WO2024063529A1 - 신규 화합물 및 이를 포함하는 염증성 질환과 암에 대한 진단 및 치료에 사용되는 mri 조영제 - Google Patents

신규 화합물 및 이를 포함하는 염증성 질환과 암에 대한 진단 및 치료에 사용되는 mri 조영제 Download PDF

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WO2024063529A1
WO2024063529A1 PCT/KR2023/014251 KR2023014251W WO2024063529A1 WO 2024063529 A1 WO2024063529 A1 WO 2024063529A1 KR 2023014251 W KR2023014251 W KR 2023014251W WO 2024063529 A1 WO2024063529 A1 WO 2024063529A1
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inflammatory
galangin
mri contrast
treatment
contrast agent
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PCT/KR2023/014251
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장용민
양병우
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주식회사 테라노큐어
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table

Definitions

  • the present invention relates to a new compound and a gadolinium-based MRI contrast agent. More specifically, it relates to a novel compound that targets inflammatory diseases and cancer and allows simultaneous diagnosis and treatment, and to an MRI contrast agent containing the same.
  • Flavonoids are bioactive substances found in fruits, vegetables, tea, etc., and have antioxidant and anti-inflammatory effects. Inflammation causes cell damage and promotes the production of ROS, and ROS is a reactive oxygen species that causes an inflammatory response. It is important to control inflammation and ROS. Flavonoids have powerful antioxidant efficacy through direct scavenging of ROS, upregulation of ROS scavenging enzymes, and downregulation of free radicals. Recent studies have shown that flavonoids reduce the inflammatory response by inhibiting the activation of NLRP3 and can be effective in preventing and treating various diseases such as coronary artery disease, metabolic syndrome, and rheumatoid arthritis.
  • flavonoids have very low bioavailability and are difficult to absorb and metabolize for this reason, so they must be consumed in very large amounts to maintain sufficient levels in the body.
  • flavonoids have very low solubility in water, so they are mostly administered orally, and orally administered drugs are exposed to a wide variety of environments in digestive pathways such as the mouth, esophagus, stomach, and intestines.
  • pH has the widest range in the body, from 1.5 to 7.
  • no matter where the drug is absorbed from the stomach to the small intestine it eventually passes through the liver and then moves to other tissues, so there is a problem in that only a very small amount reaches the target area compared to the drug taken for the first time.
  • Solubility is a very important issue in the characteristics of drugs, and research and development is needed to increase the solubility of flavonoids and maximize the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer effects of flavonoids even with small amounts.
  • One object of the present invention is to provide a novel compound that has sufficient solubility to allow intravenous administration and is capable of simultaneously diagnosing and treating inflammatory diseases and cancer, and an MRI contrast agent containing the same.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory agent for intravenous administration containing the novel compound.
  • Another object of the present invention is to provide an antioxidant for intravenous administration containing the novel compound.
  • the present invention provides a gadolinium complex having galangin, one of the flavonoids with anti-inflammatory, antioxidant, and anti-cancer effects, as a functional group.
  • a new compound for one purpose of the present invention may be represented by the following formula (1).
  • L is *-(CH 2 ) x -A 1 -(CH 2 ) y -A 2 -(CH 2 ) z -*
  • x, y and z are each independently selected as random integers from 0 to 5
  • a 1 and A 2 are single bonds, in the group containing *-COO-*, *-CO-*, *-NH-*, *-CH 2 -*, *-CONH-* and *-O-*
  • Each is one or more independently selected structures
  • X is a structure having the following formula (2):
  • R 1 and R 2 represent a hydroxy group
  • * is a binding site
  • a 1 may be *-COO-*, and A 2 may be *-O-*.
  • x may be 1.
  • y may be 3.
  • z may be 0.
  • the compound may be represented by the following formula (3).
  • R 1 and R 2 represent a hydroxy group.
  • the gadolinium (Gd) may coordinate with one or more water molecules.
  • the compound represented by Formula (1) may have a structure in which a flavonoid functional group is bonded to a gadolinium-based compound. Since the compound represented by the formula (1) has sufficient solubility to allow intravenous administration, even in small amounts, the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer effects of the flavonoid itself can be quickly maximized to increase the treatment effect of inflammation and cancer.
  • the compounds of the present invention target inflammatory diseases and may have anti-inflammatory activity at the site of inflammation. Due to its high solubility, the compound of the present invention shows a high contrast effect by specifically targeting inflammatory diseases, especially hepatitis, when administered intravenously. Therefore, the compounds of the present invention can be used for diagnosis and treatment of inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease may be hepatitis.
  • the compounds of the present invention target cancer and may have anticancer activity. Due to its high solubility, the compound of the present invention shows a high contrast effect by specifically targeting serious diseases such as cancer, for example, liver cancer, when administered intravenously. Therefore, the compounds of the present invention can be used for diagnosis and treatment of cancer.
  • an MRI contrast agent for other purposes of the present invention may include a compound represented by the above formula (1).
  • the MRI contrast agent of the present invention is T 1 MRI As a contrast agent, it has excellent contrast around hepatitis, making it easy to target diagnosis and treatment of hepatitis.
  • the MRI contrast agent is administered intravenously. Additionally, the MRI contrast agent can be used for targeted diagnosis and treatment of hepatitis.
  • the MRI contrast agent has anti-cancer activity and can be used for targeted diagnosis and treatment of cancer.
  • the compound shows a contrast effect about 1.5 times higher than that of a commercial MRI contrast agent (Gadovist ® ) for liver cancer cells, HepG2, and can be used for targeted diagnosis and treatment of cancer.
  • the present invention can provide an anti-inflammatory agent for intravenous administration, which includes a compound represented by Formula (1), targets an inflammatory site, and has anti-inflammatory activity at the inflammatory site.
  • the anti-inflammatory agent for intravenous administration of the present invention can target the inflammatory site and have therapeutic efficacy. More specifically, it specifically targets hepatitis and exhibits anti-inflammatory activity against hepatitis, so it can have both targeting and therapeutic efficacy against hepatitis.
  • the present invention can provide an antioxidant for intravenous administration that includes the compound represented by the formula (1) and has antioxidant efficacy.
  • the compound having galangin, a flavonoid according to an embodiment of the present invention, as a functional group can be used as an intravenous injection preparation due to its excellent solubility, which is different from existing insoluble flavonoids. Due to this increase in solubility, it is possible to expect increased anti-inflammatory, antioxidant, and anti-cancer efficacy even in small amounts through direct drug delivery, which makes diagnosis and treatment of inflammatory diseases and cancer possible at the same time.
  • the T 1 MRI contrast agent of the present invention has sufficient solubility to enable intravenous administration, even a small amount can quickly maximize the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer effects of the flavonoid itself, thereby increasing the treatment effect.
  • the gadolinium-flavonoid contrast agent of the present invention is a commercial MRI contrast agent (Gadovist ) shows higher targeting and contrast effect than that of
  • gadolinium compounds similarly range from 10 to 100 ⁇ M, so they can be considered suitable for use with flavonoids.
  • solubility is a very important issue in drug characteristics, and as a highly water-soluble agent, gadolinium compounds can improve the solubility of flavonoids.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for synthesizing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 2a-2c show the results of HR-FAB-MS analysis of compounds synthesized according to the present invention.
  • Figures 3a-3c show the results of HPLC analysis of compounds synthesized according to the present invention.
  • Figure 4 shows the results of confirming the presence of free gadolinium ions in compounds synthesized according to the present invention using an arsenazo III solution.
  • FIGS 5 to 19 are diagrams showing results according to experimental examples of the present invention.
  • Figure 20 shows the chemical structure of the flavonoid functional group contained in the compound of the present invention.
  • Figure 21 shows the anti-inflammatory mechanism of Gd-galangin synthesized according to the present invention.
  • the gadolinium ion (Gd 3+ ) can form a complex by coordinating with the carboxylate (COO - ) group in the formula (1).
  • L may be *-(CH 2 ) x -A 1 -(CH 2 ) y -A 2 -(CH 2 ) z -*, and x, y and z are any of 0 to 5.
  • the L may be a linker connecting the nitrogen and the X in the cyclic structure of the compound.
  • the A 1 and A 2 may determine the functional group determined by the method or the method by which the linker connects the nitrogen and the X in the cyclic structure of the compound.
  • the x, y and z may determine the length of the chain connecting A 1 and A 2 in the linker.
  • a 1 may be *-COO-*
  • a 2 may be *-O-*.
  • x may be 1.
  • y may be 3.
  • z may be 0.
  • the gadolinium (Gd) in the compound may coordinate with one or more water molecules.
  • X may have a structure having the following formula (2).
  • R 1 and R 2 represent a hydroxy group
  • * is a binding site
  • the compound may be represented by the following formula (3).
  • R 1 and R 2 represent a hydroxy group.
  • the compound has sufficient solubility to allow intravenous administration, even a small amount can quickly maximize the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer effects of the flavonoid itself, thereby increasing the treatment effect of inflammation or cancer.
  • the compound targets inflammatory diseases and may have anti-inflammatory activity at the site of inflammation. Due to its high solubility, the compound of the present invention shows a high contrast effect by specifically targeting inflammatory diseases, especially hepatitis, when administered intravenously. Therefore, the compounds of the present invention can be used for diagnosis or treatment of inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease may be hepatitis.
  • the compound targets cancer and may have anticancer activity. Due to its high solubility, the compound of the present invention shows a high contrast effect by specifically targeting serious diseases such as cancer, for example, liver cancer, when administered intravenously. Therefore, the compound of the present invention can be used for diagnosis or treatment of cancer.
  • an MRI contrast agent for other purposes of the present invention may include a compound represented by the above formula (1).
  • the MRI contrast agent of the present invention is T 1 MRI As a contrast agent, it has excellent contrast around hepatitis, making it easy to diagnose and target diagnosis and treatment of hepatitis.
  • the MRI contrast agent is administered intravenously.
  • the MRI contrast agent of the present invention can be particularly used in the diagnosis and treatment of inflammatory diseases or cancer. More specifically, the MRI contrast agent can be used for targeted diagnosis and treatment of inflammatory diseases such as hepatitis.
  • the MRI contrast agent has anti-cancer activity and can be used for targeted diagnosis and treatment of cancer.
  • the compound shows a contrast effect about 1.5 times higher than that of a commercial MRI contrast agent (Gadovist ® ) for liver cancer cells, HepG2, and can be used for targeted diagnosis and treatment of cancer.
  • the present invention can provide an anti-inflammatory agent for intravenous administration, which includes a compound represented by Formula (1), targets an inflammatory site, and has anti-inflammatory activity at the inflammatory site.
  • the anti-inflammatory agent for intravenous administration of the present invention can target the inflammatory site and have therapeutic efficacy. More specifically, it specifically targets hepatitis and exhibits anti-inflammatory activity against hepatitis, so it can have both targeting and therapeutic efficacy against hepatitis.
  • the present invention can provide an antioxidant for intravenous administration that includes the compound represented by the formula (1) and has antioxidant efficacy.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the synthesis of a gadolinium complex containing DO3A bound to 7-Hydroxyflavone, chrysin, and galangin is shown in Figure 1.
  • the specific synthesis method is as follows.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the hydroxy group at position 7 of the flavonoid ring A is more acidic than the hydroxy groups at other positions, and the highly reactive hydroxy group at position 7 acts as a linker to form 1,3-dibro. 1a-c coupled to mopropane were synthesized.
  • the galangin intermediate protected with an acetyl group (2) reacted with imidazole and thiophenol (PhSH) so that the linker reacted at the same position (3).
  • intermediates 6a-6c formed an ester bond with 1a-c under triethylamine and tetrahydrofuran (THF) conditions.
  • THF tetrahydrofuran
  • tert-butyl and acetyl groups were deprotected with hydrochloric acid (7a-c), and then formed into gadolinium complexes (8a; Gd-flavone, 8b; Gd-chrysin, 8c) in the presence of GdCl 3 ⁇ 6H 2 O and 1M NaHCO 3 ; Gd-galangin) was synthesized.
  • the r 1 and r 2 relaxivities of Gd-flavone, Gd-chrysin, Gd-galangin and other commercial contrast agents were measured at five concentrations (0.0625, 0.125) in deionized water, phosphate-buffered saline (PBS), or 0.67mM human serum albumin (HSA) solutions. , 0.25, 0.5, and 1mM), respectively (see Table 1).
  • Gd-galangin showed the highest r 1 relaxivity, while Gd-flavone, Gd-BT-DO3A, and Gd-DOTA showed similar values.
  • Gd-chrysin showed a slightly higher level of r 1 relaxivity than other compounds.
  • the octanol-water partition coefficient (log P) was calculated using a known method, and the values were -1.40, -0.91, and -0.74, respectively. was obtained (see Table 1).
  • the log P values of clinically used drugs Gd-BT-DO3A (-3.13) and Gd-DOTA (-3.09) were also calculated.
  • the lipophilicity of the new gadolinium complex of the present invention was significantly higher than that of the gadolinium complex currently used in clinical settings. This is due to the presence of polyphenol hydroxy groups present in the compounds of the present invention. Considering that log P values are highly correlated with relaxivity and protein binding, it can be seen that the high relaxivity of Gd-flavone, Gd-chrysin, and Gd-galangin is related to high lipophilicity.
  • Endogenous metal ions including Zn 2+ , Cu 2+ and Ca 2+ , can compete with Gd 3+ ions for chelation, resulting in Gd ion loss, leading to diseases such as nephrogenic systemic fibrosis (NSF) or in the brain.
  • NSF nephrogenic systemic fibrosis
  • Diseases such as Gd 3+ ion deposition can cause it.
  • Gd-based macrocyclic chelates are characterized by higher kinetic inactivity.
  • Gd-galangin showed the highest kinetic inertness value
  • Gd-galangin which has the same macrocyclic chelate structure as Gd-BT-DO3A and Gd-DOTA, flavone and Gd-chrysin showed similar values.
  • R 2 relaxation rate was monitored for 72 hours
  • the linear DTPA analog showed a significant decrease in R 2 values.
  • the insoluble substances 7-hydroxyflavone, chrysin, and galangin were synthesized into a water-soluble gadolinium complex, and the solubility for use as an intravenous injection preparation was evaluated.
  • Table 2 above shows the results of evaluating the water solubility of the flavonoids 7-hydroxyflavone, chrysin, and galangin and the materials synthesized with water-soluble gadolinium complexes of 7-hydroxyflavone, chrysin, and galangin at 25°C.
  • flavonoids 7-hydroxyflavone, chrysin, and galangin are insoluble substances that are almost insoluble in water. Because these substances are difficult to absorb in the body and have low bioavailability, it is difficult to expect anti-inflammatory, antioxidant, and anti-cancer effects from these substances.
  • Figure 6 shows images of the synthesized water-soluble gadolinium complexes observed immediately after dissolution in tertiary distilled water, saline solution, and PBS, 30 minutes after dissolution, and 2 hours after dissolution. From the left, the order is Gd-galangin, Gd-chrysin, and Gd-flavone.
  • Maintaining the aqueous solution state is also related to the stability of the material.
  • the three types of synthesized gadolinium complexes had similar structures, but only Gd-galangin maintained high solubility. Through these results, it was confirmed that Gd-galangin is most suitable as an injection preparation.
  • Gd-galangin is an insoluble substance, and can be administered intravenously by increasing solubility by synthesizing it into a gadolinium complex.
  • direct drug delivery is possible, and anti-inflammatory, antioxidant, and anticancer effects can be expected to increase.
  • Gd-galangin showed the lowest level among the three flavonoids and three gadolinium complexes.
  • Free radicals are harmful substances that destroy cells in the body, and their relationship with inflammation is well known. Antioxidant action that removes large amounts of free radicals is very important.
  • DPPH, FRAP, and ABTS experiments were conducted to evaluate free radical scavenging activity. This is an experiment in which a highly reactive reagent with a single electron generates free radicals and compares them by measuring the difference in wavelength absorption using a spectrophotometer when reacting with a drug. Representative antioxidants ascorbic acid (AA) and trolox (TR) were used as controls.
  • Gd-galangin has a radical scavenging activity similar to that of ascorbic acid (AA) and Trolox (TR) in FRAP and ABTS. showed. This result shows that Gd-galangin has the most excellent antioxidant effect.
  • the luminol derivative L-012 is a highly sensitive chemiluminescent material characterized by greater activity than luminol itself. Although it reacts with various ROS generated in the body, its activation time is limited. Therefore, L-012 was administered repeatedly to compare the efficacy of the drug, and the free radical removal effect was compared.
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • cytokines expressed in various cells during inflammatory reactions. It performs oxidative reduction and produces NO (nitric oxide). NO performs various physiological functions such as vasodilation, inhibition of platelet aggregation, and neurotransmission, and also plays an important role in inflammatory reactions.
  • Gd-galangin decreased the NO increased by LPS from 50 uM, and iNOS tended to decrease depending on the concentration. This result shows that Gd-galangin decreases the NO increased by LPS by reducing iNOS expression. It shows that it contributes to the inhibition of induced NO production.
  • Figure 12 shows the results of Western blot on inflammatory tissue in an LPS-induced myositis animal model. Similar to the results of in vitro experiments, LPS promoted the expression of iNOS and NLRP3 inflammasome-related factors, and administration of Gd-galangin promoted the expression of these factors. Anti-inflammatory efficacy was also demonstrated in vivo by confirming that the inflammatory response was suppressed.
  • Figure 13 shows the results of histological evaluation by H&E staining on inflammatory tissue induced by LPS. Looking at Figure 13, it can be seen that the intercellular spacing is very tight in the case of normal cells compared to the LPS-administered group. On the other hand, compared to the LPS only group, both the intravenous injection of Gd-galangin and the oral administration of galangin showed a better condition, but the intercellular spacing was wider in galangin overall, so the group in which Gd-galangin was administered intravenously This showed results closer to the normal tissue state.
  • Figure 14 shows the results of an in vivo experiment to evaluate the anti-inflammatory efficacy of galangin and Gd-galangin, showing the results of immunohistochemical staining.
  • IHC immunohistochemical staining
  • Gd-galangin The diagnostic imaging properties of Gd-galangin were evaluated using a mouse model of LPS-induced inflammation. 24 hours after LPS injection, Gd-galangin and Gd-BT-DO3A (control group) were injected intravenously at the same concentration (0.1 mmol Gd/kg) and coronal and axial injections were performed throughout the body and at the inflamed area at 3.0 T. ) T1-weighted MR images were obtained.
  • the signal intensity of the gallbladder was enhanced 1 hour after intravenous injection, and during the hepatobiliary phase, the contrast agent was absorbed by hepatocytes and then excreted through the biliary route, showing a characteristic enhancement pattern for hepatobiliary excretion contrast agent.
  • the flavonoid moiety of the gadolinium complex confers high lipophilicity, and Gd-galangin can maintain higher and longer signal intensity in the liver and gallbladder.
  • Hepatitis is an inflammation of the liver cell tissue and includes acute hepatitis caused by viruses and toxins, and chronic hepatitis such as alcoholic and non-alcoholic hepatitis. There are many treatment methods, but treatment for inflammation is the most important. Targeted treatment for inflammation is very important because it can slow or prevent progression to chronic disease through inflammation treatment.
  • PARP activity is associated with increased oxidative stress and DNA damage, which induces PARP activity. Overactivation of PARP can cause ATP and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) depletion, leading to cell death.
  • NAD+ nicotinamide adenine dinucleotide
  • PARP expression is associated with several hepatitis diseases and is used as an indicator to detect cell death.
  • Nrf2 mediates HO-1 upregulation to activate antioxidant responses. Accordingly, the relevance of Gd-galangin to the Nrf2 signaling pathway was investigated, and the results are shown in Figure 19.
  • Gd-galangin has an antioxidant effect by promoting phosphorylation of Nrf2 and upregulated expression of HO-1.
  • the present invention evaluated the diagnostic ability of a gadolinium-based contrast agent combined with flavonoids for inflammation.
  • Flavonoids and their derivatives are known to be effective in preventing and treating inflammatory diseases such as encephalitis, hepatitis, rheumatism, and serious diseases such as cancer, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease.
  • inflammatory diseases such as encephalitis, hepatitis, rheumatism, and serious diseases such as cancer, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease.
  • conventional flavonoid substances have been administered by oral administration.
  • Oral administration is the most preferred method of drug administration due to convenience, patient compliance, and reduced risk of cross-infection.
  • Oral drugs are mostly absorbed through digestion or metabolism, and their absorption into the body is very limited. As such, there is a problem in that it exhibits limited bioavailability due to low permeability and stability, seriously reducing its effectiveness as a therapeutic agent.
  • the present invention combines a DO3A chelating substance and a flavonoid to increase water solubility, and the high lipophilicity due to the binding portion can increase intracellular diffusion ability.
  • Ring B is due to conjugation with the chromone moiety, which provides more resonance and binding sites and supports the chromone.
  • the linking group synthesis utilized the unique high reactivity of the hydroxyl group at position 7, and the gadolinium compound of the present invention was synthesized in high yield by forming an ester bond with DO3A through the linking group.
  • DO3A-flavonoid was designed to maintain active sites for antioxidant effects and increase synthesis efficiency.
  • the ester bond-based DO3A and flavonoid binding portion has a large structure that is difficult for esterases to act on, so it is protected when decomposed, and as a result, the synthesized material has high stability.
  • flavone, chrysin, and galangin differ in the position and number of hydroxyl groups for rings A and C. Considering the structural features mentioned above, the greatest effect can be expected from galangin, which was confirmed in radical scavenging ability tests (DPPH, FRAP, ABTS) conducted with the newly synthesized structure. In particular, the results for Gd-flavone and Gd-chrysin show the importance of the hydroxyl group at position 3.
  • the proposed mechanism underlying the effects of Gd-galangin is summarized in Figure 21.
  • the inflammatory response is an important response for survival dominated by inflammatory cytokines and chemokines.
  • Gd-galangin of the present invention suppresses iNOS and NLRP3 inflammasome expression and regulates the expression of downstream factors NO and IL-1 ⁇ .
  • NLRP3 inflammasome activation is a target for inflammation treatment because it promotes inflammation and induces disease development.
  • IL-1 ⁇ is an inflammatory cytokine that is matured by activated NLRP3 inflammasome.
  • Gd-galangin reduces IL-1 ⁇ expression due to its contribution to NLRP3 and ASC suppression.
  • I k B binds to NF- k B and inhibits its translocation to the nucleus.
  • phosphorylation of IkB triggers the release of NF- kB , restoring its nuclear translocation.
  • Gd-galangin also shows that inhibition of phosphorylation of IkB inhibits NF- kB translocation to the nucleus.
  • Nrf2 mediates the upregulation of HO-1 to initiate antioxidant activity. This upregulated expression of HO-1 contributes to the maintenance of redox homeostasis through several mechanisms.
  • Keap1 generally binds to Nrf2 and inhibits its translocation to the nucleus.
  • Phosphorylation of Nrf2 promotes its dissociation from Keap1, which contributes to the expression of HO-1.
  • Gd-galangin exerts antioxidant effects by promoting phosphorylation of Nrf2 and upregulating HO-1 expression.
  • the MAPK signaling pathway is a cascade of serine/threonine kinases that regulate cell survival and death
  • Erk, JNK, and p38 are members of the MAPK family that contribute to LPS-stimulated inflammation by phosphorylation.
  • Gd-galangin tended to inhibit Erk, JNK, and p38, and showed particularly high anti-inflammatory activity against JNK.
  • Gd-galangin used as a T 1 MR contrast agent according to the present invention, showed a contrast enhancement effect up to 5 times better than conventional contrast agents for hepatitis, an inflamed tissue, and maintained its durability for more than 3 hours.

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Abstract

본 발명은 항염증, 항산화, 항암 효과가 있는 천연물 중 하나인 플라보노이드를 작용기로 가진 신규 화합물 및 이를 포함하는 MRI 조영제에 관한 것이다. 본 발명의 신규 화합물은 기존의 불용성 플라보노이드와는 다른 뛰어난 용해도를 토대로 정맥 투여가 가능하며, 소량으로도 항산화, 항염 및 항암 효과를 기대할 수 있고, 염증성 질환과 암을 표적하여 진단과 치료가 동시에 가능한 T 1 MRI 조영제로 활용될 수 있다.

Description

신규 화합물 및 이를 포함하는 염증성 질환과 암에 대한 진단 및 치료에 사용되는 MRI 조영제
본 발명은 신규 화합물 및 가돌리늄을 기반으로 한 MRI 조영제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 염증성 질환과 암을 표적하여 진단과 치료가 동시에 가능한 신규 화합물 및 이를 포함하는 MRI 조영제에 관한 것이다.
플라보노이드는 과일, 채소, 차 등에서 발견되는 생리활성 물질로, 항산화와 항염증 효과가 있다. 염증은 세포 손상을 유발하여 ROS의 생성을 촉진시키고, ROS는 반대로 염증 반응을 유발하는 활성 산소 종으로, 염증과 ROS를 조절하는 것이 중요하다. 플라보노이드는 ROS의 직접적인 소거, ROS 제거 효소의 상향 조절 및 활성 산소의 하향 조절을 통해 강력한 항산화 효능을 갖는다. 최근 연구에서는 플라보노이드가 NLRP3의 활성화를 억제하여 염증 반응을 감소시키고 관상동맥질환, 대사증후군, 류마티스 관절염 등 다양한 질환에 대하여 예방과 치료에 효과적일 수 있음을 보여주고 있다.
그러나, 플라노보이드는 매우 낮은 생체이용률을 가지며 이러한 이유로 흡수 및 대사되기 어려워 생체 내에서 충분한 양을 유지하기 위해서는 매우 많은 양을 섭취해야 한다.
더하여, 플라보노이드는 물에 대한 매우 낮은 용해도를 가지므로 대부분 경구 투여되는데, 경구 투여된 약물은 입, 식도, 위, 장 등 소화 경로에서 매우 다양한 환경에 노출되게 된다. 위와 장을 보면 pH는 1.5-7까지 신체에서 가장 넓은 범위를 가지고 있다. 그리고, 복용한 약물은 위에서 소장까지 어디에서 흡수되어도 결국 간을 통과하며 그 다음에 다른 조직으로 이동이 되기 때문에 처음 복용한 약물에 비해서는 매우 적은 양만 목표로 하는 곳에 도달하게 되는 문제점이 있다.
용해도는 약물의 특성에서 매우 중요한 문제로, 플라보노이드의 용해도를 높여, 소량으로도 플라보노이드의 항산화, 항염, 항암 효과를 극대화시킬 수 있는 연구 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 정맥 투여가 가능할 정도로 충분한 용해도를 가지며, 염증성 질환과 암을 표적하여 진단과 치료가 동시에 가능한 신규 화합물 및 이를 포함하는 MRI 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 포함하는 정맥 투여용 항염증제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 포함하는 정맥 투여용 항산화제를 제공하는 것이다.
본 발명은 항염, 항산화, 항암 효과가 있는 플라보노이드 중 하나인 갈란긴(galangin)을 작용기로 가진 가돌리늄 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 목적을 위한 신규 화합물은 하기 화학식 (1)으로 표시될 수 있다.
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000001
(1)
여기서,
L은 *-(CH2)x-A1-(CH2)y-A2-(CH2)z-*이고,
x,y 및 z는 0 내지 5의 임의의 정수로 각각 독립적으로 선택되고,
A1 및 A2는 단일 결합, *-COO-*, *-CO-*, *-NH-*, *-CH2-*, *-CONH-* 및 *-O-* 를 포함하는 군에서 각각 독립적으로 선택된 하나 이상의 구조이고,
X는 하기 화학식 (2)를 가지는 구조이고:
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000002
(2)
여기서, R1 및 R2 는 하이드록시기를 나타내고, *은 결합 자리이다.
일 실시예에 있어서, 상기 A1은 *-COO-*이고, A2는 *-O-*일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 x는 1 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 y는 3 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 z는 0 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (3)으로 표시될 수 있다.
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000003
(3)
여기서, R1 및 R2는 하이드록시기를 나타낸다.
일 실시예에 있어서, 상기 가돌리늄(Gd)이 하나 이상의 물 분자와 배위할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물은 가돌리늄 기반 화합물에 플라보노이드 작용기가 결합된 구조를 가질 수 있다. 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물은 정맥 투여가 가능할 정도로 충분한 용해도를 가지기 때문에 소량으로도 플라보노이드 자체의 항산화, 항염, 항암 효과를 빠른 시간에 극대화하여 염증과 암의 치료 효과를 높일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 염증성 질환을 표적하고 염증 부위에 항염증 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 높은 용해도에 기인하여 상기 화합물을 정맥 투여하는 경우, 염증성 질환, 특히 간염을 특이적으로 표적하여 높은 조영 효과를 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물은 염증성 질환의 진단 및 치료 용도로 활용될 수 있다. 일 예로, 상기 염증성 질환은 간염일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 암을 표적하고 항암 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 높은 용해도에 기인하여 상기 화합물을 정맥 투여하는 경우, 암, 예를 들어 간암과 같은 중증 질환을 특이적으로 표적하여 높은 조영 효과를 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물은 암의 진단 및 치료 용도로 활용될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 목적을 위한 MRI 조영제는 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 MRI 조영제는 T 1 MRI 조영제로서 간염 주변의 대조도(contrast)가 뛰어나 간염의 표적 진단 및 치료가 용이하다.
일 실시예에 있어서, 상기 MRI 조영제는 정맥 투여되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 MRI 조영제는 간염의 표적 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
일 실시예로, 상기 MRI 조영제는 항암 활성을 가지며, 암의 표적 진단 및 치료에 사용될 수 있다. 일 예로, 상기 화합물은 간암세포인 HepG2에 대하여 상용 MRI 조영제(Gadovist®)보다 약 1.5배 높은 조영 효과를 보이며 암에 대한 표적 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 실시예로 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함하고, 염증 부위를 표적하고 염증 부위에 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 정맥 투여용 항염증제를 제공할 수 있다. 본 발명의 정맥 투여용 항염증제는 염증 부위를 표적 진단하고 치료 효능을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 간염을 특이적으로 표적하고, 간염에 대해 항염증 활성을 나타내어, 간염에 대한 표적 및 치료 효능을 동시에 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 실시예로 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함하고, 항산화 효능을 갖는 정맥 투여용 항산화제를 제공할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 플라보노이드인 갈란긴을 작용기로 가진 화합물은 기존의 불용성 플라보노이드와는 다른 뛰어난 용해도로 인해 정맥 주사 제제로 활용이 가능하다. 이러한 용해도의 증가로 인해 직접적인 약물 전달로 소량으로도 항염증, 항산화, 항암 효능 증대를 기대할 수 있으며, 이로 인해 염증성 질환과 암의 진단과 치료가 동시에 가능하다.
한편, 본 발명의 T 1 MRI 조영제는 정맥 투여가 가능할 정도로 충분한 용해도를 가지기 때문에 소량으로도 플라보노이드 자체의 항산화, 항염, 항암 효과를 빠른 시간에 극대화하여 치료 효과를 높일 수 있다. 특히, 간염에 대해 본 발명의 가돌리늄-플라보노이드계 조영제는 상용 MRI 조영제(Gadovist　)보다 더 높은 표적성과 조영 효과를 보여준다.
플라보노이드를 치료약으로 투여할 때, 마이크로몰(micromolar) 농도를 사용할 필요가 있는데, 그 이유는 일반적으로 생체 내 항산화 활성을 위해 10-100 μM 범위 내의 농도가 필요하기 때문이다.
가돌리늄 화합물의 임상 용량은 유사하게 10~100μM 범위이므로 플라보노이드와 함께 사용하기에 적합하다고 볼 수 있다. 또한, 용해도는 약물의 특성에서 매우 중요한 문제로 높은 수용성 제제로서 가돌리늄 화합물은 플라보노이드의 용해도를 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 화합물 합성 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2a-2c는 본 발명에 따라 합성된 화합물들의 HR-FAB-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 3a-3c는 본 발명에 따라 합성된 화합물들의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 합성된 화합물들의 유리 가돌리늄 이온의 존재를 아르세나조(arsenazo) III 용액을 사용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5 내지 도 19는 본 발명의 실험예에 따른 결과 등을 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 화합물에 포함된 플라보노이드 작용기의 화학 구조를 나타낸다.
도 21은 본 발명에 따라 합성된 Gd-galangin의 항염 메커니즘을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 실시예에 따른 화합물은 하기 화학식 (1)을 가질 수 있다.
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000004
(1)
상기 화학식 (1)에서 가돌리늄 이온 (Gd3+)는 상기 화학식 (1)의 카르복실레이트 (carboxylate; COO-) 기와 배위하여 착화합물을 형성할 수 있다.
상기 화학식 (1)에서 L은 *-(CH2)x-A1-(CH2)y-A2-(CH2)z-*일 수 있고, x,y 및 z는 0 내지 5의 임의의 정수로 각각 독립적으로 선택될 수 있고, A1 및 A2는 단일 결합, *-COO-*, *-CO-*, *-NH-*, *-CH2-*, *-CONH-* 및 *-O-* 를 포함하는 군에서 각각 독립적으로 선택된 하나 이상의 구조일 수 있다. *은 결합 자리이다.
상기 L은 상기 화합물의 고리형 구조 내 질소와 상기 X를 연결하는 링커(linker)일 수 있다. 상기 A1 및 A2는 상기 링커가 상기 화합물의 고리형 구조 내 질소와 상기 X를 연결하는 방법 또는 그 방법에 의해 결정되는 작용기를 결정할 수 있다. 상기 x, y 및 z는 상기 링커 내 상기 A1 및 A2를 연결하는 사슬의 길이를 결정할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 A1은 *-COO-* 이고, 상기 A2 는 *-O-* 일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 x는 1 일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 y는 3 일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 z는 0 일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 화합물은 실질적으로 상기 화학식 (1)의 구조를 가지는 한, 당업자에게 허용 가능한 결합 또는 결합의 제거를 본 발명의 범위에서 배제하지 않는다. 일례로, 일 실시예에 있어서, 상기 화합물에서 상기 가돌리늄(Gd)이 하나 이상의 물 분자와 배위할 수 있다.
상기 화학식 (1)에서 X는 하기 화학식 (2)를 가지는 구조일 수 있다.
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000005
(2)
여기서, R1 및 R2는 하이드록시기를 나타내고, *은 결합 자리이다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (3)으로 표시될 수 있다.
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000006
(3)
여기서, R1 및 R2는 하이드록시기를 나타낸다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 정맥 투여가 가능할 정도로 충분한 용해도를 가지기 때문에 소량으로도 플라보노이드 자체의 항산화, 항염, 항암 효과를 빠른 시간에 극대화하여 염증 또는 암의 치료 효과를 높일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은, 염증성 질환을 표적하고 염증 부위에 항염증 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은, 높은 용해도에 기인하여 상기 화합물을 정맥 투여하는 경우, 염증성 질환, 특히 간염을 특이적으로 표적하여 높은 조영 효과를 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물은 염증성 질환의 진단 또는 치료 용도로 활용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 염증성 질환은 간염일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 암을 표적하고 항암 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 높은 용해도에 기인하여 상기 화합물을 정맥 투여하는 경우, 암, 예를 들어 간암과 같은 중증 질환을 특이적으로 표적하여 높은 조영 효과를 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물은 암의 진단 또는 치료 용도로 활용될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 목적을 위한 MRI 조영제는 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 MRI 조영제는 T 1 MRI 조영제로서 간염 주변의 대조도(contrast)가 뛰어나 진단하기 용이하며, 간염의 표적 진단 및 치료가 용이하다.
일 실시예에 있어서, 상기 MRI 조영제는 정맥 투여되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 MRI 조영제는 특히 염증성 질환 또는 암의 진단 및 치료에 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 MRI 조영제는 간염과 같은 염증성 질환의 표적 진단 및 치료에 사용할 수 있다.
다른 예로, 상기 MRI 조영제는 항암 활성을 가지며, 암의 표적 진단 및 치료에 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 화합물은 간암세포인 HepG2에 대하여 상용 MRI 조영제(Gadovist®)보다 약 1.5배 높은 조영 효과를 보이며 암에 대한 표적 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 실시예로 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함하고, 염증 부위를 표적하고 염증 부위에 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 정맥 투여용 항염증제를 제공할 수 있다. 본 발명의 정맥 투여용 항염증제는 염증 부위를 표적 진단하고 치료 효능을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 간염을 특이적으로 표적하고, 간염에 대해 항염증 활성을 나타내어, 간염에 대한 표적 및 치료 효능을 동시에 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 실시예로 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 포함하고, 항산화 효능을 갖는 정맥 투여용 항산화제를 제공할 수 있다.
이하에서는, 구체적인 실시예들을 통해서 본 발명에 따른 신규 화합물 및 이를 포함하는 MRI 조영제의 특성에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
가돌리늄 착물 합성
7-히드록시플라본(7-Hydroxyflavone), 크리신(chrysin) 및 갈란긴(galangin)이 결합된 DO3A를 포함하는 가돌리늄 착물의 합성 개략도를 도 1에 나타냈다. 구체적인 합성 방법은 다음과 같다.
화합물 1a-1c 합성
1,3-디브로모프로판(10 eq)과 K2CO3(3 eq)의 아세톤 용액에 플라보노이드(1 eq) 함유 아세톤 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 60 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 상온으로 식힌 후 짧은 실리카겔 컬럼(5% methanol/CH2Cl2, v/v)으로 여과하여 무기염을 포함한 불순물을 제거하였다. 용매를 제거하고 혼합물 세척액을 저온에서 CH2Cl2/헥산 조건 하에 천천히 침전시켜 1,3-디브로모프로판을 분리하였다.
이후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(0-5% 메탄올/CH2Cl2, v/v)를 사용하여 정제하여 1a-c를 얻었다.
4-옥소-2-페닐-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트(2) 합성
갈란긴(3,5,7-트리히드록시플라본)(5.4328g, 20mmol)을 THF(200mL) 및 트리에틸아민(34mL, 240mmol)에 용해시켰다. 혼합물에 아세트산 무수물(24mL, 240mmol)을 첨가하고 실온에서 24-48시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC(헥산:에틸 아세테이트 = 1:1)로 모니터링하고 출발 물질이 사라질 때까지 교반하였다. 용매를 제거하여 미정제 혼합물이 남았고, 이를 에틸 아세테이트(300mL) 및 물(100mL)로 희석했다. 수성 층을 5% NaHCO3 용액으로 pH 7로 조절하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, Na2SO4를 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 10% 에틸 아세테이트/헥산(v/v)으로 세척하였다. 이후, 생성물(2)을 백색 고체(7.160g, 90%)로 얻었다. mp 146-148 ℃.
7-히드록시-4-옥소-2-페닐-4H-크로멘-3,5-디일 디아세테이트(3) 합성
생성물 2(7.927g, 20mmol)를 질소 하에서 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)(150mL)에 용해시키고 용액을 0℃로 냉각시켰다. 온도를 유지하면서 티오페놀(2.644g, 24mmol)을 첨가한 후, NMP에 용해된 이미다졸(0.477g, 7mmol)을 시린지하였다. 혼합물을 천천히 실온으로 올리고 6-12시간 동안 반응시켰다. 반응을 TLC(헥산:에틸 아세테이트=1:1) 출발물질이 없어질 때까지 교반하였다. 이후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 1M HCl 및 염수로 세척하였다. 다음으로 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축하였다.
잔류물을 10% 에틸 아세테이트/헥산 및 10% IPA/헥산(v/v)으로 세척하였다. 생성물(3)을 백색 또는 담황색 고체(13.122g, 93%)로 얻었다. mp 222-224 ℃.
화합물 6, 7 합성
5(1 eq)를 THF에 용해시키고 트리에틸아민(3 eq)을 첨가하였다. 1a-c(1.2 eq)의 THF 용액을 천천히 첨가하고 40 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 실온으로 냉각시키고 짧은 실리카 겔 컬럼(5% 메탄올/CH2Cl2, v/v)을 통해 여과하여 무기 불순물을 제거하였다. 이후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(0-5% 메탄올/CH2Cl2, v/v)를 사용하여 정제하여 6a-c를 얻었다.
다음으로, 6a-c을 1,4-디옥산에 용해시키고 HCl을 0 ℃에서 천천히 첨가하였다. 반응물을 교반하고 천천히 40 ℃에 도달하도록 하였다. 12시간 후 용매를 제거하면 미정제 혼합물이 남고 이를 물로 희석하고 여과했다. 이후, C18 실리카(5-95% 아세토니트릴/물) 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 7a-c를 수득하였다.
화합물 8 합성
7a-c(1 eq) 및 GdCl3ㆍ6H2O(1-1.2 eq)를 탈이온수에 용해시키고 1M NaHCO3 용액을 사용하여 pH 6까지 반응 혼합물의 pH를 조절하였다. 이후, 혼합물을 실온에서 교반하고 TLC 및 LC-MS로 모니터링하였다. 혼합물을 5,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.25㎛ 필터로 여과하였다. 다음으로, C18 실리카(5-95% 아세토니트릴/물) 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 8a-c를 수득하였다.
도 1을 참조하면, 플라보노이드 고리 A의 7번 위치에 있는 하이드록시기는 다른 위치의 하이드록시기에 비해 더 산성이며, 반응성이 높은 7번 위치의 하이드록시기는 링커로서 작용하여 1,3-디브로모프로판에 결합된 1a-c가 합성되었다. 아세틸기로 보호된 갈란긴 중간체(2)는 이미다졸 및 티오페놀(PhSH)과 반응하여 링커가 동일한 위치에서 반응하도록 하였다(3).
한편, tBu-DO3A-COOH(5)를 합성한 후, 중간체 6a-6c은 트리에틸아민 및 테트라히드로푸란(THF) 조건 하에서 1a-c와 에스테르 결합을 형성하였다. 이후, tert-부틸 및 아세틸 그룹을 염산으로 탈보호한 후(7a-c), GdCl3ㆍ6H2O 및 1M NaHCO3의 존재 하에서 가돌리늄 착물(8a; Gd-flavone, 8b; Gd-chrysin, 8c; Gd-galangin)을 합성했다.
대부분의 반응은 80% 이상의 양호한 수율을 제공했으며, Gd-galangin의 수율은 반응 시간, pH 및 온도에 따라 다를 수 있음(44.41% ~ 67.95%)을 확인했다.
합성된 물질은 1H NMR, 13C NMR, HR-FAB-MS, 녹는점 분석을 통해 확인하였다(도2a-2c). 또한, 가돌리늄 착물(8a-c)의 순도는 HPLC 분석(도 3a-3c)을 기반으로 결정되었고, 유리 가돌리늄 이온의 존재는 아르세나조(arsenazo) III 용액을 사용하여 확인되었다(도 4).
실험예 1: 가돌리늄-플라보노이드 착물의 특성 평가
합성된 가돌리늄 착물의 물리화학적 특성
Gd-flavone, Gd-chrysin, Gd-galangin과 다른 상용 조영제들의 r1 및 r2 이완성은 탈이온수, 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 0.67mM 인간 혈청 알부민(HSA) 용액에서 5가지 농도(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1mM)로 각각 측정되었다(표 1 참조).
[표 1]
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000007
* Values are expressed as mean SD (n = 3)
표 1을 참조하면, 합성된 세 가지 화합물 중 Gd-galangin이 가장 큰 r1 이완성을 나타냈고, Gd-flavone, Gd-BT-DO3A 및 Gd-DOTA는 유사한 값을 나타냈다. 또한, 0.67mM HSA가 포함된 용액에서, Gd-chrysin이 다른 화합물보다 약간 더 높은 수준의 r1 이완성을 보이는 결과를 확인하였다.
한편, Gd-flavone, Gd-chrysin 및 Gd-galangin의 상대 극성을 계산하기 위해 옥탄올-물 분배 계수(log P)를 공지된 방법을 통해 계산하였고, 각각 -1.40, -0.91 및 -0.74의 값을 얻었다(표 1 참조). 비교를 위해 임상적으로 사용되는 약제인 Gd-BT-DO3A(-3.13) 및 Gd-DOTA(-3.09)의 log P 값도 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 새로운 가돌리늄 착물의 친유성(lipophilicity)이 현재 임상 환경에서 사용되는 가돌리늄 착물의 친유성보다 상당히 높다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 화합물에 존재하는 폴리페놀 하이드록시기의 존재에 기인한다. log P 값이 이완성 및 단백질 결합과 높은 상관관계가 있는 점을 고려하면, Gd-flavone, Gd-chrysin 및 Gd-galangin의 높은 이완성은 높은 친유성과 관련이 있는 것을 알 수 있다.
동역학 안정성 평가
Zn2+, Cu2+ 및 Ca2+를 포함한 내인성 금속 이온은 킬레이트에 대해 Gd3+ 이온과 경쟁할 수 있으므로 Gd 이온 손실이 발생하여 NSF(nephrogenic systemic fibrosis)과 같은 질병을 유발하거나 또는 뇌에 Gd3+ 이온 침착과 같은 질병이 유발할 수 있다.
Gd-DTPA 및 Gd-DTPA-EOB와 같은 선형 킬레이트와 비교하여 Gd 기반 거대고리형 킬레이트는 더 높은 운동 비활성을 특징으로 한다. 도 5(a)를 참조하면, 평가된 화합물 중에서 Gd-galangin이 가장 높은 운동 비활성(kinetic inertness) 값을 나타냈고, Gd-BT-DO3A 및 Gd-DOTA와 동일한 거대고리형 킬레이트 구조를 갖는 Gd-flavone 및 Gd-chrysin은 유사한 값을 나타냈다. 또한, R2 완화 속도를 72시간 동안 모니터링한 결과, 선형 DTPA 아날로그는 R2 값의 상당한 감소를 나타냈다.
또한, pH 1에서 11까지의 다양한 pH 값과 대조군으로서 Gd-BT-DO3A의 시간 경과에 따른 Gd-flavone, Gd-chrysin 및 Gd-galangin의 R2 이완성 관련 안정성을 평가하였다. 그 결과를 나타낸 도 5(b)-(d)를 보면, Gd-flavone, Gd-chrysin 및 Gd-galangin은 R2 값이 pH 3에서 11까지의 광범위한 pH 값에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지됨을 확인했으며, 합성된 가돌리늄 착물이 산성 및 염기성 조건 모두에서 충분히 안정적임을 확인하였다. 이러한 결과는 Gd-flavone, Gd-chrysin 및 Gd-galangin이 생체 내에서 충분한 안정성을 유지함을 확인시켜준다.
실험예 2: 가돌리늄-플라보노이드 착물의 용해도 평가
실시예에 따라 불용성 물질인 7-hydroxyflavone, chrysin, galangin을 수용성 가돌리늄 복합체로 합성하고, 정맥 주사 제제로 활용하기 위한 용해도를 평가하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2023014251-appb-img-000008
상기 표 2는 플라보노이드인 7-hydroxyflavone, chrysin, galangin과 7-hydroxyflavone, chrysin, galangin을 수용성 가돌리늄 복합체로 합성한 물질들의 물에 대한 용해도를 25℃에서 평가한 결과를 나타낸다.
표 2에 나타나듯이, 플라보노이드인 7-hydroxyflavone, chrysin, galangin은 거의 물에 녹지 않는 불용성 물질이다. 이러한 물질은 체내 흡수가 어렵고 낮은 생체이용률을 보이기 때문에 물질에 대한 항염, 항산화, 항암 효능을 기대하기 어렵다.
반면, 수용성 가돌리늄 복합체의 경우, 조영제 관련 실험을 진행하기 위해 주로 활용되는 50 mM을 기준으로, 그 이상 모두 용해가 가능하며 특히 Gd-galangin의 경우는 100 mM 까지 용해되어 유지되는 결과를 보였다.
도 6은 합성된 수용성 가돌리늄 복합체들의 3차 증류수, 식염수, PBS에 대한 용해 직후, 및 용해 30분 후, 2시간 후의 모습을 관찰한 이미지를 나타낸다. 왼쪽부터 Gd-galangin, Gd-chrysin, Gd-flavone 순이다.
도 6을 보면, 용해된 직후에는 합성된 가돌리늄 복합체 3종이 모두 용해되었으나, 30분이 지난 후에는 Gd-flavone이 뿌옇게 석출되었다. 용해 후 2시간이 지나면, 3차 증류수와 PBS에 용해된 Gd-chrysin은 침전되기 시직하며, 식염수에서는 상대적으로 석출되는 속도가 느렸다. Gd-galangin은 7일이 지나도 석출되지 않고 용액으로 존재하였으며, Gd-chrysin, Gd-flavone에 비해 뛰어난 용해도를 보여준다.
수용액 상태가 유지되는 것은 물질의 안정성과도 연관이 되는데, 합성된 가돌리늄 복합체 3종은 유사한 구조를 가지나, 오직 Gd-galangin만이 높은 용해도를 유지하는 결과를 보였다. 이러한 결과를 통해, Gd-galangin은 주사 제제로 가장 적합함을 확인하였다.
Gd-galangin은 불용성 물질인데, 이를 가돌리늄 복합체로 합성하여 용해도를 증가시킴으로써 정맥 투여가 가능하며, 정맥 주사 제제로 활용하면 직접적인 약물의 전달이 가능해 항염증, 항산화, 항암 효능의 증대를 기대할 수 있다.
실험예 3: 가돌리늄-플라보노이드 착물의 세포 독성 실험
RAW 264.7 cell에 대한 독성 실험으로 플라보노이드 3종 (7-hydroxyflavone, chrysin, galangin)과 이를 모이어티로 합성한 가돌리늄 복합체 3종(Gd-flavone, Gd-chrysin, Gd-galangin)을 비교하였다.
그 결과를 나타낸 도 7을 보면, 약물 농도 0에서 100 uM 까지에 대한 독성 결과 본 발명의 실시예에 따라 합성된 Gd-flavone, Gd-chrysin은 7-hydroxyflavone, chrysin과 유사하거나 오히려 증가된 결과를 보여준다. 그러나, Gd-galangin은 50 uM 에서 독성을 보이지 않으면서 galangin과 차이를 보여준다.
이와 같이, 세포 독성 실험에서 Gd-galangin은 플라보노이드 3종과 가돌리늄 복합체 3종 중에서 가장 낮은 수치를 나타냈다. 이러한 결과는 합성된 가돌리늄 복합체 중 Gd-galangin이 가장 임상에 적합함을 보여준다.
실험예 4: 가돌리늄-플라보노이드 착물의 항산화 효능 평가
DPPH, FRAP, ABTS 자유 라디칼 소거 활성 in vitro 실험
자유라디칼은 체내에서 세포를 파괴하는 유해물질이며 염증과의 관계는 많이 알려져 있다. 다량의 자유라디칼을 제거하는 항산화 작용은 매우 중요하다. 자유라디칼 소거 활성을 평가하기 위하여 DPPH, FRAP, ABTS 실험 진행하였다. 홑전자를 가져 반응성이 높은 시약을 자유라디칼을 생성하고 약물과 반응시 분광 광도계를 사용하여 파장이 흡수되는 차이를 측정하여 비교하는 실험이다. 대조군으로 대표적인 항산화제인 ascorbic acid(AA)와 trolox(TR)를 사용하였다.
도 8을 참조하면, Gd-flavone과 Gd-chrysin 모두 라디칼을 제거하지 못하는 반면에 Gd-galangin은 FRAP과 ABTS에서 ascorbic acid(AA)와 Trolox(TR)의 효능과 비슷한 라디칼 소거능(Radical Scavenging Activity)을 보여주었다. 이는 Gd-galangin이 가장 뛰어난 항산화 효과를 가지는 것을 보여주는 결과이다.
자유라디칼 제거 효과 비교 in vivo 실험
루미놀 유도체 L-012는 루미놀 자체보다 활성이 큰 것을 특징으로 하는 고감도 화학발광 소재이다. 체내에서 생성된 다양한 ROS와 반응하지만 활성시간이 제한적이기 때문에, 약물의 효능 비교를 위해서 L-012를 반복 투여하고, 자유라디칼 제거 효과를 비교하였다.
그 결과를 나타낸 도 9를 보면, LPS에 의해 생성된 ROS 소거능(ROS Scavenging Affinity)는 생리식염수(saline)와 비교했을 때 Gd-galangin이 현저하게 감소하였기에 생체 내 ROS 거능(ROS Scavenging Affinity)을 입증하였다.
실험예 5: Gd-galangin의 항염증 효능 평가
LPS 유도 iNOS 및 NO 억제에 대한 in vitro 실험
iNOS(inducible nitric oxide synthase)는 염증 반응 시 각종 세포에서 발현되는 염증성 사이토카인 등에 의해 유도되는 단백질로, 산화적인 환원 작용을 수행하며 NO(nitric oxide)를 생성한다. NO는 혈관확장 작용, 혈소판 집합 억제, 신경전달 등 다양한 생리적 작용을 수행하며, 염증 반응에서도 중요한 역할을 한다.
LPS가 대식세포(macrophage)와 쿠퍼세포(Kupffer cell)에서 발현된 iNOS가 Raw 세포(Raw cell)에서 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타나듯이 LPS에 의해 증가된 NO에 대해서는 Gd-galangin이 50 uM 에서부터 감소시켰고, iNOS는 농도에 맞춰서 감소하는 경향을 보이는데, 이러한 결과는 Gd-galangin이 iNOS 발현 감소를 통해 LPS 유도 NO 생성 억제에 기여함을 보여준다.
NLRP3 인플라마좀 활성 억제에 대한 in vitro 실험
한편, NLRP3 인플라마좀 활성(NLRP3 inflammasome activation)과 관련하여 Gd-galangin의 억제(inhibition) 능력을 평가하기 위해, ASC, IL-1β 및 NLRP3의 발현을 하향 조절하는 능력을 확인하고, 그 결과를 도 11에 나타냈다.
그 결과를 보면, RAW cell LPS 단독으로 처리한 결과, NLRP3 및 ASC의 발현이 증가되었고, 이는 NLRP3 인플라마좀 활성화를 촉진할 수 있다. Gd-galangin의 투여는 LPS에 의해 유도된 NLRP3 발현을 약간 줄이는 것으로 보이며, 반면 LPS 처리에 대한 반응으로 생성된 ASC 및 IL-1β은 농도 디펜던트하게 감소하였다. 이러한 결과는 Gd-galangin이 NLRP3 및 ASC와 이들의 염증 유발 생성물인 IL-1β의 발현을 억제하여 항염증 효과가 있음을 보여준다.
NLRP3, ASC, iNOS에 대한 in vivo 실험
도 12는 LPS로 유도된 근염 동물 모델에서 염증 조직에 대한 웨스턴블랏 결과로, In vitro 실험 결과와 마찬가지로 LPS는 iNOS와 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 관련 요인의 발현을 촉진하였고 Gd-galangin 투여로 이러한 염증 반응이 억제되는 것을 확인하여 in vivo 에서도 항염 효능을 입증하였다.
Galangin과 Gd-galangin의 항염증 효과 비교 in vivo 실험
H & E
도 13은 LPS로 유발된 염증 조직에 대한 H&E 염색(staining)으로 조직학적 평가 결과이다. 도 13을 보면, LPS 투여군에 비하여 정상 세포(Normal)의 경우 세포간 간격이 매우 촘촘한 상태인 것을 확인할 수 있다. 한편, LPS 단독 군에 비하여 Gd-galangin을 정맥 주사한 경우와 galangin을 경구 투여 했을 때 모두 더 나은 상태를 보여주지만, 세포간 간격이 galangin이 전반적으로 더 벌어져 있어서, Gd-galangin을 정맥 투여한 쪽이 정상 조직 상태와 더 가까운 결과를 보였다.
면역조직화학(IHC)
도 14는 Galangin과 Gd-galangin의 항염증 효능을 평가하기 위한 in vivo 실험 결과로, 면역조직화학염색 결과를 보여준다. 항원-항체 반응을 이용하여 특이적으로 검출하는 방법인 면역조직화학염색법(IHC)으로 관찰하고자 하는 표적 단백질이 항원이면, 표적 단백질에 대한 항체는 그 단백질만을 특이적으로 인식하고 결합한다. 이를 관찰하고자 표지자를 붙여 발색시켜 검출하게 된다.
도 14를 보면, LPS에 의한 염증이 유도될 때 ASC, iNOS, NLRP3, IL-1β 모두 발현되는 것을 볼 수 있다. 이후, Galangin 군보다 Gd-galangin 군이 뚜렷하게 감소된 결과를 확인할 수 있다. 이는 용해도가 증가된 Gd-galangin을 정맥 주사했을 경우, 구강 투여된 galangin 보다도 빠르고 효과적으로 항염증, 항산화 효과가 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 6: Gd-galangin의 염증에서 MR 진단 대상의 생체 내 평가
Gd-galangin의 진단적 이미징 특성은 LPS로 유발된 염증의 마우스 모델을 사용하여 평가되었다. LPS 주입 24시간 후, Gd-galangin과 Gd-BT-DO3A(대조군)를 같은 농도(0.1mmol Gd/kg)로 정맥 주사하고 3.0 T에서 전신 및 염증부위의 관상면(coronal) 및 축방향(axial) T1 강조 MR 영상을 얻었다.
도 15(a) 및 (b)를 보면, 간 및 염증성 병변의 MR 영상 대조는 Gd-galangin 및 Gd-BT-DO3A 처리 마우스 사이에 유의한 차이를 나타냈다. Gd-galangin이 최대 3시간 동안 높은 신호 강도를 유지했다. 이 향상 패턴은 생체 분포 결과와 일치한다(도 15(d)).
담낭의 신호 강도는 정맥 주사 1시간 후 강화되었으며, 간담도기 동안 조영제가 간세포에 흡수된 후 담도 경로를 통해 배설됨으로써 간담도 배설 조영제의 특징적인 강화 패턴을 나타냈다.
가돌리늄 착물의 플라보노이드 부분은 높은 친유성을 부여하고 Gd-galangin은 간과 담낭에서 더 높고 더 긴 신호 강도를 유지할 수 있다.
염증 부위에서 CNR을 기반으로 측정된 Gd-galangin의 신호 향상은 최대 1.5시간 동안 계속 증가하여 Gd-BT-DO3A를 사용하여 얻은 것보다 약 5배 더 강한 CNR 차이를 나타냈다. 또한, 염증 조직에서 신호 향상이 최소 3시간 동안 유지되었다(도 15(c)).
Gd-galangin의 높은 친유성으로 인해 체내 체류 시간이 연장되어 염증 조직에 대한 이 제제의 표적 능력이 향상되어 MRI를 이용한 염증 진단에 유리한 결과를 확인하였다.
실험예 7: 간염에 대한 Gd-galangin의 항염증 효능 평가
간염은 간세포 조직에 염증이 생긴 것으로 바이러스, 독성에 의한 급성 간염과 알코올성, 비알코올간염과 같이 만성 간염이 있다. 여러 치료 방법이 있겠지만, 염증에 대한 치료가 가장 우선이라고 할 수 있다. 염증 치료를 통하여 만성 질환으로의 진행을 늦추거나 막을 수 있기에 염증에 대한 표적 치료는 매우 중요하다.
대사 장애는 산화 스트레스가 증가하고 DNA 손상과 관련이 있는데 이는 PARP 활동을 유도하게 된다. PARP의 과다 활성화는 ATP와 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide) 고갈을 야기하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. PARP 발현이 여러 간염에서 관련이 있으며 세포 사멸을 검출하기 위한 지표로 활용이 된다.
도 16을 보면, LPS와 D-갈락토사민(D-galactosamine)로 유도된 급성 간염 동물 모델에 대한 Gd-galangin 정맥 주사와 galangin 구강 투여에 대하여, 염증 인자인 NLRP3와 PARP의 경우 Galangin의 경우 아무런 효과를 보이지 않았으며, Gd-galangin (0.1 mmol/kg)에 대해서 통계적으로 유효한 결과를 보여준다.
Gd-galangin이 LPS로 유도된 MAPK 신호전달 경로에 미치는 영향
MAPK 신호 전달 경로에 대한 Gd-galangin의 영향을 조사했다. RAW 264.7 세포의 LPS 자극에 대한 반응으로 Erk, JNK, p38의 인산화를 검출하였으며, 이는 일반적으로 30분에서 1시간 동안 높은 수준으로 유지되었다(도 17 참조). 그러나, 처리 후 3시간에 이들 MAPK 경로 구성원 세 개 모두 낮은 수준의 인산화를 보였다.
도 17(a)-(c)에서 볼 수 있듯이 Gd-galangin의 투여는 인산화된 Erk와 p38의 수준을 크게 변경하지는 않았으나, 인산화된 JNK 수준의 감소를 효과적으로 촉진하였다. 이러한 결과는, Gd-galangin의 항염증 활성이 특히 JNK와 관련하여 MAPK 신호 전달의 억제를 통해 적어도 부분적으로 매개된다는 것을 의미한다.
NF-kB의 전위 및 IkBα의 인산화 억제를 통한 Gd-galangin의 항염 효과
도 18(a)-(c)를 보면, LPS 처리 RAW 264.7 세포에 대한 반응으로, 처리되지 않은 세포에 비해 세포질에서 NF-kB의 낮은 수준과 축적되는 경향을 확인했다. 이는 LPS 자극이 NF-kB의 핵 전위를 촉진한다는 것을 나타낸다. 반면, Gd-galangin 처리에 대한 반응으로 우리는 NF-kB의 세포질 수준이 유지되는 반면 핵에서 상당한 감소가 있음을 확인했다. Gd-galangin이 NF-kB의 핵 전좌를 억제함을 의미한다.
한편, 도 18(c)를 보면, LPS가 IkBα의 인산화를 촉진하는 반면 인산화된 IkBα의 낮은 수준이 Gd-galangin의 투여 후에 검출되었다. 이러한 결과는 Gd-galangin이 IkBα의 인산화에 대한 억제 효과를 통해 NF-kB의 핵 전좌를 억제한다는 것을 나타낸다.
Nrf2 및 HO-1 발현을 통한 Gd-galangin의 항염 효과
산화 스트레스에 대한 반응으로 Nrf2는 항산화 반응을 활성화하기 위해 HO-1 상향 조절을 매개한다. 이에, Gd-galangin 의 Nrf2 신호 전달 경로의 관련성을 조사하고, 그 결과를 도 19에 나타냈다.
도 19(a)를 참조하면, LPS에 의해 자극된 Nrf2의 상승된 인산화는 Gd-galangin 처리에 의해 더욱 증가되었다. LPS 자극 12시간 후, LPS만 처리된 그룹과 Gd-galangin 처리된 그룹 사이에 명확하고 통계적으로 유의미한 차이를 감지했다.
한편, HO-1 발현과 관련해서, LPS 자극 후 최대 6시간까지 LPS 단독 처리군과 Gd-galangin 처리군 사이에 유의한 차이가 없었지만, Nrf2의 인산화에 대한 반응으로 12시간 후 HO-1 발현과 관련하여, Gd-galangin 처리된 세포에서 더 현저한 증가가 관찰되었다(도 19(b)).
이러한 결과는 Gd-galangin이 Nrf2의 인산화를 촉진하고 HO-1의 상향 조절된 발현을 촉진하여 항산화 효과가 있음을 나타낸다.
결론
본 발명은 플라보노이드와 결합된 가돌리늄 기반 조영제의 염증에 대한 진단 능력을 평가하였다. 플라보노이드와 그 유도체는 뇌염, 간염, 류머티즘과 같은 염증성 질환과 암, 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 심각한 질병의 예방 및 치료에 효과가 있음이 알려져 있다. 그러나, 대부분의 플라보노이드는 용해도가 매우 낮거나 물에 녹지 않기 때문에, 종래의 플라보노이드 물질은 경구 투여 방식으로 투여되었다. 경구 투여는 편의성, 환자 순응도 및 교차 감염 위험 감소로 인해 약물 투여에 가장 선호되는 방법이다.
경구용 약물은 대부분 소화나 대사의 형태로 흡수되며, 구조는 신체에 매우 제한적으로 흡수된다. 이와 같이, 낮은 투과성 및 안정성으로 인해 제한된 생체이용률을 나타내어 치료제로서의 효과를 심각하게 감소시키는 문제점이 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 DO3A 킬레이트 물질과 플라보노이드를 결합시켜 물에 대한 용해도를 증가시켰으며, 결합 부분으로 인한 높은 친유성은 세포 내 확산 능력을 증가시킬 수 있다.
합성된 DO3A-galangin의 용해도 및 친유성 개선으로 인해 정맥 주사가 가능하며, 이로 인해 소량의 주입으로도 플라보노이드의 빠르고 즉각적인 항염증 효과를 구현할 수 있다.
도 20을 보면, 플라보노이드의 기본 골격 중 4-카보닐 그룹, C2=C3 이중 결합 및 C3 위치의 하이드록실 그룹은 시너지 효과를 통한 라디칼 제거 및 항산화 기능에 매우 중요한 역할을 한다. 고리 B는 더 많은 공명 및 결합 부위를 제공하고 크로몬을 지원하는 크로몬 모이어티와의 접합에 기인한다.
연결기 합성은 7번 위치의 수산기 특유의 높은 반응성을 이용하였으며, 연결기를 통해 DO3A와 에스테르 결합을 하여 높은 수율로 본 발명의 가돌리늄 화합물이 합성되었다.
도 1을 참조하면, DO3A-플라보노이드는 항산화 효과를 위한 활성 부위를 유지하고 합성 효율을 높이도록 설계되었다. 에스테르 결합을 기반으로 한 DO3A와 플라보노이드 결합 부분은 에스테라아제에 작용하기 어려운 큰 구조를 가지고 있기 때문에 분해시 보호되며, 이로 인해 합성된 물질은 높은 안정성을 갖는다.
한편, 플라본(Flavone), 크리신(Chrysin) 및 갈란긴(Galangin)은 고리 A와 C에 대한 수산기의 위치와 수에 차이가 있다. 앞서 언급한 구조적 특징을 고려할 때, 갈란긴(galangin)에서 가장 큰 효과를 기대할 수 있으며, 이는 새로 합성된 구조로 실시한 라디칼 소거능 시험(DPPH, FRAP, ABTS)에서 확인하였다. 특히, Gd-flavone과 Gd-chrysin의 결과는 위치 3에 있는 수산기의 중요성을 보여준다.
이를 바탕으로, Gd-galangin의 LPS로 유발된 염증에 대한 항산화 및 항염증 효과를 체외(in vitro) 및 체내(in vivo)에서 확인하였다.
Gd-galangin의 효과를 뒷받침하는 제안된 메커니즘은 도 21에 요약되어 있다. 염증 반응은 염증성 사이토카인과 케모카인이 지배하는 생존을 위한 중요한 반응이다. 본 발명의 Gd-galangin은 iNOS 및 NLRP3 인플라마좀 발현을 억제하면서 하위 요인인 NO 및 IL-1β의 발현을 조절한다. 특히, NLRP3 인플라마좀 활성화는 염증을 촉진하고 질병 발생을 유도하기 때문에 염증 치료의 표적이 된다. IL-1β는 활성화된 NLRP3 염증에 의해 성숙되는 염증성 사이토카인이다. Gd-galangin은 NLRP3 및 ASC 억제에 대한 기여로 인해 IL-1β 발현을 감소시킨다.
정상적인 조건에서 IkB는 NF-kB에 결합하여 핵으로의 전위를 억제한다. 대조적으로, LPS 유도 스트레스 조건 하에서 IkB의 인산화는 NF-kB의 방출을 유발하여 핵 전좌를 복원한다. Gd-galangin은 또한 IkB의 인산화 억제가 핵에 대한 NF-kB 전위를 억제함을 보여준다. 또한, 산화 스트레스에 대한 반응으로 Nrf2는 HO-1의 상향 조절을 매개하여 항산화 활동을 시작한다. HO-1의 이러한 상향 조절된 발현은 여러 메커니즘을 통해 산화환원 항상성의 유지에 기여한다. 이러한 과정에서 Keap1은 일반적으로 Nrf2에 결합하여 핵으로의 전위를 억제한다. Nrf2의 인산화가 Keap1과의 해리를 촉진하고, 이는 HO-1의 발현에 기여한다. Gd-galangin은 Nrf2의 인산화를 촉진하고 HO-1 발현을 상향 조절함으로써 항산화 효과를 나타낸다.
한편, MAPK 신호 전달 경로는 세포 생존과 사멸을 조절하는 세린/트레오닌 키나아제의 캐스케이드이고, Erk, JNK 및 p38은 인산화에 의해 LPS 자극 염증에 기여하는 MAPK 계열의 구성물질이다. Gd-galangin은 Erk, JNK, p38을 억제하는 경향을 보였고, 특히 JNK에 대한 항염증 활성이 높게 나타났다.
위와 같은 실험을 통해, 본 발명에 따라 합성된 Gd-galangin의 항산화 및 항염증 효과는 충분히 입증되었으며, 염증이 각종 질환의 중요한 요인이라는 점을 고려할 때, Gd-galangin은 다양한 염증성 질환에 대해 치료 효능을 나타낼 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 T1 MR 조영제로 활용된 Gd-galangin은 염증 조직인 간염에 대해 종래의 조영제보다 최대 5배 우수한 조영 증강 효과를 보였고, 3시간 이상 지속력을 유지하였다. 이러한 특징은 염증에 대한 진단 능력을 지원하는 갈란긴과 가돌리늄 킬레이트와의 조합으로 인해 발생하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2023014251-appb-img-000009
    (1)
    여기서,
    L은 *-(CH2)x-A1-(CH2)y-A2-(CH2)z-*이고,
    x, y 및 z는 0 내지 5의 임의의 정수로 각각 독립적으로 선택되고,
    A1 및 A2는 단일 결합, *-COO-*, *-CO-*, *-NH-*, *-CH2-*, *-CONH-* 및 *-O-* 를 포함하는 군에서 각각 독립적으로 선택된 하나 이상의 구조이고,
    X는 하기 화학식 (2)를 가지는 구조이고:
    Figure PCTKR2023014251-appb-img-000010
    (2)
    여기서, R1 및 R2는 하이드록시기를 나타내고, *은 결합 자리이다.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 (3)으로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2023014251-appb-img-000011
    (3)
    여기서, R1 및 R2는 하이드록시기를 나타낸다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가돌리늄(Gd)이 하나 이상의 물 분자와 배위하는,
    화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 MRI 조영제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 MRI 조영제는 간염을 표적 진단 및 치료하는 것을 특징으로 하는,
    MRI 조영제.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 MRI 조영제는 정맥 투여되는 것인,
    MRI 조영제.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 MRI 조영제는 항암 활성을 가지며, 암을 표적 진단 및 치료하는 것을 특징으로 하는,
    MRI 조영제.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하고, 염증 부위를 표적하고 염증 부위에 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 정맥 투여용 항염증제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항염증제는 염증 부위를 표적 진단 및 치료하는 것을 특징으로 하는,
    정맥 투여용 항염증제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 항염증제는 간염을 특이적으로 표적하고, 간염에 대해 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는,
    정맥 투여용 항염증제.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하고, 항산화 효능을 갖는 정맥 투여용 항산화제.
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