WO2017061828A1 - Plrg1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Plrg1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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박은란
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이은주
함용호
김상범
박선후
한철주
홍성희
김양현
김정민
김미연
강문경
송은영
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Definitions

  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a pleiotropic regulator 1 (PLRG1) inhibitor as an active ingredient, a method for treating cancer comprising administering the composition to a subject, and an agent for measuring the expression level of PLRG1. It relates to a method for providing cancer diagnosis comprising a composition for diagnosing cancer, and measuring the expression level of PLRG1, and a method for screening an agent for preventing or treating cancer.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • Cancer has characteristics that are not regulated in cell growth compared to normal cells, invading into adjacent tissues, and sometimes metastatic. Cancer is a disease primarily related to tissue growth regulation. When normal cells are transformed into cancer cells, the expression of genes that regulate cell growth and division change (Croce., The New England Journal of Medicine, 358). (5): 502-511, 2008).
  • Chemotherapy involves the removal of tumor tissue physically, or the use of oncogenes, including anti-apoptotic molecules, telomerases, growth factor receptor genes (such as oncogenes). It is performed in a manner that inhibits the expression of genes necessary for the survival of cancer cells or induces cell death, such as growth factor receptor genes, signaling molecules, etc. (Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1 (2): 157-162, 2001). However, in the treatment process, not only cancer cells but also normal cells may be affected, resulting in side effects.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • the present invention has been completed by confirming that cell death can be induced.
  • One object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a PLRG1 (pleiotropic regulator 1) inhibitor as an active ingredient.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a PLRG1 inhibitor as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer, which comprises an agent for measuring the expression level of PLRG1 (pleiotropic regulator 1).
  • Still another object of the present invention is to measure the expression level of (pleiotropic regulator 1) PLRG1 from isolated biological samples; (b) comparing the expression level with the PLRG1 expression level of the normal control sample; And (c) determining that the PLRG1 expression level of the biological sample is higher than the PLRG1 expression level of the normal control group.
  • Another object of the present invention (a) measuring the level of PLRG1 (pleiotropic regulator 1) expression from a sample of a control animal diseased cancer; (b) administering a candidate substance expected to be able to treat cancer in the experimental animal; (c) measuring the expression level of PLRG1 from a sample of the experimental animals administered with the candidate substance in the experimental group; And (d) a prophylactic agent for preventing the onset of cancer when the PLRG1 expression level measured in the control group is lower than that measured in the control group compared to that measured in the experimental group.
  • it provides a method for screening a product for the prevention or treatment of cancer, comprising the step of determining that it can be used as a therapeutic agent for treating cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating cancer, comprising: (a) treating a cancer treatment candidate to an isolated cancer cell expressing PLRG1 (pleiotropic regulator 1); (b) measuring the PLRG1 expression level in the isolated cancer cells treated with the candidate substance; And (c) when the PLRG1 expression level measured in step (b) is lower than that of isolated cancer cells that have not been treated with the candidate, the candidate agent may be used as a prophylactic agent or cancer for preventing the onset of cancer. It provides a method of screening for a prophylactic or therapeutic agent for cancer, comprising the step of determining that it can be used as a therapeutic agent for treatment.
  • Another object of the present invention comprises the step of designing an anti-cancer candidate for inhibiting the transcription or translation of PLRG1 or inhibit the activity of PLRG1 protein based on the PLRG1 gene sequence, the preparation of a candidate for the prevention or treatment of cancer To provide a search method.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • the PLRG1 inhibitor of the present invention has an excellent effect as an anticancer agent without side effects, and can also be utilized for cancer diagnosis and anticancer drug screening by measuring the PLRG1 expression level.
  • Figure 1 confirms that the expression of PLRG1 (pleiotropic regulator 1) is increased in liver cancer tissues and liver cancer cell lines.
  • PLRG1 expression in peripheral liver tissue (N) and liver cancer tissue (T) was measured by RT-PCR and Western blot method.
  • B PLRG1 expression in normal and cancer cell lines was measured by RT-PCR and Western blot methods.
  • LO2 immortalized cells.
  • Figure 2 confirms that the growth of cancer cell monoclonal (clonal growth) is inhibited by the inhibition of PLRG1 expression.
  • Figure 3 confirms the inhibition of cancer cell specific cell growth by inhibition of PLRG1 expression.
  • A 5 days after inoculation of Huh7, HDF, IMR90, WI38 and BJ cells into which Control-siRNA (si-Con) or PLRG1-siRNA (si-PLRG1 # 1, si-PLRG # 2) was introduced into crystal violet By staining (top), the degree of color development was quantified at OD 595 nm to compare cell growth (bottom). Statistical significance of growth difference between control-siRNA treated cells and PLRG1-siRNA treated cells was analyzed (Not significant, N.S. p> 0.05; significant ***, p ⁇ 0.001).
  • B The effect of reduced PLRG1 expression in Huh7 cells was measured at 24 hour intervals to create cell growth curves. The expression of PLRG1 and beta-actin was measured by RT-PCR.
  • Figure 4 confirms the induction of cancer specific cell death (apoptosis) by the inhibition of PLRG1 expression by Annexin V staining.
  • A Inoculated with SNU475, Huh7, and BJ cells introduced with Control-siRNA (si-Con) or PLRG1-siRNA (si-PLRG # 2), and incubated for 96 hours, and stained with Annexin V. It was.
  • B Annexin V-positive populations were quantified by measuring by FACS.
  • Figure 5 confirms the cancer specific cell death (apoptosis) by the inhibition of PLRG1 expression by Annexin-PI staining method.
  • BJ, HDF, and WI38 normal cell lines into which control-siRNA (si-Con) or PLRG1-siRNA (si-PLRG # 2) were introduced were inoculated, and cultured for 96 hours. After staining with Annexin V and PI, PI-positive, Annexin V-positive and PI-Annexin-double positive populations were measured by FACS.
  • Figure 6 confirms that inhibition of PLRG1 expression does not affect mesenchymal stem cell growth.
  • A Pictures of cells inoculated with mesenchymal stem cells into which Control-siRNA (si-Con) or PLRG1-siRNA (si-PLRG1 # 1, si-PLRG # 2) were introduced and cultured for 7 days.
  • B After staining with crystal violet (top), the cell growth rate was measured by measuring the color development at OD 595 nm. Cell growth rate was calculated based on the degree of staining of cells treated with control-siRNA.
  • Figure 7 confirms that there is no influence of PLRG1 expression inhibition on the growth of telomerase (telomerase) induced normal cells.
  • telomerase telomerase induced normal cells.
  • A inoculated BJ and BJ-T (telomerase-positive BJ) cells into which Control-siRNA (si-Con) or PLRG1-siRNA (si-PLRG1 # 1, si-PLRG # 2) was introduced, and 5 Staining with crystal violet after daily incubation.
  • B The cell growth rate was measured by measuring the color development at OD 595 nm, the cell growth rate was calculated based on the degree of staining of the control-siRNA treated cells.
  • the expression of PLRG1 and beta-actin was measured by RT-PCR.
  • 8A shows the corresponding positions of 10 siRNAs prepared for PLRG1.
  • FIG 8B shows the expression and colony number of PLRG1 when SNU475 cells were treated with control siRNA (si-Con) or PLRG1 siRNA (si-PLRG1 # 1 to siPLRG1 # 10).
  • FIG. 10 shows the system after the introduction of IPTG-inducible sh-PLRG1 into Huh7 and SNU475 cell lines.
  • A Human PLRG1 sh-RNA target sequence position is shown.
  • B Infection and hepatic cancer cell death in liver cancer and normal cell lines by PLRG1 sh-RNA lentivirus were observed under a microscope.
  • C PLRG1 sh-RNA lentiviral infection and cancer cell death by the IPTG expression suppression system were observed under a microscope.
  • D Protein expression during cancer cell death was measured by Western blot.
  • Figure 11 confirms the effect of inhibiting PLRG1 in animal models.
  • the left side is a picture of the mouse 27 days after the cell injection, the right side is the tumor size in each mouse by date.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a PLRG1 (pleiotropic regulator 1) inhibitor as an active ingredient.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • CDC5L cell division cycle 5-like
  • PLRG1 plays a key role in determining alternative splicing locations and some reports have been made regarding the stage of development, but no correlation between PLRG1 and cancer has been reported.
  • PLRG1 is suitable as a cancer treatment target.
  • PLRG1 inhibitor is used as a generic term for all agents that reduce the expression or activity of PLRG1, specifically, in a manner that acts directly on PLRG1 or indirectly on its ligand, By reducing expression at the level of transcription or interfering with its activity, any agent that reduces the expression level of PLRG1 or its activity may be included.
  • the inhibitor of PLRG1 may be used without limitation in form of a compound, a nucleic acid, a peptide, a virus, or a vector containing the nucleic acid, which may target PLRG1 and inhibit the expression or activity of PLRG1.
  • the PLRG1 inhibitor may be, but is not limited to, an oligonucleotide that inhibits the expression of PLRG1 mRNA, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that inhibits the activity of the PLRG1 protein, and more specifically, inhibits the expression of the PLRG1 mRNA.
  • the oligonucleotides may be antisense oligonucleotides, aptamers, shRNAs or siRNAs specific for PLRG1 mRNA, and more specifically, the siRNAs may be oligonucleotides of any one of SEQ ID NOs: 11 to 20 and complements thereof. It may be a double strand of the oligonucleotide having a sequence, the shRNA may have an oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or 22, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA, RNA, or derivatives thereof that contain a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, which binds to a complementary sequence in the mRNA and inhibits translation of the mRNA into a protein. It works. Antisense oligonucleotide sequence means a DNA or RNA sequence that is complementary to the PLRG1 mRNA and capable of binding to said mRNA. This may inhibit the essential activity of the translation of the PLRG1 mRNA, translocation into the cytoplasm, maturation or any other overall biological function.
  • the length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro in a conventional manner to be administered in vivo or to allow the antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is in the opposite direction of the multicloning site (MCS).
  • MCS multicloning site
  • the antisense RNA is preferably such that the translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • the design of antisense oligonucleotides that can be used in the present invention can be readily prepared according to methods known in the art with reference to the nucleotide sequence of PLRG1.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule that is a single-stranded oligonucleotide and has a size of about 20 to 60 nucleotides and has a binding activity to a predetermined target molecule. It has various three-dimensional structures depending on the sequence, and may have a high affinity with a specific substance, such as an antigen-antibody reaction. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the desired target molecule.
  • the aptamers of the invention may be RNA, DNA, modified nucleic acids or mixtures thereof, and may also be in linear or cyclic form. Preferably, the aptamer may play a role in binding to PLRG1 and inhibiting the activity of PLRG1.
  • Such aptamers can be prepared by a person skilled in the art from a sequence of PLRG1 by known methods.
  • shRNA is nucleic acid molecules capable of mediating RNA interference or gene silencing, and are effective in knockdown methods or genes because they can inhibit expression of target genes. Used as a treatment method.
  • shRNA is a hairpin structure formed by binding between complementary sequences in a single strand of oligonucleotide, and in vivo, the shRNA is cleaved by a dicer and is a small RNA fragment of 21 to 25 nucleotides in size.
  • SiRNA which is a double-stranded oligonucleotide, can be specifically bound to mRNA having a complementary sequence to suppress expression.
  • PLRG1 can be specifically inhibited by cleaving PLRG1 mRNA molecules to induce RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for producing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art can be used.
  • a method for chemically synthesizing siRNA directly a method for synthesizing siRNA using in vitro transcription, a method for cleaving long double stranded RNA synthesized by in vitro transcription with an enzyme, Expression methods through intracellular delivery of shRNA expression plasmids or viral vectors and expression methods through intracellular delivery of polymerase chain reaction (SIPC) -induced siRNA expression cassettes (cassette), but are not limited thereto.
  • SIPC polymerase chain reaction
  • the siRNA for PLRG1 of the present invention may be composed of a double strand of oligonucleotide having an oligonucleotide and any complementary sequence of any one of SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 20, but is not limited thereto.
  • the shRNA may have an oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, but is not limited thereto.
  • the term "antibody” refers to a substance that reacts when an antigen, an external substance, invades while circulating blood or lymph in the immune system of a living body, and is also called an immunoglobulin as a globulin-based protein formed in lymphoid tissue.
  • Antibodies are proteins produced by B cells that flow into body fluids and bind specifically to antigens.
  • a single antibody molecule has two heavy chains and two light chains. And the light chain has a variable region at its N-terminal end. Each variable region consists of three complementarity determining regions (CDRs) and four framework regions (FRs), which determine the antigen binding specificity of an antibody and determine the structure of the variable region. It exists as a relatively short peptide sequence that is maintained at formation sites.
  • the antibody may be an antibody capable of binding to PLRG1 and inhibiting the activity of PLRG1.
  • cancer refers to a disease associated with cell death regulation, and refers to a disease caused by overproliferation of cells when a normal cell death balance is broken. These abnormally overproliferating cells sometimes invade surrounding tissues and organs to form masses and destroy or modify the normal structure of the body, which is called cancer.
  • tumor refers to a lump grown abnormally by autonomous overgrowth of body tissue, and may be classified into a benign tumor and a malignant tumor. Malignant tumors grow much faster than benign tumors and invade surrounding tissues, resulting in metastasis, which is life threatening.
  • Such malignant tumors are commonly referred to as 'cancer', and the types of cancers are cerebral spinal cord tumors, brain tumors, head and neck cancers, lung cancers, breast cancers, thymic tumors, mesothelioma, esophageal cancer, cancer, colon cancer, liver cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, Include biliary tract cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colon cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma and skin cancer
  • the type of cancer of the present invention is not limited.
  • the cancer in the present invention may be a cancer in which PLRG1 is overexpressed than normal tissue, but is not limited thereto.
  • the cell death is a form of cell death, which is distinguished from cell necrosis, in which cells are physically destroyed. Also referred to as programmed cell death, a process in which DNA damaged or unnecessary is killed by itself. .
  • PLRG1 inhibition is quite strictly cancer cells. It was confirmed that the cell death can be specifically induced. Furthermore, using the IPTG-inducible-sh-PLRG1 system, it was confirmed in the mouse animal model that the results were the same in vivo (FIG. 11). This suggests that when the PLRG1 inhibitor is used as an anticancer agent, it can induce apoptosis of cancer cells specifically without adverse effects on normal cells without side effects.
  • the term "treatment” refers to clinical intervention to alter the natural process of the individual or cell to be treated, which can be done during or to prevent clinical pathology.
  • the desired therapeutic effect includes preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating the symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, slowing the progression of the disease, and reducing the disease state. Or temporarily alleviate, drive off, or improve the prognosis.
  • the present invention includes all actions of improving cancer progression by administration of a composition containing a substance that inhibits PLRG1.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of cancer by administration of a composition comprising a substance that inhibits PLRG1 according to the present invention.
  • compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • Compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used.
  • Solid form preparations for oral administration may include tablet pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in one or more compounds. (lactose), gelatin can be prepared by mixing.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations And it may have any one formulation selected from the group consisting of suppositories.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a pleiotropic regulator 1 (PLRG1) inhibitor as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising a pleiotropic regulator 1 (PLRG1) inhibitor as an active ingredient.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • the term "individual” means any animal, including humans, who possesses or develops a cancer disease of the present invention.
  • cancer can be alleviated or treated, including liver cancer.
  • Said alleviation refers to any action by which administration of a composition according to the invention improves or benefits cancer disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "administration" refers to introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a subject in any suitable manner, and the route of administration may be administered via various routes, oral or parenteral, as long as the target tissue can be reached.
  • the pharmaceutical composition may be appropriately administered to a subject according to conventional methods, routes of administration, and dosages used in the art, depending on the purpose or need.
  • routes of administration may be administered orally, parenterally, subcutaneously, intraperitoneally, pulmonary, and intranasally, and parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration.
  • an appropriate dosage and frequency of administration may be selected according to methods known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention to be administered may be based on the type of symptom to be treated, route of administration, sex, health condition, It may be appropriately determined by various factors such as the diet, the age and weight of the individual, and the severity of the disease.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to inhibit or mitigate the increase in vascular permeability at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical use, and the effective dose level may include the type and severity, age, It may be determined according to sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer, comprising an agent for measuring the expression level of pleiotropic regulator 1 (PLRG1).
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • the present invention provides a method for preparing a human body, the method comprising: (a) measuring the expression level of PLRG1 (pleiotropic regulator 1) from an isolated biological sample; (b) comparing the expression level with the PLRG1 expression level of the normal control sample; And (c) determining that the PLRG1 expression level of the biological sample is higher than the PLRG1 expression level of the normal control group, thereby providing information for cancer diagnosis.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1
  • the term “diagnosis” refers to the identification or presence of a cancer disease by measuring the presence or absence of the PLRG1 of the invention in a biological sample or tissue sample.
  • a “marker or diagnostic marker” is a substance that can diagnose cancer cells or individuals with cancer disease by distinguishing them from normal cells or normal individuals, and increases or decreases in cells or individuals with cancer compared to normal cells.
  • Organic biomolecules such as polypeptides, proteins or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) exhibiting a decrease.
  • the cancer diagnostic marker of the present invention is PLRG1, which exhibits a particularly high level of expression in cancer cells as compared to cells of normal cells or tissues.
  • measuring the PLRG1 expression level may be to measure the mRNA expression level of PLRG1 or to measure the PLRG1 protein expression level.
  • the "mRNA expression level measurement” is a process of confirming the presence and expression level of the mRNA of the cancer marker gene in a biological sample to diagnose cancer, it can be known by measuring the amount of mRNA. Analytical methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA) and Northern blotting (Northern). blotting), DNA chips and the like, but are not limited thereto.
  • the "protein expression level measurement” is a process of confirming the presence and expression of the protein expressed in the cancer marker gene in a biological sample to diagnose cancer, using an antibody that specifically binds to the protein of the gene Check the amount of protein by For analysis, Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis , Tissue immunity staining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation assay), complement fixation assay (complement fixation assay), FACS, protein chip (protein chip) and the like, but are not limited thereto.
  • the agent for measuring the mRNA level may be a primer pair, a probe, or an anti-sense nucleotide for the mRNA of PLRG1 of the present invention, and the polynucleotide of PLRG1 of the present invention. Sequences allow those skilled in the art to easily design primers, probes, or antisense nucleotide sequences.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody.
  • the effect of the diagnosis of cancer, including liver cancer was confirmed by measuring the level of PLRG1.
  • the present invention provides a method for treating a cancer, comprising: (a) measuring the expression level of pleiotropic regulator 1 (PLRG1) from a sample of a control animal with cancer; (b) administering a candidate substance expected to be able to treat cancer in the experimental animal; (c) measuring the expression level of PLRG1 from a sample of the experimental animals administered with the candidate substance in the experimental group; And (d) a prophylactic agent for preventing the onset of cancer when the PLRG1 expression level measured in the control group is lower than that measured in the control group compared to that measured in the experimental group.
  • a screening method of the agent for preventing or treating cancer comprising the step of determining that it can be used as a therapeutic agent for treating cancer.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising: (a) treating a cancer treatment candidate to an isolated cancer cell expressing PLRG1 (pleiotropic regulator 1); (b) measuring the PLRG1 expression level in the isolated cancer cells treated with the candidate substance; And (c) when the PLRG1 expression level measured in step (b) is lower than that of isolated cancer cells that have not been treated with the candidate, the candidate agent may be used as a prophylactic agent or cancer for preventing the onset of cancer. It provides a method of screening for a prophylactic or therapeutic agent for cancer, comprising the step of determining that it can be used as a therapeutic agent for treatment.
  • Measuring the expression level of the gene of the present invention or the level of the protein encoded by the gene in cells in the absence of a candidate agent capable of preventing or treating cancer, and also in the presence of the candidate agent After comparing the two by measuring the expression level or the level of the protein encoded by the gene, the expression level of the gene of the present invention when the candidate substance is present or the level of the protein encoded by the gene is absent of the candidate substance. Substances that decrease below levels can be predicted as agents for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • the screening method may be performed in vivo or in vitro, and is not particularly limited.
  • Candidates can be known or novel, and can be screened on a large scale via, for example, plant extracts or chemical libraries. Through this, it is possible to discover an agent for preventing or treating cancer that can induce cancer cell specific cell death by inhibiting the expression or activity of PLRG1.
  • the present invention includes the step of designing an anti-cancer candidate that inhibits the transcription or translation of PLRG1 or inhibits the activity of the PLRG1 protein based on the PLRG1 gene sequence.
  • a method for searching for a candidate for prophylaxis or treatment is provided.
  • the present invention first identified that the inhibition of PLRG1 has a cancer cell specific anticancer effect. Therefore, those skilled in the art can recognize that a substance that inhibits transcription or translation of PLRG1 or inhibits the activity of PLRG1 protein may have anticancer activity.
  • siRNA and shRNA for PLRG1 confirming the effect in the embodiment of the present invention should be seen as only one example that demonstrates this technical idea, and those skilled in the art will be able to obtain PLRG1 gene sequence information through various methods known in the art.
  • siRNA or shRNA may be prepared based on the PLRG1 gene sequence, or a compound capable of inhibiting the compound based on the structure of the protein translated from the PLRG1 gene may be predicted through a computer program.
  • Candidates selected by the screening method may be used for screening effective substances through in vitro or in vivo screening.
  • RT-PCR and real-time PCR primers used to measure gene expression are as follows.
  • PLRG1 forward primer ACCGTCCAC AGCCTACAGCGA (SEQ ID NO: 1)
  • PLRG1 reverse primer ACTATCACGCCCCGCACAGT (SEQ ID NO: 2)
  • GAPDH forward primer GTCAGTGGTGGACCTGACCT (SEQ ID NO: 3)
  • GAPDH reverse primer TGCTGTAGCCAAATTCGTTG (SEQ ID NO: 4)
  • ⁇ -actin forward primer GGACTTCGAGCAAGAGATGG (SEQ ID NO: 5)
  • ⁇ -actin reverse primer AGCACTGTGTTGGCGTACAG (SEQ ID NO: 6)
  • PLRG1 forward primer CTTAAAGAGAAGGGTCCTCAG (SEQ ID NO: 7)
  • PLRG1 reverse primer GGTCCTGGTGGGTATGGATGT (SEQ ID NO: 8)
  • ⁇ -actin forward primer GCACCACACCTTCTACAATGA (SEQ ID NO: 9)
  • ⁇ -actin reverse primer TAGCACAGCCTGGATAGCAAC (SEQ ID NO: 10)
  • siRNAs and shRNAs used to inhibit PLRG1 expression are as follows.
  • siPLRG1 # 1 uccggucauaaugcuauuauu (SEQ ID NO: 11)
  • siPLRG1 # 2 agccaugauacuacaauucga (SEQ ID NO: 12)
  • siPLRG1 # 3 cgaggagguacagaaacauucugua (SEQ ID NO: 13)
  • siPLRG1 # 4 aaagagaaggguccucagaaugcaa (SEQ ID NO: 14)
  • siPLRG1 # 5 cagaacuauaaagaucugggacuug (SEQ ID NO: 15)
  • siPLRG1 # 6 uccagucagcuggaaaccagaaauu (SEQ ID NO: 16)
  • siPLRG1 # 7 cccaugacauguuuguagcugauaa (SEQ ID NO: 17)
  • siPLRG1 # 8 ccaagaacucugcacugauggcuaa (SEQ ID NO: 18)
  • siPLRG1 # 9 accguggaaacucuacaggguuauc (SEQ ID NO: 19)
  • siPLRG1 # 10 aagcugauaaaaccauuaaaguaua (SEQ ID NO: 20)
  • shPLRG1 # 1 CCATGATACTACAATTCGATT (SEQ ID NO: 21)
  • shPLRG1 # 2 GACTTGGCTAGTGGCAAATTA (SEQ ID NO: 22)
  • Human liver cancer cell lines Huh7 and SNU475 cells purchased from ATCC were cultured in RPMI medium containing 10% FBS (fetal bovine serum). Another human liver cancer cell line, Hep3B and HepG2 cells, was cultured in MEM medium containing 10% FBS. Normal cells HDF, IMR90, WI38, BJ and BJ-T cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS.
  • Human mesenchymal stem cells purchased from Lonza were incubated with human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKit TM Medium (MSCGM).
  • cDNA complementary DNA
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • Proteins were extracted from liver cancer tissues and surrounding tissues using lysis buffer, and protein expression levels were measured by Western blot using PLRG1 (pleiotropic regulator 1) antibody (SIGMA) and GAPDH antibody (Santacruz). . Western blot was performed for each cell line in the same manner as above. ⁇ -actin antibody (Santacruz) was used as a control.
  • PLRG1 pleiotropic regulator 1 antibody
  • GAPDH antibody Santacruz
  • siRNAs against PLRG1 as inhibitors to inhibit PLRG1 expression.
  • SiPLRG1 # 1 to siPLRG # 10 used were purchased from Qiagen, control-siRNA was purchased from Mbiotech. After inoculating each cell into a 60 mm culture dish, control-siRNA and two types of PLRG1-siRNA were introduced. After 24 hours, 1,000 cells were counted and inoculated again, and after 10 days, the cells were stained with crystal violet. Stained colonies were counted to quantify monoclonal growth.
  • control-siRNA and two types of PLRG1-siRNA were introduced. After 5 days, the cells were stained with crystal violet, dissolved with glacial acetic acid, and absorbance was measured at O.D 595 nm. Each experiment was repeated three times. Huh7 cell lines were measured for cell growth at 24, 48, 72, 96 and 120 hours.
  • Each cell was inoculated in a 60 mm petri dish and treated with control-siRNA and PLRG1-siRNA, respectively. After 72 hours, all cells were collected, stained for 15 minutes by adding Annexin V-FITC, and the degree of cell death was measured using a flow cytometer.
  • Annexin V-FITC and PI propidium iodide were added at the same time for 15 minutes and stained using a flow cytometer.
  • the mRNA levels of PLRG1 present in the non-tumoral surrounding liver tissues and liver cancer tissues were measured by RT-PCR, respectively. As a result, it was confirmed that the mRNA of PLRG1 was overexpressed in the liver cancer tissues compared to the non-tumoral liver tissues (FIG. 1). ). In Western blot analysis, the amount of protein was also significantly increased in the expression of PLRG1 in liver cancer tissue (FIG. 1A).
  • PLRG1 is overexpressed in cancer cells or tissues, and inhibiting expression does not affect normal cells and induces death of cancer cells specifically, indicating that PLRG1 is a growth factor specifically required for cancer cells. To reinforce these results, the effect of PLRG1 was measured using mesenchymal stem cells with rapid cell division.
  • stem cells including mesenchymal stem cells are activated telomerase (telomerase) as in cancer cells. Since no effect of PLRG1 expression was observed in mesenchymal stem cells, the effect of PLRG1 expression reduction was measured using normal cells induced with telomerase overexpression.
  • telomerase telomerase
  • telomerase has no effect by inhibiting PLRG1 expression in normal cells but not cancer cells regardless of expression.
  • siRNAs targeting the PLRG1 gene were produced by different sequences (FIG. 8A). Each siRNA was transformed into Huh7 and SNU475 and the effects on cell growth and PLRG1 expression were measured.
  • lung cancer cells A549, H460
  • breast cancer cells MDA231
  • cervical cancer cells Hela, SiHa
  • osteosarcoma SaOS2, U2OS
  • brain cancer cells LN229)
  • colon cancer cells HCT116, SW480
  • PLRG1 expression control system by IPTG-inducible sh-PLRG1.
  • Constitutive lentivectors loaded with shRNA against human PLRG1 were purchased from Sigma (FIG. 10A). Oligos were synthesized to introduce the shPLRG1 # 1 and shPLRG1 # 2 sequences verified in the constitutive lentivector system into the inducible lentivector system. The primers were annealed for shPLRG1 # 1 and shPLRG1 # 2, and then the synthesized PCR product was cut with KpnI-EcoRI and cloned into the LKO-3X Inducuble vector. Oligo sequence information is as follows.
  • shPLRG1 # 1-F (KpnI): CgaGgtaCCGGCCATGATACTACAATTCGATTCTCGAGAATCGAATTGTAGTATCATGGTTTTTagaattcCG (SEQ ID NO: 23)
  • shPLRG1 # 1-R (EcoRI): CGgaattctAAAAACCATGATACTACAATTCGATTCTCGAGAATCGAATTGTAGTATCATGGCCGGtacCtcg (SEQ ID NO: 24)
  • shPLRG1 # 2-F (KpnI): CgaGgtaCCGGGACTTGGCTAGTGGCAAATTACTCGAGTAATTTGCCACTAGCCAAGTCTTTTTTGaattcCG (SEQ ID NO: 25)
  • shPLRG1 # 2-R (EcoRI): CGgaattCAAAAAAGACTTGGCTAGTGGCAAATTACTCGAGTAATTTGCCACTAGCCAAGTCCCGGtacCtcg (SEQ ID NO: 26)
  • Virus was synthesized from the complete lentivector, and then infected with liver cancer cell lines Huh7, SNU475, and normal cell line BJ. After 7 days of maintaining the cells, normal cells were not affected by cell death, whereas liver cancer cell lines induced cell death by sh-RNA target sequences sh-PLRG1 # 1 and sh-PLRG1 # 2 (FIG. 10B). . After synthesizing the virus against two inducible lentivectors, sh-PLRG1 # 1 and sh-PLRG1 # 2, they were infected with liver cancer cell lines Huh7, SNU475 and normal cell line BJ for 2 days and then infected with puromycin for 5 days. Were screened.
  • Huh7 cells (3 ⁇ 10 6 each) introduced with IPTG-inducible sh-PLRG1 # 1 or # 2 were injected into the right thigh of the nude mouse, respectively, and the Huh7 cells with the sh-control vector introduced into the left thigh of the nude mouse. Injected into. The mice were then bred for 27 days with or without IPTG and then water was confirmed in each mouse.
  • PLRG1 expression did not affect normal cells such as mesenchymal stem cells, and induced cell death specifically for cancer cells. Therefore, it can be used as an anticancer agent using an agent capable of inhibiting PLRG1 expression, and is also expected to be utilized for cancer diagnosis and anticancer drug screening by measuring the PLRG1 expression level.

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Abstract

본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법, PLRG1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물, 및 PLRG1의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. PLRG1 (pleiotropic regulator 1)은 암 세포에서 과발현되고, 이의 발현을 억제하는 경우 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이에, 본 발명의 PLRG1 억제제는 부작용 없이 항암제로 우수한 효과가 있으며, 또한 PLRG1 발현 수준을 측정함으로써 암 진단 및 항암제 스크리닝 등에 활용할 수 있다.

Description

PLRG1 (PLEIOTROPIC REGULATOR 1) 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물
본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법, PLRG1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물, 및 PLRG1의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 정상 세포에 비하여 세포 성장이 조절되지 않고, 근접한 조직으로 침입이 가능하며, 때로는 전이가 되는 특성을 가지고 있다. 암은 기본적으로 조직의 성장 조절에 관련되어 있는 질병으로, 정상 세포가 암 세포로 형질전환이 되면 세포 성장과 분열을 조절하는 유전자의 발현이 변화한다 (Croce., The New England Journal of Medicine, 358(5): 502-511, 2008).
항암 치료는 물리적으로 종양 조직을 제거하거나, 또는 방사선 조사나 항암제 투여를 통해 암 유전자 (oncogene)를 비롯하여 항-세포 사멸 분자 (anti-apoptotic molecule), 텔로머라제 (telomerase), 성장인자 수용체 유전자 (growth factor receptor gene), 신호전달 분자 (signaling molecule) 등과 같이 암 세포의 생존에 필요한 유전자의 발현을 저해시키거나 세포 사멸을 유도하는 방식으로 수행된다 (Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1(2): 157-162, 2001). 그러나 이와 같은 치료 과정에서 암 세포뿐만 아니라 정상 세포도 영향을 받을 수 있어 부작용이 나타나는 문제점이 있다.
본 발명자들은 부작용 없이 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있는 제제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, PLRG1 (pleiotropic regulator 1)이 정상 세포보다 암 세포에서 과발현되며 이를 억제할 경우 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 PLRG1 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 PLRG1 발현 수준이 정상 대조군의 PLRG1 발현 수준보다 높을 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 실험동물에서 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 PLRG1 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) PLRG1 (pleiotropic regulator 1)을 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 PLRG1 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PLRG1 유전자 서열을 기반으로 PLRG1의 전사 혹은 번역을 억제하거나, PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 항암 후보물질을 설계하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제 후보물질의 탐색 방법을 제공하는 것이다.
PLRG1 (pleiotropic regulator 1)은 암 세포에서 과발현되고, 이의 발현을 억제하는 경우 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이에, 본 발명의 PLRG1 억제제는 부작용 없이 항암제로 우수한 효과가 있으며, 또한 PLRG1 발현 수준을 측정함으로써 암 진단 및 항암제 스크리닝 등에 활용할 수 있다.
도 1은 간암 조직 및 간암 세포주에서 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현이 증가되는 것을 확인한 것이다. (A) 간암 주변조직 (N)과 간암조직 (T)에서 PLRG1 발현을 RT-PCR과 웨스턴블랏 (western blot) 방법으로 측정하였다. (B) 정상 세포주와 암 세포주에서 PLRG1 발현을 RT-PCR과 웨스턴블랏 방법으로 측정하였다. LO2: 불멸화 세포 (immortalized cells).
도 2는 PLRG1의 발현 억제에 의해 암 세포 단일 클론의 성장 (clonal growth)이 억제되는 것을 확인한 것이다. Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG1#1, si-PLRG#2)가 도입된 SNU475 (A), Hep3B (B), HepG2 (C), 및 Huh7 (D) 암 세포주를 저밀도로 접종한 후 단일 클론 성장을 측정하였다. 형성된 콜로니를 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하여 (상단), 콜로니 수를 수치화하였다 (하단). PLRG1 발현 감소와 internal control beta-actin의 발현은 RT-PCR로 측정하였다.
도 3은 PLRG1 발현 억제에 의한 암 세포 특이적 세포 성장 억제를 확인한 것이다. (A) Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG1#1, si-PLRG#2)가 도입된 Huh7, HDF, IMR90, WI38 및 BJ 세포를 접종하고 5 일 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 (상단), OD 595 nm에서 발색 정도를 수치화하여 세포 성장을 비교하였다 (하단). control-siRNA를 처리한 세포와 PLRG1-siRNA를 처리한 세포의 성장 차이에 대한 통계적 유의성을 분석하였다 (Not significant, N.S. p>0.05; significant ***, p<0.001). (B) Huh7 세포에서 PLRG1 발현 감소에 의한 영향을 24 시간 간격으로 측정하여 세포 성장 곡선을 작성하였다. PLRG1, beta-actin의 발현은 RT-PCR로 측정하였다.
도 4는 PLRG1 발현 억제에 의한 암 특이적 세포 사멸(apoptosis)이 유도되는 것을 Annexin V 염색으로 확인한 것이다. (A) Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG#2)가 도입된 SNU475, Huh7, 및 BJ 세포를 각각 접종하고, 96 시간 배양한 후, Annexin V로 죽는 세포를 염색하였다. (B) Annexin V-양성 집단을 FACS로 측정하여 정량화하였다.
도 5는 PLRG1 발현 억제에 의한 암 특이적 세포 사멸 (apoptosis)을 Annexin-PI 염색 방법으로 확인한 것이다. Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG#2)가 도입된 BJ, HDF, WI38 정상 세포주와 SNU475, Huh7 암 세포주를 접종하고, 96 시간 배양하였다. Annexin V와 PI로 염색한 후 PI-양성, Annexin V-양성 및 PI-Annexin-이중 양성 집단을 FACS로 측정하였다.
도 6은 PLRG1 발현 억제가 중간엽 줄기세포 성장에 영향이 없음을 확인한 것이다. (A) Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG1#1, si-PLRG#2)가 도입된 중간엽 줄기세포를 접종하고 7 일간 배양한 세포의 사진이다. (B) 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 (상단), OD 595 nm에서 발색 정도를 측정하여 세포 성장률을 측정하였다. 세포 성장률은 control-siRNA를 처리한 세포의 염색 정도를 기준으로 계산하였다.
도 7은 텔로머라제 (telomerase) 발현이 유도된 정상 세포의 성장에 PLRG1 발현 억제의 영향이 없음을 확인한 것이다. (A) Control-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA (si-PLRG1#1, si-PLRG#2)가 도입된 BJ 및 BJ-T (텔로머라제-양성 BJ) 세포를 접종하고, 5 일간 배양한 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. (B) OD 595 nm에서 발색 정도를 측정하여 세포 성장률을 측정하였으며, 세포 성장률은 control-siRNA를 처리한 세포의 염색 정도를 기준으로 계산하였다. PLRG1, beta-actin의 발현은 RT-PCR로 측정하였다.
도 8a는 PLRG1에 대해 제작한 10 종의 siRNA의 대응 위치를 나타낸 것이다.
도 8b는 SNU475 세포에 대조군 siRNA (si-Con) 또는 PLRG1 siRNA (si-PLRG1#1 내지 siPLRG1#10)를 처리한 경우 PLRG1의 발현 및 콜로니 수를 확인한 것이다.
도 9는 다양한 암 세포주에서 PLRG1 억제에 따른 콜로니 수를 확인한 것이다. 대조군-siRNA (si-Con) 또는 PLRG1-siRNA를 다양한 암 세포에 형질전환시킨 후 콜로니 수를 확인하였다.
도 10은 IPTG-유도 (inducible) sh-PLRG1을 Huh7과 SNU475 세포주에 도입한 뒤 시스템을 확인한 것이다. (A) Human PLRG1 sh-RNA 타겟 염기서열 위치를 도식하였다. (B) PLRG1 sh-RNA 렌티바이러스에 의한 간암 및 정상세포주에서 감염과 이에 의한 암 세포 사멸을 현미경으로 관찰하였다. (C) PLRG1 sh-RNA 렌티바이러스 감염과, IPTG 발현억제 시스템에 의한 암 세포 사멸을 현미경으로 관찰하였다. (D) 암세포 사멸 중 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
도 11은 동물모델에서 PLRG1 억제 효과를 확인한 것이다. 좌측은 세포를 주입한 후 27 일째의 마우스 사진이고, 우측은 날짜별로 각 마우스에서 종양 크기를 표시한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "PLRG1 (pleiotropic regulator 1)"은 CDC5L (cell division cycle 5-like) 복합체의 일 구성 단백질로, 상기 CDC5L 복합체는 스플라이스좀 (spliceosome)의 일부로 pre-mRNA 스플라이싱에 역할을 한다. PLRG1은 얼터너티브 스플라이싱 (alternative splicing) 위치를 결정하는데 핵심적인 역할을 하며, 발생 단계와 관련하여 일부 보고가 있으나, PLRG1과 암과의 상관관계는 보고된 바 없다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 종양 조직 및 암 세포주에서 PLRG1의 발현이 정상 조직 및 정상 세포주에 비해 높게 발현되는 것을 최초로 확인함으로써 (도 1), PLRG1이 암 치료 타겟으로 적합함을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "PLRG1 억제제"는 PLRG1의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 PLRG1에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, PLRG1의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써, PLRG1의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.
상기 PLRG1의 억제제는 PLRG1을 표적으로 하여 PLRG1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 PLRG1 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로 PLRG1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 PLRG1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 PLRG1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA가 될 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 siRNA는 서열번호 11 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥인 것일 수 있고, 상기 shRNA는 서열번호 21 또는 22의 올리고 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 상기 PLRG1 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 PLRG1 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 예는 RNA 중합효소 I을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 디자인은 PLRG1의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "앱타머 (aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 PLRG1에 결합하여 PLRG1의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 PLRG1의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 PLRG1에 특이적으로 작용하여 PLRG1 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 PLRG1을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 PLRG1에 대한 siRNA는 서열번호 11 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 shRNA는 서열번호 21 또는 서열번호 22의 올리고 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬 (heavy chain)과 두 개의 경사슬 (light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 PLRG1과 결합하여 PLRG1의 활성을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 암은 PLRG1이 정상 조직보다 과발현된 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암의 예방 또는 치료는 암 세포 특이적 세포 사멸 (apoptosis)에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 상기 세포 사멸은 세포가 죽는 일 형태로서 물리적으로 세포가 파괴되는 세포 괴사 (necresis)와는 구별되는데, 예정세포사 (programmed cell death)로도 일컬어지며 DNA가 손상되거나 불필요하게 된 세포가 스스로 사멸하는 과정을 말한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 PLRG1에 대한 siRNA를 세포에 처리하여 PLRG1의 발현을 감소시킨 경우, 암 세포주에서는 단일 클론 성장이 감소하고 세포 증식이 억제되었으나, 정상 세포주에서는 세포 증식에 영향이 없는 것을 확인하였다 (도 3). 또한, PLRG1에 대한 siRNA를 처리한 세포에 대하여 Annexin V 단독 또는 Annexin V 및 PI로 염색하여 상기 결과는 PLRG1의 감소에 따라 암 세포 특이적으로 세포 사멸이 일어나기 때문임을 확인하였다 (도 4 및 5). 나아가, 이러한 PLRG1 감소로 인한 암 세포 특이적 효과는 정상 세포인 중간엽 줄기세포 및 텔로머라제 활성이 도입된 세포에서도 나타나지 않는 것을 확인함으로써 (도 6 및 7), PLRG1 억제는 상당히 엄격하게 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다. 나아가 IPTG-inducible-sh-PLRG1 시스템을 이용하여 상기 결과는 생체 내에서도 동일하게 나타나는 것임을 마우스 동물 모델에서 확인하였다 (도 11). 이는, PLRG1 억제제가 항암제로 사용될 경우 정상 세포에는 영향을 미치지 않고 부작용 없이 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 PLRG1을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 PLRG1을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 PLRG1 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 PLRG1 발현 수준이 정상 대조군의 PLRG1 발현 수준보다 높을 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명을 통해 암 마커 PLRG1을 검출함으로써 암 진단에 필요한 정보를 제공하여 암을 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단"은 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 PLRG1의 존재 또는 부재를 측정함으로써, 암 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 PLRG1이다.
본 발명에서 PLRG1 발현 수준을 측정하는 것은 PLRG1의 mRNA 발현 수준을 측정하거나 PLRG1 단백질 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 "mRNA 발현 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 "단백질 발현 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 PLRG1의 mRNA에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)일 수 있으며, 본 발명의 PLRG1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다. 다른 일 예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 항체일 수 있다.
본 발명에서는 PLRG1의 암 진단 마커로서의 가능성을 확인함으로써, PLRG1의 수준을 측정하여 간암을 비롯한 암을 진단할 수 있는 효과를 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 실험동물에서 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 PLRG1 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것 보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) PLRG1 (pleiotropic regulator 1)을 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 PLRG1 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
암을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 암의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 후보 물질은 공지된 물질 또는 신규 물질일 수 있으며, 예를 들어 식물 추출물 또는 케미컬 라이브러리 (chemical library)를 통하여 대규모로 스크리닝을 수행할 수 있다. 이를 통해 PLRG1의 발현 또는 활성을 억제하여 암 세포 특이적 세포 사멸을 유도할 수 있는 암의 예방 또는 치료용 제제를 발굴할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 유전자 서열을 기반으로 PLRG1의 전사 혹은 번역을 억제하거나, PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 항암 후보물질을 설계하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제 후보물질의 탐색 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이 본 발명에서는 PLRG1의 발현을 억제하면 암 세포 특이적으로 증식이 억제되고 세포사멸이 일어나는 것을 시험관 내 및 생체 내에서 다각도로 확인하였다. 즉, 본 발명에서는 PLRG1의 억제가 암 세포 특이적인 항암 효과를 가진다는 것을 최초로 규명하였다. 따라서, 당업자는 본 발명을 통해 PLRG1의 전사 혹은 번역을 억제하거나, PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 물질이 항암 활성을 가질 수 있음을 인지할 수 있다. 이에, 본 발명의 실시예에서 그 효과를 확인한 PLRG1에 대한 siRNA 및 shRNA는 단지 이러한 기술적 사상을 입증한 일 예시로 보아야 할 것이고, 당업자는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 PLRG1 유전자 서열 정보를 기반으로 하여 PLRG1의 발현 혹은 활성 등을 억제할 수 있는 암의 예방 또는 치료용 제제 후보물질을 설계할 수 있다. 이에 대한 구체적인 일 예로, PLRG1 유전자 서열을 기반으로 하여 이를 억제하는 siRNA 혹은 shRNA를 제작할 수 있고, 또는 PLRG1 유전자로부터 번역되는 단백질의 구조를 기반으로 하여 이를 억제할 수 있는 화합물을 컴퓨터 프로그램 등을 통해 예측할 수 있다. 상기 탐색 방법을 통해 선별된 후보 물질들은 시험관 내 혹은 생체 내 스크리닝을 통하여 유효 물질 선별에 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 프라이머 및 siRNA 서열
유전자의 발현을 측정하기 위하여 사용한 RT-PCR 및 real-time PCR 프라이머는 다음과 같다.
[RT-PCR]
PLRG1 forward primer: ACCGTCCAC AGCCTACAGCGA (서열번호 1)
PLRG1 reverse primer: ACTATCACGCCCCGCACAGT (서열번호 2)
GAPDH forward primer: GTCAGTGGTGGACCTGACCT (서엷번호 3)
GAPDH reverse primer: TGCTGTAGCCAAATTCGTTG (서열번호 4)
β-actin forward primer: GGACTTCGAGCAAGAGATGG (서열번호 5)
β-actin reverse primer: AGCACTGTGTTGGCGTACAG (서열번호 6)
[Real-time PCR]
PLRG1 forward primer: CTTAAAGAGAAGGGTCCTCAG (서열번호 7)
PLRG1 reverse primer: GGTCCTGGTGGGTATGGATGT (서열번호 8)
β-actin forward primer: GCACCACACCTTCTACAATGA (서열번호 9)
β-actin reverse primer: TAGCACAGCCTGGATAGCAAC (서열번호 10)
PLRG1발현을 억제하기 위하여 사용한 siRNA 및 shRNA는 다음과 같다.
siPLRG1#1 : uccggucauaaugcuauuauu (서열번호 11)
siPLRG1#2 : agccaugauacuacaauucga (서열번호 12)
siPLRG1#3 : cgaggagguacagaaacauucugua (서열번호 13)
siPLRG1#4 : aaagagaaggguccucagaaugcaa (서열번호 14)
siPLRG1#5 : cagaacuauaaagaucugggacuug (서열번호 15)
siPLRG1#6 : uccagucagcuggaaaccagaaauu (서열번호 16)
siPLRG1#7 : cccaugacauguuuguagcugauaa (서열번호 17)
siPLRG1#8 : ccaagaacucugcacugauggcuaa (서열번호 18)
siPLRG1#9 : accguggaaacucuacaggguuauc (서열번호 19)
siPLRG1#10 : aagcugauaaaaccauuaaaguaua (서열번호 20)
shPLRG1#1 : CCATGATACTACAATTCGATT (서열번호 21)
shPLRG1#2 : GACTTGGCTAGTGGCAAATTA (서열번호 22)
실시예 2. 암 세포, 정상세포 및 중간엽 줄기세포의 배양
ATCC에서 구입한 인간 간암 세포주인 Huh7과 SNU475 세포는 10 % FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 RPMI 배지로 배양하였다. 또 다른 인간 간암 세포주인 Hep3B와 HepG2 세포는 10 % FBS를 함유하는 MEM 배지로 배양하였다. 정상 세포인 HDF, IMR90, WI38, BJ 및 BJ-T 세포는 10 % FBS를 함유하는 DMEM 배지로 배양하였다. Lonza에서 구입한 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 MSCGM (human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKit™ Medium)으로 배양하였다.
실시예 3. RNA 분리 및 RT-PCR
Qiagen RNeasy Mini Kit를 이용하여 RNA를 추출하였고, RNA 농도는 ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc. Wilmington, DE, USA)를 이용하여 측정하였다. 그리고 iScript™ cDNA Synthesis Kit를 이용하여 (Biorad) cDNA (complementary DNA)를 합성하였고, Maxime PCR PreMix kit (Intron Biotechnology)를 이용하여 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 수행하였다.
실시예 4. 단백질 분리 및 웨스턴블랏 (western blot)
간암 환자 조직 및 그 주변 조직으로부터 용해 완충액 (lysis buffer)을 이용하여 단백질을 추출하였고, PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 항체 (SIGMA)와 GAPDH 항체 (Santacruz)를 사용하여 웨스턴블랏으로 단백질 발현양을 측정하였다. 각각의 세포주에 대하여도 상기와 동일한 방법으로 웨스턴블랏을 수행하였다. 대조군으로 β-actin 항체 (Santacruz)를 사용하였다.
실시예 5. PLRG1 억제제를 이용한 단일 클론 성장 (clonal growth) 억제 측정
본 발명자들은 PLRG1 발현을 억제하기 위한 억제제로서, 대표적으로 PLRG1에 대한 siRNA를 이용하였다. 이에 사용한 siPLRG1 #1 내지 siPLRG #10은 Qiagen에서 구입하였고, control-siRNA는 Mbiotech에서 구입하여 사용하였다. 각 세포를 60 mm 배양접시에 접종한 후 control-siRNA와 2 종류의 PLRG1-siRNA를 각각 도입하였다. 24 시간 후에 1,000 개의 세포를 계산하여 다시 접종하고, 10 일 경과 후 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 세포를 염색하였다. 염색된 콜로니를 계산하여 단일 클론 성장을 정량화하였다.
실시예 6. PLRG1 억제제를 이용한 세포성장 억제
각 세포를 24-웰 배양접시에 접종한 후 control-siRNA와 2 종류의 PLRG1-siRNA를 각각 도입하였다. 5 일 경과 후 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하고 빙초산으로 녹여내어 O.D 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 3 회 반복 실험하였다. Huh7 세포주는 24, 48, 72, 96, 120 시간째에 세포성장을 측정하였다.
실시예 7. PLRG1 억제제를 이용한 세포 사멸 (apoptosis) 유도
각 세포를 60 mm 배양접시에 접종한 후, control-siRNA와 PLRG1-siRNA를 각각 처리하였다. 72 시간 후, 세포를 모두 모아 Annexin V-FITC를 첨가하여 15 분간 염색시키고 유세포분석기를 이용하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
이중 염색의 경우, Annexin V-FITC와 PI (propidium iodide)를 동시에 첨가하여 15 분간 염색하고, 유세포분석기를 이용하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
실험예 1. 간암조직 및 간암 세포주의 PLRG1 ( pleiotropic regulator 1) 발현 수준 확인
비종양성 주변 간 조직과 간암 조직에 존재하는 PLRG1의 mRNA 양을 각각 RT-PCR 방법으로 측정한 결과, 비종양성 주변 간 조직과 비교하여 간암 조직에서 PLRG1의 mRNA가 과발현되어 있는 것을 확인하였다 (도 1). 웨스턴블랏 방법으로 단백질양을 측정한 결과에서도 간암 조직에서 PLRG1의 발현이 크게 증가되어 있었다 (도 1의 A).
세포주를 이용한 실험에서도 암 세포주의 PLRG1 발현양이 정상 세포주의 발현양보다 많음을 확인하였다 (도 1의 B).
실험예 2. 암 세포주에서 PLRG1 발현 억제에 의한 단일 클론 성장 (clonal growth) 억제 확인
상기 실험예 1의 결과로부터, PLRG1이 암 성장 등 암의 진행 (progression)에 역할을 할 것으로 추정되었으며, 이를 확인하기 위해 PLRG1 발현을 억제시켰을 때 암 세포의 단일 클론 성장에 미치는 영향을 측정하였다.
그 결과, PLRG1-siRNA를 암 세포주 SNU475에 처리하여 PLRG1 발현을 감소시키면 control-siRNA를 처리한 대조군과 비교하여 콜로니 형성이 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (도 2의 A). 이러한 PLRG1 발현 억제에 의한 암 세포의 콜로니 형성억제는 Hep3B, HepG2, Huh7 암 세포주에서도 마찬가지로 관찰되었다 (도 2의 B, C 및 D). 또한, PLRG1 발현 감소에 의한 단일 클론 성장 억제는 2 종류의 서로 다른 PLRG1-siRNA (#1, #2)를 이용한 실험에서 유사하게 관찰되었다. 상기 결과를 통해 PLRG1 발현 감소는 다양한 암 세포에서 단일 클론 성장을 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
실험예 3. 정상 세포주에서 PLRG1의 발현 억제 효과 확인
PLRG1 발현억제가 정상 세포주의 성장에도 영향을 미치는지 알기 위해, PLRG1-siRNA를 처리한 후 암 세포주와 정상 세포주의 성장을 측정, 비교하였다. 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염색 방법으로 세포 성장을 측정한 결과, 암 세포주인 Huh7의 경우, 콜로니 형성 실험에서 보여준 것과 같이, PLRG1 발현 억제에 의해 세포 성장이 이루어지지 않았고 (도 3의 A), 오히려 감소되었다 (도 3의 B). 그러나, 실험에 적용한 HDF, IMR90, WI38 및 BJ 정상 세포주의 경우, control-siRNA를 처리한 대조군과 비교하여 PLRG1 발현 억제에 의해 세포 성장 감소 현상이 관찰되지 않았다 (도 3의 A, p > 0.05). 상기 결과로부터, PLRG1 발현 감소에 의한 세포 성장 억제는 암 세포 특이적인 것임을 알 수 있다.
실험예 4. PLRG1 발현 억제에 의한 세포 사멸 (apoptosis) 확인
상기 실험예 2에서 확인한 PLRG1 발현억제에 의한 세포성장 억제가 세포 죽음 (cell death)과 관련 있는지 알기 위하여, 세포 사멸 마커 (apoptosis marker)인 Annexin-V에 염색된 세포를 측정하였다. Huh7과 SNU475 암 세포주의 경우, control-siRNA를 처리한 세포주와 비교하여 PLRG1-siRNA를 처리하였을 때 Annexin V 염색 강도가 크게 증가하였으나, 정상 세포주인 BJ 세포의 경우 대조군과 차이가 없었다 (도 4의 A 및 B).
보다 정확한 분석을 위하여, Annexin V와 PI를 이중염색하여 염색된 세포의 변화를 FACS로 분석하였다. 암 세포주인 SNU475, Huh7은 PLRG1-siRNA 처리에 의하여, PI와 Annexin V가 동시에 염색 (late apoptosis marker)된 세포의 수가 크게 증가하였으나, 정상 세포주인 BJ, HDF, 및 WI38에서는 변화가 거의 관찰되지 않았다 (도 5). 따라서, PLRG1 발현억제는 암 세포 특이적으로 후기 세포 사멸 (late apoptosis)을 유도하게 된다는 사실을 알 수 있었다.
실험예 5. 중간엽 줄기세포에서 PLRG1 억제의 효과 확인
PLRG1은 암 세포 또는 조직에서 과발현되어 있고, 발현을 억제하면 정상 세포에는 영향이 없으며 암 세포 특이적으로 사멸을 유도한다는 것을 통해, PLRG1이 암 세포에 특이적으로 필요한 성장 인자임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 보강하기 위하여, 세포분열이 빠른 중간엽 줄기세포를 이용하여 PLRG1의 영향을 측정하였다.
그 결과, 다른 정상 세포에서와 같이 중간엽 줄기세포에서도 PLRG1의 발현 감소에 의한 세포 성장 억제는 관찰되지 않았다 (도 6). 구체적으로, 현미경 관찰에 의한 세포 형태 (cell morphology) (도 6의 A) 뿐 아니라 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 세포성장 (도 6의 B) 실험에서도 PLRG1 발현 감소에 의한 변화가 관찰되지 않았다.
한편, 중간엽 줄기세포를 비롯한 줄기세포는 암 세포에서와 같이 텔로머라제 (telomerase)가 활성화되어 있다. 중간엽 줄기세포에서 PLRG1 발현 감소의 영향이 관찰되지 않았으므로, 이를 보다 명확히 하기 위해 텔로머라제의 과발현이 유도된 정상 세포를 이용하여 PLRG1 발현 감소의 영향을 측정하였다.
그 결과, 텔로머라제 발현이 없는 BJ 세포나 텔로머라제 발현이 유도된 BJ-T 세포 모두 PLRG1 발현 억제에 의하여 세포 성장이 영향을 받지 않는 것을 확인하였다 (도 7의 A 및 B). 이는, 텔로머라제가 발현에 관계 없이 암 세포가 아닌 정상 세포에서는 PLRG1 발현 억제에 의한 영향이 없다는 것을 의미한다.
실험예 6. 다양한 PLRG1-siRNA의 암세포 성장 억제 효과 확인
PLRG1 억제로 인한 항암효과를 더욱 명확히 확인하기 위해, 추가적으로 PLRG1 유전자를 표적으로 하는 siRNA 10 종을 서열을 달리하여 제작하였다 (도 8a). 그리고 각각의 siRNA를 Huh7과 SNU475에 형질전환시키고 세포 성장 및 PLRG1 발현에 미치는 영향을 측정하였다.
그 결과, 상기 두 세포주에서 10 종의 siRNA (siPLRG1#1 내지 siRLRG1#10)는 모두 PLRG1 발현을 억제하였고, 이에 따라 생존하는 콜로니 수도 크게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 8b). 따라서, PLRG1-siRNA 효능은 특정 염기서열를 타겟팅하는 siRNA에 국한 된 것이 아님을 알 수 있었다. 상기 결과는 PLRG1 유전자의 발현이 억제되기만 한다면 그 방법에 상관 없이 암 세포 특이적으로 세포 성장을 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 7. 다양한 암 세포주에서 PLRG1 억제 효과 확인
상기 PLRG1 억제에 의한 암 세포 사멸현상이 간암 등 특정 암에 국한된 것인지, 아니면 유래 조직에 상관 없이 모든 암 세포에 범용적으로 적용되는 현상인지 확인하기 위하여, 다양한 암 세포주를 이용하여 추가실험을 진행하였다.
그 결과, 실험에 사용하였던 폐암 세포 (A549, H460), 유방암 세포 (MDA231), 자궁경부암 세포 (Hela, SiHa), 골육종 (SaOS2, U2OS), 뇌암 세포 (LN229)와 대장암 세포 (HCT116, SW480) 모두에서 PLRG1의 발현을 억제하였을 때 생존하는 콜로니 수가 크게 감소하는 것을 확인하였다 (도 9). 따라서, PLRG1 발현 억제에 의한 암 세포 사멸은 특정 암에 국한된 것이 아니라 광범위하게 모든 암에 적용이 가능한 현상임을 알 수 있었다.
실험예 8. IPTG -유도 (inducible) sh - PLRG1 시스템 제작 및 이에 따른 암 세포 성장 억제 효과 확인
PLRG1 결핍에 의한 암세포 성장억제 현상을 좀 더 명확히 규명하기 위해, 본 발명자들은 IPTG-유도 (inducible) sh-PLRG1에 의한 PLRG1 발현조절 시스템을 제작하였다. 사람 PLRG1(NM_002669)에 대한 shRNA가 탑재되어있는 Constitutive 렌티벡터를 시그마에서 구입하였다 (도 10a). Constitutive 렌티벡터 시스템에서 검증된 shPLRG1#1와 shPLRG1#2 염기서열을 inducible 렌티벡터 시스템으로 도입하기 위해 올리고를 합성하였다. shPLRG1#1와 shPLRG1#2를 대상으로 프라이머를 annealing하였고, 이후 합성된 PCR 산물을 KpnI-EcoRI으로 잘라 LKO-3X Inducuble 벡터에 클로닝하였다. 올리고 시퀀스 정보는 아래와 같다.
shPLRG1#1-F (KpnI): CgaGgtaCCGGCCATGATACTACAATTCGATTCTCGAGAATCGAATTGTAGTATCATGGTTTTTagaattcCG (서열번호 23)
shPLRG1#1-R (EcoRI): CGgaattctAAAAACCATGATACTACAATTCGATTCTCGAGAATCGAATTGTAGTATCATGGCCGGtacCtcg (서열번호 24)
shPLRG1#2-F (KpnI): CgaGgtaCCGGGACTTGGCTAGTGGCAAATTACTCGAGTAATTTGCCACTAGCCAAGTCTTTTTTGaattcCG (서열번호 25)
shPLRG1#2-R (EcoRI): CGgaattCAAAAAAGACTTGGCTAGTGGCAAATTACTCGAGTAATTTGCCACTAGCCAAGTCCCGGtacCtcg (서열번호 26)
클로닝이 완성된 렌티벡터를 대상으로 바이러스를 합성한 후, 간암 세포주 Huh7, SNU475와 정상 세포주 BJ에 감염시켰다. 이후 7 일간 세포를 유지한 결과 정상세포는 세포 사멸에 영향을 받지 않는 반면, 간암 세포주는 sh-RNA 타겟 시퀀스 sh-PLRG1#1, sh-PLRG1#2에 의해 세포 사멸이 유도되었다 (도 10b). 2 종의 Inducible 렌티벡터 즉, sh-PLRG1#1, sh-PLRG1#2를 대상으로 바이러스를 합성한 후, 간암 세포주 Huh7, SNU475와 정상 세포주 BJ에 2일간 감염 한 후 5 일동안 puromycin으로 감염세포를 선별하였다. 이후 10 일간 1 mM IPTG 처리 하에 세포를 유지한 결과 정상세포는 세포 사멸에 영향을 받지 않는 반면, 간암 세포주는 sh-RNA 타겟 시퀀스 #1, #2 에 의해 세포 사멸이 유도됨을 확인할 수 있었다 (도 10c). sh-RNA 타겟 시퀀스 #1, #2에 의한 간암 세포주의 사멸을 또 다른 세트의 실험에서 확인하였으며, 이때 PLRG1 단백질 발현이 sh-대조군 시퀀스와 비교하여 크게 감소되어 있었다 (도 10d).
실험예 9. IPTG -유도 (inducible) sh - PLRG1 시스템을 이용한, 동물 모델에서 PLRG1 억제의 효과 확인
IPTG-inducible sh-PLRG1#1 또는 #2를 도입한 Huh7 세포 (각 3 x 106 개)를 각각 누드 마우스의 우측 대퇴부에 주입하고, sh-대조군 벡터를 도입한 Huh7 세포를 누드 마우스의 좌측 대퇴부에 주입하였다. 그 다음 상기 마우스들을 IPTG를 함유하거나 함유하지 않은 물을 공급하면서 27 일 동안 사육한 뒤, 각 마우스에서 종양 형성여부를 확인하였다.
그 결과, IPTG를 함유하고 있는 물을 먹이며 사육한 쥐의 경우, 주입한 Huh7 세포 (즉, sh-PLRG1#1 혹은 #2가 도입된 세포)의 종양형성이 이루어졌으나 일정기간 지난 후 성장감소와 더불어 결국엔 종양이 소멸되는 것을 확인하였다. 그러나 IPTG가 없는 물을 먹이며 사육한 쥐의 경우 종양조직의 크기가 지속적으로 커지는 것을 확인하였다. 또한, sh-대조군를 갖고 있는 Huh7 세포를 주입한 경우 IPTG 유무에 관련 없이 지속적인 성장이 이루어졌다 (도 11).
상기 결과를 종합하면, PLRG1 발현 억제는 중간엽 줄기세포 등 정상 세포에는 영향이 없으며, 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 이에, PLRG1 발현을 억제할 수 있는 제제를 이용하여 항암제로 사용할 수 있고, 또한 PLRG1 발현 수준을 측정함으로써 암 진단 및 항암제 스크리닝 등에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PLRG1 억제제는 PLRG1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 PLRG1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 PLRG1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 11 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어진 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 21 또는 22의 올리고 뉴클레오티드 서열을 가지는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암의 예방 또는 치료는 암 세포 특이적 세포 사멸 (apoptosis)에 의하여 달성되는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 뇌척수종양, 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암인 것인, 조성물.
  8. PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
  9. PLRG1 (pleiotropic regulator 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물.
  10. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 PLRG1 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 시료의 PLRG1 발현 수준이 정상 대조군의 PLRG1 발현 수준보다 높을 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 실험동물에서 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계;
    (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 대조군에서 측정된 PLRG1 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것 보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  12. (a) PLRG1 (pleiotropic regulator 1)을 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 PLRG1 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 PLRG1 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 암을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  13. PLRG1 (pleiotropic regulator 1) 유전자 서열을 기반으로 PLRG1의 전사 혹은 번역을 억제하거나, PLRG1 단백질의 활성을 억제하는 항암 후보물질을 설계하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 제제 후보물질의 탐색 방법.
PCT/KR2016/011272 2015-10-08 2016-10-07 Plrg1 (pleiotropic regulator 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2017061828A1 (ko)

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