WO2024062675A1

WO2024062675A1 - 角層形成促進剤

Info

Publication number: WO2024062675A1
Application number: PCT/JP2023/018112
Authority: WO
Inventors: 忍中西; 大気筒井; 菜緒染井
Original assignee: 株式会社資生堂
Priority date: 2022-09-20
Filing date: 2023-05-15
Publication date: 2024-03-28

Abstract

嗅覚受容体の活性化を介した角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、メラニン産生抑制剤、及びそれらのスクリーニング法の提供。　ＯＲ１０Ａ６を指標とすることで、角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、及びメラニン産生抑制剤、のスクリーニングを行うことができる。

Description

角層形成促進剤

　本発明は、角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、及び皮膚バリア機能改善剤、及びメラニン産生抑制剤、並びにかかる剤のスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化による角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、及びメラニン産生抑制剤、かかる剤のスクリーニング方法、角層形成の促進、肌荒れの抑制、保湿機能の向上、皮膚バリア機能、メラニン産生の抑制のためのＯＲ１０Ａ６活性化剤、ＯＲ５Ｐ２活性化剤、及びＯＲ５Ｐ３活性化剤、並びにそれらを含む組成物に関する。

　嗅覚受容体は、主に鼻に存在し匂いを感知するセンサーとして機能するが、近年ある種の嗅覚受容体は鼻のみならず、皮膚などの器官にも存在し皮膚に好ましい効果をもたらすことが報告されている（非特許文献１）。例えば、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４は角化細胞にも存在し、ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストであるサンダロールの適用により角化細胞におけるＯＲ２ＡＴ４が活性化されると創傷治癒や角化細胞の増殖が促進されることや、ＯＲ２ＡＴ４が毛包の鞘細胞にも存在しておりサンダロールの適用により毛髪伸長を引き起こすことも報告されている（非特許文献２、３、特許文献１）。

　しかしながら、嗅覚受容体は哺乳類の種類によっては１，０００種類以上存在し、ヒトでは機能する嗅覚受容体だけでも約４００種類の存在が確認されている。その上、非常に多様な種類の匂いをかぎ分けることを可能とするため、これらの嗅覚受容体はそれぞれ１つではなく複数の物質に反応し多岐にわたる機能に関与する（非特許文献４）。例えば、汗腺に発現している嗅覚受容体ＯＲ６Ｃ７４、ＯＲ５１Ａ７、ＯＲ４Ａ１５は発汗調節に関与することが報告されている（特許文献２）。このように嗅覚受容体の種類及び機能は非常に多岐にわたるため、どのような嗅覚受容体皮膚に存在しその活性化により皮膚に好ましい影響を与える物質については未知の部分が多く、更なる探索が求められる。

特表２０１９－５１９５０２号公報特開２０２１－１２７２９３号公報

The American Physiological Society, June 13, 2018; p. 1739-1763; doi:10.1152/physrev.00013.2017 Experimental Dermatology, Volume 26, Issue 1, p. 58-65; doi:10.1111/exd.13132 Nature FEBRUARY 2019, volume 18, p. 116-138; doi:10.1038/s41573-018-0002-3 オレオサイエンス　第 15 巻第 9 号（2015）, p401-406 Pharmaceutics 2021, 13, 1314. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13081314

　本発明者らは、嗅覚受容体に着目したスキンケアについて鋭意研究を行っており、角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、メラニン産生抑制剤等の取得を目的とする。

　本発明者らは、嗅覚受容体であるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、及びＯＲ５Ｐ３が皮膚において発現すること、そしてこれら嗅覚受容体の１つであるＯＲ１０Ａ６のアゴニストによりＯＲ１０Ａ６の活性を向上することで角層形成促進等の皮膚に好ましい作用を奏することを見出し、本発明に至った。

　そこで本発明は下記に関する：
［１］
　ＯＲ１０Ａ６活性化剤を有効成分として含有する、角層形成促進剤。
［２］
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、角層形成促進剤。
［３］
　［１］又は［２］の角層形成促進剤を含有する、角層形成を促進するための組成物。
［４］
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、肌荒れ抑制剤。
［５］
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、保湿剤。
［６］
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、皮膚バリア機能改善剤。
［７］
　プロパン酸３－フェニルプロピル、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、メラニン産生抑制剤。
［８］
　角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のためのＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化剤。
［９］
　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性を指標とした角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、又はメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
［１０］
　候補物質を含む培地で生体試料を培養すること、
　生体試料におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性を測定すること、および
　対照に比較して前記ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性が増加した場合に、候補物質を角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制作用を有する物質として決定すること、
　を含む、［９］に記載のスクリーニング方法。
［１１］
　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性を決定するための試薬を含む、［９］又は［１０］のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を実施するためのキット。
［１２］
　対象のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３を活性化させることを含む、対象の角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のための美容目的の方法。
［１３］
　前記ＯＲ１０Ａ６の活性化は、［１］に記載の角層形成促進剤、［４］に記載の肌荒れ抑制剤、［５］に記載の保湿剤、［６］に記載の皮膚バリア機能改善剤、又は［７］に記載のメラニン産生抑制剤を対象に投与することにより達成される、［１２］に記載の方法。

　プロパン酸３－フェニルプロピル、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、又はＯＲ１０Ａ６活性化剤を適用することで、ＯＲ１０Ａ６の活性化を介して角層形成の促進、肌荒れの抑制、保湿機能の向上、皮膚バリア機能の向上、メラニン産生の抑制が可能になる。更に、ＯＲ１０Ａ６の活性を評価することにより角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制作用の評価が可能になる。かかる評価方法を利用し、角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、又はメラニン産生抑制剤をスクリーニングすることが可能になる。

図１は、角化細胞におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、ＯＲ５Ｐ３、及び内部標準としてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を示す。図２左は、角化細胞内Ｃａ²⁺濃度を蛍光強度比（Ｆ３４０／３８０）として示す。左図グラフの横軸は時間(分）であり、計測開始時点を０．０とし、約０．５分の時点で３ＰＰＰを添加した場合のＣａ²⁺濃度の経時的変化を示す。図２右は、左図のグラフについて、３ＰＰＰ添加によるＣａ²⁺濃度の変化を、計測開始時点の値に対する比として最大蛍光強度比（ΔＦ３４０／３８０）で示す。右図のグラフ中のそれぞれの点は、計測開始時点から１．５分以内における一定の時間間隔ごとの最大蛍光強度比（ΔＦ３４０／３８０）を示し、実線はその平均値を示す。上図は各濃度（１．０ｍＭ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ）の３ＰＰＰを添加した結果であり、下図は１．０ｍＭの３ＰＰＰを添加した場合のＯＲ１０Ａ６ノックダウン角化細胞（ｓｉＯＲ１０Ａ６：右）における３ＰＰＰ添加によるＣａ²⁺濃度の増加を対照非ノックダウン角化細胞（ｓｉＣｏｎｔ：左）と比較した結果である。＊＊＊、＊＊＊＊はＡＮＯＶＡ分散分析、Ｓｃｈｅｆｆｅ法により統計的有意差があることを示す（＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図３は、３ＰＰＰを添加した場合の角化細胞におけるＣＥ産生率（％）を示す。左図は１．０ｍＭの３ＰＰＰを添加（３ＰＰＰ＋）又は無添加（３ＰＰＰ－）の場合の非ノックダウン角化細胞におけるＣＥ産生率（％）を示す。右図は、１．０ｍＭの３ＰＰＰを添加（３ＰＰＰ＋）又は無添加（３ＰＰＰ－）の場合のＯＲ１０Ａ６ノックダウン角化細胞（ｓｉＯＲ１０Ａ６＋）におけるＯＲ１０Ａ６活性を対照非ノックダウン角化細胞（ｓｉＯＲ１０Ａ６－）と比較した結果である。実験はそれぞれｎ＝４で行い、エラーバーは平均値±ＳＤ、＊はｔ検定（左図）、ANOVA分散分析、Ｓｃｈｅｆｆｅ法（右図）により統計的有意差があり（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、ｎｓは統計的有意差がないことを示す。

　本発明は、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、メラニン産生抑制剤を提供する。

　プロパン酸３－フェニルプロピル（ＣＡＳ番号：１２２－７４－７）は、フローラル系の香気を有し、主に香料として使用される物質である。本明細書では、３ＰＰＰと称する場合がある。

　シトロネロール（ＣＡＳ番号：１０６－２２－９）は、ゼラニウム油、シトロネラ油などの精油に含まれ、バラ様の香気を有する香気成分である。

　フェネチルアルコール（ＣＡＳ番号：６０－１２－８）は、バラや酒などに含まれ、バラ様の香気を有し香料として利用されるほか、その抗菌作用により保存料などに利用される。

　αシンナミルアルコール（ＣＡＳ番号：４４０７－３６－７）は、桂皮アルコール等とも呼ばれ、シナモンの葉等に含まれ、ヒアシンス様の香気を有する。

　シクラメンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１０３－９５－７）は、シクラメン、スズラン様の香気を有するが天然には存在しない人工香料物質である。

　ゲラニオール（ＣＡＳ番号：１０６－２４－１）は、ゼラニウム油、パルマローザ油、シトロネラ油等に含まれ、バラ様香気成分として知られている。

　αイオノン（ＣＡＳ番号：１２７－４１－３）は、テルペノイドの一種であり、α-イオノン、β-イオノン、γ-イオノンの異性体のうちの１つである。異性体ごとに異なる香気を有し、α-イオノンは、スミレの花様の香気を有する。

　ネロール（ＣＡＳ番号：１０６－２５－２）は、ネロリ油、バラ油等に含まれバラ様の香気を有する香気成分である。

　ノナデカン（ＣＡＳ番号：６２９－９２－５）は、バラ油等に含まれワックス様のにおいを有する成分である。

　リナロール（ＣＡＳ番号：７８－７０－６）は、（Ｒ）体と（Ｓ）体が存在し、（Ｓ）体はオレンジ様、（Ｒ）体はラベンダー様の香気を有し香料として使用されるが、ゲラニオールやシトラールなどの合成原料としても使用される。ラセミ体が好ましく使用できる。

　リラール（ＣＡＳ番号：３１９０６－０４－４）は、リリアールとも呼ばれスズラン様の香気を有する香料である。

　フェニルプロピルアルコール（ＣＡＳ番号：１２２－９７－４）は、スパイス様の香気を有し、香料、保存料等として使用される。

　アンドロスタジエノン（ＣＡＳ番号：４０７５－０７－４）は、フェロモン作用を示すことが知られており、特有の香気を有し香水に調合されることもあるステロイドである。

　アンドロステロン（ＣＡＳ番号：４５３－４１－８）は、体臭の原因物質にもなる男性ホルモンであるが、その特有の匂いのため香水に調合されることもあるステロイドである。

　酪酸（ＣＡＳ番号：１０７－９２－６）は、特有の不快臭を有し、天然に広く分布する物質であるが、その特有の匂いのため香料に含まれることもある。

　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸は、嗅覚受容体の一つであるＯＲ１０Ａ６のアゴニストとして作用することが知られている。これらの物質は、主に匂い物質やフェロモン物質として知られているが、本発明者らにより角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及びメラニン産生抑制作用といった皮膚に好ましい作用を発揮することが見出された。とりわけ、かかる作用は、ＯＲ１０Ａ６の活性化を介して発揮される。これらの成分は、市販のものを用いても合成してもよい。

　また、上記以外の成分であっても、ＯＲ１０Ａ６を活性化することができれば角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及びメラニン産生抑制作用等の皮膚に好ましい作用を発揮することができると考えられる。更に、ＯＲ５Ｐ２およびＯＲ５Ｐ３もＯＲ１０Ａ６と同様に角化細胞において発現することが発見されたため、これらの嗅覚受容体も活性化させることにより角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及びメラニン産生抑制作用といった皮膚に好ましい作用を発揮することが期待される。従って、本発明は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及びメラニン産生抑制のためのＯＲ１０Ａ６活性化剤、ＯＲ５Ｐ２活性化剤、又はＯＲ５Ｐ３活性化剤も提供する。ＯＲ１０Ａ６活性化剤の例としては、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸等のＯＲ１０Ａ６アゴニスト作用を有する物質を有効成分として含む剤が挙げられる。中でも、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコールが好ましく、特にプロパン酸３－フェニルプロピルが好ましく使用できる。ＯＲ５Ｐ３活性化剤の例としては、１－オクタノール、アセトフォノン、及びクマリン等のＯＲ５Ｐ３アゴニスト作用を有する物質を有効成分として含む剤が挙げられる。

　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３は、嗅覚受容体の一種であり、それぞれＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。嗅覚受容体は、鼻腔内の嗅細胞の繊毛等に存在し、匂い分子が結合することにより、細胞のイオンチァネルが開かれ、ナトリウムイオンが細胞内へ流入すると活動電位が発生し、これにより匂い情報が脳へと伝達され匂いの知覚を引き起こす。上述のようにいくつかの嗅覚受容体では、鼻以外の組織にも存在し、匂い情報の伝達以外の作用にも関与することが報告されているが、本発明者らにより、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３が皮膚にも存在すること、更にはＯＲ１０Ａ６の活性化により角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及びメラニン産生抑制作用等の皮膚に好ましい作用を発揮することが発見された。

　一態様では、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化とは、例えば、生体試料におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量が、本発明のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化剤を添加すると、添加しない場合と比べて増加することを指す。例えば、増加は、有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する増加、及び／又は、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはそれ以上の増加を意味し得る。

　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３発現の測定は、生体試料におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定することにより決定することができる。ｍＲＮＡ量の測定としては、定量的ＰＣＲやノーザンブロティングなど本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。例えば、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３のｍＲＮＡに対するプローブを用いてもよい。タンパク質量については、ウエスタンブロッティング、免疫染色、ＩＣＭなどの本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。

　一態様では、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化は、それぞれ各嗅覚受容体にプロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、１－オクタノール、アセトフォノン、クマリン、その他匂い分子といったＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３に対する活性化作用を有する物質（例えば、上記各嗅覚受容体に対するアゴニスト等）が結合することにより、惹起される。ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化は、例えば、生体試料におけるこれらの受容体が存在する細胞内へのＮａ⁺、Ｋ⁺、又はＣａ²⁺等の陽イオンの流入により測定することができる。例えば、候補物質を添加すると添加前に比べて細胞内Ｃａ²⁺といった陽イオンが増加する場合、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化作用があると判断できる。例えば、陽イオン濃度の増加は、候補物質を添加した場合に、例えば有意水準を５％とした統計学的有意差（例えば、ＡＮＯＶＡ分散分析、Ｓｃｈｅｆｆｅ法等）をもって増加していること、あるいは、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはそれ以上増加することを意味し得る。陽イオンの流入は、限定されないものの、蛍光顕微鏡などを用いる細胞内イメージング等を行うことによって測定してもよい。

　対照のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化作用に比べて、候補物質を添加した場合の活性化作用が増加した場合、候補物質がＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化作用を有するものと決定することもできる。対照のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性化作用は、対照薬剤を添加した実験系や候補物質のみを含まない以外は同じ条件の実験系で決定されてもよいし、ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ等を介したＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３ノックダウン細胞や、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集等を介するノックアウト細胞を含む実験系で決定されてもよい。

　生体試料とは、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性が測定可能な細胞を含む試料であればよく、角化細胞以外の細胞が含まれていてもよい。角化細胞以外の細胞としては、嗅細胞等のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の存在が確認される細胞、あるいは、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３を有するように作成される細胞等が挙げられる。生体試料は、任意の動物由来であってよいが、化粧料や医薬品の開発の観点からはヒト由来が好ましい。生体試料としては、上記嗅覚受容体を測定可能な細胞、例えば、角化細胞又はその他のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性が測定可能な細胞の培養物であってもよいし、皮膚試料であってもよいし、３次元に構築された培養皮膚モデルを用いてもよい。

　角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用は、例えば、角化外膜（ＣＥと称することがある）を測定することにより確認できる。例えば、角化外膜の産生量は、角化細胞をβ－メルカプトエタノール等のアルコールやＳＤＳ等の界面活性化剤等を含む細胞溶解液等により溶解させ、溶液中で溶解せずに残った角化外膜の数をカウントすることにより求められる。例えば、このようにして測定された角化外膜の産生量が、候補物質を添加した場合の神経活性化作用が対照に比べて増加した場合、候補物質が角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用を有するものと決定することができる。例えば、角化外膜の産生量の増加は、候補物質を添加した場合に、対照に比べて例えば有意水準を５％とした統計学的有意差（例えば、ｔ検定、ダネットの検定等）をもって増加していること、あるいは、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、又はそれ以上増加することを意味し得る。対照の角化外膜の産生量は、対照薬剤を添加した実験系や候補物質のみを含まない以外は同じ条件の実験系で決定されていてもよいし、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３ノックダウン細胞やノックアウト細胞を含む実験系で決定してもよい。角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用は、角化細胞の増殖マーカー、目視検査、ＴＥＷＬ、特定のタンパクや脂質の測定等のＣＥ測定以外の方法によって確認することもできる。例えば、ＴＧＭ１（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－１）、ＦＬＧ（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＨＡＳ３（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ３）、ＧＢＡ（β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、ＩＬ－１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１　Ａｌｐｈａ）等の遺伝子発現量やタンパク質産生量を測定することにより確認することができる。メラニン産生抑制作用は、ＩＬ－１α、ＣＯＸ２等のメラニン産生に関与する遺伝子のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定することにより決定することができる。ｍＲＮＡ量の測定としては、定量的ＰＣＲやノーザンブロティングなど本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。例えば、ＴＧＭ１、ＦＬＧ、ＨＡＳ３、ＧＢＡ、ＩＬ－１α等のｍＲＮＡに対するプローブを用いてもよい。タンパク質量については、ウエスタンブロッティング、免疫染色、ＩＣＭなどの本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。例えば、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、又は皮膚バリア機能改善は、例えば、生体試料におけるＴＧＭ１、ＦＬＧ、ＨＡＳ３、ＧＢＡのｍＲＮＡ量又はタンパク質量が増加すること、及び／又はＩＬ－１αのｍＲＮＡ量又はタンパク質量が減少することにより確認できる。例えば、増加は、有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定、ダネットの検定）を有する増加、及び／又は、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはそれ以上の増加を意味し得る。例えば、減少は、有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定、ダネットの検定）を有する減少、及び／又は、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％以上の減少を意味し得る。

　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３ノックダウン細胞とは、例えば、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３遺伝子にノックダウン処置が施され、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の発現が損なわれた又は低減した細胞を指す。ノックダウン処置は、例えば、ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ等の任意の公知技術を用いることができる。ノックダウン処置によりＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３発現が損なわれた又は低減したとは、例えば、ノックダウン処置を施した細胞のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３遺伝子の発現量及び／又はＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３タンパク質量が、非ノックダウン細胞に比べて、例えば有意水準を５％とした統計学的有意差（例えば、ｔ検定等）をもって低減していること、あるいは、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％低減することを意味し得る。

　ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３ノックアウト細胞とは、例えば、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３遺伝子にノックアウト処置が施され、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３遺伝子の機能が完全に除去された細胞を指す。ノックアウト処置は、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集等の任意の公知技術を用いることができる。

　本発明のある実施形態は、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数、ＯＲ１０Ａ６活性化剤、ＯＲ５Ｐ２活性化剤、又はＯＲ５Ｐ３活性化剤（以下、包括的に本発明の剤と称する場合がある）、あるいはそれを含む組成物を適用することを含む、対象における角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のための方法も提供する。本発明は、対象のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３を活性化させることを含む、対象における角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のための方法も提供する。当該実施形態の一態様では、対象のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化は、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、１－オクタノール、アセトフォノン、及びクマリン、又は本発明の剤、あるいはそれを含む組成物を適用することにより達成される。

　本発明の方法を適用する対象は、例えば、角層形成能が低下している対象、肌荒れを有するか又は予防又は軽減を望む対象、肌の乾燥等を有し保湿が必要であるか又は保湿を望む対象、皮膚バリア機能が低下しているか又は皮膚バリア機能改善を希望する対象、例えば、日焼け、しみ、くすみが気になる対象、美白を希望する対象等のメラニン産生抑制が必要又はメラニン産生抑制を希望する対象、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性が低下している対象、あるいは、嗅覚受容体の活性が低下している対象、例えば加齢などの原因により嗅覚が低下している対象等が挙げられる。

　本願にかかる方法は、美容目的であり、医師や医療従事者が行う医療行為は除かれることがある。また、本願にかかる方法は、対象の美容行為を支援する方法であってもよい。

　好ましい一実施形態は、プロパン酸３－フェニルプロピルを適用することを含む、対象における角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のための美容方法である。かかる実施形態の一態様では、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制は、対象のＯＲ１０Ａ６を活性化させることにより達成される。

　さらに本発明は、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸１－オクタノール、アセトフォノン、及びクマリンから選ばれる１種又は複数、又は本発明の剤を含む、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、及び／又はメラニン産生抑制のための組成物も提供する。

　本発明の剤又は組成物の適用は、経皮、経口、経粘膜、経鼻、静脈内、動脈内、皮下など任意の経路で適用することができるが、皮膚に作用させる観点から経皮投与が好ましい。経皮的に投与する場合、任意の皮膚、例えば顔面、頭部、頸部、四肢、体幹の皮膚に適用することができる。

　本発明の剤は、それぞれ化粧料、医薬品又は医薬部外品に配合されてもよい。これらの薬剤は、経口、又は非経口、例えば経皮的に適用されてもよい。経皮的な適用の場合、皮膚外用剤に剤形することができる。皮膚外用剤は、皮膚に適用可能であれば特に限定されず、例えば、溶液状、乳化状、固形状、半固形状、粉末状、粉末分散状、水－油二層分離状、水－油－粉末三層分離状、軟膏状、ゲル状、エアゾール状、ムース状、スティック状等、任意の剤型が適用できる。皮膚外用剤に剤形される場合には、皮膚外用剤に通常用いられる基剤、及び賦形剤、例えば保存剤、乳化剤、ｐＨ調整剤などが用いられてもよい。化粧料に配合する場合、化粧水、乳液、美容液、クリーム、ローション、パック、エッセンス、ジェル等の顔用又は体用の化粧料や、ファンデーション、化粧下地、コンシーラー等のメーキャップ化粧料、さらには浴用剤などに配合することができる。本発明の剤を含む化粧品を用いることにより、例えばＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３の活性化を介して、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制をもたらす。したがって、本発明の剤は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制を目的とした化粧料に使用されてもよい。

　本発明の剤又は組成物における有効成分の量は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制作用を発揮させる観点で任意に選択することができる。例えば、皮膚外用剤として配合する観点からは、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、１－オクタノール、アセトフォノン、クマリン、又はその他ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３を活性化することができる有効成分を０．０００５～１００．０ｍＭで配合することができる。効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．０５ｍＭ以上で配合でき、さらに好ましくは０．５ｍＭ以上、例えば１．０ｍＭで配合することができる。一方、強いにおいを避ける観点から、好ましくは１０．０ｍＭ以下で配合することができ、さらに好ましくは５．０ｍＭ以下で配合してもよい。上記成分を任意の比率で組み合わせてもよく、その場合、それらの成分の合計量が上記範囲内にあることが好ましい。

　また、本発明は、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性を指標とした角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、又は皮膚バリア機能改善剤、又はメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法を提供する。

　一態様では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程：
　生体試料におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性を測定すること、および
　対照に比較してＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３活性が増加した場合に、候補物質を角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、又はメラニン産生抑制剤として決定することを含む。

　候補物質としては、化粧品素材ライブラリー、エキスライブラリー、医薬品ライブラリー、化合物ライブラリーなど任意のライブラリーに属する物質を使用することができる。例えば、嗅覚受容体に反応する匂い物質や香料原料等が挙げられるがこれらに限定されない。

　さらに本発明は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のためのプロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、１－オクタノール、アセトフォノン、又はクマリン等のＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３に対するアゴニストも提供し、ここで、好ましくは角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制はＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、又はＯＲ５Ｐ３を活性化することにより達成される。好ましい実施形態は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のためのプロパン酸３－フェニルプロピルであり、ここで角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制はＯＲ１０Ａ６を活性化することにより達成される。

　さらに、本発明は、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のための薬剤の製造におけるプロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸等のＯＲ１０Ａ６に対するアゴニスト、ＯＲ５Ｐ２に対するアゴニスト、又は１－オクタノール、アセトフォノン、クマリン等のＯＲ５Ｐ３に対するアゴニストの使用も提供する。

　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

　実施例１：角化細胞におけるＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、及びＯＲ５Ｐ３の発現
　培養ケラチノサイト（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＥ－ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）で、３７℃加湿雰囲気下で培養し、コンフルエントになった培養物を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（販売元：ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ）を用いて、ｃＤＮＡをＶＩＬＯ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（販売元：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の製品説明書にしたがって調製した。以下に示す配列のＯＲ１０Ａ６増幅用プライマー(配列番号１，２）、ＯＲ５Ｐ２増幅用プライマー(配列番号３，４）、ＯＲ５Ｐ３増幅用プライマー(配列番号５，６）及び内部標準のＧＡＰＤＨ増幅用プライマー(配列番号７，８）用いて、リアルタイムPCRを行い増幅産物を電気泳動により確認した。

OR10A6 forward: 5’-tatttacaacccaaatctg-3’ （配列番号１）
OR10A6 reverse: 5’-tcagattgtgtgtaaaacc-3’ （配列番号２）
OR5P2 forward: 5’-accttcatttatgtgatgc-3’ （配列番号３）
OR5P2 reverse: 5’-aaaataacaagcatcatgag-3’ （配列番号４）
OR5P3 forward: 5’-cagtcactctgttctatgg-3’ （配列番号５）
OR5P3 reverse: 5’-taagctctctcttcagagc-3’ （配列番号６）
GAPDH forward: 5’-gaaggtgaaggtcggagtc-3’ （配列番号７）
GAPDH reverse： 5’-gaagattggtgatgggatttc-3’ （配列番号８）

　結果を図１に示す。ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、及びＯＲ５Ｐ３はいずれも角化細胞において発現することが確認された。そこで、以下の実験によりこれらの嗅覚受容体の一つであるＯＲ１０Ａ６およびそのアゴニストである３ＰＰＰを使用して角化細胞における反応を調べた。

　実施例２：３ＰＰＰによる細胞のカルシウム応答観察
　培養角化細胞（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＷ－ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）またはＯＲ１０Ａ６　ｓｉＲＮＡ（販売元：Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含むＥＰＩＬＩＦＷ－ＫＧ２培地で、３７℃加湿雰囲気下で１日間培養した。コンフルエントになった細胞に対し、Ｆｕｒａ２　ＡＭ（販売元：ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を５μＭで含むＥＰＩＬＩＦＷ－ＫＧ２に置換し１時間培養した。その後、ＮａＣｌ　１５０ｍＭ、ＫＣｌ　５　ｍＭ、ＣａＣｌ₂　１．８ｍＭ、ＭｇＣｌ₂　１．２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　２５ｍＭ、Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　１０ｍＭを含むバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、３－Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ　ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（３ＰＰＰ）（販売元：ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を０．０５～１ｍＭの濃度で細胞に添加した。３ＰＰＰを添加した際の細胞内Ｃａ²⁺濃度変化を、蛍光顕微鏡（販売元：ニコン社）により３４０ｎｍと３８０ｎｍの波長を観察することで、各時点における蛍光強度比（Ｆ３４０／３８０）として測定した。

　結果を図２に示す。上図に示されるように、３ＰＰＰを添加するとＣａ²⁺濃度が３ＰＰＰを添加する前の値に対し大きく上昇した。また、そのＣａ²⁺濃度の上昇は３ＰＰＰの濃度が０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭと上昇するにつれ、有意に高くなり濃度に依存することもわかる。更に、下図により３ＰＰＰによる反応はＯＲ１０Ａ６ノックダウン角化細胞では有意に低くなることが確認された。以上の実験により角化細胞に存在するＯＲ１０Ａ６がそのアゴニストである３ＰＰＰにより活性化されたことがわかる。そこで、以下の実験によりＯＲ１０Ａ６を３ＰＰＰにより活性化することによる皮膚への影響を調べた。

　実施例３：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用１
　培養角化細胞（販売元：クラボウ）を、ＥＰＩＬＩＦＷ－ＫＧ２培地（販売元：クラボウ）またはＯＲ１０Ａ６　ｓｉＲＮＡ（販売元：Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含むＥＰＩＬＩＦＷ－ＫＧ２培地で、３７℃加湿雰囲気下で１日間培養した。コンフルエントになった細胞に対し、３－Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ　ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（３ＰＰＰ）（販売元：ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＭの濃度で細胞に添加しさらに３日間培養した。３日後培養細胞をトリプシン（販売元：ナカライテスク株式会社）処理により回収し、光学顕微鏡で全細胞数をカウントし、更にトリパンブルー（販売元：ナカライテスク株式会社）により染色された死細胞数をカウントすることにより、生細胞数を全細胞数-死細胞数として求めた。その後細胞を遠心後β－メルカプトエタノール１％、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）１％、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含むバッファーに置換し９５℃、１５分で細胞を溶解させ、溶液中に溶解せずに残った角化外膜を有する角化細胞の数を光学顕微鏡でカウントした。角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善作用の指標として角化外膜の産生量を角化外膜を有する角化細胞の数／生細胞数×１００として算出し、その値をＣＥ産生率（％）として示した。

　結果を図３に示す。角化細胞におけるＣＥ産生率は３ＰＰＰにより有意に増加した（左図）。しかしながら、ＯＲ１０Ａ６ノックアウト角化細胞では３ＰＰＰを添加しても角化外膜の産生量に有意な増加は見られなかった。更に、３ＰＰＰ無添加の場合、ＣＥ産生率はＯＲ１０Ａ６ノックアウト角化細胞ではＯＲ１０Ａ６非ノックアウト角化細胞に比べて有意に低下した（右図）。したがって、ＯＲ１０Ａ６の活性化によりＣＥ産生が促進されることが示唆される。

　以上の結果により、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、及びＯＲ５Ｐ３は角化細胞に存在し、３ＰＰＰによるＯＲ１０Ａ６の活性化によりＣＥ産生が促進されることがわかった。

　実施例４：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用２
　実施例３により３ＰＰＰがＯＲ１０Ａ６などの嗅覚受容体の活性化を介してＣＥの形成を促進する可能性が示されたが、本実施例では、ＯＲ１０Ａ６活性化によるＣＥの形成および成熟を促進する酵素であるトランスグルタミナーゼ１をコードするＴＧＭ１遺伝子の発現を測定した。
　４－１：細胞の培養
　ＨａＣａＴ細胞を、２４ウェルプレート（Ｃａｔ　Ｎｏ．３５２６，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）に１０．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で１０．０％（ｖ／ｖ）Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｃａｔ　Ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＫ）および１．０％（ｖ／ｖ）抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ　１００Ｘ，Ｃａｔ　Ｎｏ．１５２４０－０６２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｃａｔ　Ｎｏ．０４３－３００８５，Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）に播種し、ＣＯ２インキュベータ内（ＣＯ２濃度　５％、３７℃）で２４時間培養した。培地を除去後、終濃度が０．０５ｍＭとなるように３ＰＰＰを添加した培地に交換しＣＯ２インキュベータ内で更に４８時間培養した。対照には３ＰＰＰを含まない培地を用いた。

　４－２：ＲＮＡ抽出・精製、定量および純度測定
　ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ　Ｎｏ．１２１８３０１８Ａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ抽出・精製を行い、精製したＲＮＡの一部をＵＶ透過性９６ウェルプレートに分取してＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒにより１０倍希釈し、マイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ（登録商標）１０Ｍ　ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２３０、ＯＤ２６０、ＯＤ２８０）を測定した。ＯＤ２６０を用いてＲＮＡ濃度を算出し、ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで希釈してＲＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬに調製した。

　４－３：リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析
　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ　ＶＩＬＯＴＭ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｅｚＤＮａｓｅ（Ｃａｔ　Ｎｏ．１１７６６０５０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡの逆転写を行った。８連チューブに１ウェルあたり４μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ　ＶＩＬＯＴＭ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘおよび６μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを添加し、リアルタイムＰＣＲ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、８５℃で５分間加熱して、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲプレートに１ウェルあたり１０μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ　ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｃａｔ　Ｎｏ．４４４４５５７，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、１μＬのＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｒ、７μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅＴＭ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ　Ｎｏ．１０９７７－０１５，ＵＳＡ）および２μＬのｃＤＮＡを加え、密封した。ＴＧＭ１のプライマー（Ｈｓ００１６５９２９＿ｍ１）及び内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨのプライマー（Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）を用いＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ｑＰＣＲを行い、３ＰＰＰ添加培地におけるＴＧＭ１のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出後、ＧＡＰＤＨによりＣｔ値を補正してΔＣｔ値とし、かつ、1サイクル当たり遺伝子量が２倍になると仮定し、対照の遺伝子発現量を１とした場合の３ＰＰＰ添加培地における遺伝子発現量を求めた。遺伝子発現量の解析には１つの処理群につき２４ウェルプレート×３ウェルの平均値を用いた。

　結果を以下表１に示す。

　表１に示すように、３ＰＰＰを添加するとＴＧＭ１の遺伝子発現が有意に上昇し、３ＰＰＰがＯＲ１０Ａ６を活性化しＴＧＭ１の産生を促進することによりＣＥの形成および成熟を促進され、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善に寄与する可能性が示唆された。

　実施例５：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用３
　ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア改善効果を確認するために、これらの機能に関与する他の遺伝子を用いて以下の実験を行った。より具体的には、ＮＭＦとして皮膚の水分保持機能に関与するフィラグリンをコードするＦＬＧ（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、表皮細胞で産生され皮膚の水分保持に関与するヒアルロン酸の合成酵素をコードするＨＡＳ３（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　３）、及び皮膚のバリア機能に関わるセラミドＥＯＰ（セラミド１）の産生酵素をコードするＧＢＡ（β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）の発現量を測定した。

　ＴＧＭ１のプライマー（Ｈｓ００１６５９２９＿ｍ１）の代わりに、ＦＬＧ（Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）、Ｈｕｍａｎ　Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　３（ＨＡＳ３，Ａｓｓａｙ　ＩＤ．Ｈｓ００１９３４３６＿ｍ１）、Ｈｕｍａｎ　β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ（ＧＢＡ，Ａｓｓａｙ　ＩＤ．Ｈｓ００９８６８３６＿ｇ１）のプライマーを用いる以外は実施例４と同じ材料及び方法にて、０．０５ｍＭの３ＰＰＰを含む又は含まない培地におけるこれらの遺伝子発現量を測定した。

　結果を以下表２～４に示す。

　表２～４に示すように、３ＰＰＰを添加するとＦＬＧ、ＨＡＳ３、ＧＢＡの遺伝子発現が有意に上昇した。以上の結果から、３ＰＰＰ等によるＯＲ１０Ａ６活性化により、ＴＧＭ１の促進以外にもこれらの遺伝子の発現を促進することによっても、角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善に寄与している可能性が示唆された。

　実施例６：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用４
　３ＰＰＰ以外のＯＲ１０Ａ６活性化剤についても同様の効果がみられるかについて調べるために、ＯＲ１０Ａ６に反応する物質として知られているシトロネロール及びフェネチルアルコール（非特許文献５）を用い、これらの物質が、３ＰＰＰと同様に角層形成作用を有するかを検討した。より具体的には、３ＰＰＰの代わりにシトロネロール（ＣＡＳ番号：１０６－２２－９、和光０３７－０５９９３）又はフェネチルアルコール（ＣＡＳ番号：６０－１２－８、ＴＣＩ　Ｐ００８４）を下記濃度で用いる以外は実施例４と同じ材料及び方法にてＴＧＭ１遺伝子発現量を測定した。

　結果を以下表５、６に示す。

　表６の結果より、３ＰＰＰのみならず他のＯＲ１０Ａ６活性化剤であるシトロネロールやフェネチルアルコールを用いてもＴＧＭ１の発現が有意に上昇した。

　実施例７：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用５
　実施例６について効果がみられたシトロネロール及びフェネチルアルコールについて、実施例５と同様にＧＢＡを用いて以下の実験を行った。より具体的には、３ＰＰＰの代わりにシトロネロール（ＣＡＳ番号：１０６－２２－９、和光０３７－０５９９３）又はフェネチルアルコール（ＣＡＳ番号：６０－１２－８、ＴＣＩ　Ｐ００８４）を下記濃度で用いる以外は実施例５と同じ材料及び方法にてＧＢＡ遺伝子発現量を測定した。

　結果を以下表７、８に示す。

　表７の結果より、実施例６と同様、３ＰＰＰ以外のＯＲ１０Ａ６活性化剤であるシトロネロールやフェネチルアルコールでもＧＢＡの発現が有意又は有意傾向で上昇した。

　実施例８：ＯＲ１０Ａ６活性化による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用５
　実施例６、７について効果がみられたシトロネロールについて、実施例５と同様にＨＡＳ３を用いて以下の実験を行った。より具体的には、３ＰＰＰの代わりにシトロネロール（ＣＡＳ番号：１０６－２２－９、和光０３７－０５９９３）を下記濃度で用いる以外は実施例５と同じ材料及び方法にてＨＡＳ３遺伝子発現量を測定した。

　結果を以下表９に示す。

　実施例９：
　以上により、ＯＲ１０Ａ６を活性化することにより角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善作用を奏することが示唆されたが、他の効果について確認するために炎症性サイトカインでありメラニン産生を促進することが知られているＩＬ－αをコードするＩＬ－１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１　Ａｌｐｈａ）の発現量を測定した。より具体的には、ＴＧＭ１のプライマー（Ｈｓ００１６５９２９＿ｍ１）の代わりに、ＩＬ－１αのプライマー（Ｈｓ００１７４０９２＿ｍ１）を用いる以外は実施例４と同じ材料及び方法にて、下記濃度の３ＰＰＰを含む又は含まない培地におけるＩＬ－１αの遺伝子発現量を測定した。ＩＬ－１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１　Ａｌｐｈａ）は、炎症性サイトカインであるＩＬ－１αタンパクをコードする遺伝子であり、ＩＬ－１αはチロシナーゼ活性を高めることによりメラニンの過剰生成を引き起こすことが知られている。

　結果を以下表１０に示す。

　表１０に示すように、３ＰＰＰを添加するとＩＬ－αの遺伝子発現が濃度依存的に減少した。この結果から、ＯＲ１０Ａ６の活性化によりＴＧＭ１、ＦＬＧ、ＨＡＳ３、ＧＢＡ発現促進による角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、及び皮膚バリア機能改善のみならず、ＩＬ－αの発現抑制によって肌荒れ抑制やメラニン産生抑制にも寄与している可能性が示唆された。

　以上の結果により、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、及びＯＲ５Ｐ３の活性化により角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、メラニン産生抑制作用等の皮膚に好ましい影響を及ぼし、これらの効果はＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５Ｐ２、ＯＲ５Ｐ３を活性化させる成分等により達成されることが期待される。例えば、ＯＲ１０Ａ６を活性化させる成分としては、プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、酪酸、ＯＲ５Ｐ３を活性化させる成分としては、１－オクタノール、アセトフォノン、及びクマリン等が知られているため、これらの成分による効果が期待できる。

Claims

　ＯＲ１０Ａ６活性化剤を有効成分として含有する、角層形成促進剤。
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、角層形成促進剤。
　請求項１又は２の角層形成促進剤を含有する、角層形成を促進するための組成物。
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、肌荒れ抑制剤。
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、保湿剤。
　プロパン酸３－フェニルプロピル、シトロネロール、フェネチルアルコール、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ネロール、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、皮膚バリア機能改善剤。
　プロパン酸３－フェニルプロピル、αシンナミルアルコール、シクラメンアルデヒド、ゲラニオール、αイオノン、ノナデカン、リナロール、リラール、フェニルプロピルアルコール、アンドロスタジエノン、アンドロステロン、及び酪酸から選ばれる１種又は複数を有効成分として含有する、メラニン産生抑制剤。
　角層形成促進、肌荒れ抑制、保湿、皮膚バリア機能改善、又はメラニン産生抑制のためのＯＲ１０Ａ６活性化剤。
　ＯＲ１０Ａ６活性を指標とした角層形成促進剤、肌荒れ抑制剤、保湿剤、皮膚バリア機能改善剤、又はメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。