JP6719135B2

JP6719135B2 - ｍｔｇＡ遺伝子の欠損した微生物

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Publication number: JP6719135B2
Application number: JP2017521879A
Authority: JP
Inventors: 精一田口; 亨介門屋
Original assignee: Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2020-07-08
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Description

本発明は、バイオプラスチックを高生産するために使用されるｍｔｇＡ遺伝子に変異を有する宿主細菌株、および該細菌株の製造方法、ならびにバイオプラスチックを高生産するｍｔｇＡ遺伝子に変異を有する細菌株、該細菌株を培養することによってバイオプラスチックを高生産する方法、および該細菌株の製造方法に関する。

近年、石油などの化石燃料の消費を抑制した環境負荷の少ない技術が注目され、バイオマス資源を原料とするバイオプラスチックの生産が世界で盛んに行われるようになった。微生物生産バイオプラスチックは、再生可能なバイオマスから微生物細胞内で合成されるバイオプラスチックであり、汎用プラスチック材料として開発され、環境的または生物化学的用途にも適用可能である。微生物ポリエステルは微生物生産バイオプラスチックの一種であり、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡともいう）と総称され、３−ヒドロキシブチレート（以下、３ＨＢともいう）を含む多くの構成モノマーが報告されている。なかでも、構成モノマーとして炭素数３〜１４個程度のヒドロキシアルカノエートを含むポリマーが一般的であり、特に、ポリ乳酸等の乳酸モノマーを含むバイオプラスチックは最も実用化が進んでいる。微生物細胞内のＰＨＡ合成経路は、代謝経路からのモノマー供給およびＰＨＡ重合酵素によるモノマー重合からなり、モノマー供給にはモノマー供給酵素が関与する。

これまでに、微生物生産バイオプラスチックの生産量増加の戦略として、細胞あたりの生産性向上のために、ＰＨＡ重合酵素への優良変異の導入、プロモーターの強化によるＰＨＡ重合酵素遺伝子発現量の増大、細胞内の代謝の流束強化などについて研究されている。また、ｐＨまたは溶存酸素量などのバイオプラスチック生産菌の培養条件も検討された。例えば、種々のテイラーメードＰＨＡの高収量生産を達成する目的で、天然および遺伝子操作したＰＨＡ生合成経路を組み込んだ組み換え大腸菌（Escherichia coli）系の研究が報告されている（非特許文献１〜３）。

単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（monofunctional peptidoglycan transglycosylase、以下、ＭｔｇＡともいう）は、ペプチドグリカン合成に関与する酵素である。ペプチドグリカンは、細菌の細胞内膜の外側に層を形成する細胞壁の主成分であり、細胞形態の維持に重要な役割を果たすことが知られている。これまでに、ＭｔｇＡと微生物生産バイオプラスチックの生産性向上との関連性についての報告はない。

Le Meur S, et al, Microb Cell Fact 2014; 13: 131 Matsumoto K, et al., J Biotechnol 2011; 156: 214-217 Matsumoto K, et al., Biomacromolecules 2013; 14: 1913-1918

現在もなお、微生物によるバイオプラスチック生産のさらなる改良が求められている。本発明は、バイオプラスチック生産量を向上させた細菌株の開発を目的とする。

本発明者らは、微生物によるバイオプラスチック生産のさらなる改良のために、バイオプラスチック生産量の向上に間接的に寄与する陽性因子を探索する目的で、乳酸ベースのポリエステルであるポリ（乳酸−コ−３−ヒドロキシブチレート）［以下、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）ともいう］の生合成系を含む大腸菌にゲノムワイドにトランスポゾン変異を導入し、作成した変異体ライブラリーをスクリーニングした。その結果、ペプチドグリカン合成に関与する単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子配列に変異が導入された株が、該変異のない対照株（親株）と比べて、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）を高生産することを見出した。さらに、興味深いことに、該変異株は細胞内でのバイオプラスチックの合成・蓄積に伴って、その細胞形態を膨張させて細胞体積を増大することが見出された。かくして、本発明を完成した。

すなわち、本発明は下記の態様を包含する。
［１］単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子の変異を含む細菌株であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、バイオプラスチック生産用宿主細菌株、
［２］単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子の変異を含み、バイオプラスチック生合成系遺伝子群をさらに含む、バイオプラスチックを生産する細菌株であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、細菌株、
［３］大腸菌である、［１］または［２］記載の細菌株、
［４］変異が、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせである、［１］〜［３］のいずれか１項記載の細菌株、
［５］バイオプラスチックが乳酸および３−ヒドロキシブチレートを含むコポリマーまたはポリ３−ヒドロキシブチレートである、［２］〜［４］いずれか１項記載の細菌株、
［６］バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、およびＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を含む、［２］〜［５］のいずれか１項記載の細菌株、
［７］バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに含む、［６］記載の細菌株、
［８］バイオプラスチック生産時に細胞体積を増大させる、［２］〜［７］のいずれか１項記載の細菌株、
［９］［２］〜［８］のいずれか１項記載の細菌株をバイオプラスチック生産を可能とする条件下で培養することを含む、バイオプラスチックの製造方法、
［１０］単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子を変異させることを含むバイオプラスチック生産用宿主細菌株の製造方法であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、製造方法、
［１１］単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子を変異させること、およびバイオプラスチック生合成系遺伝子群を導入することを含むバイオプラスチックを生産する細菌株の製造方法であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、製造方法、
［１２］変異が、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせである、［１０］または［１１］記載の方法、
［１３］バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、およびＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を含む、［１１］または［１２］記載の方法、および
［１４］バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに含む、［１３］記載の方法。

本発明によれば、バイオプラスチックを高生産する細菌株、該細菌株を培養することによってバイオプラスチックを高生産する方法、および該細菌株の作成方法が提供される。また、本発明の細菌株は、高い対糖収率でバイオプラスチックを安定に合成することができる。本発明の細菌株は、その細胞体積を増大させて、多量のバイオプラスチックを蓄積することができる。さらに、本発明によれば、バイオプラスチックを高生産するための宿主として利用できる細菌株が提供され、かかる細菌株は、微生物生産バイオプラスチック合成用のプラットフォームとして有用である。

本発明のバイオプラスチックを高生産する細菌によるＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）の合成の模式図である。図中、「ＬＤＨ」は乳酸脱水素酵素、「ＰＣＴ」はプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、「ＰｈａＡ」はβ−ケトチオラーゼ、「ＰｈａＢ」はアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、「ＰｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）」は３２５位のＳｅｒからＴｈｒへの変異および４８１位のＧｌｎからＬｙｓへの変異を有するＰＨＡシンターゼ、「ＰＢＰｓ」はペニシリン結合タンパク質を示す。本発明のバイオプラスチックを高生産する細菌によるバイオプラスチック生産の増加およびグルコース消費を示すグラフである。図中、棒グラフがバイオプラスチック生産量を表し、折れ線グラフが培地中のグルコース量を表す。（Ａ）は、ｍｔｇＡ遺伝子欠損を有しない対照株の結果を示し、（Ｂ）は、本発明のバイオプラスチックを高生産する細菌による結果を示す。本発明のバイオプラスチックを高生産する細菌によるバイオプラスチック生産の増加を示すグラフである。図中、「野生型」はｍｔｇＡ遺伝子欠損を有しない対照株を示し、「変異体（ΔｍｔｇＡ）」は本発明のバイオプラスチックを高生産する細菌を示す。

本発明において使用される細菌は、グラム陰性菌である。かかるグラム陰性菌の例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｌｃａｌｌｇｅｎｅｓ属細菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属細菌、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｖｉｂｒｉｏ属細菌などが挙げられる。好ましくは、大腸菌が使用される。

本発明の細菌は、単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子（以下、「ｍｔｇＡ遺伝子」ともいう）に変異を含み、該変異は、ＭｔｇＡの不活性化をもたらす変異であるか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす変異である。このような変異を、本願明細書においては、「ｍｔｇＡ遺伝子の欠損」ともいう。「変異のない対照株」とは、ｍｔｇＡ遺伝子に変異を含まない（すなわち、ｍｔｇＡ遺伝子の欠損を有しない）株であり、例えば、野生株、または当該変異を導入する前の親株を意味する。「不活性化」には、活性の喪失、抑制および低減が含まれる。すなわち、「ＭｔｇＡの不活性化」には、ＭｔｇＡ活性の喪失、抑制または低減、ＭｔｇＡの発現の喪失、抑制または低減、およびＭｔｇＡをコードする遺伝子の機能の喪失、抑制または低減が含まれる。ＭｔｇＡは、ペプチドグリカン合成に関与する酵素である。本発明において、ＭｔｇＡをコードする遺伝子における変異は、ＭｔｇＡの不活性化またはＭｔｇＡ活性の低減をもたらすいずれの変異であってもよく、当該分野で知られた方法によって変異を導入することができる。例えば、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせや、ＭｔｇＡをコードする遺伝子への少なくとも１つの停止コドンの挿入、フレームシフト突然変異を導入するための１以上の塩基の挿入もしくは欠失、ＭｔｇＡをコードする遺伝子内の１以上の点突然変異の導入等が挙げられる。

かくしてＭｔｇＡをコードする遺伝子内に変異が導入された上記の細菌は、バイオプラスチック生産のための宿主細菌として使用することができる（以後、「本発明の宿主細菌株」ともいう）。該宿主細菌に、所望のいずれかのバイオプラスチック生合成系遺伝子群を導入し、それにより、バイオプラスチック生産細菌を得ることができる。あるいは、本発明においては、バイオプラスチック生合成系遺伝子群を有する細菌のＭｔｇＡをコードする遺伝子内に変異を導入してもよい。かくして得られたバイオプラスチック生産細菌を本明細書において「本発明の細菌株」ともいう。

バイオプラスチックとは、デンプンや糖などのバイオマス資源から生産されるプラスチックをいう。本発明におけるバイオプラスチックは、微生物によってその体内で生産される、微生物生産バイオプラスチックである。微生物生産バイオプラスチックの例としては、例えば、ポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリヒドロキシアルカノエートなどのポリエステルなどが挙げられる。

本発明において、「バイオプラスチック生合成系遺伝子群」とは、細菌内でバイオプラスチックが合成されるために必要な２以上の酵素、例えば、モノマー供給酵素およびＰＨＡ重合酵素をコードする２以上の遺伝子を意味する。モノマー供給酵素としては、例えば、β−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）、などが挙げられる。ＰＨＡ重合酵素としては、例えば、ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ１）、乳酸重合酵素（ＬＰＥ）、クラス３ＰＨＡシンターゼサブユニット（ＰｈａＥ）、クラス４ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＲ）などが挙げられる。これらの酵素は、天然酵素であってもよく、または変異型酵素であってもよい。変異型酵素としては、例えば、ＰｈａＣ１の変異体、例えば、３２５位のＳｅｒからＴｈｒへの変異および４８１位のＧｌｎからＬｙｓへの変異を有するＰＨＡシンターゼ［ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）］、上記ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）の３９２位のＰｈｅからＳｅｒへの変異を有するＰＨＡシンターゼ［ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ）］などが挙げられる。ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）は、乳酸重合酵素としても使用される。上記の酵素をコードする遺伝子としては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａなど由来のβ−ケトチオラーゼ遺伝子：例えば、Ｚｏｏｇｌｏｅａ属、例えばＺｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａなど由来のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子：例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等由来のエノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子：例えばＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ属、例えば、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉなど、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍなど由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子；例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属、例えばＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６８０３など由来のＰＨＡシンターゼ遺伝子が挙げられる。バイオプラスチック生合成系遺伝子群の遺伝子は、バイオプラスチックを生産する細菌に内在する遺伝子であってもよく、または外来性遺伝子であってもよい。また、バイオプラスチック生合成系遺伝子群の全ての遺伝子がバイオプラスチック生産細菌の内在性遺伝子であってもよく、またはバイオプラスチック生合成系遺伝子群の全てが外来性遺伝子であってもよく、あるいはバイオプラスチック生合成系遺伝子群の一部が内在性遺伝子であって、残りが外来性遺伝子であってもよい。

バイオプラスチック生合成系遺伝子が外来性である場合、ベクター等を用いて通常の遺伝子組み換え技術により該遺伝子を宿主細菌細胞内に導入すればよい。該遺伝子を導入するためのベクターの例としては、宿主中で自立複製可能なベクターが挙げられ、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。さらに、宿主細菌細胞に導入する該遺伝子は、適当なプロモーターの下流に連結していてもよい。該プロモーターは、宿主細菌内で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれであってもよく、使用される宿主細胞に応じて選択することができる。また、ベクターには、必要に応じて、エンハンサー配列、ターミネーター配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。該ベクターは、当業者に知られた通常の方法によって宿主細菌に導入すればよい。該導入方法としては、例えば。接合伝達法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

バイオプラスチック生合成系遺伝子群を宿主細菌に導入することにより、該細菌はバイオプラスチック生合成経路を付与され、バイオプラスチック生産が可能となる。

バイオプラスチック生合成系遺伝子群は、生産したい所望のバイオプラスチックの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、所望のバイオプラスチックがＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）である場合、バイオプラスチック生合成系遺伝子群は、例えば、ＰＣＴ、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ、およびＰｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）をコードする遺伝子群を含む。例えば、所望のバイオプラスチックがＰ（３ＨＢ）である場合、バイオプラスチック生合成遺伝子群は、例えば、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ、及びＰｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）をコードする遺伝子群を含む。

本発明の細菌株により生産されるバイオプラスチックとしては、特に限定されないが、例えば、ポリエステル、例えば、ポリ乳酸、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）、ポリ３−ヒドロキシブチレート（以下、Ｐ３ＨＢともいう）、３ＨＢと他のヒドロキシアルカノエートとのコポリマー、例えば、３ＨＢとヒドロキシ酢酸とのコポリマー［Ｐ（ＧＬ−ｃｏ−３ＨＢ）］、ポリ２−ヒドロキシブチレート［Ｐ（２ＨＢ）］、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）］、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］などが挙げられる。

上記のようにして得られた、バイオプラスチック生合成系遺伝子群を含み、かつ、ＭｔｇＡをコードする遺伝子に、ＭｔｇＡの不活性化をもたらす変異、または変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす変異を含む細菌株を、炭素源を含む培地で培養することにより、バイオプラスチックを製造することができる。該バイオプラスチックは、細菌細胞内で生産され、蓄積される。

培地に含有させる炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物などが挙げられる。その他、培地は、窒素源、例えば、窒素源、例えば塩化アンモニウム、無機物として、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カルシウムなどを含んでいてもよい。例えば、本発明の細菌株を培養する培地として、グルコースおよびパントテン酸カルシウムを含有するＬＢ培地などを使用することができる。また、培地には、適宜、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコールなどの抗生物質を添加してもよい。

本発明の細菌株を上記培地中で培養する条件は、使用される細菌の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、振盪培養などの好気条件下、２５℃〜３７℃で、２４時間以上培養する。使用される細菌の種類にもよるが、好ましくは、好気条件下、糖（グルコースの最終濃度として２％）を含有するＬＢ培地中、３０℃で４８時間以上培養する。

かくして細菌細胞内で生産され、蓄積されたバイオプラスチックは、当業者に知られた方法にしたがって回収することができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を収集し、乾燥し、クロロホルム等によって抽出、次いで精製することができる。

本発明の細菌株を上記の適当な培養条件下で培養した場合、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の変異を含まない対照株と比べて、増加した量のバイオプラスチックを生産する。また、本発明の細菌株は、バイオプラスチック生産時にその細胞サイズを増大させることが観察された。さらに、このような細菌の細胞サイズ増大は、細胞の細胞長（長軸）（ｘ）よりも細胞幅（短軸）（ｙ）の長さを顕著に増加させた。したがって、サイズが増大した細胞は、風船のように膨らんだ形態を有する（以下、肥満細胞ともいう）。一方、バイオプラスチック生合成系遺伝子群を含まない本発明の細菌株（本発明の宿主細菌株にバイオプラスチック生合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入したもの；以後、「バイオプラスチック非生産条件」ともいう）を上記の適当な培養条件下で培養しても、このような細胞サイズの増大は観察されず、対照株と変わらない形態を示した。したがって、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の変異による細胞サイズに対する影響は、バイオプラスチック生合成および蓄積に連動していることが分かった。このような細胞サイズの増大はおそらく、細胞内で合成されたバイオプラスチックからの外向きの圧力によるものと考えられる。このようにバイオプラスチック生産増加および細胞サイズの増大の両方を誘導する単一遺伝子の変異は、発明者らの知る限りにおいて、これまでに報告がなく、初めて見出されたものである。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
［材料および方法］
１．プラスミド、株、および増殖条件
実施例において使用した大腸菌株を表１に示す。Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐｃｔ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来の乳酸（ＬＡ）重合活性を有する遺伝子改変ＰＨＡシンターゼ［ｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）］、およびＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ由来の３ＨＢ−ＣｏＡ供給酵素β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（各々、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ）を含む発現ベクターｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを作成し、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）生産のために使用した。該発現ベクターの作成方法等については、以前の記載のとおりである（参考文献１〜４）。Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）の合成系モデルを図１に示す。ｐＴＳ５２を接合のためのヘルパープラスミドとして用いた（参考文献５）。

バイオプラスチック生産のために、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを有する組み換え大腸菌を２０ｇ／ｌグルコースおよび１０ｍＭパントテン酸カルシウムを含有する１．７ｍｌのＬＢ培地上、３０℃で４８時間、１８０ｒｐｍで振蘯培養した。培地には、必要に応じて、アンピシリン（Ａｍｐ）１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｋｍ）２５μｇ／ｍｌ、およびクロラムフェニコール（Ｃｍ）２５μｇ／ｍｌを加えた。ＡＳＫＡクローンからｐＣＡ２４Ｎ−ｍｔｇＡを入手した。バイオプラスチック非生産条件として、バイオプラスチック生合成系遺伝子群を含まないプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）で大腸菌を形質転換し、上記と同じ培養条件下で培養した。

２．大腸菌ＪＭ１０９の変異体ライブラリーの構築および陽性変異体のスクリーニング
トランスポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ５を用いることによって、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）を生産する大腸菌ＪＭ１０９株の変異体ライブラリーを作成した。ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢ（Ａｍｐ耐性）およびｐＳＴ５２（Ｃｍ耐性）を大腸菌ＪＭ１０９に導入して、組換え体を得た。ｐＵＴｍｉｎｉ−Ｔｎ５Ｋｍ（Ａｍｐ耐性、Biomedical, Seville, Spain、参考文献９)を導入した大腸菌Ｓ１７−１λ−ｐｉｒを用いて、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢ（Ａｍｐ耐性）およびｐＳＴ５２（Ｃｍ耐性）を含む組換え大腸菌ＪＭ１０９にｍｉｎｉ−Ｔｎ５トランスポゾン（Ｋｍ耐性）を接合伝達した。Ｓ１７−１およびＪＭ１０９細胞の接合は、ＬＢ寒天プレート上、３０℃で１６時間行った。該細胞を１０ｍＭＭｇＳＯ_４中に懸濁し、Ｃｍ、ＫｍおよびＡｍｐを含有するＬＢプレート上で培養した。Ｃｍにより、Ｓ１７−１細胞が除去された。Ｋｍにより、トランスポゾンが挿入されたＪＭ１０９細胞が選択された。Ａｍｐにより、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを維持した。該プレートを３０℃で１６時間インキュベートした。トランスポゾンが挿入された、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを含有するＪＭ１０９を、２％グルコース、Ａｍｐ、Ｋｍおよび０．５μｇ／ｍｌナイルレッド（Sigma-Aldrich）を含有するＬＢプレート上でスクリーニングした。トランスイルミネーター下で強い蛍光を発するコロニーを候補として選択し、以前に記載されたように（参考文献１０）、バイオプラスチック生産量を測定するためのＨＰＬＣ分析に付した。簡単に言うと、細胞を濃硫酸で１２０℃で直接処理して、ポリエステルを不飽和クロトン酸に変換し、ＵＶ検出器を用いて２１０ｎｍにて測定した（参考文献１１、１２）。上清中のグルコースの濃度は、屈折率検出器を備えたＨＰＬＣによって、以前に記載されたように測定した（参考文献１３）。

３．トランスポゾン挿入部位の同定
逆ＰＣＲ法を用いて、トランスポゾン挿入部位を同定した。大腸菌の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、セルフライゲーションし、トランスポゾン中のＫｍ耐性遺伝子にアニールする５’−ＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２）のプライマー対を用いてＰＣＲによって増幅した（参考文献１４、１５）。増幅断片を配列決定して、大腸菌染色体中のトランスポゾン挿入部位を同定した。

４．フローサイトメトリーを用いる細胞密度の測定
ＳＨ８００セルソーター（SONY）を用いるフローサイトメトリーにより、容積細胞密度（細胞／ｌ）を測定した。上記条件下において細胞を増殖させ、４８時間後に採取し（ＯＤ_６００２０〜２５）、水で１０倍希釈した試料を分析した。流速は１１μｌ／分（圧２）に設定した。全てのＦＳＣ（フォワードスカッター）およびＳＳＣ（サイドスカッター）画像をＳＨ８００ソフトウェア（SONY）を用いて記録した。

５．細胞サイズの測定
バイオプラスチック生産条件下で細胞を増殖させ、４８時間後に採取した。細胞画像を顕微鏡ＢＺＡ−Ｘ７００（Keyence）を用いて取得した。該デジタル画像において、各条件下について１５０〜２００個の細胞の細胞長（長軸）（ｘ）および細胞幅（短軸）（ｙ）の長さをＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を用いて測定した。バイオプラスチック蓄積細胞の「レモン型」の形態に基づいて、細胞体積（Ｖ）は楕円球体の体積に近似するので、下記の式（１）を用いて算出した。

［結果］
１．トランスポゾン変異誘発および高バイオプラスチック生産変異体のスクリーニング
上記したとおり、トランスポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ５を用いることによって、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）を生産する大腸菌ＪＭ１０９株の変異体ライブラリーを作成した。ナイルレッド含有寒天プレートを用いるプレートアッセイによって、バイオプラスチック蓄積細胞のハイスループットスクリーニングを行った。該色素染色により、元の組み換え体（親対照）のバイオプラスチック生産よりも高いバイオプラスチック生産を示す候補の容易なスクリーニングが可能になった。ＪＭ１０９株は、ナイルレッドによって効率良く染色されるので、該株を宿主として使用した。およそ１０，０００個のコロニーのうち、１００個のコロニーを第一段階の候補として選択した。該候補のバイオプラスチック生産量をＨＰＬＣを用いて測定し、最終的に、増加したバイオプラスチック蓄積を示した１つの変異体Ｃ２１を単離した。該変異体Ｃ２１は、親組み換え体のバイオプラスチック生産量（２．９ｇ／ｌ）と比べて、増加したバイオプラスチック生産量（５．１ｇ／ｌ）を示した。

２．ｍｔｇＡ遺伝子の欠損のバイオプラスチック生産増加に対する寄与
Ｃ２１の染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列解析により、該トランスポゾンが配列番号３に示されるｍｔｇＡ遺伝子の塩基配列における９８番目と９９番目のヌクレオチド間に挿入されたことが分かった。ｍｔｇＡ遺伝子の変異がバイオプラスチック生産増加に関与することを確認するために、バイオプラスチック生産に広く使用されているＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）生産大腸菌株ＢＷ２５１１３を用いて下記の実験を行った（参考文献１０、１６）。

ＢＷ２５１１３、およびＢＷ２５１１３のｍｔｇＡ欠損株ＪＷ３１７５（ｍｔｇＡ遺伝子領域がカナマイシン耐性遺伝子で置換されている）をＫｅｉｏコレクションから入手した（参考文献８、１７）。ＪＷ３１７５およびＢＷ２５１１３に常法によりｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを導入し、該組換え体ＪＷ３１７５およびＢＷ２５１１３（以後、各々、ｒＪＷおよび親組み換え体ともいう）を２０ｇ／ｌのグルコースを含有するＬＢ培地上、３０℃で４８時間、１８０ｒｐｍにて振盪培養して、バイオプラスチック蓄積を誘導した（表２）。ｒＪＷは、Ｃ２１で観察されたのと同様に、親組換え体（５．２ｇ／ｌ）と比べて、増加した量のＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）（７．０ｇ／ｌ）を生産した。

該増加したバイオプラスチック生産に対するｍｔｇＡ欠損の寄与を確認するために、常法にしたがって、外来性ｍｔｇＡ遺伝子の発現によるｒＪＷの補完実験を行った（参考文献１８）。該補完は、親組換え体の表現型を回復させた（表２）。したがって、ｍｔｇＡ遺伝子の欠損が大腸菌におけるＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）生産の増加をもたらしたことが分かった。一方、ｍｔｇＡ遺伝子の欠損は、該コポリマーにおけるＬＡ／３ＨＢ比率にほとんど影響しなかった。

表中、野生型は、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを含有する大腸菌ＢＷ２５１１３、ΔｍｔｇＡは、ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを含有するＪＷ３１７５を示す。データは、３つの独立した試験の平均±標準偏差を示す。ｐＣＡ２４Ｎ−ｍｔｇＡは、ｌａｃプロモーターによって発現されるｍｔｇＡ遺伝子を有する。^ａは、１００μＭＩＰＴＧを加えた。真の細胞重量は、全細胞乾燥重量からバイオプラスチック重量を減じた重量を示す。

バイオプラスチック蓄積およびグルコース消費の時間プロフィールを図２に示す。図２中、「野生型／ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢ」は親組換え体を示し（図２の（Ａ））、「変異体（ΔｍｔｇＡ）／ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢ」はｒＪＷを示す（図２の（Ｂ））。開始段階で、ｒＪＷは、親組換え体よりもわずかに少ない量のバイオプラスチックを生産したが、２４時間で、親組換え体よりも高い生産量に達した。特に、ｒＪＷは、親組換え体よりも迅速にグルコースを消費した。ｒＪＷのグルコース消費量は培養４８時間で２０ｇ／ｌであり（図２）、バイオプラスチック生産量は７．３ｇ／ｌであった（表２）。これに対し、親組換え体（野生型）のグルコース消費量は培養４８時間で約１６．５ｇ／ｌであり（図２）、バイオプラスチック生産量は５．１ｇ／ｌであった（表２）。ｒＪＷにおけるグルコースからのバイオプラスチック収率（０．３７ｇ／ｇ）は、親組換え体（０．３１ｇ／ｇ）よりも高かった。このことは、ｒＪＷが親組換え体よりもグルコース利用効率が良いことを示す。したがって、ｍｔｇＡの欠損は、グルコース消費およびバイオプラスチックへの変換効率の両方を増加させた。なお、グルコースからのバイオプラスチック収率は、以下の式で求めた。
グルコースからのバイオプラスチック収率（ｇ／ｇ）＝バイオプラスチック生産（ｇ／ｌ）／グルコース消費量（ｇ／ｌ）

３．ｍｔｇＡ欠損株におけるバイオプラスチック蓄積によって引き起こされる細胞サイズ増大
ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを大腸菌ＢＷ２５１１３（野生型）およびＪＷ３１７５（ΔｍｔｇＡ）に導入し、得られた組換え体（バイオプラスチック生産条件）をＬＢ培地上、３０℃で４８時間増殖させた。対照として、大腸菌ＢＷ２５１１３（野生型）およびＪＷ３１７５（ΔｍｔｇＡ）にｐＴＶ１１８Ｎを導入し、得られた組換え体（バイオプラスチック非生産条件）を同様に培養した。細胞密度は、フローサイトメトリーを用いて測定した。各細胞サイズを、１５０〜２００個の細胞の顕微鏡画像を用いて決定した。さらに、トランスポゾン挿入株ＪＭ１０９Ｃ２１、およびｒＪＷの補完株も同様に培養し、細胞サイズを測定した。

バイオプラスチック蓄積を有するｍｔｇＡ欠損株の細胞形態を観察すると、バイオプラスチック非生産条件では、ＪＷ３１７５は親株ＢＷ２５１１３と類似の細胞サイズを示した（表３）。したがって、ｍｔｇＡ欠損は単独で細胞形態に影響を及ぼしているわけではないことが分かった。対照的に、バイオプラスチック生産条件では、ｒＪＷ細胞は、親組換え体と比べて、細胞サイズを著しく増加させた（１．４倍）（表３）。ｍｔｇＡ欠損は、細胞幅（短軸）（ｙ）のみの増加をもたらし、細胞長（長軸）（ｘ）の長さの増加をもたらさなかった。したがって、細胞は、長いというより、膨らんだ形状になった。さらに、ｒＪＷの補完株は、親組換え体と類似の細胞サイズを示した。このことは、ｍｔｇＡ欠損が細胞膨張に寄与したことを支持する。トランスポゾン挿入株ＪＭ１０９Ｃ２１は、ｒＪＷと類似の細胞形態を示した。

データは、３つの独立した試験の平均±標準偏差を示す。細胞のバイオプラスチック含量は、全細胞乾燥重量に対するバイオプラスチック重量の割合として定義した。Ｎ．Ｄ．は検出不可能を示す。

４．肥満細胞におけるバイオプラスチック生産の定量分析
バイオプラスチック生産（Ｐ）は、下記の式を用いて決定した。
Ｐ（ｇ／ｌ）＝細胞密度（細胞／ｌ）×１細胞重量（ｇ／細胞）×細胞のバイオプラスチック含量（ｗｔ％）

細胞膨張の利益を得るためには、細胞増殖に対する影響が重要な因子である。ｒＪＷの増殖は、開始段階で、対照よりもわずかに遅かったが（図２）、４８時間で、親組換え体と比べたバイオプラスチック蓄積ｒＪＷの細胞密度の減少（容積当たりの細胞数）は、２０％と小さかった（表３）。このことは、細胞増殖に対するｍｔｇＡ欠損のひどい影響はないことを示唆する。さらに、ｍｔｇＡ欠損株は、強いようであり、細胞溶解が観察されなかった。

また、細胞あたりのバイオプラスチック生産も重要である。細胞乾燥重量および細胞のバイオプラスチック含量に基づいて、ｒＪＷの１細胞におけるバイオプラスチック生産は、７．３×１０^−１２ｇ／細胞であると概算された。これは、親組換え体（４．５×１０^−１２ｇ／細胞）の１．６倍多い。この結果は、明らかに、ｒＪＷ肥満細胞がバイオプラスチックを蓄積する能力が高いことを示す。細胞サイズの増加は、必然的に、細胞膜の量（面積）の増加を伴う。実際、ｒＪＷの真の細胞重量（全細胞乾重量からバイオプラスチック重量を減じた重量）は、細胞がバイオプラスチックを蓄積した場合、親組換え体よりも大きかった（表３）。しかしながら、ＰＨＡに対する増加した蓄積能力の利益は、細胞形成のための炭素源の付加的な消費を上回り、全体として、ｒＪＷにおけるバイオプラスチック生産（ｇ／ｌ）およびグルコース消費（ｇ／ｌ）に対するバイオプラスチック収率（ｇ／ｇ）は増加した。逆に言えば、この事実は、細胞内スペースのサイズが大腸菌中のバイオプラスチック蓄積における制限因子であり、ｍｔｇＡ欠損が該制限を排除したことを示す。

実施例２
大腸菌ＢＷ２５１１３およびＪＷ３１７５をプラスミドｐＧＥＭ−Ｃ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢで形質転換した。該プラスミドは、バイオプラスチック生合成遺伝子群のうち、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣ１_Ｐｓ（ＳＴ／ＱＫ）をコードする遺伝子を含み、Ｐ（３ＨＢ）合成能を導入細胞に付与する。該プラスミドの作成および形質転換は、以前の記載（参考文献１〜４）および常法にしたがった。得られた組換え大腸菌を実施例１と同様に培養し、バイオプラスチック生産量を測定した。結果を、実施例１で得られたＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）生産の結果と共に図３に示す。図３中、「野生型」はＢＷ２５１１３の組換え体を示し、「変異体（ΔｍｔｇＡ）」はＪＷ３１７５の組換え体を示す。

実施例１では、組換え大腸菌におけるＰ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）生産は、膨張細胞の形成を導くｍｔｇＡ遺伝子の破壊によって増加した（図２）。同じ現象が、本実施例において、ｍｔｇＡ欠損株におけるＰ（３ＨＢ）生産について観察された。このことは、ｍｔｇＡ欠損の有利な効果が、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）の生産に限定されず、幅広い細胞内蓄積化合物に適用可能であることを示す。

本発明によれば、バイオプラスチックを高生産する細菌株、該細菌株を培養することによってバイオプラスチックを高生産する方法、および該細菌株の作成方法が提供される。また、本発明の細菌株は、高い対糖収率でバイオプラスチックを安定に合成することができる。本発明の細菌株は、その細胞体積を増大させて、多量のバイオプラスチックを蓄積することができる。さらに、本発明によれば、バイオプラスチックを高生産するための宿主として利用できる細菌株が提供され、かかる細菌株は、微生物生産バイオプラスチック合成用のプラットフォームとして有用である。本発明の細菌株は、野生株と比較して、バイオプラスチック生産量が多く、また、グルコースを効率良く利用してバイオプラスチックを生産する。本発明の細菌株を用いることにより、少ない基質（デンプン、糖などのバイオマス資源）からより多くのバイオプラスチックを生産することが可能となる。

参考文献（これらの文献は参照により本明細書に援用される。）
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Claims

単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子の変異を含み、バイオプラスチック生合成系遺伝子群をさらに含む、バイオプラスチックを生産する細菌株であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、細菌株。
大腸菌である、請求項２記載の細菌株。
変異が、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせである、請求項２または３記載の細菌株。
バイオプラスチックが乳酸および３−ヒドロキシブチレートを含むコポリマーまたはポリ３−ヒドロキシブチレートである、請求項２〜４のいずれか１項記載の細菌株。
バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、およびＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を含む、請求項２〜５のいずれか１項記載の細菌株。
バイオプラスチック生合成系遺伝子群が、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項６記載の細菌株。
バイオプラスチック生産時に細胞体積を増大させる、請求項２〜７のいずれか１項記載の細菌株。
請求項２〜８のいずれか１項記載の細菌株をバイオプラスチック生産を可能とする条件下で培養することを含む、バイオプラスチックの製造方法。
単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子を変異させること、およびバイオプラスチック生合成系遺伝子群を導入することを含むバイオプラスチックを生産する細菌株の製造方法であって、該変異がＭｔｇＡの不活性化をもたらすか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす、製造方法。
変異が、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせである、請求項１１記載の方法。