WO2023282583A1 - 생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법 - Google Patents

생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법 Download PDF

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polymer
hemostatic agent
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chitosan
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권오형
곽동민
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금오공과대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a powder-type hemostatic agent containing a biocompatible polymer and a method for manufacturing the same, and more specifically, it is characterized by excellent biocompatibility and high blood absorption through a cross-linked structure by using a natural polymer.
  • a hemostatic material by including a hemostatic material, the rate of clot formation is fast, many blood clots are formed, and blood coagulation ability is excellent, and tissue adhesion can be increased by including an adhesive, and an excellent hemostatic effect is provided.
  • Blood is discharged out of the blood vessel due to trauma or internal bleeding that exists within the blood vessel, which is called hemorrhage.
  • hemostasis occurs to prevent blood loss.
  • the hemostasis process is largely classified into primary hemostasis and secondary hemostasis.
  • blood flow is first hindered by vasoconstriction, and platelets adhere to the inner wall of blood vessels with the help of vWF (von Willebrand factor) and aggregate to form the primary hemostasis.
  • vWF von Willebrand factor
  • a platelet plug is formed, which is called primary hemostasis.
  • secondary hemostasis is achieved as insoluble fibrin is produced through continuous activation of various types of blood coagulation factors and finally a secondary hemostatic plug is formed.
  • Hemostasis methods include a mechanical method, a cold/hot method, and a chemical method.
  • the most basic mechanical method is to directly press the bleeding area using gauze or cotton, or to stop bleeding by using instruments such as sutures, clamps, and clips for bleeding caused by cuts or lacerations.
  • bone bleeding bone wax
  • the cold and hot method there is a cold compress method that suppresses blood going to the bleeding area by lowering the body temperature and a method of coagulating the tissue by applying heat to the tissue using an electrocautery machine, which is one of electrosurgical devices using high-frequency electrical energy, to stop bleeding.
  • a typical chemical method includes a hemostatic agent.
  • Hemostatic agents are largely astringents that suppress direct bleeding by an astringent action that forms a film when applied to the skin or mucous membranes, blood coagulation accelerators that promote blood coagulation by using various factors involved in the blood coagulation process as drugs when bleeding occurs, and blood coagulants.
  • Topical hemostats are produced in various forms such as sponge, sheet, hydrogel, bar, and powder. Hemostats in the form of sponges and sheets can be applied to wide wounds and can absorb a large amount of blood, but have the disadvantage of having to be cut to fit the size of the wound and weak adhesiveness. Hydrogel-type hemostatic agents can absorb a large amount of water due to the network structure between polymer chains, can be applied to irregular surfaces, and have excellent adhesiveness, but because they have a lot of moisture, viruses or microorganisms can easily propagate and cause infection. there is.
  • powder type hemostatic agent Since the powder type hemostatic agent has a large surface area compared to other hemostatic agents, the contact area with blood is widened, enabling rapid hemostasis. However, due to the nature of the powder itself, it does not participate in hemostasis and is messy due to the powder around the wound. Powder-type hemostats currently on the market form a film to stop bleeding temporarily and stop bleeding. If the film is removed, bleeding may occur again, and if the amount of blood is large, the film cannot be properly attached to the tissue and is lost along with the blood. has
  • the present invention has been made to solve the problems of the prior art, to provide a powder-type hemostatic agent having excellent biocompatibility and high blood absorption through a crosslinked structure using natural polymers, and a manufacturing method thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a powder-type hemostatic agent having a high blood clot formation rate by including a hemostatic substance and having a high clot formation rate.
  • tissue adhesion by including an adhesive, and to provide a powder-type hemostatic agent having an excellent hemostatic effect.
  • first polymer a first polymer
  • second polymer a second polymer
  • cross-linking agent wherein the first polymer and the second polymer are biocompatible polymers, and the first polymer and the second polymer are cross-linked by the cross-linking agent.
  • the biocompatible polymer is chitosan, starch, cellulose, alginate, gelatin, hyaluronic acid, sodium hyaluronate, collagen, polyvinyl alcohol (PVA), alginic acid, pectin, carrageenan, chondroitin (sulfate), dextran (sulfate), polylysine (polylysine), carboxymethyl titin, fibrin, agarose, pullulan, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxyethylcellulose (HEC), hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), sodium carboxymethylcellulose, polyalcohol, gum arabic, cyclodextrin, dextrin, glucose, fructose, trehalose, glucose, maltose, lactose, lactulose, fructose, turanose, melitose, melegitose , dex
  • the first polymer may include chitosan
  • the second polymer may include starch
  • the crosslinking agent is glyoxal, glutaraldehye, citric acid, At least one selected from the group consisting of N,N-methylene bisacrylamide, dialdehyde, oxalic acid and citric acid can include
  • the powder-type hemostatic agent may further include at least one selected from the group consisting of an adhesive, a calcium compound, and a hemostatic material.
  • the adhesive may include at least one selected from the group consisting of poly(vinyl pyrrolidone), PVP, pullulan, and dopamine.
  • the amount of the adhesive may be 0.5 to 15 parts by weight relative to 100 parts by weight of the powdered hemostatic agent.
  • the calcium compound may include at least one selected from the group consisting of calcium chloride, calcium nitrate, calcium carbonate, calcium acetate, calcium carbonate, calcium sulfide, calcium carbonate and calcium phosphate.
  • the hemostatic material may include at least one selected from the group consisting of thrombin, prothrombin, thromboplastin, fibrinogen, aprotinin, vitamin C and vitamin K.
  • Another aspect of the present invention (a) preparing a first mixed solution by preparing a first polymer solution and a second polymer solution, respectively, and mixing them; (b) preparing a cross-linked product in which the first polymer and the second polymer are cross-linked by adding a cross-linking agent to the first mixed solution; and (c) lyophilizing the cross-linked product and pulverizing it to prepare a powder-type hemostatic agent.
  • step (b) mixing the crosslinked product with a solution containing at least one selected from the group consisting of an adhesive, a calcium compound and a hemostatic material to prepare a second mixed solution Step; may be further included.
  • the step (c) may be (c') preparing a powder-type hemostatic agent by lyophilizing and pulverizing the second mixed solution.
  • step (c) After freeze-drying in step (c), cooling under nitrogen gas conditions may be further included.
  • the powdered hemostatic agent of the present invention has excellent biocompatibility by using natural polymers and has a high blood absorption rate through a cross-linked structure.
  • the powder-type hemostatic agent of the present invention contains a hemostatic material, so that the rate of clot formation is fast, and many clots are formed, so that the blood coagulability is excellent.
  • the powder-type hemostatic agent of the present invention can increase tissue adhesion by including an adhesive, and has an effect of having an excellent hemostatic effect.
  • 1 is a schematic diagram showing the structure of the powdered hemostatic agent of the present invention.
  • Example 2 is a graph showing the blood absorption rate according to the Chitosan/starch content ratio adjustment of the chitosan/starch powder type hemostatic agent according to Example 1.
  • Figure 3 is a graph showing the blood absorption rate according to the crosslinking time in Example 1, (a) 2 hours, (b) 4 hours, (c) 12 hours, (d) 24 hours, (e) 72 hours.
  • Figure 4 is a graph showing the blood absorption rate according to the crosslinking agent content in Example 1, (a) 1000 ⁇ l, (b) 500 ⁇ l, (c) 100 ⁇ l, (d) 50 ⁇ l, (e) 25 ⁇ l, (f) is 10 ⁇ l.
  • Figure 5 is a graph showing the blood absorption rate according to the particle size of the chitosan / starch powder type hemostat according to Example 1, (a) 250-500 ⁇ m, (b) 125-250 ⁇ m, (c) 0-125 ⁇ m .
  • Figure 6 is the FTIR analysis result, (A) chitosan, (B) starch, (C) FTIR spectrum of the chitosan / starch powder type hemostat prepared according to Example 1.
  • Example 7 is a graph comparing the adhesion of chitosan/starch powder type hemostat (Freeze dry) prepared according to Example 1, Pure PVP and chitosan/starch powder type hemostat containing 15 wt% PVP prepared according to Example 2 .
  • Example 8 is a graph comparing the adhesiveness according to the PVP concentration of chitosan/starch powder-type hemostatic agents containing PVP prepared in Example 2.
  • FIG 9 is a graph showing the blood absorption rate according to the PVP concentration of the chitosan/starch powder-type hemostatic agent containing PVP prepared according to Example 2.
  • 10 is a graph showing fibrin formation time according to CaCl 2 concentration.
  • 11 is a graph showing fibrin formation time according to thrombin concentration.
  • FIGs 12 a1 to i2 (A) is a chitosan/starch powder type hemostat prepared according to Example 1, (B) is a chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 3, ( C) to (I) are SEM images of chitosan/starch powder-type hemostat containing PVP/CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 4, and (C) to (I) show PVP concentrations of 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15 wt%.
  • (A) is a chitosan/starch powder type hemostat prepared according to Example 1
  • (B) is a chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 3 is the result of EDS analysis of
  • Figure 14 is the results of the whole blood coagulation test (Lee-White method) of the powder-type hemostat prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4.
  • Figure 15 is the results of the whole blood coagulation test (Imai-Nose method) of the powder-type hemostat prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4.
  • Figure 19 is the result of the cytotoxicity test through the MTT assay of the powder-type hemostat prepared according to Examples 3 and 4 (elution conditions: 1mg / ml).
  • Figure 20 is the result of the cytotoxicity test through the MTT assay of the powder-type hemostat prepared according to Examples 3 and 4 (elution condition: 5mg / ml).
  • Figure 21 is the result of the cytotoxicity test through the MTT assay of the powder-type hemostat prepared according to Examples 3 and 4 (elution conditions: 10mg / ml).
  • Figure 23 is the result of the hemostatic ability evaluation (bleeding amount) through in vivo animal testing of the powdered hemostat prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4.
  • Example 24 is the result of calculating the hemostatic ability evaluation (bleeding amount per hour) of the powdered hemostat prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4 through in vivo animal experiments.
  • 25a to 25f are H&E staining results of powdered hemostats prepared according to Examples 1, 3 and 4.
  • 26a to 26f are Carstair's staining results of powdered hemostats prepared according to Examples 1, 3 and 4.
  • the hemostatic agent refers to a drug used for the purpose of stopping bleeding for bleeding symptoms, preferably in the form of a powder, and can be used in any part of the body where bleeding occurs.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the powdered hemostatic agent of the present invention. Hereinafter, with reference to Figure 1 will be described for the powder type hemostatic agent of the present invention.
  • the present invention is a first polymer; a second polymer; and a cross-linking agent, wherein the first polymer and the second polymer are biocompatible polymers, and the first polymer and the second polymer are cross-linked by the cross-linking agent.
  • the biocompatible polymer is chitosan, starch, cellulose, alginate, gelatin, hyaluronic acid, sodium hyaluronate, collagen, polyvinyl alcohol (PVA), alginic acid, pectin, carrageenan, chondroitin (sulfate), dextran (sulfate), polylysine (polylysine), carboxymethyl titin, fibrin, agarose, pullulan, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxyethylcellulose (HEC), hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), sodium carboxymethylcellulose, polyalcohol, gum arabic, cyclodextrin, dextrin, glucose, fructose, trehalose, glucose, maltose, lactose, lactulose, fructose, turanose, melitose, melegitose , dex
  • the first polymer may include chitosan
  • the second polymer may include starch
  • Chitosan can be obtained by deacetylating chitin extracted from crustaceans such as crabs and shrimps in a concentrated alkaline solution.
  • chitosan As a biomedical material, chitosan has characteristics such as biocompatibility, biodegradability, non-toxicity, and non-immunity, and has self-sterilization properties capable of inhibiting the growth of bacteria and fungi.
  • chitosan as a cationic polymer, has mucoadhesive properties and can form clots during bleeding due to interaction with negatively charged platelets and red blood cells due to the presence of cations from aminoglucose.
  • Starch is a polymer composed of many glucose units linked by glycosidic bonds. It is the most common carbohydrate in the human diet and is present in large quantities in staple foods such as potatoes, maize, rice, wheat and cassava. Starch is generally composed of 20-25% amylose and 75-80% amylopectin, is inexpensive, and has excellent biocompatibility, non-toxicity, and biodegradability like chitosan. In addition, starch is used after being dissolved in water at 80 ° C. When dissolved in water, starch absorbs water and increases viscosity. An excellent hemostatic effect can be provided by increasing the viscosity of blood and increasing the concentration of blood cells.
  • the crosslinking agent is glyoxal, glutaraldehye, citric acid, At least one selected from the group consisting of N,N-methylene bisacrylamide, dialdehyde, oxalic acid and citric acid It may include, preferably may include glyoxal.
  • the crosslinking agent refers to a material that combines linear polymer monomer molecules through chemical bonds to form a polymer compound with a three-dimensional network structure.
  • biomolecular compounds can be cross-linked with each other through covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, and physical bonds. Accordingly, mucoadhesiveness and hemostatic properties of chitosan and viscosity are improved by starch, thereby providing performance as a hemostatic agent with excellent biocompatibility and blood absorption.
  • Glyoxal has the smallest dialdehyde group present and is a cross-linking agent that forms acetal bond or hemiacetal bond with hydroxyl group present in polysaccharide under acid catalyst, and forms primary amine and shiff base bond.
  • the powdered hemostatic agent is composed of particles including the first polymer and the second polymer, and the first polymer and the second polymer are crosslinked by the crosslinking agent.
  • the powder-type hemostatic agent may further include at least one selected from the group consisting of an adhesive, a calcium compound, and a hemostatic material.
  • the pressure-sensitive adhesive may include at least one selected from the group consisting of poly(vinyl pyrrolidone), PVP, pullulan, and dopamine, and preferably may include PVP. there is.
  • PVP is a non-toxic synthetic polymer because it is not absorbed through the gastrointestinal tract or mucous membrane, and as a powder soluble in water and polar solvents, it has the property of forming a film after the absorbed water evaporates.
  • PVP is an FDA-approved material and is widely used in daily life, such as biomaterials, cosmetics, and synthetic detergents.
  • Another characteristic of PVP is its excellent adhesive ability. This is because PVP has a strong attraction to other molecules due to its polarity.
  • the content of the adhesive may be 0.5 to 15 parts by weight, preferably 3 to 7 parts by weight, based on 100 parts by weight of the powdered hemostatic agent.
  • the pressure-sensitive adhesive may contain PVP, and the PVP solution may have a content of 0.5 to 15 mL compared to 100 mL of the PVP aqueous solution when preparing a powder-type hemostatic agent.
  • the calcium compound may include at least one selected from the group consisting of calcium chloride, calcium nitrate, calcium carbonate, calcium acetate, calcium carbonate, calcium sulfide, calcium carbonate, and calcium phosphate, preferably calcium chloride (CaCl 2 ). can do.
  • the hemostatic material may include at least one selected from the group consisting of thrombin, prothrombin, thromboplastin, fibrinogen, aprotinin, vitamin C and vitamin K, and preferably may include thrombin.
  • CaCl 2 activates prothrombin into thrombin
  • thrombin is a representative blood coagulation promoting factor that activates fibrinogen into fibrin.
  • Ca 2+ ions were introduced using thrombin and CaCl 2 , which are blood coagulation promoting drugs, to improve blood coagulation ability upon contact with blood.
  • Ca 2+ ions also exist in the body and activate prothrombin into thrombin, and thrombin activates fibrinogen into fibrin, which is involved in blood clot formation.
  • the size of the particles may be 1 to 500 ⁇ m, preferably 125 to 250 ⁇ m.
  • the adhesive, calcium compound and hemostatic material may be coated on the surface of the particle.
  • a first polymer solution and a second polymer solution are prepared, respectively, and mixed to prepare a first mixed solution (step a).
  • the weight ratio of the first polymer to the second polymer may be 1 to 7:7 to 1, preferably 1 to 3:3 to 1.
  • a crosslinking agent is added to the first mixed solution to prepare a crosslinked product in which the first polymer and the second polymer are crosslinked (step b).
  • the content of the crosslinking agent relative to 100 parts by volume of the first mixed solution may be 5 to 500 parts by volume, preferably 20 to 30 parts by volume.
  • step (b) the crosslinking reaction may be carried out for 2 to 72 hours, preferably for 10 to 15 hours.
  • the cross-linked product is lyophilized and pulverized to prepare a powdered hemostatic agent (step c).
  • step (b) mixing the crosslinked product with a solution containing at least one selected from the group consisting of an adhesive, a calcium compound and a hemostatic material to prepare a second mixed solution Step; may be further included.
  • the step (c) may be (c') preparing a powder-type hemostatic agent by lyophilizing and pulverizing the second mixed solution.
  • step (c) After freeze-drying in step (c), cooling under nitrogen gas conditions may be further included.
  • Chitosan solution was prepared by dissolving chitosan (low molecular weight 50,000 ⁇ 190,000 Da, Sigma-Aldrich Co.) in 100 mL of 2% acetic acid aqueous solution, heating 100 mL of distilled water to 80 ° C and dissolving starch (Daejung Co.) A starch solution was prepared.
  • a mixed solution was prepared by mixing the chitosan solution and the starch solution. The weight ratio of chitosan and starch in the mixed solution is 1.25:0.75 ( ⁇ 1.67:1).
  • a cross-linking reaction was performed for 12 hours by adding glyoxal (Sigma-Aldrich Co.) as a cross-linking agent to the mixed solution.
  • glyoxal Sigma-Aldrich Co.
  • the chitosan/starch aqueous solution was precipitated in 500 mL of acetone and stirred for 30 minutes in order to remove the unreacted cross-linking agent and obtain a cross-linked product in which chitosan and starch were cross-linked.
  • the precipitate and acetone were separated from the supernatant by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, and the precipitate was finally separated through centrifugation after solvent exchange once in 500mL acetone and once in 500mL distilled water, a total of two times.
  • a swollen precipitate was obtained.
  • the obtained swollen precipitate was pre-frozen and then freeze-dried.
  • the freeze-dried sample was quenched using liquid nitrogen and ground in a mortar to prepare a chitosan/starch powder-type hemostatic agent.
  • Example 2 Preparation of chitosan/starch powder type hemostatic agent containing PVP
  • Example 1 the solvent exchange was completed by centrifugation, and PVP aqueous solution (molecular weight ⁇ 1,300,000 Da, Sigma-Aldrich Co.) was added to the centrifuged sample at a ratio of 1: 1 v / v%, and then a vortex mixer was used. and mixed. After preliminary freezing in a -80 ° C cryogenic freezer, freeze-drying was performed. The lyophilized sample was quenched using liquid nitrogen and then pulverized in a mortar to prepare a chitosan/starch powder-type hemostatic agent containing PVP.
  • Example 3 Preparation of chitosan/starch powder type hemostatic agent containing CaCl 2 /thrombin
  • the concentrations of the CaCl 2 solution and the thrombin solution were set to 20 mM and 100 ⁇ g/ml, respectively.
  • a CaCl 2 /thrombin solution was prepared by mixing the CaCl 2 solution and the thrombin solution.
  • Example 1 the solvent exchange was completed by centrifugation, and the CaCl 2 /thrombin solution was added to the centrifuged sample at a ratio of 1:1 v/v% and then mixed using a vortex mixer. After preliminary freezing in a -80 ° C cryogenic freezer, freeze-drying was performed. The lyophilized sample was quenched using liquid nitrogen and then pulverized in a mortar to prepare a chitosan/starch powder-type hemostatic agent containing CaCl 2 /thrombin.
  • Example 4 Preparation of chitosan/starch powder type hemostatic agent containing PVP/CaCl 2 /thrombin
  • the concentrations of the CaCl 2 solution and the thrombin solution were set to 20 mM and 100 ⁇ g/ml, respectively. After dissolving PVP in the CaCl 2 solution, a thrombin solution was added to prepare a PVP/CaCl 2 /thrombin solution.
  • Example 1 the solvent-exchanged sample was centrifuged, and the PVP/CaCl 2 /thrombin solution was added to the centrifuged sample at a ratio of 1:1 v/v% and mixed using a vortex mixer. After preliminary freezing in a -80 ° C cryogenic freezer, freeze-drying was performed. The lyophilized sample was quenched using liquid nitrogen and then pulverized in a mortar to prepare a chitosan/starch powder-type hemostatic agent containing PVP/CaCl 2 /thrombin.
  • the optimal content ratio was determined by considering the weight when the powder could no longer be absorbed by 0.1 g of the chitosan/starch powder-type hemostatic agent according to Example 1 as the maximum absorption rate. Absorption rate was calculated by Equation 1 below, and the results are shown in FIG. 2.
  • Equation 1 W 0 is the initial weight of the powder, and W max is the weight of the powder when it is absorbed to the maximum.
  • Example 1 the blood absorption rate according to the crosslinking time was observed in order to set an appropriate reaction time to provide sufficient time for the crosslinking reaction to occur as the crosslinking time was longer, and the results are shown in FIG. 3.
  • the crosslinking time is 2 hours in (a), 4 hours in (b), 12 hours in (c), 24 hours in (d), and 72 hours in (e).
  • the absorption rate is low because sufficient crosslinking is not performed in the initial 2 hours after the crosslinking agent glyoxal is added, and the network structure is not properly formed. As the reaction proceeds, the network structure is well formed. At 12 hours, the maximum absorption rate of 806% could be observed. After that, the tendency for the absorption rate to decrease as the reaction continues seems to decrease as the crosslinking degree increases and the network spacing of the polymer narrows. Through this, 12 hours with the best absorption rate was set as the optimal crosslinking time.
  • the absorption rate was confirmed to set the crosslinking agent content, and the results are shown in FIG. 4.
  • the content of the crosslinking agent is 1000 ⁇ l in (a), 500 ⁇ l in (b), 100 ⁇ l in (c), 50 ⁇ l in (d), 25 ⁇ l in (e), and 10 ⁇ l in (f).
  • the content of the cross-linking agent was 50 ⁇ l
  • the highest absorption rate was 1202%.
  • the higher the crosslinking agent content the lower the absorption rate due to the increase in the degree of crosslinking.
  • the amount of crosslinking agent is less than that of the polymer functional group, so the absorption rate is reduced because the crosslinking is not sufficiently performed.
  • the powder produced through pulverization after freeze-drying has a difference in blood absorption rate according to the particle size due to the nature of the powder.
  • the pulverized powder was sieved and classified into particle sizes of 125 ⁇ m or less, 125-250 ⁇ m, and 250-500 ⁇ m, and the blood absorption rate of the powder according to the particle size was measured to determine the optimal particle size.
  • the results are shown in FIG. .
  • the size of the particles is 250-500 ⁇ m in (a), 125-250 ⁇ m in (b), and 0-125 ⁇ m in (c).
  • the absorption rate was the highest at 1040.8% when the particle size was 125-250 ⁇ m.
  • Absorption rates at 250-500 ⁇ m and 0-125 ⁇ m were 866.2% and 696.6%, respectively. Based on the absorption rate, the particle size of 125-250 ⁇ m was selected as the optimal particle size.
  • FIG. 6 In order to confirm cross-linking of the chitosan/starch powder-type hemostatic agent prepared in Example 1, functional groups were analyzed using FTIR transmission, and the results are shown in FIG. 6 .
  • (A) is chitosan
  • (B) is starch
  • (C) is an FTIR spectrum of chitosan/starch powdered hemostatic agent prepared according to Example 1.
  • the adhesiveness was measured using TA instruments' DHR- ⁇ . Geometry (40 mm parallel plate, Peltier plate Steel, 110258), stage temperature (37°C), angular frequency (10 rad/s), and gap (3000 ⁇ 500 ⁇ m) were set as measurement conditions, and the adhesion in the actual tissue was observed. To this end, the experiment was conducted by attaching porcine skin (250-300 mm) to the geometry using an instant adhesive.
  • Example 7 is a graph comparing the adhesiveness of a chitosan/starch powder type hemostat prepared in Example 1 (Freeze dry), Pure PVP, and a chitosan/starch powder type hemostat containing 15wt% PVP.
  • FIG. 8 is a graph comparing the adhesiveness according to the PVP concentration of chitosan/starch powder-type hemostatic agents containing PVP prepared in Example 2. Referring to FIG. 8, it was confirmed that the adhesiveness of the powder improved as the PVP concentration increased.
  • the powder without PVP applied had the lowest adhesive force at -0.28 N, and the adhesive force of 15 wt% with the highest PVP concentration was -2.38 N, which was 881% higher than that of the powder without PVP applied.
  • FIG. 9 is a graph showing the blood absorption rate according to the PVP concentration of the chitosan/starch powder-type hemostatic agent containing PVP prepared according to Example 2.
  • the initial introduction of PVP hindered absorption rather than formation of a PVP film by the introduction of water and blood In the case of 3.0-7.0 wt%, it was confirmed that the ability to support water increased as the viscosity of the powder that absorbed water increased along with the formation of the PVP film. After 10.0 wt%, it was confirmed that the absorption rate decreased because contact between the powder and water/blood was blocked due to excessive PVP film formation.
  • a stainless steel tube rack to support the watch glass was placed, and water was filled in a constant temperature water bath to the extent that the bottom of the watch glass was submerged, and maintained at 37 ° C. Thereafter, the watch glass was put on the rack for 10 minutes to adjust the temperature, and then the experiment was conducted.
  • 300 ⁇ l of the CaCl 2 solution was placed on a watch glass, and 300 ⁇ l of PPP was introduced and mixed thereon, and the fibrin formation time was measured.
  • the tip of a 200 ⁇ l pipette tip was bent and the PPP into which the coagulation promoting factor was introduced was lifted and confirmed.
  • the CaCl 2 concentration with the shortest fibrin formation time was optimally set, and based on this, the optimal conditions for thrombin were set.
  • Fibrin formation time according to CaCl 2 concentration is shown in FIG. 10 .
  • the fibrin formation time was the shortest at 239 seconds when the concentration of CaCl 2 was 20 mM.
  • the concentration of Ca 2+ ions is low, fibrin formation is not properly involved, and when the concentration of Ca 2+ ions is high, activation of fibrinogen to fibrin is delayed, resulting in a V-shape.
  • 11 is a graph showing fibrin formation time according to thrombin concentration. Referring to FIG. 11, the higher the concentration of thrombin, the shorter the fibrin formation time, but at a concentration higher than 100 ⁇ g/ml, the fibrin formation time was similar to 0.13 seconds.
  • a scanning electron microscope (SEM, JSM-6380. Japen) was used to observe the shape and microstructure of the powdered hemostatic agent.
  • a scanning electron microscope is a type of electron microscope that scans and images the surface of a sample through an electron beam. When high-speed electrons are fired, the electrons collide with the sample surface and interact to analyze the ejection of materials such as electrons from the sample. to be.
  • the samples were coated with platinum to impart conductivity before observation using a sputter coater (108 auto, degree of vacuum: less than 10 Pa, Cressington Scientific Instruments Inc. UK). Accurate SEM images could be observed through the coating and were observed under conditions of accelerating voltage (10 kV) and working distance (15 mm).
  • FIGs 12a1 to 12i2 are a chitosan/starch powder type hemostat prepared according to Example 1
  • (B) is a chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 3
  • (C) to (I) are SEM images of chitosan/starch powder-type hemostat containing PVP/CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 4, and
  • (C) to (I) are PVP concentrations of 0.5 and 1, respectively. , 3, 5, 7, 10, 15 wt%.
  • Example 3 Surface of the chitosan/starch powder-type hemostat containing CaCl 2 /thrombin prepared in Example 3 using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to identify CaCl 2 and thrombin introduced to promote blood coagulation. Elemental analysis was performed. Through elemental analysis, Ca 2+ of CaCl 2 and S in cysteine and methionine among the amino acid structures of thrombin were confirmed to confirm the presence of blood coagulation promoting factors in the powder phase and the degree of dispersion.
  • EDS energy-dispersive X-ray spectroscopy
  • (A) is a chitosan/starch powder type hemostat prepared according to Example 1
  • (B) is a chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin prepared according to Example 3.
  • EDS analysis Referring to FIGS. 13a and 13b, it was confirmed that the Ca 2+ ions of the coated CaCl 2 were contained on the surface by about 6.48%. It is expected that element S was not detected due to the small effect of the ratio of cysteine to methionine present in thrombin. As a result of EDS mapping of Ca 2+ ions in yellow, it was confirmed that they were uniformly dispersed in all particles.
  • the Lee-White method was performed to measure the blood coagulation time of powdered hemostatic agents.
  • the Lee-White method is to put whole blood into a glass vial and set the time when the blood loses fluidity and clots as the blood coagulation time.
  • blood itself without introduction of the powdered hemostatic agent was set, and the powdered hemostatic agent prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4 was set as the experimental group.
  • 10 mg of powdered hemostat in the vial 1 ml of whole blood was added and the time at which blood no longer flowed was recorded by tilting, and the results are shown in FIG. 14 .
  • the condition containing the blood coagulation promoting factor CaCl 2 and thrombin was about 3.5 times faster than the condition without the blood coagulation promoting factor.
  • the fastest time was 36 seconds at 7 wt% of PVP, but there was no significant difference when compared to other PVP conditions.
  • the blood coagulation ability of the powder was improved due to the introduction of the blood coagulation promoting factor, and it was confirmed that the blood coagulation ability was not inhibited by the introduction of PVP.
  • the Imai-Nose method was performed to confirm the clot formation ability of the powdered hemostatic agent.
  • a stainless steel centrifugal tube tube rack was placed in a constant temperature water bath set at 37 ° C., and a watch glass was placed on it, and the temperature was maintained for 10 minutes. Thereafter, 10 mg of a powder-type hemostatic agent was introduced and 200 ⁇ l of blood was added and the experiment was performed while mixing. As a control, the thrombogenicity was observed without applying the powder.
  • the reaction times of blood and powder were observed at 1, 3, 5, 7, 10, and 20 minutes, respectively, and when the reaction time was reached, 5 ml of distilled water was added to terminate the blood coagulation reaction.
  • the resulting clot was separated, fixed with 35% formaldehyde for 10 minutes, soaked in distilled water, washed for 5 minutes, and dried for 24 hours. Then, the weight of the thrombus was measured according to the reaction time, and the results are shown in FIG. 15 .
  • the degree of thrombosis was about 7-8 times higher than that of the control group. It was observed that hemostatic agents formed clots better. It seems that the cross-linked chitsoan/starch powder helped blood coagulation by absorbing blood and reducing the amount of remaining blood. In addition, as a result of observing thrombus formation according to the PVP concentration, it was confirmed that the introduction of PVP did not inhibit the formation of thrombi.
  • the red blood cell hemolysis test is a test method for quantifying the remaining red blood cells according to the blood coagulation reaction. As the red blood cells are hemolyzed, the hemoglobin in the red blood cells is released, and the blood coagulation ability is confirmed by measuring the absorbance at this time.
  • a stainless steel centrifugal tube tube rack was placed in a constant temperature water bath and a watch glass was placed thereon. After introducing 5 mg of powdered hemostatic agent on the watch glass, water was filled to submerge the bottom of the watch glass, and the temperature was maintained at 37° C. for 10 minutes. Thereafter, 200 ⁇ l of blood was introduced and carefully mixed to initiate the coagulation reaction. As a control, 200 ⁇ l of only blood not introduced with powder was placed in a watch glass. The reaction time was set to 1, 3, 5, 7, 10, and 20 minutes. When the reaction time was over, 5 ml of distilled water was added to terminate the blood coagulation reaction, and blood clots and powder were removed, followed by hemolysis of red blood cells for 5 minutes.
  • the absorbance was about 18% lower than that when the factor was not introduced. This indicates that a blood clot is formed by a blood coagulation reaction, and there are few remaining red blood cells, and many blood clots are generated. As there was no significant difference in the absorbance by the remaining red blood cells according to the PVP concentration, it was confirmed that PVP did not affect clot formation.
  • Plasma protein coagulation occurs by adding calcium ions to plasma decalcified by anticoagulants. Using this, a plasma recalcification time (PRT) measurement method was performed to investigate the interaction between the powdered hemostatic agent and plasma proteins.
  • PRT plasma recalcification time
  • PRT measurement measures the time until fibrin is formed after adding calcium ions to PPP obtained by centrifuging whole blood.
  • a powdered hemostatic agent prepared according to Example 4 was used as an experimental group. PPP was obtained by centrifugation of whole blood containing anticoagulant, and the separated PPP was stored on ice and used within several hours. In addition, since an anticoagulant was included, a 0.0125 M CaCl 2 solution was added to suppress the anticoagulant.
  • a stainless steel tube rack was placed in a constant temperature water bath, a watch glass was placed on it, the water was adjusted so that the bottom of the watch glass could be submerged, and a temperature of 37 ° C was applied. Thereafter, 20 mg of a powdered hemostatic agent was placed on a watch glass while adjusting the temperature with a constant temperature water bath for 10 minutes, and 300 ⁇ l of PPP and 300 ⁇ l of a 0.025 M CaCl 2 solution were introduced to observe the fibrin formation time. Upon observation, fibrin formation was observed while lifting the plasma by bending the end of a 200 ⁇ l pipette tip, and the results are shown in FIG. 18 .
  • the fibrin formation time was about 4 to 5 times faster when the blood coagulation accelerator was included than when it was not included.
  • the condition in which PVP was introduced took the longest fibrin formation time among the conditions in which PVP was introduced, at 54.66 seconds at 1.0 wt%, but there was no significant difference from other concentration conditions, so it was confirmed that PVP introduction did not inhibit fibrin formation.
  • 1 ⁇ 10 4 cells of NIH/3T3 cells were dispensed into wells of a 96-well cell culture plate and cultured for 24 hours in an incubator at 37°C and 5% CO 2 environment.
  • the elution medium was eluted for 24 hours by applying 1, 5, and 10 mg of powdered hemostat per 1 ml of the medium.
  • the medium of the 96-well cell culture plate was suctioned, and 100 ⁇ l of the dissolution medium was dispensed into each well and cultured for another 24 hours.
  • MTT solution made of DMEM medium (9): MTT stock solution (1) was added and reacted for 1-4 hours. After 1-4 hours, after removing the MTT reagent, 100 ⁇ l of DMSO was added to dissolve insoluble formazan, and the absorbance was measured at 540 nm using an ELISA microplate reader. 20 (elution conditions: 5 mg/ml) and FIG. 21 (elution conditions: 10 mg/ml).
  • avertin stock solution by mixing 25 g avertin (2,2,2-tirbromoethanol) and 15.5 ml tert-amyl alcohol (2-methyl-2-butanol) to be used as an anesthetic for 12 hours in a dark room.
  • the amount of blood loss is calculated by measuring the weight of the filter paper, powder, and disposable gauze that have absorbed blood.
  • a control group was set in a state in which nothing was introduced, and ARISTA-AH, a commercially available highly absorbable hemostatic agent, was used as a positive control group.
  • ARISTA-AH a commercially available highly absorbable hemostatic agent
  • the powdered hemostatic agent prepared according to Example 1, Example 3 and Example 4 was set as an experimental group.
  • a powder-type hemostat containing 3.0 wt% PVP and 10.0 wt% PVP was used.
  • the results for bleeding time are shown in FIG. 22 .
  • the bleeding time of the control group was about 5 minutes and 31 seconds
  • the positive control group, ARISTA-AH was about 2 minutes and 55 seconds.
  • the speed of hemostasis was 2-3 times faster than that of conditions without it.
  • chitosan/starch powder type hemostat containing 3 wt% PVP/CaCl 2 /thrombin was the fastest showed speed. It seems that the powder was not lost along with bleeding during the hemostasis process and was well adhered to the tissue, so that the bleeding was stopped in a short time.
  • the results of blood loss are shown in FIG. 23 .
  • the control group and ARISTA-AH were 3439.8 mg and 1533.6 mg, respectively, the chitosan/starch powder type hemostat in the experimental group was 1202.8 mg, and the chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin was 606.2 mg, 3wt%.
  • Chitosan/starch powder-type hemostat containing PVP/CaCl 2 /thrombin and chitosan/starch powder-type hemostat containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin obtained 273 mg and 974.2 mg, respectively.
  • the control group and ARISTA-AH are 637.5 mg/min and 459.64 mg/min
  • the experimental group is chitosan/starch powder type hemostat, chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin, 3 wt% PVP/ Chitosan/starch powder-type hemostat containing CaCl 2 /thrombin and chitosan/starch powder-type hemostat containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin were 449.91 mg/min, 291.81 mg/min, 157.13 mg/min, and 404.15 mg, respectively. The value of /min was shown.
  • blood coagulation accelerators help to form clots, they can prevent re - bleeding, but they do not form hard fibrin, so they are easily removed along with the powder.
  • hemostatic agents effective hemostasis was possible based on appropriate adhesiveness and high absorption rate, so re-bleeding did not occur.
  • chitosan/starch powder type hemostat containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin with excessive adhesiveness is removed together with the blood clot generated due to tissue and strong adhesion in the process of removal after spraying saline, so it can be re-removed. It seems that bleeding occurs and the hemostatic effect is reduced. Through this, it was confirmed that the chitosan/starch powder type hemostatic agent containing 3wt% PVP/CaCl 2 /thrombin had better hemostatic ability than commercially available ARISTA-AH.
  • hematoxylin, a basic dye, and eosin, an acidic dye are sequentially stained to stain cell nuclei in blue, and cytoplasm, cell membranes, red blood cells, and collagen are stained in red.
  • the collected tissue is first put into a 10% formalin solution to fix it, and then washed with a xylene solution. Thereafter, the tissue was put in paraffin, solidified, and then thinly sectioned with a microtome to a thickness of 5 ⁇ m, washed twice in xylene for 10 minutes for deparaffinization, and then dipped in alcohol for 5 minutes to remove xylene. After alcohol washing, proceed with hematoxylin staining in hematoxylin solution for 8 minutes, and then wash in running water for 5 minutes.
  • (A) is a control group
  • (B) is ARISTA-AH
  • (C) is a chitosan/starch powder type hemostat
  • (D) is a chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin
  • (E) is a chitosan/starch powder-type hemostat containing 3wt% PVP/CaCl 2 /thrombin
  • (F) is an H&E staining result of a chitosan/starch powder-type hemostat containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin. Referring to FIGS. 25A to 25F , it was confirmed that the wound area was stained red due to red blood cell aggregation.
  • A is a control group
  • B is ARISTA-AH
  • C is a chitosan/starch powder type hemostatic agent
  • D is CaCl 2 /thrombin-containing chitosan/starch powder type hemostat
  • E is chitosan/starch powder type hemostatic agent containing 3wt% PVP/CaCl 2 /thrombin
  • F is chitosan containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin /starch This is the result of Carstair's staining of a powder-type hemostatic agent. Referring to FIGS. 26A to 26F , fibrin formed during hemostasis was confirmed through orange staining at the wound site under all conditions.
  • chitosan/starch powder type hemostat containing CaCl 2 /thrombin applied with CaCl 2 and thrombin chitosan/starch powder type hemostat containing 3wt% PVP/CaCl 2 /thrombin, than control group and ARISTA-AH
  • chitosan/starch powder type hemostatic agent containing 10wt% PVP/CaCl 2 /thrombin was applied, clearer red blood cell aggregation was observed at the bleeding site. This seems to be the result of platelet aggregation of Ca 2+ ions and rapid hemostasis of thrombin.

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Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 천연고분자를 사용하여 생체적합성이 우수하고 가교 구조를 통해 혈액 흡수율이 높은 것에 특징이 있다. 또한 지혈물질을 포함함으로써 혈전 형성 속도가 빠르고, 많은 혈전이 형성되어 혈액응고능이 우수하고, 점착제를 포함함으로써 조직점착성을 높일 수 있으며, 우수한 지혈 효과를 제공한다.

Description

생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법
본 발명은 생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 천연고분자를 사용하여 생체적합성이 우수하고 가교 구조를 통해 혈액 흡수율이 높은 것에 특징이 있다. 또한 지혈물질을 포함함으로써 혈전 형성 속도가 빠르고, 많은 혈전이 형성되어 혈액응고능이 우수하고, 점착제를 포함함으로써 조직점착성을 높일 수 있으며, 우수한 지혈 효과를 제공한다.
혈액은 혈관 내에 존재하는 외상이나 내부출혈로 인해 혈관 밖으로 방출되게 되는데 이를 출혈이라고 한다. 출혈이 발생하게 되면 혈액 손실을 막기 위해 지혈과정이 일어난다. 지혈과정은 크게 1차 지혈, 2차 지혈로 분류되는데 출혈이 발생하게 되면 제일 먼저 혈관 수축으로 혈류의 흐름을 방해하고 vWF (von Willebrand factor)의 도움으로 혈소판이 혈관내벽에 부착되며 응집하여 1차 지혈마개(platelet plug)를 형성하게 되는데 이를 1차 지혈이라고 한다. 이와 동시에 여러 종류의 혈액응고인자들의 연속적인 활성화로 불용성 섬유소(fibrin)가 만들어지고 최종적으로 2차 지혈마개(hemostatic plug)가 형성되면서 2차 지혈이 이루어진다.
지혈방법에는 기계적 방법(mechanical method), 냉온 방법(cold/hot method), 화학적 방법(chemical method)이 있다. 가장 기본이 되는 기계적 방법에는 거즈나 솜을 이용하여 출혈 부위를 직접적으로 눌러주거나 자상이나 열상에 의한 출혈에는 봉합사, 클램프, 클립과 같은 기구를 사용하여 출혈을 멈출 수 있으며, 골 출혈의 경우 bone wax를 이용하는 방법이 있다. 냉온 방법의 경우 체온을 낮춰 출혈부위로 가는 혈액을 억제하는 냉찜질 방법과 고주파 전기적 에너지를 이용한 전기수술기중 하나인 전기소작기를 활용하여 조직에 열을 가하여 조직을 응고시켜 지혈하는 방법이 있다.
화학적 방법에는 대표적으로 지혈제가 존재한다. 지혈제는 크게 피부, 점막에 바르면 피막을 형성하는 수렴작용에 의해 직접적인 출혈을 억제해주는 수렴제, 출혈 발생 시 혈액응고 과정에 관여하는 여러 인자들을 약물로 사용하여 혈액응고를 촉진하는 혈액응고 촉진제, 혈액응고 과정에서 생긴 피브린 섬유소의 분해를 막아 지혈을 돕는 항섬유소용해제, 출혈로 인해 손실된 혈액을 직접적으로 흡수하여 혈액에 존재하는 혈구의 농도를 높여 빠른 지혈을 도와주는 국소 지혈제가 있다.
국소지혈제의 형태는 스펀지(sponge), 시트(sheet), 하이드로젤(hydrogel), 바(bar), 파우더(powder) 등 다양한 형태로 제작된다. 스펀지, 시트 형태의 지혈제는 넓은 상처에 적용이 가능하며 많은 양의 혈액을 흡수할 수 있지만 사용할 때 상처 크기에 맞게 잘라서 사용해야 하며 접착성이 약하다는 단점을 가지고 있다. 하이드로젤 형태의 지혈제는 고분자 사슬들 간의 망상구조로 인해 많은 양의 물을 흡수할 수 있으며 불규칙한 표면에 적용이 가능하며 점착성이 우수하지만 수분을 많이 가지기 때문에 바이러스나 미생물이 쉽게 번식하여 감염이 일어날 수 있다.
파우더형 지혈제는 다른 지혈제에 비해 표면적이 크기 때문에 혈액과 접촉면적이 넓어져 빠른 지혈을 가능하게 한다. 그러나 파우더 자체의 성질상 지혈에 참여하지 않고 상처 주변에 있는 파우더로 인해 지저분하며 응집되지 못하면 쉽게 날아가고 점착력이 낮기 때문에 넓은 상처부위에 적용하기 어려우며 가공 기술로 인한 지혈제 가격 또한 비싸다. 현재 판매중인 파우더형 지혈제는 막을 형성하여 출혈을 일시적으로 막아주어 지혈을 하는 방식으로, 막을 제거할 경우 출혈이 다시 일어날 수 있으며 혈액 양이 많은 경우 막이 조직에 제대로 붙어있지 못하여 혈액과 함께 소실된다는 단점을 가지고 있다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로써, 천연고분자를 사용하여 생체적합성이 우수하고 가교 구조를 통해 혈액 흡수율이 높은 파우더형 지혈제 및 그의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
또한 지혈물질을 포함함으로써 혈전 형성 속도가 빠르고, 많은 혈전이 형성되어 혈액응고능이 우수한 파우더형 지혈제를 제공하는 것에 있다.
또한 점착제를 포함함으로써 조직점착성을 높일 수 있으며, 우수한 지혈 효과를 갖는 파우더형 지혈제를 제공하는 것에 있다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면은,
제1 고분자; 제2 고분자; 및 가교제;를 포함하고, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 생체적합성 고분자이고, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 지혈제가 제공된다.
상기 생체적합성 고분자는 키토산, 녹말, 셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 콜라겐, 폴리비닐알코올(PVA), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산 및 폴리말레인산키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 제1 고분자는 키토산을 포함하고, 상기 제2 고분자는 녹말을 포함할 수 있다.
상기 가교제는 글리옥살(glyoxal), 글루타알데히드(glutaraldehye), 시트르산(citric acid), N,N-메틸렌 비스아크릴아마이드(N,N-methylene bisacrylamide), 디알데하이드(dialdehyde), 옥살릭액시드(oxalic acid) 및 시트르산(citric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 파우더형 지혈제는 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP), 풀루란(pullulan) 및 도파민(dopamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 파우더형 지혈제 전체 100 중량부 대비 상기 점착제의 함량은 0.5 내지 15 중량부일 수 있다.
상기 칼슘화합물은 염화칼슘, 질산칼슘, 탄산칼슘, 아세트산칼슘, 탄산칼슘, 황화칼슘, 탄화칼슘 및 인산칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 지혈물질은 트롬빈, 프로트롬빈, 트롬보플라스틴, 피브리노겐, 아프로티닌, 비타민 C 및 비타민 K로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, (a) 제1 고분자 용액과 제2 고분자 수용액을 각각 제조하고, 이들을 혼합하여 제1 혼합용액을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합용액에 가교제를 투입하여 제1 고분자 및 제2 고분자가 가교결합된 가교물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 가교물을 동결건조한 후, 분쇄하여 파우더형 지혈제를 제조하는 단계;를 포함하는 파우더형 지혈제의 제조방법이 제공된다.
상기 단계 (b)와 단계 (c) 사이에, (b') 상기 가교물과 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 용액을 혼합하여 제2 혼합용액을 제조하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단계 (c)는 (c') 상기 제2 혼합용액을 동결건조한 후 분쇄하여 파우더형 지혈제를 제조하는 단계;일 수 있다.
상기 단계 (c)의 동결건조 후, 질소 가스 조건에서 냉각하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 파우더형 지혈제는 천연고분자를 사용하여 생체적합성이 우수하고 가교 구조를 통해 혈액 흡수율이 높은 효과가 있다.
또한 본 발명의 파우더형 지혈제는 지혈물질을 포함함으로써 혈전 형성 속도가 빠르고, 많은 혈전이 형성되어 혈액응고능이 우수한 효과가 있다.
또한 본 발명의 파우더형 지혈제는 점착제를 포함함으로써 조직점착성을 높일 수 있으며, 우수한 지혈 효과를 갖는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 파우더형 지혈제의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 2는 실시예 1에 따른 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 Chitosan/starch 함량비 조절에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 가교시간에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프로, (a)는 2시간, (b)는 4시간, (c)는 12시간, (d)는 24시간, (e)는 72시간이다.
도 4는 실시예 1에서 가교제 함량에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프로, (a)는 1000㎕, (b)는 500㎕, (c)는 100㎕, (d)는 50㎕, (e)는 25㎕, (f)는 10㎕이다.
도 5는 실시예 1에 따른 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 입자 크기에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프로, (a)는 250-500μm, (b)는 125-250μm, (c)는 0-125μm이다.
도 6은 FTIR 분석 결과로, (A)는 키토산, (B)는 녹말, (C) 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 FTIR 스펙트럼이다.
도 7은 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제(Freeze dry), Pure PVP 및 실시예 2에 따라 제조된 15wt% PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 점착성을 비교한 그래프이다.
도 8은 실시예 2에 따라 제조된 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 PVP 농도에 따른 점착성을 비교한 그래프이다.
도 9는 실시예 2에 따라 제조된 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 PVP 농도에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 CaCl2 농도에 따른 피브린 형성 시간을 나타낸 그래프이다.
도 11은 트롬빈 농도에 따른 피브린 형성 시간을 나타낸 그래프이다.
도 12 a1 내지 i2에서 (A)는 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (B)는 실시예 3에 따라 제조된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (C) 내지 (I)는 실시예 4에 따라 제조된 PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 SEM 이미지로, (C) 내지 (I)는 PVP 농도가 각각 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15 wt%이다.
도 13 a 및 도 13 b에서 (A)는 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (B)는 실시예 3에 따라 제조된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 EDS 분석 결과이다.
도 14는 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 전혈응고실험(Lee-White법) 결과이다.
도 15는 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 전혈응고실험(Imai-Nose법) 결과이다.
도 16은 실시예 1 및 실시예 2에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 적혈구 용혈 실험 결과이다.
도 17은 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 적혈구 용혈 실험 결과이다.
도 18은 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 혈장 재칼슘화 시간(PRT) 측정 실험 결과이다.
도 19는 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 MTT assay를 통한 세포 독성 실험 결과이다(용출 조건: 1mg/㎖).
도 20은 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 MTT assay를 통한 세포 독성 실험 결과이다(용출 조건: 5mg/㎖).
도 21은 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 MTT assay를 통한 세포 독성 실험 결과이다(용출 조건: 10mg/㎖).
도 22는 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 In vivo 동물실험을 통한 지혈능 평가(출혈 시간) 결과이다.
도 23은 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 In vivo 동물실험을 통한 지혈능 평가(출혈량)에 대한 결과이다.
도 24는 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 In vivo 동물실험을 통한 지혈능 평가(시간당 출혈량)을 계산한 결과이다.
도 25a 내지 도 25f는 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 H&E 염색 결과이다.
도 26a 내지 도 26f은 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 Carstair's 염색 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.
덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 지혈제는 출혈 증상에 대하여 출혈을 멈추게 할 목적으로 사용되는 약제를 의미하며, 바람직하게는 분말(powder)의 형태로 출혈이 발생한 인체의 어떠한 부위에도 모두 사용 가능하다.
도 1은 본 발명의 파우더형 지혈제의 구조를 나타낸 개략도이다. 이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 파우더형 지혈제에 대해 설명하도록 한다.
본 발명은 제1 고분자; 제2 고분자; 및 가교제;를 포함하고, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 생체적합성 고분자이고, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 지혈제를 제공한다.
상기 생체적합성 고분자는 키토산, 녹말, 셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 콜라겐, 폴리비닐알코올(PVA), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산 및 폴리말레인산키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 제1 고분자는 키토산을 포함하고, 상기 제2 고분자는 녹말을 포함할 수 있다.
키토산(chitosan)은 게나 새우와 같은 갑각류로부터 추출한 키틴을 진한 알칼리 용액 중에서 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 키토산은 생체의료용 재료로서 생체적합성, 생분해성, 무독성, 비면역성 등의 특징을 가지고 있으며, 세균 및 곰팡이의 발육을 저지시킬 수 있는 자기 멸균성을 가지고 있다. 또한 키토산은 양이온성 고분자로서 점막 접착 특성을 가지고 있으며 아미로글루코스(aminoglucose)에서 나오는 양이온의 존재로 음전하를 띤 혈소판 및 적혈구와의 상호작용으로 인해 출혈시 혈전을 형성할 수 있다.
녹말(starch)은 글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 연결된 수많은 포도당 단위로 구성된 고분자로서 인간의 식단에서 가장 흔한 탄수화물이면서 감자, 옥수수, 쌀, 밀, 카사바와 같은 주식에 다량 함유되어 있다. 녹말은 일반적으로 20-25% 아밀로스(amylose)와 75-80% 아밀로펙틴(amylopectin)으로 이루어져 있으며 가격이 저렴하고 키토산과 마찬가지로 생체적합성, 무독성, 생분해성이 뛰어나다. 또한 녹말은 80℃ 물에 녹여서 사용하며 물에 녹았을 경우 물을 흡수하여 점도를 증가시키는 특성을 가진다. 혈액의 점도를 증가시키고 혈구들의 농도를 증가시켜 우수한 지혈 효과를 제공할 수 있다.
상기 가교제는 글리옥살(glyoxal), 글루타알데히드(glutaraldehye), 시트르산(citric acid), N,N-메틸렌 비스아크릴아마이드(N,N-methylene bisacrylamide), 디알데하이드(dialdehyde), 옥살릭액시드(oxalic acid) 및 시트르산(citric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글리옥살을 포함할 수 있다.
가교제는 선형구조의 고분자 단량체 분자 사이를 화학결합으로 결합시켜서 3차원 망상구조의 고분자 화합물로 만드는 물질을 의미한다. 가교제를 투입함으로써 생체 고분자 화합물들이 공유결합, 수소결합, 반데르발스 결합 및 물리적 결합에 의해 서로 가교가 될 수 있다. 이에, 키토산의 점막 접착성, 지혈 특성과 녹말에 의해 점성이 향상되어 생체 적합성과 혈액 흡수율이 우수한 지혈제로의 성능을 제공할 수 있다.
글리옥살은 현존하는 가장 작은 dialdehyde 그룹을 가지고 있으며, 다당류에 존재하는 hydroxyl 그룹과 산 촉매하에 acetal 결합이나 hemiacetal 결합을 형성하고, primary amine과 shiff base 결합을 형성하는 가교제이다.
상기 파우더형 지혈제는 상기 제1 고분자 및 제2 고분자를 포함하고, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자가 상기 가교제에 의해 가교결합되어 있는 입자들로 이루어져 있다.
상기 파우더형 지혈제는 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP), 풀루란(pullulan) 및 도파민(dopamine) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 PVP를 포함할 수 있다.
PVP는 위장관(gastrointestinal tract)이나 점막(mucous membrane)을 통해 흡수되지 않기 때문에 무독성 합성고분자이며, 물과 극성용매에 용해되는 분말로서 흡수된 물이 증발한 후에 피막을 형성하는 성질을 가지고 있다. 또한 PVP는 FDA에 승인된 재료로써 생체재료나 화장품, 합성세제 등 일상생활에서도 광범위하게 사용된다. PVP의 다른 특성으로는 우수한 접착 능력이 있다. 이는 PVP의 극성으로 인해 다른 분자를 끌어당기는 힘이 강하기 때문이다.
상기 파우더형 지혈제 전체 100 중량부 대비 상기 점착제의 함량은 0.5 내지 15 중량부일 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 7중량부일 수 있다.
본원의 일 실시예에 따르면, 상기 점착제가 PVP를 포함할 수 있고, 파우더형 지혈제를 제조하기 위해 PVP 용액 제조 시 PVP 수용액 100 mL 대비 상기 PVP의 함량은 0.5 내지 15 mL 일 수 있다.
상기 칼슘화합물은 염화칼슘, 질산칼슘, 탄산칼슘, 아세트산칼슘, 탄산칼슘, 황화칼슘, 탄화칼슘 및 인산칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘(CaCl2)을 포함할 수 있다.
상기 지혈물질은 트롬빈, 프로트롬빈, 트롬보플라스틴, 피브리노겐, 아프로티닌, 비타민 C 및 비타민 K로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 트롬빈을 포함할 수 있다.
CaCl2는 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시켜주고, 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 활성화 시켜주는 대표적인 혈액응고 촉진 인자이다.
본 발명은 혈액과 접촉 시 혈액응고능을 향상시키기 위해 혈액응고 촉진 약물인 트롬빈(thrombin)과 CaCl2를 사용하여 Ca2+ 이온을 도입하였다. Ca2+ 이온은 체내에도 존재하며 프로트롬빈(prothrombin)을 트롬빈(thrombin)으로 활성화시켜 주며, 트롬빈(thrombin)은 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 활성화시켜 혈전형성에 관여한다.
상기 입자의 크기는 1 내지 500μm일 수 있으며, 바람직하게는 125 내지 250μm일 수 있다.
상기 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질은 상기 입자의 표면에 코팅될 수 있다.
이하, 본 발명의 파우더형 지혈제의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.
먼저, 제1 고분자 용액과 제2 고분자 수용액을 각각 제조하고, 이들을 혼합하여 제1 혼합용액을 제조한다(단계 a).
상기 단계 (a)의 제1 혼합용액에서 제1 고분자와 제2 고분자의 중량비는 1 내지 7:7 내지 1일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3:3 내지 1일 수 있다.
다음으로, 상기 제1 혼합용액에 가교제를 투입하여 제1 고분자 및 제2 고분자가 가교결합된 가교물을 제조한다(단계 b).
상기 단계 (b)에서 상기 제1 혼합용액 100 부피부 대비 상기 가교제의 함량은 5 내지 500 부피부일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 30 부피부일 수 있다.
상기 단계 (b)에서 가교반응은 2 내지 72시간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 15시간 동안 수행될 수 있다.
마지막으로, 상기 가교물을 동결건조한 후, 분쇄하여 파우더형 지혈제를 제조한다(단계 c).
상기 단계 (b)와 단계 (c) 사이에, (b') 상기 가교물과 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 용액을 혼합하여 제2 혼합용액을 제조하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단계 (c)는 (c') 상기 제2 혼합용액을 동결건조한 후 분쇄하여 파우더형 지혈제를 제조하는 단계;일 수 있다.
상기 단계 (c)의 동결건조 후, 질소 가스 조건에서 냉각하는 단계를 더 포함할 수 있다.
질소 가스 조건에서 냉각을 하는 경우, 다공성의 구조를 유지하면서 파우더를 형성할 수 있는 효과를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
< 실시예 >
실시예 1: chitosan/starch 파우더형 지혈제의 제조
2% 아세트산(acetic acid) 수용액 100mL에 키토산(low molecular weight 50,000 ~ 190,000 Da, Sigma-Aldrich社))을 녹여 키토산 용액을 제조하고, 증류수 100 mL를 80℃로 가열하고 녹말(Daejung社)을 녹여 녹말 용액을 제조하였다. 상기 키토산 용액과 녹말 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액에서 키토산과 녹말의 함량의 중량비는 1.25:0.75(≒1.67:1)이다.
상기 혼합용액에 가교제로 글리옥살(Sigma-Aldrich社)을 넣어주어 12시간 동안 가교반응을 하였다. 12시간 반응 후, 미반응 가교제 제거와 키토산 및 녹말이 가교된 가교물을 얻기 위해 chitosan/starch 수용액을 500mL 아세톤(acetone)에 침전시켜 30분 동안 교반하였다. 그 후 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물과 acetone을 분리하여 상층액과 분리한 뒤, 다시 침전물을 500mL acetone에서 1회, 500mL 증류수에서 1회, 총 2회 용매 교환 후 원심 분리를 통해 최종적으로 swelling 된 침전물을 얻었다. 얻어진 swelling 된 침전물은 예비 동결 후 동결 건조를 하였다. 동결 건조된 샘플은 액체 질소를 이용하여 급냉한 후 막자사발을 통해 분쇄하여 chitosan/starch 파우더형 지혈제를 제조하였다.
실시예 2: PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 제조
실시예 1에서 상기 용매 교환이 완료된 샘플을 원심 분리하고, 원심 분리한 샘플에 PVP 수용액(molecular weight ~ 1,300,000 Da, Sigma-Aldrich社)을 1:1 v/v%으로 넣어준 뒤 vortex mixer를 사용하여 혼합하였다. 이후 -80℃ 초저온냉동고에서 예비 동결 후 동결 건조하였다. 동결 건조된 샘플을 액체 질소를 이용하여 급냉한 후 막자사발을 통해 분쇄하여 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제를 제조하였다.
실시예 3: CaCl2/트롬빈을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 제조
Platelet-Poor-Plasma(PPP)를 이용한 피브린 형성 시간을 측정하여(실험예 5 참조) CaCl2 용액과 트롬빈 용액의 농도를 각각 20 mM과 100 ㎍/㎖로 설정하였다. CaCl2 용액과 트롬빈 용액을 혼합하여 CaCl2/트롬빈 용액을 제조하였다.
*실시예 1에서 상기 용매 교환이 완료된 샘플을 원심 분리하고, 원심 분리한 샘플에 상기 CaCl2/트롬빈 용액을 1:1 v/v%으로 넣어준 뒤 vortex mixer를 사용하여 혼합하였다. 이후 -80℃ 초저온냉동고에서 예비 동결 후 동결 건조하였다. 동결 건조된 샘플을 액체 질소를 이용하여 급냉한 후 막자사발을 통해 분쇄하여 CaCl2/트롬빈을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제를 제조하였다.
실시예 4: PVP/CaCl2/트롬빈을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 제조
Platelet-Poor-Plasma(PPP)를 이용한 피브린 형성 시간을 측정하여(실험예 5 참조) CaCl2 용액과 트롬빈 용액의 농도를 각각 20 mM과 100 ㎍/㎖로 설정하였다. CaCl2 용액에 PVP를 녹인 후 트롬빈 용액을 첨가하여 PVP/CaCl2/트롬빈 용액을 제조하였다.
실시예 1에서 상기 용매 교환이 완료된 샘플을 원심 분리하고, 원심 분리한 샘플에 상기 PVP/CaCl2/트롬빈 용액을 1:1 v/v%으로 넣어준 뒤 vortex mixer를 이용하여 혼합하였다. 이후 -80℃ 초저온냉동고에서 예비 동결 후 동결 건조하였다. 동결 건조된 샘플을 액체 질소를 이용하여 급냉한 후 막자사발을 통해 분쇄하여 PVP/CaCl2/트롬빈을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제를 제조하였다.
< 실험예 >
실험예 1: chitosan/starch 파우더형 지혈제의 혈액 흡수율 측정
실험예 1-1: chitosan/starch 함량비 조절에 따른 혈액 흡수율 측정
실시예 1에 따른 chitosan/starch 파우더형 지혈제 0.1g에 혈액을 흡수시켜 파우더가 더 이상 흡수할 수 없을 때의 무게를 최대 흡수율로 간주하여 최적의 함량비를 결정하였다. 흡수율(Absorption rate)은 아래 식 1로 계산하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[식 1]
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상기 식 1에서, W0는 파우더의 최초 무게, Wmax는 최대로 흡수했을 때의 파우더 무게이다.
도 2를 참조하면, 키토산과 녹말의 함량비가 1.25:0.75(≒1.67:1)일 때 흡수율이 855%으로 최대 흡수율을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1-2: 가교시간에 따른 혈액 흡수율 측정
*실시예 1에서 가교반응 시 가교시간이 길수록 가교반응이 일어나기에 충분한 시간을 제공해주기 위해 적절한 반응시간 설정을 위해 가교시간에 따른 혈액 흡수율을 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 가교시간이 (a)는 2시간, (b)는 4시간, (c)는 12시간, (d)는 24시간, (e)는 72시간이다.
도 3을 참조하면, 가교제인 글리옥살(glyoxal)을 넣은 후 초기 2시간에서는 충분한 가교가 이루어지지 않아 네트워크 구조를 제대로 이루지 못해 흡수율이 낮게 나온 것으로 예상되며, 반응이 진행될수록 네트워크 구조가 잘 형성되어 12시간에서 최대 흡수율인 806%를 관찰할 수 있었다. 그 이후로는 반응이 계속 될수록 흡수율이 감소하는 경향은 가교도가 올라감에 따라 고분자의 네트워크 간격이 좁아짐에 따라 흡수율이 낮아지는 것으로 보인다. 이를 통해 흡수율이 가장 좋은 12시간을 최적의 가교시간으로 설정하였다.
실험예 1-3: 가교제 함량에 따른 혈액 흡수율 측정
최적화된 가교시간(12시간)을 바탕으로 가교제 함량의 설정을 위해 흡수율을 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 가교제의 함량이 (a)는 1000㎕, (b)는 500㎕, (c)는 100㎕, (d)는 50㎕, (e)는 25㎕, (f)는 10㎕이다.
도 4를 참조하면, 가교제의 함량이 50㎕일 때 1202%로 가장 높은 흡수율을 보였다. 100, 500, 1000 ㎕의 경우 가교제 함량이 많을수록 가교도의 증가로 흡수율이 낮아지는 것으로 보이며, 10 ㎕의 경우 고분자 작용기에 비해 가교제의 양이 적어 가교가 충분히 이루어지지 않아 흡수율이 감소한 것으로 보인다.
실험예 1-4: 입자 크기에 따른 혈액 흡수율 측정
동결건조 후 분쇄를 통해 제작된 파우더는 파우더 특성상 입자 크기에 따른 혈액 흡수율 차이를 가진다. 분쇄된 파우더는 체로 걸러 125μm 이하, 125-250μm, 250-500μm의 입자 크기로 분류하고, 최적의 입자 크기를 결정하기 위해 입자 크기에 따른 파우더의 혈액 흡수율을 측정해 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 입자의 크기가 (a)는 250-500μm, (b)는 125-250μm, (c)는 0-125μm이다.
도 5를 참조하면, 입자의 크기가 125-250μm일 때 흡수율이 1040.8%로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 250-500μm와 0-125μm일 때의 흡수율은 각각 866.2%와 696.6%를 나타내었다. 흡수율을 바탕으로 입자의 크기가 125-250μm를 최적 입자 크기로 선정하였다.
실험예 2: chitosan/starch 파우더형 지혈제의 가교 확인
실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 가교 여부를 확인하기 위해 FTIR 투과법을 이용해 작용기를 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 (A)는 키토산, (B)는 녹말, (C) 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 FTIR 스펙트럼이다.
도 6을 참조하면, 가교 후 chitosan의 -NH2기와 glyoxal의 -OH기의 반응을 통해 1차 아민이 2차 아민이 되면서 1차 아민의 특정 피크인 1590 cm-1의 흡수강도가 줄어들고, -CH=N의 특성피크인 1635 cm-1의 흡수가 증가하였다. 또한 아세탈 반응으로 인한 시 -C-O-C기 형성으로 인해 가교된 chitosan/starch는 1020 cm-1의 피크가 증가하는 것을 확인하여 glyoxal에 의해 chitosan/starch 가교가 원활하게 이루어 진 것을 알 수 있었다.
실험예 3: PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 점착성 측정
가교된 chitosan/starch에 도입된 PVP의 농도에 따른 점착성의 영향을 확인하기 위해 TA instruments' DHR-±를 이용하여 점착성을 측정하였다. 측정조건으로 geometry (40 ㎜ parallel plate, Peltier plate Steel, 110258), stage temperature (37℃), angular frequency (10 rad/s), gap (3000 ± 500 ㎛)로 설정하였으며 실제 조직에서의 점착성을 보기 위해 porcine skin(250-300 ㎜)을 순간접착제를 이용하여 geometry에 부착하여 실험을 진행하였다. Geometry에 porcine skin을 부착시킨 후 0.1 g의 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제에 600 ㎕의 증류수를 흡수시킨 후, 파우더를 stage에 놓고 0.1 N의 힘을 주면서 파우더가 geometry에서 떨어질 때의 힘을 관찰하며 negative force 중 가장 낮을 때를 최대 점착력을 가지는 지점으로 보았다.
도 7은 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제(Freeze dry), Pure PVP 및 15wt% PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 점착성을 비교한 그래프이다.
도 7을 참조하면, PVP가 도입됨에 따라 점착성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
도 8은 실시예 2에 따라 제조된 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 PVP 농도에 따른 점착성을 비교한 그래프이다. 도 8을 참조하면, PVP 농도가 높아질수록 파우더의 점착성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. PVP가 적용되지 않은 파우더는 -0.28 N으로 점착력이 가장 낮으며, PVP 농도가 가장 높은 15 wt%의 점착력은 -2.38 N으로 PVP가 적용되지 않은 파우더보다 881% 높은 결과를 보였다.
실험예 4: PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 PVP 농도에 따른 혈액 흡수율 측정
도 9는 실시예 2에 따라 제조된 PVP를 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 PVP 농도에 따른 혈액 흡수율을 나타낸 그래프이다. 도 9를 참조하면, 초기 PVP 도입은 수분과 혈액 도입으로 PVP 막이 형성되면서 오히려 흡수를 방해하는 것을 확인할 수 있었다. 3.0-7.0 wt%의 경우 PVP 막의 형성과 함께 수분을 흡수한 파우더의 점도가 함께 상승하면서 수분을 담지할 수 있는 능력이 상승하는 것을 확인하였다. 10.0 wt% 이후는 과도한 PVP 막 형성으로 인해 파우더와 수분/혈액의 접촉을 차단하게 되어 흡수율이 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 5: 최적의 CaCl2 및 트롬빈 농도 설정
파우더에 적용할 혈액응고촉진 인자의 농도를 정하기 위해 혈액실험을 통해 CaCl2와 트롬빈 농도를 정하였다. 항응고제가 포함되어 있는 개의 1,2형 전혈을 1200 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액인 Platelet-Rich-Plasma (PRP)를 얻었다. PRP를 다시 20분간 원심 분리하여 최종적으로 Platelet-Poor-Plasma (PPP)를 얻어 plasma recalcification time 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 PPP는 냉장상태로 보관하면서 수시간 이내에 사용하였다.
먼저 시계접시를 받칠 스테인리스 튜브 랙을 넣고 시계접시의 바닥이 잠길 정도의 물을 항온수조에 채워 37℃로 유지하였다. 이후 시계접시를 랙 위에 10분 동안 올려두어 온도를 맞춰준 뒤 실험을 진행하였다. 300 ㎕의 CaCl2 용액을 시계접시에 올리고 그 위에 PPP 300 ㎕를 도입하여 섞어주고 피브린 형성 시간을 측정하였다. 피브린 형성 여부를 확인하기 위해 200 ㎕ 피펫팁의 끝을 구부려 혈액응고촉진 인자가 도입된 PPP를 들어올려 확인하였다. 피브린 형성 시간이 가장 짧은 CaCl2 농도를 최적으로 설정한 뒤 이를 바탕으로 트롬빈의 최적 조건을 설정하였다.
CaCl2 농도에 따른 피브린 형성 시간을 도 10에 나타내었다. 도 10을 참조하면, CaCl2의 농도가 20 mM일 때 피브린 형성 시간이 239초로 가장 짧은 것을 확인할 수 있었다. Ca2+ 이온의 농도가 낮을 경우 피브린 형성에 제대로 관여하지 못하며, Ca2+ 이온의 농도가 높을 경우 피브리노겐에서 피브린으로 활성화되는 것을 지연시켜 V자 형태를 나타내었다.
이어서 최적 CaCl2 농도를 적용하여 트롬빈의 최적 농도를 결정하였다. 도 11은 트롬빈 농도에 따른 피브린 형성 시간을 나타낸 그래프이다. 도 11을 참조하면, 트롬빈의 농도가 높아질수록 피브린 형성 시간이 짧아지지만 100 ㎍/㎖보다 높은 농도에서는 0.13초와 비슷한 값의 피브린 형성 시간을 나타내었다.
따라서 최적조건으로 20 mM의 CaCl2와 100 ㎍/㎖의 트롬빈을 chitosan/starch 파우더에 도입하였다.
실험예 6: 파우더형 지혈제의 형태 및 특성 분석
실험예 6-1: 파우더형 지혈제의 형태 관찰
파우더형 지혈제의 형태 및 미세구조를 관찰하기 위해 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM, JSM-6380. Japen)을 이용하였다. 주사전자현미경은 샘플의 표면을 전자빔을 통해 스캔하여 이미지화 시켜주는 전자 현미경의 일종으로 고속의 전자를 발사하면 전자가 시료표면에 충돌하면서 상호작용하여 시료에서 전자와 같은 물질이 튀어나오는 것을 분석하는 방법이다. 고분자의 경우 전도성이 없는 재료가 많기 때문에 관찰하기 전에 sputter coater (108 auto, degree of vacuum : 10 Pa 미만, Cressington Scientific Instruments Inc. UK)를 이용하여 샘플에 백금을 코팅하여 전도성을 부여하였다. 코팅을 통해 정확한 SEM 이미지를 관찰할 수 있었으며 가속 전압(10 kV), 작동거리(15 ㎜) 조건으로 관찰하였다.
도 12a1 내지 도 12i2에서의 (A)는 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (B)는 실시예 3에 따라 제조된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (C) 내지 (I)는 실시예 4에 따라 제조된 PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 SEM 이미지로, (C) 내지 (I)는 PVP 농도가 각각 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15 wt%이다.
실험예 6-2: EDS 원소 분석
혈액응고촉진을 위해 도입한 CaCl2와 트롬빈을 확인하기 위해 Energy-dispersive X-ray spectroscopy(EDS)를 이용하여 실시예 3에 따라 제조된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제 표면의 원소를 분석하였다. 원소분석을 통해 CaCl2의 Ca2+와 트롬빈의 아미노산 구조 중 시스테인(systeine)과 메티오닌(methionine)에 있는 S을 확인하여 파우더 상의 혈액응고촉진 인자 도입 여부 및 분산정도를 확인하였다.
도 13a 및 도 13b 에서의 (A)는 실시예 1에 따라 제조된 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (B)는 실시예 3에 따라 제조된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 EDS 분석 결과이다. 도 13a 및 도 13b을 참조하면, 코팅한 CaCl2의 Ca2+이온은 표면상에서 6.48% 정도 함유되어 있는 것을 확인하였다. S 원소는 트롬빈에 존재하는 시스테인과 메티오닌의 비율이 적은 영향으로 검출되지 않은 것으로 예상된다. Ca2+이온을 노란색으로 EDS mapping한 결과 모든 입자에서 균일하게 분산되어 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 파우더형 지혈제의 in vitro 혈액응고 실험
실험예 7-1: 전혈응고실험(Lee-White & Imai-Nose method)
파우더형 지혈제의 혈액응고시간을 측정하기 위해 Lee-White법을 진행하였다. Lee-White법은 전혈을 유리 바이알 넣고 혈액이 유동성을 잃고 응고할 때의 시간을 혈액 응고시간으로 정하는 것이다. 대조군으로 파우더형 지혈제를 도입하지 않은 혈액 자체를 설정하였으며, 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제를 실험군으로 설정하였다. 바이알에 파우더형 지혈제 10㎎을 넣은 후, 1 ㎖의 전혈을 넣고 기울여 혈액이 더 이상 흐르지 않는 시간을 기록하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14를 참조하면, 혈액응고 촉진 인자인 CaCl2 및 트롬빈(thrombin)을 포함하는 조건의 경우 혈액응고 촉진 인자를 가지지 않은 조건보다 약 3.5배 정도 더 빠른 것을 확인하였다. PVP가 도입된 조건의 경우 PVP 7 wt%에서 36초로 가장 빠른 시간을 보였지만 다른 PVP 조건과 비교하였을 때 큰 차이를 가지지 않았다. 이를 통해 혈액응고촉진 인자의 도입으로 인해 파우더의 혈액응고능이 향상됨을 알 수 있었으며, PVP의 도입은 혈액응고능을 저해하지 않는 것을 확인하였다.
또한 파우더형 지혈제의 혈전 형성 능력을 확인하기 위해 Imai-Nose법을 실행하였다. 37℃로 설정된 항온수조에 스테인리스 원심관 튜브 랙을 두고 그 위에 시계접시를 올려두고 10분간 온도를 유지시켜 주었다. 이후 파우더형 지혈제 10 ㎎을 도입하고 혈액 200 ㎕를 넣어 섞어주면서 실험을 진행하였다. 대조군으로는 파우더를 적용하지 않고 혈전형성 능력을 관찰하였다. 혈액과 파우더의 반응시간은 1, 3, 5, 7, 10, 20분으로 각각 관찰하였으며 반응시간이 되면 증류수 5 ㎖ 첨가하여 혈액응고반응을 종료시켰다. 생성된 혈전을 분리하고, 35% 포름알데하이드(formaldehyde)로 10분간 고정하고 증류수에 담궈 5분간 세척한 뒤 24시간 건조시켰다. 이후 반응시간에 따른 혈전의 무게를 측정하였으며 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, 혈액응고인자가 도입됨에 따라 혈전형성의 정도가 대조군에 비해 약 7-8배 정도 차이를 보였으며, 혈액만을 사용한 대조군보다 혈액응고촉진 인자가 포함되지 않은 chitosan/starch 파우더형 지혈제가 혈전을 좀 더 잘 형성하는 것을 관찰하였다. 이는 가교된 chitsoan/starch 파우더가 혈액을 흡수하면서 잔존하는 혈액의 양을 줄여 혈액응고에 도움을 준 것으로 보인다. 또한 PVP 농도에 따른 혈전 형성을 관찰한 결과 PVP의 도입은 혈전의 형성을 저해하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 7-2: 적혈구 용혈 실험
적혈구 용혈 실험은 혈액응고 반응에 따라 잔존하는 적혈구를 정량하는 시험법으로, 적혈구가 용혈되면서 적혈구 내에 있던 헤모글로빈이 방출되게 되고 이때의 흡광도를 측정하여 혈액 응고능을 확인하였다.
먼저, 항온수조에 스테인리스 원심관 튜브 랙을 넣고 시계접시를 올려두었다. 시계접시 위에 5 ㎎의 파우더형 지혈제를 도입한 후 시계접시 바닥부분이 잠기도록 물을 채워주고 37℃로 10분간 온도를 유지시켜 주었다. 이후 혈액 200 ㎕를 도입하여 조심스럽게 섞어 응고반응을 개시하였다. 대조군으로는 파우더를 도입하지 않은 혈액만 200 ㎕을 시계접시에 넣어주었다. 반응시간은 1, 3, 5, 7, 10, 20분으로 설정하였으며 반응시간이 종료되면 증류수 5 ㎖를 첨가하여 혈액응고반응을 종료시키고 혈전과 파우더를 제거한 뒤 5분간 적혈구를 용혈 시켰다. 이후 상층액 1 ㎖와 증류수 4 ㎖를 첨가해 적혈구를 용혈시켜주고 이 과정을 1회 더 반복한 뒤 최종 용혈 용액을 96-well cell culture plate에 분주하였다. 적혈구 용혈에 의해 방출된 헤모글로빈을 측정하기 위해서는 540 ㎚가 가장 적합함으로 ELISA microplate reader를 이용하여 측정하였다. 측정된 흡광도의 세기를 비교하여 잔존하는 적혈구의 양을 확인하고 지혈능을 비교하였으며, 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 16 및 도 17을 참조하면, 혈액응고촉진 인자가 도입된 경우는 도입되지 않은 경우보다 약 18%정도 낮은 흡광도를 보였다. 이는 혈액응고반응으로 혈전을 형성하고 잔존하는 적혈구가 적은 것을 나타내며 많은 혈전이 생성된 것을 나타낸다. PVP 농도에 따른 잔존 적혈구에 의한 흡광도는 큰 차이가 없는 것으로 보아 PVP는 혈전 형성에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실험예 7-3: 혈장 재칼슘화 시간 측정
항응고제에 의한 탈 칼슘 처리된 혈장에 칼슘이온을 첨가하여 혈장단백질의 응고가 일어난다. 이를 이용해 파우더형 지혈제와 혈장단백질과의 상호작용을 알아 보기 위해 혈장 재칼슘화 시간(plasma recalcification time, PRT) 측정법을 실시하였다.
PRT 측정은 전혈을 원심분리하여 얻은 PPP에 칼슘이온을 재첨가한 뒤 피브린이 형성될 때까지의 시간을 측정하는 것으로, 파우더를 적용하지 않은 PPP를 대조군으로 하였으며 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제를 실험군으로 사용하였다. PPP는 항응고제가 포함되어 있는 전혈을 원심분리하여 얻었으며 분리된 PPP는 얼음 위에서 보관하면서 수 시간 이내에 사용하였다. 또한 항응고제가 포함되어있기 때문에 0.0125 M 농도의 CaCl2 용액을 첨가하여 항응고제를 억제시켜 주었다.
실험은 항온수조에 스테인리스 튜브 랙을 넣고 그 위에 시계접시를 올려둔 뒤 시계접시 밑 부분이 잠길 수 있도록 물을 조절하고 37℃ 온도를 적용시켜주었다. 이후 10분간 항온수조와 온도를 맞춰주며 시계접시 위에 20 ㎎의 파우더형 지혈제를 올려두고 PPP 300 ㎕와 0.025 M CaCl2 용액 300 ㎕를 도입하여 피브린 형성시간을 관찰하였다. 관찰 시 200 ㎕ 피펫팁 끝을 구부려 혈장을 들어 올리면서 피브린 형성을 관찰하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18을 참조하면, 혈액응고촉진인자를 포함한 경우는 포함하지 않은 경우보다 약 4-5배 정도 피브린 형성 시간이 빠른 것을 확인하였다. PVP가 도입된 조건은 1.0 wt%에서 54.66초로 PVP가 도입된 조건 중에서 피브린 형성 시간이 가장 오래 걸렸지만 다른 농도 조건과 큰 차이가 없기 때문에 PVP 도입이 피브린 형성을 저해시키지 않는 것을 확인하였다.
실험예 8: 파우더형 지혈제의 in vitro 생체적합성 평가(MTT assay를 통한 세포 독성 실험)
MTT assay를 통해 in vitro 세포 독성 평가를 진행하였다. 실험은 마우스의 섬유아세포(NIH/3T3 cell)를 사용하였으며, 파우더형 지혈제의 독성 여부를 관찰하기 위해 파우더를 배지에 용출시킨 용출배지를 사용하여 실험을 진행하였다.
실험방법은 먼저, 96-well cell culture plate의 well에 NIH/3T3 cell을 1 Х 104 cells씩 분주하여 37℃, 5% CO2 환경의 incubator에서 24시간 배양하였다. 용출배지는 배지 1 ㎖당 파우더형 지혈제 1, 5, 10mg을 적용하여 24시간 동안 용출시켰다. 24시간 후 96-well cell culture plate의 배지를 suction하여 각 well에 용출배지 100 ㎕씩 분주하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후 well에 있는 용출배지를 다시 suction 한 후, DMEM 배지(9) : MTT stock solution(1)로 만든 MTT 용액 50 ㎕를 넣어주고 1-4시간 반응시켜주었다. 1-4시간 이후 MTT 시약을 제거한 후 100 ㎕ DMSO를 넣어주어 불용성 포르마잔을 녹여 ELISA　microplate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정였으며, 그 결과를 도 19(용출 조건: 1mg/㎖), 도 20(용출 조건: 5mg/㎖) 및 도 21(용출 조건: 10mg/㎖)에 나타내었다.
도 19 내지 도 21을 참조하면, 1, 5 ㎎/㎖의 파우더형 지혈제를 용출한 배지의 경우 모든 군에서 80% 이상의 세포 생존율을 통해 세포 독성 1등급의 결과를 얻었다. 10 ㎎/㎖의 경우 PVP 1, 3 wt%를 제외하고 나머지 PVP 조건의 세포독성은 80 % 밑으로 세포의 생존율이 떨어진 것을 관찰하였는데 이는 PVP 함량이 높아짐에 따라 용출배지에 더 많은 PVP가 용출됨에 따라 세포에 영향을 준 것으로 보인다.
실험예 9: 파우더형 지혈제의 in vivo 동물실험
실험예 9-1: In vivo 동물실험을 통한 지혈능 평가
파우더형 지혈제의 지혈능을 평가하기 위해 7주령 SD rat(outbred male Sprague Dawley rat, 효창사이언스, 250-300 g)을 대상으로 실험을 진행하였다.
In vivo 동물실험을 진행하기 전 항온항습이 유지되는 실험실에서 적응기간을 거쳤다. SD rat은 No. 10 scalpel blade를 이용하여 2-3 ㎝ 복부를 절개하였으며 간에 폭 4 ㎜, 깊이 5 ㎜ 상처를 내 출혈을 유도하여 파우더형 지혈제를 적용하여 지혈을 하였다. 실험 후 사용된 쥐는 안락사를 시켰으며 출혈부위의 조직을 채취하였다. 실험은 아래와 같이 프로토콜을 따라 진행하였다.
(1) 마취제로 사용할 25 g avertin (2,2,2-tirbromoethanol)과 15.5 ㎖ tert-amyl alcohol (2-methyl-2-butanol)을 암실환경에서 12시간 혼합하여 avertin stock solution을 만든다.
(2) 사용 시에는 0.5 ㎖ avertin stock solution과 39.5 ㎖ 생리식염수를 혼합하여 사용하며 0.2 ㎖/10 g을 SD rat 복부에 주사하여 마취한다.
(3) 마취가 되면 복부의 털의 제모한다,
(4) 마취된 rat을 수술대에 고정시켜준 뒤 복부절개에 앞서 포비돈 용액을 이용하여 소독하고 No. 10 scalpel blade로 복부를 2-3 ㎝ 절개한다.
(5) 절개된 부위의 피부와 복막을 분리하여 클램프를 이용해 양측 상방으로 고정시켜 간을 꺼내고 무게를 미리 잰 필터페이퍼와 OHP 필름을 아래에 깔아둔다.
(6) 수술대의 각도를 45°로 기울이고 간 절개 시 직경 4 ㎜ disposable biopsy punch를 사용하여 균일한 크기로 출혈을 유도한다.
(7) 출혈이 확인되면 일회용 거즈와 50 g 추를 사용하여 30초간 압박지혈 후 파우더형 지혈제를 적용하고 15초 간격으로 지혈상태를 확인하며 완전히 지혈 될 때까지의 시간을 측정한다.
(7) 지혈이 완료되면 혈액을 흡수한 필터페이퍼, 파우더 및 일회용 거즈의 무게를 측정하여 출혈량을 계산한다.
대조군은 아무것도 도입하지 않은 상태로 설정하였으며 양성 대조군으로는 시중에 판매되고 있는 고흡수성 지혈제인 ARISTA-AH를 사용하였다. 또한 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제를 실험군으로 설정하였다. 실시예 4에 따라 제조된 파우더형 지혈제의 경우 3.0 wt% PVP 및 10.0 wt% PVP를 포함하는 파우더형 지혈제를 사용하였다.
출혈 시간에 대한 결과를 도 22에 나타내었다. 도 22를 참조하면, 대조군의 출혈시간은 약 5분 31초, 양성 대조군인 ARISTA-AH는 약 2분 55초, 실험군은 chitosan/starch 파우더형 지혈제, CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제 순서로 각각 2분 45초, 2분 15초, 1분 48초, 2분 37초의 결과를 나타내었다. 혈액응고 촉진 인자가 함유된 조건의 경우 그렇지 않은 조건에 비해 2-3배 정도 빠른 지혈속도를 가졌으며, 그중에서 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제가 가장 빠른 지혈속도를 보였다. 이는 지혈과정에서 출혈과 함께 파우더가 유실되지 않고 조직에 잘 점착함으로서 빠른 시간에 지혈된 것으로 보인다.
출혈량에 대한 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23을 참조하면, 대조군과 ARISTA-AH는 각각 3439.8 ㎎, 1533.6 ㎎, 실험군으로 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 1202.8 ㎎, CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 606.2 ㎎, 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제와 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 각각 273 ㎎, 974.2 ㎎의 결과를 얻었다. 대조군의 비해 혈액응고 촉진 인자가 도입된 경우 빠른 혈액응고를 통해 출혈이 적은 것으로 예상되며, PVP의 도입으로 파우더의 유실없이 조직에 잘 점착함으로서 지혈 할 수 있었던 것을 보인다. 하지만 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 경우 과도한 점착성으로 인해 파우더 제거 시 지혈과정에 생성된 혈전도 함께 제거됨으로서 재출혈이 발생하여 지혈시간 뿐만 아니라 출혈량도 증가한 것으로 보인다.
지혈시간과 출혈량을 바탕으로 시간당 출혈량을 계산한 결과를 도 24에 나타내었다. 도 24를 참조하면, 대조군 및 ARISTA-AH는 637.5 ㎎/min, 459.64 ㎎/min이며, 실험군으로 chitosan/starch 파우더형 지혈제, CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 각각 449.91 ㎎/min, 291.81 ㎎/min, 157.13 ㎎/min, 404.15 ㎎/min의 값을 나타내었다.
또한 PVP의 도입의 영향을 살펴보기 위해 초기 지혈이 완료된 후, 식염수를 뿌려주어 재출혈 여부를 확인하였다. 실험결과 대조군은 100%, ARISTA-AH는 80%, chitosan/starch 파우더형 지혈제, CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 각각 80%, 40%, 0%, 40%였다.
혈액응고 촉진 인자는 혈전 형성에 도움을 주기 때문에 재출혈을 방지할 수는 있지만 단단한 피브린 형성이 되지 않아 쉽게 파우더와 함께 제거되는 반면에 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 경우 적당한 점착성과 높은 흡수율을 바탕으로 효과적인 지혈을 할 수 있어 재출혈이 발생하지 않았다. 그렇지만 과도한 점착성을 가지는 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제는 식염수를 뿌려준 뒤 제거하는 과정에서 조직과 강한 점착으로 인해 생성된 혈전을 제거할 때, 함께 제거가 됨으로서 재출혈이 발생하여 지혈 효능이 떨어지는 것으로 보인다. 이를 통해 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제가 시판 중인 ARISTA-AH보다 우수한 지혈능을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 9-2: 조직 검사(histology)
동물실험 후 채취한 조직(간 조직)에서의 혈전 형성 정도를 평가하기 위해 조직 염색인 H&E 염색 및 carstairs's 염색을 진행하였다.
먼저, H&E 염색은 염기성 염색약인 헤마톡실린과 산성 염색약인 에오신을 순차적으로 염색하여 세포핵을 푸른색으로 염색시켜주고 세포질, 세포막, 적혈구 및 콜라겐은 붉은색으로 염색된다.
H&E 염색과정은 먼저 채취된 조직을 고정시키기 위해 10% 포르말린 용액에 넣어준 뒤 자일렌(xylene)용액으로 씻어준다. 이후 조직을 파라핀에 넣고 굳힌 후 마이크로톰으로 5 ㎛ 두께로 얇게 절편한 뒤 탈파라핀을 위해 10분 동안 2회 자일렌에 세척하고 이어서 자일렌을 제거하기 위해 알코올에 5분간 담구었다. 알코올 세척 후 헤마톡실린 용액에서 8분간 헤마톡실린 염색을 진행한 후 흐르는 물에서 5분간 세척한다. 세척이 완료되면 30초 동안 1% 산성 알코올(acid alcohol)에 넣어 이물질을 제거시켜 준 뒤, 다시 흐르는 물에 1분간 세척한 뒤 0.2% 암모니아수(ammonia water) 또는 포화 탄산리튬용액(saturated lithium carbonate solution)에서 30초에서 1분간 청색화(bluing)처리한다. 이후 흐르는 물에서 세척, 95% 알코올에 담근 후 에오신 용액에 30초에서 1분간 대조 염색을 진행하여 광학현미경을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 25a 내지 도 25f에 나타내었다. 도 25a내지 도 25f에서의 (A)는 대조군, (B)는 ARISTA-AH, (C)는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (D)는 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (E)는 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (F)는 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 H&E 염색 결과이다. 도 25a 내지 도 25f를 참조하면, 적혈구 응집으로 인해 상처부위가 붉은색으로 염색된 것을 확인하였다.
Carstair's 염색은 피브린은 주황색, 혈소판은 회색빛 푸른색, 적혈구는 노란색으로 염색시켜주어 지혈과정에서 형성되는 피브린 확인 및 지혈과정에서의 혈소판 응집을 확인할 수 있다. 실험방법으로 먼저 슬라이드를 증류수로 수화시켜준 뒤 5분간 5% ferric ammonium sulfate에 담궈 흐르는 물에 씻어준다. Mayer hematoxylin으로 5분간 염색하고 세척한 뒤 다시 Picric acid-orage G 용액에서 30분에서 1시간 동안 염색하고 증류수로 헹궈준다. 이후 ponceau fuchsin 용액에서 1-5분 동안 염색하고 다시 증류수로 세척하고 마지막으로 anilin blue 용액으로 염색 후 증류수로 세척한다. Carstair's 염색 결과를 도 26a내지 도 26f에 나타내었으며, 도 26a내지 도 26f의 (A)는 대조군, (B)는 ARISTA-AH, (C)는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (D)는 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (E)는 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, (F)는 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 Carstair's 염색 결과이다. 도 26a내지 도 26 f을 참조하면, 모든 조건에서 상처부위에 주황빛 염색을 통해 지혈과정에 형성되는 피브린을 확인하였다.
상처가 발생하면 상처에 혈소판의 응집이 일어나고 응집된 혈소판의 활성화로 인해 혈액응고인자들의 활성화로 피브린이 형성되고, 최종적으로 혈액 속의 혈구들이 엉기면서 혈전을 형성하여 지혈이 이루어진다. 조직염색을 통해 출혈부위의 피브린 형성 및 적혈구 응집을 확인할 수 있었다. 또한 대조군 및 ARISTA-AH보다 혈액응고촉진 인자인 CaCl2과 트롬빈이 적용된 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 3wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제, 10wt% PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제를 적용한 간 조직에서의 출혈부위에 더 선명한 적혈구 응집을 확인할 수 있었다. 이는 Ca2+이온의 혈소판 응집과 thrombin의 빠른 지혈로 인한 결과로 보인다. 또한 PVP가 도입된 PVP/CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제와 CaCl2/thrombin을 포함하는 chitosan/starch 파우더형 지혈제의 적혈구 응집과 피브린 형성 정도를 비교한 결과, 눈에 띄는 차이가 없는 것으로 보아 PVP가 적혈구 응집 및 피브린 형성과 같은 지혈과정을 저해시키지 않는다는 것을 확인하였다.
이상, 도면을 참조하여 바람직한 실시예와 함께 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였으나, 이러한 도면과 실시예로 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양한 변형예 또는 균등한 범위의 실시예가 존재할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 기술적 사상의 권리범위는 청구범위에 의해 해석되어야 하고, 이와 동등하거나 균등한 범위 내의 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 제1 고분자; 제2 고분자; 및 가교제;를 포함하고,
    상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 생체적합성 고분자이고,
    상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 지혈제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 키토산, 녹말, 셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 콜라겐, 폴리비닐알코올(PVA), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산 및 폴리말레인산키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 고분자는 키토산을 포함하고, 상기 제2 고분자는 녹말을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 가교제는 글리옥살(glyoxal), 글루타알데히드(glutaraldehye), 시트르산(citric acid), N,N-메틸렌 비스아크릴아마이드(N,N-methylene bisacrylamide), 디알데하이드(dialdehyde), 옥살릭액시드(oxalic acid) 및 시트르산(citric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 파우더형 지혈제는 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP), 풀루란(pullulan) 및 도파민(dopamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 파우더형 지혈제 전체 100 중량부 대비 상기 점착제의 함량은 0.5 내지 15 중량부인 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 칼슘화합물은 염화칼슘, 질산칼슘, 탄산칼슘, 아세트산칼슘, 탄산칼슘, 황화칼슘, 탄화칼슘 및 인산칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 지혈물질은 트롬빈, 프로트롬빈, 트롬보플라스틴, 피브리노겐, 아프로티닌, 비타민 C 및 비타민 K로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제.
  10. (a) 제1 고분자 용액과 제2 고분자 용액을 각각 제조하고, 이들을 혼합하여 제1 혼합용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 제1 혼합용액에 가교제를 투입하여 제1 고분자 및 제2 고분자가 가교결합된 가교물을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 가교물을 동결건조한 후, 분쇄하여 지혈제를 제조하는 단계;를
    포함하는 지혈제의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (b)와 단계 (c) 사이에,
    (b') 상기 가교물과 점착제, 칼슘화합물 및 지혈물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 용액을 혼합하여 제2 혼합용액을 제조하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 단계 (c)는
    (c') 상기 제2 혼합용액을 동결건조한 후, 분쇄하여 파우더형 지혈제를 제조하는 단계;인 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 동결건조 후, 질소 가스 조건에서 냉각하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 지혈제의 제조방법.
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