WO2023169480A1 - 氘代化合物，及其制备方法和应用 - Google Patents

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WO2023169480A1
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甘李药业股份有限公司
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Definitions

  • R 1 to R 2 are each independently selected from any group among CH 3 , CH 2 D, CHD 2 and CD 3 , R 3 to R 14 are each independently H or D, and R 1 to R 14 There is at least one D-containing atom in , provided that:
  • R2 is CD3 , CH2D , or CHD2 .
  • R 1 and R 2 of the compound are CD 3 ; or R 1 and R 2 are CD 3 , R 3 is D; or R 11 and R 14 are D; or R 3 , R 9 - R 10 is D; or R 11 and R 14 are D; or R 3 , R 11 and R 14 are D; or R 1 and R 2 are CD 3 and R 9 -R 10 is D; or R 1 and R 2 is CD 3 , R 11 and R 14 are D; or R 1 and R 2 are CD 3 , R 3 , R 9 -R 10 are D; or R 1 and R 2 are CD 3 , R 3 , R 8 and R 9 -R 10 are D; or R 1 and R 2 are CD 3 , R 3 , R 11 and R 14 are D; or R 3 and R 7 are D; Or R 3 and R 6 are D; or R 1 and R 2 are CD 3 , R 3 and R 7 are D; or R 6 , and R 9 -R 10 are D; or R 6 -R 7 and R 9
  • the deuterated compounds obtained by these embodiments of the present invention can significantly increase the action time and half-life of the drug, significantly improve metabolic stability, bioavailability, and improve pharmacokinetic properties compared to Ulixertinib. .
  • Step 3) (S)-4-(5-chloro-2-(isopropylamino)pyridin-4-yl-3,6-[D2])-N-(1-(3-chlorophenyl) -2-hydroxyethyl)-1H-pyrrole-2-amide
  • Deuterated compounds 16 and 17 (the structural formulas are shown in Table 4 respectively) each adopt corresponding intermediates and can be synthesized through a synthesis method similar to deuterated compound 15. The results are shown in Table 4:
  • Diastereomers can be separated by chromatography, preferably by separation/resolution techniques based on differences in solubility. The optically pure enantiomers are then recovered, together with the resolving reagents, by any practical means that does not involve racemization.
  • a more detailed description of techniques suitable for the resolution of stereoisomers of compounds starting from racemic mixtures can be found in Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions” , Racemates and Resolutions" , John Wiley And Sons, Inc., l98l.
  • the metabolic stability of the deuterated compound 39 and BVD-523 provided by the present invention in monkeys is further verified.
  • the animals will be observed for clinical symptoms and blood collection on the monkey chair 1 hour before the blood collection point. After 1 hour, the animals will be returned to the original cage, and subsequent blood collection and observation will be completed in the cage.
  • Blood is collected mainly through the cephalic vein of the forelimb and the saphenous vein of the hind limb, directly collected with a 1 ml syringe. After collection, it is poured into a vacuum blood collection tube, transferred and centrifuged on wet ice, and the centrifugation time is recorded on the centrifuge table. Blood samples were collected for UPLC-MS/MS analysis and detection. PK parameters were estimated using WinNonlin 6.1 non-compartmental model.

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Abstract

提供了一种结构式如式IA所示的氘代化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用。部分氘代化合物的半衰期甚至是BVD-523的2-4倍，在体内代谢中将具有更长的作用时间，并产生更有效的临床应用价值，有望解决BVD-523目前由于代谢缺陷产生的副作用。

Description

氘代化合物，及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种作为ERK1/2抑制剂的氘代化合物，尤其涉及对(S)-4-(5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺进行氘代后获得的氘代化合物及其制备方法和应用。
背景技术
MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)由一系列丝氨酸/苏氨酸激酶组成，可磷酸化其细胞质蛋白，从而使磷酸化的细胞质蛋白能够从胞浆移位到细胞核中进而实现调节转录因子的活性。MAPK通路是细胞内重要的信号传导途径,它将细胞外刺激传递至细胞核,参与细胞的生长、发育、分化等一系列生理过程,并在细胞的恶性转化和肿瘤的发生发展中起重要作用。经典的MAPK信号转导通路可以将细胞外信号转导至细胞内，主要通过三级激酶级联的形式MAPKKK(MAP3K)-MAPKKs(MAP2Ks)-MAPK传导细胞信号，从而调节细胞的增殖，分化，凋亡等生理功能。其中，胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase:ERK)分为ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，EKR1(参考文献：Sciences 1990,249(4964):64-67)和ERK2(参考文献：Cell 1991,65(4):663-675)是由TERI G.BOULTON等人于90年代初首次先后分离鉴定的，ERK1的相对分子量为44KDa，ERK2的相对分子量为42KDa。ERK1/2的信号传递途径涉及调节细胞生长、发育及***的信号网络核心，从细胞外刺激作用于细胞，使细胞产生相应的生物学效应。在经典的RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2通路中的各个蛋白及其通路被激活的机制表现为，以RAS作为上游激活蛋白，以RAF作为MAP3K，以MEK1/2激酶作为MAP2K，而ERK1/2即作为MAPK发挥作用(参考文献：Cell Cycle 2009，8(8)：1168-1175)。其中，RAS蛋白包含H-RAS、N-RAS和K-RAS等不同类型的21kDa的蛋白，在RTK的细胞内激酶域的邻近位点处被激活的GTP酶让其从非激活的RAS-GDP状态转换成激活的RAS-GTP而刺激下游的RAF。RAF激酶包括A-RAF、B-RAF和C-RAF三个不同的亚型，是RAS的中下游效应物通过结合到负载GTP的RAS蛋白并对RAF的丝氨酸338、苏氨酸341双位点磷酸化而激活。RAF激酶通过对MEK(MEK1和MEK2)的两个紧密相邻的丝氨酸残基(丝氨酸217、丝氨酸221)进行双位点磷酸化使MEK 激活。MEK是双重特异性苏氨酸/酪氨酸激酶，MEK1/2激活后可以使ERK1的苏氨酸202和酪氨酸204以及ERK2的苏氨酸173和酪氨酸185双位点发生磷酸化从而激活ERK1/2。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到细胞核内,进而介导Elk-1、ATF、MYC、NF-κΒ、Ap-1、c-FOS等多种转录因子和基因的活化和转录，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多科生物学反应。(参考文献：Acta Pharmaceutica Sinica B 2018,8(4)：552-562)。
RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2信号级联反应在多种疾病，包括脑损伤、癌症、心肌肥厚、糖尿病和炎症等的发生发展中起着关键作用。特别是在癌症中，RAS已被确认为致癌基因,在大约三分之一的癌症中发现其产生突变激活，主要表现在90％的胰腺癌、50％的结直肠癌、50％的甲状腺癌、30％的肺癌以及25％的黑色素瘤中均发现RAS基因的突变激活。(参考文献：J Cell Sci 2016，129:1287–92.)。B-RAF突变在人类恶性肿瘤中占比高达7％，主要表现在100％的HCL，50％-60％的黑色素瘤，40％-60％的甲状腺癌，5％-10％结直肠癌等中都发生了B-RAF的突变激活。(参考文献：Nat Rev Cancer 2014,14:455–67.)。大量研究表明：RAS和RAF基因突变导致肿瘤细胞中的ERK1/2被持续激活，从而引起细胞过度增殖。在各种类的癌症中多个RAF和MEK小分子抑制剂的临床效果已经将该信号通路作为癌症治疗的靶点进行最终验证(参考文献：TopicsAnti-Cancer Res,2013,2:63-94)。
近年，有一些RAF抑制剂和MEK抑制剂陆续上市，例如2021年5月由安进公司自主开发的靶向KRASG12C突变的药物Sotorasib(为RAS抑制剂)也获得了FDA批准上市，而且在临床上取得了不错的疗效。但是病人使用一段时间后，发现产生了新的耐药性突变，导致RAS-RAF-MEK-ERK1/2通路的重新激活而使癌细胞恢复增殖能力。而作为RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2通路下游的“最终管理器”，靶向抑制ERK1/2也有望用于治疗MAPK通路异常激活(RAS-RAF-MEK1/2等激活变异)造成的癌变，并且可能对由于ERK1/2重新激活而产生RAS、RAF或MEK1/2抑制剂耐药的患者有效。但到目前为止，还没有出现正式上市的靶向ERK1/2的抑制剂药物。
WO2005113541A1中公开了一种中文名为(S)-4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺的靶向ERK1/2的抑制剂，与其关联的是目前已经进入临床2期阶段的药物Ulixertinib(又名 BVD-523)，虽然其在临床实验中展现出了较好的生物学活性，但是在药物代谢方面的却存在明显的缺陷，导致使用中需要施用较高的临床剂量以及非常频繁的给药方式，这些缺陷将对其进一步的临床开发产生较大限制。
很多药物由于较差的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及***(excretion)(ADME)性质从而限制了它们的在某些疾病上的使用，也是导致许多候选药物最终未能通过临床试验的原因。特别是针对药物的快速代谢问题，导致许多本来可以高效治疗疾病的药物由于过快的从体内代谢掉而难以成药。另外，快速代谢的药物也可能会使患者暴露于不良的毒性或反应性代谢物中。
因此，仍然需要代谢稳定性更好、半衰期更长、药代动力学性质更好、生物利用度更高的ERK1/2的抑制剂。
发明内容
本发明提供了一种新型的氘代修饰的Ulixertinib作为ERK1/2抑制剂，发明人通过大量实验，意外发现，本发明在特定位点进行氘代化修饰后获得的化合物在对ERK激酶具有相当或更高的抑制活性的同时，能够显著提升药物在体内的半衰期，提高生物利用度，具有更好的代谢稳定性，明显降低或消除体内代谢过程中产生的不良代谢物，能够使产生疗效所需要的施用剂量和/或施用频次明显降低。
本发明第一方面，提供了式IA氘代化合物：
其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2和CD3中的任一基团，R3-R14各自独立地是H或D，且R1-R14中至少有一个含D原子，
条件是：
当式IA仅含1个D原子时，R8不是D，
当式IA含3个D原子时，R8-R10不同时是D，
当式IA含4个D原子时，R6-R7、R11和R14不同时是D，
当式IA含7个D原子、且R1-R2是CD3时，R7-R8不是D；和/或
当式IA含9个D原子、且R1-R2是CD3时，R6、R11和R14不同时是D。
本发明第二方面，提供了式I所示的氘代化合物：
其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2和CD3中的任一基团，R3-R14各自独立地是H或D，且R1-R14中至少有一个含D原子，条件是：
当式I仅含1个D原子时，R8不是D，
当式I含3个D原子时，R8-R10不同时是D，
当式I含4个D原子时，R6-R7、R11和R14不同时是D，
当式I含7个D原子、且R1-R2是CD3时，R7-R8不是D；和/或
当式I含9个D原子、且R1-R2是CD3时，R6、R11和R14不同时是D。
在根据本发明的一个实施方案中，该化合物的R1是CD3、CH2D、或CHD2；
在一个实施方案中，R2是CD3、CH2D、或CHD2。
在一个实施方案中，R3是D；在一个实施方案中，R4是D；
在一个实施方案中，R5是D；在一个实施方案中，R6是D；
在一个实施方案中，R7是D；在一个实施方案中，R8是D；
在一个实施方案中，R9-R10是D；
在一个实施方案中，R11和R14是D；在一个实施方案中，R12-R13是D。
本发明的一个实施方案中，该化合物的R1和R2是CD3；或R1和R2是CD3，R3是D；或R11和R14是D；或R3、R9-R10是D；或R11和R14是D；或R3、R11和R14是D；或R1和R2是CD3，R9-R10是D；或R1和R2是CD3、R11和R14是D；或R1和R2是CD3，R3、R9-R10是D；或R1和R2是CD3，R3、R8和R9-R10是D；或R1和R2是CD3、R3、R11和R14是D；或R3和R7是D； 或R3和R6是D；或R1和R2是CD3，R3和R7是D；或R6、和R9-R10是D；或R6-R7和R9-R10是D；或R3、R7、和R9-R10是D；或R1和R2是CD3，R7和R9-R10是D；或R1和R2是CD3，R3、R7和R9-R10是D；或R3、R6、和R9-R10是D；或R1和R2是CD3，R3、R8是D；或R1和R2是CD3，R3、R6、R7是D；或R1和R2是CD3，R3、R6、R7、R8是D；或R1和R2是CD3，R3、R6、R7、R8、R9、R10是D。发明人意外发现，本发明的这些实施方案所得到的氘代化合物，相比于Ulixertinib，能够显著提高药物的作用时间和半衰期，显著提高代谢稳定性、生物利用度、以及改善药代动力学性质。
在根据本发明的一个实施方案中，该化合物的R12和R13是H。
在根据本发明的一个实施方案中，该化合物选自下述结构式所示的化合物中的任一种：









在根据本发明的一个实施方案中，该化合物选自下述结构式所示的化合物中的任一种：








本发明的另一方面提供了上述的氘代化合物的制备方法，所述氘代化合物是通过反应式Ⅰ制备得到的：
其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3中的任一种，R3-R14各自独立地选自H或D中的一种；X1选自Br、I、OTf或Oms中的任一种；Y为离去基团Ts或Boc。
在优选的一个实施方案中，还涉及
中间体化合物4可以通过与中间体化合物5通过铃木反应得到中间体化合物6，所述中间体化合物6水解得到中间体化合物7，最后中间体化合物7和中间体化合物8进行缩合反应，即得到式I化合物。
在根据本发明的一个实施方案中，所述中间体化合物4是通过反应式Ⅱ或反应式Ⅲ制备得到的：
其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3中的任一种，R3-R14各自独立地选自H和D中的任一种；X1为OTf或OMs，X2选自卤素F、Cl、Br或I中的任一种；Y为离去基团Ts或Boc。
在一个优选地实施方案中，所述反应式Ⅱ的中间体化合物1经还原反应制备得到中间体化合物2；所述中间体化合物2与中间体化合物3经取代反应得到中间体化合物4；
所述反应式Ⅲ中，中间体化合物1’和中间体化合物2’经还原胺化制备得到中间体化合物4。
在根据本发明的进一步的实施方案中，所述中间体化合物4选自
中的任一种。
在根据本发明的一个实施方案中，中间体化合物4与下述的中间体化合物5反应得到中间体6：
在根据本发明的进一步的实施方案中，中间体化合物5的前体化合物选自
中的任一种。
在根据本发明的进一步的实施方案中，中间体化合物8选自
中的任一种。
本发明的再一方面提供了上述氘代化合物，或其药学上可接受的盐，在制备用于预防和/或治疗增生性疾病或者由RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2激酶调节的疾病的药物中的应用。
在根据本发明的一个实施方案中，所述由RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2激酶调节的疾病为对ERK的抑制敏感的肿瘤。
本发明进一步提供了一种用于预防和/或治疗增生性疾病或者由RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2激酶调节的病症的药物组合物，其含有药学上可接受的载体和上述的氘代化合物，或其药学上可接受的盐。
进一步地，本发明所提供的上述任一化合物或任一药物组合物，其用作药物。
进一步地，本发明所提供的上述任一化合物或任一药物组合物，其用作药物，其用于预防和/或治疗对ERK的抑制敏感的肿瘤。
进一步地，本发明还提供了预防和/或治疗对ERK的抑制敏感的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的上述任一化合物或任一药物组合物。
优选地，上述疾病或者对ERK的抑制敏感的肿瘤为人黑色素瘤或人结肠癌。
本发明提供了药学效果较佳的氘代的吡咯酰胺类化合物，通过在某些位点或位点组合进行氘代后，获得的氘代化合物与对照化合物BVD-523相比具有相当或更好的抑制活性的同时，还具有更长的半衰期，体内代谢更趋于稳定、药代动力学更优、生物利用度更好，有望降低临床使用剂量。本发明提供的部分氘代化合物的半衰期甚至出乎意料地达到BVD-523的2-4倍，在体内代谢中的作用时间显著延长，有助于解决BVD-523因代谢缺陷导致的单次施用剂量较大、施用频次较高的情况，并减轻或消除因BVD-523代谢缺陷而产生的副作用，进而可以扩展用于更多适应症的治疗。同时，本发明还提供了相应氘代化合物的制备方法和应用。
附图说明
图1为化合物BVD-523在食蟹猴中1mg静脉给药(IV)和10mg口服灌胃给药(PO)血药浓度曲线图，横轴为时间(单位：hr)，纵轴为血药浓度(单位：ng/ml)；
图2为根据本发明制备得到的氘代化合物39在食蟹猴中1mg静脉给药(IV)和10mg口服灌胃给药(PO)血药浓度曲线图，横轴为时间(单位：hr)，纵轴为血药浓度(单位：ng/ml)。
图3为根据本发明制备得到的氘代化合物28在食蟹猴中1mg静脉给药(IV)和10mg口服灌胃给药(PO)血药浓度曲线图，横轴为时间(单位：hr)，纵轴为血药浓度(单位：ng/ml)。
具体实施例
下面结合具体实施例，作进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的化学原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
如无特别说明，术语“本发明的化合物”，是指式(I)化合物及其盐、包括化合物的药学上可接受的盐以及所有立体异构体(包括但不限于非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、其前药和同位素化合物。溶剂合物和水合物通常被认为是本发明的化合物的药物组成物。
术语“药学上可接受的盐”指保留了特定化合物的游离酸和碱的生物学效力而没有生物学不良作用的盐。药学上可接受的盐的例子包括但不限于：(1)酸加成盐，和无机酸例如盐酸、硫酸、氢溴酸、硝酸、磷酸等形成的盐；或和有机酸例如苹果酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙酸、肉桂酸、丙酮酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、丙烯酸、扁桃酸等形成的盐；或者(2)碱加成盐，和碱金属例如锂、钠、钾等形成的盐；和碱土金属例如钙、镁等形成的盐；和有机碱例如铵、胆碱、二乙醇胺、赖氨酸、乙二胺、叔丁胺、叔辛胺、三(羟甲基)氨基甲烷、N-甲基葡萄糖胺、三乙醇胺、脱氢松香胺等形成的盐。对于本领域的技术人员而言，其他的药学上可接受的盐是已知的。
术语“同位素化合物”是指本发明的通式(I)化合物中含有一个或多个天然或非天然丰度的原子同位素。非天然丰度的原子同位素包括但不限于氘(2H或D)、氚(3H或T)、碘-125(125I)、磷-32(32P)、碳-13(13C)或碳-14(14C)。本发明中所合成的化合物的任何原子若没有特别指定，可代表该原子的任何一种稳定的同位素。除非特别说明，当结构中某一位置被定义为H即氢(H-1)时，该位置仅含天然存在的同位素量(0.015％)。
“氘”或“D”或“d”表示氢的同位素，其核含有一个质子和一个中子。当特别的位置被指定为含有氘时，应当理解的是该位置的氘的丰度大于氘的天然丰度(通常为0.015％)。除非另外说明，否则当某位置被特别指定为“D”或“氘”时，该位置应当理解为含有丰度大于氘的天然丰度的氘。
本发明中所合成的化合物的氘代率是指合成的同位素含量与天然存在的同位素量的比值。本发明中所合成的化合物的每个指定氘原子的氘代率可至少为3333.3倍(50％)、至少为4000倍(60％)、至少为4500倍(67.5％)、至少为5000倍(75％)、至少为5333.3倍(80％)、至少为6000倍(90％)、至少为6333.3倍(95％)、至少为6466.7倍(97％)、至少为6566.7倍(98.5％)、至少为6600 倍(99％)、至少为6633.3倍(99.5％)。
本发明中所合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量取决许多因素，其中包括氘代试剂(如D2O、D2、NaOD、NaBD4、LiAlD4等)的氘同位素纯度以及引入氘同位素合成方法的有效性。然而，如前所述这种某位置的氢同位素体的量总数将少于49.9％。本发明中所合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量总数将少于47.5％、40％、32.5％、25％、17.5％、10％、5％、3％、1％或0.5％。
本文中，任何未指定为氘的各原子以其天然同位素丰度存在。
术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本专利发明的化合物的形式。此类形式的实例为水合物、醇合物等。
术语“前药”是指在体内转化成母体药物的任何药剂。前药常常是有用的，因为，在某些情况下，他们比母体药物更易于给药。例如，通过口服给药，它们是可生物利用的，而母体药物却不是。前药相对于母体药物还可改善药物组合物中的溶解度。前药可经由酶的方法以及代谢水解的途径被转化为母体药物。
英文缩写：
1,4-dioxone:1,4-二氧六环；ACN:乙腈；AOPI:一种荧光染料；
Bin2P:双联频哪醇硼酸酯；dtbpy:4,4’-二叔丁基-2，2’-联吡啶；
MeOH:甲醇；DCM:二氯甲烷；D2:氘气；DMF:N,N-二甲基甲酰胺；
DMAP:4-二甲氨基吡啶；DIEA:N,N-二异丙基乙胺；EA:乙酸乙酯；
ee％:对映体过量百分比；EDCI:1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺；
HATU:2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HOBt:1-羟基苯并三氮唑；In(OTf)3:三氟甲烷磺酸铟；Ms:甲基磺酰基；
Ir(OMe)(cod)2:甲氧基(环辛二烯)铱(I)二聚体；LiAlH4:四氢锂铝；
LiOH.H2O:氢氧化锂一水合物；LiAlD4:氘代四氢锂铝；Na2CO3:碳酸钠；
NaBH3CN:氰基硼氢化钠；NaOD:氘代氢氧化钠；NaOH:氢氧化钠；
NCS:N-氯代丁二酰亚胺；NIS:N-碘代丁二酰亚胺；NaH:钠氢；
Tf:三氟甲基磺酰基；Tf2O:三氟甲磺酸酐；TFA:三氟乙酸；
TEA:三乙胺；PE:石油醚；Pd(pph3)4:四(三苯基膦)钯；
Ts:对甲苯磺酰基；Pd/C:钯碳；
Pd(dppf)Cl2 .DCM:[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物；
Flash:低压快速制备色谱；GC-MS:气相质谱；HPLC:高压制备液相色谱；
PH:氢离子浓度指数；Pre-TLC:预制硅胶薄层色谱；TLC:薄层色谱法；
SFC:超临界流体色谱法；
KDa:千道尔顿；BID:每天2次。
本发明提供的氘代化合物(包括其盐)可使用已知有机合成技术来制备，且可按照多种可能合成途径中的任一种(诸如下文方案中的那些)来合成。用于制备本发明化合物的反应可在合适的溶剂中进行，有机合成领域的技术人员可容易地选择溶剂。合适的溶剂可在进行反应的温度(例如，在溶剂冻结温度至溶剂沸点温度范围内的温度)下与起始物质(反应物)、中间体或产物实质上不反应。既定反应可在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。技术人员可依据具体反应步骤来选择用于具体反应步骤的溶剂。
一、药物中间体及其合成
在氘代化合物的合成过程中，由于可氘代位置较多，因此针对在不同位置进行氘代时，就需要基于对应的中间体化合物进行，在此本申请基于药物的整体合成路线提出以下关键中间体，并基于关键中间体的骨架将关键中间体划分为氘取代异丙基系列关键中间体(A系列中间体)、氘取代氯苯系列关键中间体(B系列中间体)、氘取代吡啶环系列关键中间体(C系列中间体)以及氘取代吡咯环系列关键中间体(D系列中间体)，各关键中间体的合成过程具体描述如下：
1、氘取代异丙基系列关键中间体(A系列中间体)的制备
1.1中间体A-1的制备
步骤1:中间体A-1-2的制备
用冰浴控制反应瓶的温度在0℃，在80mL的无水THF中缓慢加入LiAlD4(5.0g,68.49mmol)，然后在0℃下缓慢滴加溶解在20mL的无水THF丙酮肟(5.0g,68.49mmol)。接下来，撤掉冰浴，氮气保护密封环境下，采用控温在10℃左右低温冷凝管缓慢升温到70℃剧烈反应3小时。反应完成后，缓慢降温到0℃，然后在冰浴下加入十水硫酸钠终止反应。接下来采用常压蒸馏，收集40-60℃左右的馏分，并向馏分中加入4N的盐酸1,4-二氧六环溶液，浓缩干得到A-1-2产物为黄色油状物3.7g。GC-MS[M+H]+＝61.1。
步骤2：中间体A-1的制备
将化合物5-氯-2-氟-4-碘吡啶(500mg,1.95mmol)溶解在乙醇(22mL)中，依次向反应瓶加入TEA(1.3mL)和A-1-2(1.9g,19.5mmol)。然后将该反应加热到90℃反应过夜。TLC检测反应毕，将有机溶剂旋干，萃取，柱 层析纯化(PE/EA＝1:1)得到A-1产物为无色油状物300mg。
LC-MS[M+H]+＝298.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(s,1H),7.03(s,1H),6.67(brs,1H),1.11(s,3H),1.09(s,3H)。
1.2.1中间体A-2的制备
步骤1：中间体A-2-1的制备
将氘代丙酮(25mL)溶解在100mL水中,然后将碳酸钠(20g,188.67mmol)缓慢加到氘代丙酮溶液中。接着，将盐酸羟胺(23.6g,342.02mmol)溶解在100mL水中缓慢加入到上述反应液中，然后室温搅拌过夜。反应毕，用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩得到A-2-1产物为白色固体29g。GC-MS[M+H]+＝80.3。
步骤2：中间体A-2-2的制备
用冰浴控制反应瓶的温度在0℃，在80mL的无水THF中缓慢加入LiAlH4(16.8g,441mmol)，然后在0℃下缓慢滴加溶解在20mL的无水THF中的A-2-1(29g,367mmol)。接下来，撤掉冰浴，氮气保护密封环境下，采用控温在10℃左右低温冷凝管缓慢升温到70℃剧烈反应3小时。反应毕，缓慢降温到0℃，然后，在冰浴下加入Na2SO4·10H2O终止反应。接下来采用常压蒸馏，收集40-60℃左右的馏分，并向馏分中加入4N的盐酸1,4-二氧六环溶液，浓缩至干，得到黄色油状物产物8.0g，即中间体A-2-2。GC-MS[M+H]+＝66.1。
步骤3：中间体A-2的制备
将化合物5-氯-2-氟-4-碘吡啶(2.0g,7.8mmol)溶解在乙醇(20mL)中，依次向反应瓶加入TEA(10.8mL)和A-2-2(1.9g,19.5mmol)。然后将该反应加热到95℃反应15小时。TLC检测反应毕，将有机溶剂旋干，萃取，柱层析纯化(PE/EA＝0～15％)得到A-2产物为白色固体1.8g。LC-MS[M+H]+＝303.1。
1.2.2中间体A-2’的制备
在氮气保护下，向反应瓶中依次加入氘代丙酮(617mg,9.64mmol)和4- 溴-5-氯吡啶-2-胺(1.0g,4.83mmol)溶解在10mL氘代甲醇中,加入2滴醋酸，然后室温反应过夜。第二天向反应体系中在加入NaBH3CN(910.7mg,28.92mmol)，然后继续反应12小时。将反应液倒入水中，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化(PE/EA＝0～10％)得到A-2’产物为白色固体180mg。LC-MS[M+H]+＝255.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(s,1H),6.81(s,1H),6.80(d,J＝7.6Hz,1H),3.89(d,J＝7.6Hz,1H)。
1.3中间体A-3的制备
步骤1：中间体A-2-1的制备
将氘代丙酮(5.0g)溶解在40mL水中,然后将碳酸钠(9.9g,93.7mmol)缓慢加到氘代丙酮溶液中。接着，将盐酸羟胺(5.9g,85.9mmol)溶解在30mL水中缓慢加入到上述反应液中，然后室温搅拌过夜。反应毕，用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩得到A-2-1产物为白色固体5.0g。GC-MS[M+H]+＝80.3。
步骤2：中间体A-3-1的制备
用冰浴控制反应瓶的温度在0℃，在30mL的无水THF中缓慢加入LiAlD4(1.7g,40.47mmol)，然后在0℃下缓慢滴加溶解在20mL的无水THF中的A-2-1(2.0g,25.31mmol)。接下来，撤掉冰浴，氮气保护密封环境下，采用控温在10℃左右低温冷凝管缓慢升温到70℃剧烈反应3小时。反应毕，缓慢降温到0℃，然后在冰浴下加入十水硫酸钠终止反应。接下来采用常压蒸馏，收集40-60℃左右的馏分，并向馏分中加入4N的盐酸1,4-二氧六环溶液，浓缩干得到A-3-1产物为黄色油状物2.7g。GC-MS[M+H]+＝67.2。
步骤3：中间体A-3的制备
将化合物5-氯-2-氟-4-碘吡啶(100mg,0.39mmol)溶解在乙醇(2mL)中，依次向反应瓶加入TEA(0.32mL)和A-3-1(200mg,1.95mmol)。然后将该反应加热到95℃反应15小时。TLC检测反应毕，将有机溶剂旋干，萃取，柱层析纯化(PE/EA＝0～8％)得到A-3产物为白色固体27mg。LC-MS[M+H]+＝304.2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(s,1H),7.03(s,1H),6.66(brs,1H)。
2、氘取代氯苯系列关键中间体(B系列中间体)的制备
2.1中间体B-1的制备
将反应物(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙酸(500mg,2.69mmol)溶解在10mL无水THF中，在冰浴条件下缓慢加入LiAlD4(169.5mg,4.04mmol)。然后在氮气保护下将反应液加热到70℃反应12小时。反应毕，将反应液缓慢倒入冰中，DCM萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩，C-18反向在220nm条件下纯化得到B-1产物为白色固体302mg。LC-MS[M+H]+＝174.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.42(s,1H),7.34-7.25(m,3H),4.76(brs,1H),3.84(s,1H),2.01(brs,2H)。
2.2中间体B-2的制备
步骤1：中间体B-2-1的合成
将反应物2-氨基-2-(3-氯苯基)乙酸(3.54g,19.07mmol)溶解在20mL的重水(D2O)中，然后向反应液中在缓慢加入3.5mL的NaOD。接着加热到100℃反应过夜。反应毕，将反应液降低到室温，在用1N的盐酸调节PH值到6-7后析出大量白色固体，水洗，干燥得到B-2-1产物为白色固体1.6g。LC-MS[M-H]+＝185.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(brs,1H),7.48(s,1H),7.36-7.35(m,3H)。
步骤2：中间体B-2-2的合成
将反应物B-2-1(300mg,1.61mmol)溶解在7mL无水THF中，在冰浴条件下缓慢加入LiAlH4(90.5mg,2.42mmol)。然后在氮气保护下将反应液加热到70℃反应12小时。反应毕，将反应液缓慢倒入冰中，DCM萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩，C-18反向在220nm条件下纯化得到B-2-2产物为白色固体254mg。
LC-MS[M+H]+＝173.1。
步骤3：中间体B-2的合成
将中间体B-2-2(200mg)用甲醇溶解,采用SFC进行手型拆分，拆分条件为改性剂为甲醇：乙腈＝1：1加千分之五的二乙胺，比例为15％等度，总流速80mL/min,拆分后浓缩分离得到B-2为白色固体84mg。LC-MS[M+H]+＝173.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.44(s,1H),7.30-7.25(m,3H),4.79(s,1H),3.34-3.29(m,2H),1.92(brs,2H)。
2.3中间体B-3的制备
步骤1：中间体B-2-1的合成
将反应物2-氨基-2-(3-氯苯基)乙酸(3.54g,19.07mmol)溶解在20mL的重水(D2O)中，然后向反应液中在缓慢加入3.5mL的NaOD。接着加热到100℃反应过夜。反应毕，将反应液降低到室温，在用1N的盐酸调节PH值到6-7后析出大量白色固体，水洗，干燥得到B-2-1产物为白色固体1.6g。LC-MS[M-H]+＝185.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(brs,1H),7.48(s,1H),7.36-35(m,3H)。
步骤2：中间体B-3-1的合成
将反应物B-2-1(500mg,2.69mmol)溶解在10mL无水THF中，在冰浴条件下缓慢加入LiAlD4(169.2mg,4.04mmol)。然后在氮气保护下将反应液加热到70℃反应12小时。反应毕，将反应液缓慢倒入冰中，DCM萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩，C-18反向在220nm条件下纯化得到B-3-1产物为白色固体370mg。LC-MS[M+H]+＝175.2。
步骤3：中间体B-3的合成
将中间体B-3-1(280mg)用甲醇溶解,采用SFC进行手型拆分，拆分条件为改性剂为甲醇：乙腈＝1：1加千分之五的二乙胺，比例为15％等度，总流速80mL/min,拆分后浓缩分离得到B-3为白色固体104mg。LC-MS[M+H]+＝175.2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.43(s,1H),7.34-7.24(m,3H)，4.81(brs,1H)，3.44-3.26(m,2H)。
2.4中间体B-4的制备
将(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙-1-醇(200mg,1.17mmol)溶解在5mL无水THF中，然后在加入B2Pin(3.0g,11.7mmol)。再在氮气保护下向上述体系中加入Ir(OMe)(cod)2(16mg,0.02mmol)、dtbpy(13mg,0.05mmol)和重水(2mL)。该反应加热到100℃反应19小时后，检测反应生成中间态，再将反应体系放入到微波中140℃反应2小时。反应毕，将反应将至室温，倒入水中，萃取，分离，无水硫酸钠干燥，C-18反向HPLC纯化得到B-4产物为白色固体25mg。LC-MS[M+H]+＝174.2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.35(d,J＝5.2Hz,1H),7.27(d,J＝5.2Hz,1H),4.81-4.80(m,1H),3.87-3.85(m,1H),3.43-3.41(m,1H),3.31-3.29(m,1H),1.98-1.97(m,2H)。
3、氘取代吡啶环系列关键中间体(C系列中间体)的制备
3.1.1中间体C-1的合成
步骤1：中间体C-1-1的合成
将化合物4-羟基-2-氨基吡啶(10g,90.90mmol)加入到50mL重水中，接着加入2.5g的Pd/C，并向反应液中充氢气5分钟。接着将反应加热到210℃反应8小时。反应毕，将反应液降到室温，过滤，滤饼在75℃下真空干燥3小时得到产物C-1-1为白色固体7.5g。LC-MS[M+H]+＝114.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.88(brs,1H)，5.61(brs,2H)。
步骤2：中间体C-1-2的合成
将化合物C-1-1(4.0g,35.4mmol)溶解在50mL无水DMF后，在氮气保护下向反应瓶中加入NaH(1.7g.70.8mmol)，该反应在室温下搅拌30分钟后，在向上述体系加入对甲氧基苄氯(5.6g,35.4mmol)。然后将反应液加热到60℃反应过夜。反应毕，将反应液降到室温倒入冰中，析出大量固体，过滤，得到产物C-1-2为白色固体2.0g。LC-MS[M+H]+＝234.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.36(d,J＝8.8Hz,2H),6.95(d,J＝6.8Hz,2H),5.78(brs,2H)，4.96(s,2H)，3.75(s,3H)。
步骤3：中间体C-1-3的合成
将C-1-2(1.8g,6.4mmol)溶解在15mL无水二氯甲烷中,然后依次向反应瓶中加入二碳酸二叔丁酯(1.1g,5.1mmol)、TEA(2.6mL,19.2mmol)和DMAP(78mg，0.64mmol)。接着该反应在室温反应3小时。反应毕，旋干溶剂，萃取，分液，有机相浓缩，粗品进行柱层析纯化得到C-1-3为黄色油状物0.8g。LC-MS[M+H]+＝334.2。
步骤4：中间体C-1-4的合成
将C-1-3(4.0g,12.01mmol)溶解在80mL无水DMF中，在氮气保护和0℃时，缓慢向反应瓶中加入NaH(1.08g,25.22mmol)。室温搅拌30分钟后，再向反应瓶中加入2-碘丙烷(2.86g,16.82mmol)，室温搅拌反应过夜。反应毕，将反应液倒入冰水中淬灭，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得到C-1-4为白色固体3.0g。LC-MS[M+H]+＝376.2。
步骤5：中间体C-1-5的合成
将中间体C-1-4(100mg,0.265mmol)溶解在3mLTFA中，然后将反应液加热到70℃反应4小时。反应毕，将TFA旋干，粗品采用C-18的flash进行纯化得到C-1-5为白色固体45mg。LC-MS[M+H]+＝156.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.22-6.21(m,1H),3.87-3.85(m,1H),3.55-3.43(m,1H),1.11(d,J＝6.4Hz,6H)。
步骤6：中间体C-1-6的合成
将中间体C-1-5(10mg，0.064mmol)在0℃下溶解到二氯甲烷中并搅拌10分钟，在氮气保护下将NCS(10mg,0.075mmol)加入到上述反应液中。然后在0℃反应40分钟，反应毕。将溶剂旋干，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，pre-TLC纯化得到C-1-6为白色固体8mg。LC-MS[M+H]+＝189.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.55(d,J＝5.2Hz,1H),4.19-4.10(m,1H),2.58(s,1H),1.16(d,J＝4.4Hz,6H)。
步骤6：中间体C-1的合成
将中间体C-1-6(50mg,0.266mmol)溶解在DCM中加入到5mL的反应瓶，然后0℃条件下向反应瓶中依次加入Tf2O(74.7mg,0.266mmol)和TEA(53.7mg,0.532mmol)，室温搅拌反应过夜。反应毕，将溶剂旋干，加入冰水后萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，pre-TLC纯化得到C-1为白色固体35mg。LC-MS[M+H]+＝321.3。
3.1.2中间体C-1’的合成
步骤1：中间体C-1’-1的合成
将化合物4-溴-5-氯-2-氨基吡啶(5g,24.3mmol)加入到40mL重水中，接着将反应加热到250℃反应2小时。反应毕，将反应液降到室温，过滤，滤饼在75℃下真空干燥3小时得到产物C-1’-1为白色固体503mg。LC-MS[M+H]+＝209.3。
步骤2：中间体C-1’的合成
在氮气保护下，向反应瓶中依次加入丙酮(139.4mg,2.41mmol)和C-1’-1(100mg,0.48mmol)溶解在10mL甲醇中,加入2滴醋酸，然后室温反应过夜。第二天向反应体系中在加入NaBH3CN(151.83mg,2.41mmol)，然后继续反应12小时。将反应液倒入水中，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化(PE/EA＝0～12％)得到C-1’产物为白色固体25mg。LC-MS[M+H]+＝253.1。
4、氘取代吡咯环系列关键中间体(D系列中间体)的制备
4.1中间体D-1的合成
步骤1：中间体D-1-2的合成
将5-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1.0g,4.91mmol)溶解在10mL的氘代甲醇中，然后向反应液中加入40mg的Pd/C后，在氘气环境下置换3次，室温反应4小时。反应毕，将反应液过滤，并用碳酸氢钠水溶液调节pH到7，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，有相机浓缩得到产物D-1-2为黄色油状物610mg。LC-MS[M+H]+＝127.3。
步骤2：中间体D-1-3的合成
将D-1-2(500mg,4mmol)溶解在5mL乙腈中，然后在0℃下缓慢加入NIS(1.08g,4.4mmol)和In(OTf)3(225mg,0.4mmol)。在氮气惰性环境下，该反应在0℃继续反应4小时。反应毕，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，C-18反向flash纯化得到产物D-1-3为白色固体620mg。LC-MS[M+H]+＝253.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.26(brs,1H)，6.87(s,1H)，3.75(s,3H)。
步骤3：中间体D-1-4的合成
将D-1-3(360mg,1.43mmol)溶解在4mL的二氯甲烷中，然后在0℃条件下依次向反应体系中加入对甲苯磺酰氯(407mg,2.14mmol)、TEA(0.3mL)和DMAP(174mg,1.43mmol)。接着将反应升至室温搅拌过夜。反应毕，将反应液倒入冰水中，萃取，分液，浓缩，硅胶柱层析Flash纯化分离(EA:PE＝0～15％)得到产物D-1-4为白色固体510mg。LC-MS[M+H]+＝407.3。
步骤4：中间体D-1的合成
在氮气保护下，向密闭的20mL的微波反应瓶中依次加入D-1-4(600mg,1.5mmol)溶解在6mL无水DMF中,双联频哪醇硼酸酯(762mg,3mmol)、1,1’-二(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯的二氯甲烷络合物(122mg,0.15mmol)和乙酸钾(441mg,4.5mmol)。然后将该反应液加热到95℃反应5小时。反应毕，将反应液加入少量乙酸乙酯，过硅藻土处理，接下来萃取，分液，有机相浓缩，粗品采用C-18Flash纯化分离得到产物D-1为白色固体200mg。LC-MS[M+H]+＝407.1。
4.2中间体D-2的合成
步骤1：中间体D-2-2的合成
将3-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(5.0g,24.5mmol)溶解在50mL的氘代甲醇中，然后向反应液中加入500mg的Pd/C和TEA(3.4mL)后，在氘气环境下置换3次，室温反应4小时。反应毕，将反应液过滤，并用碳酸氢钠水溶液调节PH到7，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，有相机浓缩得到产物D-2-2为黄色固体4.2g。LC-MS[M+H]+＝127.3。
步骤2：中间体D-2-3的合成
将D-2-2(200mg,1.59mmol)溶解在2mL乙腈中，然后在0℃下缓慢加入NIS(376mg,1.67mmol)和In(OTf)3(89mg,0.159mmol)。在氮气惰性环境下，该反应在0℃继续反应1.5小时。反应毕，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，C-18反向flash纯化得到产物D-2-3为黄色固体200mg。LC-MS[M+H]+＝253.1。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.19(brs,1H)，7.16(s,1H)，3.75(s,3H)。
步骤3：中间体D-2-4的合成
将D-2-3(200mg,0.75mmol)溶解在2mL的二氯甲烷中，然后在0℃条件下依次向反应体系中加入对甲苯磺酰氯(215mg,1.13mmol)、TEA(0.2mL)和DMAP(92mg,0.75mmol)。接着将反应升至室温搅拌过夜。反应毕，将反应液倒入冰水中，萃取，分液，浓缩，硅胶柱层析Flash纯化分离(EA:PE＝0～15％)得到产物D-2-4为白色固体301mg。LC-MS[M+H]+＝407.3。
步骤4：中间体D-2的合成
在氮气保护下，向密闭的20mL的微波反应瓶中依次加入D-2-4(300mg,0.75mmol)溶解在6mL无水DMF中,双联频哪醇硼酸酯(381mg,1.5mmol)、1,1’-二(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯的二氯甲烷络合物(61mg,0.075mmol)和乙酸钾(220.5mg,2.25mmol)。然后将该反应液加热到95℃反应5小时。反应毕，将反应液加入少量乙酸乙酯，过硅藻土处理，接下来萃取，分液，有机相浓缩，粗品采用C-18Flash纯化分离得到产物白色固体151mg D-2。LC-MS[M+H]+＝407.1。
4.3中间体D-3的合成
步骤1：中间体D-3-1的合成
将1H-吡咯-2-甲酸甲酯(3.0g,24mmol)溶解在30mL的乙腈中，然后在氮气保护下室温条件下依次向上述反应液中加入NIS(16.7g,74.4mmol)和In(OTf)3(4.0g,7.2mmol)。然后该反应继续在室温反应15小时。反应完毕，旋干乙腈，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，有机相浓缩。粗品采用氘代甲醇进行重结晶，过滤，干燥得到产物棕色固体6.5g，即D-3-1。LC-MS[M+H]+＝504.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.04(brs,1H),3.77(s,3H)。
步骤2：中间体D-3-2的合成
将D-3-1(6.5g,12.9mmol)溶解在40mL的氘代甲醇中，然后向反应液中加入Ni(8mL悬浮在氘代甲醇中)和NaOH(2.6g,64.6mmol)后，在氘气环境下置换3次，室温反应4小时。反应毕，将反应液过滤，并用碳酸氢钠水溶液调节PH到7，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，有相机浓缩得到产物黄色液体1.5g，即D-3-2为。LC-MS[M+H]+＝129.3。
步骤3：中间体D-3-3的合成
将D-3-2(1.3g,10.15mmol)溶解在18mL乙腈中，然后在0℃下缓慢加入NIS(2.0g,8.88mmol)和In(OTf)3(572mg,1.01mmol)。在氮气惰性环境下，该反应在0℃继续反应2小时。反应毕，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析flash纯化得到产物D-3-3为无色液体2.3g。LC-MS[M+H]+＝254.3。
步骤4：中间体D-3-4的合成
将D-3-3(2.3g,9.1mmol)溶解在20mL的二氯甲烷中，然后在0℃条件下依次向反应体系中加入对甲苯磺酰氯(2.6g,13.6mmol)、TEA(2mL)和DMAP(1.1g,9.1mmol)。接着将反应升至室温搅拌过夜。反应毕，将反应液倒入冰水中，萃取，分液，浓缩，硅胶柱层析Flash纯化分离(EA:PE＝0～15％) 得到白色固体产物3.0g，即为D-3-4。LC-MS[M+H]+＝408.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(d,J＝6.0Hz,2H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),3.68(s,3H),2.40(s,3H)。
步骤5：中间体D-3的合成
在氮气保护下，向反应瓶中依次加入D-3-4(3.4g,8.4mmol)溶解在30mL无水DMF中,双联频哪醇硼酸酯(2.3g,9.2mmol)、1,1’-二(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯的二氯甲烷络合物(685mg,0.84mmol)和乙酸钾(2.7g,27.6mmol)。然后将该反应液加热到95℃反应2小时。反应毕，将反应液加入少量乙酸乙酯，过硅藻土处理，接下来萃取，分液，有机相浓缩，粗品采用C-18Flash纯化分离得到白色固体产物3.0g即中间体D-3。LC-MS[M+H]+＝408.3。
二、通用合成路线
本发明式(I)结构的化合物可通过下述通用制备路线合成。合成路线如下所示：
反应式Ⅰ：
其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3中的任一种，R3-R14各自独立地选自H或D中的一种；X1选自Br、I、OTf或Oms中的任一种；Y为离去基团Ts或Boc。
在优选的一个实施方案中，还涉及
中间体化合物4可以与中间体化合物5通过铃木反应得到中间体化合物6，所述中间体化合物6水解得到中间体化合物7，最后中间体化合物7和中间体化合物8进行缩合反应，即得到式I化合物。
中间体化合物4可以通过下述反应式Ⅱ或反应式Ⅲ制备得到的：
其中，R1-R2定义为CH3、CH2D、CHD2、CD3，R3-R14可以定义为H、D。X1定义为OTf,OMs等，X2定义为F、Cl、Br或I等卤素，Y是一个离去基团，可以为Ts,Boc等。
具体而言，在反应式Ⅱ中，中间体化合物1经还原反应制备得到中间体化合物2；所述中间体化合物2与中间体化合物3经取代反应得到中间体化合物4；
在反应式Ⅲ中，中间体化合物1’和中间体化合物2’经还原胺化制备得到中间体化合物4。
基于上述关键中间体以及通用合成路线，本发明合成获得了以下氘代化合物。
典型氘代化合物的合成过程具体如下述实施例。
实施例1：
1、(S)-4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺(氘代化合物1)的合成，
结构式为：
合成步骤如下所示:
1)4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯的合成
将5-氯-4-碘-N-(异丙基-2-基-2-[D])吡啶-2-胺(200mg,0.67mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧基硼酸-2-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(300mg,0.74mmol)溶解在4mL的1,4-二氧六环中，然后依次向反应瓶中加入四三苯基膦钯(77mg,0.067mmol)和碳酸钠(213mg,2.01mmol)溶解于1mL水中。接着向反应体系通氮气5分钟后，在氮气保护下，升温到100℃微波反应1小时。反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分液，有机相浓缩，柱层析flash分离得到黄色固体化合物240mg。LC-MS[M+H]+＝449.3。
2)4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸
将4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(300mg,0.67mmol)溶解在3mL的THF中加入到反应瓶中，然后加入氢氧化锂一水合物(169mg,4.02mmol)溶解在1mL水中。将反应加热到75℃反应15小时。将四氢呋喃旋掉，残留液用6N的盐酸调节PH到4-5，析出大量白色固体，过滤，粗品采用pre-TLC纯化得到纯化产物150mg。LC-MS[M+H]+＝281.2。
3)(S)-4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺
依次将4-(5-氯-2-((异丙基-2-基-2-[D])氨基)吡啶-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸(150mg,0.54mmol)、(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙-1-醇(109mg,0.64mmol)和HATU(308mg,0.81mmol)溶解的无水DMF中，再加入TEA(164mg,1.62mmol)。将反应瓶抽真空，并充氮气5分钟后，在氮气环境下室温反应2小时。反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，pre-TLC和HPLC纯化得到白色固体产物18mg，即为氘代化合物1。LC-MS[M+H]+＝434.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.88(brs,1H),8.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(s,1H),7.45(s,1H),7.38-7.29(m,5H),6.60(s,1H),6.41(s,1H),5.08-5.03(m,2H),3.67-3.65(m,2H),1.13(s,6H)。
2、氘代化合物2和化合物3的合成
氘代化合物2和氘代化合物3采用各自对应的中间体，可以通过与实施例1相似的合成方法进行合成，其结果如表1所示：
表1
实施例4：
1、(S)-4-(5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基-2,2-[D2])-1H-吡咯-2-酰胺(氘代化合物4)的合成
结构式为
合成步骤如下述反应式所示，具体为：
依次将4-(5-氯-2-((异丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸(100mg,0.357mmol)、HATU(203.5mg,0.563mmol)和TEA(108mg,1.125mmol)溶解的无水DMF中。将反应瓶抽真空，并充氮气5分钟后，在氮气环境下室温反应30分钟。再将(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙-1,1-[D2]-1-醇(67.9mg,0.413mmol)溶解在无水DMF中加入到上述反应液中，继续反应2小时。反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，pre-TLC和HPLC纯化得到白色固体产物23mg，即为氘代化合物4。LC-MS[M+H]+＝435.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.86(brs,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(s,1H),7.45(s,1H),7.38-7.30(m,5H),6.60(s,1H),6.43(d,J＝7.6Hz,1H),5.06(d,J＝8.4Hz,1H),4.96(s,1H),3.99-3.93(m,1H),1.14(d,J＝6.4Hz,6H)。
2、氘代化合物7-11的合成
对比化合物1、2，氘代化合物7-11(结构式分别表2所示)基于各自对应的中间体，可以通过与氘代化合物4相似的合成方法合成获得，结果如表2所示：
表2


实施例10：
1、(S)-4-(5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2])-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺(氘代化合物12)的合成
结构式
合成步骤
步骤1)：4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2])-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯
将5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2]三氟甲磺酸(100mg,0.32mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧基硼酸-2-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(139.22mg,0.343mmol)溶解在2mL的1,4-二氧六环中，然后依次向反应瓶中加入四三苯基膦钯(36.99mg,0.032mmol)和碳酸钾(132.48mg,0.96mmol)溶解于1mL水中。接着向反应体系通氮气5分钟后，在氮气保护下，升温到120℃微波反应1小时。反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分液，有机相浓缩，柱层析flash分离得到白色固体产物105mg。LC-MS[M+H]+＝450.3。
步骤2)：4-(5-氯-2-((异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2])-1H-吡咯-2-羧酸
将4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2]-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(150mg,0.33mmol)溶解在5mL的THF中加入到反应瓶中，然后加入氢氧化锂一水合物(138.6mg,3.3mmol)溶解在2mL水中。将反应加热到78℃反应12小时。将四氢呋喃旋掉，残留液用6N的盐酸调节PH到4-5，析出大量白色固体，过滤，粗品采用C-18flash纯化得到产物90mg。LC-MS[M+H]+＝282.2。
步骤3)：(S)-4-(5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2])-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-2-酰胺
依次将4-(5-氯-2-((异丙基氨基)吡啶-4-基-3,6-[D2])-1H-吡咯-2-羧酸(50mg,0.178mmol)，(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙-1-醇(33.48mg,0.195mmol)，EDCI(37.44mg,0.195mmol)，HOBt(29.64mg,0.195mmol)溶解的无水DMF中，再加入DIEA(0.3mL)。将反应瓶抽真空，并充氮气5分钟后，在氮气环境下室温反应12小时。将反应液倒入水中，萃取，分液，浓缩，HPLC纯化得到白色固体45mg，即为氘代化合物12。LC-MS[M+H]+＝435.3。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.92(brs,1H),8.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.97(s,1H),7.45(s,1H),7.37-7.29(m,4H),6.41(d,J＝7.8Hz,1H),5.09-5.04(m,2H),3.98-3.93(m,1H),3.70-3.65(m,2H),1.14(d,J＝6.6Hz,6H)。
2、氘代化合物13、14的合成
氘代化合物13、14(结构式和合成结果分别如表4所示)采用相对应的中间体与氘代化合物12相似的合成方法进行合成，结果如表3所示：
表3

实施例13：
1、(S)-4-(5-氯-2-(异丙基氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-3-[D]-2-酰胺(氘代化合物15)的合成
结构式
步骤1)：4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-3-[D]-2-甲酸甲酯
将5-氯-4-碘-N-异丙基吡啶-2-胺(1.0g,2.5mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧基硼酸-2-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-3-[D]-2-甲酸甲酯(962mg,3.3mmol)溶解在1,4-二氧六环(10mL)中加入到20mL的微波管中，然后依次四三苯基膦钯(289mg,0.25mmol)，Na2CO3(795mg,7.5mmol)溶解在水中。然后向反应瓶中鼓氮气5分钟后，密封，在油浴中加热100℃反应3小时。TLC检测反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分离，柱层析flash纯化(EA:PE＝0～15％)即得到白色固体1.5g。LC-MS[M+H]+＝449.3。
步骤2)：4-(5-氯-2-((异丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-吡咯-3-[D]-2-羧酸
将4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基)-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯-3-[D]-2-甲酸甲酯(2.0g,4.5mmol)溶解在20mL的THF中加入到反应瓶中，然后加入NaOH(540mg,13.5mmol)溶解在4mL水中。将反应加热到60℃反应6小时。将四氢呋喃旋掉，残留液用6N的盐酸调节PH到4-5，析出大量白色固体，过滤，粗品采用C-18flash纯化得到白色固体180mg。LC-MS[M+H]+＝281.3。
步骤3)：(S)-4-(5-氯-2(异丙基氨基)吡啶-4-基)-N-(1-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-1H-吡咯-3-[D]-2-酰胺
依次将4-(5-氯-2-((异丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-吡咯-3-[D]-2-羧酸(100mg,0.36mmol)、HATU(205mg,0.54mmol)和TEA(0.2mL,1.08mmol)溶解的无水DMF中。将反应瓶抽真空，并充氮气5分钟后，在氮气环境下室温反应30分钟。再将(S)-2-氨基-2-(3-氯苯基)乙-1-醇(67mg,0.39mmol)溶解在无水DMF中加入到上述反应液中，继续反应1小时。反应毕，将反应液倒入水中，萃取，分液，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，pre-TLC和HPLC纯化得到白色固体25mg，即为氘代化合物15。LC-MS[M+H]+＝434.3。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.86(brs,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.97(s,1H),7.45(s,1H),7.38-7.29(m,4H),6.60(s,1H),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),5.09-4.99(m,2H),3.98-3.93(m,1H),3.69-3.64(m,2H),1.14(d,J＝6.4Hz,6H)。
2、氘代化合物16、17的合成
氘代化合物16、17(结构式分别如表4所示)各自采用相应的中间体，可以通过与氘代化合物15相似的合成方法合成获得，其结果如表4所示：
表4：

对照化合物3、4、5、6，以及氘代化合物18-168(结构式分别如表5所示)，各自分别采用相应的中间体，可以通过如上述氘代化合物1、4、12或15所示的合成路线合成获得，合成结果如表5所示：
表5：






























本发明提供的氘代化合物可通过化合物的消旋混合物与光学活性的拆分剂反应形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并回收光学纯度的対映体，制备成其单个立体异构体。对映体拆分时可使用本发明化合物的非对映体衍生物进行，优先可解离的复合物(例如，结晶非对映体盐)。非对映体具有显著不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)，并可通过这些不相似性的优势容易地得到分离。非对映体可通过色谱，优选通过基于溶解度的差异的分离/拆分技术进行分离。然后通过不会消旋化的任何实际手段，回收光学纯对映体，连同拆分试剂。适用于从消旋混合物开始拆分得到化合物立体异构体的技术的更详细的描述可见于Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen，“对映体、消旋体和拆分”(“Enantiomers，Racemates and Resolutions”)，JohnWileyAnd Sons，Inc.,l98l。
实验例1：ERK1、ERK2激酶实验
1、实验目的：
测定本发明提供的上述氘代化合物对于ERK1、ERK2的抑制活性。
2、实验仪器、耗材和试剂，如表6所示:
表6：
3、实验过程
(1)实验对象：阳性对照物BVD-523(根据公开于专利WO2005113541中的合成方法合成)和本发明提供的部分的氘代化合物。
(2)实验准备：
A.溶液配置
(1)4×kinase reaction buffer：使用5×kinase reaction buffer稀释+终浓度为200nM的DTT；
(2)ERK1激酶工作液(2.5×)：100ng/μL的母液用buffer稀释50倍，配置成2ng/μL的工作液；
(3)ERK2激酶工作液(2.5×)：100ng/μL的母液用buffer稀释40倍，配置成2.5ng/μL的工作液；
(4)substrate/ATP MIX工作液(2.5×)：10mM的ATP母液和1mg/mL的substrate母液用buffer稀释80倍、4倍，配置成含125μMATP、0.25mg/mL substrate的MIX工作液；
B.化合物工作液的配置
a.取2μL的10mM的对照化合物或者待测化合物的母液，使用38μL DMSO稀释至0.5mM起始浓度，混匀，加到96孔板的B1孔中。
b.在B2-B11孔中加入25μL DMSO，从B1孔中取5μL溶液加到B2孔 中，混匀，依次稀释到B9孔，B10-B11孔不稀释(只有DMSO，10孔为空白对照)，得到依次6倍稀释的溶液。
c.在96孔板C1-C11孔中加入38μL的1×kinase reactionbuffer，取B1-B11孔稀释溶液2μL加到C1-C11中，混匀，配置成首孔浓度25μM，6倍稀释的工作液。
(3)实验步骤：
a)取4μL激酶工作液液加入到384孔板中(第11孔为阴性对照，不加激酶溶液，以1×kinase reactionbuffer代替)，对应孔再加2μL各浓度的化合物工作液，1000rpm离心1min，室温300rpm孵育10min；
b)对应每孔加入4μL substrate/ATP MIX工作液，1000rpm离心1min，ERK1激酶37℃300rpm孵育60min；ERK2激酶室温300rpm孵育60min；
c)每孔加入10μL的ADP-Glo reagent，1000rpm离心1min，室温300rpm孵育50min；
d)每孔加入20μL的kinase detection reagent，1000rpm离心1min，室温300rpm孵育40min；
e)酶标仪读取Luminescence下的数值，并记录；
f)数据处理
按如下公式计算各化合物在各浓度点的抑制率，并通过软件Graphpad Prism 8.0进行曲线拟合得到IC50值。
4、实验结果
表7：



NT: No Tested。
由表7中的实验数据可见，与未氘代的对照化合物BVD-523相比，整体而言，本发明提供的供试氘代化合物对ERK1激酶和ERK2激酶的抑制活性与对照化合物相当。
实验例2本发明的部分氘代化合物对A375细胞、Colo 205细胞、HCT116细胞的增殖抑制测定
1、实验目的
测定本发明的化合物对于A375细胞、Colo205细胞、HCT116细胞的增殖的抑制活性
2、实验仪器、耗材和试剂，如表8所示:
表8
3、实验过程：
(1)实验对象：阳性对照物BVD-523，以及本发明提供的上述氘代化合 物。
(2)实验准备：
A、培养基配置
a)人恶性黑色素瘤细胞A375培养基配制：DMEM(高糖)+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin
b)人结肠癌细胞colo 205培养基配制：1640+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin
c)人结肠癌细胞HCT116培养基配制：McCoy's 5A+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin
B、化合物工作液的配置
a).取4μL的10mM的对照化合物或待测化合物的母液，使用16μL DMSO稀释至2mM起始浓度，混匀，加到96孔板的B1孔中。
b).在B2-B10孔中加入12μL DMSO，从B1孔中取8μL溶液加到B2孔中，混匀，依次稀释到B9孔，B10孔不稀释(只有DMSO，为空白对照孔)，得到依次2.5倍稀释的溶液。
c).在96孔板C1-C10孔中加入95μL的培养基，取B1-B10孔稀释溶液5μL加到C1-C10中，混匀，配置成首孔浓度100μM，2.5倍稀释的工作液。
(3)实验步骤：
a)A375细胞分别以2000细胞/90μL/孔接种至96孔平底透明细胞板，colo 205细胞分别以1000细胞/90μL/孔接种至96孔平底透明细胞板，HCT116细胞分别以600细胞/90μL/孔接种至96孔平底透明细胞板，最外圈加入200μL PBS，于37℃，5％CO2培养24h；
b)取出96孔板，将上述稀释好的化合物工作液分别以10μL/孔加入至接种有细胞的培养板中，于37℃，5％CO2培养120h；
c)取出96孔板，于室温下加入Cell Titer-Glo Reagent试剂，50μL/well，室温避光300rpm孵育30min，转移100μL至96孔白板。
d)酶标仪读取Luminescence下的数值，并记录；
e)数据处理
按如下公式计算各化合物在各浓度点的抑制率，并通过软件Graphpad Prism 8.0进行曲线拟合得到IC50值。
4、实验结果：
表9：实验对象对A375细胞、Colo205细胞和HCT116细胞的抑制活性检测结果

NT:No Tested。
由表9实验数据可见，与未氘代的对照化合物BVD-523相比，本发明提 供的供试氘代化合物对A375细胞、Colo205细胞、HCT116细胞的抑制活性与对照化合物相比活性更优或者相当。
实验例3：本发明的氘代化合物在肝微粒体中的稳定性
1、实验目的：
测定本发明的化合物在肝微粒体中的代谢稳定性。
2、实验耗材：
微粒体保存于-80℃冰箱，具体信息见表10。使用之前先于37℃水浴中融化，溶化后放置于冰上待用。其他试剂均为通用试剂。
表10:
3、实验过程：
1)对照化合物：BVD-523，对照化合物1-6，其他均为待测化合物。
2)按照下表配置反应体系，准备开始实验。
3)将该反应体系放在37℃水浴中预孵育10分钟。向反应体系中加入40μL10mM NADPH溶液，NADPH的最终浓度分别为1mM。用40μL超纯水代替NADPH溶液作为阴性对照。
4)在反应中加入4μL的100μM的待测化合物和对照药物启动反应，药物的最终浓度为1μM。
5)在0、5、15、30、45和60分钟分别取出50μL反应样品，用4倍的含有内标(200nM阿普***、200nM拉贝洛尔、2μM酮洛芬、200nM咖啡因)的冷乙腈淬灭。样品在3,220g转速下离心45分钟。离心完成后取90μL上清液和90μL超纯水混匀用于LC-MS/MS分析检测。
4、数据分析
所有的数据计算均通过Microsoft Excel软件进行。通过提取离子图谱检 测峰面积。通过对母药的消失百分比与时间进行线性拟合，检测母药的体外半衰期(T1/2)。体外(T1/2)通过斜率计算：
in vitro t1/2＝-(0.693/k)
用下列公式把体外(T1/2)转化为体外清除率(单位μL/min/mg)：
5、实验结果
(1)本发明提供的对照化合物和示例性氘代化合物在人肝微粒中代谢稳定性的实验结果如表11所示：
表11:



NT:No Tested。
(2)本发明提供的对照化合物和示例性氘代化合物在在人和猴的肝微粒代谢稳定性
实验结果如表12所示：
表12

由表11、12数据可以看出，氘代化合物28、39、41、82、95、105、107、在人，猴的肝微粒体中代谢稳定性均优于BVD-523，尤其是氘代化合物28、39、41、82、105，其在人肝微粒体半衰期是BVD-523的2-4倍，同时在其他种属动物的肝微粒稳定性实验结果展示出一致的结果，半衰期也同样提升了2-4倍。说明本发明中的部分氘代化合物具有更长的作用时间，可具有更好的临床应用价值，有望解决BVD-523目前临床给药剂量600mgBID可能因为代谢带来的副作用及限制BVD-523扩展更多适应症，从而让更多患者受益。
同时，从上述人微粒体的代谢稳定性试验结果进一步证明，相对于BVD-523的氘代位点的数量而言，并非氘代位点越多的化合物的代谢稳定性更高。另外，在某些位点发生氘代的化合物(例如对照化合物1、2和6)不仅半衰期没有延长，反而缩短了，该氘代化合物的药代动力学性质发生了劣化。
实验例4：本发明部分氘代化合物在肝细胞中的稳定性
1、实验目的：
进一步验证氘代化合物28、39、82和BVD-523的代谢稳定性。
2、实验耗材：
肝细胞保存于液氮中，具体信息见表13。
表13:
3、实验过程：
(1)对照化合物：BVD-523。其他均为受试化合物。
(2)化合物工作液的制备
将受试化合物和对照化合物BVD-523用DMSO配置成高浓度储备液，使用前用50％乙腈/水稀释到100μM的工作液，受试化合物和BVD-523的终浓度为1μM。
(3)肝细胞的制备
a)混合49.5mLWilliams’Medium E和0.5mL GlutaMAX作为孵育液。将肝细胞复苏液和孵育液于使用前置于37℃水浴中预热。
b)取一管超低温保存的肝细胞，将肝细胞迅速置于37℃水浴中并轻摇直至所有冰晶全部分散，喷洒70％乙醇后转移至生物安全柜中。
c)将肝细胞小管的内容物倾入盛有50mL复苏培养基的离心管中，将其于离心力为100g下离心10分钟。离心后，吸出复苏培养基并加入足量孵育培养基得到细胞密度约1.5×106个细胞/mL的细胞混悬液。
d)用AOPI染液对肝细胞进行计数及确定活细胞密度，肝细胞成活率必须大于75％。利用孵育培养基稀释肝细胞混悬液至活细胞密度为0.5×106个细胞/mL。
e)将一部分密度为0.5×106个细胞/mL的肝细胞混悬液开水煮沸灭活5分钟作为阴性对照。细胞灭活后，便于考察非细胞酶系介导的底物转化。
(4)实验方法
a)转移198μL活细胞或者灭活细胞的混悬液到96孔深孔板，将深孔板置于涡旋上于孵箱中预热10分钟。活细胞进行双平行孵育，灭活细胞进行单平行孵育。
b)每孔加入2μL 100μM受试物或BVD-523进行反应起始，将深孔板放回孵箱涡旋器上。
c)孵育样品，分别于0、15、30、60、90和120分钟，取25μL混悬液，加入150μL含内标的乙腈(200nM阿普***、200nM拉贝洛尔、2μM酮洛芬、200nM咖啡因)终止反应。涡旋10分钟，于离心力为3220g、4℃条件离心30分钟，离心完成后取100μL上清液和100μL超纯水混匀用于UPLC-MS/MS分析检测。
4、数据分析
所有的数据计算均通过Microsoft Excel软件进行。通过提取离子图谱检测峰面积。通过对母药消除百分比的自然对数与时间进行线性拟合，检测母药的体外半衰期(T1/2)。
体外半衰期(T1/2)通过斜率计算：
in vitro t1/2＝0.693/k
体外固有清除率(单位μL/min/106个细胞)用下列公式计算：
in vitro CLint＝kV/N
V＝每孔孵育体积(0.2mL)；
N＝每孔细胞的数量(0.1×106个细胞)
5、氘代化合物28、39、82以及BVD-523在人或猴的肝细胞中代谢稳定性实验结果如表14所示：
表14

由表14数据可以看出，氘代化合物28、39、82在人肝细胞中的代谢稳定性优于BVD-523，尤其是在猴肝细胞的中的稳定性远优于BVD-523。进一步验证了发明的氘代化合物28、39、82的代谢性质相对于对照化合物BVD-523有显著的优化，进而有助于临床用药适应症的扩展。
实验例5：氘代化合物在猴中PK实验
1、实验目的
以本发明提供的氘代化合物39为例，进一步验证本发明提供的氘代化合物39和BVD-523在猴中体内的代谢稳定性
2、实验步骤
(1)实验制剂配制：
A)BVD-523静脉注射制剂配制过程：
a)称取16.62mg BVD-523于100mL药瓶中；
b)向瓶中加入1.662mL DMSO和13.296mL PEG 400，涡旋均匀后超声至澄清透明；
c)向瓶中加入18.282mL 10％HP-β-CD的生理盐水溶液，涡旋均匀；
d)将配置好的溶液用0.22um滤膜过滤。备用。
B)BVD-523灌胃制剂配制过程：
a)称取157.07mg BVD-523于250mL药瓶中；
b)向瓶中加入3.927mL DMSO和31.414mL PEG 400，涡旋均匀后超声至澄清透明；
c)向瓶中加入43.194mL 10％HP-β-CD的生理盐水溶液，涡旋均匀。备用。
C)氘化化合物39静脉注射制剂配制过程：
a)称取18.36mg氘代化合物39于100mL药瓶中；
b)向瓶中加入1.836mL DMSO和14.688mL PEG 400，涡旋均匀后超声至澄清透明；
c)向瓶中加入20.196mL 10％HP-β-CD的生理盐水溶液，涡旋均匀。
d)将配置好的溶液用0.22um滤膜过滤。备用。
D)氘代化合物39灌胃制剂配制过程:
a)称取180.70mg氘代化合物39于250mL药瓶中；
b)向瓶中加入4.518mL DMSO和36.140mL PEG 400，涡旋均匀后超声至澄清透明；
c)向瓶中加入49.693mL 10％HP-β-CD的生理盐水溶液，涡旋均匀。备用。
(2)给药过程：
a)给药前猴子从笼子里抓出来，称重，放在猴椅上；
b)根据动物体重计算给药量；
c)收到化合物以后，摇匀，抽药前用注射器吸取吹打制剂，使之混合均匀；
d)抽取指定体积的制剂；
e)猴子插管，判断灌胃管在食道或胃部，把制剂通过灌胃管完成给药，用5毫升空气冲洗灌胃管，确保制剂完全给到动物体内。
(3)采血过程：
1小时采血点前动物会在猴椅上观察临床症状和采血，1小时之后动物放回原笼子，之后的采血和观察在笼子里完成。采血主要通过前肢头静脉和后肢隐静脉，用1毫升注射器直接采集，采集之后打入真空采血管中，并在湿冰上转移并离心，离心时间记录在离心表上。采完血样用于UPLC-MS/MS分析检测。PK参数采用WinNonlin 6.1非室模型估计。
氘代化合物28的实验操作按照上述操作平行进行。数据汇总到结果中。
(4)实验结果：
化合物BVD-523和氘代化合物28、39的静脉给药(iv)和口服灌胃给药(po)的在猴中的实验结果如表15、图1、图2及图3所示：
表15
AUC0-∞＝药物从零时间至所有原形药物全部消除这一段时间的血药浓度-时曲线下总面积，C0＝静脉注射后瞬时的血药浓度，Cmax＝最大实测血药浓度，Tmax＝最大实测血药浓度对应的时间，T1/2＝末端消除半衰期，Cl＝清除率，Vd＝表观分布容积，F＝生物利用度
由表15、图1、图2、图3数据可见，在猴中PK数据显示氘代化合物28、39显著优于BVD-523，尤其是通过口服给药的生物利用度以及浓度曲线下面积(AUC)暴露量都显著优于BVD-523。本发明提供的氘代化合物28、39能够有效改善对照化合物BVD-523的口服生物利用度低的缺陷，从而有望克服临床用药个体差异的缺陷，最终使患者受益。
本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。

Claims (22)

  1. 一种结构式如式ⅠA所示的氘代化合物、或其药学上可接受的盐：
    其中，R1和R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2和CD3中的任一基团，R3-R14各自独立地是H或D，且R1-R14中至少有一个含D原子，
    条件是：
    当式IA仅含1个D原子时，R8不是D，
    当式IA含3个D原子时，R8-R10不同时是D，
    当式IA含4个D原子时，R6、R7、R11和R14不同时是D，
    当式IA含7个D原子、且R1和R2是CD3时，R7和R8不是D；和/或
    当式IA含9个D原子、且R1和R2是CD3时，R6、R11和R14不同时是D。
  2. 一种结构式如式I所示的氘代化合物、或其药学上可接受的盐：
    其中，R1和R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2和CD3中的任一基团，R3-R14各自独立地是H或D，且R1-R14中至少有一个含D原子，条件是：
    当式I仅含1个D原子时，R8不是D，
    当式I含3个D原子时，R8-R10不同时是D，
    当式I含4个D原子时，R6、R7、R11和R14不同时是D，
    当式I含7个D原子、且R1和R2是CD3时，R7和R8不是D；和/或
    当式I含9个D原子、且R1和R2是CD3时，R6、R11和R14不同时是D。
  3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R1-R7、和R9-R14中至少有一个含D原子；优选地，R1-R5、和R9-R14中至少有一个含D原子；优选地，R1-R5、R9-R11、和R14中至少有一个含D原子。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的化合物，其特征在于，
    R1是CD3、CH2D、或CHD2；和/或
    R2是CD3、CH2D、或CHD2；和/或
    R3是D；和/或
    R4是D；和/或
    R5是D；和/或
    R6是D；和/或
    R7是D；和/或
    R8是D；和/或
    R9和R10是D；和/或
    R11和R14是D；和/或
    R12和R13是D。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的化合物，其特征在于，
    R1和R2是CD3；和/或
    R3是D；和/或
    R6是D；和/或
    R7是D；和/或
    R8是D；和/或
    R9和R10是D；和/或
    R11和R14是D。
  6. 如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其特征在于，
    R1和R2是CD3；或
    R1和R2是CD3，R3是D；或
    R11和R14是D；或
    R3、R9和R10是D；或
    R3、R11和R14是D；或
    R1和R2是CD3，R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3、R11和R14是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R8、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3、R3、R11和R14是D；或
    R3和R7是D；或
    R3和R6是D；或
    R1和R2是CD3，R3和R7是D；或
    R6、R9和R10是D；或
    R6、R7、R9和R10是D；或
    R3、R7、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R7、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R7、R9和R10是D；或
    R3、R6、R9和R10是D。
  7. 如权利要求1-4任一所述的化合物，其特征在于，
    R11和R14是D；或
    R3、R11和R14是D；或
    R1和R2是CD3、R11和R14是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R8、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3、R3、R11和R14是D；或
    R1和R2是CD3，R3和R7是D；或
    R6、R7、R9和R10是D；或
    R3、R7、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R7、R9和R10是D；或
    R3、R6、R9和R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R4和R5是D；或
    R4、R5、R6和R7是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R8是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R6、R7是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R6、R7、R8是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R6、R7、R8、R9、R10是D；或
    R1和R2是CD3，R3、R5、R6和R7是D。
  8. 如权利要求1-7任一项所述的化合物，其特征在于，R12和R13是H。
  9. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，选自下述结构式所示的化合物中的任一种：









  10. 如权利要求1、2或9任一所述的化合物，其特征在于，选自下述结构式所示的化合物中的任一种：








  11. 如权利要求1-10中任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过反应式Ⅰ制备得到的：
    其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3中的任一种， R3-R14各自独立地是H或D；X1选自Br、I、OTf和OMs中的任一种；和Y为Ts或Boc。
  12. 如权利要求11中所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体化合物4是通过反应式Ⅱ或反应式Ⅲ制备得到的：
    其中，R1-R2各自独立地选自CH3、CH2D、CHD2或CD3中的任一种，R3-R14各自独立地是H或D；X1为OTf或OMs，X2是F、Cl、Br或I中的任一种；Y为Ts或Boc。
  13. 如权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体化合物4选自
    中的任一种。
  14. 如权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于，中间体化合物4与下述的中间体化合物5反应得到中间体6：
  15. 如权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于，中间体化合物5的前体化合物选自
    中的任一种。
  16. 如权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于，中间体化合物8选自
    中的任一种。
  17. 药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和权利要求1-10中任一项所述的化合物。
  18. 如权利要求1-10中任一项所述的化合物或权利要求17所述的药物组合物，在制备用于预防和/或治疗增生性疾病或者由RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2激酶调节的疾病的药物中的应用。
  19. 如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述由RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2激酶调节的疾病为对ERK的抑制敏感的肿瘤；
    优选地，所述疾病为人恶性黑色素瘤或人结肠癌。
  20. 权利要求1-10中任一项所述的化合物或权利要求17所述的药物组合物，其用作药物。
  21. 权利要求1-10中任一项所述的化合物或权利要求17所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗的疾病为对ERK的抑制敏感的肿瘤；
    优选地，所述疾病为人恶性黑色素瘤或人结肠癌。
  22. 预防和/或治疗对ERK的抑制敏感的肿瘤疾病的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的化合物或权利要求17所述的药物组合物；
    优选地，所述疾病为人恶性黑色素瘤或人结肠癌。
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