JP5438968B2

JP5438968B2 - 両親媒性ポリマー−ｐｄｇｆ複合体

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Publication number: JP5438968B2
Application number: JP2008531815A
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Inventors: デュブルーク，ギュイ; ダリ−コレア，ラティファ; コレイア，ジョゼ; デュラシェ，ダビド; スーラ，レミ; スーラ，オリビエ; スーラ，ジェラール
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Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2014-03-12
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Description

本発明は、薬物応用のための治療用タンパク質のインビトロ及びインビボでの物理的及び化学的安定性を改善するための、両親媒性ポリマーに結合した血小板由来成長因子（PDGF）の新規複合体に関する。

PDGFは、2つのジスルフィド架橋を介して相互に連結された2つのポリペプチド鎖からなる、およそ３００００ダルトンの糖タンパク質である。A、B、C及びDの4種の鎖が同定されている。自然のタンパク質は、ホモダイマー又はAB型のヘテロダイマーの形態で存在する（Oefner C. EMBO J. 11, 3921-2926, 1992）。

PDGFは、血小板から最初に単離された。PDGFは、血液凝固の間に放出される成長因子であり、さまざまな種類の細胞の成長を促進することができる（Ross R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 1207; Kohler N. & Lipton A., Exp. Cell Res., 1974, 87, 297）。PDGFが血小板以外の一定の細胞によって産生されること、そして間葉に由来するほとんどの細胞、すなわち、血液、筋肉、骨及び軟骨細胞、に関して***促進的であることが知られている（Raines E.W., in "Biology of Platelet-Derivated Growth Factor", 1993、Westermark, B. and C. Sorg, Ed. Basel, Kerger, p.74）。マクロファージ由来のPDGFが平滑筋細胞に対して化学走性及び***促進性物質様の挙動をすること、そしてそれが動脈硬化の特徴である動脈壁の筋内膜肥厚に寄与することを、多くの文献も実証する傾向にある（Ross R. et al., Science, 1990, 248, 1009）。さらなる、そして特別なPDGFの作用は、好中球性単球による顆粒放出の刺激（Tzeng D.Y. et al., Blood, 1985, 66, 179）、リービッヒ細胞によるステロイド合成の促進（Risbridger G.P., Mol. Cell, Endocrinol., 1993, 97, 125）、好中球食作用の刺激（Wilson E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 2213）、トロンボスポンディンの発現及び分泌の調節（Majak R.A. et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8821）、及び血管平滑筋細胞におけるICAM-1遺伝子の翻訳後調節（Morisaki N. et al,. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612）を含む。

これらの様々な性質によって、組換えPDGFの医薬分野における使用は既に予想されていた。PDGFの使用は特に、糖尿病性足部潰瘍の治療（レグラネックス（Regranex）、J&J）及び歯周の修復（GEM 21S, Biomimetic）のために推奨されてきた。

まさに一般的な皮膚の治癒のように、潰瘍の治癒は、数多くの細胞種への経時的及び空間的な協調介入を必要とする複雑な現象であり、これは、3つの相：炎症相、増殖相及びリモデリング相、に要約されることができる。

正常な治癒ではおよそ７日間である炎症相においては、マクロファージが細菌を殺し、損傷を受けた組織を清掃し、組織を再生する。これをするために、マクロファージはコラゲナーゼ、サイトカイン及び成長因子を分泌する。

正常な治癒では３日目〜３週目である増殖相の過程においては、３つの事象が続いて起こる。創傷は肉芽組織で満たされ、血管新生がおこり、そして創傷は上皮細胞で覆われるようになる。肉芽組織は、端から中心に向かって成長する。線維芽細胞がIII型コラーゲンを豊富に産生する。

正常な治癒では３週目〜１、さらには２年であるリモデリング相においては、肉芽組織が成熟し、線維芽細胞の産生するコラーゲンは減少する。肉芽形成の間に形成される、無駄な血管はアポトーシスによって除去される。III型コラーゲンはI型コラーゲンに置換され、これは張力及び架橋によって器質化する。

このプロセスにおいて、PDGFは本質的な役割をはたす。創傷の形成の間、血小板が凝集し、そしてPDGFを放出する。PDGFは、好中球、マクロファージ及び線維芽細胞を創傷へ誘引し、そして強力な***促進因子である。そして今度は、マクロファージ及び内皮細胞がPDGFを合成し、そして分泌する。PDGFは、本質的にはグリコサミノグリカン及び接着タンパク質などの非コラーゲン化合物である、新たな細胞外マトリックスの線維芽細胞による産生を刺激する（J.F. Norton et al., Essential practice of surgery, Springer, 2003, chapter 7, 77-89）。

糖尿病性足部潰瘍、静脈潰瘍及び褥創などの慢性の創傷は、非常にゆっくりとした、そして時には不完全に治癒するという特徴を有し、それは、治癒プロセスが正常に起こらないからである（R. Lobmann et al., J. of Diabetes and its complications, 2006, 20, 329-335）。

実際に、治癒プロセスは組織への損傷を除去するために必要な破壊プロセスと新しい組織を形成する修復プロセスの間のデリケートなバランスである。プロテアーゼ及び成長因子は、このバランスを調節することによってこのプロセスにおいて本質的な役割を演じている。慢性の創傷の場合、このバランスは分解に傾いて妨害され、したがって、これらの創傷は治癒するのが遅い。様々なタイプの慢性の創傷が存在するが、それらは、プロテアーゼレベルが高くなりそしてしたがって成長因子活性が低下することとなる、持続的な炎症相に特徴を有するという点で、生化学的に比較的類似する（G. Lauer et al. J. Invest. Dermatol. 115(2000) 12-18）。この成長因子の分解は、治癒にとって有利でない慢性の創傷に関連した全体的な組織の損失に寄与する（D.R. Yager et al., J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748）。

現在、市場には、商品名レグラネックス（Regranex（登録商標））で販売されている、国際的な非商標名「ベカプレルミン」に相当する、ヒト組換えPDGF-BBベースの医薬がある。この医薬は、糖尿病における下肢潰瘍の治療に適応される。それは局所投与のためのジェルの形態であり、潰瘍治癒を促進することができる。それは、特に内因性のPDGFのように、細胞増殖、そしてしたがって新しい組織の形成を促進することを可能とする。

臨床試験が治癒及び治癒に必要な期間の改善を示したにもかかわらず（Greenhalgh et al., American Journal of pathology, 136, 1235-1246 1990; Ladin Plastic and Reconstructive Surgery, 105, 1230-1231, 2000; Holloway et al., Wounds, 5/4, 198-206; Mandracchia et al., Clinics in Podiatric Medicine and Surgery, 18, 189-209 2001; Wieman T.J. American Journal of Surgery, 176, 74S-79S 1998）、この治療法の有効性は限定されている（Cullen et al. The international journal of biochemistry & Cell Biology 34, 1544-1556, 2002）。

J&Jが販売するPDGF-BBを含むレグラネックス製品は、治療された患者における回復率を、創傷の標準的治療のみを受けた患者がわずか３６％だったのに対して、５０％に増加させることによってその有効性を示した。糖尿病性足部潰瘍の治療におけるこの顕著な改善にもかかわらず、長期のそして高価な治療後に、わずか５０％の患者しか回復していないことは注目すべきである。回復しない場合、その結果は非常に深刻であり、多くの場合、下肢を切断する結果となる。それに加えて、平均治療期間は約２０週間と非常に長く、その投与は高価で限定的であり、なぜなら創傷は清浄化されなければならず、レグラネックスは朝投与され、創傷を清浄化することによってその１２時間後に投与されなければならないからである。これらの2つの手順は看護師によるケアを通常必要とするものである。さらに、２０週間続く治療の平均コスト（１４００米ドルのオーダー）は過度に高い。

部分的な有効性は、治療される創傷におけるPDGFの急速な分解により説明可能である。慢性の創傷の場合、この分解は、創傷におけるプロテアーゼの過剰産生の刺激によるPDGFにとって不利な環境をもたらす、持続的な炎症状態に起因する。

創傷の治癒にとって分解の制御が必要であるにもかかわらず、過剰のタンパク分解活性は、それが細胞外マトリックス（F. Grinnell et al., J. Invest. Dermatol. 106 (1996) 335-341及びC.N. Rao et al. J. Invest. Dermatol. 105 (1995) 572-578）及び成長因子などの主要な機能的役割をを有する分子（V. Falanga et al. J. Derm. Surg. Onc. 18 (1992) 604-606; D.R. Yager et al., Wound Rep, Reg. 5 (1997) 23-32.及びM. Wlaschek et al. Br. J. Dermatol. 137 (1997) 646-647）の分解に導くために有害である。実際、PDGF、TGFβ又はbFGFなどの成長因子は、細胞遊走、増殖、タンパク合成及びマトリックス形成を誘導するそれらの能力、並びにより一般的にはそれらが修復プロセスを制御するという事実によって、治癒プロセスにおける重要な要素である。しかしながら、これらの成長因子はタンパク質分子であり、その結果、タンパク分解に対して感受性である。数件の研究が、PDGFなどの成長因子の分解が、それらが慢性の創傷に由来する体液と接触したときにかなり迅速であることを示しており、それは、これら体液が高濃度のメタロプロテイナーゼを含むからである（D.R. Yager et al. J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748）。

静脈の潰瘍の治療に関しては、文献に報告されたパイロット臨床試験において（T.J. Wieman, Wounds, 2003, vol. 15, No.8, 257-264）、レグラネックスは、創傷の通常の清浄と圧迫治療に基づく現在の治療のわずかな改善を示したのみであった。

PDGFの不安定さの問題は、例えば、該タンパク質の生産の間に明らかとなった。PDGFが翻訳後タンパク分解に対して特に感受性であり（Hart et al., Biochemistry 29: 166-172, 1990及び米国特許出願第07/557,219号）、該タンパク質の成熟した鎖の３２位のアルギニンアミノ酸と３３位のスレオニンアミノ酸の間の結合のレベルにおいて特に感受性であることは知られている。PDGFのB鎖の７９位のアルギニンと８０位のリジンの間、又は２７位のアルギニンと２８位のアルギニンの結合などの他の部位もタンパク分解に対して感受性である。

タンパク分解に対するこの不安定さは、米国特許第US4,845,075号に記載の方法によって組換えにより酵母において産生されたこのタンパク質を得ることに関して大きな問題をもたらす。特に、米国特許第US7,084,262号は、PDGF-BBの分析及び精製が、翻訳後の細胞内タンパク質分解による切断から生じる２１のアイソフォームの生成に導くことを教示する。結果として、この大きな構造的不均一性は、遺伝子工学により生成されたタンパク質に、無処置の成熟形態のタンパク質に比較して５０％の活性低下をもたらす。

さらに、２００６年８月１４日付の公報（www.prnewswire.com）によれば、１４週間後にも回復していない糖尿病性足部潰瘍についてのCardiumによる最近の臨床結果は、PDGF−BBによる治療が提案可能であるということを示している。Cardiumにより提案された解決法は、PDGF-BBの発現のための遺伝子を、それを局所的に過剰発現させるように、創傷の細胞中に導入することからなる。アデノベクターによるこの遺伝子治療は、１５人の患者群のうち、一般的な治療に対して耐性であったこれらの糖尿病性足部潰瘍の80％近くを治癒させることができた。しかしながら、遺伝子療法に基づく治療における医薬の進歩はこれまで、アデノウイルスタイプのウイルスベクターの使用に関連する安全性の理由によって、なお非常に有害なものである。

したがって、PDGFによる糖尿病性足部潰瘍の現在の治療を改善する必要性と可能性がある。

糖尿病性足部潰瘍の治療の場合、最終的な目的は、以下の：回復を促進すること、回復率を増加させること、及び治療プロトコールを単純化すること、の３つである。

静脈潰瘍及び褥創のケースもあり、これらは、ひどい痛み及び非常に重い医学的合併症の原因である。

したがって、解決すべき問題は本質的に、慢性の創傷においてPDGFを保護するという問題である。

様々な解決法が提案されてきた。

米国特許第US5,905,142号は、可能性のある切断部位に近い1つ以上のリジンアミノ酸又はアルギニンアミノ酸を置換すること若しくは除去することにより、タンパク分解による攻撃に対して耐性を高めた該タンパク質の突然変異体を作出することによって、PDGFに関するこれらのタンパク質分解の問題を改善する手段を記載する。プロテアーゼに対してタンパク質をより耐性とするこの戦略は満足のいくものではない。このPDGFの遺伝子修飾は、その様々な受容体に対する異なる親和性によって生理活性の変更に導くことができ、これは、毒性学的問題も誘導しうる。さらに、PDGFのかかる修飾は、新しい医薬の開発を必要とし、これは極めて高価かつリスクを伴うものである。

１９７０年代にこのタンパク質が大いに研究されたとき、PDGFはそのカチオン性及び疎水性の性質によって「非常に粘着性のタンパク質」であるため、精製が極めて難しいことが発見された（Heldin, C.H. EMBO J. 11:4251-4259, 1992; Raines and Ross, J. Biol. Chem. 257(9):5154-5160, 1982; Antoniades, PNAS 78:7314, 1981; Deuel et al. J. Biol. Chem. 256:8896, 1981）。実際、PDGFは非常にカチオン性のタンパク質であり、その等電点は９．８〜１０．５である。Weiら（Journal of controlled release 112:103-110, 2006）などの他の著者もこの挙動を確認しており、PDGFが溶液としてその中に入っている容器の表面上にPDGFが容易に吸着すると説明している。該著者らは、上記混合物に、０．１％BSA又は０．１％BSA/Tween20混合物のいずれかを加えることによって上記問題を解決している。最高９５％のタンパク質が溶液中に見出されるため、これらの解決法は上記問題を大幅に解決する。しかしながら、BSAの動物起源及びウシ海綿状脳症に関連するリスクを考えると、これらの解決法は医薬の観点からは満足のいくものではない。

同じ著者らによって提案された他の解決法は、PDGFを溶液中に保持することを可能とする、より強力なアニオン性界面活性剤（SDS）を加えることからなる。あいにく、SDSもタンパク質の部分的な変性を誘導し、生理活性を損失させる。したがって、この解決法はタンパク質の安定化のためには満足のいくものではない。

PCT国際特許出願公開第WO93/08825号においては、発明者らは、精製PDGFが局所投与用のジェルの形態に製剤化された場合に大きな不安定性を示すことを実証した。彼らは例として、PDGFと、メチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどの医薬品の製剤化に慣用される一定の製品、そしてまた、ベンジルアルコールなどの一定の慣用の保存剤との不適合性を挙げている。著者らは、局所投与用である一方、同時に良好な長期の安定性を有するジェルの形態にPDGFを製剤化する必要があることを説明することによって問題を提起する。同じ著者らは、溶液中のPDGFが中性のpHにおける脱アミド化のプロセスによって分解し、そして該タンパク質がわずかに酸性のpHでより安定であることを示している。著者らは、該タンパク質といかなる相互作用も示さないポリマー、ｐHがわずかに酸性であって脱アミド化反応の制限を可能とする緩衝液、及び該タンパク質に関してニュートラルである保存剤、の数種のパラメータを組み合わせることによって、医薬の観点から安定である製剤を得るためにPDGFを製剤化することは可能であることを示している。

著者らは、脱アミド化によって該タンパク質を分解する反応を避けるために該製剤がわずかに酸性のpHに維持されるという条件で、該タンパク質といかなる相互作用も示さないポリマーを加えることによって、貯蔵安定な製剤を得ることが可能であることを示す。しかしながら、この解決法は生理的ｐＨにおけるインビボでのタンパク分解に対して成長因子を保護することができないため、満足のいくものではない。

ジェルの形態のPDGF製剤を記載するPCT国際特許出願公開第WO97/12601号においては、著者らは、彼らが使用するセルロース誘導体は、貯蔵中に起こりうる活性低下に対して成長因子を安定化することができる、と説明する。このために、彼らは、米国特許第US4,717,717号において先にEGFについて得られた結果を根拠として使用する。しかしながら、彼らは、PDGFを含むセルロースジェルの安定性は、荷電したアミノ酸又は金属イオンなどの荷電した化学種を製剤に加えることによって大いに改善されることができるとも説明している。ここでも、この解決法は、製品の貯蔵の間に製剤中の成長因子を安定化することが可能であるが、生理的ｐHでの慢性の創傷中に存在するプロテアーゼに対してこれらの成長因子を安定化することはできない。

したがって、慢性の創傷の治療、特に糖尿病性足部潰瘍の創傷の治療との関係での成長因子、特にPDGF、の有効性を高めるために、それを安定化しかつ保護することには治療的利益がある。したがって、本発明は、両親媒性ポリマーとPDGFの複合体を開発することによって、インビトロ及びインビボでの生理的pHにおいて起こりうる化学的又は物理的分解に対してPDGFを安定化することに関する。

したがって、本発明は、両親媒性ポリマーとPDGF間の複合体（両親媒性ポリマー−PDGF）の形成に関し、この複合体は、インビトロ及びインビボの生理的pHにおける分解に関して、化学的及び物理的安定性を該タンパク質に提供する。

したがって、本発明は、物理的及び化学的に安定で、水溶性である、両親媒性ポリマー−PDGF複合体に関し、該複合体は以下の：
―該両親媒性ポリマーは以下の式：

｛式中、
R及びR'は、結合、又は場合により、O、N及び／又はSなどの1つ以上のヘテロ原子を含む、分岐した及び／又は不飽和の１〜１８個の炭素を含む鎖であり、
R及びR'は、お互いに同じ又は異なり、
F及びF'は、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル、又はアミンであり、
F及びF'は、お互いに同じ又は異なり、
Xは、以下の：カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネートであってよい親水性基であり、
Yは、以下の：スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネートであってよい親水性基であり、
Hyは、以下の：
場合により不飽和及び／またはO、N若しくはSなどの1つ以上のヘテロ原子を含む、直鎖又は分岐鎖C₈〜C₃₀アルキル、
場合により不飽和及び／または場合によりヘテロ原子を含む、直鎖又は分岐鎖C₈〜C₁₈アルキルアリール又はアリールアルキル、
場合により不飽和のC₈〜C₃₀多環式基、であってよい疎水性基であり、
ｎ及びoは１〜３であり、
ｈは、０．０１〜０．５の、モノマー単位に対する疎水性基のモル分率を表し、
ｘは、０〜２．０の、モノマー単位に対する親水性基のモル分率を表し、
ｙは、０〜０．５の、モノマー単位に対する親水性基のモル分率を表す。｝
により表される、疎水性置換基及び親水性基で官能化された親水性ポリマー骨格からなり；
―PDGFは、PDGF（血小板由来成長因子）群から選ばれる、
に特徴を有する。

それは、PDGFが、2つのB鎖を含むヒト組換えPDGF(rhPDGF-BB)からなる群から選ばれることに特徴を有する複合体に関する。

それは、PDGFがPDGF-BBであることに特徴を有する複合体に関する。

両親媒性ポリマーの置換基は、制御されたやり方で又はランダムに分布する。制御された分布を有するポリマーの中では、例えば、ブロックコポリマー及び交互コポリマーが挙げられる。

したがって、1つの実施態様においては、本発明は、その中の置換基がランダムに分布するポリマーからポリマーが選ばれることに特徴を有する、両親媒性ポリマー−PDGF複合体にも関する。

1つの実施態様においては、本発明は、両親媒性ポリマーがポリアミノ酸から選ばれることに特徴を有する、両親媒性ポリマー−PDGF複合体にも関する。

1つの実施態様においては、上記ポリアミノ酸は、ポリグルタメート又はポリアスパルテートから成る群から選ばれる。

1つの実施態様においては、上記ポリアミノ酸はホモポリグルタメートである。

1つの実施態様においては、上記ポリアミノ酸はホモポリアスパルテートである。

1つの実施態様においては、上記ポリアミノ酸は、アスパルテート及びグルタメートのコポリマーである。これらのコポリマーはブロックコポリマー又はランダムコポリマーのいずれかである。

1つの実施態様においては、本発明は、ポリマーがポリサッカライドから選ばれることに特徴を有する両親媒性ポリマー−PDGF複合体にも関する。

1つの実施態様においては、ポリサッカライドは、ヒアルロン酸類、アルギン酸類、キトサン類、ガラクツロン酸類、コンドロイチン硫酸類、デキストラン類及びセルロース類からなる群から選ばれるポリサッカライドである。

セルロース群は、カルボキシメチルセルロースなどの、酸で官能化されたセルロースからなる。

デキストラン群は、カルボキシメチルデキストランなどの、酸で官能化されたデキストランから成る。

1つの実施態様においては、ポリサッカライドは、以下の式（I)：

｛式中、
Dは、好ましくは一連のグルコシド単位から成る、ポリサッカライド鎖を表し、
MCは、メチルカルボキシル基を表し、
Bは、N-ベンジルメチレンカルボキサミド基を表し、
Suは、スルフェート基（グルコシド単位が担持する遊離のヒドロキシル官能基の硫酸化）を表し、
ａ、ｂ及びｃは、以下の：
ｉ）ａは絶対的に０超であり；
ｉｉ）ｂは、以下の：
ｂが０．３以上であり、かつｃが０．１〜０．５であるか；又は
ｂが絶対的に０．３未満であり、かつｃが以下の式（１）：

に相当する、
であり、それぞれ、MC、Ｂ及びSu基の置換度（ds）を表す。｝
に対応する、可溶性デキストラン誘導体である。

これらの式（Ｉ）のデキストラン誘導体及びそれらの調製方法は、PCT国際特許出願公開第WO99/29734号中により広く記載されている。これらの式（I）のデキストラン誘導体は、慣用的にDMCBSuと呼ばれ、R-OH及びR-OXサブユニットから成るコポリマーであると考えられ、Xはメチルカルボキシル（MC）、ベンジルアミド（B）又はスルフェート（Su）基であることができる。したがって、メチルカルボキシル基に関する０．６の置換度（ds）を有するメチルカルボキシリックデキストラン（DMC）は、グルコシド単位あたり、０．６個の置換基（R-MC）及び２．４個のヒドロキシル基（R-OH）を含む。

1つの実施態様においては、Dは、１０００〜２００００００Da、そして1つの実施態様においては７００００Da未満のモル質量を有する。

1つの実施態様においては、デキストラン誘導体は、ｂが０．３５以上である式（I）の化合物から選ばれる。

この場合、そして1つの実施態様によれば、デキストラン誘導体は、aが０．５〜０．８であり、ｃが０．１〜０．５である式（I）の化合物から選ばれる。

1つの実施態様においては、ポリサッカライドは、ヒアルロン酸類、アルギン酸類及びキトサン類からなる群から選ばれる。

これらの様々なポリサッカライドは、以下のように表されることができる：

ポリサッカライドは、１０〜１００００の平均重合度ｍを有することができる。

1つの実施態様においては、それは、１０〜５０００の平均重合度ｍを有する。

他の実施態様においては、それは、１０〜５００の平均重合度ｍを有する。

１つの実施態様においては、本発明は、疎水性基Hyが以下の：脂肪酸類、脂肪族アルコール類、脂肪族アミン類、ベンジルアミン類、コレステロール誘導体類及びフェノール類から成る群から選ばれることに特徴を有する、両親媒性ポリマー−PDGF複合体にも関する。

1つの実施態様においては、コレステロール誘導体はコール酸である。

他の実施態様においては、フェノールはα−トコフェロールである。

1つの実施態様においては、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体は、可逆的である。

使用するポリマーは、当業者に知られた技術によって合成されるか、又はSigma-Aldrich, NOF Corp.若しくはCarboMer Inc.などの供給者から購入される。

PDGFは、当業者に知られた技術によって得られるか、又はGentaur社（USA）若しくはResearch Diagnostic Inc. (USA）などの供給者から購入されるヒト組換えPDGFから選ばれる。

化学的及び物理的安定化の実証は、特に、以下の試験：
ゲル電気泳動によって実施される、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の実証のための試験（ゲル移動度シフト法）；
プロテアーゼと接触させることによって実施される、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の酵素的分解の減速についての試験；
SDS-Pageにより実施される、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の生理的pHでの物理的安定化についての試験、
を行うことによって実施されることができる。

本発明は、化学的及び物理的安定化の実証のための試験、すなわち、複合体の実証のための試験（ゲル移動度シフト法（Gel Mobility Shift Assay））、プロテアーゼと接触させることによる酵素的分解の減速についての試験、及びSDS-Pageにより実施される生理的pHでの物理的安定化についての試験に合格することに特徴を有する、両親媒性ポリマーPDGF複合体にも関する。

ゲル移動度シフト法によって実施される複合体の実証のための試験は、電場の作用下でのイオンの置換に基づく。アニオン性複合体は陽極に向かって移動し、カチオン性複合体は陰極に向かって転置する。

移動の後、タンパク質は毛管作用によってPVDF膜上へ移され、そしてペルオキシダーゼに結合した第二抗体によって認識される該たんぱく質に特異的な抗体によって可視化される。タンパク質単独ではわずかしか移動しないか又は全く移動せず、両親媒性ポリマーとのタンパク質複合体は、複合体全体の電荷に依存して陽極又は陰極に移動する。

酵素的分解の減速についての試験は、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体がプロテアーゼと接触させられた後のタンパク質の完全性の検証に基づく。（トリプシン、キモトリプシンなどの）プロテアーゼの溶液が複合体溶液に加えられてキネティックスが測定される。反応は、酵素に特異的な阻害剤（インドール、ベンズアミジン）の添加によって停止される。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-Page）によってタンパク質の完全性が分析される。

PDGFの物理的安定化についての試験は、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の溶液とPDGF単独の溶液を、pH７．４で溶液中のタンパク質濃度について比較することによる、タンパク質の完全性の検証に基づく。これら２つの溶液は、周囲温度で４８時間、シェーキングベンチ上に置かれ、そして遠心分離される。各溶液中のPDGF濃度は、SDS-Pageにより評価される。

本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体は、PDGFと両親媒性ポリマーを、該タンパク質を変性させるかもしれないいかなる有機溶媒も使用せずに生理的pHの水溶液中に溶解させることによって形成される。両親媒性ポリマー−PDGF複合体の形成は自発的なものであり、PDGFと両親媒性ポリマー間のいかなる共有結合も含まない。この会合は、本質的に疎水性の相互作用及びイオン性の相互作用である弱い結合を介して起こる。

本発明はまた、PDGFと両親媒性ポリマーが生理的pHの溶液中で接触させられることに特徴を有する、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体を調製する方法にも関する。

本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の形成の実証を完結するために他の試験が設定可能である：
円二色性で測定される、PDGFの三次元構造の維持についての試験；
ストレス下、生理的pHにおける、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体中のPDGFの安定性についての試験。ストレスは、攪拌、塩の存在などの特定の方法であることができる。

本発明はまた、PDGF／両親媒性ポリマー比が１／５〜１／５０００であることに特徴を有する、両親媒性ポリマー−PDGF複合体にも関する。

1つの実施態様においては、該比は、１／１００〜１／５０００である。

他の実施態様においては、該比は、１／３００〜１／７００である。

本発明はまた、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体を含むことに特徴を有する治療用組成物にも関する。

「治療用組成物」という用語は、ヒト用又は獣医学用医薬において使用可能な組成物を意味することを意図される。

本発明の医薬組成物は、好ましくは、ジェル、クリーム、スプレー、ペースト又はパッチの形態であることができる局所適用のための組成物である。

本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体とともに製剤化されることのできる賦形剤の性質は、その提示形態に応じて、製剤学の専門家の一般的知識によって選択される。

したがって、本発明の組成物がジェルの形態であるとき、ジェルは、例えばカルボキシメチルセルロース（CMCs）、ビニルポリマー、PEO-PPOタイプのコポリマー、ポリサッカライド、PEO、アクリルアミド又はアクリルアミド誘導体などのポリマーから作製される。

製剤のパラメータを調整するために、pHを調節するための緩衝剤、等張性を調節するための剤、メチルパラヒドロキシ安息香酸、プロピルパラ−ヒドロキシ安息香酸、ｍ−クレゾール又はフェノールなどの保存剤、或いはL-リジンハイドロクロライドなどの抗酸化剤などの他の賦形剤が使用可能である。

本発明によれば、治療用組成物は、１mlあたり約１００μgのPDGFの投与を可能とすることに特徴を有する。

本発明はまた、潰瘍の治療において局所投与で使用するための、治癒効果を有する治療用組成物の調製のための、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体の使用にも関する。

それはまた、本発明の両親媒性ポリマー−PDGF複合体を含む治療用組成物を治療部位に投与することからなることに特徴を有する、ヒト用又は獣医学用の使用のための治療方法にも関する。

実施例１：PDGF−BB／DMCBSu複合体
ベンジルアミンで修飾された、硫酸化カルボキシメチルデキストラン（DMCBSu）の合成
両親媒性ポリマーを、糖単位当たりのカルボキシメチルに関する置換度が１．０であり、平均モル質量が４００００ｇ／モルの、カルボキシメチルデキストランから合成する。水中、水溶性カルボジイミドの存在下での慣用のカップリング方法にしたがって、このポリマーの酸にベンジルアミンを結合させる。糖単位当たりのベンジルアミンに関する置換度は、¹H NMRで測定して０．４である。そして、このポリマーをSO₃／ピリジン複合体で硫酸化する。糖単位当たりのスルフェートに関する置換度は、０．３である。

PDGF-BB／DMCBSu複合体の調製
０．１mg/mlのPDGF−BB溶液１０μlを、５０mg/mlのDMCBSu溶液９０μlに加える。PDGF-BB及びDMCBSu溶液をpH７．４及び３００mOsmで緩衝化する。この溶液を周囲温度で２時間、穏やかに攪拌し、そして４℃で保存する。

PDGF-BB／DMCBSu複合体形成の実証
上記のPDGF-BB／DMCBSu複合体の溶液１０μlをアガロースゲルにのせる。化合物の移動を、電場（２００mA−４時間）の作用下でおこなう。移動後、一夜PDGF-BBをPVDF膜上に移動させ、ヤギ抗−PDGF-BB抗体による免疫ブロッティングで可視化し、これにHRPペルオキシダーゼに結合した抗−ヤギIgG二次抗体が結合し、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）によって可視化する。

PDGF-BB／DMCBSu複合体は陽極にむかって移動する。その負電荷は、それがPDGF-BBよりもずっとDMCBSu豊富な組成を有するという事実によって説明可能である。PDGF-BBのみから成る対照は移動しない。

PDGF-BB／DMCBSu複合体溶液の安定性の実証
pH７．４の０．０１mg/mlのPDGF-BB溶液１０μlと、pH７．４の上記PDGF-BB／DMCBSu複合体の溶液１０μlを、周囲温度でシェーキングベンチ上に４８時間置く。遠心分離後、各溶液中のPDGF-BB濃度をSDS-Pageで評価する。PDGF-BB／DMCBSu複合体の場合の溶液中のPDGF-BB濃度は変化しないが、PDGF-BB単独の溶液では減少したようである。

このPDGF-BB／DMCBSu複合体における、トリプシンに対するPDGF-BBの保護の実証
上記PDGF-BB／DMCBSu複合体の溶液１０μlを３７℃の１０ng/mlのトリプシン溶液９０μl中に注ぎ込む。

３０分ごとに１０μlのサンプルを採取し、１０μg/mlのインドール溶液１０μlを加えて酵素反応を停止させた後、PDGF-BB濃度をElisaで測定する。

これらのキネティックスは、PDGF-BB単独では１時間３０分で完全に分解されるが、PDGF-BB／DMCBSu複合体の場合にはそうでないことを明らかにする。

PDGF-BB／DMCBSu複合体の生理活性の検証
ヒト皮膚線維芽細胞(Human Dermal Fibroblast adult（HDFa）)の初代培養を、３７℃の温度、１０％のウシ胎仔血清（FCS）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含むαMEM培地中、CO₂富化（５％）した湿度飽和大気中で行う。培地は４日ごとに新しくする。９６ウエルプレート（Nunc社）について５０００細胞／ウエルの密度で培養皿に播種するために、細胞懸濁液を培地で希釈した。

細胞の各バッチについて、トリチウム化したチミジンの取り込みによって、様々な濃度の複合体によるPDGF-BB−安定化効果を検証した（１００μl中、５０００細胞／ウエル）。分離の２４時間後、１μg/mlの濃度の両親媒性ポリマーの不存在下又は存在下で０．１〜１００ng/mlの様々な濃度のPDGF-Bを加えることによって線維芽細胞を刺激した。複合体の存在下又は不存在下でのPDGF-BBによる刺激の１８時間後に、５０μCi/mlの溶液、すなわち０．５μCi/ウエルを加えることによって、トリチウム化チミジンの取り込みを実施した。計測バイアル中で放射活性を回収し、１００μlの１００mM NaOHでウエルをすすぎ、１mlのシンチレーション液（Zinsser Analytic）を１mlくわえた後、自動カウンターで放射活性を計測した。

得られた結果は、添付の図１に示し、ここで、線維芽細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンの量（Dpm×１０³）は、ug/mlで表したPDGF-BB濃度の関数として表す。

実線の曲線は、１μg/mlの濃度のデキストラン誘導体にかかる本発明の複合体の結果を、そして破線の曲線は、デキストラン誘導体の不存在下での結果を表す。

ED50は、ヒト線維芽細胞の５０％増殖を得るようなPDGF-BB濃度に相当する。比率Rは、以下のように計算したED50値の比率である。

これらの結果は、PDGF-BBを単独で使用した場合、５０％増殖を得るためには、６μg/mlを使用する必要があるが、PDGF-BBが式（I）のデキストラン誘導体と複合化された場合には、２μg/mlが５０％増殖を得るために十分であることを示す。この場合、比率Rは３に等しい。

実施例２：PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体
トリプトファンメチルエステルで修飾したカルボキシメチルデキストラン(DMCTrpOMe)の合成
両親媒性ポリマーを、糖単位あたりカルボキシメチルに関する置換度が１．０であり、平均モル質量が４００００g／モルであるカルボキシメチルデキストランから合成する。水中、水溶性カルボジイミドの存在下でのカップリングの慣用方法によってトリプトファンメチルエステルをこのポリマーの酸に結合する。糖単位当たりのトリプトファンに関する置換度は、¹H NMRで測定して０．３である。

PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の調製
０．１mg/mlのPDGF−BB溶液１０μlを、５０mg/mlのDMCTrpOMe溶液９０μlに加える。PDGF-BB及びDMCTrpOMe溶液をpH７．４及び３００mOsmで緩衝化する。この溶液を周囲温度で２時間、穏やかに攪拌し、そして４℃で保存する。

PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体形成の実証
上記のPDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の溶液１０μlを、免疫学的可視化を伴うゲル電気泳動のためのアガロースゲル上にのせた。電場（２００mA−４時間）の作用下で化合物が移動する。移動後、PDGF-BBを、一夜、PVDF膜上に移動させ、そしてヤギ抗−PDGF-BB抗体による免疫ブロッティングで可視化し、これにペルオキシダーゼに結合した抗−ヤギIgG二次抗体を結合し、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）によって明らかにする。

PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体は陽極に向かって移動する。その負電荷は、その組成物がPDGF-BBに比べてかなりDMCTrpOMeに富むという事実によって説明可能である。PDGF-BBのみからなる対照は移動しない。

PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の安定性の実証
pH７．４の０．０１mg/mlのPDGF-BBの溶液１０μlとpH７．４の上記PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の溶液１０μlを周囲温度で４８時間、シェーキングベンチ上に置く。各溶液中のPDGF-BB濃度をSDS-Pageによって評価する。PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の場合には溶液中のPDGF-BB濃度は変化していないが、PDGF-BB単独の溶液では減少したようである。

このPDGF-BB／DMCTrpOMe複合体における、トリプシンに対するPDGF-BBの保護の実証
上記のPDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の溶液１０μlを、１０ng/mlのトリプシン溶液９０μlとともに３７℃でインキュベートする。３０分ごとに１０μlのサンプルをとり、１０μg/mlのインドール溶液１０μlを加えることによって酵素反応を停止させた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-Page)によってPDGF-BBの構造的完全性を評価する。

これらのキネティックスは、PDGF-BB単独では１時間３０分で完全に分解されるが、PDGF-BB／DMCTrpOMe複合体の場合にはそうでないことを明らかにした。

実施例３：PDGF-BB／CMCBSu複合体
ベンジルアミンで修飾した硫酸化カルボキシメチルセルロース（CMCBSu）の合成
両親媒性ポリマーは、糖単位あたりのカルボキシメチルに関する置換度が１．２で平均モル質量３００００g／モルのカルボキシメチルセルロースから合成する。ベンジルアミンは、水中、水溶性カルボジイミドの存在下でのカップリングの慣用方法にしたがってこのポリマーの酸に結合する。糖単位当たりのベンジルアミンに関する置換度は、¹H NMRで測定して０．２である。硫酸化は、SO₃-ピリジン複合体の存在下で実施し、スルフェートに関する置換度は０．３０である。

PDGF-BB／CMCBSu複合体の調製
０．１mg/mlのPDGF-BB溶液１０μlを、５０mg/mlのCMCB溶液９０μｌに加える。PDGF-BB及びCMCBSuの溶液は、pH７．４及び３００mOsmで緩衝化する。この溶液を周囲温度で２時間、穏やかに攪拌し、そして４℃で保存する。

PDGF-BB／CMCBSu複合体形成の実証
上記のPDGF-BB／CMCBSu複合体の溶液１０μlを、免疫学的可視化を伴うゲル電気泳動のためのアガロースゲルにのせる。化合物は電場（２００mA−４時間）の作用下で移動する。移動後、PDGF-BBを一夜PVDF膜上に移動させ、そしてヤギ抗−PDGF-BB抗体による免疫ブロッティングで可視化し、これにHRPペルオキシダーゼに結合した抗−ヤギIgG二次抗体が結合し、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）によって可視化する。

PDGF-BB／CMCBSu複合体は陽極にむかって移動する。この負電荷は、その組成物がPDGF-BBよりもかなりCMCBSuに富むという事実によって説明可能である。PDGF-BBのみからなる対照は移動しない。

PDGF-BB／CMCBSu複合体の安定性の実証
pH７．４の０．０１mg/mlのPDGF-BB溶液１０μlとpH７．４の上記PDGF-BB／CMCBSu複合体の溶液１０μlを周囲温度で４８時間、シェーキングベンチ上に置く。遠心分離後、各溶液中のPDGF-BB濃度をSDS-Pageで評価する。PDGF-BB／CMCBSu複合体の場合の溶液中のPDGF-BB濃度は変化していないが、PDGF-BB単独の溶液では減少したようである。

このPDGF-BB／CMCBSu複合体における、トリプシンに対するPDGF-BBの保護の実証
上記のPDGF-BB／CMCBSu複合体の溶液１０μlを、１０ng/mlのトリプシンの溶液９０μlとともに３７℃でインキュベートする。３０分ごとに１０μlのサンプルをとり、１０μg/mlのインドール溶液１０μｌを加えることによって酵素反応を停止した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-Page）でPDGF-BBの構造的完全性を評価する。

これらのキネティクスは、PDGF-BB単独では１時間３０分で完全に分解されたが、PDGF-BB／CMCBSu複合体の場合にはそうでないことを明らかにする。

対照例１： PDGF-BB/CMCB複合体
ベンジルアミンで修飾したカルボキシメチルセルロース（CMCB）の合成
両親媒性ポリマーを、糖単位あたりのカルボキシメチルに関する置換度１．２及び平均モル質量３００００ｇ／モルを有するカルボキシメチルセルロースから合成する。ベンジルアミンを、水中、水溶性カルボジイミドの存在下での慣用のカップリング方法にしたがって、このポリマーの酸に結合した。糖単位当たりのベンジルアミンに関する置換度は、¹H NMRによって０．２である。

PDGF-BB／CMCB複合体の調製
０．１mg/mlのPDGF-BBの溶液１０μlを、５０mg/mlのCMCB溶液９０μlに加える。PDGF-BB及びCMCB溶液をpH７．４及び３００mOmsに緩衝化する。この溶液を周囲温度で穏やかに２時間攪拌し、そして４℃で保存する。

PDGF-BB／CMCB複合体が形成しないことの実証
上記のPDGF-BB／CMCB複合体の溶液１０μlを、免疫学的可視化を伴うゲル電気泳動のためのアガロースゲル上にのせる。電場（２００mA−４時間）の作用下で化合物が移動する。移動後、PDGF-BBは、一夜、PVDF膜上に移動させ、そしてヤギ抗−PDGF-BB抗体によるイムノブロッティングにより可視化し、ここにＨＲＰペルオキシダーゼに結合した抗−ヤギIgG二次抗体が結合し、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）によって可視化する。

可視化は、両親媒性ポリマーを伴うPDGF-BBのみのいかなる移動も示さない。CMCB及びPDGF-BB間の複合体は形成していない。

（原文記載なし）

Claims

物理的及び化学的に安定な、水溶性の両親媒性ポリサッカライド−PDGF複合体であって、前記両親媒性ポリサッカライドは、以下の一般式：

｛式中、
該ポリサッカライドは、カルボキシメチルセルロース又はカルボキシメチルデキストランであり、R及びR'は、結合、又は、１〜１８個の炭素鎖であり、該炭素鎖は、場合により、O、N及びSから成る群より選択された1つ以上のヘテロ原子を含む、分岐した及び／又は不飽和の炭素鎖であり、
R及びR'は、お互いに同じ又は異なり、
F及びF'は、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル、又はアミンであり、
F及びF'は、お互いに同じ又は異なり、
Xは、カルボキシレートである親水性基であり、
Hyは、次の(i)〜(iii)から選択される疎水性基であり；
(i) 直鎖又は分岐鎖C ₈ 〜C ₃₀ アルキル基、該直鎖又は分岐鎖アルキル基は、飽和又は不飽和であり及び／またはO、N及びSから成る群より選択された1つ以上のヘテロ原子を含む、
(ii) 直鎖又は分岐鎖C ₈ 〜C ₁₈ アルキルアリール又はアリールアルキル基、該直鎖又は分岐鎖アルキルアリール又はアリールアルキル基は、飽和又は不飽和であり及び／またはヘテロ原子を含む、
(iii) 飽和又は不飽和のC₈〜C₃₀多環式基、
ｎ及びoは１〜３であり、
ｈは、０．０１〜０．５の、モノマー単位に対する疎水性基のモル分率を表し、
ｘは、０〜２．０の、モノマー単位に対する親水性基のモル分率を表す｝
により表される、疎水性置換基及び親水性基で官能化された親水性ポリマー骨格からなり；
前記PDGFは、血小板由来成長因子である、こと、
を特徴とする、前記複合体。
前記PDGFが、2つのB鎖を含むヒト組換えPDGF(rhPDGF-BB)であることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
前記ポリサッカライドは、前記置換基がランダムに分布するポリサッカライドから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
前記疎水性基Hyが、脂肪酸類、脂肪族アルコール類、脂肪族アミン類、ベンジルアミン類、コレステロール誘導体類及びフェノール類から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
前記両親媒性ポリサッカライド−PDGF複合体の形成が可逆的であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか1項に記載の複合体。
化学的及び物理的安定性の実証のための試験に合格することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
前記化学的及び物理的安定性の実証のための試験が、前記複合体の実証のための試験(ゲル移動度シフト法)、プロテアーゼと接触させることによる酵素的分解の減速についての試験、及びSDS-Pageにより実施される生理的pHでの物理的安定性についての試験からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の複合体。
前記PDGF／両親媒性ポリサッカライド比が、１／５〜１／５０００であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
前記PDGF／両親媒性ポリサッカライド比が、１／１００〜１／５０００であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
前記PDGF／両親媒性ポリサッカライド比が、１／３００〜１／７００であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか1項に記載の複合体。
前記疎水性基Hyがトリプトファン又はトリプトファンのエステル又はトリプトファンの塩であることを特徴とする、請求項１記載の複合体。
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の両親媒性ポリサッカライド−PDGF複合体の調製方法であって、該ポリサッカライド−PDGF複合体が、水性媒体中で、かつ該タンパク質を変性しうる有機溶媒の不存在下で調製されることを特徴とする、前記方法。
請求項１〜１１のいずれか1項に記載の両親媒性ポリサッカライド−PDGF複合体を含むことを特徴とする、治療用組成物。
１００μg/mlのPDGFの投与を可能とすることを特徴とする、請求項１３に記載の治療用組成物。
局所投与による潰瘍の治療における使用のための治癒効果を有する治療用組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の両親媒性ポリサッカライド−PDGF複合体の使用。