도 및 PIM 1 키나아제의 발현 분석 및 노화 세포 선택적 사멸능 분석
PIM 키나아제는 다르게 인산화와 같이 활성을 조절하는 2차적인 변화가 잘 알려져 있지 않으며, PIM 키나아제의 발현량에 전체적인 활성이 비례하는 것으로 보고되어 있다.
유방암 세포주(MCF7 및 MDA-MB231) 이외에도, 위암(SNU601, MKN1, MKN74), 대장암(SW480, Hct116), 두경부암(HSC4), 자궁경부암(HeLa S3), 담관암 (SNU308, SNU478, SNU1196), 췌장 선암종(BxPC3), 전립선암(PC3) 세포주에 대해 실시예 1과 동일한 방법을 통해 치료에 의한 노화를 유도하여 치료 유도된 노화 세포를 수득하였다.
그 결과 도 4a 내지 4b에 도시된 것과 같이, 모든 암세포주에 대해 치료 유도된 노화가 진행되는 경우, PIM-1 키나아제 mRNA와 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 아드리아마이신 외의 항암제를 사용하는 경우에도, 치료 유도 노화(TIS)가 발생하는지 확인하기 위해, 시스플라틴(cisplatin Selleckhem, Catalog No.S1166 CAS 15663-27-1) 10uM을 다양한 암세포주(MCF7, MDA-MB 231, MKN1, HSC4, SNU869)에 처리하는 경우에도 치료 유도 노화(TIS)가 발생하였으며, PIM-1 키나아제 유전자의 mRNA 발현이 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 4c).
치료에 의해 노화가 유도된 위암(SNU601), 두경부암(HSC4), 대장암(SW480) 세포주에 대해 Pim-1 키나아제 억제제를 처리하는 경우의 노화세포 선택적 사멸효과를 확인하기 위해 실시예 3에 도시된 방법과 동일한 방법으로 농도에 따른 사멸능을 확인하였다.
도 5에 도시된 것과 같이, 모든 암세포 주에서, 대조군은 유의미한 사멸효과가 나타나지 않은데 반해, 치료 유도된 노화 암세포의 경우 현저한 사멸효과를 나타내어, Pim-1 키나아제 억제제가 노화 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: Pim-1 유전자 발현 억제를 통한 노화 세포 선택적 사멸능 분석
Pim-1 키나아제 단백질 억제제의 처리 외에도, Pim-1 유전자의 발현 억제시 노화 세포를 선택적으로 사멸할 수 있는지 확인하기 위해, Pim-1 유전자를 표적으로 하는 siRNA(GUAUGAUAUGGUGUGUGGAGAUAUUC, 서열번호 1)를 처리하여 Pim-1 유전자의 발현을 억제하고 세포 독성을 확인하였다.
그 결과 도 6에 도시된 것과 같이, Pim-1 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 처리하여 Pim-1 키나아제의 발현을 유전자 단계에서 억제(knock down)할 수 있음을 확인하였으며(도 6a), 다양한 암세포(MCF7, HSC4, SNU601)에 Pim-1 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 처리하여 Pim-1 키나아제의 발현을 유전자 단계에서 억제(knock down)하는 경우에도 노화 세포에 대해 선택적인 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 6b 및 6c).
본 발명의 실시예에서와 같이, Pim-1 키나아제 단백질의 활성을 억제하는 다양한 화합물 또는 Pim-1 키나아제 유전자를 선택적으로 억제하는 siRNA의 처리시 일관적으로 노화 세포에 대해 뛰어난 노화세포의 성장 억제 및 사멸능을 고려하면, Pim-1 키나아제의 발현 억제 또는 활성 억제가 노화세포의 성장 억제 및 사멸을 유도할 수 있는 신규한 작동 메커니즘임이 입증되었다 할 수 있다.
따라서, 상기 실시예의 결과로부터 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제, 또는 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제는 그 종류 및 형태를 불문하고, Pim-1 키 (아주대) PP-B2966.docx나아제의 억제를 통해 다양한 노화 세포의 사멸 용도(senolytic use)에 이용될 수 있음을 자명하게 이해할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포, 특히 Pim-1 키나아제 발현이 향상된 노화 세포에 선택적인 사멸효과를 나타낸다. 본 발명의 노화 세포의 사멸용 조성물은 노화 세포에 대한 선택적 사멸효과를 통해 노화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히, 종양 세포의 노화 유도를 기반으로 하는 항암요법에 후속적으로 Pim-1 키나아제 억제제를 투여하여 치료 유도된 노화 세포(Therapy induced senescence cell)를 선택적 사멸시킴으로써 뛰어난 종양의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (20)

  1. Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 세포의 사멸용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제, 또는 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), anti-microRNA, MicroRNA mimic, nuclease, Zinc Finger Nucleases(ZFNs), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), gRNA, sgRNA 및 self-ribozyme-flanked RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 Pim-1 kinase 단백질 활성 억제제는 Pim-1 kinase 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 압타머, 항체 및 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 노화 세포는 노화 암 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 노화 암 세포는 종양유전자 유도된 노화 세포(Oncogene-induced senescence cell; OIS cell) 또는 치료 유도된 노화 세포(Therapy induced senescence cell; TIS cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 노화 세포는 Pim-1 키나아제의 발현이 향상된 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 세포(TIS cell)는 화학 요법, 생물학적 요법 또는 방사선 요법에 의해 노화가 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 치료 유도된 노화 세포(TIS cell)는 항암제에 의해 노화가 유도된 암세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. Pim-1 키나아제 억제제를 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 알츠하이머, 파킨슨, 백내장, 황반변성, 녹내장, 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 심근경색, 뇌졸중, 고혈압, 특발성 폐섬유증(IPF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 골관절염, 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만, 지방기능장애, 관상동맥질환, 뇌혈관 질환, 치주질환, 각종 조직의 위측, 섬유증과 같은 암 치료 관련 장애, 뇌 및 심장의 손상, 및 골수이형성증후군으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. Pim-1 키나아제 억제제를 포함하고, 종양 세포의 노화 유도 요법 뒤에 투여되는, 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제14항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제, 또는 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 Pim-1 키나아제 유전자를 표적으로 하는 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), anti-microRNA, MicroRNA mimic, nuclease, Zinc Finger Nucleases(ZFNs), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), gRNA, sgRNA 및 self-ribozyme-flanked RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 유전자 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 Pim-1 키나아제 단백질 활성 억제제는 Pim-1 키나아제의 활성을 특이적으로 억제하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 압타머, 항체 및 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 종양 세포의 노화 유도 요법은 화학요법, 생물학적 요법 또는 방사선 요법인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 상기 종양 세포의 노화 유도 요법에 의해 생성된 치료 유도된 노화 종양 세포(TIS tumor cell)를 선택적으로 사멸시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제13항에 있어서, 상기 종양 세포의 노화 유도 요법으로 유도된 노화 종양 세포는 Pim-1 키나아제의 발현이 향상된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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