WO2024004923A1

WO2024004923A1 - 細菌標的型カプシド粒子、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌除去方法、殺菌方法、腐食予防方法、動物治療方法、遺伝子導入方法、細菌機能追加方法、細菌標的型カプシド粒子の製造方法、細菌標的型カプシド粒子用核酸の製造方法

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Publication number: WO2024004923A1
Application number: PCT/JP2023/023521
Authority: WO
Inventors: 龍洙崔; 恒太朗氣駕
Original assignee: 学校法人自治医科大学
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2023-06-26
Publication date: 2024-01-04

Abstract

非増殖性で殺菌効果等が高い細菌標的型カプシド粒子を提供する。　ファージのカプシドタンパク質は、ファージのゲノムから分割された、パッケージング領域を含まない、主にＶｉｒｉｏｎ領域を含み、カプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜により調製される。細菌標的型カプシド粒子（Ｂａｃｔｅｒｉａ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｃａｐｓｉｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｂ－ＣＡＰ）用エレメントは、ファージのゲノムのカプシド核酸エレメン卜以外の箇所から分割された、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含む。これらがアセンブリされた細菌標的型カプシド粒子（Ｂ－ＣＡＰ）は、非増殖性であるものの、殺菌効果等を含めた新たな生物学的機能を付与する長鎖ＤＮＡの搭載を可能にする。

Description

細菌標的型カプシド粒子、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌除去方法、殺菌方法、腐食予防方法、動物治療方法、遺伝子導入方法、細菌機能追加方法、細菌標的型カプシド粒子の製造方法、細菌標的型カプシド粒子用核酸の製造方法

　本発明は、特に細菌標的型カプシド粒子、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌除去方法、殺菌方法、腐食予防方法、動物治療方法、遺伝子導入方法、細菌機能追加方法、細菌標的型カプシド粒子の製造方法、細菌標的型カプシド粒子用核酸の製造方法に関する。

　従来から、数多くの抗菌薬が開発され、様々な細菌感染症が治療されてきた。しかしながら、抗菌薬の使用から間もなく薬剤耐性菌（抗菌薬、抗生物質が効かない細菌）が報告され始めた。今や耐性菌は地球上のいたるところに存在し、臨床で使用されているほぼ全ての抗菌薬に対して耐性菌が出現している。抗菌薬の開発を遥かに上回るスピードで耐性菌が現れるため、細菌感染症が再び人類の健康を脅かす世界的問題となってきている。すなわち、抗菌薬開発と耐性菌変遷の歴史を鑑みると、耐性菌の出現は避けられそうになく、更に、新たな耐性菌が現れても対応できる進化適応型医薬品は存在しないことが危惧されている。このような危機的状況のなか、世界各国が薬剤耐性対策アクションプランを策定し、耐性菌に対する新たな予防、診断、治療法の開発を推進している。

　ここで、従来から、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ、以下、「ファージ」という。）を用いた抗菌治療法であるファージセラピーが知られている。ファージは、細菌に感染するウイルスで、以下の過程を経て増殖する。（１）宿主細菌に付着、（２）自身の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を注入し、（３）菌体内で自身の核酸の複製を行う。その後、（４）外殻となる構成タンパク質（カプシド）を合成、（５）娘ファージを組み立て、（６）溶菌等により娘ファージを菌体外に放出する。ファージセラピーは、細菌に感染するウイルスであるファージの溶菌活性を利用して殺菌する治療法であり、１９１５年のファージの発見により試みられ、近年、臨床応用が加速化してきている。
　しかしながら、ファージは増殖し、遺伝子を伝播することから、予期せぬ細菌進化の誘発や毒素遺伝子の伝播、生態系への悪影響が懸念されている。

　そこで、特許文献１には、増殖しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を搭載したファージによる殺菌方法が記載されている。また、遺伝子欠損ファージやファージミドを利用したファージセラピー開発も試みられている。

国際公開第２０１４／２０４７２６号

Ｋｉｇａ　Ｋ．他、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ－ｂａｓｅｄ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０２０年、ｖｏｌ．　１１（１）：２９３４Ｄｅ　Ｇｒａａｆ，Ｆ．Ｋ．及びＯｕｄｅｇａ，Ｂ．、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｃｌｏａｃｉｎ　ＤＦ１３　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｌｉｃｉｎｓ」、Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８６、ｖｏｌ．１２５、ｐ．１８３－２０５

　しかしながら、特許文献１に記載したような、従来の増殖しないファージでは、感染した菌しか殺菌ができない等の限界があり、薬剤耐性菌の治療等により効果的なファージ等が求められていた。

　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

　本発明の細菌標的型カプシド粒子は、ファージのカプシドタンパク質と、前記ファージのゲノムの核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントとを備え、非増殖性であることを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子は、前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントは、外来遺伝子を含むことを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子は、前記外来遺伝子は、殺菌遺伝子、バイオフィルム分解遺伝子、抗原提示用遺伝子、及び導入用遺伝子のいずれか又は任意の組み合わせを含むことを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子は、前記殺菌遺伝子により、周囲の菌を殺菌する分泌性の殺菌産物を生成することを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子は、前記外来遺伝子は、標的細菌の殺菌を抑える抵抗因子を含むことを特徴とする。
　本発明の治療用組成物は、前記細菌標的型カプシド粒子を含むことを特徴とする。
　本発明の殺菌剤は、前記細菌標的型カプシド粒子を含むことを特徴とする。
　本発明の食品は、前記細菌標的型カプシド粒子を含むことを特徴とする。
　本発明の細菌除去方法は、前記細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を除去することを特徴とする。
　本発明の細菌除去方法は、標的細菌は、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在することを特徴とする。
　本発明の細菌除去方法は、標的細菌は、食品内に存在することを特徴とする。
　本発明の殺菌方法は、前記細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を殺菌することを特徴とする。
　本発明の腐食予防方法は、前記細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を殺菌し、物品の腐食を予防することを特徴とする。
　本発明の動物治療方法は、前記細菌標的型カプシド粒子により動物を治療することを特徴とする。
　本発明の遺伝子導入方法は、前記細菌標的型カプシド粒子に含まれる前記外来遺伝子を標的細菌に導入することを特徴とする。
　本発明の細菌機能追加方法は、前記細菌標的型カプシド粒子に含まれる前記外来遺伝子を標的細菌に導入し、該標的細菌に機能を追加することを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子の製造方法は、ファージのゲノムから分割された、パッケージング領域を含まず、カプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜により前記ファージのカプシドタンパク質を調製し、前記ファージのゲノムの前記カプシド核酸エレメン卜以外の箇所から分割された、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びに前記パッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントを、前記カプシドタンパク質にパッケージングし、非増殖性の細菌標的型カプシド粒子を生成することを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子の製造方法は、前記カプシド核酸エレメン卜及び前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントを、調製用の調製細菌内に導入して、前記細菌標的型カプシド粒子を前記調製細菌内で生成させることを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子の製造方法は、前記カプシド核酸エレメン卜は、前記調製細菌用の染色体又は人工染色体により導入されることを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子の製造方法は、前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントは、前記染色体又はプラスミドにより導入されることを特徴とする。
　本発明の細菌標的型カプシド粒子用核酸の製造方法は、ファージゲノムから、パッケージング領域を含まず、カプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜を分割して調製し、前記ファージゲノムの前記カプシド核酸エレメン卜以外の箇所から、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びに前記パッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントを分割して調製し、非増殖性の細菌標的型カプシド粒子用核酸を構築することを特徴とする。

　本発明によれば、ファージのカプシドタンパク質と、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントとを備えることで、薬剤耐性菌の治療等に効果的な、非増殖性の細菌標的型カプシド粒子を提供することができる。

本発明の実施形態に係る細菌標的型カプシド粒子の構造を示す図である。従来のファージ療法と、本発明の実施形態に係る細菌標的型カプシド粒子による抗菌治療方法との比較を示す概念図である。本発明の実施例に係るＴ７ファージ及びＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰの配列構造の概念図である。本発明の実施例に係るＴ７ファージ及びＢ－ＣＡＰの配列構造の概念図である。本発明の実施例に係るＰＣＲ法でのＢ－ＣＡＰ構築の確認についての模式図及び電気泳動結果の写真である。本発明の実施例に係るＢ－ＣＡＰの電子顕微鏡による写真である。本発明の実施例に係るＢ－ＣＡＰの殺菌活性を示す写真である。本発明の実施例に係る黄色ブドウ球菌由来のＴａｎ２ファージのＢ－ＣＡＰ配列構造、Ｂ－ＣＡＰ合成の概念図、及びＢ－ＣＡＰ合成の写真である。本発明の実施例に係るＢ－ＣＡＰへの長鎖ＤＮＡの搭載の試験の概念図である。図９に示す試験で得られたプラーク数を示すグラフである。図９に示す試験で得られたプラークの写真である。図９に試験で得られたプラークへの長鎖ＤＮＡの搭載をＰＣＲ法で確認する際の模式図及び電気泳動結果の写真である。図９に試験で得られたプラークへの長鎖ＤＮＡの搭載をシーケンシングで確認した結果を示す図である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの構築の概念図である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの配列構造の模式図である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰのプレートによる殺菌効果を示す写真である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの液体培養液中での殺菌効果を示すグラフである。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの薬剤耐性大腸菌に対する殺菌効果を示す写真である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの細菌感染マウスに対する抗菌治療試験の概念図である。本発明の実施例に係る殺菌性Ｂ－ＣＡＰの細菌感染マウスに対する抗菌治療効果を示すグラフである。

＜実施形態＞
　増殖性のファージは予期せぬ細菌進化の誘発や毒素遺伝子の伝播、生態系への悪影響が懸念されている。
　このため、本発明者らは、非増殖性であり薬剤耐性菌の治療等により効果的なファージを作製しようと考えた。そして、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、ＤＮＡ注入とＤＮＡ複製に必要なファージゲノムエレメントを有する、「細菌にＤＮＡを注入できる非増殖性ファージカプシド粒子」の構築を行うことを着想した。そこで、本発明者らは、増殖性に関連しカプシドを合成する領域を含むビリオン（Ｖｉｒｉｏｎ）構成遺伝子を除外した配列を持つＤＮＡ構造物（エレメント）を生成し、そのエレメントの溶菌ファージカプシドへのパッケージングに成功し、本発明を完成させるに至った。ファージカプシド内にパッケージングされたエレメントは、野生ファージの細菌感染と同様に、対象宿主細菌の細胞内に注入される。このため、このエレメントがパッケージングされたものを、非増殖性の細菌標的型カプシド粒子（Ｂａｃｔｅｒｉａ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｃａｐｓｉｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「Ｂ－ＣＡＰ」という。）と名付けた。

　以下で、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰ、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌除去方法、殺菌方法、腐食予防方法、動物治療方法、遺伝子導入方法、細菌機能追加方法、Ｂ－ＣＡＰの製造方法、Ｂ－ＣＡＰ用核酸の製造方法について具体的且つ詳細に説明する。

（Ｂ－ＣＡＰの構築）
　まず、Ｂ－ＣＡＰの構築法（製造方法）について説明する。まず、本実施形態に係るファージゲノム分割法として、ファージの染色体（ゲノム）を適切に分割することで、溶菌ファージでトランスダクションとＤＮＡ複製とパッケージングに特化したＢ－ＣＡＰ用エレメントの構築を行う。具体的には、ファージのゲノムを分割して、ＤＮＡ注入とＤＮＡ複製に必要な遺伝子群のみを含むＢ－ＣＡＰ用エレメントを生成する。このＢ－ＣＡＰ用エレメントは、増殖性に関連しカプシドを合成する領域を含むビリオン（Ｖｉｒｉｏｎ）構成遺伝子を除外し、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含む。
　Ｂ－ＣＡＰ用エレメントは、染色体又はプラスミドにより構築されてもよい。このプラスミドは、人工染色体よりコピー数が多くてもよい。

　一方、ファージのゲノムから、Ｂ－ＣＡＰ用エレメント以外の箇所、すなわち、ファージカプシドを合成するカプシド構築用のＤＮＡエレメントであるカプシド核酸エレメン卜（以下、「カプシミド（ｃａｐｓｉｍｉｄ）」という。）の構築も行う。このカプシド核酸エレメン卜は、Ｖｉｒｉｏｎを含むもののパッケージング領域を含まず、カプシドを合成することに特化したエレメントとなる。
　本実施形態において、カプシド核酸エレメン卜は、調製細菌内で安定的に維持するため、調製細菌用の染色体又は細菌の人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＢＡＣ）により構築されてもよい。

　このように、Ｂ－ＣＡＰ用エレメントとカプシド核酸エレメン卜とを構築することで、非増殖性のＢ－ＣＡＰ用核酸を製造することができる。

　これら、Ｂ－ＣＡＰ用エレメント及びカプシド核酸エレメン卜は、調製用の調製細菌内に導入して、Ｂ－ＣＡＰを調製細菌内で生成させることが可能である。具体的には、Ｂ－ＣＡＰ調製用細菌内に、エレクトロポレーション、リポソーム、インジェクション、その他の遺伝子導入方法により、Ｂ－ＣＡＰ用エレメント及びカプシド核酸エレメン卜を調製細菌内に導入可能である。
　この調製細菌は、例えば、大腸菌や枯草菌等の一般的な細菌を用いることが可能である。また、Ｂ－ＣＡＰが感染しＤＮＡを注入する標的となる標的細菌と同種又は近縁種の細菌を、調製細菌とすることも可能である。

　この上で、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰの製造方法では、調製細菌内で、Ｂ－ＣＡＰ用エレメントが増殖する。また、同じ調製細菌内で、カプシド核酸エレメン卜によりカプシドタンパク質も生成され、増殖したＢ－ＣＡＰ用エレメントが、このカプシドタンパク質にパッケージングされる。これにより、非増殖性のＢ－ＣＡＰ粒子が生成される。このＢ－ＣＡＰ粒子は、調製細菌の溶菌及び／又は菌体外へ放出させ、超遠心により精製する等の当業者に一般的な手法により、大量に取得可能となる。

　図１により、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰの構築を、大腸菌に主に感染するＴ７ファージにて行った一例について説明する。
　本実施形態においては、後述する実施例に示すように、増殖ファージのモデルであるＴ７ファージのゲノムをＢ－ＣＡＰ用エレメントと、カプシド核酸エレメン卜であるＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰの領域に分割し、アセンブリした。Ｂ－ＣＡＰ用エレメントは、プラスミド様の円形ＤＮＡとした。一方、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰは、大腸菌の人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＢＡＣ）に挿入し、ｐＫＬＣ１７２と名付けた。この上で、Ｂ－ＣＡＰ用エレメントのＤＮＡとｐＫＬＣ１７２とを大腸菌ＨＳＴ０８株、ＭＣ１０６１株、及びＭＣ１０６１Ｒ株に、それぞれエレクトロポレーションすることで、Ｔ７ファージのカプシドにパッケージングされ、ＤＮＡを標的細菌に導入できるＢ－ＣＡＰを作製することができた。

　このようにして製造されるＢ－ＣＡＰは、非増殖性である。そして、分割されたもう片方のカプシド核酸エレメン卜を保有する遺伝子補完ホス卜の調製細菌内のみで増殖が可能となり、この調製細菌はＢ－ＣＡＰ合成の「工場」になる。

　一方、製造されたＢ－ＣＡＰは、非増殖性ながら野生型ファージと同じ感染様式を持ち、長鎖ＤＮＡを標的細菌にデリバリーすることができる。すなわち、Ｂ－ＣＡＰは、外来性ＤＮＡの搭載と標的菌体内へ、Ｂ－ＣＡＰ用エレメントＤＮＡの注入が可能である。また注入されたＢ－ＣＡＰ用エレメントは、標的細菌内での増幅を含め、自身のＤＮＡに由来する生物学的活性を発揮できる。
　このため、Ｂ－ＣＡＰは、従来より効率的に、細菌感染症の抗菌治療薬、消毒剤、整腸剤、口腔用構成物、防腐剤等として応用が可能である。

　ここで、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰのＢ－ＣＡＰ用エレメントは、外来遺伝子を含んでもよい。この外来遺伝子は、バイオフィルム分解遺伝子、抗原提示用遺伝子、導入用遺伝子、及び殺菌遺伝子のいずれか又は任意の組み合わせを含んでいてもよい。
　具体的には、後述する実施例で示すように、作製したＢ－ＣＡＰには少なくとも１８．０ｋｂの外来の長鎖ＤＮＡを挿入することが可能である。この長鎖ＤＮＡ内に、外来遺伝子を含ませることが可能である。

　このうち、本実施形態に係るバイオフィルム分解遺伝子は、例えば、細菌の多糖質、ペプチドグリカン、タンパク質等からなるバイオフィルムの分子構造を切断したり、分解したりするデキストラナーゼ、プロテアーゼ等であってもよい。このバイオフィルム分解遺伝子の遺伝子産物により、細菌のバイオフィルムを分解し、細菌自体の生存を不可能とし、及び／又は抗菌剤等が浸透しやすくすることができる。

　また、本実施形態に係る抗原提示用遺伝子は、免疫系に認識しやすくしたり、攻撃の標的となる抗原を提示したりする遺伝子であってもよい。この抗原は、必ずしも、Ｂ－ＣＡＰが感染する細菌に対する抗原でなくても、病巣に存在する他の病原生物、ウイルス、動物の腫瘍等に対する抗原であってもよい。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、カプシド内に自由にＤＮＡ配列を導入できるため、病原細菌、腸内フローラの細菌、その他の細菌のＤＮＡを搭載、又はファージカプシド表面に抗原を提示させるファージワクチン分野にも利用可能である。また、がん治療や遺伝性疾患の治療にも適用可能となる。

　また、本実施形態に係る導入用遺伝子は、細菌に導入される遺伝子であってもよい。この導入用遺伝子は、Ｂ－ＣＡＰが感染する細菌への機能追加を行うための各種遺伝子を用いることが可能である。たとえば、この機能追加として、タンパクや各種物質の合成、分泌等に係る遺伝子を追加可能である。また、上述のように、Ｂ－ＣＡＰには、外来の長鎖ＤＮＡを搭載可能であるため、複数の遺伝子を導入することも可能である。この導入用遺伝子は、例えば、薬剤遺伝子、薬剤耐性遺伝子、弱毒化又は強毒化に関連するタンパク質をコードする遺伝子、毒素遺伝子、特定の代謝産物遺伝子、特定の代謝産物を生成するための酵素遺伝子、菌を特定するための遺伝子、形質転換に用いたレポーター遺伝子、遺伝子組み換えに用いられた制限酵素や粘着末端を含む配列、リピート配列、その他の広義の遺伝型を示す「遺伝子」であってもよい。

　また、本実施形態に係る外来遺伝子は、核酸取得及び／又は核酸変異によって薬剤耐性を失わせ、又は薬剤耐性を生じさせるものであってもよい。
　具体的には、耐性菌は、外来のＤＮＡ又はＲＮＡ（核酸）取得、及び／又は核酸変異によって生じることがあるため、この核酸取得及び／又は核酸変異を抑制させるような外来遺伝子により、抗菌効果を高めることが可能となる。

　また、本実施形態に係る殺菌遺伝子は、分泌性の殺菌産物を生成するものであってもよい。具体的には、本実施形態に係る殺菌遺伝子により、周囲の菌を殺菌する分泌性の殺菌産物を生成することが可能である。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰに、分泌性の殺菌産物を生成する殺菌遺伝子を搭載することで、標的細菌と標的細菌周辺の細菌群を殺菌（集団殺菌）できる。
　たとえば、Ｂ－ＣＡＰに、外来遺伝子として、分泌性の殺菌性ＤＮＡマシナリーを搭載可能である。この殺菌性ＤＮＡマシナリーとしては、例えば、バクテリオシンを生成、分泌するためのバクテリオシン遺伝子群（ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅ１　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ）を搭載してもよい。バクテリオシンは、細菌が産生する抗菌性のタンパク質又はペプチドであり、菌体外に分泌され、類縁菌に対して抗菌活性を示す。このため、Ｂ－ＣＡＰにバクテリオシン遺伝子群を搭載することで、標的細菌と標的細菌周辺の細菌群を殺菌することが可能となり、著しい抗菌効果が得られる。
　本発明者らは、このように、殺菌剤として用いるＢ－ＣＡＰを、非増殖性集団殺菌型抗菌カプシド（Ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｍａｓｓ－ｋｉｌｌｉｎｇ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃａｐｓｉｄ。以下、「ＮＭ－ＡＢカプシド」という。）と名付けた。

　ここで、本実施形態に係るＮＭ－ＡＢカプシドは、非常に強い集団殺菌効果を示し、非増殖性であるものの効率的に治療が可能なＢ－ＣＡＰとなる。
　具体的には、後述の実施例で示すように、ＮＭ－ＡＢカプシドの一例として、バクテリオシン遺伝子群を搭載したＢ－ＣＡＰ（Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１）は、非増殖性でありながら、カルバペネム耐性大腸菌に対して強い殺菌活性を発揮した。また、当菌に感染されたマウスに対しても著しい生存効果を示した。

　図２により、本実施形態に係るＮＭ－ＡＢカプシドを含むＢ－ＣＡＰによる抗菌治療方法の概念について説明する。
　図２は、Ｔ７ファージ、Ｂ－ＣＡＰ、及びＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１による抗菌治療の違いを示す。
　Ｔ７ファージは増殖性であり、標的となる細菌の菌体内で増殖し、増殖過程で宿主を溶菌する。増殖するため、環境への悪影響や、他の細菌への遺伝子伝播が懸念される。
　一方、Ｂ－ＣＡＰは、ファージ由来のＤＮＡを注入することで標的細菌を殺菌できるが、増殖性が無いため殺菌力そのものは弱い。一方、Ｂ－ＣＡＰは長鎖遺伝子を搭載することができ、標的細菌内でその遺伝子を一過的に大量に発現させることが可能である。このため、非増殖製のカプシドとして、各種利用が可能である。さらに、上述のバイオフィルム除去遺伝子等を搭載し、殺菌等にも効率的に利用可能である。
　Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、ＮＭ－ＡＢカプシドの一例であり、Ｂ－ＣＡＰに分泌性の抗菌タンパク質／ペプチド（ＡＭＰｓ）を搭載したものである。Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、ＡＭＰｓとして、バクテリオシンを搭載している。ＮＭ－ＡＢカプシドは、標的となる菌体内に入ると増幅し、ＡＭＰｓを大量に合成する。ＡＭＰｓは菌体外に分泌され、周囲の細菌も殺菌することができる。

　ここで、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１では、Ｂ－ＣＡＰにバクテリオシン遺伝子群として、Ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅ１（ＣｏｌＥ１）、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ（免疫遺伝子）、ｃｏ　ｌｉｃｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ（分泌遺伝子）を搭載して、Ｂ－ＣＡＰ＿Ｃｏｌ　Ｅ１を作製した。
　このうち、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ（免疫遺伝子）は、標的細菌の殺菌を抑える抵抗因子の一例である。このようにＢ－ＣＡＰの外来遺伝子として、抵抗因子の遺伝子を含めることで、ＮＭ－ＡＢカプシドが標的細菌に感染した後に、分泌性の殺菌産物が十分生成されるまで、この標的細菌が殺菌されるのを抑えることができる。

　なお、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰに搭載する外来遺伝子は複数であるように構成してもよい。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、一つのファージ内に、複数の外来遺伝子を含ませることが可能である。この際、カプシド内に含ませることが可能な範囲で、複数の外来遺伝子を含ませてもよい。この複数の外来遺伝子は、配列内に連続して又は複数の部位として並べても、複数含むように構成してもよい。
　たとえば、複数の種類の細菌に適用可能なように複数の殺菌遺伝子を搭載することで、一つのＢ－ＣＡＰを複数の耐性菌に適用可能となる。さらに、複数の耐性遺伝子を持つような多剤耐性菌の場合、これら全てに対応するような遺伝子を複数搭載して、抗菌効率を向上させることも可能である。さらに、Ｂ－ＣＡＰに、上述の殺菌遺伝子、バイオフィルム分解遺伝子、抗原提示用遺伝子、及び導入用遺伝子の任意の組み合わせを搭載させることで、抗菌効果をより高めることも可能である。

（治療用組成物）
　本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、これを含む治療用組成物の用途にも用いることが可能である。
　すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰを治療用に投与させることで、細菌を殺菌する抗菌治療法に用いることが可能である。具体的には、Ｂ－ＣＡＰにより、細菌を殺菌する抗菌治療法を実現可能である。これにより、薬剤耐性菌の感染症を含む、抗菌薬で治療が難しい感染症の抗菌治療を可能にすることができる。
　この治療用組成物製造には、従来のファージを用いた抗菌治療法と同様の各種配合物を用いることが可能である。

　また、本発明の実施形態に係る治療用組成物は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。

　また、本実施形態の治療用組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等から選択される１又は２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。

　本発明の実施形態に係る治療用組成物は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
　本発明に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口的な投与又は非経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、細菌叢や感染部位への直接投与、滴下、塗布等が可能である。この投与方法は、従来のファージセラピーと同様に行ってもよい。

　また、本発明の実施形態に係る治療用組成物を上述の治療に用いるためには、投与間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
　本発明の実施形態に係る治療用組成物の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
　投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。

　本発明の実施形態に係る治療用の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
　また、本発明の実施形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。

　また、本発明の実施形態に係る治療用組成物は、生物、生物の体内の一部分、又は生物より摘出又は排出されたその一部分について、治療用の対象とすることができる。
　この生物は特に限定されず、例えば、動物、植物、及び菌類等であってもよい。この動物は、例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物等を含む。
　このため、本発明の実施形態に係る治療用組成物は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、ヒト以外の各種動物を対象とした動物治療方法にも用いることが可能である。

　具体的には、本実施形態の動物治療方法は、Ｂ－ＣＡＰを含む治療用組成物により、ヒト以外の動物における細菌による感染症を治療することが可能である。
　この動物も、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類としては、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンの霊長類等であってもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
　すなわち、本発明の実施形態に係る治療用組成物は、ヒトの治療の他に、動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。

　また、本発明の実施形態に係る殺菌方法は、Ｂ－ＣＡＰにより標的細菌を除去（殺菌、滅菌）することを特徴とする。
　このように、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰを含む組成物を、殺菌剤（増殖抑制剤）の用途に用いることが可能である。この殺菌剤も、上述のように適切な担体、溶液等に含ませておくことが可能である。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰを含む組成物は、消毒薬として、洗剤、手洗い用せっけん、うがい薬、マスクやナプキン、空気清浄機のフィルター等、各種の抗菌用品に含ませて提供されてもよい。
　また、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰを含む組成物を、細菌のペプチドグリカン、バイオフィルム等を除去する用途で利用することも可能である。この場合、上述のように、Ｂ－ＣＡＰの外来遺伝子として、バイオフィルム分解遺伝子を搭載することが好適である。
　この本実施形態に係る殺菌剤を、塗布、散布等することで、病巣、細菌叢、及び環境中から細菌の除去及び増殖抑制を行うことが可能である。すなわち、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在する細菌を減少させることができる。

　また、本発明の実施形態に係る細菌除去方法においては、食品内又は外に存在する細菌を除去することも可能である。具体的には、Ｂ－ＣＡＰを含むことを特徴とする食品を提供することもできる。すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰにより、食品内の細菌を除去することが可能である。これは、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、取得してもヒトには感染しないためである。また、このように細菌を除去した食品を提供することも可能となる。これにより、例えば、毒素を産生する食中毒菌を確実に除去した安全な食品を提供することが可能となる。ここで、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、各種野菜、食肉、魚介類、加工食品、乳製品等を含む栽培、養殖、採取等された任意の食品に含ませて用いることが可能である。
　さらに、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、標的細菌を殺菌し、食品及び食品以外の物品の腐食を予防する、腐食予防方法の用途に用いることも可能である。

　以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
　従来から、抗菌薬が細菌感染症の治療において最も重要な役割を果たしてきた。しかし、抗菌薬の効かない薬剤耐性菌の出現とその急速な蔓延により、既存の抗菌薬が無力化されつつある。薬剤耐性菌は世界規模で蔓延しているため、新しい抗菌薬の開発が求められている。しかし、抗菌薬の開発を遥かに上回るスピードで耐性菌が現れ、更に新規抗菌薬の開発が行き詰まっているため、耐性菌の問題が解決できなくなりつつあった。このため、細菌感染症が再び人類の健康を脅かす世界的問題となってきている。

　また、従来、ファージの薬剤耐性菌に対する殺菌効果が認められ、ファージセラピーを展開しようとする動きがある。ファージセラピーで使用されるファージは感染巣に存在する細菌内で増殖するため、強い殺菌力を発揮する。しかし、増殖性というファージ自身の生物学的性質から臨床使用が懸念され、実用化が進んでいない。すなわち、抗菌治療にファージの増殖性を利用した場合、殺菌力は確保されるが、生態系への悪影響や意図しない副作用が心配される。また、ファージによる薬剤耐性遺伝子や毒素遺伝子の伝播も懸念される。

　このため、ファージ療法を社会的に使用可能とさせるためには、治療確度を上げること、標的をコントロールすること、安全性を上げることが課題であることがわかってきた。
　そのため、改変ファージによりこれらの問題を解決する試みが行われている。具体的には、ファージのゲノムを部分的に欠損させ、非増殖型ファージにすることも考えられる。
　たとえば、非増殖性ファージの合成として、Ａｍｂｅｒ変異の導入等で必須遺伝子の機能欠損により増殖能を失わせることが知られていた。また、遺伝子欠損はプラスミドによる遺伝子の相補で増殖能が戻ることも知られていた。しかし、ファージゲノムの大幅削除や複数遺伝子の欠損は技術的に困難と思われ、その作業は全く行われてこなかった。
　実際に、本発明者らもプラスミドによる長鎖遺伝子欠損ファージの合成を試みたが失敗に終わった。具体的には、ファージのｔｅｒＳ遺伝子を欠損させてプラスミドで相補することにより、非増殖性のファージカプシドを作製した。この際、ファージミドを利用した方法とＳａＰＩを利用した方法で増殖しないファージを合成したが、合成にはＭｉｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ等の誘導剤が必要であったり、合成量が少なかったりするという不利点があった。

　さらに、非増殖性ファージは、増殖しないため、一般的にその殺菌力が弱いことが知られている。実際、非増殖製ファージを利用した場合、増殖しないために治療には非常に多くの投与量が必要となる。後述の実施例でも、非増殖性のＢ－ＣＡＰのみを大腸菌に作用させても、ＭＯＩ＝１では、ほとんど殺菌効果が得られなかった。
　すなわち、非増殖性ファージは、感染部位で増幅できるファージのメリットが失われ、実際の抗菌治療に要するファージが大量に必要になる点でも、治療に用いるには現実的ではなかった。

　これらの理由から、通常のファージや非増殖性ファージは、抗菌治療剤としての利用が難しかった。理想的なファージ製剤は、耐性菌に効果がある「耐性菌への効力」、非増殖性ファージのように生態系への影響が少ない「高い安全性」、「量産性」、及び抗菌治療効果の高い「強い抗菌力」が求められている。

　これに対して、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰでは、ファージゲノム分割法により、非増殖性の性質を保ったまま、外来遺伝子を長鎖のＤＮＡ内に搭載可能であるため、効率的に利用可能となる。すなわち、搭載する外来遺伝子を適切に選択してＢ－ＣＡＰを作製することで、確実に細菌を殺菌等することが可能となる。たとえば、単独の殺菌遺伝子では細菌の進化により耐性が生じることがあるものの、Ｂ－ＣＡＰに複数の遺伝子を搭載することで、これを抑制して効果を長く保つことができる。
　また、Ｂ－ＣＡＰは、搭載する外来遺伝子により、どんな細菌も殺菌対象にできるため、「耐性菌への効力」が高くなる。すなわち、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、新たな耐性菌が生じた場合、搭載する遺伝子を変更するだけで対応できるため、進化適応型医薬品となりうる。また、遺伝子工学的技術を用いてＢ－ＣＡＰ自体を改変して、細菌に対応することも可能である。

　さらに、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、「高い安全性」として、自己増殖するファージ（増殖ファージ、ｐｒｏｇｅｎｙ　ｐｈａｒｇｅ）を生成しないため、一般的なファージよりも安全面で優位であると考えられる。また、従来の非増殖性ファージにおいては、単独の遺伝子欠損だと補完されて増殖可能となる可能性が高いという問題があったものの、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは長鎖ファージゲノムが欠損しており、自然界から長鎖ＤＮＡを補完することはほぼ不可能であると考えられる。すなわち、Ｂ－ＣＡＰは、増殖性を獲得する確率は極めて低いため、安全性が高い。さらに、Ｂ－ＣＡＰは、分割されたカプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜（カプシミド）を保有する遺伝子補完する調製細菌内のみで調製が可能である。すなわち、Ｂ－ＣＡＰは、自然界では生成されず、Ｂ－ＣＡＰ合成の「工場」となる専用の調製細菌でなければ調製ができない。
　これらの理由から、Ｂ－ＣＡＰは、「高い安全性」を備え、抗菌ファージ製剤の生物学的安全性問題を解決できる。

　さらに、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、自己増殖しない合成カプシドであるため、Ｂ－ＣＡＰ自体の変異による作用を抑えられる。たとえば、Ｂ－ＣＡＰは、増殖しないため耐性遺伝子や毒素遺伝子を新たに取り込むこともなく、伝播もしない。また、Ｂ－ＣＡＰが自己増殖しないことで、投与された生物や環境中の細菌にプロファージが保持される可能性も極めて低くなり、生態系への影響が少ない。さらに、原理的に、耐性菌が発生しにくい。これにより、安全性を高められる。さらには、Ｂ－ＣＡＰは自己増殖しないので、投与用量を的確に見積もることが可能となる。
　また、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、自然物由来であるので安全で環境負荷が低い。このため、安全で環境負荷が低い殺菌剤や食品を提供することも可能となる。

　また、「量産性」について、従来、非増殖性ファージのゲノムアセンブリは酵母を利用した煩雑な手法を使用するものの、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰでは、合成する際のゲノムアセンブリを全てｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うことが可能となり、量産性を担保できる。すなわち、本実施形態では溶菌ファージのゲノムを分割するゲノム分割法という新しい概念により、ファージの核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含んだＢ－ＣＡＰを構築し、ファージカプシドへの任意の長鎖ＤＮＡ搭載とその大量合成を可能にした。
　Ｂ－ＣＡＰゲノムのアセンブリをｉｎ　ｖｉｔｒｏでダイレクトに行うことで、高効率でＢ－ＣＡＰの合成ができるようになり、その合成コストや時聞を大幅に削減できる。また、製剤化に関しても、大量（約１０¹⁰ＰＦＵ／ｍｌ以上）のＢ－ＣＡＰを安価に合成できるため、コストを削減して製造上のメリットが大きい。

　本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、非増殖性ながら野生型ファージと同じ感染様式を持ち、長鎖ＤＮＡを標的細菌にデリバリーすることができる。このため、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、搭載ＤＮＡの性質により、殺菌活性を含む様々な生物学的の機能を付与できるため、新しいモダリティを創出することができる。すなわち、Ｂ－ＣＡＰは、高い殺菌力を持つファージ製剤の構築を可能にする。

　本実施形態で合成したＢ－ＣＡＰは、外来性ＤＮＡの搭載と標的菌体内へのＤＮＡ注入が可能である。また注入されたＤＮＡは、標的細菌内での増幅を含め、自身のＤＮＡに由来する生物学的活性を発揮できる。
　また、カプシミドを利用したファージゲノム分割法により、菌体内で維持できるＢ－ＣＡＰのＤＮＡ配列の長さを、従来のファージの約半分まで減らすことが可能となる。このため、Ｂ－ＣＡＰは長鎖ＤＮＡのクローニングベクターとしても機能し、毒性の強い長鎖遺伝子の維持、短時間での大量合成を可能にする。すなわち、Ｂ－ＣＡＰに外来の長鎖ＤＮＡを搭載することが可能となる。実際に、後述の実施例では、Ｂ－ＣＡＰにおいて黄色ブドウ球菌由来の１８ｋｂの長鎖ＤＮＡを搭載することに成功している。
　すなわち、Ｂ－ＣＡＰにより、殺菌効果等に加え、新たな生物学的機能を付与するのにも利用可能である。

　ここで、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、非増殖性であっても、殺菌活性が強い殺菌物質を作り出す殺菌遺伝子を搭載することで、その産物が分泌されて周囲の細菌群を殺菌できるため、「増殖しないため抗菌活性が弱い」という非増殖性ファージのデメリットを補完できる。
　たとえば、Ｂ－ＣＡＰに、外来遺伝子として周囲の菌を殺菌する分泌性の殺菌産物を生成する殺菌遺伝子を搭載することで、非増殖性にも関わらず宿主細菌の周囲の細菌も殺菌できる抗菌力プシド（ＮＭ－ＡＢＣａｐｓｉｄ）を構築することができる。

　実際に、後述する実施例にて、ＮＭ－ＡＢＣａｐｓｉｄであるＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、標的細菌の菌体内で、分泌性の殺菌タンパク質であるバクテリオシン（ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅ１）を合成し、非常に強い集団殺菌効果を示した。すなわち、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、標的細菌の周囲の細菌群も殺菌し、菌数と同数の投与でも十分な殺菌効果を発揮した。具体的には、実施例によれば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌効果は、単体のＢ－ＣＡＰの１０００倍であった。
　さらに、マウスの感染実験において、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は顕著な抗菌治療効果を示した。具体的には、Ｂ－ＣＡＰ＿Ｃｏｌ　Ｅ１は、マウス感染モデルで示した臨床で非常に重要な耐性菌であるカルバペネム耐性大腸菌感染を治療でき、致死性の感染マウスを生存させることができた。すなわち、後述の実施例では、マウスに対してカルバペネム耐性大腸菌を腹腔投与し、当菌に感染されたマウスに対しても著しい生存効果を示した。
　すなわち、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、非増殖性ながら高い殺菌力を持つファージ製剤の構築を可能にすることができる。

　また、バクテリオシンの強い抗菌活性は細菌感染症治療への応用が期待されているものの、治療に用いるにはバクテリオシンを大量に合成、精製する必要性があった。また、バクテリオシンは濃度依存的な殺菌を示すため、感染局所で濃度が維持される必要があった。そのためバクテリオシンを利用した抗菌薬創生において、バクテリオシンの大量合成方法の確立と感染巣へのバクテリオシンの効果的なデリバリーシステムの構築は重要な課題であった。
　これに対して、本実施形態に係るＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、安全な非増殖性のファージにバクテリオシンを搭載しつつ、標的細菌の殺菌を抑える抵抗因子であるｉｍｍｕｎｅ　ｇｅｎｅにより、感染局所で濃度が維持される程度、バクテリオシンを分泌することができる。これにより、カプシドによる抗菌治療効果を著しく上げることができる。

　なお、上述の実施形態においては、Ｂ－ＣＡＰを作製する際に、カプシド核酸エレメン卜（カプシミド）のＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ領域をＢＡＣに搭載する例について記載した。
　しかしながら、カプシド核酸エレメン卜を、細菌のゲノムやプラスミドに搭載することも可能である。この際、一般的なプラスミドはコピー数が多く、宿主にとってｔｏｘｉｃな遺伝子を多く持つファージの遺伝子や長鎖遺伝子を維持することは困難である。このため、コピー数が少ないプラスミドを用い、ｔｏｘｉｃなファージの遺伝子を誘導性にし、長鎖ＤＮＡを複数のプラスミドに分割挿入する等により安定維持することが可能となる。

　また、Ｂ－ＣＡＰからは、非必須遺伝子を削除したり、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ側に一部の必須遺伝子を移したりすることも可能である。これにより、より長鎖ＤＮＡを搭載することも可能である。
　さらに、ゲノム上に溶原化しているファージのＢ－ＣＡＰを作製する場合、溶原化に必要な領域を削除することも可能である。この場合、Ｂ－ＣＡＰに載せる必要のない領域（Ｖｉｒｉｏｎ等）を染色体上に残し、Ｂ－ＣＡＰに必要な領域（核酸の複製に必要な複製領域、及びパッケージング領域）等のみをＢ－ＣＡＰとして構築することも可能である。
　また、Ｂ－ＣＡＰには、核酸の複製に必要な複製領域として、ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ領域、及びパッケージング領域以外の領域のうち、必要最小限の領域を保持することも可能である。

　また、上述の実施形態では、Ｂ－ＣＡＰを形成する際に、ファージのゲノムを直接分割したものの、それ以外の配列を用いることも可能である。
　たとえば、Ｂ－ＣＡＰの構築の際に、細菌のゲノムに含まれるＰＩＣＩ（Ｐｈａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｉｓｌａｎｄ）と名付けられている、通常２０ｋｂ程度の領域の配列を用いてもよい。このＰＩＣＩは、黄色ブドウ球菌の場合は、ＳａＰＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｉｓｌａｎｄｓ）とも呼ばれている。

　ＰＩＣＩ又はＳａＰＩは、細菌のゲノムに入り込むことができる溶原化ファージと類似しているが、基本的にファージのビリオン構成遺伝子を持たない。このため、溶原化ファージの半分ほどのゲノム長となる。ＰＩＣＩはコンパクトな構造にも関わらず、ファージ感染時にゲノムから誘発、複製され、ファージのカプシド内にゲノムをパッケージングさせることが可能である。このパッケージングにはＰＩＣＩ由来のパッケージング配列が必要で、この領域をプラスミドに搭載すると、溶原ファージの中にそのプラスミドを挿入できる。また、ファージのカプシドに入り込んだＰＩＣＩは、ファージ同様に他の細菌にトランスダクションされることが知られ、ＰＩＣＩはファージを介して伝播されていくため、Ｂ－ＣＡＰに用いることが可能である。
　さらに、ファージのＤＮＡとこのＰＩＣＩ又はＳａＰＩのＤＮＡとを同時に用いるような構成も可能である。

　さらに、上述の実施形態においては、Ｔ７ファージを基に、Ｂ－ＣＡＰを作製したものの、Ｔ７以外のファージ、他の細菌でも構築可能である。
　たとえば～１７０ｋｂ程度あるモデルファージのＴ４ファージや、その他ジャンボファージを利用することで、より長いＤＮＡを搭載することが可能になる。
　さらに、本発明者らは、大腸菌ファージＴ７をグラム陰性菌の事例として、また黄色ブドウ球菌のＴａｎ２ファージをグラム陽性菌の事例として、それぞれのＢ－ＣＡＰの作製を行っている。すなわち、Ｂ－ＣＡＰを利用したファージ製剤は幅広い細菌種に適用できる。

　また、上述の実施形態においては、Ｂ－ＣＡＰ用に一般的なバクテリオファージを用いる例について説明した。しかしながら、一般的なバクテリオファージとは異なる、細菌に感染するウイルス（Virus）、ＲＮＡウイルス、ファージミド等をＢ－ＣＡＰとして用いることも可能である。また、Ｂ－ＣＡＰは、プロファージの状態で細菌のゲノムやプラスミドにインテグレートされた状態で提供されてもよい。また、ファージミドは、例えば、本実施形態の細菌判別方法では、エレクトロポレーション及びナノ粒子を用いたような任意の手法を介して細胞に導入することが可能である。

　上述の実施形態においては、外来遺伝子として、殺菌遺伝子、バイオフィルム分解遺伝子、抗原提示用遺伝子、及び導入用遺伝子を用いる例について説明した。
　しかしながら、外来遺伝子は、任意の遺伝子を対象とすることが可能である。さらに、外来遺伝子は、薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子に付随して発現したり、発現制御されたり、関連したりするような遺伝子を含んでいてもよい。これに加え、外来遺伝子は、その他の病原性に関係がある病原遺伝子及びこれを抑える遺伝子を含んでいてもよい。

　さらに、本実施形態の外来遺伝子は、がん治療や遺伝性疾患の標的となる遺伝子変異の配列、一塩基置換、リピート等の広義の「遺伝子」であってもよい。この場合、細菌自体を、薬剤の運び手（キャリアー）として治療用に投与することも可能である。すなわち、この外来遺伝子の細胞に対応した薬剤を、対象の細菌の細胞質等に含ませておき、溶菌により組織や標的細胞周辺に散布するといった用途にも適用可能である。この場合、プロファージが含まれる細菌自体を提供することも可能である。また、特定の免疫反応により活性化されるようなプロファージを含んでもよい。

　また、上述の実施形態においては、Ｂ－ＣＡＰを感染症治療の治療用組成物として用いる例について記載した。
　しかしながら、この治療には、感染症治療そのものだけでなく、細菌叢の改変や、糞便移植の前処理等にも使用できる。具体的には、外来遺伝子として抗原提示用遺伝子を用いて、細菌叢内の治療上必要となる菌に対する免疫を誘発することも可能である。

　さらに、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）がファージの食品添加を認めているように、Ｂ－ＣＡＰを食品の除菌や腐敗予防にも使用可能である。

　また、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰは、他の組成物等と併用することも可能である。さらに、複数の種類のＢ－ＣＡＰを含む「カクテル」として提供することも可能である。また、本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。

　以下で、本発明の実施形態に係るＢ－ＣＡＰの構築（製造）、殺菌（細菌除去）、動物治療方法について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。

〔手法〕
（菌株と培養条件）
　本実施例で使用した菌株を下記の表１に示す。菌株はＬＢ培地（ＢＤ　Ｄｉｆｃｏ社製）で、３７℃にて増殖させた。特に明記されていない限り、適切な抗生物質を次の最終濃度で増殖培地に添加した。アンピシリン（Ａｍｐ）の場合は１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｋｍ）の場合は３０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール（Ｃｍ）の場合は３４μｇ／ｍｌであった。

　このうち、ＭＣ１０６１、ＵＳＡ３００は、Ｌｕｃｉｇｅｎ社製のものを用いた。ＨＳＴ０８は、タカラバイオ社製を用いた。ＥＳＢＬ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　β－Ｌａｃｔａｍａｓｅ）大腸菌であるＥｃ３２０、Ｅｃ３５３は、Ｚｅｎｚｏ　Ｎａｇａｓａｗａ博士から入手した。

（使用したＤＮＡ）
　本実施例で使用したＤＮＡとして、プラスミドベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）等のＤＮＡを下記の表２に示す。

（使用したプライマー）
　本実施例で使用したプライマーを、下記の表３及び配列表に示す。

（ヘルパーＢ－ＣＡＰのコンストラクト）　
　Ｔ７ファージのＤＮＡから、ｇｐ６．５からｇｐ１２までの領域（８．７ｋｂ）、ｇｐ１３からｇｐ１７までの領域（９．１ｋｂ）をそれぞれＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で２ステップ法にて増幅した。さらにｐＳＭＡＲＴ　ＢＡＣ　ｖ２．０　（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）のｒｒｎＢＴ１　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒからＴＴｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒまでの領域（７．５ｋｂ）も、同様に増幅した。増幅したＰＣＲ断片はＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にてＧｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを行い、濃度を測定した。それぞれの断片を約１００ｎｇと、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１０μｌでトータル２０μｌにし、５０℃１時間で結合させた。次にＭＣ１０６１大腸菌のエレクトロコンピテントセルの準備を行った。まず対数増殖期にあるＯＤ₆₀₀＝０．５のＭＣ１０６１大腸菌１００ｍｌを氷上で２０分間静置し、その後氷冷１０％グリセロールで３回、洗った。最終的に２００～４００μｌの１０％グリセロールで懸濁した。エレクトロコンピテントセル５０μｌに対し５μｌのＤＮＡを加え、氷冷１ｍｍキュベット内に移し、ＥＬＥＰＯ２１により、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は、Ｐｏｒｉｎｇ　Ｐｕｌｓｅ　電圧：１，５００Ｖ、パルス幅：２．５ｍ秒、パルス間隔：５０ｍ秒、回数：１回、極性：＋、Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐｕｌｓｅ　電圧：１５０Ｖ、パルス幅：５０ｍ秒、パルス間隔：５０ｍ秒、回数：５回、極性：＋／－である。その後、エレクトロポレーションした大腸菌を１ｍｌのＳＯＣ培地に入れて３０分間３７℃でインキュベートし、５０μｌをクロラムフェニコール入りのＬＢプレートに播いた。８個のコロニーを取得し、Ｂ－ＣＡＰの合成効率が良い菌株をＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰを保有する大腸菌（以下、「ＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）」株という。）とした。さらに、ＣｏｌＥ１耐性のあるＭＣ１０６１Ｒ株についても、ｐＫＬＣ１７２で同様にエレクトロポレーションして「ＭＣ１０６１Ｒ（ｐＫＬＣ１７２）」株を形成した。これらの株に含まれるｐＫＬＣ１７２は、ＰＣＲ法とディープシーケンシングによって確認した。また、このＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）株又はＭＣ１０６１Ｒ（ｐＫＬＣ１７２）株は、後述する各試験にて使用する調製細菌の例である。すなわち、ＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）株又はＭＣ１０６１Ｒ（ｐＫＬＣ１７２）株は、Ｂ－ＣＡＰ又はＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１を増殖させ製造するための「Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　Ｓｔｒａｉｎ（増殖用株）」として用いた。

　黄色ブドウ球菌用のＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰは、２つのプラスミドに分けて作製した。黄色ブドウ球菌の溶原化ファージのテイル部分をテトラサイクリン誘導性にしたプラスミドをｐＬＣ－ｔａｉｌＴａｎ２として、ヘッド部分をカドミウム誘導性にしたプラスミドをｐＮＬ－ｈｅａｄＴａｎ２として構築した。それぞれの薬剤耐性は、クロラムフェニコールとエリスロマイシンを用いた。
　ＰＣＲに利用したプライマー配列は、上述の表３及び配列表に記載した。

（Ｂ－ＣＡＰの生成）
　大腸菌用のＢ－ＣＡＰでは、Ｔ７ファージのＤＮＡから、ｇｐ１７．５からｇｐ１までの領域（６．８ｋｂ）、ｇｐ１からｇｐ２．８までの領域（６．９ｋｂ）、ｇｐ３からｇｐ６．３までの領域（８．２ｋｂ）をそれぞれＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で２ステップ法にて増幅した。増幅したＰＣＲ断片はＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）にてゲル抽出を行い、濃度を測定した。それぞれの断片を約１００ｎｇと、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１０μｌでトータル２０μｌにし、５０℃４時間でアセンブリした。Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰを保有するＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）株を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養し、ＯＤ₆₀₀＝０．５となった時点で大腸菌を冷却し、氷冷１０％グリセロールで３回、洗浄した。振盪時の５００倍ほどに濃縮されるように氷冷１０％グリセロールで懸濁し、エレクトロコンピテントセルとした。エレクトロコンピテントセル５０μｌに対して、５μｌの作製したＢ－ＣＡＰ反応液を加え、氷冷した１ｍｍキュベットに混合液を移した。Ｂ－ＣＡＰ作製と同じ条件でエレクトロポレーションを行い、１ｍｌのＳＯＣ培地に入れて３０分間３７℃でインキュベートした。その後、培養産物全量と３ｍｌのＬＴＡ（１ｍＭ　ＣａＣｌ₂を含んだＬＢ０．５％アガロース、５６℃）を混ぜてＬＢプレート上に重層した。ＬＢプレートを１０分ほど乾燥させた後、３７℃のインキュベーターで８時間ほどが経過すると、Ｂ－ＣＡＰのプラークが現れた。作製したＢ－ＣＡＰは、ＰＣＲ法とディープシーケンシングによって確認した。
　黄色ブドウ球菌のＢ－ＣＡＰは、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡを保有するＲＮＡ４２２０株に、Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡを、エレクトロポレーションを行うことで構築した。エリスロマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ₂（２．５μＭ）、ＡＴｃ（１μｇ／ｍｌ）を添加した４ｍｌ　ＴＳＡトップ寒天培地に１５０μｌのオーバーナイト培養物を添加し、混合後、ＴＳＡプレート上に流した。このプレートを３７℃のインキュベーターで一晩培養した。
　ＰＣＲに使用したプライマー配列は、上述の表３及び配列表に記載している。

（外来遺伝子を搭載するＢ－ＣＡＰの生成）
　まず、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰとＢ－ＣＡＰのＤＮＡを準備した。外来遺伝子をＢ－ＣＡＰに挿入するため、Ｂ－ＣＡＰをＰＣＲで３断片化したものと、外来遺伝子をＰＣＲで増幅したものを作製した。外来遺伝子として黄色ブドウ球菌とＣｏｌＥ１のＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲのテンプレートは、黄色ブドウ球菌のゲノムＤＮＡ、ｐＫＬＣ１８７である。それぞれの断片の末端に、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒでアセンブリできるように相同配列を付加した。その相同配列により４つの遺伝子断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒによりアセンブリした。アセンブリしたＤＮＡとＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰを大腸菌のコンピテントセルであるＨＳＴ０８（ＴａＫａＲａ社製）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの条件は上述のものと同様であった。エレクトロポレーションした産物を全量１ｍｌのＳＯＣ培地に移し、３０分間３７℃で振盪培養した。Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰを保有する大腸菌であるＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）を一晩培養したものを１ｍｌ加え、１ｍＭ　ＣａＣｌ₂を含む８ｍｌのＬＢ培地を加えた。３０分間３７℃でインキュベートし、約１０ｍｌの培養液から１ｍｌをとり、３ｍｌのＬＴＡ（１ｍＭ　ＣａＣｌ₂を含むＬＢ０．５％アガロース、５６℃）と混ぜて、クロラムフェニコール入りのＬＢプレート上に重層した。プレートを１０分ほど乾燥させた後、３７℃のインキュベーターで培養した。
　ＰＣＲに利用したプライマー配列は、上述の表３及び配列表に記載している。

（黄色ブドウ球菌及びＣｏｌＥ１配列の準備）
　黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）とＣｏｌＥ１のＤＮＡ配列を、Ｂ－ＣＡＰに搭載するために準備した。２０ｍＬ　３７℃で一晩振盪し、遠心してペレットを１ｍＬ　ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。そこに１０μｌ　ｏｆ　Ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　（５０Ｕ／μｌ）、５μｌ　ｏｆ　Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）ａｎｄ　１μｌ　ｏｆ　ＲＮａｓｅを加え、３７℃で２時間培養し、１６５μｌの１０％　ＳＤＳと１２．５μｌのプロテイナーゼＫを加えた。５７℃で２時間培養し、１．２ｍｌのＴＥ飽和フェノールを加え良く混合した。１２０００×ｇで１０分間遠心後、上清を新しいチューブに移した。サンプルと同量のクロロホルム　イソアミルアルコール（２５：１）を加えて混合し、再び１２０００×ｇで１０分間遠心した。上清に２．５倍量エタノール、１／１０　３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、－２０℃で冷却した後に遠心し、最後に７０％エタノールで洗浄し、黄色ブドウ球菌のＤＮＡサンプルとした。ＣｏｌＥ１遺伝子配列はＣｏｌＥ１　ＤＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）から、ＣｏｌＥ１の遺伝子カセット（ｉｍｍｕｎｅ　ｇｅｎｅ（免疫遺伝子）、ｒｅｌｅａｓｅ　ｇｅｎｅ（分泌遺伝子）を含む）をＰＣＲで増幅し、アラビノース誘導性の発現ベクターである非特許文献２に記載のｐＫＬＣ２３にクローニングし、ｐＫＬＣ１４６と名付けた。ｐＫＬＣ１４６は、アラビノース誘導性プロモーターのすぐ下流にＣｏｌＥ１がくるように、その後、ｉｍｍｕｎｅ　ｇｅｎｅ、ｒｅｌｅａｓｅ　ｇｅｎｅが並ぶように設計してある。

　ｐＫＬＣ１４６プラスミドを大腸菌ＭＣ１０６１株にトランスフォーメーションし、０．２％　Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅを含むＬＢ培地で１２時間培養後、上清を採取した。５，０００×ｇで１０分間遠心後、上清を０．２２μＭのフィルターで濾過した。この濾液をＭＣ１０６１に加え、細菌の増殖が強く抑制された。つまりＣｏｌＥ１がｐＫＬＣ１４６から合成されていることを確認した。その後、Ｂ－ＣＡＰへのＣｏｌＥ１搭載を容易にするため、ｐＫＬＣ１４６にＴ７ファージの配列を一部挿入したプラスミドを作製し、ｐＫＬＣ１８７と名付けた。
　ＰＣＲに利用したプライマー配列は上述の表３及び配列表に記載している。

（Ｔ７ファージ耐性大腸菌の調製）
　一晩、培養した大腸菌ＭＣ１０６１株２００μｌと３ｍｌのＬＴＡ（１ｍＭ　ＣａＣｌ₂を含むＬＢ０．５％アガロース、５６℃）とを混合し、ＬＢプレート上に重層した。１０分程度乾燥してａｇａｒｏｓｅが固まった後、ＬＴＡの上から５μｌのＴ７ファージ溶液（１０⁸ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）／ｍｌ）を滴下した。３７℃で２０時間培養後、現れたコロニーを取得し、新しいＬＢプレート上に塗り広げた。出てきたコロニーをもう一度新しいＬＢプレートに塗り広げ、出てきたコロニーをＬＢ培地で培養した。このコロニーがＴ７ファージに対して耐性であることを、ＬＴＡアガーを利用した実験で確認し、保存した。

（ファージ及びＢ－ＣＡＰのＴＥＭイメージング）
　濃縮されたファージ懸濁液をまずコロジオンコートされた４００メッシュの銅グリッド（日新ＥＭ株式会社、日本）に１滴落とし、ファージを１０分間吸着させた。その後，残留液をろ紙で除去し，１％酢酸ウラニル（ネガティブ染色液）を銅グリッドに滴下した。メッシュグリッドを約５秒間完全に濡らしてからブロッティングで乾燥させた。染色後，８０ｋＶの透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）であるＨＴ７７００（日立社製）で観察した。ファージの透過型電子顕微鏡写真を８Ｍピクセルのメインデジタルカメラで撮影した。

（ファージ及びＢ－ＣＡＰからのＤＮＡ抽出）
　対数増殖した宿主細胞に０．１～０．０１のＭＯＩで目的のファージ及びＢ－ＣＡＰを加え、３７℃で溶液の濁度が薄くなるまで培養した。その後、上清を５，０００ｇで１０分間遠心分離し、この上清を新しいチューブに回収した。最終濃度の１０μｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と１０μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え、３７℃で１時間攪拌し、等量のＰＥＧ溶液（１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）を徐々に加えた。４℃で一晩インキュベートした後、１５０００ｇ、３０分、４℃で遠心分離を行い、沈殿したファージを回収した。ファージペレットをＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁し、１／１００量の１Ｍ　ＥＤＴＡと１／１００量の１０％ＳＤＳをファージ懸濁液に加え，６８℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）を加え、溶液をよく混合した。遠心分離した後、水相を新しいチューブに移し、等量のクロロホルム：イソアミルアルコールを２４：１（ｖ／ｖ）の割合で加え、再びよく混合した。遠心後、ファージＤＮＡを含む水相を新しいチューブに移し、２．５倍量のエタノールを加えた。－２０℃で１時間インキュベートした後、４℃で１２，０００ｇ、１０分間の遠心を行った。ペレット化したＤＮＡを１ｍｌの７０％エタノールで２度洗浄し、取得されたＤＮＡを軽く乾燥させ、適量のＴＥバッファーに再懸濁した。

（プレートによる細菌増殖抑制試験）
　一晩培養した細菌１００μｌと、３ｍｌのＬＢソフトアガー（ＬＢ、０．５％　ａｇａｒｏｓｅ、１ｍＭ　ＣａＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ₂、５６℃）と混合し、丸型のＬＢプレートに素早く流し込んだ。角形のプレートの場合は、流し込む容量を２倍にした。室温で５分間放置した後，Ｂ－ＣＡＰもしくはファージを、細菌細胞を含む上部寒天に２μｌずつ直接スポットし，プレートを３７℃で培養した。約６時間のインキュベーション後、プラークの形成を観察し、写真を撮影した。

（培養液による細菌増殖抑制試験）
　ＭＣ１０６１株、又はＣｏｌＥ１耐性のあるＭＣ１０６１Ｒ株をＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で１２時間インキュベートした。プレート上のコロニーを含むＬＢ培地に移し、３７℃で８時間培養した。菌が十分に増殖したことを確認した後、各培養液をＬＢ培地で１００倍に希釈し、激しく振とう（４００ｒｐｍ）しながら３７℃で４時間培養した。ＯＤ（６５０ｎｍ）が約０．５に達したとき、ＬＢ培地で再びＯＤ₆₀₀＝０．２５に合わせ、培養を開始した。培養２時間後、増殖中の大腸菌液にＢ－ＣＡＰ／Ｂ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）を約ＭＯＩ＝０．００１、０．０１、０．１、１（１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹ＰＦＵ／ｍｌ）となるように加え、再び２４時間振盪培養を続けた。その間、１時間毎に細菌の濁度を測定した。

（ファージのタイターの測定）
　Ｔ７ファージ及びＢ－ＣＡＰを１０^-4から１０^-7の範囲で、ＳＭバッファーにて１０倍ずつ希釈して使用した。一方、ＬＢ培養液で１：１００に希釈した大腸菌ＭＣ１０６１株及びＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）株の一晩培養液を、３７℃でＯＤ₆₀₀が約０．５になるまで撹拌しながら培養した。その後、１００μｌの菌体懸濁液にＴ７ファージ／Ｂ－ＣＡＰの各希釈液を１０μｌずつ加え、３７℃で２０分間培養した。その後、培養液の全量を１ｍＭ　ＣａＣｌ₂を含む０．５％ＬＴＡと混合し、ＬＢプレートの表面に流し込んだ。その後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プレート上のプラークの数をカウントし、ファージのタイター（力価）として、ＰＦＵ／ｍＬを算出した。

（抽出ＤＮＡの全ゲノムシーケンシング）
　次世代シーケンサーにより、抽出されたＤＮＡの配列の読み取り（シーケンシング）を行った。まず、各ゲノムＤＮＡをランダムにせん断して短い断片にし、得られたフラグメントは末端を修復し、Ａ－ｔａｉｌを付け、さらにイルミナアダプターとライゲーションした。アダプターの付いた断片はＰＣＲで増幅し、サイズを選択して精製した。ライブラリーはＱｕｂｉｔとリアルタイムＰＣＲで定量し、バイオアナライザーでサイズ分布を検出した。Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて，プラスミドからペアエンドシーケンシングライブラリを構築した。シークエンシングは、ＭｉＳｅｑ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（２×３０１ｂｐ）で行った。リード数はそれぞれ、Ｂ－ＣＡＰでは７０５９４９６、８２７７７８６、Ｂ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）では８００００４４、８６９１７３８、ｐＫＬＣ１７２では８８１４７３４、８１７３９０８であった。リード配列をトリミングし、ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてコンティグにｄｏ　ｎｏｖｏでアセンブルした。ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いてシーケンスエラーやＤＮＡの循環を評価し、ＲＡＳＴ　ｖｅｒ．２．０３８を用いて得られたゲノムのアノテーションを行った。

（マウス生存試験）
　大腸菌感染症の治療に対するＢ－ＣＡＰ／Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の効果を評価するために、７週齢のＢａｌｂ／ｃ（Ｃｌｅａ、Ｊａｐａｎ社製）を生存試験に使用した。マウスは、アッセイを開始する前に、１週間飼育して実験室の環境に慣らした。まず、カルバペネム耐性大腸菌の一晩培養液を新鮮なＬＢ培地で１：１０００に希釈し、さらに３７℃で撹拌しながら培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．５になるまで培養した。その後、菌体をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで約１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｍＬの密度に調整した。Ｂ－ＣＡＰ、Ｂ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）、Ｔ７ファージはＰＥＧ沈殿後、ＳＭバッファーで溶かし、ＰＢＳで透析を１日行った。それぞれのタイター（力価）はＭＣ１０６１又はＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）を利用して測定した。
　マウスに麻酔をかけた後、各群６匹のマウスを選び、２００μｌの細菌懸濁液（２×１０⁹ＣＦＵ／マウス）を腹腔内に直接注入した。再度麻酔をかけ、１時間半後に、Ｂ－ＣＡＰ、Ｂ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）、Ｔ７ファージを含むＰＢＳ、又はＰＢＳのみを２００μｌ、菌液が注入された同じ部位に注入した。マウスの後背部の皮下に塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノール　混合麻酔薬を２００μｌ注射し、その後アチパメゾールで麻酔から覚醒させ、最長で５日間生存を観察した。感染後４８時間及び７２時間の時点で各治療群の累積死亡率とその時点での体重を記録した。そして、独立した３つの実験のデータからＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を作成し、ソフトウェアＰｒｉｓｍ　８を用いてｌｏｇ－ｒａｎｋテストで分析した。

〔結果〕
（ファージゲノム分割法によるＢ－ＣＡＰの構築）
　図３及び図４により、Ｂ－ＣＡＰの構築（合成、製造）について説明する。
　図３（ａ）は、溶菌ファージのモデルであるＴ７ファージのＤＮＡを抽出し、次世代シーケンサーにより配列を読み、ＲＡＳＴ　ｖｅｒ２．０を利用してアノテーションを行った結果を示す。このＴ７ファージの配列長は３９９５６ｂｐであった。

　本実施例では、Ｂ－ＣＡＰの合成用に、Ｔ７ファージのゲノムをＢ－ＣＡＰ用エレメントであるＢ－ＣＡＰ　ＤＮＡと、カプシド核酸エレメン卜（カプシミド）であるＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡとに２分割した。分割したＤＮＡは、それぞれアセンブリを行った。
　このうち、Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡは、Ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ（Ｈｏｓｔ－ｖｉｒｕｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎとＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ｌｙｓｉｓとｐａｃｋａｇｉｎｇを担う領域が含まれるように設計した。
　Ｂ－ＣＡＰを構築するためのＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡはＶｉｒｉｏｎ構成領域が含まれるように設計した。このＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡは菌体内で安定的に維持するためにＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）にクローニングし、ｐＫＬＣ１７２を作製した。

　図３（ｂ）は、本実施例のＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰとして、Ｖｉｒｉｏｎ構造遺伝子領域をＢＡＣにクローニングし、ｐＫＬＣ１７２を作製した例を示す。このｐＫＬＣ１７２はＢＡＣのｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍとＴ７ファージのＶｉｒｉｏｎ構成遺伝子全てを結合させたものである。ｐＫＬＣ１７２は次世代シーケンサーにより配列を読み、２５２８９ｂｐであることを確認した。さらに、ＲＡＳＴ　ｖｅｒ２．０を利用してアノテーションを行った。

　次に、図４により、作製されたＢ－ＣＡＰの配列構造について説明する。
　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡをＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡを保有する大腸菌ＨＳＴ０８株にエレクトロポレーションすると、Ｂ－ＣＡＰのプラークができ、そのプラークを単離後、Ｂ－ＣＡＰが構築されているかを調べた。具体的には、Ｔ７ファージとＢ－ＣＡＰのゲノムＤＮＡを抽出し、次世代シーケンサーにより配列を読みとり、ＲＡＳＴ　ｖｅｒ２．０でアノテーションを行った。
　全ゲノム配列を調べた結果、Ｂ－ＣＡＰは２２１３２ｂｐであり、Ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅ、ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｌｙｓｉｓ、Ｐａｃｋａｇｉｎｇ領域は保持していたが、Ｖｉｒｉｏｎ遺伝子は欠損していた。

　図５により、精製したＴ７ファージ及びＢ－ＣＡＰのＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法でＢ－ＣＡＰ構築の確認を行った結果について説明する。
　図５（ａ）は、Ｔ７ファージ及びＢ－ＣＡＰの確認用のプライマーの構成を示す。具体的には、上述の表３の「Ｂ－ＣＡＰ　ｄｅｔ１　２７４ｂｐ－ｆ」～「Ｔ７　ｃｈｅｃｋ　ｄｅｔ５－ｍｉｎｉ３（ｄｅｔ６）　７００９ｂｐ　ｍｉｎｉ５２２１ｂｐ－ｒ，　　　ｄｅｔ６　ａｓ　２３，０２７ｂｐ」の各プライマーセットでＰＣＲを行った。
　図５（ｂ）は、０．５％のアガロースゲルで電気泳動を行った結果を示す。これにより、Ｂ－ＣＡＰのゲノムＤＮＡサイズが約２２ｋｂまで短くなっていることを確認した。Ｔ７ファージにおけるＶｉｒｉｏｎ、ｌｙｓｉｓ、ｐａｃｋａｇｉｎｇ領域のＰＣＲ（ＰＣＲ３）のフラグメントの長さは２３．０ｋｂとなり、Ｂ－ＣＡＰにおける相当領域のフラグメントの長さは５．２ｋｂとなっていることも確認した。

　次に、Ｔ７ファージとＢ－ＣＡＰとを精製して、ネガティブ染色を行い、電子顕微鏡で撮影した。
　図６に、撮影された電子顕微鏡写真を示す。図６（ａ）はＴ７ファージ、図６（ｂ）はＢ－ＣＡＰの写真である。
　結果として、Ｂ－ＣＡＰはＴ７ファージの形状とほぼ同じであることが確認された。

　次に、構築したＢ－ＣＡＰの殺菌活性について測定した。具体的には、Ｔ７ファージ及びＢ－ＣＡＰの希釈系列を作製し、ソフトアガープレート上で培養した大腸菌ＭＣ１０６１及びＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）に滴下した。３７℃で６時間培養した後に、プレートの写真を撮った。全てのアッセイは、３回ずつ行われた。
　図７に、撮影された写真を示す。Ｂ－ＣＡＰを大腸菌ＭＣ１０６１株に感染させたところ、２×１０⁵以上をＭＣ１０６１のＢａｃｔｅｒｉａｌ　ｌａｗｎ（菌叢）にスポットした場合のみ、ファージプラークのない殺菌斑（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ　ｓｐｏｔｓ）を確認した。Ｂ－ＣＡＰはＴ７ファージ由来のエンドライシンやｔｏｘｉｃな遺伝子が含まれるため、ファージとは異なる殺菌斑が形成されたと考えられる。
　その一方で、Ｂ－ＣＡＰが持たないファージのゲノム領域をＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ（ｐＫＬＣ１７２）で補完した大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）株では、Ｂ－ＣＡＰの増殖性が回復したため、より少ないＢ－ＣＡＰ濃度でも殺菌斑が生じた。しかし、Ｂ－ＣＡＰによるプラークサイズは、完全なＴ７ファージのものよりは小さかった。

　本実施例では、さらに黄色ブドウ球菌由来のＢ－ＣＡＰの合成を行った。
　ここでは、この黄色ブドウ球菌のＴａｎ２ファージのゲノムをＢ－ＣＡＰ　ＤＮＡとＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡに分割した。具体的には、溶原化した黄色ブドウ球菌のＴａｎ２ファージにおいて、構造遺伝子を欠損させた。さらに、構造遺伝子を発現するＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドを構築し、構造遺伝子欠損Ｔａｎ２ファージが溶原化した黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０に形質転換した。このＢ－ＣＡＰ合成菌にマイトマイシンＣを添加し、Ｔａｎ２ファージを誘導することでＢ－ＣＡＰを組み上げた。

　図８にこの黄色ブドウ球菌のＴａｎ２ファージからのＢ－ＣＡＰ構築の例を示す。
　図８（ａ）は、Ｔａｎ２ファージの遺伝子構造と、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰにクローニングした領域の概念を示す。このＴａｎ２ファージでは、構造遺伝子であるｍｉｎｏｒ　ｃａｐｓｉｄからｔａｉｌ　ｆｉｂｅｒまでの２０１４０ｂｐをクローニングし、ｐＬＣ１プラスミドに挿入することで、Ｔａｎ２ファージ用Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドを構築した。

　図８（ｂ）は、このＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドを用いたＢ－ＣＡＰの構築の例を示す。ここでは、まず、Ｔａｎ２ファージが溶原化した黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株を作製した。そして、その菌からファージの構造遺伝子を欠損させた、「Ｔａｎ２　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｓ」の菌を作製した。この上で、構造遺伝子を欠損させたＴａｎ２ファージを保有するＲＮ４２２０にＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドを形質転換して、Ｔａｎ２ベースのＢ－ＣＡＰを合成する黄色ブドウ球菌株（「Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　ＲＮ４２２０：：Ｔａｎ２　（ｐＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ）」と名付けた。）を構築した。このＢ－ＣＡＰ合成菌にマイトマイシンＣを添加して、Ｔａｎ２ファージを誘導することで、Ｂ－ＣＡＰを組み上げた。

　図８（ｃ）は、作製した野生型Ｔａｎ２ファージとＢ－ＣＡＰの連続１０倍希釈液をＲＮ４２２０、又はＨｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドを保有するＲＮ４２２０（以下、「ＲＮ４２２０（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ）」という。）を含む寒天培地上にスポットし、一晩培養した後、溶菌斑を観察した。ＲＮ４２２０（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰ）でのみ溶菌斑が観察されたことから、Ｂ－ＣＡＰ構築に成功していることが示された。

（Ｂ－ＣＡＰへの長鎖ＤＮＡの搭載）
　Ｂ－ＣＡＰはファージの感染システムを利用して、標的細菌にＤＮＡを注入できる。そこで、本発明者らは、Ｂ－ＣＡＰにどの程度の長さのＤＮＡまでが搭載可能かを調べることにした。具体的には、Ｂ－ＣＡＰゲノムをＰＣＲで３つの断片にし、黄色ブドウ球菌由来のＤＮＡ配列を挿入することにした。

　図９により、Ｂ－ＣＡＰへの長鎖ＤＮＡの搭載の試験について説明する。ここでは、Ｂ－ＣＡＰに黄色ブドウ球菌の染色体由来の長鎖ＤＮＡ断片を挿入し、Ｂ－ＣＡＰ（Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ）を得た。具体的には、黄色ブドウ球菌由来のＤＮＡ断片は、それぞれ約１７、１８、１９、２０ｋｂを準備し、Ｔ７ファージのｌａｔｅ　ｇｅｎｅであるｇｐ１９の下流の領域に挿入されるようにＢ－ＣＡＰのＤＮＡにアセンブリした。本実施例では、Ｂ－ＣＡＰ　ＤＮＡをＰＣＲで３断片に増幅し、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂの黄色ブドウ球菌由来のＤＮＡ断片と結合させて環状化した。これらアセンブリした黄色ブドウ球菌由来の配列を含むＢ－ＣＡＰの環状ＤＮＡを、Ｈｅｌｐｅｒ　Ｂ－ＣＡＰプラスミドであるｐＫＬＣ１７２と共に、大腸菌ＨＳＴ０８株にエレクトロポレーションした。その後、合成されたＢ－ＣＡＰ（Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ）をプラークとして検出するために、エレクトロポレーション後のサンプルと大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）とソフトアガーとを混合し、クロラムフェニコール（Ｃｍ）入りのＬＢプレート上に注いだ。クロラムフェニコールを入れた理由は、大腸菌ＨＳＴ０８の野生株を増殖させず、Ｂ－ＣＡＰのＨｅｌｐｅｒ大腸菌であるＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）のみが増殖できるようにするためである。培養後、プラークを得た。

　図１０に、各長さの長鎖ＤＮＡを導入して得られたプラーク数を示す。各バーは、標準偏差と平均とを示す（ｎ＝３）。
　図１１は、Ｂ－ＣＡＰ（Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ）のプラークの代表的な写真を示す。
　Ｂ－ＣＡＰのＨｅｌｐｅｒ大腸菌であるＭＣ１０６１（ｐＫＬＣ１７２）の菌叢上にできたプラークをカウントしたところ、１７ｋｂと１８ｋｂのＤＮＡを挿入したＢ－ＣＡＰからは、それぞれ約１５０個、約４０個のプラークを確認できた。
　その一方で、１９ｋｂと２０ｋｂの挿入を試みたＢ－ＣＡＰからも数個プラークが確認されたが、これらのプラークは全てＤＮＡが挿入されていない野生型のＢ－ＣＡＰであった。

　ここで、黄色ブドウ球菌由来の１７ｋｂと１８ｋｂのＤＮＡ配列が、Ｂ－ＣＡＰに挿入されていることを、ＰＣＲ法とサンガー法のシーケンシングで確認した。
　図１２は、得られたプラークを単離、増幅し、ＰＣＲ法により長鎖ＤＮＡの挿入を確認した結果を示す。図１２（ａ）は、各フラグメントの模式図である。図１２（ｂ）は、０．５％アガロースゲルで電気泳動した結果を示す。
　図１３は、同様に得られたプラークを単離、増幅し、次世代シーケンサーでシークエンシングした結果を示す。図１３（ａ）は、Ｂ－ＣＡＰ（Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ）のシーケンスを行った位置を、シーケンス１及びシーケンス２として示す模式図である。図１３（ｂ）は、実際のシーケンスの一部を示す。

　以上の結果から、Ｂ－ＣＡＰには少なくとも１８ｋｂの長さの外来ＤＮＡを挿入できることが分かった。

（殺菌性遺伝子の搭載による強力な殺菌性Ｂ－ＣＡＰ（ＮＭ－ＡＢカプシド）の構築）
　次に、Ｂ－ＣＡＰを利用した抗菌剤の開発を試みた。上述の図７に示したように、Ｂ－ＣＡＰには溶菌酵素や宿主のメタボリズムを変化させる遺伝子が含まれているので、増殖はできないものの、感染した細菌を殺菌することが可能である。
　ここで、Ｂ－ＣＡＰは通常のファージとは異なり子孫を増やさないため、予測されない感染や遺伝子伝播等の生物学的危険性の心配はない。しかしながら、ファージのように感染局所での増幅ができないため、抗菌力は通常のファージより劣ることが予想される。そこで本発明者らは、Ｂ－ＣＡＰに抗菌力を付与することを考えた。
　本実施例では、菌体外に分泌される因子として、非特許文献２に記載された、大腸菌のプラスミドにコードされている、大腸菌殺菌性バクテリオシンであるコリシン（ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅ１、以下、「ＣｏｌＥ１」という。）を利用した。ＣｏｌＥ１は、ＣｏｌＥ１を保有する細菌自身を殺菌させないように、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎと一緒にコードされており、菌体外へバクテリオシンを分泌させるためにｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎを保有する。

　図１４により、本実施例の殺菌性Ｂ－ＣＡＰ（ＮＭ－ＡＢカプシド）の構築について説明する。
　本実施例では、コリシン、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ、及びｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎがセットになったＣｏｌＥ１の遺伝子領域をＢ－ＣＡＰに搭載した。このＣｏｌＥ１遺伝子、ｉｍｍｕｎｉｔｙ遺伝子とｒｅｌｅａｓｅ　ｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子で構成された遺伝子カセットをＢ－ＣＡＰに搭載して得られたＮＭ－ＡＢカプシド構造物を、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１と名付けた。Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は標的細菌に感染して細胞内にＤＮＡを注入すると、殺菌性のＣｏｌＥ１を産生して周囲に分泌する。

　図１５は、このＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１のＢ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）の配列の構造を示す。ここでは、Ｔ７ファージとＢ－ＣＡＰの全ＤＮＡを抽出し、次世代シーケンサーのシーケンシングにより配列を読み、ＲＡＳＴｖｅｒ２．０を利用してアノテーションした。Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１のゲノム長は２４３２２ｂｐであった。これにより、ＣｏｌＥ１、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎが全て挿入されていることを確認した。
　Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１が注入された細菌宿主で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１のＤＮＡが転写される。そして、ＣｏｌＥ１、ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎが産生され、宿主細菌はｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎに守られながらＣｏｌＥ１をｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎによって菌体外に分泌する。分泌されたＣｏｌＥ１は、宿主細菌周囲の細菌群を広い範囲で殺菌できることが予想された。

　一方で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１のＤＮＡが注入された細菌は、Ｂ－ＣＡＰ由来のｅｎｄｏｌｙｓｉｎ等のｔｏｘｉｃな遺伝子により殺菌される。
　このように、非増殖性であるにも関わらず、広範囲の細菌を殺菌できる抗菌製剤ができると考え、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌力を調べた。

　図１６は、この殺菌力を調べた結果を示す。写真は、大腸菌ＭＣ１０６１及びＭＣ１０６１Ｒ（ｐＫＬＣ１７２）をソフトアガープレート上に植え、Ｂ－ＣＡＰとＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１それぞれを含む溶液をプレート上にスポットして培養した結果である。「Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ」は、ＣｏｌＥ１耐性のあるＭＣ１０６１Ｒ株にｐＫＬＣ１７２を導入したＭＣ１０６１Ｒ（ｐＫＬＣ１７２）で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣＯＬＥ１を取得するための菌であり、比較例である。Ｈｏｓｔ：ＭＣ１０６は、実際に殺菌力を調べるための菌である。これらの試験は、３回繰り返された。

　結果として、Ｂ－ＣＡＰは非増殖性であったため、殺菌効果はあまり確認できなかったが、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は非常に強い集団殺菌効果を示した。
　具体的には、大腸菌ＭＣ１０６１にＢ－ＣＡＰを添加したところ、２×１０⁵ＰＦＵでは殺菌斑が確認されたが、それ以下では殺菌斑が、ほぼ確認されなかった。一方、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１では、２×１０¹ＰＦＵでも殺菌斑が確認された。また、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は増殖性のない非常に小さな殺菌斑を形成した。これはおそらく、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１のＤＮＡを注入された細菌周囲の細菌が、ＣｏｌＥ１により殺菌されたためと考えられる。
　このように、プレート上におけるＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌力を確認できた。

　図１７により、液体培養液中でのＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌力を調べた結果について説明する。ＭＣ１０６１株及びＴ７耐性株であるＭＣ１０６１Ｒ株を液体培養し、２時間後にＢ－ＣＡＰ及びＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１を約ＭＯＩ＝１、０．１、０．０１、０．０１で加え、細菌の増殖を調べた。具体的には、増殖期の各細菌を希釈して培養し、２時間後にＭＯＩが約１、０．１、０．０１、０．００１となるようにＢ－ＣＡＰ又はＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１を加えた。

　図１７中の各系列は、４つの独立の実験結果の平均値を示す。図１７（ａ）はＭＣ１０６１、図１７（ｂ）はＭＣ１０６１Ｒ株の結果である。Ｂ－ＣＡＰをＭＯＩ＝１で大腸菌株ＭＣ１０６１株に加えたとき、増殖カーブが少し緩やかになったが、ＭＯＩ＝０．１、０．０１、０．００１で加えた時は増殖カーブに変化は生じなかった。Ｂ－ＣＡＰをＭＯＩ＝１で加えたときに増殖カーブが緩やかになったのは、ＭＣ１０６１がＢ－ＣＡＰのＤＮＡにコードされているエンドライシン等により殺菌されたからであると考えられる。一方で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、ＭＣ１０６１の増殖を、Ｂ－ＣＡＰよりも圧倒的に少ない量で抑制した。
　よりＭＯＩ＝０．００１のときのＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌効果は、ＭＯＩ＝１のＢ－ＣＡＰよりも強く、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１はＭＯＩを上げていくとさらに強い抗菌活性を示すこともわかった。Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１添加後３時間からは、ＯＤ₆₀₀が減少していることから、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は静菌性ではなく殺菌性に作用していることが示唆された。また、ＣｏｌＥ１耐性大腸菌であるＭＣ１０６１Ｒ株では、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１による殺菌活性がほとんど確認されなかったことから、ＭＣ１０６１株に対するＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌効果は、ＣｏｌＥ１によるものであることが示された。

（殺菌性Ｂ－ＣＡＰの薬剤耐性大腸菌に対する殺菌効果）
　大腸菌を含む腸内細菌科細菌の薬剤耐性は、世界レベルで大変深刻な問題である。実際にカルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）とＥＳＢＬ産生大腸菌はＷＨＯではＣＲＩＴＩＣＡＬ　ｐｒｉｏｒｉｔｙ、ＣＤＣではＣＲＥがＵｒｇｅｎｔ　Ｔｈｒｅａｄｓに、ＥＳＢＬ産生大腸菌がＳｅｒｉｏｕｓ　Ｔｈｒｅａｄｓにそれぞれ分類されている。
　そこで我々は、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１がこれらの薬剤耐性大腸菌の臨床分離株に効果があるかを調べた。

　図１８により、プレート上でのＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の殺菌効果について説明する。大腸菌ＭＣ１０６１、ＣｏｌＥ１耐性のＭＣ１０６１Ｒ、カルバペネム耐性の臨床分離大腸菌、ＥＳＢＬ大腸菌、Ｔ７耐性の臨床分離株、Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎであるＭＣ１０６１　（ｐＫＬＣ１７２）をソフトアガープレート上に植えた。Ｂ－ＣＡＰとＢ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）の希釈系列を作製し、プレート上にスポットして３７℃で培養後に写真を撮った。
　結果として、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、カルバペネム耐性大腸菌の臨床分離株であるＥｃ８９、Ｅｃ９３、Ｅｃ１０１を効果的に殺菌した。この殺菌活性は、実験室株であるＭＣ１０６１に対する活性とほぼ同程度であった。また、Ｂ－ＣＡＰによる殺菌斑も確認されたが、殺菌斑は薄く、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の１／１０００程度の殺菌力であると判断した。また、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は、多剤耐性菌であるＥＳＢＬ大腸菌であるＥｃ３２０やＥｃ３５３に対しても、同様に強い殺菌活性を示した。
　この結果から、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は臨床で深刻な問題となっている薬剤耐性大腸菌に対しても、殺菌活性があることがわかった。

（殺菌性Ｂ－ＣＡＰの細菌感染マウスに対する抗菌治療効果）
　次に、Ｂ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）の抗菌治療効果を調べるために、マウスの細菌感染モデルを用いて細菌感染症の抗菌治療試験を行った。
　図１９により、この抗菌治療試験について説明する。図１９（ａ）は時系列図、図１９（ｂ）は、投与量を示す。ここでは、臨床で分離したカルバペネム耐性大腸菌Ｅｃ９３株の菌液をマウスの腹腔に１０ＣＦＵ接種し、１．５時間後にＢ－ＣＡＰ及びＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１をＭＯＩ＝１又は０．１で腹腔に直接投与して、マウスの生存率を調べた。
　また、陰性コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を投与した群（図中で、「Ｓａｌｉｎｅ」として示す。）、陽性コントロールとして増殖性のＴ７ファージ投与群も用意した。

　図２０に、このＢ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１の抗菌治療効果として、投与後１２０時間後までの生存曲線と体重変化とを示した。図２０（ａ）が生存曲線、図２０（ｂ）が体重変化のグラフである。感染後７２時間までは６時間毎に、その後の９６時間後と１２０時間後に生存と体重を確認した。
　Ｂ－ＣＡＰとＰＢＳ投与群（Ｓａｌｉｎｅ）は差がなく、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１投与群とＰＢＳ投与群（Ｓａｌｉｎｅ）は有意差があった。ここでは、ｐ値を、ログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ　ｔｅｓｔ）にて計算した。結果は、グループあたり６匹のマウスを使用して実行された３つの独立した実験の集計値として表した。結果として、ｐ＝０．０００６であった。
　Ｂ－ＣＡＰ投与群、及び陰性コントロールのＰＢＳ投与群（Ｓａｌｉｎｅ）は、感染１８時間後から３０時間後までの間に全頭が死んだ。その一方で、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１投与群は、ＭＯＩ＝０．１で１２０時間後に１匹の死亡が確認されたが、それ以外マウスは全てが生存した。
　また、経時的体重測定の結果では、治療成功群は４２時間あたりを下限のピークに、その後少しずつ回復していくことが確認された。陽性コントロールとして用いた増殖性のＴ７ファージ投与群も全例回復した。
　この結果から、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１は非増殖性にも関わらず、薬剤耐性大腸菌の抗菌治療に使用できることや少量でも治療効果があることが示唆された。

（まとめ）
　本実施例では、Ｂ－ＣＡＰにバクテリオシン、分泌遺伝子と免疫遺伝子とを同時に搭載することにより、Ｂ－ＣＡＰ感染細菌の菌体内で大量にバクテリオシンを合成させ、それを菌体外に分泌できる抗菌製剤としてＢ－ＣＡＰ（ＣｏｌＥ１）を構築した。さらに、Ｂ－ＣＡＰ＿ＣｏｌＥ１はＭＯＩ＝０．１でもマウス大腸菌腹腔感染モデルに対して強い治療効果を示した。Ｂ－ＣＡＰは、非増殖性で安全性を確保しながらも、ＭＯＩ＝０．１で治療効果が得られる本製剤は、安全性と治療確度に課題があったファージセラピーにおいて、非常に有効な一手になると考えられる。

　本発明によれば、細菌標的型カプシド粒子（Ｂ－ＣＡＰ）を治療用組成物、殺菌剤、食品等として提供でき、産業上利用可能である。

Claims

　ファージのカプシドタンパク質と、
　前記ファージのゲノムの核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びにパッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントとを備え、非増殖性である
　ことを特徴とする細菌標的型カプシド粒子。
　前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントは、外来遺伝子を含む
　ことを特徴とする請求項１に記載の細菌標的型カプシド粒子。
　前記外来遺伝子は、殺菌遺伝子、バイオフィルム分解遺伝子、抗原提示用遺伝子、及び導入用遺伝子のいずれか又は任意の組み合わせを含む
　ことを特徴とする請求項２に記載の細菌標的型カプシド粒子。
　前記殺菌遺伝子により、周囲の菌を殺菌する分泌性の殺菌産物を生成する
　ことを特徴とする請求項３に記載の細菌標的型カプシド粒子。
　前記外来遺伝子は、標的細菌の殺菌を抑える抵抗因子を含む
　ことを特徴とする請求項４に記載の細菌標的型カプシド粒子。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子を含む
　ことを特徴とする治療用組成物。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子を含む
　ことを特徴とする殺菌剤。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子を含む
　ことを特徴とする食品。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を除去する
　ことを特徴とする細菌除去方法。
　標的細菌は、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在する
　ことを特徴とする請求項９に記載の細菌除去方法。
　標的細菌は、食品内に存在する
　ことを特徴とする請求項９に記載の細菌除去方法。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を殺菌する
　ことを特徴とする殺菌方法。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子により標的細菌を殺菌し、物品の腐食を予防する
　ことを特徴とする腐食予防方法。
　請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子により動物を治療する
　ことを特徴とする動物治療方法。
　請求項２乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子に含まれる前記外来遺伝子を標的細菌に導入する
　ことを特徴とする遺伝子導入方法。
　請求項２乃至５のいずれか１項に記載の細菌標的型カプシド粒子に含まれる前記外来遺伝子を標的細菌に導入し、該標的細菌に機能を追加する
　ことを特徴とする細菌機能追加方法。
　ファージのゲノムから分割された、パッケージング領域を含まず、カプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜により前記ファージのカプシドタンパク質を調製し、
　前記ファージのゲノムの前記カプシド核酸エレメン卜以外の箇所から分割された、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びに前記パッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントを、前記カプシドタンパク質にパッケージングし、
　非増殖性の細菌標的型カプシド粒子を生成する
　ことを特徴とする細菌標的型カプシド粒子の製造方法。
　前記カプシド核酸エレメン卜及び前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントを、調製用の調製細菌内に導入して、前記細菌標的型カプシド粒子を前記調製細菌内で生成させる
　ことを特徴とする請求項１７に記載の細菌標的型カプシド粒子の製造方法。
　前記カプシド核酸エレメン卜は、前記調製細菌用の染色体又は人工染色体により導入される
　ことを特徴とする請求項１８に記載の細菌標的型カプシド粒子の製造方法。
　前記細菌標的型カプシド粒子用エレメントは、前記染色体又はプラスミドにより導入される
　ことを特徴とする請求項１９に記載の細菌標的型カプシド粒子の製造方法。
　ファージゲノムから、パッケージング領域を含まず、カプシドを合成するカプシド核酸エレメン卜を分割して調製し、
　前記ファージゲノムの前記カプシド核酸エレメン卜以外の箇所から、核酸注入領域、核酸の複製に必要な複製領域、並びに前記パッケージング領域を含む細菌標的型カプシド粒子用エレメントを分割して調製し、
　非増殖性の細菌標的型カプシド粒子用核酸を構築する
　ことを特徴とする細菌標的型カプシド粒子用核酸の製造方法。