WO2024058182A1 - 形質転換微生物、及び、共重合ポリエステルの製造方法 - Google Patents

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WO2024058182A1
WO2024058182A1 PCT/JP2023/033246 JP2023033246W WO2024058182A1 WO 2024058182 A1 WO2024058182 A1 WO 2024058182A1 JP 2023033246 W JP2023033246 W JP 2023033246W WO 2024058182 A1 WO2024058182 A1 WO 2024058182A1
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WO
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seq
acid
coa
transformed microorganism
amino acid
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PCT/JP2023/033246
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English (en)
French (fr)
Inventor
祥 古舘
俊輔 佐藤
相昊 高
精一 田口
Original Assignee
株式会社カネカ
国立大学法人神戸大学
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a transformed microorganism capable of producing a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and another hydroxyalkanoic acid, and a method for producing a copolyester using the microorganism.
  • LAHB Poly(3-hydroxybutyric acid-co-lactic acid)
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • LA lactic acid
  • LAHB can be produced by microbial fermentation.
  • LA monomer ie, lactyl-CoA
  • Non-Patent Document 1 reports that LAHB was successfully produced by introducing PCT Cp V193A, a single amino acid mutant of propionyl-CoA transferase derived from Clostridium propionicum, into the microorganism Cupriavidus necator. has been done.
  • Non-Patent Document 1 the productivity of LAHB when glucose is used as a carbon source is only 0.14 g/ It is shown that it was L.
  • An object of the present invention is to provide a transformed microorganism capable of producing a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acids with good productivity.
  • PCT Cp V193A supplies a higher amount of lactyl-CoA than PCT Cp V193A, and is effective even in Capriavidus microorganisms that do not have the gene encoding the enzyme that supplies 3HB-CoA deleted.
  • a functional CoA transferase that can copolymerize LA to 3HB and produce LAHB with good productivity, leading to the present invention.
  • the present invention provides a transformed microorganism of a microorganism belonging to the genus Capriavidus, which has the ability to produce a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and another hydroxyalkanoic acid, and a gene encoding a copolyester synthase; , a foreign gene encoding propionyl CoA transferase or butyl CoA transferase having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 6, or 90 to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs 2 to 6.
  • the present invention relates to a transformed microorganism having a foreign gene encoding a protein having a sequence identity of % or more and having propionyl CoA transferase activity or butyl CoA transferase activity.
  • the present invention can provide a transformed microorganism capable of producing a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acid with good productivity.
  • the transformed microorganism according to the present invention can produce a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acids even if it retains the gene encoding the enzyme that supplies 3HB-CoA.
  • the transformed microorganism according to the present invention does not need to be cultured using a natural medium, and can produce a copolymerized polyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acids by culturing in a synthetic medium. .
  • the present invention is a transformed microorganism capable of producing a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acids.
  • the other hydroxyalkanoic acid contained in the copolymerized polyester is not particularly limited, but may be, for example, a hydroxyalkanoic acid having 2 to 15 carbon atoms that can be copolymerized with 3-hydroxybutyric acid.
  • the copolymerized polyester only one type may be contained in the copolymerized polyester, or two or more types may be contained. Among these, it is preferable that at least lactic acid is contained, and LAHB composed of 3-hydroxybutyric acid and lactic acid is particularly preferable as the copolymerized polyester.
  • the ratio of the other hydroxyalkanoic acid in the copolymerized polyester is not particularly limited. By adjusting the composition, carbon source, culture conditions, etc. of the transformed microorganism according to the present disclosure, it is possible to produce copolymerized polyesters having various ratios. However, for example, the ratio of the other hydroxyalkanoic acid units to all monomer units constituting the copolymerized polyester may be about 0.1 to 50 mol%, and may be about 0.5 to 30 mol%. It may be about 1 to 10 mol%.
  • Microorganisms belonging to the genus Capriavidus have a proven track record in producing PHBH, which is a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • PHBH a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • Escherichia coli needs to be cultured in an expensive and nutritious natural medium
  • microorganisms of the genus Capriavidus can accumulate polyester by culturing in an inexpensive synthetic medium, making them suitable for industrial production of polyester. ing. Therefore, the transformed microorganism according to the present disclosure utilizes a microorganism belonging to the genus Capriavidus as a host.
  • Cupriavidus necator can be particularly preferably used.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure has a gene encoding a copolyester synthase.
  • the copolymerized polyester synthase is a copolymerized polyester synthase that copolymerizes 3-hydroxybutyric acid and another hydroxyalkanoic acid using the CoA form of 3-hydroxybutyric acid and the CoA form of the other hydroxyalkanoic acid as substrates. It is an enzyme that has the activity of synthesizing polyester. Polyester synthase is also called polyester polymerase.
  • the copolyester synthase is not particularly limited as long as it has the above activity, but may be any known enzyme that has the activity of synthesizing a polymer or copolymer of 3-hydroxybutyric acid.
  • the gene encoding such an enzyme may be the phaC gene originally possessed by the host of the transformed microorganism according to the present disclosure, or may be a gene obtained by introducing a mutation into the phaC gene. , or may be a foreign gene.
  • the copolyester synthase is not particularly limited, but polyhydroxyalkanoic acid synthase derived from a microorganism of the genus Pseudomonas or a variant thereof can be suitably used.
  • the variant refers to a protein that has 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of the polyhydroxyalkanoic acid synthase and exhibits polyhydroxyalkanoic acid synthesis activity.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • a STQK mutant in which the 325th serine of the polymerase PhaC1 Ps derived from 61-3 is converted to threonine and the 481st glutamine is converted to lysine can be preferably used. It has been reported that the STQK mutant was able to produce LAHB by introducing the STQK mutant into E. coli and culturing the transformed strain in a natural medium (Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 17323-17327 (2008)).
  • the transformed microorganism according to the present disclosure has a foreign gene encoding propionyl CoA transferase (PCT) or butyl CoA transferase (BCT). These CoA transferases have the activity of adding CoA to the other hydroxyalkanoic acid and synthesizing the CoA form of the hydroxyalkanoic acid.
  • PCT propionyl CoA transferase
  • BCT butyl CoA transferase
  • These CoA transferases have the activity of adding CoA to the other hydroxyalkanoic acid and synthesizing the CoA form of the hydroxyalkanoic acid.
  • the number of foreign genes introduced may be one or more.
  • SEQ ID NO: 2 is Epulopiscium sp.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of PCT Fb from Firmicutes bacterium CAG:466, SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of PCT Al from Anaerotignum lactatifermentans, SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of BCT Ah, a butyl-CoA transferase derived from Anaerobutyricum hallii, and SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of BCT Ah , which is a butyl-CoA transferase derived from Anaerobutyricum hallii. The amino acid sequence of the derived BCT Rs is shown.
  • Enzymes having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 6 are more likely to have CoA forms of the other hydroxyalkanoic acids than PCT Cp V193A, which is a single amino acid variant of propionyl-CoA transferase derived from Clostridium propionicum, which has been previously reported. It was found that the supply of By introducing genes encoding these enzymes into microorganisms of the genus Capriavidus, it becomes possible to produce copolymerized polyesters of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acids with high productivity.
  • the homologue is a protein that has 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 6, and has propionyl CoA transferase activity or butyl CoA transferase activity.
  • Examples include genes that cause The sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • sequence identity between the above-mentioned amino acid sequence of PCT Cp V193A and the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 6 is less than 90%.
  • the homolog is a protein having propionyl-CoA transferase activity or butyl-CoA transferase activity, and has one or more amino acids substituted, deleted, or The protein may have an inserted or added amino acid sequence.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or more amino acids described above is preferably a conservative mutation that maintains the normal function of the protein, and more preferably a conservative substitution.
  • conservative substitutions include substitutions between aromatic amino acids, substitutions between hydrophobic amino acids, substitutions between polar amino acids, substitutions between basic amino acids, substitutions between amino acids having hydroxyl groups, and the like.
  • the amino acid substitution, deletion, insertion, or addition may be an artificial mutation or a natural mutation due to individual differences in the organism from which the gene is derived, differences in species, or the like.
  • CoA transferase is not an enzyme that only catalyzes the CoA transfer reaction to lactic acid, but is known to have the activity of transferring CoA to hydroxyalkanoic acids other than lactic acid.
  • CoA transferase can transfer CoA to hydroxyalkanoic acids such as 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid, 4-hydroxybutyric acid, and 3-hydroxy-2-methylbutyric acid (Microbial. Cell Factories, 21, 84 (2020), Japanese Patent Application Publication No. 2019-119806).
  • the transformed microorganism according to the present disclosure can be used.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure preferably further has genes encoding acetyl-CoA acetyltransferase (PhaA) and acetoacetyl-CoA reductase (PhaB1).
  • PhaA acetyl-CoA acetyltransferase
  • PhaB1 acetoacetyl-CoA reductase
  • the phaA gene is an enzyme that catalyzes the reaction of forming acetoacetyl-CoA from two molecules of acetyl-CoA, and is sometimes called ⁇ -ketothiolase.
  • a specific example is an acetyl-CoA acetyltransferase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or an acetyl-CoA acetyltransferase that has 90% or more sequence identity to SEQ ID NO: 9 and exhibits acetyl-CoA acetyltransferase activity.
  • proteins include proteins.
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of acetyl-CoA acetyltransferase derived from Capriavidus necator.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the phaB1 gene is an enzyme that catalyzes a reaction that reduces acetoacetyl-CoA to form ⁇ -hydroxybutyryl-CoA (3HB-CoA).
  • Specific examples include acetoacetyl-CoA reductase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, or having 90% or more sequence identity to SEQ ID NO: 10 and exhibiting acetoacetyl-CoA reductase activity.
  • proteins SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of acetoacetyl-CoA reductase derived from Capriavidus necator. The sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the transformed microorganism has the phaA gene and the phaB1 gene, a pathway for synthesizing 3HB-CoA from acetyl-CoA via acetoacetyl-CoA is established, increasing the supply amount of 3HB-CoA and increasing the productivity of the copolymerized polyester. can be increased.
  • the CoA transferase possessed by the transformed microorganism according to the present disclosure has a high supply amount of the CoA form of the other hydroxyalkanoic acid, even if the transformed microorganism according to the present disclosure has the phaA gene and the phaB1 gene, By copolymerizing the other hydroxyalkanoic acid with 3-hydroxybutyric acid, it becomes possible to produce a copolymerized polyester of 3-hydroxybutyric acid and other hydroxyalkanoic acid with good productivity.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure may be one in which the phaA gene and the phaB1 gene are deleted. Thereby, the ratio of the other hydroxyalkanoic acid in the copolymerized polyester can be further increased.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure further has a foreign gene encoding lactate dehydrogenase (LDH).
  • LDH is an enzyme that catalyzes the reaction of reducing virupic acid and converting it into D-lactic acid.
  • the LDH gene By introducing the LDH gene, a pathway that can convert virupic acid to D-lactic acid is established, so the copolymerized polyester, especially LAHB, can be efficiently produced using sugars such as glucose instead of lactic acid as a carbon source. It becomes possible to do so.
  • the lactate dehydrogenase is not particularly limited as long as it is an enzyme having the activity of converting virupic acid into D-lactic acid, and examples thereof include lactate dehydrogenase derived from Escherichia coli, lactate dehydrogenase derived from the genus Lactobacillus, lactate dehydrogenase derived from the genus Leuconostoc, and Limulus lactate dehydrogenase. Examples include lactate dehydrogenase derived from the genus, variants thereof, and the like.
  • the variant refers to a protein that has 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of the lactate dehydrogenase and exhibits lactate dehydrogenase activity.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • the introduced gene When introducing a foreign gene into a Capriavidus microorganism, the introduced gene may be present on the chromosome of the host microorganism, or on DNA such as a plasmid or megaplasmid. From the viewpoint of retention of the introduced gene, it is preferably present on a chromosome or megaplasmid possessed by a microorganism, and more preferably on a chromosome possessed by a microorganism.
  • Methods for site-specifically replacing or inserting any DNA into DNA possessed by a microorganism, or methods for deleting any site of DNA possessed by a microorganism are well known to those skilled in the art, and the transformation according to the present disclosure Can be used when producing microorganisms.
  • representative methods include methods that utilize transposons and homologous recombination mechanisms (Ohman et al., J. Bacteriol., vol. 162: p. 1068 (1985)); A method based on the principle of site-specific integration and elimination by second-step homologous recombination (Noti et al., Methods Enzymol., vol. 154, p.
  • the base sequence of the gene to be introduced is not particularly limited, but may be appropriately optimized depending on the host microorganism of the genus Capriavidus.
  • the promoter for expressing the introduced gene is not particularly limited, and examples thereof include the trp promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, trc promoter, tic promoter, tac promoter, lacN17 promoter, lacN19 promoter, and modified versions thereof derived from Escherichia coli. Available for use. Furthermore, instead of using a foreign promoter, it is also possible to use a promoter sequence that originally exists near the position on the genomic DNA where the target gene is inserted. Furthermore, it is also possible to use a combination of the above-mentioned naturally existing promoter sequence and a foreign promoter.
  • the copolymerized polyester can be accumulated in the microorganism cells.
  • a conventional microbial culture method can be followed, and the culture may be carried out in a medium containing an appropriate carbon source.
  • the medium composition there are no particular limitations on the medium composition, carbon source addition method, culture scale, aeration/agitation conditions, culture temperature, culture time, etc.
  • the carbon source is added to the medium continuously or intermittently.
  • any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the transformed microorganism.
  • examples include, but are not limited to, sugars such as glucose, fructose, sucrose, and xylose; palm oil and palm kernel oil (including low-melting fractions of these such as palm olein, palm double olein, and palm kernel oil olein) ), fats and oils such as corn oil, coconut oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, and jatropha oil, their fractionated oils, or their refining byproducts; other hydroxyalkanoic acids such as D-lactic acid; lauric acid, oleic acid , fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myrinstic acid, derivatives thereof, and glycerol.
  • gases or alcohols such as carbon dioxide, carbon monoxide, methane, methanol, and ethanol, these can also be used as carbon sources
  • the microorganism In the production of the copolymerized polyester, it is preferable to culture the microorganism using a medium containing the carbon source, a nitrogen source that is a nutrient source other than the carbon source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • the nitrogen source include, but are not limited to, ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • examples of other organic nutritional sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C.
  • the copolyester After culturing the transformed microorganism for an appropriate period of time to accumulate the copolyester within the microorganism cells, the copolyester is recovered using a well-known method.
  • the recovery method is not particularly limited, but from an industrial perspective, recovery by separation and purification in an aqueous system with low environmental impact is preferred.
  • cell components other than the copolyester are dissolved in water by applying mechanical shearing force or disrupting the cells using surfactants, alkalis, enzymes, etc. liquid can be obtained.
  • the copolymerized polyester After separating the copolymerized polyester from the aqueous phase by filtration or centrifugation of the cell disruption solution, the copolymerized polyester can be recovered by drying.
  • [Item 1] A transformed microorganism of a microorganism belonging to the genus Capriavidus, which has the ability to produce a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and another hydroxyalkanoic acid, and a gene encoding a copolyester synthase, and SEQ ID NO: 2 to A foreign gene encoding propionyl-CoA transferase or butyl-CoA transferase having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 or 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 2 to 6. 1.
  • a transformed microorganism having a foreign gene encoding a protein having propionyl CoA transferase activity or butyl CoA transferase activity [Item 2] The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a gene encoding an acetyl-CoA acetyltransferase having 90% or more sequence identity to SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 10
  • [Item 3] The transformed microorganism according to item 1 or 2, further having a gene encoding lactate dehydrogenase.
  • [Item 4] The transformed microorganism according to any one of items 1 to 3, wherein the copolyester synthase is a polyhydroxyalkanoic acid synthase derived from a microorganism of the genus Pseudomonas or a mutant thereof.
  • [Item 5] The transformed microorganism according to any one of items 1 to 4, wherein the microorganism belonging to the genus Capriavidus is Capriavidus necator.
  • [Item 6] A method for producing a copolymer polyester of 3-hydroxybutyric acid and another hydroxyalkanoic acid, the method comprising the step of culturing the transformed microorganism according to any one of items 1 to 5.
  • [Item 7] The manufacturing method according to item 6, wherein the copolymer polyester contains at least lactic acid as the other hydroxyalkanoic acid.
  • [Item 8] 8 The manufacturing method according to item 7, wherein the copolymer polyester is a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and lactic acid.
  • the present invention will be explained in more detail below with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • the overall genetic manipulation can be carried out, for example, as described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Enzymes, cloning hosts, etc. used in genetic manipulation can be purchased from commercial suppliers and used according to their instructions. The enzymes are not particularly limited as long as they can be used in genetic manipulation.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the necator H16 strain as a template and the oligo DNAs shown by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 as primers.
  • Prime STAR GXL DNA polymerase (manufactured by Takara Bio) was used as the DNA polymerase.
  • PCR was performed using the DNA shown by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 as primers.
  • Overlap PCR was performed using the two DNA fragments obtained in the above PCR as templates and the DNAs shown by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 14 as primers.
  • the obtained DNA fragment is a fragment in which approximately 500 base pairs upstream and approximately 500 base pairs downstream of the ORF of the PHA polymerase gene phaC 1Re are linked.
  • This DNA fragment was treated with the restriction enzyme SmiI and ligated with the vector pNS2X-sacB (described in JP-A-2007-259708), which had also been treated with SmiI, using DNA ligase.
  • the resulting gene disruption plasmid containing the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 15 was named pNS2X-sacB- ⁇ PhaC 1Re .
  • the PHA polymerase gene phaC 1Re on the genome was transformed into an STQK mutant (polymerase PhaC1 Ps derived from Pseudomonas sp. 61-3, in which serine at position 325 was converted to threonine and glutamine at position 481 was converted to lysine.
  • STQK mutant polymerase PhaC1 Ps derived from Pseudomonas sp. 61-3, in which serine at position 325 was converted to threonine and glutamine at position 481 was converted to lysine.
  • pNS2X-sacB-PhaC 1Re ::STQK containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 was prepared as a plasmid for replacing the gene with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, which encodes PHA polymerase).
  • the gene disruption plasmid pNS2X-sacB- ⁇ PhaC 1Re was introduced into Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) by electroporation, and KNK005 ⁇ phaZ 1,2,6 /nagE G793C.
  • the cells were mixedly cultured with the dR strain on Nutrient Agar medium (manufactured by Difco), and conjugative transfer was performed.
  • strains in which the plasmid was inserted into the genome were placed on Simmons agar medium containing 250 mg/L of kanamycin sulfate (sodium citrate 2 g/L, sodium chloride 5 g/L, magnesium sulfate heptahydrate). 0.2 g/L of diammonium hydrogen phosphate, 1 g/L of diammonium hydrogen phosphate, 15 g/L of agar, pH 6.8) and isolated.
  • kanamycin sulfate sodium citrate 2 g/L, sodium chloride 5 g/L, magnesium sulfate heptahydrate
  • the dR strain was then genetically modified with the plasmid pNS2X-sacB-PhaC 1Re ::STQK to obtain H16 phaC 1Re ::STQK ⁇ phaZ 1,2,6 /nagE G793C. in which the STQK gene was inserted at the phaC 1Re position.
  • the dR strain was obtained. This strain will be used as host (1).
  • CoA transferase A nucleotide sequence encoding CoA transferase having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7 was obtained from C.I. A DNA fragment having a base sequence optimized for the necator codon was artificially synthesized.
  • Biosynthesis of polyester Biopolymer-producing bacteria into which the expression vectors of each CoA transferase were introduced were grown in a meat medium (composition: 1% (w/v) meat extract, 1% (w/v) bactotryptone, 0.2% (w/v)). Preincubation overnight with yeast extract, 0.9% (w/v) disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 0.15% (w/v) potassium dihydrogen phosphate, 50 ⁇ g/L kanamycin) did.
  • a meat medium composition: 1% (w/v) meat extract, 1% (w/v) bactotryptone, 0.2% (w/v)
  • yeast extract 0.9% (w/v) disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 0.15% (w/v) potassium dihydrogen phosphate, 50 ⁇ g/L kanamycin
  • a synthetic medium containing 20 g/L of D-lactic acid or glucose as a carbon source (composition: 1.1% (w/v) disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 0.19% (w/v) phosphorous potassium dihydrogen acid, 0.129% (w/v) ammonium sulfate, 0.15% (w/v) magnesium sulfate heptahydrate, 50 ⁇ g/L kanamycin, 0.75% (v/v) trace metal salt solution (1.6% (w/v) iron(II) hydrochloride hexahydrate, 1% (w/v) calcium chloride dihydrate, 0.02% (w/v) cobalt chloride in 0.1N hydrochloric acid) Hexahydrate, 0.016% (w/v) copper sulfate pentahydrate, 0.012% (w/v) nickel chloride hexahydrate)) were inoculated into a Sakaguchi flask and incubated at 30°C.
  • the polyester biosynthesized by each strain was extracted with chloroform from dried bacterial cells washed with ethanol and hexane, and the chloroform was removed by volatilization and recovered.
  • the composition of the obtained polyester was analyzed by 1 H NMR, and the LA fraction was calculated. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 Epulopiscium sp.
  • PCT Fb (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO : 3), which is a propionyl-CoA transferase derived from Firmicutes bacterium CAG:466, was used.
  • PCT Al derived from Anaerotignum lactatifermentans (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) was used, and in Example 4, BCT Ah (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5) which is a butyl-CoA transferase derived from Anaerobutyricum hallii was used.
  • Roseburia sp The derived BCT Rs (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6) was expressed.
  • the culture was performed using D-lactic acid as a carbon source.
  • necator and Escherichia coli was introduced into a host (1) carrying the phaA gene and phaB1 gene by trc or It was expressed using the lacN17 promoter and cultured using D-lactic acid as a carbon source, but although polyester was produced, copolymerization of lactic acid could not be confirmed. This result showed that PCT Cp V193A did not have a sufficient supply of lactyl-CoA.
  • the REP promoter was used in Examples 1 and 2
  • the lacUV5 promoter was used in Example 3
  • the trc promoter was used in Examples 4 and 5.
  • lactic acid was copolymerized at a higher ratio than in Examples 4 to 5.
  • the CoA transferase used in the above has a particularly high ability to supply lactyl-CoA.
  • the trc promoter was used in PCT Cp V193A, production of LAHB could not be confirmed, and this result also showed that PCT Cp V193A did not have a sufficient supply of lactyl-CoA.
  • propionyl CoA transferase PCT Me derived from Megasphaera elsdenii (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7), or Tyzzerella sp.
  • An114-derived propionyl-CoA transferase PCT Ts (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8) was expressed using the trc promoter and cultured using D-lactic acid as a carbon source, but as above, polyester Although the polyester was synthesized, no results indicating copolymerization of lactic acid were obtained in the obtained polyester.
  • the sequence identity between the amino acid sequences of PCT Me and PCT Ts and the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 6 is less than 90%.
  • This plasmid is a plasmid obtained by inserting the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 22 into the pNS2X-sacB vector by ligation.
  • host (1) was genetically modified using the homologous recombination method described above, and H16 phaC 1Re ::STQK ⁇ phaZ 1,2,6 /nagE G793C.
  • a dR phaJ4a::lacN17-PCT Es strain was created. This will be called host (2). If an enzyme capable of producing D-lactic acid is expressed in this host (2) using an appropriate expression vector, LAHB biosynthesis from glucose becomes possible.
  • Example 6 first, a DNA fragment encoding Escherichia coli-derived lactate dehydrogenase LDH Ec having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 as an enzyme that produces D-lactic acid was amplified by PCR, and a DNA fragment encoding lactate dehydrogenase LDH Ec , which is an enzyme that produces D-lactic acid, was amplified by PCR.
  • a DNA fragment treated with EcoRI and SpeI having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 was ligated with a DNA fragment obtained by treating pCUP2 vector with MunI and SpeI using DNA ligase to create vector pCUP2-trc-LDH. Ec was obtained.
  • this vector was introduced into the host (2) by electroporation and cultured using glucose as a carbon source.
  • LAHB with an LA fraction of 1.1 mol% was produced at a production rate of 5 g/L. I was able to synthesize it.
  • Example 7 is a vector pCUP2-trc-LDH in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 that can express Limulus polyphemus-derived lactate dehydrogenase LDH Lp having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 with the trc promoter was introduced into the pCUP2 vector. Lp was produced, this vector was introduced into host (2) by electroporation, and culture was performed using glucose as a carbon source. As a result, LAHB with an LA fraction of 0.9 mol% could be biosynthesized at a production amount of 4 g/L.
  • Comparative Example 1 PCT Cp V193A was expressed using a trc promoter, and Escherichia coli-derived lactate dehydrogenase LDH Ec was expressed using a trc promoter, and culture was performed using glucose as a carbon source.
  • the polyester was biosynthesized, no results indicating copolymerization of lactic acid were obtained in either GC analysis or 1 H NMR analysis of the obtained polyester.
  • the polymer productivity of Comparative Example 1 was lower than that of Examples 6 and 7, indicating that the propionyl-CoA transferase PCT Es used in Examples 6 and 7 is extremely suitable for LAHB production. It was done.

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Abstract

３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する、カプリアビダス属に属する微生物の形質転換微生物が、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子、並びに、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子、または、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を有する。

Description

形質転換微生物、及び、共重合ポリエステルの製造方法
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する形質転換微生物、及び、当該微生物を用いた共重合ポリエステルの製造方法に関する。
　３－ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）と乳酸（以下、ＬＡと略す）の共重合体であるポリ（３－ヒドロキシ酪酸－ｃｏ－乳酸）（以下、ＬＡＨＢと略す）は、生分解性を示すポリマー材料であり、これをポリ乳酸に配合することで、ポリ乳酸の透明性を実質的に低下させることなく、ポリ乳酸を可塑化できることが報告されている（特許文献１を参照）。
　このようなＬＡＨＢは微生物発酵によって生産することができる。その際、ＬＡモノマー、すなわちラクチルＣｏＡを供給するため、ＣｏＡを乳酸に転移させるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を微生物に導入することが知られている。
　例えば、非特許文献１では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼの一アミノ酸変異体であるＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａを、微生物カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）に導入することで、ＬＡＨＢの生産に成功したことが報告されている。
　この報告では、３ＨＢに対しＬＡを共重合させるため３ＨＢ－ＣｏＡの供給量を抑制することを目的に、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒにおいて、３ＨＢ－ＣｏＡを供給する酵素であるＰｈａＡ及びＰｈａＢ１をコードする遺伝子を欠損させる処理を行っている。
　しかし、ＰｈａＡ及びＰｈａＢ１をコードする遺伝子を破壊した結果、ＬＡＨＢの生産性が著しく阻害されており、非特許文献１では、グルコースを炭素源として使用した時のＬＡＨＢの生産性がわずか０．１４ｇ／Ｌであったことが示されている。
国際公開第２０２０／０６６６７９号
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０，２０－２８（２０１３）
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを、生産性良く産生することが可能な形質転換微生物を提供することを目的とする。
　上述した通り、これまで報告されているＬＡＨＢの生産能を有するカプリアビダス属微生物では、ＬＡを３ＨＢに共重合させるために、３ＨＢ－ＣｏＡを供給する酵素であるＰｈａＡ及びＰｈａＢ１をコードする遺伝子を欠損させて３ＨＢ－ＣｏＡの供給能を抑制していた。結果、ＬＡＨＢは生産できるものの、その生産性が不十分であり、工業的に実施するにあたってはＬＡＨＢの生産性を改善する必要があった。
　従来の形質転換微生物に導入されていたＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａ）によるラクチルＣｏＡの供給量が十分でなかったと考えられる。
　発明者らは数多くのＣｏＡトランスフェラーゼを鋭意検討した結果、ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３ＡよりもラクチルＣｏＡの供給量が高く、３ＨＢ－ＣｏＡを供給する酵素をコードする遺伝子を欠損させていないカプリアビダス属微生物においても有効に機能し、ＬＡを３ＨＢに共重合させてＬＡＨＢを生産性良く産生することが可能なＣｏＡトランスフェラーゼを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する、カプリアビダス属に属する微生物の形質転換微生物であって、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子、並びに、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子、または、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を有する、形質転換微生物に関する。
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを、生産性良く産生することが可能な形質転換微生物を提供することができる。
　本発明に係る形質転換微生物は、３ＨＢ－ＣｏＡを供給する酵素をコードする遺伝子を保持していても、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを産生することができる。
　また、本発明に係る形質転換微生物は、天然培地を利用した培養を行う必要がなく、合成培地における培養によって、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを産生することができる。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する形質転換微生物である。
　前記共重合ポリエステルに含まれる前記他のヒドロキシアルカン酸としては、特に限定されないが、例えば、３－ヒドロキシ酪酸と共重合が可能な、炭素数２～１５のヒドロキシアルカン酸であってよい。具体的には、乳酸、グリコール酸、３－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシへプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸、３－ヒドロキシテトラデカン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、４－ヒドロキシ吉草酸、４－ヒドロキシヘキサン酸、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、３－ヒドロキシ－２－メチル吉草酸等が挙げられる。これらのうち１種類のみが前記共重合ポリエステルに含まれていてもよいし、２種類以上が含まれていてもよい。中でも、少なくとも乳酸が含まれることが好ましく、特に、３－ヒドロキシ酪酸と乳酸とから構成されるＬＡＨＢが、前記共重合ポリエステルとして好ましい。
　前記共重合ポリエステルにおける前記他のヒドロキシアルカン酸の比率は、特に限定されない。本開示に係る形質転換微生物の構成や、炭素源、培養条件等を調節して、様々な比率を持つ共重合ポリエステルを生産させることが可能である。しかし、例えば、前記共重合ポリエステルを構成する全モノマー単位に対する前記他のヒドロキシアルカン酸単位の比率は、０．１～５０モル％程度であってよく、０．５～３０モル％程度であってもよく、１～１０モル％程度であってもよい。
　カプリアビダス属に属する微生物は、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であるＰＨＢＨなどの生産において実績がある。また、大腸菌は、栄養価の高い高価な天然培地で培養する必要があるのに対し、カプリアビダス属微生物は、安価な合成培地での培養によってポリエステルを蓄積できるので、ポリエステルの工業的な生産に適している。そのため、本開示に係る形質転換微生物は、カプリアビダス属に属する微生物を宿主として利用する。中でも、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）を特に好ましく使用することができる。
　本開示に係る形質転換微生物は、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子を有する。前記共重合ポリエステル合成酵素とは、３－ヒドロキシ酪酸のＣｏＡ体と、前記他のヒドロキシアルカン酸のＣｏＡ体を基質として、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸を共重合させて、前記共重合ポリエステルを合成する活性を有する酵素である。ポリエステル合成酵素は、ポリエステル重合酵素ともいう。
　前記共重合ポリエステル合成酵素は、前記活性を有している酵素である限り特に限定されないが、３－ヒドロキシ酪酸の重合体又は共重合体を合成する活性を有する公知の酵素であってよい。そのような酵素をコードする遺伝子としては、本開示に係る形質転換微生物の宿主が本来有しているｐｈａＣ遺伝子であってもよいし、該ｐｈａＣ遺伝子に変異を導入した遺伝子であってもよいし、外来の遺伝子であってもよい。
　前記共重合ポリエステル合成酵素としては、特に限定されないが、シュードモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素又はその変異体を好適に利用することができる。前記変異体とは、前記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつ、ポリヒドロキシアルカン酸合成活性を示すタンパク質をいう。前記配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましく、９９．５％以上が最も好ましい。
　シュードモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の変異体としては、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．６１－３由来の重合酵素ＰｈａＣ１Ｐｓの３２５番目のセリンをスレオニンに変換し、４８１番目のグルタミンをリシンに変換したＳＴＱＫ変異体を好ましく使用することができる。該ＳＴＱＫ変異体は、これを大腸菌に導入してなる形質転換株を天然培地で培養することでＬＡＨＢを生産できたことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５，１７３２３－１７３２７（２００８））。
　また、前記共重合ポリエステル合成酵素として、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰｈａＣ１Ｒｅの変異体（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９７，３４４１－３４４７（２０１３））や、Ａｅｒｏｍｏｎａ　ｃａｖｉａｅ由来のＰｈａＣ及びその変異体なども利用可能である。
　本開示に係る形質転換微生物は、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＢＣＴ）をコードする外来遺伝子を有する。これらＣｏＡトランスフェラーゼは、前記他のヒドロキシアルカン酸にＣｏＡを付加して、当該ヒドロキシアルカン酸のＣｏＡ体を合成する活性を有する。導入する外来遺伝子の数は、１つでも良いし、複数であっても良い。
　これらＣｏＡトランスフェラーゼとして、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同体を使用する。配列番号２は、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ　ｓｐ．由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＥｓのアミノ酸配列を示し、配列番号３は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＣＡＧ：４６６由来のＰＣＴＦｂのアミノ酸配列を示し、配列番号４は、Ａｎａｅｒｏｔｉｇｎｕｍ　ｌａｃｔａｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のＰＣＴＡｌのアミノ酸配列を示し、配列番号５は、Ａｎａｅｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　ｈａｌｌｉｉ由来のブチルＣｏＡトランスフェラーゼであるＢＣＴＡｈのアミノ酸配列を示し、配列番号６は、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｓｐ．由来のＢＣＴＲｓのアミノ酸配列を示す。
　配列番号２～６で表されるアミノ酸配列を有する酵素は、従来報告されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼの一アミノ酸変異体であるＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａよりも、前記他のヒドロキシアルカン酸のＣｏＡ体の供給量が高いことが判明した。これら酵素をコードする遺伝子をカプリアビダス属微生物に導入することによって、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを、生産性良く産生することが可能となる。
　前記相同体とは、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつ、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。前記配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましく、９９．５％以上が最も好ましい。尚、前述したＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａのアミノ酸配列と配列番号２～６のアミノ酸配列との配列同一性はいずれも、９０％未満である。
　前記相同体は、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　前記の１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異であることが好ましく、保存的置換がより好ましい。保存的置換とは、例えば、芳香族アミノ酸同士の置換、疎水性アミノ酸同士の置換、極性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換、ヒドロシキル基を有するアミノ酸同士の置換などが挙げられる。アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、人工的な変異であっても良いし、遺伝子の由来の生物の個体差や、種の違いなどによる天然の変異であっても良い。
　ＣｏＡトランスフェラーゼは、乳酸へのＣｏＡ転移反応のみを触媒する酵素ではなく、乳酸以外のヒドロキシアルカン酸にＣｏＡを転移させる活性を有することが知られている。例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼは、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ－２－メチル酪酸等のヒドロキシアルカン酸にＣｏＡを転移させ得ることが報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２１，８４（２０２０），特開２０１９－１１９８０６号公報）。
　従って、上述した配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同体をカプリアビダス属に導入し、炭素源や培養条件を調節することで、本開示に係る形質転換微生物は、ＬＡＨＢだけではなく、３－ヒドロキシ酪酸と、乳酸以外のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを生産することができる。
　本開示に係る形質転換微生物は、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、及び、アセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ１）をコードする遺伝子をさらに有することが好ましい。
　ｐｈａＡ遺伝子は、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを形成する反応を触媒する酵素であり、βケトチオラーゼと呼ばれることもある。具体例としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、または、配列番号９に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性を示すタンパク質が挙げられる。配列番号９は、カプリアビダス・ネカトールに由来するアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す。前記配列同一性は、９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　ｐｈａＢ１遺伝子は、アセトアセチルＣｏＡを還元して、β－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ（３ＨＢ－ＣｏＡ）を形成する反応を触媒する酵素である。具体例としては、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ、または、配列番号１０に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ活性を示すタンパク質が挙げられる。配列番号１０は、カプリアビダス・ネカトールに由来するアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列を示す。前記配列同一性は、９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　形質転換微生物がｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ１遺伝子を有することによって、アセチルＣｏＡから、アセトアセチルＣｏＡを経て３ＨＢ－ＣｏＡを合成する経路を確立して３ＨＢ－ＣｏＡの供給量を増やし、前記共重合ポリエステルの生産性を高めることができる。
　カプリアビダス属微生物においては複数のアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼと複数のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼを有しているものが多いことが知られている。カプリアビダス・ネカトールにおいては、特にｐｈａＡおよびｐｈａＢ１が主要な役割を果たしており、この二つの遺伝子を破壊すると、共重合ポリエステル合成酵素が乳酸モノマーを取り込みやすくなるため乳酸分率の高いＬＡＨＢの生産が容易となるが、ＬＡＨＢの生産量が著しく低下する傾向がある。
　しかし、本開示に係る形質転換微生物が有するＣｏＡトランスフェラーゼは前記他のヒドロキシアルカン酸のＣｏＡ体の供給量が高いことから、本開示に係る形質転換微生物がｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ１遺伝子を有していても、前記他のヒドロキシアルカン酸を３－ヒドロキシ酪酸と共重合させて、生産性良く、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルを産生することが可能となる。
　しかし、本開示に係る形質転換微生物は、ｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ１遺伝子を欠損させたものであってもよい。これによって、前記共重合ポリエステル中の前記他のヒドロキシアルカン酸の比率をより高めることができる。
　本開示に係る形質転換微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードする外来遺伝子をさらに有することが好ましい。ＬＤＨは、ビルピン酸を還元してＤ－乳酸に変換する反応を触媒する酵素である。ＬＤＨ遺伝子を導入することで、ビルピン酸をＤ－乳酸に変換できる経路が確立されるので、炭素源として乳酸ではなくグルコースなどの糖類を使用して、前記共重合ポリエステル、特にＬＡＨＢを効率よく生産することが可能となる。
　前記乳酸デヒドロゲナーゼとしては、ビルピン酸をＤ－乳酸に変換する活性を有する酵素である限り特に限定されないが、例えば、大腸菌由来の乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌｉｍｕｌｕｓ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼ、それらの変異体等が挙げられる。前記変異体とは、前記乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を示すタンパク質をいう。前記配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましく、９９．５％以上が最も好ましい。
　カプリアビダス属微生物に外来の遺伝子を導入するにあたって、導入遺伝子は、宿主となる微生物が保有する染色体上、あるいはプラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良い。導入遺伝子の保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。
　微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換または挿入する方法、あるいは微生物が保有するＤＮＡの任意の部位を欠失させる方法は当業者に周知であり、本開示に係る形質転換微生物を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９または２００１）などに記載される技術を利用することができる。
　導入する遺伝子の塩基配列は特に限定されないが、宿主のカプリアビダス属微生物にあわせて適宜最適化すればよい。
　導入遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、例えば、大腸菌に由来するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＮ１７プロモーター、ｌａｃＮ１９プロモーター、これらの改変体等が使用可能である。また、外来のプロモーターを用いず、ゲノムＤＮＡ上の対象遺伝子を挿入する位置付近に元来存在するプロモーター配列を利用することもできる。さらに、前記の元来存在するプロモーター配列と外来のプロモーターを組み合わせて利用することもできる。
　（微生物の培養）
　本開示に係る形質転換微生物を培養することで、微生物細胞内に前記共重合ポリエステルを蓄積させることができる。前記形質転換微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
　培養時の炭素源としては、前記形質転換微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロース、キシロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；Ｄ－乳酸等の前記他のヒドロキシアルカン酸；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。また、前記形質転換微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
　前記共重合ポリエステルの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　前記形質転換微生物の培養を適切な時間行なって微生物細胞内に前記共重合ポリエステルを蓄積させた後、周知の方法を用いて前記共重合ポリエステルを回収する。回収方法については特に限定されないが、工業的には、環境負荷の低い水系における分離・精製による回収が好ましい。例えば、培養終了後、機械的なせん断力を加えたり、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いて細胞を破砕したりすることで、前記共重合ポリエステル以外の細胞成分が水に溶解した細胞破砕液を得ることができる。前記細胞破砕液の濾過や遠心分離によって前記共重合ポリエステルを水相から分離した後、乾燥させることで、前記共重合ポリエステルを回収することができる。
　以下の各項目では、本開示における好ましい態様を列挙するが、本発明は以下の各項目に限定されるわけではない。
［項目１］
　３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する、カプリアビダス属に属する微生物の形質転換微生物であって、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子、並びに、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子、または、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を有する、形質転換微生物。
［項目２］
　配列番号９で表されるアミノ酸配列または配列番号９に対して９０％以上の配列同一性を有するアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、および、配列番号１０で表されるアミノ酸配列または配列番号１０に対して９０％以上の配列同一性を有するアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、の少なくとも１種をさらに有する、項目１に記載の形質転換微生物。
［項目３］
　乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに有する、項目１又は２に記載の形質転換微生物。
［項目４］
　前記共重合ポリエステル合成酵素が、シュードモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素又はその変異体である、項目１～３のいずれかに記載の形質転換微生物。
［項目５］
　前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである、項目１～４のいずれかに記載の形質転換微生物。
［項目６］
　項目１～５のいずれかに記載の形質転換微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合体ポリエステルの製造方法。
［項目７］
　前記共重合体ポリエステルが、前記他のヒドロキシアルカン酸として、少なくとも乳酸を含む、項目６に記載の製造方法。
［項目８］
　前記共重合体ポリエステルが、３－ヒドロキシ酪酸と乳酸との共重合体である、項目７に記載の製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
（宿主）
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株を遺伝子組換えし、ゲノム上のＰＨＡ重合酵素遺伝子ｐｈａＣ１Ｒｅを別のＰＨＡ重合酵素遺伝子と入れ替え、ＰＨＡ分解酵素遺伝子ｐｈａＺ１，２，６を破壊し、グルコース資化能を強化するためにＮ－アセチルグルコサミンの取り込み遺伝子であるｎａｇＥの７９３番目の塩基であるＧをＣに置換し、さらに転写制御因子をコードする遺伝子であるｎａｇＲを破壊したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ株（国際公開第２０１７／１０４７２２号参照）を準備した。
　（遺伝子改変用プラスミドの作製）
　Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１１および配列番号１２で示されるオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）を用いた。同様に、配列番号１３および配列番号１４で示されるＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた二つのＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１１および配列番号１４で示されるＤＮＡをプライマーとして用いてオーバーラップＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片は、ＰＨＡ重合酵素遺伝子ｐｈａＣ１ＲｅのＯＲＦの上流約５００塩基対と下流約５００塩基対を連結した断片である。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで処理し、同じくＳｍｉＩ処理を行ったベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ（特開２００７－２５９７０８に記載）とＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。得られた配列番号１５で示される塩基配列を含む遺伝子破壊用プラスミドを、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔＰｈａＣ１Ｒｅと命名した。
　同様に、ゲノム上のＰＨＡ重合酵素遺伝子ｐｈａＣ１Ｒｅを、ＳＴＱＫ変異体（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　６１－３由来の重合酵素ＰｈａＣ１Ｐｓの３２５番目のセリンをスレオニンに変換し、４８１番目のグルタミンをリシンに変換したＰＨＡ重合酵素）をコードする、配列番号１６で示される塩基配列を有する遺伝子に入れ替えるためのプラスミドとして、配列番号１７で示される塩基配列を含むｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰｈａＣ１Ｒｅ：：ＳＴＱＫを作製した。
　（相同組換えによるＣ．ｎｅｃａｔｏｒの遺伝子改変）
　前記遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔＰｈａＣ１Ｒｅを大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）にエレクトロポレーション法により導入し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養し、接合伝達を行った。
　混合培養後の菌群から、ゲノム上にプラスミドが挿入された株を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸水素二アンモニウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で選別し、単離取得した。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地で単離した株をさらに純化した後、ショ糖を１５％含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地に植菌し、プラスミドが脱離した株を取得した。相同組換えにより、プラスミド脱離の段階で、元のゲノム配列に戻る株とｐｈａＣ１Ｒｅの配列が欠損した株の二種類が発生し、コロニーＰＣＲにより後者を単離取得した。取得した遺伝子欠損株を、再度ショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地で純化し、Ｈ１６　ΔｐｈａＣ１Ｒｅ　ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ株を取得した。
　得られたＨ１６　ΔｐｈａＣ１Ｒｅ　ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ株を、次に、前記プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰｈａＣ１Ｒｅ：：ＳＴＱＫで遺伝子改変し、ｐｈａＣ１Ｒｅの位置にＳＴＱＫ遺伝子が挿入されたＨ１６　ｐｈａＣ１Ｒｅ：：ＳＴＱＫ　ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ株を取得した。この株を宿主（１）とする。
　（ＣｏＡトランスフェラーゼ）
　配列番号１～７で示されるアミノ酸配列を有するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする塩基配列を、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒのコドンに最適化した塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工合成した。
　（ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の導入）
　各ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＵＰ２ベクター（国際公開第２００７／０４９７１６号参照）をＭｕｎＩ　とＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、各ＣｏＡトランスフェラーゼの発現ベクターを得た。この発現ベクターを宿主（１）にエレクトロポレーション法で導入した。適宜カナマイシンを添加してプラスミドを保持させた。各ＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号１８～２１で示される塩基配列を有するｔｒｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ＲＥＰプロモーター、又はｌａｃＮ１７プロモーターを用いて発現させた。これらのプロモーターは、ｔｒｃ＞ｌａｃＵＶ５＞ＲＥＰ＞ｌａｃＮ１７の順番に発現量が高くなることが報告されている（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔ．，１５，１８４（２０１６），及び、国際公開第２０１９／１４２８４５号を参照）。
　（ポリエステルの生合成）
　各ＣｏＡトランスフェラーゼの発現ベクターを導入したバイオポリマー生産菌を、肉培地（組成：１％（ｗ／ｖ）肉エキス、１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．２％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、０．１５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、５０μｇ／Ｌカナマイシン）を用いて終夜で前培養した。
　次いで、炭素源としてＤ－乳酸又はグルコースを２０ｇ／Ｌ含む合成培地（組成：１．１％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、０．１９％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１２９％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．１５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水和物、５０μｇ／Ｌカナマイシン、０．７５％（ｖ／ｖ）微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）塩酸鉄（ＩＩ）六水和物、１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム二水和物、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化コバルト六水和物、０．０１６％（ｗ／ｖ）硫酸銅五水和物、０．０１２％（ｗ／ｖ）塩化ニッケル六水和物））を入れた阪口フラスコに植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで７２時間培養後、全量集菌し真空乾燥させた。ここで、ＰＨＡの生産は合成培地のみを用いた一段培養で行った。
　培養後、ポリエステルの生産量（ｇ／Ｌ）をガスクロマトグラフィーによって定量した。
　各株によって生合成されたポリエステルを、エタノールおよびヘキサンで洗浄した乾燥菌体からクロロホルムにより抽出し、クロロホルムを揮発除去して回収した。得られたポリエステルについて、１Ｈ　ＮＭＲにより組成分析を行い、ＬＡ分率を算出した。結果を表１に示す。
　実施例１では、宿主（１）において、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ　ｓｐ．由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼであるＰＣＴＥｓ（配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する）を、実施例２では、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＣＡＧ：４６６由来のＰＣＴＦｂ（配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する）を、実施例３では、Ａｎａｅｒｏｔｉｇｎｕｍ　ｌａｃｔａｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のＰＣＴＡｌ（配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する）を、実施例４では、Ａｎａｅｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　ｈａｌｌｉｉ由来のブチルＣｏＡトランスフェラーゼであるＢＣＴＡｈ（配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する）を、実施例５では、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｓｐ．由来のＢＣＴＲｓ（配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する）を発現させたものである。これら実施例１～５では、炭素源としてＤ－乳酸を使用して培養を行った。
　実施例１～５では、得られたポリエステルにおいて、ＧＣ分析及び１Ｈ　ＮＭＲ測定で３－ヒドロキシ酪酸と乳酸の存在が確認され、ポリエステル中のＬＡ分率は３～５モル％であり、ポリエステルとしてＬＡＨＢが生合成されたことが確認された。これによって、配列番号２～６で表されるアミノ酸配列を有するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入したカプリアビダス属の形質転換微生物によって、３－ヒドロキシ酪酸と乳酸の共重合ポリエステルを、生産性良く産生できることが示された。
　各実施例における形質転換株はｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ１遺伝子を保持しており、豊富な３ＨＢ－ＣｏＡの供給量のなかでも乳酸を共重合できたことから、各実施例で用いたＣｏＡトランスフェラーゼはラクチルＣｏＡの供給能が高いことが分かる。一方で、過去にＣ．ｎｅｃａｔｏｒや大腸菌などによるＬＡＨＢの生合成が報告されているプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａ（配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する）を、ｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ１遺伝子を保持した宿主（１）に、ｔｒｃまたはｌａｃＮ１７プロモーターで発現させて、Ｄ－乳酸を炭素源に培養したが、ポリエステルは生産されたものの、乳酸の共重合化は確認できなかった。この結果から、ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３ＡはラクチルＣｏＡの供給量が十分ではないことが示された。
　また、プロモーターとして、実施例１及び２ではＲＥＰプロモーター、実施例３ではｌａｃＵＶ５プロモーター、実施例４及び５ではｔｒｃプロモーターを使用した。実施例１～３では、ｔｒｃプロモーターよりも発現量が低いプロモーターを使用しているにも関わらず、実施例４～５よりも高い比率で乳酸を共重合できたことから、実施例１～３で用いたＣｏＡトランスフェラーゼはラクチルＣｏＡの供給能が特に高いものと推測される。ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａではｔｒｃプロモーターを使用したが、ＬＡＨＢの生産が確認できず、この結果からもＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３ＡはラクチルＣｏＡの供給量が十分ではないことが示された。
　また、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＭｅ（配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する）、又は、Ｔｙｚｚｅｒｅｌｌａ　ｓｐ．　Ａｎ１１４由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＴｓ（配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する）を、ｔｒｃプロモーターで発現させ、炭素源としてＤ－乳酸を用いて培養を行ったが、上記と同様、ポリエステルは生合成されたものの、得られたポリエステルにおいて乳酸の共重合を示す結果は得られなかった。尚、ＰＣＴＭｅおよびＰＣＴＴｓのアミノ酸配列と配列番号２～６のアミノ酸配列との配列同一性はいずれも、９０％未満である。
　（グルコースを炭素源とする培養例）
　次に、グルコースからＤ－乳酸を産生できるように、外来の乳酸デヒドロゲナーゼを導入した株を用いて、ＰＣＴと強発現させることでグルコースからＬＡＨＢを生産した例を示す。
　まず、宿主（１）のゲノム上のｐｈａＪ４ａ（Ｌｏｃｕｓ　ｔａｇ：Ｈ１６＿Ａ１０７０）のＯＲＦと置き換える形で、ｌａｃＮ１７プロモーターでＥｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ　ｓｐ．由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＥｓを発現させる遺伝子配列を導入可能なプラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＪ４ａ：：ｌａｃＮ１７－ＰＣＴＥｓを作製した。このプラスミドは、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢベクターに、配列番号２２で表されるＤＮＡ断片をライゲーションにより挿入したプラスミドである。
　この遺伝子導入用のプラスミドを用いて、宿主（１）を、前述した相同組替え法を用いて遺伝子改変し、Ｈ１６　ｐｈａＣ１Ｒｅ：：ＳＴＱＫ　ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥ　Ｇ７９３Ｃ．ｄＲ　ｐｈａＪ４ａ：：ｌａｃＮ１７－ＰＣＴＥｓ株を作製した。これを宿主（２）とする。
　この宿主（２）に、適当な発現ベクターでＤ－乳酸を産生できる酵素を発現させれば、グルコースからのＬＡＨＢの生合成が可能となる。
　実施例６では、まず、Ｄ－乳酸を産生させる酵素として、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨＥｃをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、強力なｔｒｃプロモーターの下流に連結した配列番号２４で示される塩基配列をもつＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ベクターｐＣＵＰ２－ｔｒｃ－ＬＤＨＥｃを得た。
　次いで、このベクターを宿主（２）にエレクトロポレーション法で導入し、炭素源としてグルコースを用いた培養を行ったところ、ＬＡ分率が１．１ｍｏｌ％のＬＡＨＢを５ｇ／Ｌの生産量で生合成することができた。
　実施例７は、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するＬｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ由来の乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨＬｐをｔｒｃプロモーターで発現できる配列番号２６で示される塩基配列を、ｐＣＵＰ２ベクターに導入したベクターｐＣＵＰ２－ｔｒｃ－ＬＤＨＬｐを作製し、このベクターを宿主（２）にエレクトロポレーション法で導入し、炭素源としてグルコースを用いた培養を行ったものである。結果、ＬＡ分率が０．９ｍｏｌ％のＬＡＨＢを４ｇ／Ｌの生産量で生合成することができた。
　一方、比較例１は、ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａを、ｔｒｃプロモーターで発現させると共に、大腸菌由来の乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨＥｃをｔｒｃプロモーターで発現させ、炭素源としてグルコースを用いて培養を行ったものである。ポリエステルは生合成されたものの、得られたポリエステルにおいて、ＧＣ分析と１Ｈ　ＮＭＲ分析のいずれでも、乳酸の共重合を示す結果は得られなかった。
　また、比較例１のポリマー生産性は実施例６及び７よりも低くなっていることから、実施例６及び７で使用したプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼＰＣＴＥｓが、ＬＡＨＢの生産にきわめて適していることが示された。
　尚、比較例１のＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａを、ｔｒｃプロモーターよりも高い発現量を示すプロモーターによって発現させることを試みたが、そのようなプロモーターでＰＣＴｃｐ　Ｖ１９３Ａを発現する形質転換体は得られなかった。したがって、ＰＣＴＣｐ　Ｖ１９３Ａで実現可能なＬＡ分率の限界値はｔｒｃプロモーターで発現した場合の値であると推測される。

Claims (8)

  1. 　３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合ポリエステルの産生能を有する、カプリアビダス属に属する微生物の形質転換微生物であって、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子、並びに、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子、または、配列番号２～６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性又はブチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を有する、形質転換微生物。
  2. 　配列番号９で表されるアミノ酸配列または配列番号９に対して９０％以上の配列同一性を有するアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、および、配列番号１０で表されるアミノ酸配列または配列番号１０に対して９０％以上の配列同一性を有するアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、の少なくとも１種をさらに有する、請求項１に記載の形質転換微生物。
  3. 　乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに有する、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
  4. 　前記共重合ポリエステル合成酵素が、シュードモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素又はその変異体である、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
  5. 　前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
  6. 　請求項１又は２に記載の形質転換微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシ酪酸と他のヒドロキシアルカン酸との共重合体ポリエステルの製造方法。
  7. 　前記共重合体ポリエステルが、前記他のヒドロキシアルカン酸として、少なくとも乳酸を含む、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記共重合体ポリエステルが、３－ヒドロキシ酪酸と乳酸との共重合体である、請求項７に記載の製造方法。
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DATABASE UniProtKB ANONYMOUS : "Acyl CoA:acetate/3-ketoacid CoA transferase - Epulopiscium sp |", XP093148607, retrieved from UniProt *
NICOLE LINDENKAMP, MARC SCHÜRMANN, ALEXANDER STEINBÜCHEL: "A propionate CoA-transferase of Ralstonia eutropha H16 with broad substrate specificity catalyzing the CoA thioester formation of various carboxylic acids", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 97, no. 17, 1 September 2013 (2013-09-01), Berlin/Heidelberg, pages 7699 - 7709, XP055241903, ISSN: 0175-7598, DOI: 10.1007/s00253-012-4624-9 *
SI JAE PARK, YOUNG-AH JANG, HYUK LEE, A-REUM PARK, JUNG EUN YANG, JIHOON SHIN, YOUNG HOON OH, BONG KEUN SONG, JONGGEON JEGAL, SEUN: "Metabolic engineering of Ralstonia eutropha for the biosynthesis of 2-hydroxyacid-containing polyhydroxyalkanoates", METABOLIC ENGINEERING, ACADEMIC PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 20, 1 November 2013 (2013-11-01), AMSTERDAM, NL, pages 20 - 28, XP055637427, ISSN: 1096-7176, DOI: 10.1016/j.ymben.2013.08.002 *

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