WO2023198898A1 - Procédé continu de croissance d' un microorganisme - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
Definitions
- the present invention refers to a process comprising a step (a) of continuous growth of a microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin.
- Vanillin can be obtained by different methods known to those skilled in the art, and in particular by the following two routes:
- a biotechnological process including in particular the cultivation of a microorganism capable of allowing the biotransformation of a fermentation substrate into vanillin.
- Such a process is known in particular from application EP0885968 in which the fermentation substrate is ferulic acid.
- US patent 5017388 describes a process in which the fermentation substrate is eugenol and/or isoeugenol. These processes result in the preparation of a vanillin called natural vanillin.
- vanillin can also be prepared according to a route described as “bio-based” in which the vanillin comes from lignin, we can cite in particular documents US 2745796, DE1132113 and the article entitled “Preparation of lignin from wood dust as vanillin source and comparison of different extraction method” by Azadbakht et al in International Journal of Biology and Biotechnology, 2004, vol 1, No 4, pp 535-537, or prepared from materials of natural origin, we can cite in particular document WO 2019/020773.
- the processes of the so-called natural route include the cultivation of a microorganism capable of transforming a substrate into vanillin.
- This stage is a phase of growth of the microorganism to obtain a biomass which will be used as a biocatalyst for the bioconversion phase of a substrate into vanillin.
- this growth phase is time-consuming and delicate. Indeed, it is generally necessary to inoculate a small quantity of microorganism contained in a cryotube, and to transfer it to a first fermenter of slightly larger volume to grow the microorganism. This step of growing the biomass and transferring it to a larger reactor can be repeated as many times as necessary. The total duration of this growth stage can be significant, for example around 72 hours. Furthermore, this growth stage must be carried out in a sterile environment. .An initial sterilization step of the fermenter(s) as well as all inlets and outlets of the fermenter(s) is required and must be carried out under specific conditions. The result is that on the one hand transfers from one fermenter to another present risks of contamination and on the other hand the implementation of this type of process is complex.
- the present invention aims at an efficient and industrial process for growing a microorganism in which the risk of contamination is reduced and whose productivity is improved.
- a first object of the present invention relates to a process comprising a step (a) of continuous growth of a microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin.
- the present invention also relates to a process for producing a compound of formula (I), preferably vanillin, characterized in that it comprises a step (a) of continuous growth of a microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably vanillin.
- Lig 2 Process for producing a compound of formula (I) according to the invention
- Lig 3 Process for producing a compound of formula (I) according to the invention
- Lig. 4 Process for producing a compound of formula (I) according to the invention detailed description
- the growth of a microorganism refers to a process in which said microorganism multiplies. Growth results in the production of biomass. Growth can be defined by the increase in biomass concentration.
- bioconversion refers to a biotechnological process in which a microorganism allows the transformation of a substrate into a bioconversion product.
- the microorganism may be a wild strain, genetically modified obtained by molecular biology or mutated, in particular by random or directed mutagenesis.
- process carried out under aseptic conditions refers to a process carried out under conditions free of any germs and/or microorganisms.
- process carried out in sterile conditions refers to a process carried out in conditions free of any germ and/or microorganism likely to be deleterious to the microorganism capable of transforming a substrate made of compound of formula (I), preferably vanillin, used in the context of the process of the present invention.
- asepsis or sterilization can be obtained by any method, in particular thermal, chemical, mechanical or by radiation, allowing the elimination of germs and/or microorganisms. Asepsis or sterilization can be carried out on the fluids, raw materials, and/or devices used as part of the process according to the present invention.
- Sterilization by dry or moist heat carried out by raising the temperature to a sufficient temperature, followed by maintaining this temperature for a sufficient period of time for the elimination of germs and/or microorganisms, for illustration purposes the temperature can be 121°C, then maintaining this temperature of 121°C for a sufficient time to eliminate germs, Membrane filtration or several successive membrane filtrations, the smallest cut-off diameter of which allows the elimination of any germs and/or microorganisms.
- reactor refers to a container capable of carrying out chemical reactions.
- the reactor can be used after having been sanitized or sterilized or without sanitized or sterilized.
- the term “fermentation” refers to any biological reaction involving a microorganism such as bacterial growth, bioconversion, biosynthesis or biocatalysis.
- the term “fermenter” refers to a reactor capable of carrying out fermentations, for example a bioreactor.
- the fermenter can be used after having been sanitized or sterilized or without sanitized or sterilized.
- n is between 0 and 5, preferably between 1 and 2
- R identical or different, is chosen from the group consisting of OH, ORi, formyl, CO2H, linear or branched alkyl chains, optionally substituted, comprising between 1 and 6 carbon atoms, alkenyls, linear or branched, optionally substituted, comprising between 1 and 6 carbon atoms.
- RI is chosen from the group consisting of methyl, ethyl, propyl and butyl.
- the compound of formula (I) is chosen from vanillin and frambinone.
- a first aspect of the present invention refers to a process comprising a step (a) of continuous growth of a microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I) preferably into vanillin.
- the process comprising a step (a) of continuous growth or “continuous growth process” refers to a step or a process in which the volume of the reactor is constant.
- the microorganism multiplies.
- a flow (Fl) comprising at least the biomass is transferred continuously.
- a flow (Fl) comprising all of the biomass is transferred continuously.
- a flow (Fl) comprising a part of the biomass is transferred continuously.
- the pH of the growth medium is controlled and optionally regulated by addition of acid or base.
- Those skilled in the art will be able to adapt the pH of the growth medium to the needs of the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I) preferably into vanillin used in the process of the present invention.
- the pH of the growth medium is between 3 and 9, in particular between 4 and 8, and very preferably between 6 and 8.
- the continuous growth process is carried out under controlled temperature conditions, the temperature can optionally be regulated.
- the temperature can be between 10 to 55°C, particularly preferably in the range of 30 to 50°C, and very preferably between 35°C and 45°C.
- the pCL of the growth medium is controlled and optionally regulated.
- Those skilled in the art will be able to adapt the pCL of the growth medium to the needs of the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin used in the context of the process of the present invention.
- the pO2 can be between 1% and 99%, preferably of the order of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%.
- the pCh corresponds to the dissolved oxygen concentration in the growth medium relative to the dissolved oxygen concentration at saturation, without biomass.
- the pCL can in particular be measured with an O2 Sensor Hamilton OXYFERM FDA VP 225.
- the continuous growth process is carried out with stirring. Agitation can be characterized using the speed at the tip of the blade or peripheral speed.
- the blade tip speed can be calculated with the following formula:
- Vp 2*Pi*D/2*N/60, in which Vp is the speed at the tip of the blade (m/s), D is the diameter of the reactor or fermenter (in m) and N is the rotation speed of the agitator (rpm).
- Vp is the speed at the tip of the blade (m/s)
- D is the diameter of the reactor or fermenter (in m)
- N is the rotation speed of the agitator (rpm).
- the speed at the tip of the blade is between 1 and 10 m/s, preferably between 2 and 5 m/s.
- growth is carried out in a medium or “growth medium” adapted to the microorganism whose growth is sought.
- the growth medium refers to a medium comprising nutrients essential and/or beneficial to the survival and/or growth of microorganisms.
- the composition of the growth medium is controlled.
- the composition of the growth medium is continuously adapted.
- the growth medium is added continuously.
- the rate of addition of the growth medium is equal to the rate of withdrawal of the flow (Fl).
- the rate of addition of the growth medium or withdrawal of the flow is adapted so as to allow the microorganism sufficient time to multiply and avoid a decrease in its concentration. It is preferable that the rate of addition of the growth medium or withdrawal of the flow is adapted so as to avoid accumulation or reduction of the amount of glucose in the medium.
- the rates of addition of the growth medium and withdrawal of the flow (Fl) can be constant.
- the flow rates of addition of the growth medium and withdrawal of the flow (Fl) can be carried out occasionally.
- the continuous growth process according to the present invention is carried out in a fermenter.
- the continuous growth process is carried out under aseptic conditions, preferably under sterile conditions.
- the continuous growth process is carried out in aseptic conditions, preferably sterile, indicates that the reactor or the fermenter in which the process is carried out, and the different supply or outlet pipes of the reactor or the fermenter have been sanitized, preferably sterilized, prior to their use in the process.
- the continuous growth process is carried out under aseptic conditions, preferably sterile, indicates that the solvent and the growth medium used during the process have been sanitized, preferably sterilized, prior to their use in the process.
- the continuous growth process is carried out in aseptic conditions, preferably sterile, indicates that the air or oxygen used during the process is sanitized, preferably sterilized, prior to its use in the process.
- the growth medium includes a carbon source, an organic or inorganic nitrogen source, inorganic salts and, optionally, growth factors.
- a carbon source an organic or inorganic nitrogen source
- inorganic salts include aluminum, magnesium, calcium, magnesium, calcium, magnesium, calcium, magnesium, calcium, magnesium, calcium, magnesium, calcium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium, magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium magnesium
- the term "carbon source” refers to a source of carbon that could be used to support the growth of microorganisms.
- Cells generally use sugars as their primary carbon source and energy source, however other carbon sources may also be used.
- the carbon source can be chosen from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose, galactose, lactose, ethanol, cellobiose, glycerol and polysaccharides such as cellulose, and mixtures thereof.
- the carbon source comprises glucose.
- the concentration of carbon source is controlled.
- the concentration of carbon source is adapted to the needs of the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably vanillin, used in the context of the process of the present invention.
- the concentration of carbon source is maintained at a concentration of between 0 and 20 g.L' 1 , preferably between 0.1 and 10 g.L' 1 and very preferably between 0.5 and 5 g.L' 1 .
- the addition of a carbon source, in particular glucose, is generally carried out continuously.
- nitrogen source refers to a source of nitrogen that could be used to support the growth of microorganisms.
- suitable nitrogen sources are inorganic nitrogen sources such as nitrates and ammonium salts and organic nitrogen sources such as yeast extract, urea, peptone.
- the inorganic salts which can be used are for example, among others, sulfates, nitrates, chlorides, carbonates, hydrogen phosphates and phosphates of sodium, potassium, magnesium, calcium, zinc and iron.
- usable growth factors are, for example, D-biotin, nicotinic acid, thiamine (HCl), pyridoxine (HCl), para-aminobenzoic acid, myo-inositol, calcium pantothenate, Na2- EDTA, ZnSO 4 .7H2O, MnC12.4H2O, COCI2.6H2O, CUSO 4 .5H 2 O, Na2MoO 4 .2H 2 O, CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, H3BO3, Kl.
- the concentration of nitrogen source and/or growth factors can be controlled.
- the concentration of nitrogen source and/or growth factors can be between 0 and 5 g.L'1 , preferably between 0.1 and 2.5 g.L'1 , and very preferably between 0.2 and 1.5 g.L' 1 .
- magnesium ions such as magnesium sulfate
- the addition of magnesium ions can be continuous.
- the biomass concentration can be controlled.
- the biomass concentration, expressed as dry mass can be between 2 and 50 g/L, preferably between 5 and 25 g/L, very preferably between 8 and 15 g/L.
- the biomass concentration can be controlled by measuring the optical density.
- the optical density, measured at 880 nm is included between 5 and 400, preferably between 20 and 200, very preferably between 40 and 100 and even more preferably between 60 and 80.
- Optical density measurement at 880 nm can be performed continuously, online.
- Optical density at 880 nm can be measured using a Hamilton Dencytee Unit probe.
- the biomass concentration can be controlled by measuring the optical density at 600 nm.
- the optical density, measured at 600 nm is between 2 and 100, preferably between 5 and 80, very preferably between 10 and 60 and even more preferably between 25 and 45.
- Measuring the optical density at 600 nm can be measured by taking a sample of growth medium. The sample is then diluted 50 times in water.
- Optical density at 600 nm can be measured using a spectrophotometer set at 600 nm.
- the microorganism can be any microorganism capable of forming a compound of formula (I), preferably vanillin by bioconversion of an appropriate substrate.
- the microorganism in particular bacteria or fimgus, may be a wild microorganism, genetically modified by molecular biology, mutated, by random or directed mutagenesis.
- the microorganism is chosen from bacteria belonging to the order AesActinomycetales, Caulobacterales or P seudomonadales, preferably belonging to the family Streptomycetacae, Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, or Pseudomonadaceae, very preferably Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp.
- Streptomyces psammoticus Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens, or their mutants, even more preferably Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp., Streptomyces psammoticus.
- the bioconversion reaction is carried out in the presence of a strain available under the number ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants, preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992 , CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants and very preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926.
- the microorganism can be chosen from genetically modified microorganisms belonging to the family Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
- the microorganism used in the context of the present invention can also be a strain as described in WO 2014/102368, WO 2016/001203 or EP 2721148.
- the microorganism is chosen from the fungus belonging to the genus Aspergillus, Pycnoporus, Penicillium, preferably belonging to the family Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus, Penicillium camamberti.
- substrate can be transformed by bioconversion into a compound of formula (I), preferably into vanillin.
- the substrate is generally chosen from the group consisting of glucose, ferulic acid, eugenol, isoeugenol, coumaric acid, caffeic acid, L-tyrosine, vanillic acid, 4-vinyl guaiacol, preferably chosen from glucose, ferulic acid and eugenol .
- the continuous growth process can be preceded by a step (aO) during which a microorganism is cultured so as to obtain a sufficient quantity of biomass.
- This sufficient quantity of biomass can then be used in a continuous growth process according to the present invention.
- Culturing the bacteria is generally carried out in an aqueous medium, in the presence of nutrients.
- the culture medium includes a carbon source, an organic or inorganic nitrogen source, inorganic salts and growth factors.
- a carbon source is generally between 5 and 50 gL 4 , preferably between 20 and 34 gL 4 .
- the nitrogen source, such as a yeast extract, and the growth factors are generally added at a concentration of between 2 and 20 g.L'1 , preferably between 5 and 10 gL.
- magnesium ions such as magnesium sulfate
- the pH of the culture is between 3 and 9, in particular between 4 and 8, and very preferably between 6 and 8.
- the temperature of the culture is between 10 and 55 °C, particularly preferably in the range of 30 to 50°C, preferably between 30 and 42°C and very preferably between 35°C and 45°C.
- the culture period generally lasts between 15 minutes and 80 hours, preferably between 1 hour and 50 hours and very preferably between 5 hours and 40 hours.
- the duration of the period of culture is variable and can be adapted depending on the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin used in the context of the present invention.
- the culture period can last until the carbon source, generally glucose, is almost completely consumed, preferably such that the concentration of carbon source is less than or equal to 15 g.L'1 , preferably less than or equal to 5 g.L'1 , very preferably less than or equal to 3 g.L'1 .
- the cultivation period may last until 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the source of carbon introduced at the start of the stage (aO) has been consumed.
- the present invention relates to a process for producing a compound of formula (I), preferably vanillin, characterized in that it comprises a step (a) of continuous growth of a microorganism capable of transforming a substrate in compound of formula (I), preferably in vanillin.
- step (a) is carried out under the conditions described above for the continuous process of growth of a microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin.
- the process for producing a compound of formula (I), preferably vanillin, may further comprise a step (aO) prior to step (a) as described above.
- the process for producing a compound of formula (I), preferably vanillin further comprises a bioconversion step (b) in which the microorganism transforms a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin.
- Steps (a) and (b) can be carried out successively, step (a) is carried out before step (b). According to another embodiment, steps (a) and (b) can be carried out simultaneously.
- Bioconversion step (b) can in particular be carried out under the conditions described in EP0885968, EP0761817, or WO2017/025339.
- step (b) can be carried out in batch or fed-batch.
- the bioconversion substrate can be added all at once or several times.
- step (b) can be carried out continuously.
- the bioconversion substrate can be fed continuously.
- a stream (F2) comprising the compound of formula (I), preferably vanillin, can be removed continuously.
- the flow (F2) can also optionally include fermentation substrate, impurities and biomass.
- Step (b) can be carried out under aseptic conditions, preferably sterile.
- step (b) can be carried out without aseptic or sterility conditions.
- the bioconversion substrate can be chosen from glucose, ferulic acid, eugenol, isoeugenol, coumaric acid, caffeic acid, L-tyrosine, vanillic acid, 4-vinyl guaiacol, preferably chosen from glucose, ferulic acid and eugenol.
- the microorganism can be any microorganism capable of forming the compound of formula (I), preferably vanillin by bioconversion of an appropriate substrate.
- the microorganism in particular bacteria or fimgus, may be a wild microorganism, genetically modified by molecular biology, mutated, by random or directed mutagenesis.
- the microorganism is chosen from bacteria belonging to the order AesActinomycetales, Caulobacterales or P seudomonadales, preferably belonging to the family Streptomycetacae, Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, or Pseudomonadaceae, preferably Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens.
- the bioconversion reaction is carried out in the presence of a strain available under the number ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants, preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992 , CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants and very preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926.
- the microorganism can be chosen from genetically modified microorganisms belonging to the family Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
- microorganism used in the context of the present invention can also be a strain as described in WO 2014/102368, WO 2016/001203 or EP 2721148.
- the microorganism is chosen from the fungus belonging to the genus Aspergillus, Pycnoporus, Penicillium, preferably belonging to the family Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus, Penicillium camamberti.
- step (b) is carried out in a batch process according to Figure 2.
- step (a) is carried out in a fermenter.
- a flow (El) is removed from this fermenter to feed a reactor or fermenter.
- the bioconversion is carried out under batch conditions as described in EP0885968, with or without sterilization of the reactor or fermenter used in step (b) of bioconversion.
- the flow (Fl) can supply several reactors or fermenters operated in batches in parallel.
- step (b) is carried out in a continuous process after step (a), according to Figure 3.
- step (a) is carried out in a fermenter.
- a stream (Fl) is removed from this fermenter to feed a reactor, a fermenter or a reactor or fermenter cascade in which the bioconversion step (b) is carried out.
- Ferulic acid is fed continuously into the reactor or fermenter in which the bioconversion is carried out.
- the flow (Fl) can supply several reactors or fermenters operated continuously in parallel.
- step (b) is carried out in a continuous process simultaneously with step (a), according to Figure 4.
- the fermenter is continuously supplied with growth medium and as a fermentation substrate.
- a stream (F3) can be removed comprising compound of formula (I), preferably vanillin, and optionally fermentation substrate, impurities and biomass.
- the continuous processes for growth and production of compound of formula (I) preferably vanillin according to the present invention are particularly advantageous in that they allow a saving of time and productivity. These processes also allow a gain in terms of reducing the frequency of maintenance operations. The risk of contamination in the reactor or the fermenter, operated continuously, is also reduced, given that the biomass concentration is high compared to the concentration of possible contaminant, the risk of colonization by a contaminating agent is thus reduced.
- the composition of the biomass is more homogeneous, unlike batch processes in which the biomass composition could vary from one growth batch to another. This homogeneity makes it possible to obtain a more homogeneous raw vanillin composition. This makes it possible to facilitate purification processes in particular.
- step (b) can be followed by a step (c) of purification of the compound of formula (I), preferably vanillin, obtained.
- purification comprises a first step in which the fermentation must is separated from the biomass.
- the purification of the compound of formula (I) preferably vanillin obtained at the end of step (b) can in particular be carried out by liquid/liquid extraction, by distillation, by crystallization, by evaporation in a scraped film evaporator , falling film, in a bulkhead evaporator, and/or by stripping. Nanofiltration and ultrafiltration steps can also be carried out as part of purification step (c).
- the purification process can be carried out according to the methods described in WO2013/087795, WO 2014/114590, WO2018/146210, WO2021/019005.
- the vanillin can be continuously extracted from the fermenter using a vanillin separation device.
- the purification process can be carried out according to the process described in WO2017/025339.
- the vanillin separation device is a membrane filtration device. This type of device makes it possible to recover fermentation must, a retentate containing the microorganism and a filtrate free of microorganism.
- the vanillin separation device can also enable the selective extraction of vanillin from the extracted fermentation wort.
- the present invention also relates to a compound of formula (I), preferably a vanillin, capable of being obtained according to the process of the present invention.
- the present invention refers to the use of the compound of formula (I), preferably vanillin obtained according to the present invention as a flavoring in the field of human and animal food, pharmacy, or in as a perfume in the cosmetics, perfumery and detergent industry.
- Streptomyces setonii ATCC 39116 strain is cultivated under the conditions described in document WO2017/025339.
- the microorganism Streptomyces setonii is cultured according to Example 1.
- a new growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSCL, 7H2O at 0.8 g/L is continuously introduced into the fermenter. This medium was previously sterilized.
- a drain line withdraws the growth medium at the same rate as the growth medium inlet flow rate to keep the fermenter volume constant.
- the culture conditions are identical to those of Example 1. Under these conditions, the concentration of the biomass remains constant and the culture is maintained for 13 days.
- the microorganism Streptomyces setonii is cultured according to Example 1.
- the aeration, temperature and agitation conditions do not change. After 8.5 hours, the glucose concentration is less than 4 g/L. Feeding with growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSCL, 7H2O at 0.8 g/L is restarted, as is withdrawal through the drain line.
- the microorganism Streptomyces setonii is cultured according to Example 1.
- a new growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSCL, 7H2O at 0.8 g/L is continuously introduced into the fermenter. This medium was previously sterilized.
- a drain line withdraws the growth medium at the same rate as the growth medium inlet flow rate to keep the fermenter volume constant.
- the culture conditions are identical to those of Example 1.
- a volume of growth medium containing the biomass is withdrawn from the fermenter.
- the same volume of growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSCL, 7H2O at 0.8 g/L is introduced instantly into the fermenter.
- the feeding and draining are then stopped. The aeration, temperature and agitation conditions do not change.
- a volume of growth medium containing the biomass is withdrawn from the fermenter.
- the same volume of growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSO4, 7H2O at 0.8 g/L is introduced instantly into the fermenter.
- the feeding and draining are then stopped. The aeration, temperature and agitation conditions do not change.
- Growth medium containing biomass prepared according to Examples 2, 3 or 4, is used.
- the pH of the growth medium is adjusted to 8.4 by adding 30 mol% sodium hydroxide and kept constant, with stirring.
- a solution containing ferulic acid (78 g), 30 molar% sodium hydroxide (60 g), and water (522 g) is prepared. This solution is then added to the fermenter containing the biomass. Whatever the method of preparing the biomass, a vanillin concentration is measured, after 24 hours, of around 15 g/L, 0.3 g/L in ferulic acid by HPLC. The conversion rate of ferulic acid is around 99%. The vanillin selectivity of the process is greater than 80%.
- Example 6 Preparation of vanillin according to Figure 3
- the microorganism Streptomyces setonii is cultured in a fermenter 1 according to example 1.
- a new growth medium containing glucose at 30 g/L and MgSCL, 7H2O at 0.8 g/L is introduced continuously into fermenter 1 at a PL flow rate This medium has been previously sterilized.
- a drain line withdraws the growth medium at the same flow rate Fl as the arrival flow rate of the growth medium to keep the volume of fermenter 1 constant.
- the culture conditions are identical to those of Example 1.
- This flow Fl feeds a fermenter 2 also fed by a flow of a 20 g/L ferulic acid solution at a flow rate F2.
- a drain line withdraws the bioconversion medium at a flow rate F3 which is the sum of the flow rate Fl and the flow rate F2 to maintain the volume of fermenter 2 constant.
- the bioconversion conditions are identical to those of Example 5.
- the withdrawal flow at a flow rate F3 from fermenter 2 is analyzed at regular intervals.
- a concentration of vanillin of the order of 5 g/L and 0.5 g/L of ferulic acid are measured by HPLC.
- the results obtained show a conversion rate of ferulic acid of around 95%.
- the vanillin selectivity of the process is greater than 80%.
- examples 5 and 6 show that the continuous growth process of the microorganism has no deleterious effect on the microorganism.
- the microorganism allows the bioconversion of a substrate into vanillin as efficiently as the processes of the prior art in which the growth is carried out in batches.
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Abstract
La présente invention se réfère à un procédé comprenant une étape (a) de croissance en continu d'un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Description
PROCÉDÉ CONTINU DE CROISSANCE D' UN MICROORGANISME
Domaine de l’invention
La présente invention se réfère à un procédé comprenant une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Art antérieur
La vanilline peut être obtenue par différentes méthodes connues de l’homme de l’art, et notamment par les deux voies suivantes :
- Une voie dite naturelle basée sur un procédé biotechnologique comprenant notamment la culture d’un microorganisme apte à permettre la biotransformation d’un substrat de fermentation en vanilline. Il est notamment connu de la demande EP0885968 un tel procédé dans lequel le substrat de fermentation est l’acide férulique. Le brevet US 5017388 décrit un procédé dans lequel le substrat de fermentation est l’eugénol et/ou l’isoeugénol. Ces procédés aboutissent à la préparation d’une vanilline dite vanilline naturelle.
- Une voie dite synthétique comprenant des réactions chimiques classiques à partir du gaïacol ne faisant pas intervenir de microorganisme. Ce procédé aboutit à la préparation d’une vanilline dite vanilline synthétique.
Enfin la vanilline peut également être préparée selon une voie qualifiée de « bio-based » dans laquelle la vanilline est issue de lignine, on peut citer en particulier les documents US 2745796, DE1132113 et l’article intitulé « Preparation of lignin from wood dust as vanillin source and comparison of different extraction method » by Azadbakht et al in International Journal of Biology and Biotechnology, 2004, vol 1 , No 4, pp 535-537, ou préparée à partir de matériaux d’origine naturelle, on peut citer en particulier le document WO 2019/020773.
Comme mentionné ci-dessus, les procédés de la voie dite naturelle comprennent la culture d’un microorganisme apte à transformer un substrat en vanilline. Cette étape est une phase de
croissance du microorganisme pour obtenir une biomasse qui sera utilisée comme biocatalyseur de la phase de bioconversion d’un substrat en vanilline.
Industriellement, cette phase de croissance est chronophage et délicate. En effet, il est en général nécessaire d’inoculer une petite quantité de microorganisme contenu dans un cryotube, et de le transférer dans un premier fermenteur de volume un peu plus grand pour faire croître le microorganisme. Cette étape de croissance de la biomasse et de transfert dans un réacteur plus grand peut être répétée autant de fois que nécessaire. La durée totale de cette étape de croissance peut être importante, de l’ordre par exemple de 72h. Par ailleurs, cette étape de croissance doit être réalisée en milieu stérile. .Une étape de stérilisation initiale du ou des fermenteurs ainsi que de toutes les arrivées et sorties du ou des fermenteurs est requise et doit être effectuée dans des conditions spécifiques. Il en résulte que d’une part les transferts d’un fermenteur à un autre présentent des risques de contamination et d’autre part la mise en œuvre de ce type de procédé est complexe
La présente invention vise un procédé efficace et industriel de croissance d’un microorganisme dans lequel le risque de contamination est réduit et dont la productivité est améliorée.
Brève description
Un premier objet de la présente invention porte sur un procédé comprenant une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
La présente invention vise également un procédé de production d’un composé de formule (I), de préférence de vanilline caractérisé en ce qu’il comprend une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Description des figures
Eig 1 : Procédé continu de croissance selon l’invention
Lig 2 : Procédé de production d’un composé de formule (I) selon l’invention Lig 3 : Procédé de production d’un composé de formule (I) selon l’invention Lig. 4 : Procédé de production d’un composé de formule (I) selon l’invention
Description détaillée
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, l’expression « compris entre ... et... » inclut les bornes.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, la croissance d’un microorganisme se réfère à un processus dans lequel ledit microorganisme se multiplie. La croissance aboutit à la production d’une biomasse. La croissance peut être définie par l’augmentation de la concentration de la biomasse.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « bioconversion » se réfère à un procédé biotechnologique dans lequel un microorganisme permet la transformation d’un substrat en un produit de bioconversion. Le microorganisme peut être une souche sauvage, génétiquement modifiée obtenue par biologie moléculaire ou mutée, notamment par mutagénèse aléatoire ou dirigée.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « procédé réalisé en conditions aseptiques » se réfère à un procédé réalisé dans des conditions exemptes de tout germe et/ou microorganisme.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « procédé réalisé en conditions stériles » se réfère à un procédé réalisé dans des conditions exemptes de tout germe et/ou microorganisme susceptible d’être délétère au microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline, utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, l’asepsie ou la stérilisation peut être obtenue par toute méthode, en particulier thermique, chimique, mécanique ou par rayonnement, permettant l’élimination des germes et/ou microorganisme. L’asepsie ou la stérilisation peuvent être réalisées sur les fluides, matières premières, et/ou dispositifs utilisés dans le cadre du procédé selon la présente invention. A titre illustratif on peut citer notamment, les méthodes suivantes :
Stérilisation par chaleur sèche ou humide, réalisée par montée en température jusqu’à un température suffisante, suivie d’un maintien de cette température sur une durée suffisante pour l’élimination des germes et/ou microorganismes, à titre illustratif la température peut être de 121 °C, puis maintien de cette température de 121 °C pendant une durée suffisante permettant l’élimination des germes,
Filtration sur membrane ou plusieurs filtrations successives sur membrane, dont le plus petit diamètre de coupure permet l’élimination de tout germe et/ou microorganisme.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « réacteur » fait référence à un récipient apte à la réalisation de réactions chimiques. Dans le cadre de la présente invention, le réacteur peut être utilisé après avoir été aseptisé ou stérilisé ou sans aseptisation ou stérilisation.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « fermentation » fait référence à toute réaction biologique faisant intervenir un microorganisme telle que croissance bactérienne, bioconversion, biosynthèse ou biocatalyse.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « fermenteur » fait référence à un réacteur apte à la réalisation de fermentations, par exemple un bioréacteur. Dans le cadre de la présente invention, le fermenteur peut être utilisé après avoir été aseptisé ou stérilisé ou sans aseptisation ou stérilisation.
Dans le cadre de la présente invention, un composé de formule (I) présente la formule suivante :
Formule (I) dans lequel n est compris entre 0 et 5, de préférence compris entre 1 et 2,
R, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de OH, ORi, formyle, CO2H, les chaines alkyles linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, alcényles, linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation particulier, R est choisi dans le groupe constitué de formyle -CHO, OH, OMe, OEt, OPr, OBu, méthyle, éthyle, -(CH2)2-C(O)-CH3, -CH=CH-C(O)-CH3, -CH=CH- CO2H, -CO2H, -CH2-OH.
Selon un mode de réalisation particulier, RI est choisi dans le groupe constitué de méthyle, éthyle, propyl et butyle.
Selon un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) est choisi parmi vanilline et frambinone.
Un premier aspect de la présente invention se réfère à un procédé comprenant une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) de préférence en vanilline.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé comprenant une étape (a) de croissance en continu ou « procédé continu de croissance » se réfère à une étape ou un procédé dans lequel le volume du réacteur est constant. Pendant le procédé continu de croissance, le microorganisme se multiplie. Pendant le procédé continu de croissance, un flux (Fl) comprenant au moins la biomasse est transféré en continu. Selon un mode de réalisation, un flux (Fl) comprenant l’intégralité de la biomasse est transféré en continu. Selon un autre mode de réalisation, un flux (Fl) comprenant une partie de la biomasse est transféré en continu.
Dans le cadre de la présente invention, le pH du milieu de croissance est contrôlé et optionnellement régulé par ajout d’acide ou de base. L’homme du métier pourra adapter le pH du milieu de croissance aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
Selon un mode de réalisation particulier, le pH du milieu de croissance est compris entre 3 et 9, en particulier compris entre 4 et 8, et très préférentiellement compris entre 6 et 8.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé continu de croissance est réalisé dans des conditions contrôlées de température, la température peut optionnellement être régulée. L’homme du métier pourra adapter la température du procédé aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention. Selon un mode de réalisation particulier, la température peut être comprise entre 10 à 55°C, de manière particulièrement préférée dans la plage de 30 à 50°C, et très préférentiellement entre 35°C et 45°C.
Dans le cadre de la présente invention, la pCL du milieu de croissance est contrôlée et optionnellement régulée. L’homme du métier pourra adapter la pCL du milieu de croissance aux
besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
A titre illustratif, la pO2 peut être comprise entre 1% et 99%, de préférence de l’ordre de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. La pCh correspond à la concentration en oxygène dissous dans le milieu de croissance par rapport à la concentration en oxygène dissous à saturation, sans biomasse. La pCL peut notamment être mesurée avec un O2 Sensor Hamilton OXYFERM FDA VP 225.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé continu de croissance est réalisé sous agitation. L’agitation peut être caractérisée grâce à la vitesse en bout de pale ou vitesse périphérique. La vitesse en bout de pale peut être calculée avec la formule suivante :
Vp = 2*Pi*D/2*N/60, dans laquelle Vp est la vitesse en bout de pale (m/s), D est le diamètre du réacteur ou fermenteur (en m) et N est la vitesse de rotation de l'agitateur (tours/min). L’homme du métier pourra adapter l’agitation aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention. Selon un mode de réalisation particulier, la vitesse en bout de pale est comprise entre 1 et 10 m/s, de préférence comprise entre 2 et 5 m/s.
Selon la présente invention, la croissance est réalisée dans un milieu ou « milieu de croissance » adapté au microorganisme dont la croissance est recherchée. En général, le milieu de croissance se réfère à un milieu comprenant des nutriments essentiels et/ou bénéfiques à la survie et/ou croissance des microorganismes.
Dans le cadre de la présente invention, la composition du milieu de croissance est contrôlée. La composition du milieu de croissance est adaptée de manière continue. Ainsi dans le cadre de la présente invention du milieu de croissance est ajouté en continu.
Dans le cadre de la présente invention, le débit d’ajout du milieu de croissance est égal au débit de retrait du flux (Fl). Dans le cadre de la présente invention, il est préférable que le débit d’ajout du milieu de croissance ou de retrait du flux soit adapté de manière à laisser au microorganisme suffisamment de temps pour se multiplier et éviter la diminution de sa concentration. Il est préférable que le débit d’ajout du milieu de croissance ou de retrait du flux soit adapté de manière à éviter l’accumulation ou la réduction de la quantité de glucose dans le milieu.
Selon un mode de réalisation, les débits d’ajouts du milieu de croissance et de retrait du flux (Fl) peuvent être constants. Selon un autre mode de réalisation, les débits d’ajouts du milieu de croissance et de retrait du flux (Fl) peuvent être réalisés occasionnellement.
En général, le procédé de croissance en continu selon la présente invention est réalisé dans un fermenteur. En général le procédé de croissance en continu est réalisé en conditions aseptiques, de préférence en conditions stériles.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé de croissance en continu est réalisé en conditions aseptisées, de préférence stériles, indique que le réacteur ou le fermenteur dans lequel est réalisé le procédé, et les différents tuyaux d’alimentation ou de sortie du réacteur ou du fermenteur ont été aseptisés, de préférence stérilisés, préalablement à leur utilisation dans le procédé. Dans le cadre de la présente invention, le procédé de croissance en continu est réalisé en conditions aseptiques, de préférence stériles, indique que le solvant et le milieu de croissance utilisés au cours du procédé ont été aseptisés, de préférence stérilisés, préalablement à leur utilisation dans le procédé. Dans le cadre de la présente invention, le procédé de croissance en continu est réalisé en conditions aseptiques, de préférence stériles, indique que l’air ou l’oxygène utilisé au cours du procédé est aseptisé, de préférence stérilisé, préalablement à son utilisation dans le procédé.
En général, le milieu de croissance comprend une source de carbone, une source organique ou inorganique d’azote, des sels inorganiques et, optionnellement des facteurs de croissance. L’homme du métier pourra adapter la composition du milieu de croissance aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
De manière générale, l’expression « source de carbone » se réfère à une source de carbone qui pourrait être utilisé pour soutenir la croissance des microorganismes. Les cellules utilisent en général des sucres comme source principale de carbone et source d’énergie, cependant d’autres sources de carbone peuvent également être utilisées. Selon un aspect particulier, la source de carbone peut être choisie dans le groupe constitué de glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose, arabinose, galactose, lactose, éthanol, cellobiose, glycérol et polysaccharides tels que la cellulose, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préféré, la source de carbone comprend du glucose.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration en source de carbone est contrôlée. Dans le cadre de la présente invention, la concentration en source de carbone est adaptée aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline, utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration en source de carbone est maintenue à une concentration comprise entre 0 et 20 g.L'1, de préférence entre 0,1 et 10 g.L'1 et très préférentiellement entre 0,5 et 5 g.L'1. L’ajout d’une source de carbone, en particulier glucose, est en général réalisé en continu.
De manière générale, l’expression « source d’azote» se réfère à une source d’azote qui pourrait être utilisé pour soutenir la croissance des microorganismes. Des exemples de sources d'azote appropriées sont les sources d'azote inorganique telles que les nitrates et les sels d'ammonium et les sources d'azote organique telles que l'extrait de levure, urée, peptone.
Les sels inorganiques utilisables sont par exemple, entre autres, les sulfates, les nitrates, les chlorures, les carbonates, les hydrogénophosphates et les phosphates de sodium, de potassium, de magnésium, de calcium, de zinc et de fer.
Dans le cadre de la présente invention, des facteurs de croissance utilisables sont, par exemple, D-biotine, acide nicotinique, thiamine (HCl), pyridoxine (HCl), acide para-aminobenzoique, myo-inositol, pantothénate de calcium, Na2-EDTA, ZnSO4.7H2O, MnC12.4H2O, COCI2.6H2O, CUSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, H3BO3, Kl.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration en source d’azote et/ou facteurs de croissance peut être contrôlée. Dans le cadre de la présente invention, la concentration en source d’azote et/ou facteurs de croissance peut être comprise entre 0 et 5 g.L'1, de préférence entre 0,1 et 2,5 g.L'1, et très préférentiellement entre 0,2 et 1,5 g.L'1.
En outre, des ions magnésium, tels que du sulfate de magnésium, peuvent être ajoutés à une concentration comprise entre 0 et 0,5 g.L'1, de préférence entre 0,01 et 0,25 g.L'1, et très préférentiellement entre 0,02 et 0,15 g.L'1. L’ajout en ions magnésium peut être continu.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration en biomasse peut être contrôlée. La concentration en biomasse, exprimée en masse sèche, peut être comprise entre 2 et 50 g/L, de préférence comprise entre 5 et 25 g/L, très préférentiellement comprise entre 8 et 15 g/L Dans le cadre de la présente invention, la concentration en biomasse peut être contrôlée par la mesure de la densité optique. En général la densité optique, mesurée à 880 nm, est comprise
entre 5 et 400, de préférence comprise entre 20 et 200, très préférentiellement comprise entre 40 et 100 et encore plus préférentiellement comprise entre 60 et 80 . La mesure de la densité optique à 880 nm peut être effectuée en continu, en ligne. La densité optique à 880 nm peut être mesurée à l’aide d’une sonde Hamilton Dencytee Unit.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration en biomasse peut être contrôlée par la mesure de la densité optique à 600 nm. En général la densité optique, mesurée à 600 nm est comprise entre 2 et 100, de préférence comprise entre 5 et 80, très préférentiellement comprise entre 10 et 60 et encore plus préférentiellement comprise entre 25 et 45. La mesure de la densité optique à 600 nm peut être mesurée en prélevant un échantillon de milieu de croissance. L’échantillon est ensuite dilué 50 fois dans l’eau. La densité optique à 600 nm peut être mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre réglé à 600 nm.
Dans le cadre de la présente invention, le microorganisme peut être n'importe quel microorganisme capable de former un composé de formule (I), de préférence de la vanilline par bioconversion d'un substrat approprié. Le microorganisme, en particulier bactérie ou fimgus, peut être un microorganisme sauvage, modifié génétiquement par biologie moléculaire, muté, par mutagénèse aléatoire ou dirigée. De préférence le microorganisme est choisi parmi les bactéries appartenant à l’ordre AesActinomycetales, Caulobacterales ou P seudomonadales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae, Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, ou Pseudomonadaceae, très préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens, ou leurs mutants, encore plus préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp., Streptomyces psammoticus. De manière préférée la réaction de bioconversion est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants, préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants et très préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926. Selon un autre mode de réalisation le microorganisme peut être choisi parmi les microorganismes génétiquement modifiés appartenant à la famille Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
Le microorganisme utilisé dans le cadre de la présente invention peut également être une souche telle que décrite dans WO 2014/102368, WO 2016/001203 ou EP 2721148.
Selon un autre mode de réalisation, le microorganisme est choisi parmi les fungus appartenant au genre des Aspergillus, Pycnoporus, Pénicillium, de préférence appartenant à la famille Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus , Pénicillium camamberti Dans le cadre de la présente invention, le substrat peut être transformé par bioconversion en composé de formule (I), de préférence en vanilline. Le substrat est en général choisi dans le groupe constitué de glucose, acide férulique, eugénol, isoeugénol, acide coumarique, acide cafféique, L-tyrosine, l’acide vanillique, 4-vinyl guaiacol, de préférence choisi parmi glucose, acide férulique et eugénol.
En général, le procédé continu de croissance peut être précédé d’une étape (aO) pendant laquelle un microorganisme est mis en culture de manière à obtenir une quantité de biomasse suffisante. Cette quantité de biomasse suffisante peut ensuite être utilisée dans un procédé continu de croissance selon la présente invention.
La mise en culture de la bactérie est généralement réalisée en milieu aqueux, en présence d’éléments nutritifs. En général, le milieu de culture comprend une source de carbone, une source organique ou inorganique d’azote, des sels inorganiques et des facteurs de croissance. L’homme du métier pourra adapter la composition du milieu de culture aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention. La concentration en source de carbone est généralement comprise entre 5 et 50 g.L4, de préférence entre 20 et 34 g.L4. La source d’azote, telle qu’un extrait de levure, et les facteurs de croissance sont en général ajoutés à une concentration comprise entre 2 et 20 g.L'1, de préférence entre 5 et 10 g.L . En outre, des ions magnésium, tels que du sulfate de magnésium, peuvent être ajoutés à une concentration comprise entre 0,1 et 5 g.L4, de préférence comprise entre 0,5 et 1 g.L4. En général, le pH de la mise en culture est compris entre 3 et 9, en particulier compris entre 4 et 8, et très préférentiellement compris entre 6 et 8. En général, la température de la mise en culture est comprise entre 10 à 55°C, de manière particulièrement préférée dans la plage de 30 à 50°C, préférentiellement entre 30 et 42°C et très préférentiellement entre 35°C et 45°C.
La période de culture dure en général entre 15 minutes et 80 heures, de préférence entre 1 heure et 50 heures et très préférentiellement entre 5 heures et 40 heures. La durée de la période de
culture est variable et peut être adaptée en fonction du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline utilisé dans le cadre de la présente invention. A titre illustratif, la période de culture peut durer jusqu’à ce que la source de carbone, en général du glucose, soit presque intégralement consommée, de préférence telle que la concentration en source de carbone soit inférieure ou égale à 15 g.L'1, de préférence inférieure ou égale à 5 g.L'1, très préférentiellement inférieure ou égale à 3 g.L'1. Selon un autre mode de réalisation, la période de culture peut durer jusqu’à ce que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de la source de carbone introduite en début d’étape (aO) ait été consommée.
Selon un autre aspect, la présente invention porte sur un procédé de production de composé de formule (I) de préférence de vanilline caractérisé en ce qu’il comprend une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Dans le cadre de ce mode de réalisation, l’étape (a) est conduite dans les conditions décrites précédemment pour le procédé continu de croissance d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Le procédé de production de composé de formule (I), de préférence de vanilline peut comprendre en outre une étape (aO) préalable à l’étape (a) telle que décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, le procédé de production de composé de formule (I), de préférence de vanilline comprend en outre une étape (b) de bioconversion dans laquelle le microorganisme transforme un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline.
Les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées successivement, l’étape (a) est réalisée avant l’étape (b). Selon un autre mode de réalisation, les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées simultanément. L’étape (b) de bioconversion peut notamment être réalisée dans les conditions décrites dans EP0885968, EP0761817, ou WO2017/025339.
Selon une alternative, l’étape (b) peut être réalisée en batch ou en fed-batch. Le substrat de bioconversion peut être ajouté en une fois ou en plusieurs fois. Selon un autre mode de réalisation l’étape (b) peut être réalisée en continu. En particulier du substrat de bioconversion peut être alimenté en continu. Optionnellement, un flux (F2) comprenant le composé de formule (I), de préférence la vanilline peut être retiré en continu. Le flux (F2) peut également comprendre optionnellement du substrat de fermentation, des impuretés et de la biomasse.
L’étape (b) peut être réalisée en conditions aseptiques, de préférence stériles. Selon un autre mode de réalisation, l’étape (b) peut être réalisée sans condition d’asepsie ou stérilité.
En particulier le substrat de bioconversion peut être choisi parmi glucose, acide férulique, eugénol, isoeugénol, acide coumarique, acide caféique, L-tyrosine, l’acide vanillique, 4-vinyl guaiacol, de préférence choisi parmi glucose, acide férulique et eugénol.
Dans le cadre de la présente invention, le microorganisme peut être n'importe quel microorganisme capable de former du composé de formule (I), de préférence de la vanilline par bioconversion d'un substrat approprié. Le microorganisme, en particulier bactérie ou fimgus, peut être un microorganisme sauvage, modifié génétiquement par biologie moléculaire, muté, par mutagénèse aléatoire ou dirigée. De préférence le microorganisme est choisi parmi les bactéries appartenant à l’ordre AesActinomycetales, Caulobacterales ou P seudomonadales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae, Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, ou Pseudomonadaceae, xès préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens. ou leurs mutants, encore plus préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus. De manière préférée la réaction de bioconversion est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants, préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants et très préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926.
Selon un autre mode de réalisation le microorganisme peut être choisi parmi les microorganismes génétiquement modifiés appartenant à la famille Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
Le microorganisme utilisé dans le cadre de la présente invention peut également être une souche telle que décrite dans WO 2014/102368, WO 2016/001203 ou EP 2721148.
Selon un autre mode de réalisation, le microorganisme est choisi parmi les fungus appartenant au genre des Aspergillus, Pycnoporus, Pénicillium, de préférence appartenant à la famille Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus , Pénicillium camamberti Selon un premier aspect de la présente invention, l’étape (b) est opérée en procédé batch selon la figure 2. Selon ce mode de réalisation, l’étape (a) est réalisée dans un fermenteur. Un flux (El)
est retiré de ce fermenteur pour alimenter un réacteur ou un fermenteur. La bioconversion est réalisée dans les conditions batch tel que décrites dans EP0885968, avec ou sans stérilisation du réacteur ou fermenteur utilisé dans le cadre de l’étape (b) de bioconversion. Selon ces modes de réalisation, le flux (Fl) peut alimenter plusieurs réacteurs ou fermenteurs opérés en batch en parallèle.
Selon un autre aspect de la présente invention, l’étape (b) est opérée en procédé continu à l’issue de l’étape (a), selon la figure 3. Selon ce mode de réalisation, l’étape (a) est réalisée dans un fermenteur. Un flux (Fl) est retiré de ce fermenteur pour alimenter un réacteur, un fermenteur ou une cascade de réacteur ou de fermenteur dans lequel est effectuée l’étape (b) de bioconversion. L’acide férulique est alimenté en continu dans le réacteur ou fermenteur dans lequel est effectuée la bioconversion. Selon ce mode de réalisation, le flux (Fl) peut alimenter plusieurs réacteurs ou fermenteurs opérés en continu en parallèle.
Selon un autre aspect de la présente invention, l’étape (b) est opérée en procédé continu simultanément à l’étape (a), selon la figure 4. Selon ce mode de réalisation, le fermenteur est alimenté en continu en milieu de croissance et en substrat de fermentation. Un flux (F3) peut être retiré comprenant du composé de formule (I), de préférence de la vanilline, et optionnellement du substrat de fermentation, des impuretés et de la biomasse.
Les procédés continus de croissance et de production de composé de formule (I) de préférence de vanilline selon la présente invention sont particulièrement avantageux en ce qu’ils permettent un gain de temps et de productivité. Ces procédés permettent également un gain en termes de réduction de la fréquence des opérations de maintenance. Le risque de contamination dans le réacteur ou le fermenteur, opéré en continu, est également réduit, étant donné que la concentration en biomasse est élevée par rapport à la concentration en contaminant éventuel, le risque de colonisation par un agent contaminant est ainsi réduit. Enfin la composition de la biomasse est plus homogène, contrairement aux procédés batch dans lequel la composition en biomasse pouvait varier d’un lot de croissance à un autre. Cette homogénéité permet d’obtenir une composition de vanilline brute plus homogène. Ceci permet de faciliter notamment les procédés de purification.
Dans le cadre de la présente invention, l’étape (b) peut être suivie d’une étape (c) de purification du composé de formule (I), de préférence de la vanilline, obtenu. En général, la purification
comprend une première étape dans laquelle le moût de fermentation est séparé de la biomasse. La purification du composé de formule (I) de préférence de la vanilline obtenu à l’issue de l’étape (b) peut notamment être réalisée par extraction liquide/liquide, par distillation, par cristallisation, par évaporation dans un évaporateur à film raclé, à film tombant, dans un évaporateur à cloison, et/ou par stripping. Des étapes de nanofiltration, d’ultrafiltrations peuvent également être opérées dans le cadre de l’étape (c) de purification. A titre illustratif, le procédé de purification peut être réalisé selon les procédés décrits dans WO2013/087795, WO 2014/114590, WO2018/146210, WO2021/019005.
Selon un autre mode de réalisation, la vanilline peut être extraite en continu du fermenteur grâce à un dispositif de séparation de la vanilline. A titre illustratif, le procédé de purification peut être réalisé selon le procédé décrit dans WO2017/025339. Il n’y a pas de limitation particulière quant au choix du dispositif de séparation de la vanilline. De préférence, le dispositif de séparation de la vanilline est un dispositif de filtration sur membrane. Ce type de dispositif permet de récupérer du moût de fermentation, un rétentat contenant le microorganisme et un filtrat exempt de microorganisme. Le dispositif de séparation de la vanilline peut également permettre l’extraction sélective de la vanilline du moût de fermentation extrait.
La présente invention vise également un composé de formule (I), de préférence une vanilline, susceptible d’être obtenu selon le procédé de la présente invention. Enfin la présente invention se réfère à l’utilisation du composé de formule (I), de préférence de la vanilline obtenu selon la présente invention en tant qu’ arôme dans le domaine de l’alimentation humaine et animale, de la pharmacie, ou en tant que parfum dans l'industrie des cosmétiques, de la parfumerie et de la détergence.
Exemples
Exemple 1 : mise en culture
La souche Streptomyces setonii ATCC 39116 est cultivée dans les conditions décrites dans le document WO2017/025339.
Exemple 2 : Procédé continu selon l’invention
Le microorganisme Streptomyces setonii est mis en culture selon l’exemple 1.
Lorsque la concentration en glucose dans le milieu descend en dessous de 3 g/L, un nouveau milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est introduit de manière continue dans le fermenteur. Ce milieu a été préalablement stérilisé. Une ligne de vidange soutire le milieu de croissance au même débit que le débit d’arrivée du milieu de croissance pour maintenir le volume du fermenteur constant. Les conditions de culture sont identiques à celles de l’exemple 1. Dans ces conditions, la concentration de la biomasse reste constante et la culture est maintenue pendant 13 jours.
On n’observe pas de dégradation de la biomasse au cours de la période de 13 jours de culture.
Exemple 3 : Procédé continu selon l’invention
Le microorganisme Streptomyces setonii est mis en culture selon l’exemple 1.
Lorsque la concentration en glucose dans le milieu descend en dessous de 3 g/L, un nouveau milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSÛ4, 7H2O à 0,8 g/L est introduit de manière continue dans le fermenteur. Ce milieu a été préalablement stérilisé. Une ligne de vidange soutire le milieu de croissance au même débit que le débit d’arrivée du milieu de croissance pour maintenir le volume du fermenteur constant. Les conditions de culture sont identiques à celles de l’exemple 1. Après 146h de croissance (environ 6 jours), un volume de milieu de croissance contenant la biomasse est soutirée du fermenteur. Un même volume de milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est introduit instantanément dans le fermenteur. L’alimentation et la vidange sont ensuite arrêtées. Les conditions d’aération, de température et d’agitation ne changent pas. Après 8,5h, la concentration en glucose est inférieure à 4 g/L. L’alimentation avec du milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est redémarrée, ainsi que le soutirage par la ligne de vidange.
On n’observe pas de dégradation de la biomasse lors d’une variation soudaine de la composition du milieu de croissance. On note également que lorsque l’alimentation en milieu de croissance et le soutirage sont redémarrés de manière continue, la croissance du microorganisme se poursuit sans changement.
Exemple 4 : Procédé continu selon l’invention
Le microorganisme Streptomyces setonii est mis en culture selon l’exemple 1.
Lorsque la concentration en glucose dans le milieu descend en dessous de 3 g/L, un nouveau milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est introduit de manière continue dans le fermenteur. Ce milieu a été préalablement stérilisé. Une ligne de vidange soutire le milieu de croissance au même débit que le débit d’arrivée du milieu de croissance pour maintenir le volume du fermenteur constant. Les conditions de culture sont identiques à celles de l’exemple 1.
Après 146h de croissance (environ 6 jours), un volume de milieu de croissance contenant la biomasse est soutirée du fermenteur. Un même volume de milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est introduit instantanément dans le fermenteur. L’alimentation et la vidange sont ensuite arrêtées. Les conditions d’aération, de température et d’agitation ne changent pas.
Après une nouvelle période de 146h de croissance, un volume de milieu de croissance contenant la biomasse est soutirée du fermenteur. Un même volume de milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSO4, 7H2O à 0,8 g/L est introduit instantanément dans le fermenteur. L’alimentation et la vidange sont ensuite arrêtées. Les conditions d’aération, de température et d’agitation ne changent pas.
On n’observe pas de dégradation de la biomasse lors des variations soudaines de la composition du milieu de croissance. On note également qu’à chacune de ces variations, le microorganisme est capable de poursuivre sa croissance.
Exemple 5 : Préparation de vanilline
Du milieu de croissance contenant de la biomasse, préparé selon les exemples 2, 3 ou 4, est utilisé. Le pH du milieu de croissance est ajusté à 8,4 par ajout de soude à 30% molaire et maintenu constant, sous agitation.
Une solution contenant de l’acide férulique (78 g), de la soude à 30% molaire (60 g), et de l’eau (522 g) est préparée. Cette solution est ensuite ajoutée dans le fermenteur contenant la biomasse. Quelle que soit la méthode de préparation de la biomasse, on mesure une concentration en vanilline, après 24h, de l’ordre de 15 g/L, 0,3 g/L en acide férulique par HPLC. Le taux de conversion d’acide férulique de l’ordre de 99%. La sélectivité en vanilline du procédé est supérieure à 80%.
Exemple 6 : Préparation de vanilline selon la figure 3
Le microorganisme Streptomyces setonii est mis en culture dans un fermenteur 1 selon l’exemple 1.
Lorsque la concentration en glucose dans le milieu descend en dessous de 3 g/L, un nouveau milieu de croissance contenant du glucose à 30 g/L et MgSCL, 7H2O à 0,8 g/L est introduit de manière continue dans le fermenteur 1 à un débit PL Ce milieu a été préalablement stérilisé. Une ligne de vidange soutire le milieu de croissance au même débit Fl que le débit d’arrivée du milieu de croissance pour maintenir le volume du fermenteur 1 constant. Les conditions de culture sont identiques à celles de l’exemple 1.
Ce flux Fl alimente un fermenteur 2 également alimenté par un flux d’une solution d’acide férulique 20 g/L à un débit F2. Une ligne de vidange soutire le milieu de bioconversion à un débit F3 qui est la somme du débit Fl et du débit F2 pour maintenir le volume du fermenteur 2 constant. Les conditions de bioconversion sont identiques à celles de l’exemple 5.
Le flux de soutirage à un débit F3 du fermenteur 2 est analysé à intervalle régulier. On mesure une concentration en vanilline de l’ordre de 5 g/L, 0,5 g/L en acide férulique par HPLC.
Les résultats obtenus montrent un taux de conversion de l’acide férulique de l’ordre de 95%. La sélectivité en vanilline du procédé est supérieure à 80%.
Ainsi les exemples 5 et 6 montrent que le procédé continu de croissance du microorganisme n’a pas d’effet délétère sur le microorganisme. Le microorganisme permet la bioconversion d’un substrat en vanilline de manière aussi efficace que les procédés de l’art antérieur dans lesquels la croissance est effectuée en batch.
Toutefois les procédés continus de croissance tels que décrits aux exemples 2 à 4 permettent un gain de temps et de productivité de l’ordre de 20%. Ces procédés permettent également un gain en termes de réduction de la fréquence des opérations de maintenance, de nettoyage. Le dimensionnement des équipements requis pour la production d’un volume annuel de vanilline est réduit.
Claims
REVENDICATIONS Procédé continu comprenant une étape (a) de croissance d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline dans lequel le composé de formule (I) est
Formule (I) dans lequel n est compris entre 0 et 5, de préférence compris entre 1 et 2,
R, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de OH, ORi, formyle -CHO, -CO2H, les chaines alkyles linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, alcényles, linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, RI est choisi dans le groupe constitué de méthyle, éthyle, propyle et butyle,. Procédé continu selon la revendication 1 caractérisé en ce que le procédé de croissance est réalisé dans un milieu de croissance. Procédé continu selon la revendication 2 caractérisé en ce que le milieu de croissance est ajouté en continu. Procédé continu selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la concentration en source de carbone dans le milieu de croissance est contrôlée et est adaptée aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline. Procédé continu selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l’étape (a) est précédée d’une étape (aO) de mise en culture du microorganisme. Procédé continu selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le substrat est choisi dans le groupe constitué de glucose, acide férulique, eugénol,
isoeugénol, acide coumarique, acide cafféique, L-tyrosine, l’acide vanillique, 4-vinyl guaiacol, de préférence choisi parmi glucose, acide férulique et eugénol. Procédé de production d’un composé de formule (I), de préférence de vanilline caractérisé en ce qu’il comprend une étape (a) de croissance en continu d’un microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline selon l’une quelconque des revendications 1 à 6. Procédé de production d’un composé de formule (I), de préférence de vanilline selon la revendication 7 caractérisé en ce qu’il comprend une étape (b) de bioconversion. Procédé de production d’un composé de formule (I), de préférence de vanilline selon l’une quelconque des revendications 7 à 8 caractérisé en ce que les étapes (a) et (b) sont successives. Procédé de production d’un composé de formule (I), de préférence de vanilline selon l’une quelconque des revendications 7 à 8 caractérisé en ce que les étapes (a) et (b) sont simultanées.
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| WO2021019005A1 (fr) | 2019-07-30 | 2021-02-04 | Rhodia Operations | Procede de traitement d'une composition comprenant de la vanilline naturelle |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AZADBAKHT ET AL., INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 1, no. 4, 2004, pages 535 - 537 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR3134583A1 (fr) | 2023-10-20 |
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