WO2010092304A2 - Procedes de production d'acide succinique - Google Patents

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WO2010092304A2
WO2010092304A2 PCT/FR2010/050230 FR2010050230W WO2010092304A2 WO 2010092304 A2 WO2010092304 A2 WO 2010092304A2 FR 2010050230 W FR2010050230 W FR 2010050230W WO 2010092304 A2 WO2010092304 A2 WO 2010092304A2
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culture medium
glucose
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succinic acid
acid
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WO2010092304A3 (fr
Inventor
Bernard Caulier
Laurent Segueilha
Original Assignee
Roquette Freres
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention relates to processes for producing succinic acid and / or succinate ions by fermentation under anaerobic conditions.
  • Succinic acid or butanedioic acid
  • New products derived from succinic acid are in constant development, including the development of polyesters.
  • the esters of succinic acid have the potential to be new "green” solvents which can substitute the more harmful solvents for humans and
  • carboxylic acids such as malic acid, succinic acid or fumaric acid
  • renewable raw materials in this case through the fermentation process
  • Succinate is a metabolic intermediate during anaerobic fermentation by propionate-producing bacteria, but these fermentation processes result in the production of very low yields and succinic acid titers.
  • succinic acid-producing microorganisms have been isolated, such as ruminal anaerobic bacteria, Bacteroides ruminicola and Bacteroides amylophilus.
  • Rumen organisms are very unstable during fermentation processes, and therefore can not be used industrially for the production of succinic acid.
  • US Pat. No. 7,223,567 describes the use of a recombinant Escherichia coli strain overproducing succinate for the same amount of available NADH.
  • This Escherichia coli strain SBS550 MG pHL 413 exhibits inactivation of adhE, idhA gene products (involved in the NADH-consuming pathways), and inactivation of the ack-pta gene products and the iclR gene (activating the glyoxylate pathway), and contains a plasmid vector overexpressing an exogenous PYC gene.
  • the present invention relates to a process for producing succinic acid, comprising:
  • step (a) a step of culturing an Escherichia coli strain in a culture medium, wherein said step (a) comprises:
  • (a-1) a step of cultivating the strain under aerobic conditions in which glucose is added to the culture medium in a "fed-batch" mode, and during which the glucose concentration of said culture medium is lower or equal to 0.5 g / l, preferably less than 0.5 g / l, preferably less than or equal to 0.3 g / l and more preferably still less than or equal to 0.1 g / l; (a-2) optionally, an intermediate culture step; (b) a step of producing succinate ions by fermentation of the strain cultured in step (a) under anaerobic conditions in the presence of CO 2 ;
  • step (c) a step of converting the succinate ions formed in step (b) into succinic acid
  • step (a) may comprise a pre-culture step (a-0) before the culturing step (a-1).
  • the concept of "fed-batch” is also known to those skilled in the art, and generally corresponds to a diet programmed over time (addition or controlled addition over time) of at least one substrate or an ingredient of the medium culture, or a gaseous reagent.
  • the "fed-batch” mode according to the invention can be in particular exponential or linear.
  • the addition of glucose in "fed-batch” can be controlled by a computer system.
  • the process according to the invention makes it possible to increase the production yield of succinic acid and the specific productivity of a given strain (expressed in terms of g of succinic acid product / g of biomass and per hour).
  • the amount of orotic acid produced is less than 300 mg / l of culture medium, preferably less than 280 mg / l, preferably less than 250 mg / l, preferably less than 220 mg / L, preferably less than 200 mg / L, preferably less than 180 mg / L, preferably less than 160 mg / L, preferably less than 140 mg / L, preferably less than 135 mg / L, preferably less than 130 mg / l, preferably less than 120 mg / l, preferably less than 1 10 mg / l, preferably less than 100 mg / l, preferably less than or equal to 80 mg / l.
  • step (c) thus makes it possible to produce a succinic acid having less than 0.2 g of orotic acid per 100 g of succinic acid.
  • Glucose can be added as a syrup.
  • the glucose is added in the culture medium in the form of syrup, for example syrup at concentrations of 100 to 700 g / l.
  • step (a) takes place at a pH in a range of 6.0-7.5, preferably 6.5-7.0, preferably 6.75.
  • fermentation techniques such as in particular described in Fermentation & Biochemical Engineering Handbook: principles, lawsuits design & equipment, 2nd ed 1996 of VOGEL Henry C. and
  • Fermentation is a biochemical reaction that usually consists of releasing energy, or producing certain metabolites of interest, from an organic substrate under the action of microbial enzymes.
  • the fermentation is generally carried out in devices (fermenters) adapted to the fermentation process, that is to say adapted to the culture of microorganisms under the desired conditions (devices allowing, if necessary, to control the gaseous equilibrium of the culture medium, in particular by gas inlet and / or outlet ducts, vents, etc .; devices for introducing culture medium and other substances; devices for controlling, regulating, modifying other types of parameters, such as stirring, temperature, pH, etc.).
  • anaerobic culture conditions are culture conditions in the presence of carbon dioxide.
  • the conditions of anacrobies fermentation in the presence of CO 2 and / or with addition of CO 2 are fermentation conditions in CO 2 saturation.
  • the method of the invention comprises a step (b) of producing succinate ions by fermentation of the strain cultivated in step (a) (above described) in anaerobic condition in the presence of CO 2 by adding glucose to culture medium of step (a).
  • Glucose can be added as a syrup.
  • the glucose is added in the culture medium in the form of syrup, for example syrup at concentrations of 100 to 700 g / l.
  • the glucose is added all at once, so as to obtain a concentration of 50 to 80 g / l, for example 60 g / l of the culture medium.
  • step (b) takes place at a pH in a range of 6.0-
  • step (c) comprises an acidification.
  • the acidification can in particular be carried out by adding at least one acid chosen from orthoacidic acid. phosphoric, oxalic acid, sulfuric acid. These acids can be added pure or in the form of concentrated aqueous solutions.
  • the optional purification step (d) comprises an ethanolic purification which is carried out as follows: filtration (elimination of a protein precipitate), for example on B ⁇ chner and / or on acidified wort filtration soil optionally, concentration of the filtrate by evaporation under vacuum (preferably, according to a concentration factor between approximately 2 and 8), addition of ethanol, for example 95% ethanol, in a ratio of 1/1 to 5/1 to cause the precipitation of salts (succinic acid remains soluble), separation of the salt precipitate by filtration, for example on a membrane, recovery of ethanol by evaporation in vacuo,
  • the purification step may be followed by a crystallization step of the purified succinic acid.
  • step (a-1) the glucose is added to the culture medium in a "fed-batch” mode at a speed G (t) such that:
  • G (t) rate of addition of glucose in the culture medium at time t of the step
  • Go maximum speed at which the glucose can be consumed by the amount of biomass present in the culture medium at the instant to start of step (a-1).
  • the rate of addition of glucose G (t) is generally expressed as mass of glucose per unit of time, for example in kg of glucose per hour. However, if need be, those skilled in the art can easily convert it to glucose concentration per unit of time.
  • GB in particular according to the amount of biomass at instant to. It depends on the maximum growth rate of biomass and the conversion efficiency from glucose to biomass.
  • the value of GB is in fact conventionally determined by the following formula:
  • G 0 is expressed in g / L / h
  • ⁇ max Maximum growth rate in h -1 under aerobic conditions
  • Co Initial biomass concentration in g / L
  • Yx / s Conversion efficiency of glucose into biomass into g /boy Wut.
  • step (a-1) glucose is added to the culture medium in an exponential "fed-batch" mode.
  • step (a-1) the glucose is added to the culture medium in a "fed-batch" mode such that:
  • G (t) rate of addition of glucose in the culture medium at time t of the step
  • Exp refers to the exponential function).
  • the addition to glucose advantageously follows an exponential profile "modeled" on the growth profile of the strain (and vice versa).
  • Those skilled in the art can determine the growth rate ⁇ of a given strain under aerobic conditions: under exponential growth conditions, the cell population of the strain generally follows an equation of the type: or :
  • Nj number of cells at time T]> T 0 .
  • step (a-1) glucose is added to the culture medium in an exponential "fed-batch" mode and then linear.
  • glucose is added to the culture medium in a "fed-batch" mode such that step (a-1) comprises:
  • G (t) G 0 . exp ( ⁇ .ti) with G (t), Go, ⁇ , ⁇ and ⁇ max as described above.
  • the culture medium contains a glucose concentration of 0 to 0.5 g / L, preferably 0 at 0.2 g / L.
  • step (a-1) takes place at a pH in a range of 6.0-7.5, preferably 6.4-7.0.
  • the glucose concentration in the culture medium is less than or equal to 0.5 g / l, preferably less than or equal to 0.3 g / l and more. preferentially still less than or equal to 0.1 g / L
  • the method according to the invention comprises an intermediate culture step (a-2).
  • step (a-2) glycerol and / or gluconic acid or a salt thereof, and / or pyruvic acid or a pyruvic acid, may be added to the culture medium. salt thereof, and / or malic acid or a salt thereof, and / or succinic acid or a salt thereof, and / or acetic acid or a salt thereof. this one.
  • acetic acid or a salt thereof may be added to the culture medium.
  • the addition can be done according to different modalities: addition of a suspension and / or addition of a solution and / or addition of a solid (for example in the form of powder).
  • addition of these compounds makes it possible to further increase the production yield of succinic acid and the specific productivity.
  • step (a-2) is added in the culture medium 5- 15 g / L, preferably 7-12 g / l, preferably about 10 g / l of glycerol.
  • step (a-2) is added in the culture medium 5- 15 g / L, preferably 7-12 g / L, preferably about 10 g / L of gluconic acid (or equivalent of one of its salts).
  • Gluconic acid can be added as sodium gluconate.
  • step (a-2) is added in the culture medium 2-
  • step (a-2) is added in the culture medium 2-
  • Malic acid can be added as sodium malate.
  • step (a-2) is added in the culture medium 2- 15 g / L, preferably 3-12 g / L, preferably about 4 g / L of succinic acid (or equivalent of one of its salts).
  • Succinic acid can be added as sodium succinate.
  • step (a-2) is added in the culture medium 2-
  • Acetic acid can be added as sodium acetate.
  • step (a-2) pyruvic acid or a salt thereof, and malic acid or a salt thereof, are added to the culture medium. this. According to one embodiment, during step (a-2), there is added in the culture medium: 2-10 g / L of pyruvic acid (or equivalent of a salt thereof), and
  • step (a-2) is added in the culture medium:
  • step (a-2) is added in the culture medium: pyruvic acid or a salt thereof, malic acid or a salt thereof , and acetic acid or a salt thereof.
  • step (a-2) there is added in the culture medium: 2-10 g / L of pyruvic acid (or equivalent of a salt thereof), 2-10 g / L of malic acid (or equivalent of a salt thereof), and 1-10 g / L of acetic acid (or equivalent of a salt thereof).
  • step (a-2) is added in the culture medium:
  • concentrations and combinations of concentrations mentioned above for the additions of glycerol, gluconic acid, pyruvic acid, malic acid, succinic acid, acetic acid and, if appropriate, their salts may be preferentially used when the biomass concentration at the end of step (a-1) is about 10 g / L.
  • these concentrations can advantageously be doubled for a biomass concentration of about 20 g / L at the end of step (a-1); triplets for a biomass concentration of about 30 g / L at the end of step (a-1), etc.
  • the glycerol and the organic acids mentioned above (and / or their salts) can be added by adding, in the culture medium, all or part of the mother liquors of crystallization resulting from a process for producing succinic acid by fermentation.
  • step (a-2) is added in the culture medium, any liquid composition containing at least one organic acid or glycerol, said composition being derived from a process for the production of succinic acid by fermentation and / or a process for the purification of succinic acid.
  • This may include in particular the addition of different eluates obtained during such production or purification processes.
  • step (a-2) glucose is added to the culture medium, and an O 2 partial pressure value is maintained in the culture medium in an interval of 0. -5%, preferably 0-2%, preferably 0-1%; and regulating the pH value of the culture medium.
  • O 2 partial pressure value
  • Those skilled in the art are familiar with the concept of partial pressure of a gas in a liquid medium.
  • one skilled in the art knows how to determine and regulate the partial pressure of O 2 (p ⁇ 2 ) in a culture medium. For example, it is possible to maintain a certain value of p 2 in a fermenter by adjusting the stirring parameters of the culture medium.
  • regulating the pH is meant according to the present invention, the action of maintaining the pH value of the culture medium in a certain range or selection of values.
  • the pH can be regulated in different ways: - regulation in a range: the pH value is maintained within a certain range of values. The pH value can then vary over time, without however going beyond the interval considered; “low point” control: the pH value is kept above a threshold value. The pH value can then vary over time without falling below the threshold value; one-time control: the pH value is maintained at this value consistently over time.
  • acids for example, concentrated sulfuric acid, concentrated hydrochloric acid
  • bases concentrated solutions of NaOH, NH 3 solutions, etc.
  • the glucose can be added in one or more times.
  • glucose is added at one time.
  • the pH of the culture medium can be regulated by addition of at least one mineral acid.
  • the mineral acid can typically be selected from hydrochloric acid or sulfuric acid, ⁇ ur (s) or concentrated (s).
  • the glucose is added in several times. For example, it is possible to add glucose to the culture medium in 5 to 15 times (or in 8 to 12 times, or in 10 times). According to one embodiment, it is possible to add in the culture medium about 1, 1.5 or 2 g / L of glucose in 5 to 15 times (or in 8 to 12 times, or in 10 times). Glucose can also be added to the culture medium 20 to 40 times (or 25 to 35 times, or 30 times). For example, about 0.1, 0.3, or 0.5 g / L of glucose can be added in the culture medium in 15 to 30 times (or in 8 to 12 times, or in 10 times).
  • the pH can advantageously be regulated as follows: after a first addition of glucose (for example 1 g / l), the addition of glucose (for example, 1 g / l) is carried out as soon as a pH increase of 0.2 units is observed; And so on.
  • the glucose additions can be scheduled in time at regular intervals, and the pH can be regulated to a single value or in an interval by adding at least one mineral acid.
  • the pH of the culture medium is regulated by addition of glucose: the addition of glucose is controlled by variations in the pH of the culture medium. It is thus possible, for example, to set a set value (regulation to a single value), and to set a tolerance (for example 0.01 or 0.02 pH units), and to add glucose so the pH of the culture medium is maintained at the set point (within the chosen tolerance).
  • the above methods make it possible to minimize the additions of neutralizers (acids and bases, in particular acids and mineral bases), and thus to minimize the saline load (ionic strength) of the culture medium.
  • this step (a-2) makes it possible to further increase the production yield of succinic acid and the specific productivity.
  • glucose is added during step (a-2)
  • step (a-2) takes place at a pH in a range of 6.0-7.5, preferably 6.4-7.0.
  • the culture medium preferably has a concentration of 0 to 5, preferably 0 to 2, preferably 0 at 1, preferably 0 to 0.5 g / L in glucose.
  • step (a-1) and / or step (a-2) and / or step (b) takes place at a pH in a range of 6.0-7.5 preferably 6.5-7.0, preferably 6.4-7.0.
  • the strain of Escherichia CoIi is a strain which has the genotype AadhE AldhA AIC1R Aackpta PYC.
  • This genotype advantageously promotes the production of succinic acid by fermentation in the presence of CO 2 .
  • the symbol ⁇ indicates that the gene in question has been inactivated, for example by mutation, deletion, interruption, insertion, or "down" -regulation, for example by introduction of a stop codon, insertion or deletion resulting in a change of the frame. reading, point mutation, etc.
  • the AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC genotype therefore corresponds to:
  • AadhE inactivation of alcohol dehydrogenase
  • AldhA inactivation of lactate dehydrogenase
  • AiclR inactivation of the isocitrate lyase repressor (also known as ace A)
  • Aackpta inactivation of acetate kinase-phosphotransacetylase
  • PYC expression of a pyruvate carboxylase gene. This indicates that the strain expresses the PYC gene, for example by transformation with a plasmid carrying a functional copy of this gene, or by genomic integration of a functional copy of PYC.
  • the PYC gene is advantageously the pyc gene of
  • Lactococcus lactis Lactococcus lactis.
  • the strain of Escherichia CoIi is the strain SBS550MG - pHL413. This strain is described in Sanchez et al., Metabolic Engineering, 7 (2005) 229-239, and in US 7,223,567 and US 2005/0042736.
  • the strain SBS550MG - pHL413 has a value of ⁇ max of 0.38. Furthermore, the present invention also relates to the use of a glucose addition in a "fed-batch" mode, in particular exponential or linear, to minimize the production of orotic acid in a succinic acid production process and / or or succinate ions by fermentation of an Escherichia coli strain, or to increase the specific succinic acid productivity of said process.
  • the present invention relates to the use of a liquid composition containing at least one organic acid or glycerol, said liquid composition being derived from a process for producing succinic acid by fermentation and / or a purification process of succinic acid, for example all or part of the mother liquors of crystallization resulting from a process for the production of succinic acid by fermentation, for the preparation of a culture medium intended for step (a-2) according to the invention, as described above.
  • the invention is illustrated by the following embodiments, which are non-limiting.
  • the strain used is the strain SBS550MG - pHL413. (All concentrations shown below are based on the initial volume of the culture medium at the stage in question).
  • the protocol diagram is as follows: Growth phase, biomass production:
  • Antibiotics (ampicillin, carbenicillin, oxacillin) 67 mg / L - Duration: 24 hours; temperature: 37 0 C; agitation: 100 rpm.
  • the preculture is then transferred to a 30L fermentor of the Sartorius type. Culture under aerobic conditions with addition of glucose:
  • step (a-1) in comparison with an addition of glucose according to a simple batch mode, not only the "fed-batch" mode (step (a-1) according to the invention) drastically reduces the production of orotic acid, but also, surprisingly, the method according to the invention makes it possible to increase the biomass yield as well as the production yield of succinic acid and the specific productivity of a given strain.
  • step (a-2) according to the invention makes it possible to further increase the production yield of succinic acid and the specific productivity.
  • the concentrations indicated are expressed relative to the initial volume.
  • ⁇ coefficient of addition of glucose during step (a-1); Addition in batch: addition at once (batch says “simple”); Multiple additions: additions in several times (puises);
  • RTD Prod Yps (%): conversion efficiency from glucose to succinic acid in step (b);

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Abstract

La présente invention concerne des procédés de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation en conditions anaérobies permettant de minimiser la production d'acide orotique. En particulier, l'invention fournit un procédé de production d'acide succinique, comprenant : (a) une étape de culture d'une souche d'Εscherichia coli dans un milieu de culture, où ladite étape (a) comprend : (a-1) une étape de culture de la souche en conditions aérobies lors de laquelle du glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », et durant laquelle la concentration en glucose dudit milieu de culture est inférieure à 0,5 g/L; (a-2) optionnellement, une étape de culture intermédiaire; (b) une étape de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) en conditions anaérobies en présence de CO2; (c) une étape de conversion des ions succinate formés à l'étape (b) en acide succinique; (d) optionnellement, une étape de purification de l'acide succinique.

Description

PROCEDES DE PRODUCTION D'ACIDE SUCCINIQUE
La présente invention concerne des procédés de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation en conditions anaérobies. L'acide succinique (ou acide butanedioïque) est un acide organique avec deux groupes carboxyles, de formule semi-développée COOH-CH2-CH2-COOH, qui intervient dans le métabolisme cellulaire, comme intermédiaire métabolique du cycle de Krebs dans la mitochondrie.
Il trouve de nombreuses applications dans les domaines cosmétiques, agroalimentaires, pharmaceutiques, textiles et dans les plastiques. Ainsi il est par exemple utilisé comme intermédiaire de synthèse des plastiques pour la fabrication de 1,4 butanediol, de tétrahydrofuranne et de gammabutyrolactone.
De nouveaux produits dérivés de l'acide succinique sont en constant développement, incluant le développement de polyesters. Généralement, les esters de l'acide succinique ont le potentiel d'être de nouveaux solvants "verts" qui peuvent substituer les solvants plus nuisibles pour l'homme et
1 ' environnement.
La production d'acides carboxyliques, tels que l'acide malique, l'acide succinique ou l'acide fumarique, à partir de matières premières renouvelables (en l'occurrence par le biais des processus de fermentation) est connue de l'Homme du métier.
Le succinate est un intermédiaire métabolique lors de la fermentation anaérobie par des bactéries produisant du propionate, mais ces procédés de fermentation résultent en la production de très faibles rendements et titres en acide succinique.
Ces dernières années, beaucoup de microorganismes producteurs d'acide succinique ont été isolés, comme par exemple les bactéries anaérobies du rumen, Bacteroides ruminicola et Bacteroides amylophilus. Toutefois, les organismes du Rumen sont très instables lors des procédés de fermentations, et ne sont donc pas utilisables de manière industrielle pour la production d'acide succinique.
On sait depuis longtemps qu'un mélange de plusieurs acides, dont l'acide succinique est produit à partir de la fermentation de E. coli en présence de glucose et de CO2 comme substrats carbonés, comme décrit par JL Stokes en 1949 « Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli » J. Bacteriol., 57: 147-158. Cependant, pour chaque mole de glucose fermentée, seule 0.3 à 0.4 Moles d'acide succinique sont produites. Des études ont donc été menées sur des bactéries, en particulier Escherichia coli, modifiées génétiquement de manière à inactiver les voies métaboliques consommant le NADH nécessaire à la fabrication de l'acide succinique et de manière à activer les voies métaboliques de production du succinate (sel de l'acide succinique). En effet, le chemin métabolique fermentaire qui permet la conversion de l'oxaloacétate en malate, puis fumarate et enfin succinate nécessite deux moles de NADH par mole de succinate produit. Le verrou métabolique majeur pour la production de succinate et donc la biodisponibilité cellulaire en NADH.
Pour solutionner cette difficulté, le document US 7.223.567 décrit l'utilisation d'une souche Escherichia coli recombinante surproductrice de succinate pour la même quantité de NADH disponible. Cette souche Escherichia coli SBS550 MG pHL 413 présente une inactivation des produits des gènes adhE, idhA (impliqués dans les voies consommatrices de NADH), et une inactivation des produits des gènes ack-pta et du gène iclR (activant la voie glyoxylate), et contient un vecteur plasmidique surexprimant un gène PYC exogène. L'article de Sanchez et al. (intitulé « Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity » in Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239), le brevet américain US 7 223 567 et la demande de brevet américain US 2005/0042736 ont développé de nouvelles conditions de culture et de production associées à cette souche pour améliorer ses rendements de production en acide succinique. L'homme du métier recherche constamment de nouveaux procédés améliorés de production d'acide succinique. En particulier, l'homme du métier cherche à optimiser le rendement et la productivité obtenus.
En outre, la production d'acide succinique par des souches à? Escherichia coli s'accompagne généralement d'une production d'acide orotique (et/ou d'ions orotates). La présence d'acide orotique dans les moûts de fermentation est indésirable, car cet acide rend la purification d'acide succinique plus complexe et plus onéreuse. L'homme du métier cherche donc à minimiser la production d'acide orotique, tout en maintenant par ailleurs des rendements acceptables pour la production d'acide succinique.
Selon un aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'acide succinique, comprenant :
(a) une étape de culture d'une souche d'Escherichia coli dans un milieu de culture, où ladite étape (a) comprend :
(a-1) une étape de culture de la souche en conditions aérobies lors de laquelle du glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », et durant laquelle la concentration en glucose dudit milieu de culture est inférieure ou égale à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure ou égale à 0,3 g/L et plus préférentiellement encore inférieure ou égale à 0,1 g/L ; (a-2) optionnellement, une étape de culture intermédiaire ; (b) une étape de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) en conditions anaérobies en présence de CO2 ;
(c) une étape de conversion des ions succinate formés à l'étape (b) en acide succinique ;
(d) optionnellement, une étape de purification de l'acide succinique.
Les techniques de culture de souches à'Escherichia coli font partie des connaissances générales du domaine technique de la présente invention. En particulier, l'homme du métier sait déterminer des milieux et conditions de culture (température, agitation, ...) adaptés pour une souche donnée.
Selon un mode de réalisation, l'étape (a) peut comprendre une étape de pré-culture (a-0) avant l'étape de culture (a-1). La notion de « fed-batch » est également connue de l'homme du métier, et correspond généralement à une alimentation programmée au cours du temps (apport ou ajout contrôlé au cours du temps) d'au moins un substrat ou un ingrédient du milieu de culture, ou un réactif gazeux. Le mode « fed-batch » selon l'invention peut être notamment exponentiel ou linéaire. Selon un mode de réalisation, l'ajout du glucose en « fed-batch » peut être piloté par un système informatique. Avantageusement selon l'invention, et de manière totalement inattendue, en comparaison avec un ajout de glucose selon un mode de batch simple (apport en une fois à un instant donné), non seulement le mode « fed-batch » permet de réduire drastiquement la production d'acide orotique et d'augmenter le rendement en biomasse, mais également, de manière surprenante, le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement de production en acide succinique et la productivité spécifique d'une souche donnée (exprimée en g d'acide succinique produit / g de biomasse et par heure). Ainsi, selon le procédé de l'invention, la quantité d'acide orotique produite est inférieure à 300mg/L de milieu de culture, de préférence inférieure à 280mg/L, de préférence inférieure à 250 mg/L, de préférence inférieure à 220 mg/L, de préférence inférieure à 200 mg/L, de préférence inférieure à 180 mg/L, de préférence inférieure à 160 mg/L, de préférence inférieure à 140 mg/L, de préférence inférieure à 135 mg/L, de préférence inférieure à 130mg/L, de préférence inférieure à 120 mg/L, de préférence inférieure à 1 lOmg/L, de préférence inférieure à 100 mg/L, de préférence inférieure ou égale à 80 mg/L.
Le procédé selon l'invention à la sortie de l'étape (c) permet ainsi de produire un acide succinique présentant moins de 0,2 g d'acide orotique pour 100 g d'acide succinique. Le glucose peut être ajouté sous forme de sirop. De préférence, le glucose est ajouté dans le milieu de culture sous forme de sirop, par exemple de sirop à des concentrations de 100 à 700 g/L.
L'homme du métier sait mesurer la concentration en glucose d'un milieu de culture. Par exemple, il est possible d'opérer des prélèvements dudit milieu de culture et de procéder à un dosage, par exemple de type dosage enzymatique ou quantification par CLHP. Une autre possibilité est d'analyser la composition du gaz en sortie de fermenteur, notamment par le mesure du ratio [O2] / [CO2]. Cette méthode peut avantageusement être implémentée en ligne en continu en sortie du fermenteur. Selon un mode de réalisation, l'étape (a) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0- 7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,75. L'homme du métier est par ailleurs familier avec les techniques de fermentation (telles que notamment décrites dans Fermentation & Biochemical Engineering Handbook : principles, procès s design & equipment, 2nd ed 1996 de VOGEL Henry C. et
TODARO Céleste L.).
La fermentation est une réaction biochimique qui consiste généralement à libérer de l'énergie, ou à produire certains métabolites d'intérêt, à partir d'un substrat organique sous l'action d'enzymes microbiennes.
La fermentation est généralement conduite dans des dispositifs (fermenteurs) adaptés au processus de fermentation, c'est-à-dire adaptés à la culture de microorganismes dans les conditions voulues (dispositifs permettant le cas échéant de contrôler les équilibres gazeux du milieu de culture, notamment par des conduits d'entrée et/ou de sortie en gaz, évents, etc ; dispositifs permettant l'introduction de milieu de culture et autres substances ; dispositifs permettant de contrôler, réguler, modifier d'autres types de paramètres, tels que l'agitation, la température, le pH, etc).
L'homme du métier est également familier avec la fermentation en conditions anaérobies. Selon la présente invention, ceci désigne des conditions de culture en l'absence d'oxygène. De manière préférée, des conditions de culture anaérobies sont des conditions de culture en présence de dioxyde de carbone. Selon un mode de réalisation, les conditions de fermentation anacrobies en présence de CO2 et/ou avec apport de CO2 sont des conditions de fermentation en saturation de CO2.
Le procédé de l'invention comprend une étape (b) de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) (ci -dessus décrite) en condition anaérobie en présence de CO2 par ajout de glucose au milieu de culture de l'étape (a).
Le glucose peut être ajouté sous forme de sirop. De préférence, le glucose est ajouté dans le milieu de culture sous forme de sirop, par exemple de sirop à des concentrations de 100 à 700 g/L. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (b), le glucose est ajouté en une seule fois, de manière à obtenir une concentration de 50 à 80 g/L, par exemple de 60g/L du milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-
7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,75. Selon un mode de réalisation, l'étape (c) comprend une acidification. L'acidification peut notamment être réalisée par ajout d'au moins un acide choisi parmi l'acide ortho- phosphorique, l'acide oxalique, l'acide sulfurique. Ces acides peuvent être ajoutés purs ou sous forme de solutions aqueuses concentrées.
Selon un mode de réalisation, l'étape optionnelle de purification (d) comprend une purification éthanolique qui se déroule comme suit : - filtration (élimination d'un précipité protéique), par exemple sur Bϋchner et/ou sur terre de filtration du moût acidifié, optionnellement, concentration du filtrat par évaporation sous vide (de préférence, suivant un facteur de concentration entre environ 2 et 8), ajout d'éthanol, par exemple de l'éthanol 95%, dans un rapport 1/1 à 5/1, pour provoquer la précipitation des sels (l'acide succinique reste soluble), séparation du précipité salin par filtration, par exemple sur une membrane, récupération de l'éthanol par évaporation sous vide,
- traitement sur charbon actif, puis filtration sur plaque et terre de filtration. En outre, l'étape de purification peut être suivie d'une étape de cristallisation de l'acide succinique purifié.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-1), le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » à une vitesse G(t) telle que :
G(t) < G0 avec : - G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape
(a-1),
Go = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1). Selon l'invention, la vitesse d'ajout du glucose G(t) est généralement exprimée en masse de glucose par unité de temps, par exemple en kg de glucose par heure. Toutefois, si besoin, l'homme du métier pourra facilement la convertir en concentration de glucose par unité de temps.
L'homme du métier sait déterminer la valeur de Go, notamment en fonction de la quantité de biomasse à l'instant to. Elle dépend du taux de croissance maximale de la biomasse et du rendement de conversion du glucose en biomasse. La valeur de Go est en effet classiquement déterminée par la formule suivante :
G0 = [μ max x Co] / Yx/s
Où :
G0 est exprimé en g/L/h, μ max = Taux de croissance maximal en h"1 en conditions aérobies, Co = Concentration initiale en biomasse en g/L, Yx/s = Rendement de conversion du glucose en biomasse en g/g.
Par exemple, dans le cas de la souche E. coli SBS550 MG pHL 413, cette valeur de Go varie entre 0,1 et 5 g de glucose par litre de milieu de culture et par heure (g/l/h). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » exponentiel. Ainsi, dans ce cas, lors de l'étape (a-1), le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » tel que :
G(t) = G0 . exp(α.t) et
(1/4) μmax < α < μmax avec :
G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape
(a-1),
Go = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1), α = coefficient d'ajout du glucose, μmax = taux de croissance μ maximal de la souche en conditions aérobies. (« exp » désigne la fonction exponentielle).
Ainsi, l'ajout en glucose suit avantageusement un profil exponentiel « calqué » sur le profil de croissance de la souche (et inversement). L'homme du métier sait déterminer le taux de croissance μ d'une souche donnée en conditions aérobies : dans des conditions de croissance exponentielle, la population de cellules de la souche suit généralement une équation du type :
Figure imgf000009_0001
où :
- N0 = nombre de cellules au temps To
Nj = nombre de cellules au temps T] > T0.
L'homme du métier sait donc déterminer la valeur de μ de manière expérimentale, par exemple avec des mesures de densité optique. En optimisant les conditions de croissance, l'homme du métier peut ainsi déterminer la valeur μmax pour une souche donnée.
Selon un mode de réalisation, 0,25 μmax < α < μmax ; de préférence 0,50 μmax < α < μmax ; de préférence 0,60 μmax < α < μmax ; de préférence 0,90 μmax < α < μmax ; de préférence 0,95 μmax < α < μmax. Selon un autre mode de réalisation, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » exponentiel puis linéaire. Ainsi, dans ce cas, le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » tel que l'étape (a-1) comprend :
(a-l)(i) une étape (de to à ti) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », tel que :
G(t) = G0 . exp(α.t) et
(1/4) μmax < α < μmax ; et
(a-1) (ii) une étape (de ti à t2) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », tel que
G(t) = G0 . exp(α.ti) avec G(t), Go, α, μ et μmax tels que décrits ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préférentiel, au début de l'étape (a-1) (« fed-batch » linéaire ou exponentiel), le milieu de culture contient une concentration en glucose 0 à 0,5 g/L, de préférence 0 à 0,2 g/L. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a-1) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7.0.
Dans tous les cas, en fin d'étape (a-1), la concentration en glucose dans le milieu de culture est inférieure ou égale à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure ou égale à 0,3 g/L et plus préférentiellement encore inférieure ou égale à 0,1 g/L
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend une étape de culture intermédiaire (a-2).
Lors de l'étape (a-2), on peut ajouter dans le milieu de culture : du glycérol, et/ou - de l'acide gluconique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide succinique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. Selon un premier mode préférentiel de réalisation du procédé selon l'invention, lors de l'étape (a-2) on peut ajouter dans le milieu de culture : de l'acide acétique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci. Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, lors de l'étape (a- 2) on peut ajouter dans le milieu de culture de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. L'ajout peut se faire selon différentes modalités : ajout d'une suspension et/ou ajout d'une solution et/ou ajout d'un solide (par exemple sous forme de poudre). Avantageusement, l'ajout de ces composés permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 5- 15 g/L, de préférence 7-12 g/L, de préférence environ 10 g/L de glycérol. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 5- 15 g/L, de préférence 7-12 g/L, de préférence environ 10 g/L d'acide gluconique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide gluconique peut être ajouté sous forme de gluconate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2-
15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide pyruvique peut être ajouté sous forme de pyruvate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2-
15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide malique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide malique peut être ajouté sous forme de malate de sodium.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2- 15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide succinique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide succinique peut être ajouté sous forme de succinate de sodium.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2-
15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide acétique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide acétique peut être ajouté sous forme d'acétate de sodium.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et de l'acide malique ou un sel de celui-ci. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : 2-10 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et
- 2-10 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci).
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture :
- 3-5 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et - 3-5 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci).
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : 2-10 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), 2-10 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et 1-10 g/L d'acide acétique (ou équivalent d'un sel de celui-ci). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture :
- 3-5 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), - 3-5 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et
1,5-2,5 g/L d'acide acétique (ou équivalent d'un sel de celui-ci).
Toutes les concentrations et combinaisons de concentrations mentionnées ci-dessus pour les ajouts de glycérol, acide gluconique, acide pyruvique, acide malique, acide succinique, acide acétique et le cas échéant de leurs sels peuvent être préférentiellement utilisées lorsque la concentration en biomasse en fin de l'étape (a-1) est d'environ 10 g/L. En outre, ces concentrations peuvent avantageusement être doublées pour une concentration en biomasse d'environ 20 g/L en fin de l'étape (a-1) ; triplées pour une concentration en biomasse d'environ 30 g/L en fin de l'étape (a-1), etc. Selon un mode de réalisation particulier, le glycérol et les acides organiques mentionnés ci-dessus (et/ou leurs sels) peuvent être ajoutés par ajout, dans le milieu de culture, de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation. Ceci permet avantageusement de recycler une partie des eaux-mères de cristallisation obtenues précédemment comme source d'acides organiques et autres substrats. Plus généralement, selon un mode de réalisation avantageux, lors de l'étape (a-2), on ajoute, dans le milieu de culture, toute composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique. Ceci peut notamment inclure l'ajout de différents éluats obtenus lors de tels procédés de production ou de purification. Avantageusement, ceci permet de recycler une partie des sous-produits obtenus.
Selon un autre mode de réalisation préféré, lors de l'étape (a-2), on ajoute du glucose dans le milieu de culture, et on maintient une valeur de pression partielle en O2 dans le milieu de culture dans un intervalle de 0-5%, de préférence 0-2%, de préférence 0-1% ; et on régule la valeur du pH du milieu de culture. L'homme du métier est familier avec la notion de pression partielle d'un gaz dans un milieu liquide. En particulier, l'homme du métier sait déterminer et réguler la pression partielle en O2 (pθ2) dans un milieu de culture. Par exemple, il est possible de maintenir une certaine valeur de pθ2 dans un fermenteur en ajustant les paramètres d'agitation du milieu de culture.
L'homme du métier sait parfaitement réguler le pH du milieu de culture. Par « réguler le pH », on entend selon la présente invention, l'action de maintenir la valeur du pH du milieu de culture dans un certain intervalle ou sélection de valeurs. Selon l'invention, le pH peut être régulé de différentes façons : - régulation dans un intervalle : la valeur du pH est maintenue dans un certain intervalle de valeurs. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois sortir de l'intervalle considéré ; régulation « point bas » : la valeur du pH est maintenue au dessus d'une valeur seuil. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois descendre en deçà de la valeur seuil ; régulation à une valeur unique : la valeur du pH est maintenue à cette valeur de manière constante au cours du temps.
L'homme du métier peut notamment utiliser des acides (par exemple, acide sulfurique concentré, acide chlorhydrique concentré) ainsi que des bases (solutions concentrées de NaOH, solutions de NH3, etc).
Selon l'invention, lors de l'étape (a-2), le glucose peut être ajouté en une ou plusieurs fois.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en une fois. Par exemple, il est possible d'ajouter en une fois dans le milieu de culture 5-15, de préférence 8-12, de préférence environ 10 g/L de glucose en une fois. Le pH du milieu de culture peut être régulé par ajout d'au moins un acide minéral. L'acide minéral peut typiquement être choisi parmi l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique, ρur(s) ou concentrés(s).
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en plusieurs fois. Par exemple, il est possible d'ajouter du glucose dans le milieu de culture en 5 à 15 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois). Selon un mode de réalisation, on peut ajouter dans le milieu de culture environ 1, 1,5 ou 2 g/L de glucose en 5 à 15 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois). On peut également ajouter du glucose dans le milieu de culture en 20 à 40 fois (ou en 25 à 35 fois, ou en 30 fois). Par exemple, on peut ajouter dans le milieu de culture environ 0,1, 0,3, ou 0,5 g/L de glucose en 15 à 30 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois).
Dans ce cas, le pH peut avantageusement être régulé de la manière suivante : après un premier ajout de glucose (par exemple de 1 g/L), l'ajout de glucose suivant (par exemple, de lg/L) est effectué dès qu'une augmentation de pH de 0,2 unités est observée ; et ainsi de suite. Alternativement, les ajouts de glucose peuvent être programmés dans le temps à intervalles réguliers, et le pH peut être régulé à une valeur unique ou dans un intervalle par ajout d'au moins un acide minéral. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le pH du milieu de culture est régulé par ajout de glucose : l'ajout du glucose est asservi aux variations du pH du milieu de culture. 11 est ainsi possible, par exemple, de fixer une valeur de consigne (régulation à une valeur unique), et de fixer une tolérance (par exemple 0,01 ou 0,02 unités de pH), et d'ajouter le glucose de sorte à ce que le pH du milieu de culture soit maintenu à la valeur de consigne (dans la tolérance choisie).
Avantageusement, les procédés ci-dessus permettent de minimiser les ajouts de neutralisants (acides et bases, notamment acides et bases minéraux), et ainsi de minimiser la charge saline (force ionique) du milieu de culture. Ceci permet avantageusement de faciliter la purification ultérieure de l'acide succinique. Avantageusement, cette étape (a-2) permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique. Selon un mode de réalisation préféré, lorsque l'on ajoute du glucose lors de l'étape (a- 2), la pression partielle en O2 du milieu de culture est maintenue à une valeur pθ2 = 0 %.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a-2) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7.0. Dans tous les cas, si une étape (a-2) est effectuée, en fin d'étape (a-2), le milieu de culture a de préférence une concentration de 0 à 5, de préférence 0 à 2, de préférence 0 à 1, de préférence 0 à 0,5 g/L en glucose. Selon un mode de réalisation, l'étape (a-1) et/ou l'étape (a-2) et/ou l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,4- 7.0.
Selon un mode de réalisation préféré, la souche d'Escherichia CoIi est une souche qui possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC. Ce génotype permet avantageusement de favoriser la production d'acide succinique par fermentation en présence de CO2. Le symbole Δ indique que le gène en question a été inactivé, par exemple par mutation, délétion, interruption, insertion, ou « down »-régulation, par exemple par introduction d'un codon stop, insertion ou délétion résultant en un changement du cadre de lecture, mutation ponctuelle, etc.
Le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC correspond donc à :
AadhE : inactivation de l'alcool déshydrogénase ;
AldhA : inactivation de la lactate déshydrogénase ;
AiclR : inactivation du répresseur de l'isocitrate lyase (également connue sous le nom de ace A)
- Aackpta : inactivation de l'acétate kinase-phosphotransacétylase ;
PYC : expression d'un gène de pyruvate carboxylase. Ceci indique que la souche exprime le gène PYC, par exemple grâce à une transformation par un plasmide portant un exemplaire fonctionnel de ce gène, ou par intégration génomique d'un exemplaire fonctionnel de PYC. Le gène PYC est avantageusement le gène pyc de
Lactococcus lactis.
Selon un mode de réalisation très préféré, la souche d'Escherichia CoIi est la souche SBS550MG - pHL413. Cette souche est décrite dans Sanchez et al., Metabolic Engineering, 7 (2005) 229-239, et dans les documents US 7,223,567 et US 2005/0042736.
La souche SBS550MG - pHL413 possède une valeur de μmax de 0,38. Par ailleurs, la présente invention concerne également l'utilisation d'un ajout en glucose selon un mode « fed-batch », notamment exponentiel ou linéaire, pour minimiser la production d'acide orotique dans un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation d'une souche d'Escherichia coli, ou pour augmenter la productivité spécifique en acide succinique dudit procédé.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition liquide étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation, pour la préparation d'un milieu de culture destiné à l'étape (a-2) selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. L'invention est illustrée par les exemples de réalisation ci-dessous, qui sont non- limitatifs.
Exemples
La souche utilisée est la souche SBS550MG - pHL413. (Toutes les concentrations indiquées ci-dessous sont sur la base du volume initial du milieu de culture à l'étape considérée). Pour chaque exemple, le schéma du protocole est le suivant : Phase de croissance, production de biomasse :
Pré-culture en Erlenmeyer ; - Culture en conditions aérobies avec ajout de glucose ;
Optionnellement, étape de culture intermédiaire. Production d'acide succinique :
Culture en conditions anaérobies en présence de CO2. Chaque étape est détaillée ci-dessous : Pré-culture :
- 250 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ; Composition du milieu :
Tryptone lO g/L
Extrait de levure 5 g/L NaCl 10 g/L
Antibiotiques (ampicilline, carbenicilline, oxacilline) 67 mg/L - Durée : 24 h ; température : 370C ; agitation : 100 rpm.
La pré-culture est ensuite transférée dans un fermenteur de 30L de type Sartorius. Culture en conditions aérobies avec ajout de glucose :
- Milieu : voir composition Tableau 1 ci-dessous. Volume initial de milieu 15 L ; - pH régulé à 6,75 avec NH3 ;
- Ajout en glucose : o Soit en mode batch (simple) : ajout de 30 g/L (en une fois) ; o Soit en mode « fed-batch » : ajout de 5 g/L, puis, après consommation, étape (a-1) avec ajout exponentiel d'une concentration cumulée de 25 g/L (valeur de α indiquée dans le Tableau 2) ;
- Durée : 15 - 20 h ; température : 370C ; Aération : 1 wm ;
- pθ2 (pression partielle en O2) maintenue à 20% par l'agitation. Culture intermédiaire = étape (a-2) (le cas échéant) : - Milieu : voir composition Tableau 1 ci-dessous ;
- pH régulé à 6,75 par ajout d'une solution de NaOH (8N) et/ou de H2SO4 (4N) - sauf mention contraire dans le Tableau 2 ;
Ajout en divers composés (dont glucose) : voir Tableau 2 ;
Durée : 1- 8 h ; température : 37°C ; - Aération : 1 wm ; pθ2 maintenue à 20% par agitation (agitation variant entre 300 et 1 000 rpm) ou à 0% (agitation fixée à 350 rpm). Production d'ions succinates = étape (b) : pH régulé à 6,75 par ajout d'une solution de NaOH (8 N) ; - Ajout de glucose : 60 g/L en une fois ;
- Durée : 24 - 48 h ; température : 370C ;
- Apport en CO2 (débit d'injection) : 0,2 wm ; Agitation : 200 rpm.
Résultats : Avantageusement selon l'invention, et de manière totalement inattendue, en comparaison avec un ajout de glucose selon un mode de batch simple, non seulement le mode « fed-batch » (étape (a-1) selon l'invention) permet de réduire drastiquement la production d'acide orotique, mais également, de manière surprenante, le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement en biomasse, ainsi que le rendement de production en acide succinique et la productivité spécifique d'une souche donnée. En outre, l'étape (a-2) selon l'invention permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique.
Tableau 1 : Composition du milieu de culture
Les concentrations indiquées sont exprimées par rapport au volume initial.
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Tableau 2 : Description des protocoles et résultats
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Légende du tableau 2 : α : coefficient d'ajout du glucose lors de l'étape (a-1) ; Ajout en batch : ajout en une fois (batch dit « simple ») ; Ajouts multiples : ajouts en plusieurs fois (puises);
RDT Biom Yxs (%) : rendement de conversion du glucose en biomasse lors de l'étape (a-1) ;
RDT Prod Yps (%) : rendement de conversion du glucose en acide succinique lors de l'étape (b) ;
Acide orotique produit et acide succinique produit : mesurés par CLHP ; - Prod. Spec. qp (g/g/h) : productivité spécifique de la biomasse lors de l'étape (b) = quantité d'acide succinique produit par g de biomasse par heure.

Claims

Revendications
1. Procédé de production d'acide succinique, comprenant :
(a) une étape de culture d'une souche à'Escherichia coli dans un milieu de culture, où ladite étape (a) comprend :
(a-1) une étape de culture de la souche en conditions aérobies lors de laquelle du glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », et durant laquelle la concentration en glucose dudit milieu de culture est inférieure à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure ou égale à 0,3 g/L et plus préférentiellement encore inférieure ou égale à 0,1 g/L ;
(a-2) optionnellement, une étape de culture intermédiaire ;
(b) une étape de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) en conditions anaérobies en présence de CO2 ;
(c) une étape de conversion des ions succinate formés à l'étape (b) en acide succinique ;
(d) optionnellement, une étape de purification de l'acide succinique.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » à une vitesse G(t) telle que :
G(t) < G0 avec :
G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape (a-1),
G0 = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1).
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch » tel que : G(t) = G0 . exp(α.t) et
(1/4) μmax < α < μmax avec :
- G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape (a-1),
Go = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1), α = coefficient d'ajout du glucose, μmax = taux de croissance μ maximal de la souche en conditions aérobies.
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (a-1) comprend :
(a- 1 )(i) une étape (de to à tj) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », tel que : G(t) = G0 . exρ(α.t) et
(1/4) μmax < α < μmax ; et
(a-1) (ii) une étape (de tj à t2) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode « fed-batch », tel que
G(t) = G0 . exp(α.ti) avec :
G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape (a-1),
G0 = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1), α = coefficient d'ajout du glucose, μmax = taux de croissance μ maximal de la souche en conditions aérobies.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : du glycérol, et/ou de l'acide gluconique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide succinique ou un sel de celui-ci, et/ou de l'acide acétique ou un sel de celui-ci.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et de l'acide acétique ou un sel de celui-ci.
7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture de l'acide acétique ou un sel de celui-ci.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-7, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute, dans le milieu de culture, toute composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple on ajoute tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute du glucose dans le milieu de culture, on maintient une valeur de pression partielle en O2 dans le milieu de culture dans un intervalle de 0-5%, et on régule la valeur du pH du milieu de culture.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en une fois.
11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en plusieurs fois.
12. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le pH du milieu de culture est régulé par ajout de glucose.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-12, dans lequel, lors de l'étape (a-2), la pression partielle en O2 du milieu de culture est maintenue à une valeur de pθ2 = 0 %.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-13, dans lequel l'étape (a-1) et/ou l'étape (a-2) et/ou l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-14, dans lequel la souche d'Escherichia coli possède le génotype ΔadhE ΔldhA AiclR Aackpta PYC, de préférence la souche $ Escherichia coli est la souche SBS550MG - pHL413.
16. Utilisation d'un ajout en glucose selon un mode « fed-batch » pour minimiser la production d'acide orotique dans un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation d'une souche d'Escherichia coli.
17. Utilisation d'une composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition liquide étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation, pour la préparation d'un milieu de culture destiné à l'étape (a-2) selon l'une quelconque des revendications 5-7.
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