WO2023191606A1 - 태반유래 양막상피세포에서 포집된 세포외 소포 기반의 안과용 국소 약물전달체 - Google Patents

태반유래 양막상피세포에서 포집된 세포외 소포 기반의 안과용 국소 약물전달체 Download PDF

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WO2023191606A1
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WO
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extracellular vesicles
derived
evs
epithelial cells
amniotic epithelial
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김홍균
이재영
이한솔
이수진
김정호
박병웅
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경북대학교 산학협력단
충남대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention provides an ophthalmic drug delivery system based on extracellular vesicles (EVs) captured in placenta-derived amniotic epithelial cells and a method for manufacturing the same.
  • EVs extracellular vesicles
  • amnion epithelial cells derived from the amniotic membrane are of great interest from a regenerative medicine perspective because they have the biological flexibility to differentiate into any germ layer. They not only have the proliferation and differentiation abilities of embryonic stem cells, but also have the ability to differentiate into adult stem cells. It is known to have the same immunomodulating ability. These epithelial cells can be stably isolated and cultured, and compared to adult stem cells, there are no ethical problems in obtaining them, and they have the advantage of being non-immunogenic and tumorigenic. Due to these advantages, amniotic epithelial cells are being studied in many regenerative medicine treatment approaches as a method of stem cell therapy.
  • the amniotic membrane is composed of simple cuboidal epithelium, a thick basement membrane, and avascular mesenchymal stroma, and has the characteristic of not showing rejection even when transplanted.
  • the epithelial cells of the amniotic membrane have the very same biological characteristics and affinity as the epithelial cells of the ocular surface. , Histologically, it is very similar to the ocular surface, so it can provide a mechanical shield in ocular surface diseases, and it is known to be able to maintain the growth and characteristics of epithelial cells on the ocular surface, so amniotic membrane can be transplanted to the ocular surface. Amniotic membrane transplantation is often performed for ocular surface diseases.
  • amnion inhibits epithelial apoptosis, promotes epithelialization and reduces inflammation during the wound healing process, and inhibits new blood vessel formation, thereby suppressing scar formation after wound healing.
  • amniotic membrane transplantation is always performed through a surgical method, complications such as scar formation, bleeding, and infection may occur due to surgery, and there are limitations to repeat transplantation.
  • an eye drop treatment using some components of the amniotic membrane which contains components of the epithelial cells of the amniotic membrane with the therapeutic effect of stem cells, has been proposed.
  • Extracellular vesicles (EVs) are used in various cell types.
  • Extracellular vesicles are nano-sized endoplasmic reticulum surrounded by a lipid bilayer that all cells secrete into the external environment.
  • Extracellular vesicles are luminal vesicles created by the endosomal membrane moving inward during the maturation of multi-vesicle endosomes, and are secreted when multi-vesicle endosomes bind to the cell surface.
  • Extracellular vesicles contain a variety of biologically active substances such as proteins, lipids, nucleic acids, and metabolites, and reflect the state of the cells from which they originate.
  • Extracellular vesicles function as intercellular signaling substances secreted by cells, and are known to play a role in intercellular communication because they contain nuclear components as well as receptors and proteins.
  • extracellular vesicles Because it contains bioactive molecules, it fuses with target cells and delivers bioactive molecules, making it easy to induce physiologically active effects on target cells.
  • extracellular vesicles are derived from cells, they have low immunogenicity and have the same membrane topology as cells, so they easily attach to target cells.
  • extracellular vesicles are being explored as tools for a variety of therapeutic approaches, including antitumor therapy, pathogen vaccination, immunomodulatory and regenerative therapies, and drug delivery.
  • extracellular vesicles of various sizes are secreted from amniotic epithelial cells during the cell culture process.
  • extracellular vesicles of specific sizes have the characteristics of amniotic epithelial cells that specifically adhere well to the ocular surface. It may have the potential to be a new type of drug delivery vehicle that can deliver drugs through the surface.
  • Drug carriers with specific adhesion ability to the ocular surface may have the following advantages: Because they have high adhesion to the ocular surface, they can have sufficient effects with only a low concentration of drug compared to general drug carriers, significantly reducing drug-induced toxicity; It can increase intraocular drug concentration compared to existing drug delivery vehicles, and it is easy to combine various drugs.
  • the purpose of the present invention is to provide extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells encapsulating drugs for ophthalmic diseases.
  • EVs extracellular vesicles
  • Another object of the present invention is to provide a drug delivery system containing extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells.
  • EVs extracellular vesicles
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for ophthalmic diseases containing the amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs).
  • EVs amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • the present invention provides extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells encapsulating drugs for ophthalmic diseases.
  • EVs extracellular vesicles
  • the present invention provides a drug delivery system comprising extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells.
  • EVs extracellular vesicles
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for ophthalmic diseases containing the amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs).
  • EVs amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • the present invention relates to extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells encapsulating drugs for ophthalmic diseases. Since the auxiliary components for drug dissolution are contained in the extracellular vesicles, ocular toxicity caused by drugs can be dramatically reduced. The ability to deliver drugs through the ocular surface is increased, so it can be used as a drug delivery vehicle or pharmaceutical composition.
  • EVs extracellular vesicles
  • Figure 1 shows the characteristics of a formulation in which a therapeutic drug is encapsulated in extracellular vesicles.
  • Figure 2 shows the characteristics of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells.
  • Figure 3 shows the process of producing extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells encapsulated with cyclosporine.
  • Figure 4 shows the size and polydispersity of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells encapsulated with cyclosporine.
  • Figure 5 shows the results of a cell viability confirmation test of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells encapsulated with cyclosporine.
  • Figure 6 shows the evaluation of the physical stability of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells encapsulated with cyclosporine.
  • Figure 7 shows the results of an experiment measuring tear secretion in a dry eye syndrome mouse model.
  • Figure 8 shows the results of corneal irregularity analysis in a dry eye syndrome mouse model.
  • Figure 9 shows the results of corneal Lissamine green staining analysis in a dry eye syndrome animal model.
  • Figure 10 shows the results of PAS (periodic acid Schiff) staining analysis of conjunctival tissue in a dry eye syndrome animal model.
  • Figure 11 shows the characteristics of extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • Figure 12 shows the size and polydispersity of extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells before containing the drug.
  • Figure 13 shows the results of a comparative experiment on IL-8 secretion between extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • Figure 14 shows the results of a comparative experiment of human epidermal growth factor (human EGF) contained in extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • human EGF human epidermal growth factor
  • Figure 15 shows the results of a comparative experiment on mouse corneal epithelial invagination of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • Figure 16 shows the results of comparative analysis of mouse cornea irregularity of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • Figure 17 shows the results of comparative analysis of PAS (periodic acid Schiff) staining of mouse conjunctival tissues of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells.
  • PAS peripheral acid Schiff
  • the present invention provides extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells encapsulating a drug for ophthalmic disease, and the ocular disease may preferably be an ocular surface disease or an intraocular disease.
  • EVs extracellular vesicles
  • the ocular surface disease may be one selected from the group consisting of dry eye syndrome, corneal opacity, corneal epithelial damage, corneal inflammation, corneal fibrosis, and corneal neovascularization.
  • the drug for ocular surface disease may be one selected from the group consisting of cyclosporine, lipitegrast, and diquafosol, but is not limited thereto.
  • the intraocular disease may be one selected from the group consisting of intraocular inflammation, infection, glaucoma, vascular disease of the retina, and macular degeneration.
  • Drugs for intraocular diseases include a group consisting of anti-inflammatory drugs such as fluoromethorone, loteprednol, prednisolone, and tacrolimus; A group consisting of infection treatment agents such as moxifloxacin, levofloxacin, cephalosporin, vancomycin, acyclovir, ganciclovir, natamycin, and voriconazole; A group consisting of glaucoma treatments such as timolol, betaxolol, brimonidine, brinzolamide, latanoprost, travoprost, taploprost, bimatoprost, pilocarpine and dozolamide; and a group consisting of agents for treating retinal vascular diseases such as anti-vascular endothelial growth factor (anti-VEGF) and triamcinolone; It may be one selected from among, but is not limited to.
  • anti-VEGF anti-vascular endothelial growth factor
  • the extracellular vesicles may be extracellular vesicles (EVs).
  • EVs extracellular vesicles
  • the average particle diameter of the extracellular vesicles may be 50 to 200 nm, preferably 60 to 80 nm, and more preferably 70 nm.
  • the extracellular vesicles may have a drug encapsulation rate of 90 to 99%, preferably 96 to 98%.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells.
  • EVs extracellular vesicles
  • the drug delivery system can encapsulate the drug in extracellular vesicles using additives.
  • the additives are cyclodextrin, hypromellose (hydroxypropyl methylcellulose (HPMC)), D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS), and trehalose. It may be one or more selected from the group consisting of (trehalose), but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for ophthalmic diseases containing extracellular vesicles (EVs) derived from amniotic epithelial cells.
  • EVs extracellular vesicles
  • the ophthalmic disease may be an ocular surface disease
  • the pharmaceutical composition may be in an eye drop formulation. there is.
  • the pharmaceutical composition may contain suitable carriers, excipients, disintegrants, sweeteners, coating agents, bulking agents, lubricants, lubricants, flavoring agents, antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, etc. commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. It may further include one or more additives selected from the group consisting of diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants.
  • carriers, excipients, and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, and microcrystalline.
  • Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil can be used.
  • the dosage of the active ingredient according to the present invention may vary depending on the subject's condition and weight, type and degree of disease, drug form, administration route and period, and may be appropriately selected by a person skilled in the art, and the daily dosage is 0.01 mg. /kg to 200 mg/kg, preferably 0.1 mg/kg to 200 mg/kg, more preferably 0.1 mg/kg to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several administrations, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • mice were maintained in a normal breeding environment (average humidity 60 ⁇ 10%, 23°C ⁇ 2.5°C).
  • the placenta removed by cesarean section from a pregnant woman without complications was placed in a sterilized container and washed with saline solution to remove blood clots. An incision was made starting from the umbilical cord using medical scissors, and the amniotic membrane was peeled off little by little using forceps starting from the chorionic membrane. The separated amniotic membrane was spread on a stainless steel plate with the epithelium facing down, then rubbed by hand to remove any remaining chorion and blood clots, and rinsed five times with physiological saline.
  • the amniotic membrane was spread on a stainless steel plate with the epithelium facing down, and NC paper (nitrocellulose paper, 0.45 ⁇ m) was covered on top to attach the amniotic membrane to the NC paper. After attachment, it was cut into squares of about 5 to 10 cm, placed in a container containing HBSS (Hank's balanced salt solution), and transported to the laboratory.
  • NC paper nitrocellulose paper, 0.45 ⁇ m
  • the separated amniotic membrane was transferred to a sterilized beaker and washed several times using HBSS to completely remove remaining blood and tissue debris, and then the amniotic membrane pieces were washed in PBS containing 0.5mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and penicillin-streptomycin. Incubation was performed at 37°C for 10 minutes. Afterwards, the solution was placed in a 0.05% trypsin/EDTA solution at 37°C for 5 minutes, the solution was discarded to remove residues, and the solution was reacted with a new 0.05% trypsin/EDTA solution at 37°C for 10 minutes while shaking intermittently. Next, the cultures were collected.
  • PBS containing 0.5mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and penicillin-streptomycin. Incubation was performed at 37°C for 10 minutes. Afterwards, the solution was placed in a 0.05% trypsin/EDTA solution at 37°C for 5
  • the isolated cells were cultured with poly-L-lysine at a density of 1.2 ⁇ 105/cm 2 using DMEM/F12 (10% FBS, 1% P/S) culture medium. They were seeded on a coated culture dish and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions. If necessary, 10 ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF), ROCK (Rho-Associated Coil Kinase) inhibitor, and leukemia inhibitory factor (LIF) were added and cultured.
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • ROCK Rho-Associated Coil Kinase
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • Amniotic epithelial cells were grown to 80% confluency in DMEM/F12 (10% FBS, 10 ng/ml EGF, 1% P/S) poly-L-lysine coated culture dish, and the cells were incubated in PBS. All remaining medium was removed by washing three times. The medium was replaced with DMEM/F12 (1% Exosome Free FBS, 10 ng/ml EGF, 1% P/S) medium, and 72 hours later, the conditioned medium was collected. After centrifugation at 300 ⁇ g for 5 minutes to remove remaining cells in the medium, the supernatant was collected and centrifuged at 1,200 ⁇ g for 20 minutes to remove remaining cell debris.
  • DMEM/F12 1% FBS, 10 ng/ml EGF, 1% P/S
  • the collected supernatant was prepared by concentrating up to 50 times using a centrifugal concentrator (100,000 MWCO memebrane; Corning) and stored at 4°C until use. Extracellular vesicles were isolated from the concentrated supernatant using a phosphatidyl binding isolation kit (MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS, Wako).
  • the MagCapture method is an extracellular vesicle separation method through phosphatidylserine (PS) binding. It separates extracellular vesicles that bind to an extracellular vesicle capture (exosome capture) coupled to magnetic beads without using antibodies. did. Briefly, the streptavidin magnetic beads included in the kit were diluted in exosome capture immobilizing buffer and reacted on a magnetic stand for 1 minute, leaving only the beads. Biotin-labeled extracellular vesicle capture was added thereto, treated at 4°C for 10 minutes using a rotator, and then reacted on a magnetic stand for 1 minute to prepare extracellular vesicle capture immobilization beads.
  • PS phosphatidylserine
  • Samples were prepared by adding 1:500 volume ratio of exosome binding enhancer ( ⁇ 500) to the concentrated conditioned medium, and reacted using extracellular vesicle capture immobilization beads and a rotator at 4°C for more than 3 hours. After this, only the extracellular vesicles (EVs)-bound beads were separated using a magnetic stand.
  • exosome binding enhancer ⁇ 500
  • the extracellular vesicle (EVs)-binding beads were washed using a washing buffer containing an extracellular vesicle binding enhancer, and only the extracellular vesicle (EVs)-binding beads were left behind using a magnetic stand.
  • Extracellular vesicles (EVs)-binding beads were added with extracellular vesicle elution buffer to elute magnetic beads and extracellular vesicles, and finally extracellular vesicles were obtained.
  • the obtained extracellular vesicles were resuspended in PBS and used immediately, or stored at -80°C until use.
  • the shape of the extracellular vesicles as shown in Figure 2B was observed using a transmission electron microscope (TEM). 20 ⁇ l of the extracellular vesicle solution was adsorbed onto a 200 mesh carbon-coated copper grid. Samples were fixed in a solution of 2% PFA paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, and 0.05 M phosphate for 2 min. Next, the grids were washed three times with distilled water and dehydrated in absolute ethanol for 10 min. Extracellular vesicles were then negatively stained using 2% aqueous phosphotungstic acid. Grids were dried overnight and analyzed with a 120 keV HT 7700 electron microscope (Hitachi, Japan).
  • the isolated extracellular vesicle pellet was resuspended in RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, USA) supplemented with protease and phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, USA), and amniotic epithelial cell lysate was used as a control. . After centrifugation at 15,000 xg for 20 minutes, the supernatant was collected and protein concentration was measured using the PierceTM BCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Protein samples were boiled in sodium dodecyl sulfate (SDS) loading dye for 5 min and proteins were separated using 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Protein samples were transferred to nitrocellulose membranes (GE Healthcare, USA), blocked with 5% skim milk in Tris-buffered saline (TBS) buffer for 1 h at room temperature, and then incubated with CD63 antibody, CD9 antibody, CD81 antibody, and GM130 antibody (1:1000; SBI, USA) and reacted overnight at 4°C. After washing, as shown in Figure 2C, the cells were incubated in HRP-conjugated secondary antibodies for 1 hour and immunoreactivity was visualized with Pierce ECL Western blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, USA) in a LAS system (LAS 4000; GE Healthcare, USA). .
  • cyclosporine (CsA)-encapsulated extracellular vesicles were prepared using culture and sonication methods.
  • Extracellular vesicle solution (1 mL) was prepared to contain 0.1% D- ⁇ -tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) and 0.25% hydroxypropyl methylcellulose (HPMC).
  • Cyclosporine was dissolved in ethanol and added to the mixture to obtain a drug concentration of 0.05% (w/v). The mixture was stirred for 5 min, incubated in a 37 °C water bath for 5 min, and then sonicated (VC505; Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA) at 20% amplitude for 1 min.
  • TPGS D- ⁇ -tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate
  • HPMC hydroxypropyl methylcellulose
  • extracellular vesicles were 50 to 200 nm in size. was measured.
  • mesenchymal stem cells were purchased from Cell Bio (Seoul, Korea) and cultured. Using CEFOgro Human MSC Growth (10% FBS, 1% P/S) culture medium, 1.2 ⁇ 105/cm 2 cells were seeded in a cell culture dish and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • Mesenchymal stem cells were grown to 80% confluence in a cell culture dish using CEFOgro Human MSC Growth (10% FBS, 1% P/S) culture medium, and the cells were washed three times with PBS to remove all remaining medium. The medium was replaced with aMEM (1% Exosome Free FBS, 1% P/S) medium, and 72 hours later, the conditioned medium was collected. After centrifugation at 300 ⁇ g for 5 minutes to remove remaining cells in the medium, the supernatant was collected and centrifuged at 1,200 ⁇ g for 20 minutes to remove remaining cell debris.
  • CEFOgro Human MSC Growth 10% FBS, 1% P/S
  • MEM 1% Exosome Free FBS, 1% P/S
  • the collected supernatant was prepared by concentrating up to 50 times using a centrifugal concentrator (100,000 MWCO memebrane; Corning) and stored at 4°C until use. Extracellular vesicles were isolated from the concentrated supernatant using a phosphatidyl binding isolation kit (MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS, Wako).
  • the shape of the extracellular vesicles as shown in Figure 11B was observed using a transmission electron microscope (TEM). 20 ⁇ l of the extracellular vesicle solution was adsorbed onto a 200 mesh carbon-coated copper grid. Samples were fixed in a solution of 2% PFA paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, and 0.05 M phosphate for 2 min. Next, the grids were washed three times with distilled water and dehydrated in absolute ethanol for 10 min. Extracellular vesicles were then negatively stained using 2% aqueous phosphotungstic acid. Grids were dried overnight and analyzed with a 120 keV HT 7700 electron microscope (Hitachi, Japan).
  • the isolated extracellular vesicle pellet was resuspended in RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, USA) supplemented with protease and phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, USA), and amniotic epithelial cell lysate was used as a control. . After centrifugation at 15,000 xg for 20 minutes, the supernatant was collected and protein concentration was measured using the Pierce BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Protein samples were boiled in sodium dodecyl sulfate (SDS) loading dye for 5 min and proteins were separated using 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Protein samples were transferred to nitrocellulose membranes (GE Healthcare, USA), blocked with 5% skim milk in Tris-buffered saline (TBS) buffer for 1 h at room temperature, and then incubated with CD63 antibody, CD9 antibody, CD81 antibody, and GM130 antibody (1:1000; SBI, USA) and reacted overnight at 4°C. After washing, incubation in HRP-conjugated secondary antibody for 1 hour and visualization of immunoreactivity with Pierce ECL Western blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, USA) in a LAS system (LAS 4000; GE Healthcare, USA), as shown in Figure 11C. did.
  • mesodermal stem cells origin extracellular Check the size and polydispersity of the vesicles before they contain the drug.
  • Human corneal cell lines were distributed in 96-well plates, grown to 80% of the plate area, and then grown in cycles of concentrations of 0.01 ⁇ g/ml, 0.1 ⁇ g/ml, 1 ⁇ g/ml, 5 ⁇ g/ml, and 10 ⁇ g/ml.
  • Ssporine (CsA) Ssporine
  • CsA cyclosporine emulsion
  • CsA cyclosporine-encapsulated amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • As a control group a group treated with only extracellular vesicles was used. After treatment with each drug, cells were cultured in an incubator at 37°C for 24 hours, and 10 ⁇ l of CCK8 solution was added and cultured at 37°C for 2 hours to check cell viability.
  • CsA Amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles encapsulated with cyclosporine (CsA) were stored at room temperature and 4°C for 0, 5, 7, 14, and 28 days, and their physical stability was measured using NanoSight (Malvern zetasizer, Worcestershire, UK). ) was used to evaluate changes in particle size and polydispersity. The residual amount of cyclosporine (CsA) was expressed as % residual cyclosporine (CsA) relative to the initial amount.
  • mice in the above preparation example in which dry eye syndrome was induced by exposure to a scopolamine patch and dry stress for 10 days, were loaded with saline (NS), cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs), and cyclosporine.
  • Amniotic epithelial cell-derived exosomes (EVs+CsA) and prednisolone (Pred) were treated for up to 10 days, and tear production was measured on days 0, 3, 7, and 10.
  • a phenol red-impregnated cotton thread was placed on the side cantus of the mouse eye and measurements were made for 60 seconds. The thread wet with tears turned red, and the changed length was measured and evaluated.
  • mice of the preparation example in which dry eye syndrome was induced showed a decrease in tear secretion, and cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs) ), cyclosporine-encapsulated amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs+CsA), and prednisolone (Pred)-treated dry eye syndrome-induced mice were shown to induce tear secretion.
  • CsA cyclosporine
  • EVs+CsA amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • Pred prednisolone
  • mice in the above preparation example in which dry eye syndrome was induced by exposure to a scopolamine patch and dry stress for 10 days, were loaded with saline (NS), cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs), and cyclosporine.
  • Amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs+CsA) and prednisolone (Pred) were treated for up to 10 days, and the degree of corneal surface irregularity was analyzed on days 0, 3, 7, and 10.
  • a luminous O-ring was illuminated at the center of the mouse eye and the degree of distortion of the reflective O-ring was checked. The distortion score was measured from 0 to 5 points (divided crosswise into 4 parts centered on the center of the eye, 1 point assigned to each quadrant, and 1 point assigned to the degree of maintenance of the O-ring).
  • mice in the above preparation example in which dry eye syndrome was induced by exposure to a scopolamine patch and dry stress for 10 days, were loaded with saline (NS), cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs), and cyclosporine.
  • NS saline
  • CsA cyclosporine
  • EVs amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • Pred prednisolone
  • mice in the case of normal mice, there was almost no staining with lissamine green, but the corneal surface of mice with induced dry eye showed a high degree of lissamine green staining.
  • mice treated with cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs), cyclosporine-encapsulated amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs+CsA), and prednisolone (Pred) were treated with saline. It showed a lower degree of lissamine green staining compared to the experimental group treated only.
  • CsA cyclosporine
  • EVs amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • EVs+CsA cyclosporine-encapsulated amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles
  • Pred prednisolone
  • mice in the above preparation example in which dry eye syndrome was induced by exposure to the scopolamine patch and dry stress for 10 days, were loaded with saline (NS), cyclosporine (CsA), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs), and cyclosporine.
  • the cells were treated with amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (EVs+CsA) and prednisolone (Pred) for up to 10 days, sacrificed on the 10th day, and conjunctival tissue was recovered.
  • the obtained conjunctival tissue was fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin.
  • the tissue was cut to a thickness of 7 ⁇ m to prepare unstained slides, and periodic acid Schiff (PAS) staining was performed.
  • Conjunctival goblet cells were stained with PAS using a commercially available kit (Merck, Darmstadt, Germany) according to the manufacturer's instructions, and the stained area was photographed using an optical microscope.
  • Glycoprotein and glycogen, the main components of mucin synthesis in goblet cells were stained red by PAS staining, and these cells were counted to measure goblet cell density as the number of goblet cells per 100 ⁇ m.
  • amniotic epithelial cells origin extracellular Microbiome mesenchymal stem cells origin extracellular Comparison of IL-8 secretion from vesicles
  • Human conjunctival cell lines were distributed in 96-well plates, grown to 90% of the plate area, and then treated with 70 mM NaCl to induce dry eye in an in vitro environment.
  • Medium 199 (1% Exosome Free FBS, 1&P/S) culture medium was treated with 25 ⁇ g/ml each of extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells and extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells, and cultured for 24 hours. After culturing for 24 hours, the cell culture supernatant was obtained and IL-8 ELISA (R&D systems, USA) was performed using the supernatant.
  • a quantitative sandwich enzyme immunoassay technique was used to compare human epidermal growth factor (EGF) contained in the isolated extracellular vesicle pellet.
  • EGF epidermal growth factor
  • a control group without growth factors
  • extracellular vesicles derived from amniotic epithelial cells, and mesenchymal stem cells were placed on a microplate (Quantikine ELISA; human EGF immnuoassay; R&D systems, USA) pre-coated with a monoclonal antibody specific for human epidermal growth factor.
  • the derived extracellular vesicles were transferred. After 3 hours of incubation at room temperature, unbound extracellular vesicles were washed using wash buffer.
  • a PKH67-labeled extracellular vesicle pellet was obtained by ultracentrifugation at 4°C and 190,000 G for 2 hours.
  • Mouse corneal epithelial cells were treated with each extracellular vesicle, and 6 hours later, the animals were sacrificed to obtain eyeballs. After being fixed in 4% PFA for 24 hours, the eyeballs were blasted in OCT compound and 5 ⁇ m-thick sections were obtained. The slide glass with the mouse eye section attached was nuclear stained with DAPI and observed under a microscope.
  • mice of the preparation example above in which dry eye syndrome was induced by exposure to the scopolamine patch and dry stress for 10 days, were administered saline (NS), prednisolone (Pred), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (AM EVs), and mesenchymal stem cell-derived mice.
  • Extracellular vesicles (MSC EVs) were treated for up to 14 days, and the degree of corneal surface irregularity was analyzed on days 0, 3, 7, and 14.
  • a luminous O-ring was illuminated at the center of the mouse eye and the degree of distortion of the reflective O-ring was checked. The distortion score was measured from 0 to 5 points (divided crosswise into 4 parts centered on the center of the eye, 1 point assigned to each quadrant, and 1 point assigned to the degree of maintenance of the O-ring).
  • mice of the preparation example above in which dry eye syndrome was induced by exposure to the scopolamine patch and dry stress for 10 days, were administered saline (NS), prednisolone (Pred), amniotic epithelial cell-derived extracellular vesicles (AM EVs), and mesenchymal stem cell-derived mice.
  • Extracellular vesicles (MSC EVs) were treated for up to 14 days, and goblet cell density in mouse eyelids was measured on day 14.
  • mice The upper eyelids of anesthetized mice were fixed on a tray under a fluorescence microscope to be exposed to the outside, moxifloxacin eye drops (Vigamox®, Alcon Laboratories, TX, US) were instilled, and magnified images were obtained under a fluorescence microscope.
  • the goblet cells were fluorescent (white in Figure 17), and the goblet cell density within an area of 150 x 150 pixels was measured.

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Abstract

본 발명은 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)에 관한 것으로 약물의 용해를 위한 부성분등이 세포외 소포 내에 함유되므로 약물에 의한 안구독성을 획기적으로 줄일 수 있으며, 안구표면을 통하여 약물의 전달 능력이 증대되어 약물전달체나, 약학 조성물 등으로 활용가능하다.

Description

태반유래 양막상피세포에서 포집된 세포외 소포 기반의 안과용 국소 약물전달체
본 발명은 태반유래 양막상피세포에서 포집된 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs) 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법을 제공한다.
양막 (amnion)은 태반과 자궁의 가장 안쪽을 둘러싸고 있는 얇은 생체막으로, 모체로부터의 각종 감염 및 면역반응 등으로부터 태아를 보호하는 장벽 역할을 한다. 이러한 양막에서 유래한 양막상피세포는 양막상피세포는 어느 배엽으로나 분화가 가능한 생물학적 유연성을 가지고 있어 재생의학적인 관점에서 매우 주목하고 있는 세포로서 배아 줄기세포의 증식능과 분화능을 가지고 있을 뿐아니라 성체줄기세포와 같은 면역조절능력이 있는 것으로 알려져 있다. 이 상피세포는 안정적인 분리와 배양이 가능하며 성체줄기세포와 비교하여 수득하는데 윤리적인 문제가 없고 면역원성과 종양원성이 없다는 장점이 있다. 이러한 장점으로 양막상피세포는 줄기세포치료의 한 방법으로 많은 재생의학적 치료 접근법이 연구되고 있다.
양막은 단순입방상피와 두꺼운 기저막, 무혈관성의 간엽성 간질로 구성되어 이식하여도 거부 반응을 보이지 않는 특징이 있으며 양막의 상피세포는 안구표면의 상피세포와 매우 동일한 생물학적 특징과 친화도를 하지며, 조직학적으로 안구표면과 매우 유사하여 안과 질환에서 안구표면 질환에서 기계적인 방어막을 제공할 수 있으며, 안구표면의 상피세포의 성장과 특성을 유지시킬 수 있는 것으로 알려져 있어 양막을 안구표면에 이식하여 주는 양막 이식술이 안구표면질환에서 많이 시행되고 있다. 또한, 양막은 상피의 세포자멸사를 억제하여 창상치유과정에서 상피화를 촉진시키고 염증을 감소시키며, 신생혈관형성을 억제하여 상처 치유 후 반흔 형성도 억제한다. 그러나 양막 이식술은 반드시 수술적 방법을 통해 이루어지므로 수술에 의한 반흔 형성, 출혈, 감염 등의 합병증이 발생할 수 있으며, 반복 이식에도 제한점이 있다. 이러한 단점을 극복하고자, 줄기세포의 치료적 효과를 가진 양막의 상피세포의 성분이 함유된 양막의 일부 구성성분을 이용한 점안 치료법이 제안되고 있다.세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)는 다양한 세포유형에 의해 방출되며 생리학적 및 병태생리학적 과정에 참여하는 세포외 소포체 (extracellular vesicles. EVs)로 모든 세포가 외부 환경으로 분비하는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 크기의 소포체이다. 세포외 소포는 다중 소포 엔도좀이 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 생성된 내강 소낭인데, 다중 소포 엔도좀이 세포 표면과 결합할 때 분비된다. 세포외 소포는 단백질, 지질, 핵산, 대사물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질을 포함하고 있고, 유래하는 세포들의 상태를 반영하고 있다. 세포외 소포는 세포가 분비하는 세포 간 신호전달물질로 기능하는데, 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있기 때문에 세포 간 소통 역할이 가능한 것으로 알려져 있다. 생체 활성 분자를 포함하기 때문에 표적 세포와 융합되면서 생리 활성 분자가 전달되어 표적 세포의 생리학적 활성효과를 쉽게 유도할 수 있다. 또한, 세포외 소포는 세포에서 유래했기 때문에 면역원성이 낮고 세포와 동일한 막 위상을 갖고 있어 표적 세포에 손쉽게 부착한다. 이러한 특성의 결과로, 세포외 소포는 항종양요법, 병원체 백신접종, 면역조절 및 재생요법 및 약물전달을 포함한 다양한 치료 접근법을 위한 도구로 연구되고 있다. 최근 세포외 소포를 약물의 전달시스템으로 이용하는 연구들이 진행되고 있고, 미국 Louisville대에서는 우유에서 세포외 소포를 분리하고 이를 약물전달시스템으로 활용하는 방법을 개발한 바 있다.
양막상피세포에서 여러 크기의 세포외 소포가 세포 배양과정중에 분비되는 것이 확인되며 이중 특정크기의 세포외 소포인 세포외 소포는 안구표면에 특이적으로 잘 부착하는 양막상피세포의 특성을 가지며, 안구표면을 통해 약물을 전달할 수 있는 새로운 형태의 약물전달체로의 가능성을 가지고 있을 것이다. 안구표면 특이적 부착능력이 있는 약물전달체는 다음의 장점이 있을 수 있는데, 안구표면 부착력이 높아서, 일반적인 약물전달체에 비해 낮은 농도의 약물만으로 충분한 효과를 가질수 있어 약물에 의한 독성을 현저히 줄일 수 있고, 안구내 약물농도를 기존 약물전달체에 비해 높일 수있으며, 여러 가지 약제를 병합하기에 수월하다.
따라서, 양막상피세포 유래 세포외 소포를 약물전달체로 이용하여 안구질환의 새로운 치료제를 개발연구 할 필요성이 있다.
본 발명의 목적은 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 약물전달체을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 안과질환용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 약물전달체을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 안과질환용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)에 관한 것으로 약물의 용해를 위한 부성분등이 세포외 소포 내에 함유되므로 약물에 의한 안구독성을 획기적으로 줄일 수 있으며, 안구표면을 통하여 약물의 전달 능력이 증대되어 약물전달체나, 약학 조성물 등으로 활용가능하다.
도 1은 치료약물을 세포외 소포에 봉입한 제형의 특징을 나타낸다.
도 2는 양막상피세포 유래 세포외 소포의 특징을 나타낸다.
도 3는 싸이클로스포린 (cyclosporine)이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 제작 과정을 나타낸다.
도 4는 싸이클로스포린 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 크기 및 다분산도를 나타낸다.
도 5는 싸이클로스포린 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 세포 생존율 확인시험 결과를 나타낸다.
도 6은 싸이클로스포린 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 물리적 안정성 평가를 나타낸다.
도 7은 안구건조증 마우스 모델에서 눈물 분비 측정 실험결과를 나타낸다.
도 8은 안구건조증 마우스 모델에서 각막 불규칙도(irregularity) 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 안구건조증 동물 모델에서 각막 리사민 그린(Lissamine green) 염색 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 안구건조증 동물 모델에서 결막 조직의 PAS (periodic acid Schiff) 염색 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 특징을 나타낸다.
도 12는 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포가 약물을 함유하기 이전상태의 크기 및 다분산도를 나타낸다.
도 13은 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 IL-8 분비 비교 실험 결과를 나타낸다.
도 14는 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포에 함유된 인간 표피성장인자(human EGF) 비교 실험 결과를 나타낸다.
도 15는 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 마우스 각막 상피 함입 비교 실험 결과를 나타낸다.
도 16은 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 마우스 각막 불규칙도(irregularity) 비교 분석한 결과를 타나낸다.
도 17은 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 마우스 결막 조직의 PAS (periodic acid Schiff) 염색 비교 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
기존 안구건조증 등과 같은 안구표면 질환에 대한 치료제인 다양한 소수성 약물에 대한 약물전달체의 인체 내 민감도에 따른 부작용이 빈번하여, 약물의 용해를 위한 부성분 등이 세포외 소포 내에 함유되므로 약물에 의한 안구독성을 획기적으로 줄일 수 있으며, 안구표면을 통하여 약물의 전달 능력이 증대시키는 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)을 제공하며, 상기 안과질환은 바람직하게 안구표면질환 또는 안구 내 질환일 수 있다.
상기 안구표면질환은 안구건조증, 각막혼탁, 각막상피손상, 각막염증, 각막섬유화 및 각막신생혈관으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
안구표면 질환에 대한 약물은 싸이클로스포린, 리피테그라스트 및 디쿠아포솔로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
안구 내 질환은 안구내 염증, 감염, 녹내장, 망막의 혈관질환 및 황반변성으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
안구 내 질환에 대한 약물은 플루오로메토론, 로테프레드놀, 프레드니솔론, 타크로리무스 등의 염증치료제로 이루어진 군; 목시플록사신, 레보플록사신, 세팔로스포린, 반코마이신, 아사이클로버, 간시클로버, 나타마이신 및 보리코나졸 등의 감염치료제로 이루어진 군; 티몰롤, 베탁솔롤, 브리모니딘, 브린졸아마이드, 라타노프로스트, 트라보프로스투, 타플로프로스트, 비마토프로스트, 필로카르핀 및 도졸아마이드 등의 녹내장 치료제로 이루어진 군; 및 항 혈관내피성장인자 (anti vascular endothelial growth factor, anti VEGF) 및 트리암시놀론 등의 망막혈관 질환 치료제로 이루어진 군; 중에서 선택된 하나 일수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포는 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)일 수 있다.
상기 세포외 소포의 평균입자경은 50 내지 200 nm일 수 있으며, 바람직하게60 내지 80 nm일 수 있으며, 더 바람직하게 70 nm일 수 있다.
상기 세포외 소포는 90 내지 99% 약물 봉입률을 가질 수 있으며, 바람직하게 96 내지 98 %일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 약물전달체을 제공한다.
상기 약물전달체는 약물이 세포외 소포에 첨가제를 이용하여 봉입시킬 수 있다. 이때, 첨가제는 사이클로덱스트린 (cyclodextrin), 하이프로멜로스 (hydroxypropyl methylcellulose , HPMC), D-알파-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트 (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS) 및 트레할로오스 (trehalose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 안과질환용 약학 조성물을 제공하며, 바람직하게 안과질환은 안구표면질환일 수 있으며, 상기 약학 조성물은 점안제형일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[준비예] 안구건조증 동물 모델
대구경북첨단의료산업진흥재단 실험동물센터에서 실험 진행하였으며, 8-12 주령의 수컷 BABL/c 마우스를 필터 상단 뚜껑이 있고 병원균이 없으며 음식을 자유롭게 섭취할 수 있는 곳에 사육하였다 (승인번호: DGMIF-20030605-01). 마우스에 스코폴라민 (scopolamine) 패치 (키미테, 명문제약주식회사, korea)를 10일 동안 부착시켜 0.25 mg/day 농도의 스코폴라민에 노출시키는 동안 마우스를 환경 제어 가능한 챔버 (습도 평균 18.5±5 %, 23 ℃±2.5 ℃, 풍속 20 L/분)에서 사육하며 건조스트레스 상황을 만들었다. 스코플라빈 노출이 끝나면 마우스를 정상적인 사육환경 (습도 평균 60±10 %, 23 ℃±2.5 ℃)에서 관리하였다.
[실시예 1] 양막상피세포 분리
합병증이 없는 임산부의 제왕절개술에 의해서 적출된 태반을 멸균된 용기에 담아 생리식염수로 씻어 혈병을 제거하였다. 제대 쪽부터 의료용 가위를 이용하여 절개를 넣었으며 양막 (Amniotic membrane)을 융모막에서 부터 포셉을 넣어 조금씩 박리하였다. 분리한 양막을 스테인리스 플레이트에 상피가 아래를 향하게 펼친 후 손으로 문질러 남아있는 융모막과 혈병을 제거해주었으며, 생리식염수를 이용하여 5회 반복하여 헹궈주었다. 양막을 스테인리스 플레이트에 상피가 아래를 향하게 펼친 후 NC 페이퍼 (nitrocellulose paper, 0.45μm)를 위에 덮어 양막을 NC 페이퍼에 부착시켰다. 부착 후 이를 5 내지 10 cm 정도의 정방형 크기로 잘라서 HBSS (Hank's balanced salt solution)가 담긴 용기에 담아 실험실로 이동시켰다.
분리된 양막을 멸균된 비커에 옮겨 HBSS를 이용하여 여러 번 씻어 잔존 혈액과 조직 찌꺼기를 완전히 제거한 다음, 양막편을 0.5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)와 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin)을 포함한 PBS에서 37 ℃로 10분간 인큐베이션 (incubation) 하였다. 이후 0.05 % 트립신(trypsin)/EDTA 용액으로 37 ℃에서 5분간 둔 다음 찌꺼기를 제거하기 위해 해당 용액은 버리고, 새 0.05 % 트립신(trypsin)/EDTA 용액으로 37 ℃에서 10분간 간헐적으로 흔들어 주면서 반응시킨 다음 배양액을 모았다. 4배 볼륨의 DMEM/F12 배양액을 첨가하여 트립신(trypsin)/EDTA를 불활성화 시킨 다음, 300×g에서 10분간 원심분리하고 현탁한 후 포어 사이즈 (pore size) 100 μm의 셀 스트레이너 (cell strainer)로 걸러서 원심분리 후 계수하여, 양막상피세포를 분리하였다.
[실시예 2] 양막상피세포 유래 세포외 소포의 확인
1) 양막에서 분리한 양막상피세포 배양
도 2의 A에 따를 때, 분리된 세포는 DMEM/F12 (10 % FBS, 1 % P/S) 배양액을 이용하여 1.2×105/cm2 밀도로 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine) 코팅된 배양 접시에 시딩 (seeding)하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 필요에 따라 10 ng/ml 상피세포증식인자 (Epidermal Growth Factor, EGF), ROCK (Rho-Associated Coil Kinase) 억제제, 백혈병억제인자 (leukemia inhibitory factor, LIF)를 첨가하여 배양하였다.
2) 세포외 소포 분리 및 투과전자현미경을 이용한 세포외 소포 입자 확인
양막상피세포를 DMEM/F12 (10 % FBS, 10 ng/ml EGF, 1 % P/S) 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 코팅된 배양 접시에서 80 % 합일하게 키우고, 세포를 PBS로 3회 세척하여 남아있는 배지를 모두 제거하였다. 배지를 DMEM/F12 (1 % Exosome Free FBS, 10 ng/ml EGF, 1 % P/S) 배지로 교체하고 72 시간 후, 조정 배지를 수집하였다. 배지 속 남아있는 세포 제거를 위해 300×g에서 5분 동안 원심분리 한 후, 상청액을 모아 남아있을 세포 파괴물 제거를 위해 1,200×g에서 20분간 원심분리 하였다. 최종적으로 상청액을 10,000×g에서 30분간 원심분리 해줌으로서, 큰 세포외 소포 (large extracellular vesicles)와 세포외 소포를 분리되고, 최종 원심분리된 조정 배지 상층액에 세포외 소포가 포함될 수 있었다.
수집된 상청액은 원심 농축기 (100,000 MWCO memebrane; Corning)를 이용하여 최대 50배 농축시켜 준비하고, 사용 전까지 4 ℃에서 보관하였다. 농축된 상청액은 포스파티딜 결합 분리 키트 (MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS, Wako)를 이용하여 세포외 소포를 분리하였다.
MagCapture 방법은 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS) 결합을 통한 세포외 소포 분리 방법으로, 항체를 사용하지 않고 마그네틱 비즈 (magnetic beads)가 결합된 세포외 소포 캡쳐 (exosome capture)에 결합하는 세포외 소포를 분리했다. 간단히, 키트에 포함된 스트렙트아비딘 (streptavidin) 마그네틱 비즈를 세포외 소포 캡쳐 고정 버퍼 (exosome capture immobilizing buffer)에 희석하여 마그네틱 스탠드 (magnetic stand)에 1분간 반응시켜 비즈만 남겼다. 여기에 비오틴 (biotin)-표지된 세포외 소포 캡쳐를 첨가하고 4 ℃에서 로테이터 (rotator)를 이용하여 10분 처리한 후, 마그네틱 스탠드에 1분간 반응시켜 세포외 소포 캡쳐 고정 비즈를 준비하였다.
농축된 조정 배지에 1:500 부피비의 세포외 소포 결합 강화제 (exosome binding enhancer)(×500)를 첨가하여 샘플을 준비하고, 세포외 소포 캡쳐 고정 비즈와 4 ℃에서 3시간 이상 로테이터를 사용하여 반응시킨 후 마그네틱 스탠드를 사용하여 세포외 소포(EVs)-결합 비즈만 분리하였다.
세포외 소포 결합 강화제가 포함된 세척 버퍼를 이용해 세포외 소포(EVs)-결합 비즈를 워싱해주고 마그네틱 스탠드를 사용하여 세포외 소포(EVs)-결합 비즈만 남겼다. 세포외 소포(EVs)-결합 비즈에 세포외 소포 용리 버퍼를 첨가하여 마그네틱 비즈 및 세포외 소포를 용리시켜 최종적으로 세포외 소포를 획득하였다. 획득된 세포외 소포는 PBS에 재현탁시켜 바로 사용하거나, 사용 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
투과 전자 현미경 (TEM; Bio Transmission Electron Microscope)을 이용하여 세포외 소포의 도 2의 B와 같은 형태를 관찰하였다. 세포외 소포 용액 20 μl을 200 mesh 탄소 코팅된 구리 그리드에 흡착시켰다. 샘플을 2 % PFA 파라포름알데히드, 2 % 글루타르알데히드 및 0.05 M 포스페이트 용액에 2분 동안 고정시켰다. 다음으로, 그리드를 증류수로 3회 세척하고 무수 에탄올에서 10분 동안 탈수시켰다. 그런 다음 세포외 소포를 2 % 수성 인텅스텐산 (phosphotungstic acid)을 사용하여 음성으로 염색했다. 그리드를 밤새 건조시키고 120 keV HT 7700 전자 현미경 (Hitachi, Japan)으로 분석하였다.
3) 웨스턴 블랏을 이용한 세포외 소포 특이 표지자 확인
분리된 세포외 소포 펠릿을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Thermo Fisher Scientific, USA)이 첨가된 RIPA 용해 완충액 (Thermo Fisher Scientific, USA)에 재현탁하고 양막상피세포 세포 용해물 (lysate)을 대조군으로 사용했다. 15,000 xg에서 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 수집하고 Pierce™ BCA 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 단백질 샘플을 5분 동안 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 로딩 염료에서 끓이고 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)을 사용하여 단백질을 분리했다. 단백질 샘플을 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare, USA)으로 옮기고 실온에서 1시간 동안 Tris 완충 식염수 (TBS) 완충액에서 5 % 탈지유로 차단한 다음 CD63 항체, CD9 항체, CD81 항체, GM130 항체 (1:1000, SBI, USA) 4 ℃에서 하룻밤 반응시켰다. 세척 후, 도 2의 C와 같이, HRP 접합 이차 항체에서 1시간 동안 인큐베이션하고 LAS 시스템 (LAS 4000; GE Healthcare, USA)에서 Pierce ECL Western blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, USA)로 면역 반응성을 시각화하였다.
[실시예 3] 싸이클로스포린 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 제작
도 3에 따를 때, 싸이클로스포린 (cyclosporine; CsA) 봉입된 세포외 소포는 배양 및 초음파 처리 방법을 사용하여 준비했다. 0.1 % D-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트 (TPGS) 및 0.25 % 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC)를 함유하도록 세포외 소포 용액 (1 mL)을 제조하였다. 싸이클로스포린을 에탄올에 용해시키고, 혼합물에 첨가하여 0.05 % (w/v) 약물 농도를 얻었다. 혼합물을 5분 동안 교반하고 37 ℃ 수조에서 5분 동안 인큐베이션 하고 다음 1분 동안 20 % 진폭에서 초음파 (VC505; Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA) 처리했다. 그 다음, 생성물을 0.2 μm의 공극 크기를 갖는 주사기 필터 (Minisart RC 15, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Germany)를 사용하여 여과하여 부하되지 않은 싸이클로스포린을 제거하였다. 동결 보호제 및 등장화제로 3 % 트레할로스를 첨가한 샘플을 동결 건조하여 남아있는 에탄올을 제거했다. 약물 봉입률 (encapsulation efficiency, EE)을 측정하기 위해 옥타데실실란 컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Agilent 1260 infinity; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 제조된 세포외 소포의 싸이클로스포린 농도를 측정했고, 싸이클로스포린 봉입 세포외 소포 용액은 72시간 지나도 제형이 안정적임을 확인했다.
[ 실시예 4] 싸이클로스포린 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 크기 및 다분산도 확인
싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 크기 및 다분산도를NanoSight (Malvern zetasizer, Worcestershire, UK)를 사용하여 측정한 결과로, 도 4에 따를 때, 50 내지 200nm 크기의 세포외 소포가 측정되었다.
[비교예 1] 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 확인
1) 중간엽줄기세포 배양
도 11의 A에 따를 때, 중간엽줄기세포는 세포바이오 (서울, 대한민국)에서 구입하여 배양하였다. CEFOgro Human MSC Growth (10 % FBS, 1% P/S) 배양액을 이용하여 1.2×105/cm2 세포를 세포 배양 접시에 시딩 (seeding)하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
2) 세포외 소포 분리 및 투과전자현미경을 이용한 세포외 소포 입자 확인
중간엽줄기세포를 CEFOgro Human MSC Growth (10 % FBS, 1 % P/S) 배양액 사용하여 세포 배양 접시에서 80 % 합일하게 키우고, 세포를 PBS로 3회 세척하여 남아있는 배지를 모두 제거하였다. 배지를 aMEM (1 % Exosome Free FBS, 1 % P/S) 배지로 교체하고 72시간 후, 조정 배지를 수집하였다. 배지 속 남아있는 세포 제거를 위해 300×g에서 5분 동안 원심분리 한 후, 상청액을 모아 남아있을 세포 파괴물 제거를 위해 1,200×g에서 20분간 원심분리 하였다. 최종적으로 상청액을 10,000×g에서 30분간 원심분리 해줌으로서, 큰 세포외 소포 (large extracellular vesicles)와 세포외 소포가 분리되고, 최종 원심분리된 조정 배지 상층액에 세포외 소포가 포함될 수 있었다.
수집된 상청액은 원심 농축기 (100,000 MWCO memebrane; Corning)를 이용하여 최대 50배 농축시켜 준비하고, 사용 전까지 4 ℃에서 보관하였다. 농축된 상청액은 포스파티딜 결합 분리 키트 (MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS, Wako)를 이용하여 세포외 소포를 분리하였다.
투과 전자 현미경 (TEM; Bio Transmission Electron Microscope)을 이용하여 도 11의 B와 같은 세포외 소포의 형태를 관찰하였다. 세포외 소포 용액 20 μl을 200 mesh 탄소 코팅된 구리 그리드에 흡착시켰다. 샘플을 2 % PFA 파라포름알데히드, 2 % 글루타르알데히드 및 0.05 M 포스페이트 용액에 2분 동안 고정시켰다. 다음으로, 그리드를 증류수로 3회 세척하고 무수 에탄올에서 10분 동안 탈수시켰다. 그런 다음 세포외 소포를 2 % 수성 인텅스텐산 (phosphotungstic acid)을 사용하여 음성으로 염색했다. 그리드를 밤새 건조시키고 120 keV HT 7700 전자 현미경 (Hitachi, Japan)으로 분석하였다.
3) 웨스턴 블랏을 이용한 세포외 소포 특이 표지자 확인
분리된 세포외 소포 펠릿을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Thermo Fisher Scientific, USA)이 첨가된 RIPA 용해 완충액 (Thermo Fisher Scientific, USA)에 재현탁하고 양막상피세포 세포 용해물 (lysate)을 대조군으로 사용했다. 15,000 xg에서 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 수집하고 Pierce BCA 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 단백질 샘플을 5분 동안 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 로딩 염료에서 끓이고 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)을 사용하여 단백질을 분리했다. 단백질 샘플을 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare, USA)으로 옮기고 실온에서 1시간 동안 Tris 완충 식염수 (TBS) 완충액에서 5 % 탈지유로 차단한 다음 CD63 항체, CD9 항체, CD81 항체, GM130 항체 (1:1000, SBI, USA) 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 세척 후, 도 11의 C에 따를 때, HRP 접합 이차 항체에서 1시간 동안 인큐베이션하고 LAS 시스템 (LAS 4000; GE Healthcare, USA)에서 Pierce ECL Western blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, USA)로 면역 반응성을 시각화하였다.
[ 비교예 2] 중배엽줄기세포 유래 세포외 소포가 약물을 함유하기 이전상태의 크기 및 다분산도 확인
중배엽줄기세포 유래 세포외 소포가 약물을 함유하기 이전상태의 크기와 다분산도를 NanoSight (Malvern zetasizer, Worcestershire, UK)를 사용하여 측정한 결과로, 도 12에 따를 때, 50 내지 200 nm 크기의 세포외 소포가 측정되었다.
[실험예 1] 세포 생존율 확인
인간 각막 세포주를 96-well 플레이트에 분주하고, 플레이트 면적의 80 %로 성장시킨 뒤, 0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml및 10 μg/ml의 농도의 싸이클로스포린 (CsA), 싸이클로스포린 안약 (CsA emulsion), 싸이클로스포린 (CsA)이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포를 처리했다. 대조군으로 세포외 소포만 처리한 군을 사용했다. 각 약물처리 후 24시간동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양했고, CCK8 용액을 10 μl 첨가하여 2시간 동안 37 ℃에서 배양하여 세포 생존율을 확인했다.
그 결과, 도 5에 따를 때, 5 μg/ml (0.05 %) 이상의 농도에서 싸이클로스포린 (CsA), 싸이클로스포린 안약 (CsA emulsion) 처리 군에서는 낮은 수의 세포 생존율을 보여줬지만, 싸이클로스포린 (CsA)이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 처리 군은 60 %이상의 세포 생존율을 보여주었다.
[실험예 2] 물리적 안정성 평가
싸이클로스포린 (CsA)이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포를 실온 및 4 ℃에서 0일, 5일, 7일, 14일 및 28일간 보관한 후, 물리적 안정성을 NanoSight (Malvern zetasizer, Worcestershire, UK)를 이용해 입자크기, 다분산도 변화로 평가하였다. 싸이클로스포린 (CsA)의 잔여량은 초기양에 대한 잔여 싸이클로스포린 (CsA) %로 표현하였다.
그 결과, 도 6에 따를 때, 싸이클로스포린 (CsA)의 농도는 실온보다 4 ℃ 환경에서 최대 14일간 안정적으로 유지되는 것을 확인했다. 0일, 5일, 7일, 14일 및 28일간 보관 후 싸이클로스포린 (CsA)이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포의 입자 크기에는 변화가 없었다.
[실험예 3] 안구건조증 동물 모델에서 눈물 분비 측정
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 엑소좀 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred)을 최대 10일간 처리하고 0일, 3일, 7일 및 10일째 눈물 생성을 측정하였다. 페놀 레드(phenol red)-함침된 면사(cotton thread)를 마우스 안구 측면 칸투스 (cantus)에 놓고 60초 간 측정하였다. 눈물에 의해 젖은 실은 붉게 변하고, 변화된 길이를 측정하여 평가하였다.
그 결과, 도 7에 의할 때, 상기 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스는 눈물 분비가 줄어드는 양상을 보이는 것으로 나타났고, 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred) 처리된 안구건조증 유도 마우스는 눈물의 분비가 유도되는 것으로 나타났다. 특히, 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 처리 3일째 눈물양이 큰 폭으로 증가함을 확인했다.
[실험예 3] 안구건조증 동물 모델에서 각막 불규칙도 (irregularity) 분석
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred)을 최대 10일간 처리하고 0일, 3일, 7일 및 10일째 각막 표면 불규칙 (irregularity) 정도를 분석했다. 발광 O-링을 마우스 안구 중앙에 비추고 반사되는 O-링의 왜곡정도를 확인했다. 왜곡 점수는 0-5점 (안구 중앙을 중심으로 십자로 4등분하여 각 사분면을 1점씩 배정하고, O-링의 유지정도에 1점 배정)까지 측정되었다.
그 결과, 도 8에 의할 때, 안구건조증 유도 마우스에서는 O-링의 심한 왜곡이 나타났고, 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred) 처리된 안구건조증 유도 마우스는 O-링의 왜곡정도가 약물 처리 시간이 늘어남에 따라 줄어드는 양상을 보였다. 약물처리 10일째 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs) 및 싸이클로스포린아 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 처리 군에서 O-링의 왜곡이 크게 줄어들었다. 특히, 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 처리군의 예후가 가장 좋은 것을 확인했다.
[ 실험예 4] 안구건조증 동물 모델에서 각막 리사민 그린 ( Lissamine green) 염색 분석
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred)를 최대 10일간 처리하고 0일, 3일, 7일 및 10일째 안구건조증 진단에 사용되는 리사민 그린 (Lissamine green)으로 각막 염색을 수행하였다. Lissamine green ophthalmic strips (optitech)을 사용해 염색하고 슬릿 램프 현미경 (Model 900 BQ; Switzerland)으로 확인하였다. 각막 리사민 그린 염색은 Oxford Scheme 등급 시스템 (2003, Grading Of Corneal and Conjunctival Staining in the Context of Other Dry Eye Tests.)에 따라 등급 0 내지 5로 채점하였다. 염색이 없을 때 등급 0이 주어지며 최대 점수는 5이다.
그 결과, 도 9에 의할 때, 정상 마우스의 경우, 리사민 그린에 거의 염색되지 않지만, 안구건조증이 유도된 마우스의 각막 표면은 높은 리사민 그린 염색 정도를 보였다. 안구건조증 유도 후, 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred) 처리한 마우스의 경우 식염수만 처리한 실험군에 비해 낮은 리사민 그린 염색 정도를 나타냈다. 특히, 약물처리 3일째부터 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 처리 군에서 낮은 리사민 그린 염색 정도를 보여줌을 확인했다.
[ 실험예 5] 안구건조증 동물 모델에서 결막 조직의 PAS (periodic acid Schiff) 염색 분석
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred)을 최대 10일간 처리하고 10일째 희생시켜 결막 조직을 회수했다. 수득 된 결막 조직을 4 % 파라포름알데하이드에 고정시키고 파라핀에 포배(embedding) 시켰다. 조직을 7 μm 두께로 절삭하여 비염색 슬라이드를 제조하고, 과아이오딘산 쉬프 (periodic acid Schiff, PAS) 염색을 수행하였다. 제조사의 지시에 따라 시판 키트 (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 결막 술잔세포 (goblet cell)에 PAS 염색을 하고 염색된 부분을 광학 현미경을 사용하여 촬영하였다. 술잔세포에서 뮤신 합성의 주성분인 당단백질 및 글리코겐이 PAS 염색에 의해 붉게 염색되고 이 세포들을 계수하여 100 μm당 술잔세포의 수로 술잔세포 밀도를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 의할 때, 안구건조증 유도 마우스는 결막 술잔세포에서 뮤신 합성의 주성분인 당단백질 및 글리코겐 분포에 영향을 받는 것으로 나타났다. 상기 마우스에서 PAS 염색에 의해 탐색되는 술잔세포의 수는 정상 마우스의 2배수 이상 낮게 관찰되었다. 안구건조증 유도 후 싸이클로스포린 (CsA), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs), 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 및 프레드니솔론 (Pred) 처리된 마우스에서는 술잔세포의 수가 증가되는 것으로 나타났다. 특히, 싸이클로스포린이 봉입된 양막상피세포 유래 세포외 소포 (EVs+CsA) 처리군의 술잔세포 증가가 가장 많은 것을 확인했다.
[ 실험예 6] 양막상피세포 유래 세포외 소포과 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 IL-8 분비 비교
인간 결막 세포주를 96-well 플레이트에 분주하고 플레이트 면적의 90 %로 성장시킨 뒤, 70 mM NaCl 처리하여 in vitro 환경에서의 안구건조증을 유도했다. Medium 199 (1 % Exosome Free FBS, 1& P/S) 배양액에 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 각 25 μg/ml 처리하고, 24시간 배양했다. 24시간 배양 후, 세포배양 상층액을 수득하여 상층액을 이용해 IL-8 ELISA (R&D systems, USA) 수행했다.
그 결과, 도 13에 의할 때, in vitro 안구건조증 유도 후, 양막상피세포 유래 세포외 소포 또는 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 처리 시 인간 결막 세포주에서 분비되는 IL-8농도가 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 엑조솜에 함유된 인간 표피성장인자 (human EGF) 비교
분리된 세포외 소포 펠릿에 포함된 인간 표피성장인자 (EGF)를 비교하기 위해 정량적 샌드위치 효소 면역분석 기술을 사용했다. 인간 표피성장인자에 특이적인 단일클론 항체가 미리 코팅되어 있는 마이크로플레이트 (Quantikine ELISA; human EGF immnuoassay; R&D systems, USA)에 대조군 (성장인자 미포함), 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 옮겼다. 실온에서 3시간 배양 후 워시 버퍼를 이용해 결합되지 않은 세포외 소포를 세척했다. 인간 표피성장인자에 특이적인 효소 결합 폴리클로날 항체를 웰에 추가하고 30분 실온 배양 후 570 nm 파장의 마이크로플레이트 리더로 스캔했다. 세포외 소포가 포함하는 인간 표피성장인자의 양은 발색정도로 확인할 수 있었다.
그 결과, 도 14에 의할 때, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 보다 양막상피세포 유래 세포외 소포가 포함하는 인간 표피성장인자 농도가 5배 가까이 높은 것을 확인할 수 있다.
[실험예 8] 마우스 각막 상피 함입 비교
양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 마우스 각막 상피 세포 내로의 함입 (endocytosis) 및 함입 유지력을 확인하기 위해, 녹색 형광염료인 PKH67 (sigma, USA)로 세포외 소포 지질층을 표지하였다. 양막상피세포 유래 세포외 소포 및 중간엽줄기세포 세포외 소포에 각각 PKH67을 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시키고 0.971 M의 자당용액 (sigma, USA)을 첨가해 밀도구배를 형성시켰다. 4 ℃ 및 190,000 G에서 2시간 초원심분리하여 PKH67 표지된 세포외 소포 펠릿을 수득하였다. 마우스 각막 상피세포에 각 세포외 소포를 처리하고, 6시간 후 동물 희생시켜 안구를 수득하고 4 % PFA에 24시간 고정한 뒤 OCT 화합물에 안구를 포배하고 5 μm 두께의 절편을 획득하였다. 마우스 안구 절편이 붙은 슬라이드글라스를 DAPI로 핵 염색한 뒤 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 의할 때, 양막상피세포 유래 세포외 소포 처리 마우스의 경우, 세포외 소포 처리 6시간 후에도 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 보다 많은 양의 세포외 소포이 함입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 9] 안구건조증 동물 모델에서 각막 불규칙도 (irregularity) 분석 비교
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 프레드니솔론 (Pred), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (AM EVs) 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 (MSC EVs)을 최대 14일간 처리하고 0일, 3일, 7일 및 14일째 각막 표면 불규칙 (irregularity) 정도를 분석했다. 발광 O-링을 마우스 안구 중앙에 비추고 반사되는 O-링의 왜곡정도를 확인했다. 왜곡 점수는 0-5점 (안구 중앙을 중심으로 십자로 4등분하여 각 사분면을 1점씩 배정하고, O-링의 유지정도에 1점 배정)까지 측정되었다.
그 결과, 도 16에 의할 때, 안구건조증 유도 마우스에서는 O-링의 심한 왜곡이 나타났고, 프레드니솔론 (Pred) 및 양막상피세포 유래 세포외 소포 (AM EVs) 처리된 안구건조증 유도 마우스는 O-링의 왜곡정도가 약물 처리 시간이 늘어남에 따라 줄어드는 양상을 보였다. 약물처리 14일째 프레드니솔론 (Pred) 및 양막상피세포 유래 세포외 소포 (AM EVs) 처리 군에서 O-링의 왜곡이 크게 줄어들었고, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 (MSC EVs) 처리 군은 생리식염수 (NS) 처리군과 유사한 O-링의 왜곡이 나타났다.
[ 실험예 10] 안구건조증 동물 모델에서 결막 조직의 PAS (periodic acid Schiff) 염색 분석 비교
스코폴라민 패치 및 건조스트레스에 10일간 노출되어 안구건조증이 유도된 상기 준비예의 마우스에 생리식염수 (NS), 프레드니솔론 (Pred), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (AM EVs) 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 (MSC EVs)을 최대 14일간 처리하고 14일째 마우스 눈꺼풀의 술잔세포 밀도를 측정하였다. 마취된 마우스의 위 눈꺼풀이 외부로 노출되도록 형광 현미경 아래 트레이에 고정하고 목시플록사신 점안액 (Vigamox®, Alcon Laboratories, TX, US)을 점적한 뒤 형광 형미경 확대 이미지를 획득했다. 이미지에서 술잔세포는 형광 (도 17에선 흰색)을 띄고150 X 150 픽셀 면적내의 술잔세포 밀도를 측정했다.
그 결과, 도 17에 의할 때, 안구건조증이 유도된 마우스는 결막 술잔세포의 밀도가 낮아지는 것으로 나타났다. 안구건조증 유도 후 프레드니솔론 (Pred), 양막상피세포 유래 세포외 소포 (AM EVs)이 14일간 처리된 마우스에서는 술잔세포의 밀도가 생리식염수 (NS) 및 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 (MSC EVs)보다 크게 증가되는 것으로 나타났다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 안과질환용 약물을 봉입하고 있는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 안과질환은 안구표면질환 또는 안구 내 질환인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 안구표면질환은 안구건조증, 각막혼탁, 각막상피손상, 각막염증, 각막섬유화 및 각막신생혈관으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 안구 내 질환은 안구내 염증, 감염, 녹내장, 망막의 혈관질환, 황반변성으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 싸이클로스포린, 리피테그라스트, 디쿠아포솔, 플루오로메토론, 로테프레드놀, 프레드니솔론, 타크로리무스, 목시플록사신, 레보플록사신, 세팔로스포린, 반코마이신, 아사이클로버, 간시클로버, 나타마이신, 보리코나졸, 티몰롤, 베탁솔롤, 브리모니딘, 브린졸아마이드, 라타노프로스트, 트라보프로스투, 타플로프로스트, 비마토프로스트, 필로카르핀, 도졸아마이드, 항 혈관내피성장인자 (anti vascular endothelial growth factor; anti VEGF) 및 트리암시놀론으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 소포는 엑소좀 (exosome)인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 소포의 평균입자경은 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 소포는 90 내지 99% 약물 봉입률을 가지는 것을 특징으로 하는 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs).
  9. 청구항 1의 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 약물전달체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 약물전달체는 약물이 세포외 소포에 첨가제를 이용하여 봉입시킨 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 첨가제는 사이클로덱스트린 (cyclodextrin), 하이프로멜로스 (hydroxypropyl methylcellulose , HPMC), D-알파-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트 (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS) 및 트레할로오스 (trehalose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  12. 청구항 1의 양막상피세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 안과질환용 약학 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 약학 조성물은 점안제형인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 안과질환은 안구표면질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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