WO2024071336A1 - 免疫賦活活性を有する酸性菌体外多糖 - Google Patents
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- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
Definitions
- the present invention relates to an acidic bacterial exopolysaccharide that has immunostimulatory activity.
- EPS exopolysaccharides
- yogurt which is produced by fermenting milk using the lactic acid bacteria Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
- EPS has attracted attention due to its various physiologically active functions, including immunostimulatory activity.
- the EPS produced by the Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 strain has a repeating structure in which a large number of repeating units consisting of a main chain consisting of two glucose residues and two galactose residues and a side chain consisting of one galactose residue are linked together, and that there are acidic polysaccharides with phosphate groups added to the structure and neutral polysaccharides with no phosphate groups added (Non-Patent Documents 1 and 2). Furthermore, such acidic EPS produced by the OLL1073R-1 strain is also known to have an immunostimulatory effect (Non-Patent Documents 1 and 2).
- the present invention aims to further provide polysaccharides that have immunostimulatory activity.
- the present invention includes the following aspects.
- [4] The acidic exopolysaccharide according to any one of [1] to [3] above, which is derived from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 strain (accession number FERM BP-10741).
- An immunostimulating composition comprising the acidic bacterial exopolysaccharide according to any one of [1] to [4] above as an active ingredient.
- a food or medicine for immunostimulation comprising the acidic bacterial exopolysaccharide according to any one of [1] to [4] above as an active ingredient.
- a method for immunostimulation comprising having a subject ingest or administer to the subject the acidic bacterial exopolysaccharide described in any one of [1] to [4] above, the composition for immunostimulation described in [5] above, or the food or pharmaceutical for immunostimulation described in [6] above.
- the present invention provides a new EPS with immunostimulatory activity.
- FIG. 1 shows the spectrum of the acidic EPS obtained in Example 1, obtained by the [ 1 H- 13 C]-HSQC method.
- FIG. 2 shows the spectrum of the acidic EPS obtained in Example 1, obtained by the [ 1 H, 1 H]-NOESY method.
- FIG. 3 is a diagram showing the repeating structure of the acidic EPS obtained in Example 1.
- 4 is a graph showing the results of induction of IFN- ⁇ production from spleen cells by stimulation with acidic EPS obtained in Example 1. In the figure, "*" indicates that a statistically significant difference was observed.
- the present invention relates to an acidic bacterial exopolysaccharide (EPS) having immunostimulatory activity and its immunostimulatory uses.
- EPS acidic bacterial exopolysaccharide
- the acidic EPS of the present invention is a polysaccharide having a repeating structure (sugar chain) in which repeating units (repeating units) consisting of a main chain of three galactose residues and a side chain of two galactose residues are linked together, and in which at least one glycerol phosphate group is added to the repeating structure.
- repeating units linked together means that the repeating units are arranged in tandem.
- the acidic EPS of the present invention is an acidic bacterial exopolysaccharide having a repeating structure in which repeating units (repeating units; see also Figure 3) represented by the following formula (I) are linked together.
- n represents an integer of 0 or 1, independently for each repeating unit. That is, each repeating unit represented by formula (I) constituting the acidic EPS of the present invention may or may not have one glycerol 3-phosphate group, but the acidic EPS as a whole has at least one glycerol 3-phosphate group added.
- the acidic EPS of the present invention may be an acidic bacterial exopolysaccharide having a repeating structure represented by the following formula (II), in which the repeating units represented by formula (I) are linked together.
- n is an integer of 0 or 1 for each repeating unit.
- m is an integer of 1 to 300, preferably an integer of 1 to 200.
- ⁇ -D-Galp represents a pyranose-type ⁇ -D-galactose residue
- ⁇ -D-Galp represents a pyranose-type ⁇ -D-galactose residue
- ⁇ -D-Galf represents a furanose-type ⁇ -D-galactose residue
- Gro3P represents a glycerol 3-phosphate group.
- (1-2), (1-3), (1-5), and (1-6) represent the 1-2 bond (i.e., carbon-carbon bond at position 1-carbon-carbon bond), 1-3 bond, 1-5 bond, and 1-6 bond, respectively, between residues.
- the repeating structure e.g., formula (II) in which the repeating units represented by formula (I) are linked together
- the acidic EPS of the present invention preferably has the above repeating structure as the basic skeleton.
- "having a repeating structure as the basic skeleton” means that the entire length or almost the entire length of the acidic EPS (80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or 98% or more of the total number of sugar residues constituting the main chain of the acidic EPS) is composed of a repeating structure in which the repeating units represented by formula (I) are linked together.
- the acidic EPS of the present invention may be composed only of the above repeating structure.
- the acidic EPS of the present invention may be derived from a microorganism (typically, a bacterium) such as a lactic acid bacterium.
- the acidic EPS of the present invention may be produced by a microorganism (typically, a bacterium) such as a lactic acid bacterium and secreted outside the cell.
- the acidic EPS of the present invention may be obtained from a microbial culture or may be obtained from a lactic acid bacteria culture, for example, may be recovered or purified from a lactic acid bacteria culture.
- the acidic EPS of the present invention may be isolated, for example, may be isolated from a lactic acid bacteria culture. "Isolated" with respect to the acidic EPS of the present invention means that the purity of the acidic EPS of the present invention is 80% by mass or more, preferably 90% by mass or more, and more preferably 98% by mass or more.
- lactic acid bacteria examples include, but are not limited to, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, and Pediococcus.
- Examples of lactic acid bacteria include, but are not limited to, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp.
- Lactobacillus casei Lactobacillus casei
- Lactobacillus gasseri Lactobacillus gasseri
- Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum
- Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus
- Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus
- Lactobacillus plantarum Lactobacillus plan thallum
- Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus pentosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus sake, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis ssp.
- lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Lactococcus lactis ssp. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, and Pediococcus pentosaceus.
- a more preferred example of the lactic acid bacteria used to produce the acidic EPS of the present invention is Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, and a particularly preferred example of the lactic acid bacteria is Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1073R-1.
- Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 strain was deposited internationally under the Budapest Treaty on February 22, 1999 (the date of original deposit) at the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Organism Depositary (NITE-IPOD [formerly National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary]) (Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan) under the deposit number FERM BP-10741.
- This deposited strain was transferred from domestic deposit (original deposit) to international deposit under the Budapest Treaty on November 29, 2006.
- the current depositor of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 strain is Meiji Co., Ltd. Meiji Co., Ltd. has granted Meiji Holdings Co., Ltd. the authority to refer to the OLL1073R-1 strain in this application.
- the acidic EPS of the present invention can be obtained from a lactic acid bacteria culture containing one or more of the above-mentioned lactic acid bacteria.
- the lactic acid bacteria culture may be, but is not limited to, fermented milk such as yogurt produced using lactic acid bacteria, or may be obtained by culturing lactic acid bacteria in a medium (such as a milk-containing medium).
- the "milk” that can be used to prepare the lactic acid bacteria culture is preferably milk from a mammal (e.g., cow, goat, sheep, etc.).
- the lactic acid bacteria culture may contain Lactobacillus bacteria as lactic acid bacteria, for example, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
- the lactic acid bacteria culture may contain a combination of Lactobacillus and Streptococcus as lactic acid bacteria, and in a preferred embodiment, the lactic acid bacteria culture may contain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
- the acidic EPS of the present invention may be derived from lactic acid bacteria, for example, from the genus Lactobacillus and/or the genus Streptococcus, and is preferably derived from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, and more preferably from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1073R-1.
- the culture conditions used to produce the acidic EPS of the present invention by lactic acid bacteria may be, for example, the same as those in the Examples described below, but are not limited thereto.
- Such culture conditions may include, for example, culture in a milk-containing medium such as a skim milk medium at 35 to 39°C (typically 37°C) for 12 to 24 hours (for example, 18 hours).
- the acidic EPS of the present invention from a lactic acid bacteria culture
- known polysaccharide isolation and purification techniques can be used.
- the EPS in the lactic acid bacteria culture can be separated from proteins and lactic acid bacteria by trichloroacetic acid treatment or the like, recovered, and then dialyzed, after which the acidic EPS fraction can be separated using a fractionation technique such as anion exchange chromatography.
- the remaining proteins in the separated acidic EPS fraction can be removed using a proteolytic enzyme or the like, and the acidic EPS of the present invention can be obtained by further purifying the fraction.
- the method for isolating and purifying the acidic EPS of the present invention is not limited to this method.
- the acidic EPS of the present invention may be chemically synthesized using a glycan chemical synthesis method.
- a chemically synthesized acidic EPS of the present invention may also be included in the scope of the "isolated" acidic EPS of the present invention.
- the acidic EPS of the present invention has immunostimulating activity (immunostimulating effect).
- the acidic EPS of the present invention having immunostimulating activity can preferably promote the production of interferon (IFN)- ⁇ .
- IFN- ⁇ is produced mainly by immune cells such as T cells and natural killer (NK) cells, and is known to contribute to antiviral activity, immunomodulatory activity, and antitumor activity, and also to function as a powerful activator of macrophages.
- the immunostimulatory activity of the acidic EPS of the present invention can be evaluated using the amount of IFN- ⁇ produced as an index.
- the immunostimulatory activity of the acidic EPS of the present invention can be evaluated, for example, by using the same test method as in Example 3 described below. Specifically, mouse spleen cells are first suspended in a mammalian cell culture medium (e.g., RPMI 1640 medium) containing fetal bovine serum (e.g., 10% (vol/vol) fetal bovine serum), and then seeded on a plate or the like at an appropriate cell density (e.g., 5 x 105 cells/well).
- a mammalian cell culture medium e.g., RPMI 1640 medium
- fetal bovine serum e.g., 10% (vol/vol) fetal bovine serum
- Acidic EPS is added to the seeded cells at a predetermined concentration (e.g., 25 to 200 ⁇ g/mL final concentration), and the cells are cultured at 37°C under 5% CO2 for a certain period of time (e.g., 72 hours), after which the supernatant is recovered from the medium, and the amount of IFN- ⁇ contained in the recovered supernatant is quantified by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) using an anti-IFN- ⁇ antibody.
- a predetermined concentration e.g., 25 to 200 ⁇ g/mL final concentration
- a certain period of time e.g., 72 hours
- mouse spleen cells are similarly cultured without the addition of acidic EPS, and the amount of IFN- ⁇ in the supernatant is quantified and compared with the amount of IFN- ⁇ quantified as described above in the culture system to which acidic EPS is added. If the amount of IFN- ⁇ in the supernatant increases statistically significantly when acidic EPS is added compared to the control to which acidic EPS is not added, or if the amount of IFN- ⁇ in the supernatant increases in a concentration-dependent manner with an increase in the amount of acidic EPS added, it can be determined that the acidic EPS of the present invention has immunostimulatory activity.
- the strength (level) of the immunostimulatory activity of the acidic EPS of the present invention can be evaluated based on the increase in the amount of IFN- ⁇ in the supernatant when acidic EPS is added compared to the control to which acidic EPS is not added.
- the present invention also provides a composition comprising the acidic EPS of the present invention, and a food or medicine comprising the acidic EPS of the present invention.
- the composition, food or medicine comprising the acidic EPS of the present invention preferably has immunostimulating activity, and is preferably immunostimulating.
- the acidic EPS of the present invention may be contained in the composition for immunostimulation and the food or medicine for immunostimulation as an active ingredient (active ingredient for bringing about immunostimulating activity).
- the acidic EPS of the present invention may be contained in the composition for immunostimulation and the food or medicine for immunostimulation as the only active ingredient for immunostimulation and/or as the only EPS.
- containing the acidic EPS of the present invention as an active ingredient means that the acidic EPS of the present invention is contained in the composition, food or medicine in an amount (effective amount) and form sufficient to exert immunostimulating activity when the composition, food or medicine comprising the acidic EPS of the present invention is applied to a subject.
- the composition, food or medicine comprising the acidic EPS of the present invention may contain the acidic EPS of the present invention in an amount of, for example, 10 ⁇ g to 50 mg/kg body weight per application (ingestion or administration), but is not limited to this range.
- a composition, food, or medicine containing the acidic EPS of the present invention may not contain a neutral EPS (e.g., one derived from lactic acid bacteria such as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, including the OLL1073R-1 strain).
- a composition, food, or medicine containing the acidic EPS of the present invention may not contain an acidic EPS (e.g., one derived from lactic acid bacteria such as Lactobacillus delbrueckii subsp.
- bulgaricus including the OLL1073R-1 strain
- composition, food or medicine of the present invention may contain, in addition to the acidic EPS of the present invention, additives acceptable for food processing (food additives) or pharma- ceutical additives (pharmaceutical additives).
- additives include, but are not limited to, carriers, excipients, binders, lubricants, disintegrants, humectants, stabilizers, buffers, flavorings, preservatives, colorants, and the like.
- the composition (e.g., immunostimulating composition) containing the acidic EPS of the present invention may be, but is not limited to, a food composition or a pharmaceutical composition.
- the composition, food or medicine of the present invention may further contain other pharmacological and/or functional ingredients.
- “food” may be a beverage or other food, but is preferably a processed food.
- beverages include, but are not limited to, lactic acid bacteria beverages, milk beverages (coffee milk, fruit milk, etc.), tea beverages (green tea, black tea, oolong tea, etc.), fruit and vegetable beverages (beverages containing fruit juices such as orange, apple, grape, etc., and vegetable juices such as tomato and carrot), alcoholic beverages (beer, sparkling wine, wine, etc.), carbonated beverages, soft drinks, water-based beverages, etc.
- foods other than beverages include, but are not limited to, fermented milk such as yogurt, processed foods such as confectionery, jam, prepared foods, instant foods, and seasonings. For information on the manufacturing methods of various foods, existing reference books on food manufacturing can be consulted.
- the food of the present invention may be a functional food or a different food.
- “functional food” means a food that has a certain functionality for the living body, and includes so-called health foods in general, such as health functional foods including foods for specified health uses (including conditional FOSHU [foods for specified health uses]) and nutrient functional foods in Japan, functional food, foods with functional claims, foods for special dietary uses, dietary supplements, health supplements, supplements (for example, tablets, coated tablets, sugar-coated tablets, capsules, liquids, and other dosage forms), and beauty foods (for example, diet foods).
- the functional food of the present invention also includes health foods to which a health claim based on the food standards of Codex (Joint FAO/WHO Commission on Food Standards) is applied.
- the functional food of the present invention may be a food for special purposes such as food for sick people, powdered milk for pregnant women and lactating women, infant formula, food for the elderly, and food for nursing care.
- the functional food of the present invention may be in the form of a solid preparation such as a tablet, granule, powder, pill, or capsule; a liquid preparation such as a liquid, suspension, or syrup; or a gel or paste; or may be in the form of a normal food product (e.g., a beverage, yogurt, or confectionery).
- a solid preparation such as a tablet, granule, powder, pill, or capsule
- a liquid preparation such as a liquid, suspension, or syrup
- a gel or paste or may be in the form of a normal food product (e.g., a beverage, yogurt, or confectionery).
- the food of the present invention may contain any food ingredient in addition to the acidic EPS of the present invention, and is not particularly limited.
- the food of the present invention may contain water, protein, carbohydrate, lipid, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, fruit juice, flavors, etc.
- proteins include animal and vegetable proteins such as whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, lactoferrin, soy protein, chicken egg protein, and meat protein, as well as hydrolysates thereof, butter, whey minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phospholipids, and various milk-derived components such as lactose.
- carbohydrates include general sugars, modified starches (dextrin, soluble starch, British starch, oxidized starch, starch esters, starch ethers, etc.), and dietary fibers.
- lipids include animal fats and oils such as lard, fish oil, and their fractionated oils, hydrogenated oils, and transesterified oils; vegetable fats and oils such as palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, and their fractionated oils, hydrogenated oils, and transesterified oils.
- vitamins include vitamin A, carotenes, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline, and folic acid
- minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, selenium, and whey minerals.
- organic acids include malic acid, citric acid, lactic acid, and tartaric acid. These components can be used alone or in combination of two or more, and synthetic products and/or foodstuffs containing a large amount of these may be used as raw materials.
- the food of the present invention can be produced by a conventional method, for example, by adding the acidic EPS of the present invention or a raw material containing the acidic EPS of the present invention to other food ingredients at any step in the food production process.
- the pharmaceutical of the present invention may be in any dosage form, such as solid preparations such as tablets, granules, powders, pills, and capsules, gels, or liquid preparations such as solutions, suspensions, and syrups.
- the pharmaceutical of the present invention is preferably, but is not limited to, a pharmaceutical for oral administration.
- composition, food, or medicine of the present invention can provide an immunostimulatory effect based on the immunostimulatory activity (immunostimulatory effect) of the acidic EPS of the present invention.
- the composition, food, or medicine of the present invention can promote the production of interferon (IFN)- ⁇ .
- IFN interferon
- the composition, food, or medicine of the present invention can promote (stimulate) the immune response in a subject who has ingested or administered it.
- the present invention also provides a method for producing an immunostimulatory effect in a subject (immunostimulatory method), which comprises having the subject ingest or administer the acidic EPS of the present invention, or a composition, food, or medicine of the present invention containing the same.
- the subject to which the acidic EPS of the present invention or the composition, food, or medicine of the present invention containing the same is ingested or administered is preferably a mammal, including primates such as humans, livestock, pets, experimental (test) animals, etc., and more preferably a human.
- Such subjects may be subjects requiring immunostimulation or subjects for which immunostimulation is desired, but are not limited to the following, and examples include pregnant women, infants, elderly people, sick people, people recovering from illness, weak people, subjects with weakened immune systems, athletes, and subjects in need of prevention of infection or other diseases (e.g., medical workers, caregivers, exam candidates, etc.).
- the ingestion or administration to a subject of the acidic EPS of the present invention, or the composition, food, or medicine of the present invention containing the same is preferably oral, but may also be by tube-based ingestion or administration, such as a nasal tube, oral esophageal tube, gastrostomy tube, or enterostomy tube.
- tube-based ingestion or administration such as a nasal tube, oral esophageal tube, gastrostomy tube, or enterostomy tube.
- the route of administration to a subject in the present invention is not limited to these.
- the intake or administration amount of the acidic EPS of the present invention, or the composition, food, or medicine of the present invention containing the same may be any amount effective for immunostimulation, and may be varied over a wide range at the discretion of a person skilled in the art, taking into consideration the subject's species, age, body weight, administration route, number of administrations, etc.
- the intake or administration amount may be an amount of 10 ⁇ g to 50 mg/kg body weight of the acidic EPS of the present invention per application (ingestion or administration) based on the subject's body weight, but is not limited to this range.
- the ingestion or administration of the acidic EPS of the present invention, or the composition, food, or medicine of the present invention containing the same may be performed only once (once), or may be performed multiple times.
- the acidic EPS of the present invention, or the composition, food, or medicine of the present invention containing the same may be continuously ingested or administered to a subject, may be ingested or administered daily, or may be ingested or administered, for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 6 days per week.
- the present invention also relates to the acidic EPS of the present invention for use in immunostimulation (promoting immune response).
- the present invention also relates to the use of the acidic EPS of the present invention for immunostimulation (promoting immune response).
- the present invention also relates to the use of the acidic EPS of the present invention in the manufacture of a composition, food or medicine for immunostimulation (promoting immune response).
- Example 1 Production and purification of acidic EPS Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 strain (accession number FERM BP-10741) was cultured in a 10% (wt/vol) skim milk medium at 37 ° C. for 18 hours. Trichloroacetic acid was added to the resulting culture to a final concentration of 10% by mass, and the resulting denatured protein and lactic acid bacteria were precipitated, followed by centrifugation (12,000 ⁇ g, 20 minutes). The resulting supernatant was collected, and 3 times the amount of cold ethanol was added and allowed to stand overnight at 4 ° C.
- acidic EPS was fractionated.
- DEAE- Sepharose® Diethylaminoethyl- Sepharose®
- Fast Flow an anion exchange carrier
- a concentration gradient extraction method with 0-0.5M NaCl was used under 0.02M Tris-HCl buffer (pH 8.6).
- the obtained acidic EPS was dissolved in 0.05M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1mM MgCl 2 , and treated with 2mg/mL DNase and 2mg/mL RNase at 37°C for 6 hours.
- a proteinase K solution was added at a final concentration of 0.1mg/mL, and the mixture was treated at 37°C for 16 hours to decompose the protein, and the enzyme was further inactivated by heating at 90°C for 10 minutes.
- To the resulting reaction solution three times the amount of cold ethanol was added as described above, and the mixture was allowed to stand overnight at 4°C.
- the resulting precipitate was recovered by centrifugation (12,000 x g, 20 minutes), and the acidic EPS was purified by repeatedly dialyzing it against distilled water using the above-mentioned dialysis membrane, thereby preparing an acidic EPS solution.
- Example 2 Structural analysis of acidic EPS
- the purified acidic EPS was subjected to structural analysis by two-dimensional NMR.
- the two-dimensional NMR used in the analysis is a nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy that enables structural analysis of complex compounds by clarifying the correlation between signals.
- NMR nuclear magnetic resonance
- the two-dimensional NMR methods used in the analysis include the [ 1 H, 1 H]-COSY method ( 1 H, 1 H-correlation spectroscopy), the TOCSY method (total correlation spectroscopy), the [ 1 H- 13 C]-high-resolution two-dimensional NMR method ([ 1 H- 13 C]-heteronuclear multiple quantum correlation: [ 1 H- 13 C]-HSQC), and the [ 1 H, 1 H]-NOESY method ([ 1 H, 1 H]-nuclear overhauser enhancement spectroscopy).
- the structure of acidic EPS was predicted using the [ 1 H, 1 H]-COSY method. This is because the signals of each proton are influenced by two substituents attached to the same carbon atom (geminal position) or two substituents attached to adjacent carbon atoms (vicinal position), and are assigned to the 1 H chemical shifts of most anomeric sugars. Furthermore, since the signals of oligosaccharides and polysaccharides overlap in a complex manner, the data obtained by the [ 1 H, 1 H]-COSY method was supplemented by the TOCSY method, which can extract correlation peaks of all protons belonging to a specific spin system from the signals.
- the [ 1 H- 13 C]-HSQC method which can detect correlations between two different types of nuclei such as hydrogen atoms and carbon atoms, was used to analyze which hydrogen atoms are directly bonded to which carbon atoms.
- the [ 1 H, 1 H]-NOESY method which observes signals between protons that are spatially close to each other, was used to determine which signals are derived from protons that are close to each other.
- the acidic EPS obtained has a repeating structure consisting of a series of repeating units consisting mainly of galactose residues (three furanose-type galactose residues and two pyranose-type galactose residues). Furthermore, it was shown that in many of the repeating units in this repeating structure, one glycerol phosphate group is bound to each repeating unit, forming an anchor to the bacterial cell wall.
- the obtained acidic EPS was permethylated, depolymerized, and acetylated, and the obtained methylated alditol acetate was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), to determine the repeating structure of the acidic EPS as shown in Figure 3.
- GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
- A, B, C, D, and E/F are symbols given for convenience to indicate the respective sugar residues shown in the spectra of Figures 1 and 2.
- Galp represents a pyranose-type galactose residue
- Galf represents a furanose-type galactose residue
- Gro3p represents a glycerol 3-phosphate group.
- Example 3 Evaluation of immunostimulatory activity of acidic EPS
- Mouse spleen cells were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% (vol/vol) fetal bovine serum, and then seeded on a 96-well plate at a density of 5 x 105 cells/well.
- a solution of acidic EPS purified in Example 1 and structure determined in Example 2 was added to the seeded cells at a final EPS concentration of 25 ⁇ g/mL, 50 ⁇ g/mL, 100 ⁇ g/mL, or 200 ⁇ g/mL, and the cells were cultured at 37°C under 5% CO2 for 72 hours (acidic EPS-stimulated group).
- mouse spleen cells were similarly cultured without the addition of acidic EPS (unstimulated group). After the culture, the supernatant was collected, and the amount of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) produced in the medium was quantified by ELISA.
- IFN- ⁇ interferon- ⁇
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Abstract
本発明は、以下の式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有する菌体外多糖、及びその免疫賦活用途に関する。（式（Ｉ）中、ｎは、繰り返し単位毎に独立して０又は１の整数を表す）
Description
本発明は、免疫賦活活性を有する酸性菌体外多糖に関する。
乳酸菌をはじめとする様々な微生物が、菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＥＰＳ）を産生し、細胞外に分泌していることが知られている。乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ストレプトコッカス・サーモフィルス）を利用して乳を発酵することで製造されるヨーグルトをはじめとする発酵乳中にも、ＥＰＳが含まれている。近年、ＥＰＳは、免疫賦活機能などの様々な生理活性機能を有していることで注目を集めている。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株が産生するＥＰＳは、２つのグルコース残基と２つのガラクトース残基からなる主鎖及び１つのガラクトース残基からなる側鎖から構成される繰り返し単位（リピーティングユニット）が多数連なった繰り返し構造を有すること、その構造にリン酸基が付加した酸性多糖と、リン酸基が付加していない中性多糖が存在することが知られている（非特許文献１及び２）。さらに、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株が産生するそのような酸性ＥＰＳは、免疫賦活作用を有することも知られている（非特許文献１及び２）。
一方で、免疫賦活作用を有する新たなＥＰＳの取得がさらに望まれている。
Ｍａｒｉｅ－Ｒｏｓｅ Ｖａｎ Ｃａｌｓｔｅｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１３（２０１５）１１５－１２２
牧野聖也、Ｍｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．２（２００９）
本発明は、免疫賦活活性を有する多糖をさらに提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株の培養物から、糖残基がガラクトース残基のみで構成された繰り返し単位が連なる（反復した）新たな繰り返し構造を有する、免疫賦活活性を有する菌体外多糖（ＥＰＳ）を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
［１］ 以下の式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有する酸性菌体外多糖。
（式（Ｉ）中、ｎは、繰り返し単位毎に独立して０又は１の整数を表す）
［２］ 単離された、上記［１］に記載の酸性菌体外多糖。
［３］ ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含む乳酸菌培養物から単離された、上記［１］又は［２］に記載の酸性菌体外多糖。
［４］ ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１）由来である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖。
［５］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用組成物。
［６］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用の食品又は医薬品。
［７］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖、上記［５］に記載の免疫賦活用組成物、又は上記［６］に記載の免疫賦活用の食品又は医薬品を、対象に摂取させるか又は投与することを含む、免疫賦活方法。
［８］ 免疫賦活用の組成物、食品若しくは医薬品の製造における、上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖の使用。
［１］ 以下の式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有する酸性菌体外多糖。
［２］ 単離された、上記［１］に記載の酸性菌体外多糖。
［３］ ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含む乳酸菌培養物から単離された、上記［１］又は［２］に記載の酸性菌体外多糖。
［４］ ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１）由来である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖。
［５］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用組成物。
［６］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用の食品又は医薬品。
［７］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖、上記［５］に記載の免疫賦活用組成物、又は上記［６］に記載の免疫賦活用の食品又は医薬品を、対象に摂取させるか又は投与することを含む、免疫賦活方法。
［８］ 免疫賦活用の組成物、食品若しくは医薬品の製造における、上記［１］～［４］のいずれかに記載の酸性菌体外多糖の使用。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２２－１５５７０８号の開示内容を包含する。
本発明によれば、免疫賦活活性を有するＥＰＳを新たに提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、免疫賦活作用を有する酸性菌体外多糖（ＥＰＳ）、及びその免疫賦活用途に関する。
本発明の酸性ＥＰＳは、３つのガラクトース残基からなる主鎖と２つのガラクトース残基からなる側鎖から構成される繰り返し単位（リピーティングユニット）が連なった繰り返し構造（糖鎖）を有しており、かつ、その繰り返し構造に少なくとも１つのグリセロールリン酸基が付加されている多糖である。本発明において、「繰り返し単位が連なった」とは、繰り返し単位がタンデムに反復して配置されていることを意味する。
より具体的には、本発明の酸性ＥＰＳは、以下の式（Ｉ）で表される繰り返し単位（リピーティングユニット；図３も参照されたい）が連なった繰り返し構造を有する酸性菌体外多糖である。
式（Ｉ）中、ｎは、繰り返し単位毎に独立して０又は１の整数を表す。すなわち、本発明の酸性ＥＰＳを構成する式（Ｉ）で表される個々の繰り返し単位では、グリセロール３－リン酸基を１つ有するか又は有しないが、酸性ＥＰＳ全体としてはグリセロール３－リン酸基が少なくとも１つ付加されている。
本発明の酸性ＥＰＳは、式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった、以下の式（ＩＩ）で表される繰り返し構造を有する酸性菌体外多糖であり得る。
式（ＩＩ）中、ｎは、繰り返し単位毎に独立して０又は１の整数を表す。式（ＩＩ）中、ｍは１～３００の整数、好ましくは１～２００の整数を表す。
式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、α－Ｄ－Ｇａｌｐは、ピラノース型のα－Ｄ－ガラクトース残基を表し、β－Ｄ－Ｇａｌｐは、ピラノース型のβ－Ｄ－ガラクトース残基を表し、β－Ｄ－Ｇａｌｆは、フラノース型のβ－Ｄ－ガラクトース残基を表し、Ｇｒｏ３Ｐはグリセロール３－リン酸基を表す。式（Ｉ）及び（ＩＩ）中の（１－２）、（１－３）、（１－５）、及び（１－６）は、それぞれ、残基間の１－２結合（すなわち、１位炭素－２位炭素結合）、１－３結合、１－５結合、及び１－６結合を表す。
本発明の酸性ＥＰＳについては、式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造（例えば、式（ＩＩ））において、繰り返し単位１個当たり平均約１個（例えば、各繰り返し単位に対し１個（ｎ＝１）又は０個であり、かつ、酸性ＥＰＳ全体での加重平均で繰り返し単位１個当たり約１個）のグリセロール３－リン酸基が付加されていることが好ましいが、それに限定されない。
本発明の酸性ＥＰＳは、好ましくは、上記の繰り返し構造を基本骨格として有する。本発明において、「繰り返し構造を基本骨格として有する」とは、酸性ＥＰＳの全長又はほぼ全長（酸性ＥＰＳの主鎖を構成する糖残基の合計個数の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％又は９８％以上）が、式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造で構成されていることを意味する。一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、上記の繰り返し構造のみからなるものであってもよい。
本発明の酸性ＥＰＳは、乳酸菌をはじめとする微生物（典型的には、細菌）に由来するものであり得る。本発明の酸性ＥＰＳは、乳酸菌をはじめとする微生物（典型的には、細菌）により産生されて細胞外に分泌されるものであり得る。
一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、微生物培養物から取得されたものであってよく、乳酸菌培養物から取得されたものであってよく、例えば、乳酸菌培養物から回収又は精製されたものであってよい。一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、単離されたものであってよく、例えば、乳酸菌培養物から単離されたものであってよい。本発明の酸性ＥＰＳに関して「単離された」とは、本発明の酸性ＥＰＳの純度が８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９８質量％以上であることを意味する。
乳酸菌の例としては、以下に限定されないが、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）属菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属菌、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス）属菌、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）属菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス）属菌、及びＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ（ペディオコッカス）属菌などが挙げられる。乳酸菌の例としては、以下に限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（ラクトバチルス・ガセリ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ラクトバチルス・ファーメンタム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（ラクトバチルス・ヘルベティクス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ラクトバチルス・アシドフィルス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタラム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノーサス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ペントーサス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ（ラクトバチルス・サケ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ストレプトコッカス・サーモフィルス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（ロイコノストック・メセンテロイデス）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（エンテロコッカス・フェカーリス）、及びＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（ペディオコッカス・ペントサセウス）などが挙げられる。
本発明の酸性ＥＰＳを産生するために使用される、より好ましい乳酸菌の例としては、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスが挙げられ、特に好ましい乳酸菌の例としては、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株が挙げられる。
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株は、１９９９年２月２２日付け（原寄託日）で独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ［旧：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター］）（〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は２００６年１１月２９日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株の現在の寄託者は株式会社明治である。株式会社明治は、明治ホールディングス株式会社に対し本願においてＯＬＬ１０７３Ｒ－１株に言及する権限を与えている。
一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、上記の乳酸菌を１種類又は２種類以上含む乳酸菌培養物から取得することができる。乳酸菌培養物は、乳酸菌を使用して製造したヨーグルトなどの発酵乳であってもよいし、乳酸菌を培地（乳含有培地など）で培養することにより得られるものであってもよいが、それらに限定されない。本発明において乳酸菌培養物の調製に使用され得る「乳」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）の乳であることが好ましい。
一実施形態では、乳酸菌培養物は、乳酸菌としてラクトバチルス属菌を含むものであってよく、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むものであってよい。
一実施形態では、乳酸菌培養物は、乳酸菌として、ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス属菌を組み合わせて含むものであってもよく、好ましい実施形態では、乳酸菌培養物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスと、ストレプトコッカス・サーモフィルスを含むものであってよい。
一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、乳酸菌由来、例えばラクトバチルス属菌及び／又はストレプトコッカス属菌などの上記乳酸菌由来であってよく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス由来であることが好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来であることがより好ましい。
本発明の酸性ＥＰＳを乳酸菌によって産生させるために用いる培養条件は、例えば、後述の実施例と同様の培養条件であってよいが、それに限定されない。そのような培養条件は、例えば、脱脂乳培地などの乳含有培地で３５～３９℃（典型的には、３７℃）で１２～２４時間（例えば、１８時間）の培養を含むものであり得る。
本発明の酸性ＥＰＳの乳酸菌培養物からの取得には、公知の多糖単離精製技術を用いることができる。例えば、トリクロロ酢酸処理などにより、乳酸菌培養物中のＥＰＳをタンパク質や乳酸菌から分離して回収し、透析した後、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの分画技術を用いて酸性ＥＰＳ画分を分離することができる。さらに、分離した酸性ＥＰＳ画分中の残存タンパク質をタンパク質加水分解酵素などを用いて除去し、さらに精製することにより、本発明の酸性ＥＰＳを取得することができる。しかし、本発明の酸性ＥＰＳの単離精製方法は、その方法に限定されるものではない。
あるいは本発明の酸性ＥＰＳは、糖鎖化学合成法を用いて化学合成してもよい。化学合成した本発明の酸性ＥＰＳも、本発明における「単離された」酸性ＥＰＳの範囲に包含され得る。
本発明の酸性ＥＰＳは、免疫賦活活性（免疫賦活作用）を有する。免疫賦活活性を有する本発明の酸性ＥＰＳは、好ましくは、インターフェロン（ＩＦＮ）－γの産生を促進することができる。ＩＦＮ－γは、主にＴ細胞やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞により産生され、抗ウイルス活性、免疫調節活性、抗腫瘍活性に寄与し、またマクロファージの強力な活性因子として機能することが知られている。
本発明の酸性ＥＰＳの免疫賦活活性は、ＩＦＮ－γの産生量を指標として評価することができる。本発明の酸性ＥＰＳの免疫賦活活性は、例えば、後述の実施例３と同じ試験方法を用いて評価することができる。具体的には、まず、マウス脾臓細胞を、牛胎児血清（例えば、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）牛胎児血清）を含む哺乳動物細胞培養用培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０培地）に懸濁した後、適切な細胞密度（例えば、５×１０５細胞／ウェル）でプレート等に播種すればよい。播種した細胞に、酸性ＥＰＳを、所定の濃度（例えば、終濃度２５～２００μｇ／ｍＬ）で添加し、３７℃、５％ ＣＯ２下で一定時間（例えば、７２時間）培養した後、培地から上清を回収し、回収した上清中に含まれるＩＦＮ－γ量を、抗ＩＦＮ－γ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）によって定量すればよい。対照として、マウス脾臓細胞を、酸性ＥＰＳを添加せずに同様に培養し、上清中のＩＦＮ－γ量を定量し、酸性ＥＰＳを添加した培養系で前述のように定量したＩＦＮ－γ量と比較する。酸性ＥＰＳを添加しない対照と比較して、酸性ＥＰＳを添加した場合に上清中のＩＦＮ－γ量が統計学的に有意に増加した場合、又は、酸性ＥＰＳの添加量の増加に伴い濃度依存的に上清中のＩＦＮ－γ量が増加した場合には、本発明の酸性ＥＰＳが免疫賦活活性を有すると判断することができる。また、酸性ＥＰＳを添加しない対照と比較した、酸性ＥＰＳを添加した場合の上清中のＩＦＮ－γ量の増加量に基づき、本発明の酸性ＥＰＳが有する免疫賦活活性の強度（レベル）を評価することができる。
本発明はまた、本発明の酸性ＥＰＳを含む組成物、及び本発明の酸性ＥＰＳを含む食品又は医薬品も提供する。本発明の酸性ＥＰＳを含む、組成物、食品又は医薬品は、免疫賦活活性を有することが好ましく、免疫賦活用であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳは、免疫賦活用組成物、及び免疫賦活用の食品又は医薬品に、有効成分（免疫賦活活性をもたらすための有効成分）として含まれ得る。本発明の酸性ＥＰＳは、免疫賦活用組成物、及び免疫賦活用の食品又は医薬品中に、免疫賦活のための唯一の有効成分として含まれていてもよいし、及び／又は唯一のＥＰＳとして含まれていてもよい。本発明において本発明の酸性ＥＰＳを「有効成分として含む」とは、本発明の酸性ＥＰＳを含む組成物、食品又は医薬品を対象に適用する際に、本発明の酸性ＥＰＳが、免疫賦活活性を発揮するのに十分な量（有効量）及び形態で、組成物、食品又は医薬品に含まれることを意味する。本発明の酸性ＥＰＳを含む、組成物、食品又は医薬品は、例えば、本発明の酸性ＥＰＳを、適用（摂取又は投与）１回当たり１０μｇ～５０ｍｇ／ｋｇ体重となる量で含むことができるが、この範囲に限定されない。
一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳを含む、組成物、食品又は医薬品は、中性ＥＰＳ（例えば、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株をはじめとするラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスなどの乳酸菌由来のもの）を含まないものであり得る。一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳを含む、組成物、食品又は医薬品は、２つのグルコース残基と２つのガラクトース残基からなる主鎖及び１つのガラクトース残基からなる側鎖から構成される繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有し、かつその構造にリン酸基が付加した酸性ＥＰＳ（例えば、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株をはじめとするラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスなどの乳酸菌由来のもの）を含まないものであり得る。
本発明の組成物、食品又は医薬品は、本発明の酸性ＥＰＳに加えて、食品加工上許容される添加剤（食品添加物）又は製薬上許容される添加剤（医薬品添加剤）を含んでもよい。そのような添加剤としては、例えば担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の酸性ＥＰＳを含む組成物（例えば、免疫賦活用組成物）は、食品組成物又は医薬組成物であってよいが、これらに限定されない。本発明の組成物、食品又は医薬品は、他の薬理成分及び／又は機能性成分をさらに含んでもよい。
本発明において「食品」とは、飲料であってもよいしその他の食品であってもよいが、好ましくは加工食品である。飲料としては、以下に限定するものではないが、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料が挙げられる。飲料以外の食品としては、以下に限定するものではないが、ヨーグルトなどの発酵乳、菓子、ジャム、総菜、インスタント食品、調味料等の加工食品が挙げられる。各種の食品の製造法等については、食品製造に関する既存の参考書を参考にすることができる。
本発明の食品は、機能性食品であってもそれ以外の食品であってもよい。本発明において「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、日本における特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康食品を包含する。
本発明の機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液体製剤、又はジェル剤やペースト剤等であってもよいし、通常の食品形状（例えば、飲料、ヨーグルト、菓子等）であってもよい。
本発明の食品は、本発明の酸性ＥＰＳに加えて、任意の食品成分を含んでもよく、特に限定されない。本発明の食品は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を含んでもよい。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物、バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分等が挙げられる。糖質としては、一般の糖類、加工澱粉（デキストリン、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維等が挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸等が挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラル等が挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等が挙げられる。これらの成分は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食材を原料として用いてもよい。本発明の食品は、常法により製造することができ、例えば、食品製造の任意の工程で、他の食品成分に本発明の酸性ＥＰＳ又は本発明の酸性ＥＰＳを含む原料を添加することにより製造してもよい。
本発明の医薬品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤、ジェル剤、又は、液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液体製剤等の任意の剤形であってよい。本発明の医薬品は、経口投与用の医薬品であることが好ましいが、それに限定されない。
本発明の組成物、食品又は医薬品は、本発明の酸性ＥＰＳの免疫賦活活性（免疫賦活作用）に基づいて、免疫賦活効果をもたらすことができる。例えば、本発明の組成物、食品又は医薬品は、インターフェロン（ＩＦＮ）－γの産生を促進することができる。本発明の組成物、食品又は医薬品は、摂取又は投与した対象において免疫応答を促進（刺激）することができる。
本発明は、本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品を対象に摂取させるか又は投与することを含む、対象において免疫賦活効果をもたらす方法（免疫賦活方法）も提供する。
本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品を摂取又は投与する対象は、ヒトなどの霊長類、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物であることが好ましく、ヒトがより好ましい。そのような対象は、以下に限定するものではないが、免疫賦活を必要とする対象又は免疫賦活が望まれる対象であってよく、例えば、妊産婦、乳幼児、高齢者、病者、病後者、虚弱者、免疫力が低下している対象、アスリート、感染症等の疾患への罹患を予防する必要がある対象（例えば、医療従事者、介護従事者、受験生等）などが挙げられる。
本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品の対象への摂取又は投与は、経口的な摂取又は投与であることが好ましいが、鼻腔経管、口腔食道経管、胃ろう、腸ろう等の経管法による摂取又は投与であってもよい。但し本発明における対象への投与経路はそれらに限定されるわけではない。
本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品の摂取又は投与量は、免疫賦活に有効な量であればよく、対象の生物種、年齢、体重、投与経路、投与回数等を考慮して、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。一実施形態では、その摂取又は投与量は、対象の体重に基づき、適用（摂取又は投与）１回当たり本発明の酸性ＥＰＳ １０μｇ～５０ｍｇ／ｋｇ体重となる量であり得るが、この範囲に限定されない。
本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品の摂取又は投与は、単回（１回）のみ行ってもよいし、複数回行ってもよい。本発明の酸性ＥＰＳ、又はそれを含む本発明の組成物、食品若しくは医薬品は、対象に継続的に摂取又は投与してもよく、毎日摂取又は投与してもよいし、例えば、一週間当たり１日、２日、３日、４日、５日、又は６日の頻度で摂取又は投与してもよい。継続的に摂取又は投与する場合、少なくとも３日、好ましくは１週間以上、より好ましくは２週間以上、さらに好ましくは４週間以上、例えば３ヶ月以上にわたって、対象に摂取させるか又は投与することが好ましい。
本発明はまた、免疫賦活（免疫応答促進）に使用するための本発明の酸性ＥＰＳにも関する。本発明はまた、免疫賦活（免疫応答促進）のための本発明の酸性ＥＰＳの使用にも関する。さらに、本発明は、免疫賦活（免疫応答促進）用の組成物、食品若しくは医薬品の製造における、本発明の酸性ＥＰＳの使用にも関する。
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］酸性ＥＰＳの産生及び精製
乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１）を、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂乳培地において３７℃で１８時間培養した。得られた培養物に終濃度１０質量％となるようにトリクロロ酢酸を加え、生じた変性タンパク質と乳酸菌を沈殿させた後、遠心分離した（１２，０００×ｇ、２０分）。得られた上清を回収し、３倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置した。得られた沈殿を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）により回収し、透析膜（ＭＷＣＯ［分画分子量］６，０００～８，０００）を用いて蒸留水で透析した。これにより、粗ＥＰＳ（菌体外多糖）を得た。
乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１）を、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂乳培地において３７℃で１８時間培養した。得られた培養物に終濃度１０質量％となるようにトリクロロ酢酸を加え、生じた変性タンパク質と乳酸菌を沈殿させた後、遠心分離した（１２，０００×ｇ、２０分）。得られた上清を回収し、３倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置した。得られた沈殿を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）により回収し、透析膜（ＭＷＣＯ［分画分子量］６，０００～８，０００）を用いて蒸留水で透析した。これにより、粗ＥＰＳ（菌体外多糖）を得た。
得られた粗ＥＰＳから、酸性ＥＰＳを分画した。分画には、陰イオン交換担体であるＤＥＡＥ－セファロース（Ｒ）（ジエチルアミノエチル－セファロース（Ｒ））Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用し、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．６）下で０～０．５Ｍ ＮａＣｌによる濃度勾配抽出法を用いた。得られた酸性ＥＰＳを１ｍＭ ＭｇＣｌ２含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、２ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅと２ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅで３７℃で６時間処理した。その後、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬでプロテイナーゼＫ溶液を添加して３７℃で１６時間処理することによりタンパク質を分解し、さらに９０℃で１０分間加熱することにより酵素を失活させた。得られた反応液に対し、上記と同様に３倍量の冷エタノールを加えて４℃で一晩静置し、得られた沈殿を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）により回収し、上記透析膜を用いて蒸留水で透析する操作を繰り返すことにより酸性ＥＰＳを精製し、酸性ＥＰＳ溶液を調製した。
［実施例２］酸性ＥＰＳの構造解析
精製した酸性ＥＰＳについて、２次元ＮＭＲにより構造解析を行った。解析に用いた２次元ＮＭＲは、シグナル間の相関を明らかにして複雑な化合物の構造解析を可能にする核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法であり、具体的には、［１Ｈ，１Ｈ］－ＣＯＳＹ法（１Ｈ，１Ｈ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＴＯＣＳＹ法（ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、［１Ｈ－１３Ｃ］－高分解能２次元ＮＭＲ法（［１Ｈ－１３Ｃ］－ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：［１Ｈ－１３Ｃ］－ＨＳＱＣ）、及び［１Ｈ，１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ法（［１Ｈ，１Ｈ］－ｎｕｃｌｅａｒ ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）である。
精製した酸性ＥＰＳについて、２次元ＮＭＲにより構造解析を行った。解析に用いた２次元ＮＭＲは、シグナル間の相関を明らかにして複雑な化合物の構造解析を可能にする核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法であり、具体的には、［１Ｈ，１Ｈ］－ＣＯＳＹ法（１Ｈ，１Ｈ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＴＯＣＳＹ法（ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、［１Ｈ－１３Ｃ］－高分解能２次元ＮＭＲ法（［１Ｈ－１３Ｃ］－ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：［１Ｈ－１３Ｃ］－ＨＳＱＣ）、及び［１Ｈ，１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ法（［１Ｈ，１Ｈ］－ｎｕｃｌｅａｒ ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）である。
まず［１Ｈ，１Ｈ］－ＣＯＳＹ法を用いて酸性ＥＰＳの構造を推定したが、これは、各プロトンのシグナルが同じ炭素原子に結合する２つの置換基（ジェミナル位）や隣接した炭素原子に結合した２つの置換基（ビシナル位）等の影響を受け、ほとんどの各アノマータイプの糖による１Ｈケミカルシフトに帰属するためである。さらに、オリゴ糖や多糖はシグナルが複雑に重なり合うため、シグナルから特定のスピン系に属するプロトン全ての相関ピークを抽出できるＴＯＣＳＹ法を用いて［１Ｈ，１Ｈ］－ＣＯＳＹ法によるデータを補強した。一方、水素原子と炭素原子のように２つの異なる種類の核間の相関を検出することが可能な［１Ｈ－１３Ｃ］－ＨＳＱＣ法を用いて、どの水素原子が直接どの炭素原子に結合しているかを解析した。さらに、空間的に近接したプロトン間のシグナルを観察する［１Ｈ，１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ法を用いて、どのシグナルが互いに近位にあるプロトン由来のものかを決定した。
［１Ｈ－１３Ｃ］－ＨＳＱＣ法で取得したスペクトルを図１に、［１Ｈ，１Ｈ］－ＮＯＥＳＹ法で取得したスペクトルを図２に示す。
２次元ＮＭＲ構造解析の結果、得られた酸性ＥＰＳは、主に、ガラクトース残基（３つのフラノース型ガラクトース残基と２つのピラノース型ガラクトース残基）からなる繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有していることが示された。さらに、この繰り返し構造には繰り返し単位の多くで繰り返し単位毎に１つのグリセロールリン酸基が結合し、細菌細胞壁へのアンカーを形成していることも示された。
さらに、グリコシル結合分析のため、得られた酸性ＥＰＳをペルメチル化し、脱重合し、アセチル化処理し、得られたメチル化アルジトールアセテートをガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）で分析することにより、当該酸性ＥＰＳの繰り返し構造を図３のとおり決定した。図３中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ／Ｆは、図１及び２のスペクトルに示された、それぞれの糖残基を指し示すために便宜上付与している記号である。図３に示す構造において、Ｇａｌｐはピラノース型ガラクトース残基、Ｇａｌｆはフラノース型ガラクトース残基、Ｇｒｏ３ｐはグリセロール３－リン酸基を表す。
［実施例３］酸性ＥＰＳの免疫賦活活性評価
マウス脾臓細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した後、５×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。播種した細胞に、実施例１で精製し実施例２で構造を決定した酸性ＥＰＳの溶液を、ＥＰＳの終濃度２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、又は２００μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ ＣＯ２下で７２時間培養した（酸性ＥＰＳ刺激群）。また対照として、マウス脾臓細胞を、酸性ＥＰＳを添加せずに同様に培養した（無刺激群）。培養後、上清を回収し、培地中に産生されたインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
マウス脾臓細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した後、５×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。播種した細胞に、実施例１で精製し実施例２で構造を決定した酸性ＥＰＳの溶液を、ＥＰＳの終濃度２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、又は２００μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ ＣＯ２下で７２時間培養した（酸性ＥＰＳ刺激群）。また対照として、マウス脾臓細胞を、酸性ＥＰＳを添加せずに同様に培養した（無刺激群）。培養後、上清を回収し、培地中に産生されたインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
その結果、酸性ＥＰＳの添加濃度依存的な量で、脾臓細胞におけるＩＦＮ－γ産生が誘導された（図４）。このことから、得られた酸性ＥＰＳが免疫細胞を活性化できることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (8)
- 以下の式（Ｉ）で表される繰り返し単位が連なった繰り返し構造を有する酸性菌体外多糖。
- 単離された、請求項１に記載の酸性菌体外多糖。
- ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含む乳酸菌培養物から単離された、請求項１又は２に記載の酸性菌体外多糖。
- ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７４１）由来である、請求項１に記載の酸性菌体外多糖。
- 請求項１に記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用組成物。
- 請求項１に記載の酸性菌体外多糖を有効成分として含む、免疫賦活用の食品又は医薬品。
- 請求項１に記載の酸性菌体外多糖、請求項５に記載の免疫賦活用組成物、又は請求項６に記載の免疫賦活用の食品又は医薬品を、対象に摂取させるか又は投与することを含む、免疫賦活方法。
- 免疫賦活用の組成物、食品若しくは医薬品の製造における、請求項１に記載の酸性菌体外多糖の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| JP2022155708 | 2022-09-29 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024071336A1 true WO2024071336A1 (ja) | 2024-04-04 |
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ID=90478115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/035511 WO2024071336A1 (ja) | 2022-09-29 | 2023-09-28 | 免疫賦活活性を有する酸性菌体外多糖 |
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|---|---|
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-
2023
- 2023-09-28 WO PCT/JP2023/035511 patent/WO2024071336A1/ja unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SEIYA MAKINO: "Immunostimulatory effects of yogurt fermented with Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 and its exopolysaccharides.", MILK SCIENCE, vol. 58, no. 2, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 35 - 40, XP093152236 * |
| VAN CALSTEREN MARIE-ROSE; GAGNON FLEUR; NISHIMURA JUNKO; MAKINO SEIYA: "Structure determination of the neutral exopolysaccharide produced byLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusOLL1073R-1", CARBOHYDRATE RESEARCH, PERGAMON, GB, vol. 413, 9 June 2015 (2015-06-09), GB , pages 115 - 122, XP029250137, ISSN: 0008-6215, DOI: 10.1016/j.carres.2015.05.015 * |
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