WO2023077452A1 - Akr1c3活化的dna烷化剂及其医药用途 - Google Patents

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段建新
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Definitions

  • the present invention provides the method for treating cancer or tumor, it comprises the step of a or b:
  • the IHC method is an immunohistochemical method, which is suitable for the detection of solid tumor samples.
  • the present invention provides a method for synthesizing the compound of the following structure I-1, I-2 or I-3, which comprises using compound II-1, II-2 or II-3 as the starting reactant to react with phosphorus oxyhalide for the first
  • the intermediate is obtained by one reaction, and then the intermediate is reacted with haloethylamine or the hydrohalide of haloethylamine for the second time, and finally the corresponding compounds I-1, I-2 or I-3 are respectively obtained:
  • Prodrug refers to a compound (or drug) that, upon administration or administration, is metabolized or otherwise converted to a biologically active or more active compound (or drug) with respect to at least one property.
  • Prodrugs are chemically modified relative to drugs in such a way that they are less or inactive relative to the drug, but chemically modified so that the corresponding drug is produced by metabolism or other biological processes after administration of the prodrug.
  • Prodrugs may have altered metabolic stability or delivery characteristics, fewer side effects or toxicity, or improved flavor relative to the active drug.
  • Prodrugs can be synthesized using reactants other than the corresponding drug.
  • X is each independently fluorine, chlorine, bromine, iodine
  • the haloethylamine is bromoethylamine
  • the haloethylamine hydrohalide is bromoethylamine hydrobromide
  • X is each independently fluorine, chlorine, bromine, iodine, preferably bromine;
  • the cells are routinely cultured until the cell saturation is 80%-90%, and the cells are collected when the number reaches the requirement.
  • IC 50 curves obtained by testing compounds A, B, C and AST-3424 are shown in Fig. 5 .
  • test group 0 days 3 days 7 days 10 days 14 days 17 days 21 days 24 days 28 days 31 days Group 1 103.74 169.79 401.62 775.57 1319.18 2113.82 2641.70 3149.10 the the Group 2 103.93 168.82 269.83 439.29 731.99 1076.45 1241.19 1504.89 2218.52 2313.01 Group 3 103.98 150.33 318.74 683.99 1404.42 2201.20 2739.12 3311.77 3362.07 the
  • test drug Sorafenib (Sorafenib) 30mg/kg (administered once a day, continuously for 21 days) group
  • test drug compound A 1.25mg/kg (administered every day, continuously for 5 days, after stopping for 2 days, Stop for another 2 weeks, a total of 2 dosing cycles)
  • 2.5mg/kg dosing every day for 5 consecutive days, stop for 2 days, then stop for another 2 weeks, a total of 2 dosing cycles
  • 5mg/kg (dosing every day medicine, given continuously for 5 days, stopped for 2 days, then stopped for 2 weeks, a total of 2 administration cycles) single drug group and 7.5% absolute ethanol + 7.5% polyoxyethylene (35) castor oil + 80% glucose injection D5W (pH7.4) control group, 5 groups in
  • test drug Gemcitabine (Gemcitabine) 120mg/kg group, test drug compound A 10mg/kg and 7.5% absolute ethanol + 7.5% polyoxyethylene (35) castor oil + 85% glucose injection D5W (pH7.4) Vehicle control group, a total of 3 groups, 5 mice in each group.
  • 7.5% absolute ethanol+7.5% polyoxyethylene (35) castor oil+85% glucose injection D5W (pH7.4) vehicle control group, test drug compound A 10mg/kg group are tail vein injection administration, each Dosing once a week for three consecutive weeks.
  • Sorafenib (Sorafenib) 20-30mg/kg group was intragastrically administered, during day0-day11, 30mg/kg dosage was administered once a day for 12 consecutive days, during day12-day20, due to the The body weight decreased significantly, and the dosage was adjusted from 30mg/kg to 20mg/kg, administered once a day for 9 consecutive days and observed for 33 days.
  • the curative effect is evaluated according to the relative tumor inhibition rate TGI (%), and the safety evaluation is carried out according to the animal body weight change and death.
  • mice in different groups were measured on different days, and the average value was obtained and drawn as a graph, as shown in FIG. 29 .
  • HepG2 is a model of cachexia
  • the model is characterized by spontaneous weight loss of tumor-bearing mice.
  • Compound A had a significant effect on the human liver cancer HepG2 model at doses of 10mg/kg (QWx2; 1week off; QWx2, i.v., Group 4) and 2.5mg/kg (QDx5; 2days off, 2weeks off; QDx5, i.p., Group 6).
  • the effect of inhibiting tumor growth was statistically significantly different from that of the control group. Under the above two test doses and administration methods of compound A, the tumor-bearing mice did not suffer severe weight loss or death.
  • AST-3424 1.25mg/kg administered once a week, continuously administered for two weeks, stopped for one week, and then continuously administered for two weeks
  • treatment group had certain tumor inhibition on the 28th day (Day 28) after the first administration
  • TGI tumor inhibition rate
  • No NADPH 10 ⁇ L of 20 mg/mL liver microsomes and 40 ⁇ L of ultrapure H2O were added to the culture medium. The final concentration of microsomes was 0.5 mg/mL.

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Abstract

具有以下任一结构式（A，B，C）的AKR1C3活化的DNA烷化剂，或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体，及其抗癌医药用途。

Description

AKR1C3活化的DNA烷化剂及其医药用途 技术领域
本发明涉及癌症治疗化合物领域，属于药物小分子研究领域。
背景技术
发明人段建新、李安蓉等的专利PCT/CN2020/089692(申请日为2020年5月12日)，公开了如下通式的一系列化合物及其抗癌用途：
Figure PCTCN2021129077-appb-000001
该发明为了克服AST-3424为油状物而不便于制剂、储存和运输的缺点，通过在AST-3424及其类似结构化合物的分子结构中的特定位置引入三氟甲基而得到了固体(部分为蜡状物)状态的化合物，并通过初步的细胞测试证实了上述引入三氟甲基的化合物依然是AKR1C3活化的DNA烷化剂。
在对AST-3424进行进一步的研究中发现其是P-gp底物，不能透过血脑屏障，对发生在脑部的肿瘤无效。
因此应进一步研发能进入脑部或其他中枢神经***的AKR1C3活化的小分子化合物。
发明内容
发明人在后续的研发和筛选中，发现PCT/CN2020/089692中公开的16号化合物具有穿过脑部或其他中枢神经***的性质，有望进一步开发为治疗脑部或其他中枢神经***肿瘤的药物。
本发明提供一种能进入脑部或其他中枢神经***的AKR1C3活化的小分子化合物，其作用机理是通过AKR1C3酶的作用后，释放出DNA烷化剂，从而起到抑制、杀灭肿瘤细胞的效果。
具体而言，上述16号化合物结构式如下：
Figure PCTCN2021129077-appb-000002
实验证明该化合物具有较强的癌细胞增殖抑制活性，特别在AKR1C3酶激活下，癌细胞抑制活性更强；而且这些化合物经过测试表明不是Pgp(P-Glycoprotein，P-糖蛋白)的底物，能够透过血脑屏障，能够进入脑部或其他中枢神经***发挥药效；进一步在血清和肝微粒体以及动物模型实验中也显示该化合物具有较好的稳定性，对肿瘤具有较好的清除抑制效果。
基于以上的研究发现，本发明提供以下的AKR1C3活化的DNA烷化剂并明确其具有相关的抗癌、抗肿瘤医药用途。
本发明提供具有以下A、B、C任一结构式的化合物，或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体：
Figure PCTCN2021129077-appb-000003
所述盐为碱式盐或酸式盐，所述溶剂合物为水合物或醇合物。
优选地，所述醇合物为乙醇合物。
本发明提供上述三个化合物的药学上可接受的盐，所述盐可以为碱式盐，包括所述化合物与无机碱(例如碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物等)或与有机碱(例如单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺等)形成的盐。或者，所述盐可以为酸式盐，包括所述化合物与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等)或与有机酸(例如甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、富马酸、草酸、马来酸、柠檬酸等)形成的盐。选择和制备化合物的可接受的盐和溶剂化物等是本领域的公知技术。
关于本文的化合物还可以溶剂合物的形式使用，即本发明提供上述三个化合物的药学上可接受的溶剂合物，所述溶剂合物为水合物、醇合物等，醇合物包括乙醇合物。
术语“同位素变体”是指在组成此类化合物的原子中的一或多者处含有非天然比例的同位素的化合物。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氢( 1H)、氘( 2H)、氚( 3H)、碳-11( 11C)、碳-12( 12C)、碳-13( 13C)、碳-14( 14C)、氮-13( 13N)、氮-14( 14N)、氮-15( 15N)、氧-14( 14O)、氧-15( 15O)、氧-16( 16O)、氧-17( 17O)、氧-18( 18O)、氟-17( 17F)、氟-18( 18F)、磷-31( 31P)、磷-32( 32P)、磷-33( 33P)、硫-32( 32S)、硫-33( 33S)、硫-34( 34S)、硫-35( 35S)、硫-36( 36S)、氯-35( 35Cl)、氯-36( 36Cl)、氯-37( 37Cl)、溴-79( 79Br)、溴-81( 81Br)、碘-123( 123I)、碘-125( 125I)、碘-127( 127I)、碘-129( 129I)及碘-131( 131I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈稳定形式，亦即非放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氢( 1H)、氘( 2H)、碳-12( 12C)、碳-13( 13C)、氮-14( 14N)、氮-15( 15N)、氧-16( 16O)、氧-17( 17O)、氧-18( 18O)、氟-17( 17F)、磷-31( 31P)、硫-32( 32S)、硫-33( 33S)、硫-34( 34S)、硫-36( 36S)、氯-35( 35Cl)、氯-37( 37Cl)、溴-79( 79Br)、溴-81( 81Br)及碘-127( 127I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈不稳定形式，亦即放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氚( 3H)、碳-11( 11C)、碳-14( 14C)、氮-13( 13N)、氧-14( 14O)、氧-15( 15O)、氟-18( 18F)、磷-32( 32P)、磷-33( 33P)、硫-35( 35S)、氯-36( 36Cl)、碘-123( 123I)、碘-125( 125I)、碘-129( 129I)及碘-131( 131I)。应理解，在如本文提供的化合物中，在根据本领域技术人员的判断为可行时，任何氢可为例如 2H即D，或任何碳可为例如 13C，或任何氮可为例如 15N，及任何氧可为 18O。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的氘(D)。
本发明提供的同位素变体对应选自以下结构的氘代化合物：
Figure PCTCN2021129077-appb-000004
其中，A各自独立地为H或D，且9个A中至少一个为D。
优选地，所述同位素变体对应的氘代化合物如下：
Figure PCTCN2021129077-appb-000005
Figure PCTCN2021129077-appb-000006
Figure PCTCN2021129077-appb-000007
本发明提供含有上述A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体的药物。
本发明还提供上述的药物用于治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的用途。
治疗包括单药和联合用药治疗。
单药，即单药治疗。联用，即联合用药治疗。单药治疗是指在一个疗程中仅使用一种抗癌药物。联合治疗是指在一个疗程中同时或先后使用两种或两种以上的抗癌药物。
一般而言，联合治疗需要根据病情特点、联用药物种类探索不同的给药剂量、给药周期，只有根据上述情况，探索得到的联合用药治疗方案才可能取得较单一用药治疗好的治疗效果。
单药和联用治疗方案的药物给药剂量、给药周期均需要在参考上述化合物A、B、C及其类似化合物和其他药物的剂量、给药方案通过临床试验探索得到。
本发明同时提供A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体的化合物在治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的用途。
特别地，上述癌症或肿瘤为肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌。
特别地，上述癌症或肿瘤为原发性脑癌、脑肿瘤或转移至脑的转移性癌症或肿瘤。
本发明提供上述A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体在制备治疗癌症患者、肿瘤患者或由癌症、肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的药物中的用途。
上述肿瘤、癌症包括：肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、***癌、***癌、睾丸癌、结肠癌、卵巢癌、膀胧癌、子***、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、骨细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、***癌、维尔姆斯癌、胶质细胞癌、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血细胞瘤、声带神经瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维***状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管***瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、***肉瘤、淋巴肉芽瘤、***瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、***纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、***瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病贫血、红细胞增多症、淋巴瘤、子宫内膜癌、胶质瘤、结直肠癌、甲状腺癌、尿路上皮癌或多发性骨髓瘤。
优选地，所述癌症或肿瘤为原发性脑癌、脑肿瘤或转移至脑的转移性癌症、肿瘤。
优选地，所述癌症或肿瘤为肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌；更优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明提供治疗癌症或肿瘤的方法，其包含a或b的步骤：
a.测定患者癌细胞或组织的AKR1C3还原酶含量，如测得该AKR1C3还原酶含量等于或大于预定值，则向该患者投与上述的药物或投与含有上述A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体；
b.测定患者癌细胞或组织的AKR1C3还原酶对应RNA的表达水平，如测得该RNA的表达水平在预定值范围内，则向该患者投与上述的药物或投与含有上述A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体。
AKR1C3还原酶含量测定可以使用的方法包括但不限于ELISA法、IHC法。
可使用商业化的人醛酮还原酶1C3(AKR1C3)ELISA检测试剂盒对血浆、血液等液体样品进行直接检测，其他样本进行处理后进行检测。
IHC法即免疫组织化学方法，适用于对实体肿瘤样本进行检测。
有研究表明，放疗后的头颈癌患者的肿瘤组织的AKR1C3酶含量升高，因此通过放疗辐射的放射线照射患者的肿瘤组织有可能提高AKR1C3酶的表达水平，放射线包括放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的X射线、电子线、质子束及其他粒子束等。
本发明提供另一治疗癌症或肿瘤的方法，其包含AKR1C3还原酶含量调节步骤，当调节使得该AKR1C3还原酶含量等于或大于预定值，则向该患者投与上述的药物或投与含有上述A、B、C任一结构的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位 素变体。
这种方法主要是针对患者的AKR1C3还原酶含量较低的情况，通过一定的调节治疗/给药过程，将该患者的AKR1C3还原酶含量调节到合适的水平。
本发明提供制备以下结构I(化合物A、B、C)的AKR1C3活化的化合物的方法，其包括使得化合物I-1、I-2或I-3分别发生关环反应得到对应的化合物A、B或C：
Figure PCTCN2021129077-appb-000008
其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘，优选为溴。
上述制备方法中，关环反应使用氧化银或硝酸银作为催化剂，反应中加入或不加入有机碱。有机碱优选为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺。
本发明提供具有以下任一结构式的化合物：
Figure PCTCN2021129077-appb-000009
其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘，优选为溴。
本发明提供上述I-1、I-2或I-3结构化合物的用途，其作为合成上述的AKR1C3活化的DNA烷化剂(化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体)的中间体或用于制备治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的药物。
本发明提供合成以下I-1、I-2或I-3结构的化合物的方法，其包括以化合物II-1、II-2或II-3作为起始反应物分别与三卤氧磷发生第一次反应得到中间体，然后该中间体与卤代乙胺或卤代乙胺的氢卤酸盐发生第二次反应，最后分别得到对应的化合物I-1、I-2或I-3：
Figure PCTCN2021129077-appb-000010
Figure PCTCN2021129077-appb-000011
其中，结构化合物I-1、I-2或I-3中的两个X各自独立地为F、Cl、Br、I，优选为Br；
三卤氧磷选自三氟氧磷、三氯氧磷、三溴氧磷、三碘氧磷，优选为三氯氧磷；
三卤氧磷中的卤素原子与化合物I-1、I-2或I-3中的两个X可以相同也可以不同；
优选地，卤代乙胺为溴代乙胺，卤代乙胺的氢卤酸盐为溴代乙胺的氢溴酸盐。
本发明提供以下任一结构的化合物：
Figure PCTCN2021129077-appb-000012
本发明提供合成以下结构的任一化合物的方法：
Figure PCTCN2021129077-appb-000013
将化合物III-3与TMSCF3接触反应，并经脱保护操作后水解得到消旋的醇II-1，对消旋的醇II-1进行手性拆分操作分别得到手性醇II-2和手性醇II-3。
Figure PCTCN2021129077-appb-000014
所述TMSCF3为三氟甲基三甲基硅烷，所述脱保护操作使用的脱保护试剂为四丁基氟化铵TBAF，水解操作使用的是氟化铵、氯化铵水溶液或盐酸。
所述手性拆分的方法包括结晶法和化学拆分法。
本发明提供一种将化合物A的外消旋体分离以得到其中一种对映异构体或在化合物中增浓该化合物的任一对映异构体过量的方法，其包含以下步骤：
Figure PCTCN2021129077-appb-000015
使该外消旋体化合物经过光学解析处理，其中通过包含固定相及流动相的手性层析法，其中该固定相包含以官能化多糖浸渍的硅胶，且其中该流动相包含醇及另一溶剂。
优选的，所述醇为乙醇，另一溶剂为正己烷，手性层析法的操作过程中色谱柱的温度为38℃，所述官能化多糖为直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)。
本发明提供另外一种用于将化合物A的外消旋体分离以得到其中一种对映异构体或在化合物中增浓该外消旋体的任一对映异构体过量的HPLC方法，该HPLC方法使用的色谱柱为CHIRALPAKAD，流动相为乙醇，柱温为35℃。
本发明提供制备以下结构的任一氘代化合物的方法，其包括使化合物IV-1至IV-21分别发生关环反应得到对应的氘代化合物V-1至V-15：
Figure PCTCN2021129077-appb-000016
Figure PCTCN2021129077-appb-000017
Figure PCTCN2021129077-appb-000018
Figure PCTCN2021129077-appb-000019
其中，IV-1至IV-21任一化合物中的两个X原子各自独立地为氟、氯、溴、碘，优选为溴；
所述关环反应使用氧化银或硝酸银作为催化剂，反应中加入或不加入碱。
本发明提供制备上述IV-1至IV-21任一化合物的方法，其包括以化合物II-1、II-2、II-3或其氘代物II-1a、II-2a、II-3a作为起始反应物分别与三卤氧磷发生第一次反应得到中间体，然后该中间体与对应的氘代卤代乙胺VI-1或VI-2，或氘代卤代乙胺VI-1或VI-2的氢卤酸盐发生第二次反应，最后得到对应的化合物IV-1至IV-21：
Figure PCTCN2021129077-appb-000020
Figure PCTCN2021129077-appb-000021
其中，化合物VI-1或VI-2中的X原子各自独立地为氟、氯、溴、碘，且与化合物IV-1至IV-21中的X原子具有对应关系；
三卤氧磷选自三氟氧磷、三氯氧磷、三溴氧磷、三碘氧磷，优选为三氯氧磷；
三卤氧磷中的卤素与任一化合物IV-1至IV-21中的两个X原子、化合物VI-1或VI-2中的X原子可以相同也可以不同；
所述氘代卤代乙胺氢卤酸盐中氢卤酸盐中的卤素与氘代卤代乙胺中的卤素相同；
优选地，卤代乙胺为溴代乙胺，卤代乙胺氢卤酸盐为溴代乙胺氢溴酸盐。
本发明提供制备以下结构的任一化合物的方法，其包括以下步骤：以化合物
Figure PCTCN2021129077-appb-000022
为起始原料，反应得到化合物
Figure PCTCN2021129077-appb-000023
然后与式I-7-1、I-7-2或I-7-3分别反应得到相应的式A、B或C化合物。
Figure PCTCN2021129077-appb-000024
特别地，化合物结构中的Y 1和Y 2为卤素或OM，M为氢、钠、钾、镁或钙，卤素优选为溴。
特别地，在M为镁或钙时，化合物结构中其他基团的量是M为氢、钠、钾时的两倍。
关于本文所述药品，所制得的药品包含特定剂量范围的所示化合物或其盐或溶剂合物或同位素变体，和/或所制得的药物为特定剂型、特定给药方式施用。
关于本文所述用途，所制得的药物还可包含药学上可接受的辅料或赋形剂。所述药物可以为临床施用的任何剂型，例如片剂、栓剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小针、注射用冻干粉针或大输液。根据具体剂型和施用方式，所述药物中的药学上可接受的辅料或赋形剂可以包括下述的一种或多种：稀释剂、增溶剂、崩解剂、悬浮剂、润滑剂、粘合剂、填充剂、矫味剂、甜味剂、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、包裹剂和色素等。
优选地，所述患者是哺乳动物，更优选是人。
附图说明
图1为化合物A的高效液相色谱分析图谱。
图2为化合物A分离后得到的化合物A-P1的高效液相色谱分析图谱。
图3为化合物A分离后得到的化合物A-P2的高效液相色谱分析图谱。
图4为具体化合物V-10的 1HNMR图谱。
图5为不同浓度化合物A、B、C及AST-3424在常氧条件下对H460细胞的抑制率曲线，其中，Log.con(nM)表示nmol/L单位下浓度数值的10为底数的对数值。
图6为不同浓度化合物A、B、C在不同的肝癌细胞系的抑制率曲线，其中，Log.con(nM)表示nmol/L单位下浓度数值的10为底数的对数值。
图7为不同浓度化合物A、B、C在是否存在AKR1C3抑制剂AST3021的情况下对H460癌细胞的抑制率曲线，其中，Log.con(nM)表示nmol/L单位下浓度数值的10为底数的对数值。
图8为化合物A对10株非小细胞肺癌的AKR1C3依赖曲线，其中FPKM为RNA-seq的每千百万碱基片段数，然后取以2为底的对数得到Log 2FPKM，IC 50为50％抑制浓度即细胞存活量为对照样本一半时所对应的浓度。
图9为化合物AST-3424对10株非小细胞肺癌的AKR1C3依赖曲线，其中FPKM为RNA-seq的每千百万碱基片段数，然后取以2为底的对数得到Log 2FPKM，IC 50为50％抑制浓度即细胞存活量为对照样本一半时所对应的浓度。
图10为化合物A和索拉非尼在肝癌LI6280 PDX模型的AKR1C3依赖的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图11为化合物A、AST-3424和异环磷酰胺在胃癌GA6201 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图12为化合物A、AST-3424在胃癌GA6201 PDX模型的体内药效模型中在第14天停止给药后的不同天数肿瘤体积变化曲线。
图13为化合物A、AST-3424和异环磷酰胺在胃癌GA6201 PDX模型的体内药效模型中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图14为化合物A和卡铂在人源非小细胞肺癌NCI-H460皮下异种移植模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图15为化合物A和卡铂在人源非小细胞肺癌NCI-H460皮下异种移植模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图16为化合物A和索拉非尼在人肝癌LI6652皮下异种移植PDX模型中的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图17为化合物A和索拉非尼在人肝癌LI6652皮下异种移植PDX模型中的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图18为化合物A和紫杉醇在人源非小细胞肺癌NCI-H460-Luc2颅内接种CDX模型的体内药效实验中不同天数的生物荧光值变化曲线，生物荧光值大表示肿瘤体积大。
图19为化合物A和紫杉醇在人源非小细胞肺癌NCI-H460-Luc2颅内接种CDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图20为化合物A和吉西他滨在胰腺癌PA1222 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图21为化合物A和吉西他滨在胰腺癌PA1222 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图22为化合物A和紫杉醇在肺癌LU2505PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图23为化合物A和紫杉醇在肺癌LU2505 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图24为索拉非尼和0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg化合物A、不同浓度AST-3424在肝癌LI6643 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图25为索拉非尼和1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg化合物A在肝癌LI6643 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图26为索拉非尼和1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg化合物A在肝癌LI6643 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图27为化合物A和索拉非尼在肝癌LI1005 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图28为化合物A和索拉非尼在肝癌LI1005 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图29为化合物A和索拉非尼在肝癌HepG2 CDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图30为化合物A和索拉非尼在肝癌HepG2 CDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图31为化合物A和紫杉醇在肺癌LU0884 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图32为化合物A和紫杉醇在肺癌LU0884 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图33为化合物A、AST-3424和索拉非尼在肝癌LI6664 PDX模型的体内药效实验中不同天数的肿瘤体积变化曲线。
图34为化合物A、AST-3424和索拉非尼在肝癌LI6664 PDX模型的体内药效实验中在不同天数小鼠体重变化率曲线。
图35为化合物A在血浆和脑组织中浓度与时间变化曲线图。
图36为化合物A在血浆和脑组织中浓度的比率与时间变化曲线图。
图37为化合物AST-2870在血浆和脑组织中浓度与时间变化曲线图。
图38为化合物AST-2870在血浆和脑组织中浓度的比率与时间变化曲线图。
图39为化合物A在添加NADPH、未添加NADPH、添加AKR1C3抑制剂以及对照药***条件下在小鼠、猴、大鼠、人的肝细胞质溶液中反应后的剩余量随时间变化的曲线图，其中，Remaining表示代谢剩余率，Time表示时间，AST表示化合物A，Progesterone表示***。
图40为化合物AST-3424在添加NADPH、未添加NADPH、添加AKR1C3抑制剂以及对照药***条件下在小鼠、猴、大鼠、人的肝细胞质溶液中反应后的剩余量随时间变化的曲线图，其中，Remaining表示代谢剩余率，Time表示时间，Progesterone表示***。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
“前药”是指投与或施用之后经新陈代谢或以其他方式转化为关于至少一种性质的生物学活性或活性更高的化合物(或药物)的化合物。相对于药物，前药以使其相对于药物活性较低或无活性的方式进行化学修饰，但化学修饰使得在前药投与之后通过代谢或其他生物 过程产生相应药物。前药可相对于活性药物具有改变的代谢稳定性或输送特征、较少副作用或较低毒性或经改良的风味。前药可使用除相应药物以外的反应物来合成。
向患者“投与”(“administering”或“administration of”)药物(及此词组的语法等效形式)是指直接投与(其可由医学专业人士向患者投与或可自投与)及/或间接投与(其可是开处方药物的行为)。举例而言，指示患者自投与药物及/或将药物的处方提供给患者的医师是向患者投与药物。
“癌症”是指可通过侵袭而局部扩展且通过转移而全身扩展的潜在无限制生长的白血病、淋巴瘤、癌及其他恶性肿瘤(包括实体肿瘤)。癌症的实例包括(但不限于)肾上腺、骨、脑、***、支气管、结肠及/或直肠、胆囊、头及颈、肾、喉、肝、肺、神经组织、胰脏、***、副甲状腺、皮肤、胃及甲状腺的癌症。癌症的某些其他实例包括急性及慢性淋巴细胞及粒细胞肿瘤、腺癌、腺瘤、基底细胞癌、子宫颈上皮分化不良及原位癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、表皮样癌、巨细胞瘤、多型性神经胶母细胞瘤、毛细胞肿瘤、肠神经节细胞瘤、增生性角膜神经肿瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、平滑肌瘤、白血病、淋巴瘤、恶性类癌瘤、恶性黑色素瘤、恶性高钙血症、马方样体型肿瘤(marfanoid habitus tumor)、髓样上皮癌、转移性皮肤癌、黏膜神经瘤、骨髓瘤、蕈状肉芽肿、神经胚细胞瘤、骨肉瘤、骨原性及其他肉瘤、卵巢瘤、嗜铬细胞瘤、真性红血球增多症、原发性脑瘤、小细胞肺癌、溃疡型及***型二者的鳞状细胞癌、增生、***瘤、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾细胞肿瘤、局部皮肤病灶、网状细胞肉瘤及威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)。
“患者”及“个体”可互换使用，是指需要癌症治疗的哺乳动物。通常，患者是人类。通常，患者是诊断患有癌症的人类。在某些实施例中，“患者”或“个体”可指用于筛选、表征及评估药物及疗法的非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、狗、猫、兔、猪、小鼠或大鼠。
“实体肿瘤”是指包括(但不限于)骨、脑、肝、肺、***、胰脏、***、皮肤及软组织(肉瘤)中的转移肿瘤的实体肿瘤。
药物的“治疗有效量”是指当向患有癌症的患者投与时，具有预期的治疗效应(例如患者中一或多种癌症的临床表现的缓和、改善、缓解或消除)的药物的量。治疗效应不必通过投与一个剂量而出现，且可仅在投与一系列剂量后出现。因此，治疗有效量可以一或多次投与来投与。
病况或患者的“治疗”(“Treating”、“treatment of”或“therapy of”)是指采取步骤以获得有益或期望结果(包括临床结果)。出于本发明的目的，有益或期望临床结果包括(但不限于)一或多种癌症症状的缓和或改善；疾病程度的减弱；疾病进展的延迟或减缓；疾病状态的改善、缓解或稳定；或其他有益结果。
“肿瘤细胞”是指任何适当物种(例如，哺乳动物，例如鼠类、犬、猫、马或人类)的肿瘤细胞。
“治疗”或“治疗患者”是指向患者投与、使用或施用本发明相关的治疗有效量的药物。
向患者“投与”或“施用”“使用”药物是指直接投与或施用(其可由医学专业人士向患者投与或施用或者可自投与或施用)及/或间接投与或施用(其可是开处方药物的行为)。举例而言，指示患者自投与或施用药物及/或将药物的处方提供给患者的医师是向患者投与或施用药物。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
一、化合物的合成、制备和结构确证
英文缩写说明：
简称 全称
THF 四氢呋喃
DCM 二氯甲烷
EA 乙酸乙酯
TEA 三乙胺
MTBE 甲基叔丁基醚
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DBAD 偶氮二甲酸二叔丁酯
TFA 三氟乙酸
EtOH 乙醇
t-BuOH 叔丁醇
DMF N，N-二甲基甲酰胺
PE 石油醚(petroleum ether)
DMF-DMA N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛
TBAF 四丁基氟化铵
DIPEA或DIEA N，N-二异丙基乙胺
DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯
t-BuOK 叔丁醇钾
MS 质谱
HPLC 高效液相色谱仪
Calculated 质谱理论计算值
found 质谱实测值
eq 当量
其他未说明的缩写或术语均按照有机化学或有机合成手册中的定义或说明来解释或进行操作。
相关试剂药品未说明的均为商业购买。
1H-NMR核磁如未说明则测试使用400MHz仪器测定，MS质谱测试使用LC-MS液质联用仪器测定。
1.1 化合物A(即16号化合物)的合成
方法1：
Figure PCTCN2021129077-appb-000025
化合物A合成路线
化合物A的合成方法与专利PCT/CN2020/089692中16号化合物合成方法相同，在此将该专利中16号化合物合成方法引用于此。
方法2：
以3-氟-4-溴-苯酚为起始原料，经两步反应得到目标化合物A。
Figure PCTCN2021129077-appb-000026
方法3：
Figure PCTCN2021129077-appb-000027
1.2 化合物A的手性拆分
将化合物A纯品进行手性分析
HPLC手性分析条件为：
色谱柱 CHIRALPAK AD-H(AD00CD-UE022)
色谱柱尺寸 0.46cm内径×15cm长
进样体积 0.2ul
流动相 乙醇＝100％
流速 0.5ml/min
检测波长 UV254nm
柱温 35℃
测试得到的HPLC谱图如图1，具体结果如下表。
Figure PCTCN2021129077-appb-000028
取4.4814g的化合物A，溶于色谱级的乙醇中，使用下列的手性分离制备方法和手性分离制备条件进行手性分离制备。
HPLC手性分离制备方法：采用HPLC法，使用HPLC制备设备和手性柱分离上述手性外消旋体(即化合物A)，收集相应组分。旋转蒸发除去溶剂，得到光学异构体的纯品。
HPLC手性分离制备条件为：
拆分色谱柱 CHIRALPAK AD
色谱柱尺寸 5.0cm内径，25cm长，10μm的填料粒径
流动相 乙醇＝100％
Flow rate流速 40ml/min
Wave length检测波长 UV 254nm
Temperature柱温 35℃
经过分离制备后，得到1号峰对应的光学异构体的纯品2.1432g，测得ee值为99.2％；2号峰对应的光学异构体的纯品2.0840g，测得ee值为99.5％。
进一步对手性分离制备好的1号峰对应的光学异构体、2号峰对应的光学异构体使用HPLC手性分析条件进行分析，得到如图2、3的结果。
1号峰对应的光学异构体的HPLC分析结果如下表：
Figure PCTCN2021129077-appb-000029
2号峰对应的光学异构体的HPLC分析结果如下表：
Figure PCTCN2021129077-appb-000030
1.3 化合物A和其异构体A-P1、A-P2的手性稳定性研究
长期和加速条件下的异构体稳定性研究。
分别对化合物A和其异构体A-P1、A-P2在-20±5℃、5℃±3℃、25℃±2℃(60％±5％RH)、40℃±2℃(75％±5％RH)条件下进行性状和异构体稳定性考察，结果如下表：
Figure PCTCN2021129077-appb-000031
上表数据表明，化合物A分别在5℃±3℃、25℃±2℃(60％±5％RH)及40℃±2℃(75％±5％RH)条件下放置6个月，其性状和手性基本无变化，说明化合物A中两个单一异构体比例稳定，化合物A手性稳定。
化合物A-P1和A-P2分别在-20℃±5℃、5℃±3℃、25℃±2℃(60％±5％RH)条件下放置3个月，40℃±2℃(75％±5％RH)条件下放置1个月，样品颜色和手性基本无变化，说明在以上条件下单一异构体A-P1和A-P不会相互转化，手性稳定。
1.4 氘代化合物制备
采用以下合成路线或步骤制备式IV-1至IV-21氘代化合物：
步骤一，制备化合物IV-1至IV-21，其包括以化合物II-1、II-2、II-3或其氘代物II-1a、II-2a、II-3a作为起始反应物分别与三氯氧磷POCl 3发生第一次反应得到中间体，然后该中间体与对应的氘代卤代乙胺VI-1或VI-2或氘代卤代乙胺VI-1或VI-2的氢卤酸盐发生第二次反应，最后得到对应的化合物IV-1至IV-21；
Figure PCTCN2021129077-appb-000032
其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘；
所述氘代卤代乙胺氢卤酸盐中氢卤酸盐中的卤素与氘代卤代乙胺中的卤素相同；
优选的，卤代乙胺为溴代乙胺，卤代乙胺氢卤酸盐为溴代乙胺氢溴酸盐。
步骤二，制备以下任一结构的氘代化合物V-1至V-15的方法，其包括使化合物IV-1至IV-21分别发生关环反应得到对应的氘代化合物V-1至V-15；
Figure PCTCN2021129077-appb-000033
Figure PCTCN2021129077-appb-000034
其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘，优选为溴；
所述关环反应使用氧化银或硝酸银作为催化剂，反应中加入或不加入碱。
具体地，参照上述1.1中化合物A合成方法的反应条件和物料比例，选择适当的氘代中间体或起始物料即可以完成上述15个氘代化合物(V-1至V-15)的合成制备。
制备所得式V-10中的下式氘代化合物为浅黄色固体， 1HNMR图谱如图4所示，其解析数据为：
1H NMR(400MHz，CD3OD)δppm 8.13(d，J＝8.7Hz，1H)，7.60-7.51(m，4H)，7.45(s，1H)，7.19(t，J＝8.7Hz，2H)，6.99-6.96(m，2H)，6.10-6.05(m，1H).HPLC(retention time：9.817min).MS：Calculated MS，563.2，found，564.2([M+H]+)。
Figure PCTCN2021129077-appb-000035
以下第二节至第七节的体内、体外实验中涉及的外文缩写或词汇的含义均根据药物化学、生物化学、生理学或药理学、医学的教科书中的词汇含义进行解释。
二、化合物对癌细胞抑制实验
2.1 化合物A、B、C及AST-3424的H460癌细胞抑制试验
化合物AST-3424是申请人开发的以过表达醛酮还原酶1C3(AKR1C3)为靶标的DNA烷化癌症治疗药物(DNA烷化剂，PCT申请号PCT/US2016/021581，公开号WO2016145092A1，对应中国申请号CN201680015078.8，公告号CN107530556B)，现在已进入临床二期阶段，其结构式如下所示。
Figure PCTCN2021129077-appb-000036
使用活体外人类肿瘤细胞系细胞毒性的量化值IC 50来比较化合物A、B、C及AST-3424的癌细胞增殖抑制作用。
如无特别说明，IC 50值通过以下实验方法测得：
(1)细胞培养
a)H460细胞培养于RPMI-1640培养基中，加10％FBS和1％双抗，置于37℃、5％CO 2条件下培养。
(2)细胞铺板
a)细胞常规培养至细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞。
b)用相应的培养基重悬，计数，配制成合适密度的细胞悬液。
c)将细胞悬液加入96孔板，每孔100μL，细胞密度为2000/孔。
d)细胞在37℃，5％CO 2培养箱中培养过夜。
(3)化合物的准备
a)化合物按照实验要求准备。
b)空白对照孔为细胞加0.5％DMSO，作为高读值对照孔。
c)无细胞只有培养基的孔作为低读值对照孔。
(4)化合物处理细胞
a)细胞铺板24小时以后，化合物单独作用，每孔补99μL的生长培养基，然后加入1μL的200X化合物，轻轻震荡确保混合均匀，然后放入37℃，5％CO 2培养箱中。
b)将细胞板放置培养箱72小时。
(5)CTG方法检测
a)将细胞待测板放置室温平衡30分钟，每孔弃掉100μL培养基。
b)每孔加100μL CTG试剂(CelltiterGlo试剂盒)，放置快速振荡器振荡2分钟，室温避光放置30分钟。
c)用Envision仪器读取化学发光信号值。
(6)数据分析
用GraphPad Prism 8 software计算IC 50，利用以下非线性拟合公式来得到化合物的IC50(半数抑制浓度)：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))
X：化合物浓度log值，Y：抑制率(％inhibition)
抑制率(％inhibition)＝(高读值对照读数-化合物孔读值)/(高读值对照读数-低读值对照读数)×100
经过上述实验方法测得的待测化合物A、B、C及AST-3424的IC 50值列示于下表1中。
表1：化合物A、B、C及AST-3424对H460癌细胞抑制作用IC 50数据
化合物 IC 50(nmol/L)
A 6.87
B 8.77
C 23.37
AST-3424 0.11
化合物A、B、C及AST-3424测试所得的IC 50曲线如图5所示。
测试结果表明，两个光学异构体(化合物B、C)具有与消旋体(化合物A)相似的H460抑制毒性。A、B、C三个化合物IC 50均高于AST-3424。
2.2 化合物A、B、C对不同肝癌(HCC)细胞系SNU354、SNU886、MHCC97H、huH-1的细胞抑制试验
用上述同样的实验方法，进一步测试化合物A、B、C对不同肝癌(HCC)细胞系SNU354、SNU886、MHCC97H、huH-1的细胞毒性，结果如下表2：
表2：化合物A、B、C对不同的肝癌细胞HCC抑制作用IC 50数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000037
化合物A、B、C测试对应的IC 50曲线如图6所示，测试结果表明，两个光学异构体(化合物B、C)具有与消旋体(化合物A)相似的肝癌(HCC)细胞系增殖抑制活性。
三、AKR1C3活化依赖的细胞增殖抑制活性实验
3.1 化合物A、B、C及AST-3424在AKR1C3抑制剂存在与否时对H460癌细胞的抑制实验
特定而言，以4×10 3个细胞/孔密度将指数生长的细胞接种于96孔板中且在37℃下在5％CO 2、95％空气及100％相对湿度中培育24小时，然后添加测试化合物。将化合物以200倍的期望最终测试浓度溶解于100％DMSO中。在添加药物时，使用完全培养基将化合物进一步稀释至4倍的期望终浓度。将50μl特定浓度的化合物的等份试样添加至已含有150μl培养基的微量孔中，得到所报告的最终药物浓度。在药物添加之后，将板在37℃、5％CO 2、95％空气及100％相对湿度下再培育2小时，然后将药物洗掉且添加新鲜培养基且将板在37℃、5％CO 2、95％空气及100％相对湿度下再培育70小时。在此培育结束时，使用阿尔玛蓝试剂(AlamarBlue)分析来量化活细胞。使用计算机软件计算导致50％生长抑制的药物浓度(IC 50)。
为了进一步验证化合物为人AKR1C3(醛固酮类还原酶家族1成员C3)所特异性活化，化合物对H460癌细胞增殖试验是在存在或者不存在(3微摩尔浓度)特异性AKR1C3酶抑制剂AST-3021的情况下进行的。在进行化合物处理前2小时，将添加了AKR1C3酶抑制剂AST-3021的化合物溶液添加至细胞培养物中。所用抑制剂为Flanagan等人，文献BioorganicandMedicinalChemistry(2014)第962-977页中的化合物36即
Figure PCTCN2021129077-appb-000038
本专利中简称为AST-3021或TH-3021。
化合物A、B、C及AST-3424对H460癌细胞在AKR1C3抑制剂AST-3021存在与否情况下的抑制作用IC 50数据，如表3所示，对应的IC 50曲线图如图7所示。
表3：化合物A、B、C及AST-3424对H460癌细胞在AKR1C3抑制剂存在与否情况下抑制作用IC 50数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000039
测试结果表明，虽然A、B、C三个化合物在是否添加AST-3021的情况下其IC 50均较化合物AST-3424高，但是AST-3021抑制A、B、C这三个化合物IC 50的倍数却比AST-3424高许多，这显示新设计的A、B、C三个化合物的体外活性与AKR1C3酶的关系更为紧密。
3.2 化合物A和AST-3424对10株非小细胞肺癌的AKR1C3依赖实验
对10株非小细胞肺癌测定IC 50的实验方法与3.1中对H460癌细胞实验方法相同，另外，同时用下述方法测定其AKR1C3酶对应RNA的表达量，以Log 2FPKM计，可参考专利PCT/CN2021/079299。将化合物A和AST-3424的Log 2FPKM和IC 50记录于表格中，实验结果如表4和表5所示。
表4：化合物A的Log 2FPKM和IC 50数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000040
表5：化合物AST-3424的Log 2FPKM和IC 50数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000041
对AKR1C3酶对应的RNA表达量与IC 50进行相关性分析，分别得到化合物A和AST-3424的关系图，如图8和图9所示。
实验结果表明，化合物A和AST-3424的体外细胞毒性与AKR1C3表达呈正相关。具有高AKR1C3表达的细胞株，化合物A和AST-3424均表现出较强的体外细胞毒性；具有低AKR1C3表达的细胞株则显示出很低的化合物A和AST-3424介导的细胞毒性。和AST-3424相比(R 2＝0.796)，化合物A和AKR1C3表达水平相关性更加紧密(R 2＝0.952)，说明化合物A的活化对AKR1C3的特异性更强。
3.3 化合物A和索拉非尼在肝癌LI6280PDX模型的AKR1C3依赖的体内药效实验
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000042
模型LI6280瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼30mg/kg组、测试药化合物A 4.5mg/kg组，以及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共3组，每组6只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组尾静脉给药，每周给药一次，连续给药3周；测试药化合物A 4.5mg/kg组尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给3周；测试药索拉非尼30mg/kg组灌胃给药，每天给药一次，连续给药21天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。具体每组的给药方案和TGI(％)如表6所示。
表6：在
Figure PCTCN2021129077-appb-000043
肝癌LI6280模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000044
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示，即
Figure PCTCN2021129077-appb-000045
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％或T/C％＝T TV/C TV×100％(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝V t/V 0，V 0为分组时该动物的瘤体积，V t为治疗后该动物的瘤体积，下同)；TGI％＝(1-T/C)×100％(T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的平均相对肿瘤体积(RTV)，下同)。
记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表7所示。
表7：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 3天 7天 10天 14天 17天 21天 24天 28天 31天
第1组 103.74 169.79 401.62 775.57 1319.18 2113.82 2641.70 3149.10    
第2组 103.93 168.82 269.83 439.29 731.99 1076.45 1241.19 1504.89 2218.52 2313.01
第3组 103.98 150.33 318.74 683.99 1404.42 2201.20 2739.12 3311.77 3362.07  
对应的肿瘤体积随时间变化的曲线图如图10所示。
测试药索拉非尼30mg/kg治疗组在首次给药后的第17天有明显的抑瘤作用，相较对照组统计学上有显著性差异(p＜0.001)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为50.35％。测试药化合物A4.5mg/kg治疗组在首次给药后的第17天没有抑瘤作用，相较对照组统计学上没有显著性差异(p＝0.987)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为-1.41％。
用上述同样的方法测定该模型中AKR1C3酶对应RNA的表达量，以Log 2FPKM计，计算得到Log2FPKM＝-0.943。
可以从上述实验数据看出，在肝癌LI6280 PDX模型中，AKR1C3对应RNA表达水平比较低(Log 2FPKM＝-0.943)，化合物A的药效与溶媒对照组的药效几乎无差别，而非AKR1C3依赖的索拉非尼有一定的药效，因此，化合物A要发挥显著的抗癌活性，需要AKR1C3酶特异性激活，结合章节3.2中的结论，说明化合物A是AKR1C3酶活化的抗癌前药。
四、PDX、CDX动物模型实验
4.1 化合物A、AST-3424及异环磷酰胺在胃癌GA6201 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000046
模型GA6201瘤块，建立人胃癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药异环磷酰胺60mg/kg组、测试药AST-3424 5mg/kg组、测试药A化合物2.5mg/kg和5mg/kg组、及生理盐水(pH 7.0-7.6)溶媒对照组，共5组，每 组5只小鼠。其中，生理盐水(pH 7.0-7.6)溶媒对照组，每周给药一次，共给药三周，观察四周；测试药AST-34245mg/kg、测试药A化合物2.5mg/kg和5mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，共给药2周，观察7周；测试药异环磷酰胺60mg/kg组，腹腔注射给药，每周连续给五天停两天，共给药2周，观察7周。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。具体每组的给药方案和TGI(％)如表8所示。
表8：胃癌GA6201模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000047
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示，即
Figure PCTCN2021129077-appb-000048
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％或T/C％＝T TV/C TV×100％(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝V t/V 0，V 0为分组时该动物的瘤体积，V t为治疗后该动物的瘤体积，下同)；TGI％＝(1-T/C)×100％(T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的平均相对肿瘤体积(RTV))。
上述给药方案中，异环磷酰胺是根据文献(Jessica D.Sun，Qian Liu，Dharmendra Ahluwalia，Damien J.Ferraro，Yan Wang，Don Jung，Mark D.Matteucci，and Charles P.Hart.Comparison of hypoxia-activated prodrug evofosfamide(TH-302)and ifosfamide in preclinical non-small cell lung cancer models[J].Cancer Biology&Therapy，2016，17(4)：371-380.)中记载的最佳的给药方案且最大的安全药量来设计的。
记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表9所示。
Figure PCTCN2021129077-appb-000049
对应的肿瘤体积随时间变化的曲线图如图11所示。
实验结果表明，至少在49天里，AST-34245mg/kg组、测试药化合物A 2.5mg/kg和5mg/kg组具有很好的癌细胞抑制活性，并且都优于传统的DNA烷化剂异环磷酰胺，化合物A的相对肿瘤抑制率(TGI)超过了96％。
上述实验过程中，在第14天给药后，停止给药，测量肿瘤体积，绘制成曲线图，如图12所示。该实验结果说明，即使在停止治疗1个月后，化合物A的两个给药剂量仍然有抑瘤作用，肿瘤体积继续减小，并且保持较小的体积或体积无法被测量。这显示化合物A的治疗效果良好，与AST-3424相当。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，记录小鼠体重变化数据并计算小鼠体重变化率，小鼠体重变化率如图13所示。上述动物实验的体重变化数据说明，两个剂量的化合物A给药组，与生理盐水对照组、异环磷酰胺给药组、AST-3424给药组类似，对实验动物的体重没有影响。同剂量下化合物A和AST-3424有同等抑制肿瘤功效且无毒性作用。
4.2 化合物A、卡铂在人源非小细胞肺癌NCI-H460皮下异种移植模型中的体内药效实验对比
BALB/c裸小鼠皮下接种人肺癌NCI-H460细胞，建立人肺癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药卡铂(Carboplatin)100mg/kg组、测试单药化合物A 5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg组及10％乙醇+10％聚氧乙烯蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共5组，每组6只小鼠。其中，10％乙醇+10％聚氧乙烯蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药化合物A 5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，共给药三周，观察一周。测试药卡铂(Carboplatin)100mg/kg组是腹腔注射给药，每周给药一次，共给药三周，观察一周。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
肿瘤细胞接种后的第31天对NCI-H460CDX模型中各组药效进行分析，其结果如表10所示。记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表11所示。对应的肿瘤体积随时间变化关系绘制成曲线图如图14所示。
表10：人源肺癌NCI-H460模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000050
Figure PCTCN2021129077-appb-000051
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示，即
Figure PCTCN2021129077-appb-000052
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％或T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％；
3.第3组vs.第4组，p＝0.168；第3组vs.第5组，p＝0.0317；第4组vs.第5组，p＝0.998。
表11：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 7天 10天 14天 17天 21天 24天 28天 31天 35天
第1组 144.68 226.31 339.60 493.01 774.49 977.77 1370.47 1818.22 2299.37
第2组 145.46 262.15 409.97 529.44 761.56 960.42 1073.28 1230.93 1577.99
第3组 144.35 183.15 198.80 228.87 253.30 310.83 279.31 337.78 452.75
第4组 144.21 164.75 151.95 140.29 138.66 144.36 149.16 164.13 168.68
第5组 145.41 171.22 167.54 161.80 157.66 151.20 134.73 125.90 108.70
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图15所示。
上述实验数据表明，在连续的31天观察里，化合物A显示出比卡铂(carboplatin)更优良的抑瘤作用，化合物A的5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg三个给药剂量的相对肿瘤抑制率TGI(％)分别达到81.49％、91.06％、93.06％。化合物A的三个给药剂量至少在31天里对实验动物的体重没有明显影响，显示出在拥有优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.3 化合物A和索拉非尼在人肝癌LI6652皮下异种移植PDX模型中的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种人肝癌LI6652瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg(每天给药一次，连续给21天)组、测试药化合物A 1.25mg/kg(每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期)、2.5mg/kg(每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期)、5mg/kg(每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期)单药组以及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)对照组，共5组，每组6只小鼠。测试药化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg单药组以及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)对照组都是腹腔注射给药，每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期。测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组是灌胃给药，每天给药一次，连续给药21天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第31天对肝癌LI6652模型中各组药效进行分析，其结果如表12所示。记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表13所示。对应的肿瘤体积随时间变化关系绘制成曲线图如图16所示。
表12：肝癌LI6652模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000053
Figure PCTCN2021129077-appb-000054
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示，即
Figure PCTCN2021129077-appb-000055
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表13：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 3天 7天 10天 14天 17天 21天 24天 28天 31天
第1组 125.10 219.19 322.75 504.30 740.03 925.35 1284.19 1658.67 1590.50 2112.46
第2组 125.84 146.95 196.51 212.41 217.19 191.72 178.69 209.42 315.93 441.67
第3组 126.30 184.11 194.19 135.63 51.98 28.94 29.42 28.38 24.72 18.12
第4组 126.29 179.46 189.33 145.19 43.64 29.90 21.49 17.91 18.28 5.56
第5组 124.83 174.91 190.90 130.55 34.29 19.84 13.80 12.20 3.38 2.62
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图17所示。
上述实验结果表明，化合物A的三个给药剂量均表现出优良的抑瘤作用，其相对肿瘤抑制率TGI(％)均超过98％，且优于索拉非尼(Sorafenib)的抑瘤作用。化合物A的三个给药剂量至少在28天里对实验动物的体重没有明显影响，显示出在拥有优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.4 化合物A和紫杉醇在人源非小细胞肺癌NCI-H460-Luc2颅内接种CDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠颅内接种人肺癌NCI-H460-Luc2细胞，建立人肺癌颅内移植肿瘤模型。实验分为测试药紫杉醇(Paclitaxel)20mg/kg组、化合物A2mg/kg组、4mg/kg和8mg/kg组及10％乙醇+10％聚氧乙烯蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.42)溶媒对照组(Vehicle组)，每组6只小鼠。其中，10％乙醇+10％聚氧乙烯蓖麻油+80％葡萄糖注射液D5W(pH7.42)溶媒对照组、测试药化合物A 2mg/kg组、4mg/kg和8mg/kg组都是尾静脉注射给药，每周给药一次，给药3周。阳性药紫杉醇(Paclitaxel)20mg/kg组是腹腔注射 给药，每周给药一次，给药3周。根据肿瘤生物荧光值计算相对肿瘤抑制率TGI(％)并进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第11天，根据测定的生物荧光值，对人源NCI-H460-luc颅内接种模型中各组药效进行分析，其结果如表14所示。
表14：人源NCI-H460-Luc2颅内接种模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000056
根据各治疗组和对照组测定的生物荧光值绘制成关于治疗天数的曲线图，如图18所示。化合物A的三组给药剂量的生物荧光值均较低，且明显低于紫杉醇给药剂量，说明化合物A能够透过血脑屏障进入脑部发挥抑瘤作用，这是紫杉醇所不能起到的药效。
另外，为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图19所示。图中两个对照组的小鼠体重下降明显，说明紫杉醇不能透过血脑屏障进入脑部发挥抑瘤作用，反观化合物A的三组给药剂量对应的体重变化率，其小鼠体重变化不大，说明化合物A在进入脑部发挥抑瘤作用的同时，几乎没有毒副作用，从侧面也说明其穿过了血脑屏障，并且发挥了抑瘤作用。
4.5 化合物A和吉西他滨在胰腺癌PA1222 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000057
模型PA1222瘤块，建立人胰腺癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药吉西他滨(Gemcitabine)120mg/kg组、测试药化合物A 10mg/kg及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共3组，每组5只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药化合物A 10mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药三周。测试药吉西他滨(Gemcitabine)120mg/kg组腹腔注射给药，每周给药一次，连续给药3周。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第28天对胰腺癌PA1222模型中各组药效进行分析，其结果如表15所示。记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表16所示。
表15：
Figure PCTCN2021129077-appb-000058
胰腺癌PA1222模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000059
Figure PCTCN2021129077-appb-000060
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示，即
Figure PCTCN2021129077-appb-000061
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表16：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 3天 7天 10天 14天 17天 21天 24天 28天
第1组 112.01 139.75 177.43 199.20 249.21 306.79 339.57 362.58 395.45
第2组 111.91 136.17 153.75 157.55 147.44 136.71 138.01 153.69 166.11
第3组 111.50 117.62 113.91 107.17 66.08 42.94 23.22 21.20 12.51
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图20所示。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图21所示。
该模型为吉西他滨敏感模型。上述实验结果表明，10mg/kg给药剂量的化合物A具有良好的抗肿瘤活性，其抑瘤活性优于120mg/kg给药剂量的吉西他滨(Gemcitabine)。同时，与对照组的实验动物体重变化情况对比来看，化合物A在显示出优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.6 化合物A和紫杉醇在肺癌LU2505PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c Nude裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000062
模型LU2505瘤块，建立人肺癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药紫杉醇(Paclitaxel)20mg/kg组、测试药化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg组及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共5组，每组5只小鼠。其中测试药紫杉醇(Paclitaxel)20mg/kg组是腹腔注射给药，每四天给药一次，共给药四个周期，观察13天。7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药AST-0011.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药三周，观察8天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第28天对肺癌LU2505模型中各组药效进行分析，其结果如表17所示。记录不同天数肿瘤的体积大小，结果如表18所示。
表17：
Figure PCTCN2021129077-appb-000063
肺癌LU2505模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000064
表18：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 4天 7天 11天 14天 18天 21天 25天 28天
第1组 103.58 196.01 291.37 390.10 486.55 670.52 824.93 902.96 1126.00
第2组 103.12 133.63 133.14 132.14 164.42 207.89 238.63 231.63 250.47
第3组 103.28 156.32 231.55 242.12 291.72 383.24 434.92 478.15 485.95
第4组 103.26 149.02 131.34 109.62 116.57 113.09 103.18 92.38 102.06
第5组 103.23 139.41 111.31 62.41 42.40 34.32 30.63 20.52 19.00
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图22所示。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图23所示。
上述实验结果表明，1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg给药剂量的化合物A对肺癌LU2505 PDX模型具有良好的抗肿瘤活性，并且2.5mg/kg、5mg/kg给药剂量的化合物A的抗肿瘤活性高于20mg/kg给药剂量的紫杉醇(Paclitaxel)。化合物A(1.25mg/kg，2.5mg/kg和5mg/kg)的治疗作用具有剂量依赖性，化合物A(5mg/kg)治疗组相较化合物A(1.25mg/kg)治疗组统计学上有显著差异(p＝0.0192)，其余各组间无统计学差异。同时，与对照组的实验动物体重变化情况对比来看，化合物A在显示出优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.7 化合物A、索拉非尼和AST-3424在肝癌LI6643 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000065
模型LI6643瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组，测试药AST-34240.3mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg组，测试药化合物A 0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg组，以及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％生理盐水(pH7.5)溶媒对照组，共8组，每组6只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％生理盐水(pH7.5)溶媒对照组尾静脉给药，每周给药一次，连续给药3周；测试药AST-3424 0.3mg/kg和1mg/kg组尾静脉注射给药，每天给药一次，连续给5天，停两天，停两周，再连续给药5天；测试药AST-3424 1.25mg/kg组尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药两周，停一周，再连续给药两周；化合物A0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg组是尾静脉注射给药，每天给药一次，连续给药5天，停两天，停两周，再连续给药5天。测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组灌胃给药，每天给药一次，连续给药21天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第21天对肝癌LI6643模型中各组药效进行分析，其结果如表19所示。记录不同天数肿瘤体积大小，结果如表20所示。
表19：
Figure PCTCN2021129077-appb-000066
肝癌LI6643模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000067
Figure PCTCN2021129077-appb-000068
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示；
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表20：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 3天 7天 10天 14天 17天 21天 24天 28天
第1组 124.93 190.19 249.09 351.57 421.67 493.35 605.52 796.73 996.53
第2组 124.67 170.03 185.13 193.95 189.87 171.25 214.75 238.48 309.08
第3组 124.74 210.50 242.31 227.43 208.00 223.43 250.47 302.15 386.93
第4组 124.32 156.70 144.82 110.44 90.12 97.62 75.89 89.34 98.43
第5组 124.62 205.56 217.23 216.04 187.94 176.52 169.64 174.54 146.31
第6组 124.86 239.56 282.74 266.35 231.35 241.82 242.85 173.56 188.68
第7组 124.32 205.79 246.90 225.40 195.33 191.98 174.86 217.19 231.64
第8组 124.40 182.25 182.74 162.65 137.87 117.10 116.38 122.78 95.87
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图24所示。
上述实验结果表明，0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg给药剂量的化合物A与0.3mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg给药剂量的AST-3424对人源LI6643 PDX模型具有类似的良好的抗肿瘤活性，并且与20mg/kg给药剂量的索拉非尼(Sorafenib)的抗肿瘤活性相当。
4.8 化合物A和索拉非尼在肝癌LI6643 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c Nude裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000069
模型LI6643瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)20-30mg/kg组、化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共6组，每组5只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg组是腹腔注射给药，每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期，观察28天。测试药化合物A 10mg/kg组尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药2周，停1周，共2个给药周期，观察25天。索拉非尼(Sorafenib)20-30mg/kg组灌胃给药，在day0-day11期间，30mg/kg给药剂量，每天给药一次，连续给12天，在day12-day20期间，由于小鼠体重下降明显，剂量从30mg/kg调整到20mg/kg，每天给药一次，连续给9天，观察33天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第35天对肝癌LI6643模型中各组药效进行分析，其结果如表21所示。记录不同天数肿瘤体积大小，结果如表22所示。
表21：
Figure PCTCN2021129077-appb-000070
肝癌LI6643模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000071
表22：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 4天 7天 11天 14天 18天 21天 25天
第1组 127.06 184.53 321.39 445.25 595.14 856.01 1053.14 1249.58
第2组 126.16 163.51 205.85 235.50 279.42 291.41 287.76 326.85
第3组 126.11 160.85 216.99 94.21 72.94 59.48 25.80 21.28
第4组 126.02 181.97 270.85 264.04 197.40 177.65 102.13 90.41
第5组 125.92 199.12 278.32 191.74 167.14 154.33 100.94 103.28
第6组 126.93 178.97 214.95 132.13 63.74 60.36 40.93 24.91
实验室 28天 32天 35天 39天 42天 46天 49天 53天
第1组 1445.52 1574.72 1780.45 2218.93 1938.47 2147.64 / /
第2组 346.56 385.09 392.20 431.87 451.48 521.44 585.72 622.46
第3组 10.93 7.11 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
第4组 73.75 49.39 35.61 31.79 25.59 19.34 12.51 9.04
第5组 93.12 74.85 56.62 39.85 27.34 14.83 12.00 12.86
第6组 21.48 8.71 7.12 6.77 5.57 4.27 4.12 3.81
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图25所示。为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图26所示。
上述实验结果表明，1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg给药剂量的化合物A对LI6643细胞具有良好的抗肿瘤活性，并且其抗肿瘤活性均高于30mg/kg给药剂量的索拉非尼(Sorafenib)。同时，与对照组的实验动物体重变化情况对比来看，化合物A在显示出优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.9 化合物A和索拉非尼在肝癌LI1005 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c Nude裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000072
模型LI1005瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组、化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共6组，每组5只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药化合物A 1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg组是腹腔注射给药，每天给药，连续给5天，停2天后，再停2周，共2个给药周期，观察10天。化合物A 10mg/kg组尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药2周，停1周，共2个给药周期，观察7天。索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组灌胃给药，每天给药一次，连续给21天，观察15天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第35天对肝癌LI1005模型中各组药效进行分析，其结果如表23所示。记录不同天数肿瘤体积的大小，结果如表24所示。
表23：
Figure PCTCN2021129077-appb-000073
肝癌LI1005模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000074
Figure PCTCN2021129077-appb-000075
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示；
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表24：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
Figure PCTCN2021129077-appb-000076
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图27所示。为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图28所示。
实验结论：化合物A在10mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg剂量下，对
Figure PCTCN2021129077-appb-000077
肝癌LI1005具有显著抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上有显著性差异，药效优于索拉非尼。化合物A在1.25mg/kg和索拉非尼在30mg/kg剂量下，对
Figure PCTCN2021129077-appb-000078
肝癌LI1005具有抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上无显著性差异，药效与索拉非尼组无差异。荷瘤小鼠对化合物A 10mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg测试剂量下耐受良好。索拉非尼在30mg/kg测试剂量下引起小鼠一定的体重下降，给药期结束后，体重逐渐恢复正常。同时，化合物A与对照组的实验动物体重变化情况对比来看，化合物A在显示出优良抑瘤作用的同时，无毒副作用。
4.10 化合物A和索拉非尼在肝癌HepG2 CDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c nude裸小鼠皮下接种人肝癌HepG2细胞，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组、测试药化合物A 5mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.)、10mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.)、1.25mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)、2.5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)、5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)单药组及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共7组，每组6只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、测试药化合物A 1.25mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)、2.5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)和5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.)组是腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药5天，停2天和2周，再每天给药一次，连续给药5天，之后观察9天。测试药化合物A 5mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.)、10mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.)组是尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药2周，停一周，再每周给药一次，连续给药2周，末次给药后观察6天。测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组是灌胃给药，每天给药一次，连续给药21天，之后观察14天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在细胞接种后的第53天对肝癌HepG2模型中各组药效进行分析，其结果如表25所示。记录不同天数肿瘤体积的大小，结果如表26所示。
表25：人肝癌HepG2模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000079
Figure PCTCN2021129077-appb-000080
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示；
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表26：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 19天 22天 24天 27天 31天 36天 39天 42天 46天 49天 53天
第1组 192.64 336.01 345.38 430.57 617.10 771.64 969.06 1325.75 1574.22 1939.71 2293.53
第2组 189.76 291.62 311.64 340.46 398.84 491.06 509.41 657.51 816.63 1012.20 1484.78
第3组 191.48 315.19 360.12 390.21 373.82 314.44 283.08 276.88 233.11 145.58 136.44
第4组 191.97 314.32 375.81 427.75 386.68 347.85 312.31 252.78 197.45 142.21 88.20
第5组 189.54 315.41 351.74 383.10 366.64 416.27 586.80 782.39 886.97 975.41 1066.23
第6组 189.31 292.03 360.14 373.23 405.67 392.90 342.04 399.84 417.54 456.60 417.76
第7组 189.64 259.29 280.24 286.22 290.75 293.88 247.49 224.58 215.32 234.89 189.84
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图29所示。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图30所示。
实验结论：化合物A的药效优于索拉非尼。由于HepG2是恶病质模型，该模型特点是荷瘤小鼠的体重会自发的下降。化合物A在10mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.，Group 4)和2.5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.，Group 6)剂量下，对人肝癌HepG2模型具有显著抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上均有显著性差异。化合物A在上述2个测试剂量和给药方式下，荷瘤小鼠没有发生严重的体重下降或者死亡。测试单药化合物A在5mg/kg(QWx2；1week off；QWx2，i.v.，Group 3)剂量下，对人肝癌HepG2模型具有显著抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上有显著性差异，该组在给药周期内有一只小鼠发生死亡。化合物A在5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.，Group7)剂量下，对人肝癌HepG2模型具有显著抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上有显著性差异，该组有一只小鼠在给药周期内由于BWL＞20％而被安乐死。化合物A的5mg/kg组中有一只小鼠完全治愈。并且，化合物A的1.25mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.，Group 5)，2.5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.，Group 6)和5mg/kg(QDx5；2days off，2weeks off；QDx5，i.p.，Group 7)治疗组表现出剂量依赖性的量效关系。Group3、4、7组中各有一只小鼠完全治愈，Sorafenib在30mg/kg测试剂量下，对人肝癌HepG2模型具有抑制肿瘤生长的作用，相较对照组统计学上没有显著性差异，并且在测试剂量下引起小鼠明显的体重下降。
4.11 化合物A和紫杉醇在肺癌LU0884 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c Nude裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000081
模型LU0884瘤块，建立人肺癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药紫杉醇(Paclitaxel)20mg/kg组、化合物A2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg组及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共6组，每组6只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组、化合物A2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给3周，观察8天。测试药Paclitaxel 20mg/kg组是腹腔注射给药，每4天给药一次，连续给药4次，观察13天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第28天对肺癌LU0884模型中各组药效进行分析，其结果如表27所示。记录不同天数肿瘤体积的大小，结果如表28所示。
表27：
Figure PCTCN2021129077-appb-000082
肺癌LU0884模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000083
1.数据以“平均值±标准误差”表示；
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表28：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 4天 7天 11天 14天 18天 21天 25天 28天
第1组 109.73 180.12 262.62 314.65 366.16 476.97 510.27 599.15 664.59
第2组 110.11 157.57 229.87 250.46 292.52 381.53 402.62 492.50 528.88
第4组 109.86 138.21 177.96 194.38 216.81 261.94 287.79 328.61 360.43
第5组 110.67 173.28 221.81 229.45 236.47 260.75 271.59 289.40 291.60
第6组 109.04 202.09 257.40 283.55 293.14 343.92 359.85 411.01 434.80
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图31所示。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图32所示。
实验结论：测试药紫杉醇(Paclitaxel)(20mg/kg，Group 2)在测试剂量下，对
Figure PCTCN2021129077-appb-000084
肺癌LU0884具有微弱的抑瘤作用，相较对照组统计学上没有显著性差异。化合物A2.5mg/kg(Group 4)、5mg/kg(Group 5)和10mg/kg(Group 6)在测试剂量下，对
Figure PCTCN2021129077-appb-000085
肺癌LU0884均具有一定的抑瘤作用，相较对照组统计学上均没有显著性差异。因此测试药紫杉醇(Paclitaxel)和化合物A在该模型中的药效没有显著差异。荷瘤小鼠对Paclitaxel在20mg/kg(Group 2)、化合物A在2.5mg/kg(Group 4)、5mg/kg(Group 5)和10mg/kg(Group 6)测试剂量下耐受良好，没有明显的体重下降的现象发生。
4.12 化合物A、AST-3424和索拉非尼在肝癌LI6664 PDX模型的体内药效实验对比
实验说明：BALB/c裸小鼠皮下接种
Figure PCTCN2021129077-appb-000086
模型LI6664瘤块，建立人肝癌皮下移植肿瘤模型。试验分为测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg组、测试药AST-3424 0.3mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg组、化合物A0.5mg/kg、1.5mg/kg、4.5mg/kg组，以及7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组，共8组，每组6只小鼠。其中，7.5％无水乙醇+7.5％聚氧乙烯(35)蓖麻油+85％葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒对照组尾静脉给药，每周给药一次，连续给药3周；测试药AST-3424 0.3mg/kg和1mg/kg组尾静脉注射给药，每天给药一次，连续给5天，停两天，停两周，再连续给药5天；测试药AST-34241.25mg/kg组尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药两周，停一周，再连续给药两周；化合物A 0.5mg/kg、1.5mg/kg、4.5mg/kg组是尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药三周，停一周，再连续给药三周。测试药Sorafenib 30mg/kg组灌胃给药，每天给药一次，连续给药21天。根据相对肿瘤抑制率TGI(％)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
在给药后的第28天对肝癌LI6664 PDX模型中各组药效进行分析，其结果如表29所示。记录不同天数肿瘤体积的大小，如表30所示。
表29：
Figure PCTCN2021129077-appb-000087
肝癌LI6664模型中各组药效分析表
Figure PCTCN2021129077-appb-000088
Figure PCTCN2021129077-appb-000089
注：1.数据以“平均值±标准误差”表示；
2.T/C％＝T RTV/C RTV×100％or T/C％＝T TV/C TV×100％；TGI％＝(1-T/C)×100％。
表30：不同实验组在不同天数的肿瘤体积大小(mm 3)
实验组 0天 4天 7天 11天 14天 18天 21天 25天
第1组 108.31 224.91 303.09 414.35 597.93 762.00 892.78 1214.79
第2组 107.93 170.15 197.93 218.34 321.83 391.52 481.85 730.68
第3组 108.20 162.32 177.51 208.59 306.95 391.40 499.34 631.08
第4组 107.53 131.59 145.23 158.03 233.54 291.97 371.35 438.00
第5组 108.46 174.65 210.25 222.97 291.02 361.03 467.94 581.63
第6组 108.44 201.76 277.38 301.39 347.30 434.18 518.23 746.19
第7组 108.25 127.56 152.00 161.35 206.44 225.71 287.02 398.93
第8组 108.26 125.30 142.58 150.82 176.69 180.29 201.42 282.76
实验组 28天 32天 35天 39天 42天 46天 49天 /
第1组 1506.35 1441.57 1671.99 2081.93 1409.66 649.08 695.40 /
第2组 1003.42 1333.07 1595.00 2102.94 2729.04 2892.15 2600.00 /
第3组 746.71 958.09 1059.71 1226.51 1094.69 1268.82 1486.77 /
第4组 463.09 622.48 748.13 929.60 1226.79 1496.83 1717.60 /
第5组 687.95 746.71 871.84 1081.64 1307.36 1675.14 1923.31 /
第6组 920.46 1036.44 1258.05 1426.66 1661.81 2037.97 1746.71 /
第7组 466.31 543.94 643.84 805.84 1060.20 1179.82 1407.10 /
第8组 320.72 339.73 360.45 391.38 417.79 451.01 538.20 /
分别在不同天数对不同组别的小鼠的肿瘤体积进行测量，并取得平均值，并绘制成曲线图，如图33所示。
为了验证化合物A对实验动物体重变化的影响，基于上述实验方法，在不同时间点记录实验动物的体重变化情况，并计算其体重增长率，绘制成曲线图，如图34所示。
实验结论：测试药索拉非尼(Sorafenib)30mg/kg治疗组在首次给药后的第28天没有抑瘤作用，相对肿瘤抑制率TGI(％)为28.99％。测试药AST-3424 0.3mg/kg(每天给药一次，连续给5天，停两天，停两周，再连续给药5天)治疗组在首次给药后的第28天(Day 28)有一定的抑瘤作用，相较对照组统计学上没有显著性差异(p＝0.79)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为45.85％。测试药AST-3424 1mg/kg(每天给药一次，连续给5天，停两天，停两周，再连续给药5天)治疗组在首次给药后的第28天(Day 28)有显著的抑瘤 作用，相较对照组统计学上有显著性差异(p＝0.0329)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为65.05％。AST-3424 1.25mg/kg(每周给药一次，连续给药两周，停一周，再连续给药两周)治疗组在首次给药后的第28天(Day 28)有一定的抑瘤作用，相较对照组统计学上没有显著性差异(p＝0.479)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为52.42％。
化合物A0.5mg/kg(每周给药一次，连续给药三周，停一周，再连续给药三周)治疗组在首次给药后的第28天(Day 28)有轻微的抑瘤作用，相较对照组统计学上有没显著性差异(p＝0.855)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为34.07％。化合物A 1.5mg/kg和4.5mg/kg(每周给药一次，连续给药三周，停一周，再连续给药三周)治疗组在首次给药后的第28天(Day28)有显著的抑瘤作用，相较对照组统计学上有显著性差异(p值分别为0.0457和0.000856)，相对肿瘤抑制率TGI(％)分别为66.57％和77.05％。化合物A的抑瘤效果具有剂量依赖性，并且测试药化合物A4.5mg/kg治疗组(Group 8)相较0.5mg/kg治疗组(Group6)统计学上有显著性差异(p＝0.0428)。化合物A和AST-3424有相近的抑瘤效果，且均优于索拉非尼的抑瘤效果。
索拉非尼30mg/kg治疗组出现个别小鼠体重下降的现象。AST-3424和化合物A各治疗组在治疗期间没有出现小鼠体重下降的现象，耐受良好。
五、PgP抑制实验及BBB血脑屏障实验
P-糖蛋白(P-GP，也称为多药耐药蛋白)是在多药抗药性肿瘤细胞质膜上发现的一种高分子量蛋白质，具有转运泵样的结构。它将多种化疗药物泵出细胞外，降低细胞内的药物浓度，与临床化疗的抗药性关系密切。
化疗药物在治疗脑部等中枢神经***的肿瘤或癌症中的作用受到了限制，这主要是由于血脑屏障(blood brain barrier，BBB)，血脑屏障使得化疗药物对肿瘤***或肿瘤组织的渗透性差，也就是化疗药物无法穿过血脑屏障进入到脑内来杀灭癌细胞。
化疗药物等小分子穿越血脑屏障的过程比较复杂。血脑屏障位于全身血液循环和脑脊液之间，是由专门的脑微血管内皮细胞，连同周围细胞和血管周围的星形细胞通过相邻细胞间的紧密连接而形成的，其迫使大多数分子通过时形成选择性障碍，而不是围绕血管内皮细胞构成一个物理屏障。血脑屏障的膜的运输***容许亲水性小分子通过，而大型亲水性分子，包括许多化疗药物和大分子药物都将被排除出中枢神经***，除非他们能被某些蛋白主动运输。更重要的是，血脑屏障具有的保护脑组织的“药物外排泵”，如P-糖蛋白，能积极主动从大脑中排除一些化疗药物和大分子药物。因此，即使具有一定亲水性的小分子化疗药物(包括小分子靶向抗肿瘤药物分子)能穿越血脑屏障进入大脑发挥作用，但在P-糖蛋白的作用下也依然会被排除出中枢神经***而无法真正起效。也就是说，Pgp的跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，能将流水亲脂性的药物，如长春新碱(VCR)、阿霉素(Dox)或足叶乙甙(VP-16)等泵出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，细胞毒作用降低或完全丧失。
为此PGP糖蛋白与化合物的作用实验数据即可以用来评价这些化合物对中枢神经***肿瘤细胞增殖抑制的真正有效作用程度。
5.1 以MDCKII-MDR1细胞为模型，维拉帕米为抑制剂评估化合物A作为P-gp底物的潜能
5.1.1 穿透试验用细胞的制备
1)MDCKII-MDR1细胞培养于细胞培养瓶。培养箱设置为37℃、5％CO 2、保证相对湿度95％。细胞汇合度达到70-90％时可用于接种迁移小室(Transwell)。
2)细胞接种前，向迁移小室上室每孔中加入50μL细胞培养基，下层培养板内加入25mL细胞培养基。将培养板置于37℃，5％CO 2培养箱内孵育1小时后可用于接种细 胞。
3)细胞孵育后，吸取细胞混悬液转移至圆底离心管，于120g离心5分钟。
4)使用培养基重悬细胞，终浓度为1.56×10 6cells/mL。将细胞悬液以50μL每孔加入到96孔迁移小室培养板上室中，最终接种密度为5.45×10 5cells/cm 2。
5)接种后48小时开始换液，培养4-8天，隔一天换一次培养基。
6)更换培养基过程如下，将迁移小室与接收板分开，先弃掉接收板中培养基然后再弃掉迁移小室培养基，最后每个小室加入75μL新鲜培养基，接收板加入25mL新鲜培养基。
5.1.2 细胞单层膜完整性的评价
1)MDCKII-MDR1细胞经过4-8天培养后，应完全汇合并完成分化。此时，可应用于穿透试验。
2)用电阻仪(Millipore)测量单层膜电阻，记录每孔电阻。
3)测定结束后，将迁移小室培养板放回培养箱。
4)电阻值的计算：测定电阻值(ohms)×膜面积(em 2)＝TEER值(ohm·em 2)，若TEER值＜42ohms·em 2，则该孔不能用于穿透试验。
5.1.3 药物穿透试验
1)从培养箱中取出MDCKII-MDR1迁移小室培养板。使用缓冲液润洗细胞单层膜两次，37℃条件下孵育30分钟。
2)测定化合物由顶端到基底端的转运速率。向上层小室(顶端)每孔加入75μL含受试物的冲液，下层小室(基底端)每孔加入235μL缓冲液。
3)测定化合物由基底端到顶端的转运速率。向上层小室(顶端)每孔加入75μL缓冲液，下层小室(基底端)每孔加入235μL含受试物的缓冲液。
4)从工作液配制板中转移50μL样品加到200μL含内标的乙腈(100nM阿普***，200nM拉贝洛尔，200nM咖啡因和2μM酮洛芬)中作为0分钟给药样品进行检测。
5)为测定受试物在加P-gp抑制剂维拉帕米条件下的转运，需要在MDCKII-MDR1迁移小室板给药端的缓冲盐和接收端的缓冲盐中均需加维拉帕米，且终浓度为100μM。
6)将上下的转运合并后，37℃条件下孵育2小时。
7)孵育完成后，分别从迁移小室培养板上室和下室每孔取样50μL加入到新的样品管中。向样品管内加入200ul含内标的乙腈(100nM阿普***，200nM拉贝洛尔，200nM咖啡因和2μM酮洛芬)，涡旋10分钟后，于3220g离心30分钟。吸取上清液100μL，与等体积水稀释之后进行LC-MS/MS分析。各样品均采用三平行孵育。
8)用荧光黄的渗漏评价评价孵育2小时后细胞单层膜的完整性，使用缓冲液稀释荧光黄储备液至最终浓度100μM。在上侧的Transwell插板的每个孔中加入荧光黄溶液100μL，下侧接收板的每个孔中加300μL缓冲液。37℃下孵育30分钟后，分别从每孔上下层吸出80μL溶液至一个新的96孔板中。使用酶标仪，激发波长480nm和发射波长530nm条件下进行荧光测定。
5.1.4 数据分析
峰面积由离子色谱结果计算得出。化合物的表观渗透系数(Papp，单位：cm/s×10-6)用以下公式计算得出：
Figure PCTCN2021129077-appb-000090
公式中：VA为接收端溶液的体积(Ap→Bl是0.235mL，Bl→Ap是0.075mL)，Area为Transwell-96孔板膜面积(0.143cm2)；time为孵育时间(单位：s)，[drug]acceptor表示孵育结束后接收端的药物浓度，[drug]initial，donor表示孵育前的给药初始浓度。
外排率Efflux Ratio使用以下的公式计算得出：
Figure PCTCN2021129077-appb-000091
公式中：Papp(B-A)为由基底端到顶端的表观渗透系数；Papp(A-B)为由顶端到基底端的表观渗透系数。
回收率Recovery使用以下的公式计算得出：
Figure PCTCN2021129077-appb-000092
公式中：VA为接收端的溶液体积(单位：mL)；VD为给予端的溶液体积(单位：mL)。[drug]acceptor表示孵育结束后接收端的药物浓度，[drug]donor表示孵育结束后给药端的药物浓度，[drug]initial，donor表示孵育前的给药初始浓度。
细胞单层膜的荧光值LY Leakage使用以下的公式计算得出：
Figure PCTCN2021129077-appb-000093
公式中：Iacceptor是指接收孔(0.3mL)的荧光密度，Idonor是指加药孔(0.1mL)的荧光密度，用％LY表示。LY＜1.5％表示单层细胞膜完好。
分别对制备的部分化合物进行测试得到不同化合物在有无P-糖蛋白抑制剂维拉帕米存在时的外排率，实验数据如表31所示。
表31：药物穿透实验数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000094
实验结论：化合物A在有、无P-gp抑制剂维拉帕米存在的情况下，其Papp(A-B)、Papp(B-A)、Efflux Ratio这三个关键的参数都是十分接近的，因此化合物A不是PgP底物，血脑屏障对其药效影响甚微。
作为对比，同为AKR1C3酶活化的AST-3424，其测试得到的Papp(A-B)、Papp(B-A)、Efflux Ratio这三个关键的参数差异较大，显示AST-3424是PgP底物，血脑屏障对其药效有较大影响。
5.2 血脑屏障实验
5.2.1 化合物A血脑屏障实验
每个时间点3个CD-1鼠静脉给予1mg/kg测试化合物A。给药后5min、15min、1h、2h、4h和8h取血及脑组织，用LC/MS方法检测样品中的测试物的浓度，结果如表32所示。
表32：不同时间点，化合物A静脉给药到CD-1小鼠后不同时间点血及脑组织中测试物的浓度
Figure PCTCN2021129077-appb-000095
将化合物A在血液和脑组织中浓度与时间的对应结果制作成曲线图，如图35所示。
将在脑组织和血液中化合物A浓度的比例与时间的对应测试结果制作成曲线图，如图36所示。
将上述实验中测试得到的PK(药物代谢动力学)参数列表如下，如表33、表34所示。
表33～表34中相关术语解释如下：
PK parameters，药物代谢动力学参数。
T1/2，半衰期。
Cl-obs，血浆清除率。
C0，起始浓度。
AUClast，从给药时间开始到最后一个点的这段时间的药时曲线线下面积。
AUClnf，从给药开始到无穷远的时间的药时曲线线下面积。
Tmax，达峰时间。
Cmax，达峰浓度。
MRTlnf-obs，代表从给药开始到理论外推无穷远的时间的平均驻留时间。
AUClnf Ration(Brain/Plasma)，从给药开始到无穷远的时间的血清和脑组织中药时曲线
线下面积的比例。
Unit，单位。
Mean，平均值。
表33：血浆中测试得到的PK参数
PK parameters Unit Mean
Cl_obs mL/min/kg 13.85
T1/2 h 3.64
C0 ng/mL 453.48
AUClast h*ng/mL 979.51
AUCInf h*ng/mL 1202.97
MRTInf_obs h 4.37
Vss_obs L/kg 3.63
表34：脑组织中测试得到的PK参数
Figure PCTCN2021129077-appb-000096
上述实验结果表明，化合物A可在脑组织中检测到，化合物A可穿越血脑屏障，进行正常的生理代谢，发挥抑瘤作用。
5.2.2 化合物AST-2870血脑屏障实验
化合物AST-2870是化合物AST-3424的外消旋体，具有与AST-3424类似的抑瘤活性。
每个时间点3个CD-1腹腔注射给予10mg/kg测试化合物AST-2870。给药后5min、15min、30min、1h、1.5h和2h取血液及脑组织，用LC/MS方法检测样品中的测试物的浓度。将化合物AST-2870在血液和脑组织中浓度与时间的对应结果制作成曲线图，如图37所示。将在脑组织和血液中化合物AST-2870浓度的比例与时间的对应测试结果制作成曲线图，如图38所示。
将上述实验中测试得到的PK(药物代谢动力学)参数列表如下，如表35、表36所示。
表35：血浆中测试得到的AST-2870 PK参数
PK parameters Unit Mean
Cl_obs mL/min/kg NC
T1/2 h 0.15
Cmax ng/mL 4023
AUClast h*ng/mL 725
AUCInf h*ng/mL 725
MRTInf_obs h NC
Vss_obs L/kg NC
表36：脑组织中测试得到的AST-2870 PK参数
Figure PCTCN2021129077-appb-000097
实验结论：结合5.2.1中实验数据，从中可以得出，化合物A的半衰期明显长于AST-2870；化合物A在检测的8小时内脑组织中浓度与血浆浓度类似，显示这个化合物可 有效穿透血脑屏障；而AST-2870在脑中检测到的浓度明显低于血浆浓度，给药30分钟后，已低于定量下限，说明AST-2870不能穿过血脑屏障。
六、代谢稳定性评价实验
6.1 细胞质溶液稳定实验
(一)溶液配制
1)配制化合物A供试品、***阳性对照和AST-3021抑制剂100mM储备液，并于冷冻冰箱(-10℃～-30℃)保存。
2)配制2.5mM供试品或者阳性对照品中间液和1.5mM的抑制剂中间液。
3)配制10mg/mL的猴细胞溶质溶液。
4)配制含7.5μM阳性对照品的1.5mg/mL肝细胞溶质混悬液。
5)配制含7.5μM供试品的1.5mg/mL肝细胞溶质混悬液。
6)配制含7.5μM供试品和4.5μM抑制剂的1.5mg/mL肝细胞溶质混悬液。
7)称取适量的NADPH粉末，然后用磷酸钾缓冲液溶解，配制成6mM的NADPH工作液，并于37℃预热。
(二)孵育实验
1)阴性对照组：按不同的时间点(0 and 60min)，在96孔板中分装30μL/孔的含7.5μM供试品的肝细胞溶质混悬液。平行制备三个复孔。
2)阳性对照组：按不同的时间点(0、5、15、30、45 and 60min)，在96孔板中分装30μL/孔的含7.5μM阳性对照的肝细胞溶质混悬液。平行制备三个复孔。
3)正常反应组：按不同的时间点(0、5、15、30、45 and 60min)，在96孔板中分装30μL/孔的含7.5μM供试品的肝细胞溶质混悬液。平行制备三个复孔。
4)抑制反应组：按不同的时间点(0、5、15、30、45 and 60min)，在96孔板中分装30μL/孔的含7.5μM供试品和4.5μM抑制剂的肝细胞溶质混悬液。平行制备三个复孔。
5)将96孔板在37度水浴中孵育5min。
6)0min样品：先加入150μL/孔含内标的乙腈后，然后正常反应组、抑制反应组和阳性对照组样品加入15μL/孔预热的NADPH工作溶液，阴性对照组样品加入15μL/孔预热的磷酸钾缓冲液。
7)其他样品(5、15、30、45 and 60min)：对于正常反应组、抑制反应组和阳性对照组，加入15μL/孔预热的NADPH工作溶液起始反应；对于阴性对照组，加入15μL/孔预热的磷酸钾缓冲液。然后反应板在37℃水浴中继续孵育，并在对应的时间点(5、15、30、45和60min)加入150μL/孔的终止液终止反应。最终孵育体系如下表25。
8)全部反应终止后，封板，600rpm震摇混匀约10min，然后冷冻保存(-10℃～-30℃)直至分析。
表37：孵育体系数据
Figure PCTCN2021129077-appb-000098
(三)样品分析
样品于4℃，4000rpm离心15min，取上清和等体积的超纯水混合，然后用LC-MS/MS分析化合物A、AST-2660和***的浓度。
AST-2660是前药化合物A经过AKR1C3酶代谢后释放的能够有效杀死肿瘤细胞的NDA烷化剂，其结构式如下：
Figure PCTCN2021129077-appb-000099
其中，Z可以是氢、钠或钾。
(四)数据分析
各样品中的分析物浓度用峰面积比(峰面积 分析物/峰面积 内标)来表示，然后以0分钟的峰面积比为参照，计算各孵育时间点的原形剩余率(％Remaining)，将剩余率的ln对数值与孵育时间线性拟合，并根据以下公式计算半衰期。
剩余率，％Remaining＝PAR appointed time/PAR 0-min均值x 100(PAR：峰面积比)；
消除速率常数(k)＝(-斜率)；
半衰期(t 1/2)(minutes)＝0.693/k。
本实验体外考察了在存在或缺少AKR1C3抑制剂(AST-3021)情况下，待测化合物(化合物A和化合物AST-3424)在CD-1小鼠、SD大鼠、食蟹猴及人肝细胞溶质中的代谢稳定性：在存在或缺少AST-3021的情况下，5μM的待测化合物(化合物A和化合物AST-3424)与2mM的NADPH和1mg/mL的肝细胞溶质共同孵育0-60min。此外，在缺少NADPH和AST-3021的情况下，5μM的待测化合物(化合物A和化合物AST-3424)与1mg/mL的肝细胞溶质共同孵育0，60min作为阴性对照。在缺少AST-3021的情况下，5μM的***与2mM的NADPH和1mg/mL的肝细胞溶质共同孵育0-60min作为阳性对照。然后用LC-MS/MS检测孵育后样品中的阳性对照***、待测化合物(化合物A和化合物AST-3424)和AST-2660的参数，实验数据如表38和表39所示。
Figure PCTCN2021129077-appb-000100
Figure PCTCN2021129077-appb-000101
用上述实验方法分别测试化合物A和AST-3424，将实验结果数据进行分析做图，得到化合物A在添加NADPH、未添加NADPH、添加AKR1C3抑制剂以及对照药***条件下在小鼠、猴、大鼠、人的肝细胞质溶液中反应后的剩余量随时间变化的曲线图39。得到AST-3424在添加NADPH、未添加NADPH、添加AKR1C3抑制剂以及对照药***条件下在小鼠、猴、大鼠、人的肝细胞质溶液中反应后的剩余量随时间变化的曲线图40。
对化合物A的实验分析：
1.在缺少NADPH，又缺少AST-3021的情况下，与小鼠、大鼠、猴和人肝细胞溶质共同预孵60min后，化合物A的平均剩余率分别为83.01％、68.42％、78.57％和38.96％(见表38)，该数据表明化合物A可能存在非NADPH依赖的代谢途径。在所有样品中均未检测到代谢产物AST-2660(见表39)。
2.在缺少AST-3021的情况下，与小鼠、大鼠、猴和人肝细胞溶质及NADPH共同预孵60min后，化合物A的平均剩余率分别为88.89％、71.72％、73.28％和43.34％(见表38)，对应的半衰期分别为511.07min、130.84min、151.55min和49.88min，在小鼠和大鼠样品中未检测到AST-2660，在猴和人样品中检测到少量AST-2660。
3.在存在AKR1C3抑制剂AST-3021情况下，化合物A在小鼠、大鼠、猴和人肝细胞溶质中的剩余率分别为74.94％、63.81％、69.52％和53.65％，对应的半衰期分别为140.38min，、101.55min、155.47min和64.94min(见表38)，在小鼠、大鼠和人样品中未检测到AST-2660，只在一个猴60min样品中检测到AST-2660。在小鼠、大鼠和猴肝细胞溶质中，AST-3021未对化合物A的代谢产生明显抑制，但是在人肝细胞溶质中，AST-3021对化合物A的代谢产生轻微的抑制。在存在AST-3021情况下，在小鼠和大鼠细胞溶质中未检测到AST-2660。但是多数猴和人细胞溶质样品中，存在AST-3021时，AST-2660浓度减少至无法检测的水平。
以上实验证明：
i.化合物A与AST-3424的代谢机理类似：在细胞质内代谢；在NADPH、AKR1C3酶存在下代谢释放出DNA烷化剂AST-2660；在没有NADPH或没有AKR1C3酶时，也会代谢，但不会代谢释放DNA烷化剂AST-2660。
ii.在人和猴的肝细胞溶质中，化合物A的正常组代谢稳定性优于AST-3424，其半衰期更长，在作用于癌细胞时，化合物A能够发挥出比AST-3424更持久的抑癌效果。
6.2 肝微粒体稳定性实验
1)进行两个单独的实验。
1a)使用NADPH：将10μL的20mg/mL肝微粒体和40μL的10mM NADPH加入培养液中。微粒体和NADPH的终浓度分别为0.5mg/mL和1mM。
1b)没有NADPH：将10μL的20mg/mL肝微粒体和40μL的超纯H 2O加入培养液。微粒体的终浓度为0.5mg/mL。
2)加入终浓度为2μM的4μL200μM测试化合物溶液或对照化合物溶液(维拉帕米)开始反应，并在37℃下孵育。
3)在0和30分钟时从反应溶液中取出50μL等分试样。通过添加4体积的冷乙腈和四种内标(IS，100nM阿普***，200nM咖啡因，200nM拉贝洛尔和2μM酮洛芬)来终止反应溶液。将样品以3,220x g离心40分钟。将等份的100μL上清液与100μL超纯H 2O混合，然后用于LC-MS/MS分析。所有实验一式两份进行。测试结果如下表40。
表40：化合物A在肝微粒体稳定性实验中30分钟后的剩余量
Figure PCTCN2021129077-appb-000102
Figure PCTCN2021129077-appb-000103
上述实验结果表明，化合物A在人、猴和小鼠肝微粒体中相对稳定，在大鼠肝微粒体中相对不稳定。通过化合物A与AST-3424数据对比，发现化合物A在人、猴、大鼠和小鼠肝微粒体中均比AST-3424更稳定。
6.3 血浆稳定性实验
1)血浆准备
立即将冷冻的血浆在37℃水浴中融化。将血浆以3,220g离心10分钟以去除血块，并将上清液收集到新的试管中。检查并记录血浆的pH。注意：a自到达以来，仅使用融化不超过两次的血浆；b仅使用pH7至pH8范围内的血浆。
2)准备实验溶液
在DMSO中制备了1mM的测试化合物和对照化合物mevinolin的工作溶液。在乙腈中制备1mM的对照化合物丙烷溶液的工作溶液。将4μL的工作溶液加至796μL的预孵育血浆中，以达到5μM的最终浓度。溶剂的最终浓度为0.5％。
3)血浆稳定性的测试步骤
将50μL加标血浆的等分试样加到新试管中，并在37℃水浴中以大约60rpm的转速孵育2小时。该测定一式两份进行。在两小时温育结束时，将300μL室温淬灭溶液(含有内标(乙腈，100nM Alprazolam，500nM Labetalol和2μM酮洛芬)的乙腈)终止，以终止反应。通过将50μL加标血浆添加到装有300μL室温淬灭溶液的新管中，制备时间为0的样品。涡旋混合5分钟。将板中的样品在4℃下以3,220x g离心30分钟以沉淀蛋白质。将100μL上清液转移至新板中。上清液用100μL水稀释，充分混合并使用LC-MS/MS分析。
化合物A在不同物种血浆中2小时后的测试结果如下表41。
表41：不同物种血浆中2小时后的剩余百分比
化合物 种属 剩余百分比
化合物A 人 60.06
化合物A 大鼠 33.03
化合物A 小鼠 38.19
化合物A 猴 79.20
上述实验结果表明，化合物A在猴和人血浆中在2小时后仍然有79.20％和60.06％的剩余，其稳定性优于在大鼠和小鼠血浆中的稳定性。
七、最大耐受剂量(Maximal tolerance dose，MTD)实验
7.1 化合物A的MTD实验
评估食蟹猴单次30分钟静脉输注给予化合物A后的毒性反应及其毒代动力学特征。
7.1.1 实验过程：
8只健康适用的食蟹猴，雌雄各半，按照性别和体重随机分为4组，每组每性别1只动物。第1组是溶媒对照组，第2～4组分别是化合物A低(1mg/kg)、中(3mg/kg)、高(6mg/kg)剂量组。所有动物单次静脉输注30分钟给药，观察14天，第15天进行剖检。
所有动物在给药前进行1次详细临床观察和体检。除计划解剖日进行1次外，适应期 和实验期间每天进行2次笼边观察(上、下午各1次)。实验期间，第1～4组所有动物每天进行1～2次详细临床观察；分别于分组前、D1(给药前)、D3、D7、D10、D14称量一次体重，并在D15解剖前称量一次体重；除D3和D14外，每天测定一次24±1小时的耗食量；分别于适应期、D1给药前、给药后2～4h、给药后6～8h、D2(给药后24±1h)测量体温1次；分别于适应期和给药后2～4h各测一次心电图；分别于适应期、给药后2～4h和D14各测量一次血压。
临检血液样本采集前动物禁食过夜但不禁水。分别于适应期、D4和D15(计划解剖前)通过股静脉采集1次血样(约5mL)进行血液学、凝血和血清生化分析。同时提前一天收集尿液用于尿液分析。
第1组动物在给药前和给药后1h采集毒代样品，第2～4组动物在0h(给药前)、0.5h(给药后即刻)、0.75h、1h、1.25h、1.5h、2h、2.5h、4.5h和8.5h采集毒代样品。经股静脉采集约0.5mL/只/时间点血液样品，采集后置于含有肝素钠的抗凝管中，并保存在湿冰上。采集后2小时内在2～8℃条件下，6800g离心6min分离血浆。由研究机构生物分析实验室运用已建立的LC-MS/MS方法对血浆样品中的化合物A的浓度进行测定。使用WinNonlin7.0非房室模型计算Cmax、Tmax、AUC(0-t)、AUC(0-∞)、t1/2、Vss、Vz和Cl。
所有动物在计划解剖日(D15)通过静脉注射戊巴比妥钠实施安乐死，通过股动脉/静脉放血的方式确保动物死亡，然后进行大体解剖检查。
7.1.2 实验结果：
在本试验条件下，食蟹猴单次静脉输注给予0mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg化合物A后，所有动物均存活至计划解剖日。3mg/kg和6mg/kg化合物A组雌性动物在给药部位出现轻微红斑。6mg/kg化合物A组雌雄动物均可见软便。观察期间上述症状均恢复正常。化合物A的暴露量与剂量成正比。化合物A表现出中等至高的全身清除率，范围为1.34～2.72L/hr/kg；中等稳态分布容积，范围为1.80～3.64L/kg。综上，化合物A在本试验条件下的MTD(最大耐受剂量)大于6mg/kg。
7.2 化合物AST-3424的MTD实验
评价食蟹猴单次30分钟静脉滴注给予AST-3424注射液的最大耐受剂量
7.2.1 实验过程：
8只健康适用的食蟹猴，雌雄各半，按照性别和体重随机分为4组，每组每性别1只动物。第1组是溶媒对照组，第2～4组分别是AST-3424(含3.75％乙醇/1.25％丙二醇)低(0.5mg/kg)、中(1.0mg/kg)、高(1.5mg/kg)剂量组。所有动物单次静脉输注30分钟给药，观察28天，第29天进行剖检。
试验期间对以下参数进行评价：濒死死亡情况，临床观察，体重，摄食量，血液学、凝血和血清生化分析，ECG，体温，大体解剖和镜下组织病理学检查。
7.2.2 实验结果：
给予1.5mg/kg和1.0mg/kg剂量的AST-3424的雄性食蟹猴，分别在第8天和第16天有测试物相关的死亡现象出现。动物死亡前可见体瘦和稀便。此外，1.0mg/kg剂量组的雄性食蟹猴在处死前有以下表现：活动减少、体凉、体重下降、电解质紊乱(Na +下降、K +升高)、CK和BUN升高，大体解剖可见该动物心包膜内见淡黄色渗出物，结肠局部粘膜见暗红色斑块，肺脏左侧肺叶见两个白色斑块，斑块处质硬。该动物镜下可见肺脏及心脏明显的炎症反应，结肠的粘膜及粘膜下层出血及淋巴细胞坏死。在雌性猴中，没有发生供试品相关的死亡。但1.5mg/kg AST-3424组的雌猴出现体重减低、食物消耗减少、腹泻和呕吐。
雌猴在给予1.5mg/kg剂量的AST-3424后，血液学指标发生变化，包括红细胞(RBC)、血红蛋白和红细胞比容减少，网织红细胞百分比增加。网织红细胞百分比增加被认为是对 红细胞减少的再生反应。雄猴在给予1.0mg/kg剂量的AST-3424后白细胞计数(嗜中性粒细胞百分比)和纤维蛋白原增加，淋巴细胞百分比降低；以上现象与包括心脏和肺在内多种器官的炎症相关。此外，1.5mg/kg剂量组的雌猴在第14天可见总蛋白和白蛋白减少，并在第28天恢复。
综上所述，食蟹猴单次30分钟静脉滴注给予0.5、1.0和1.5mg/kg的AST-3424注射液，当剂量≥1.0mg/kg时可见雄猴出现死亡。因此，在本实验条件下，雄性和雌性食蟹猴单剂量给药最大耐受剂量分别为0.5mg/kg和1.5mg/kg。
通过上述一系列的实验，对比化合物A和AST-3424，可以发现：
(1)化合物A是固体，相较于AST-3424是液体，其具有便于储存和运输、计量，在制剂操作中更方便；
(2)化合物A具有与AST-3424相差不大的癌细胞杀灭作用，而且对AKR1C3酶活化具有更高的敏感性，特异性更强，实际上在PDX动物模型中，两者具有相近的治疗效果；
(3)相对于AST-3424是P-gp的底物，不能透过血脑屏障，新的AKR1C3活化的化合物A不是P-gp的底物，能透过血脑屏障，因此，新化合物A具有治疗中枢神经***特别是原发性脑部肿瘤或癌症以及转移至脑的转移性癌症、肿瘤的作用，实施例中提供的脑部肿瘤模型(NCI-H460-Luc2颅内接种的CDX模型)实验数据也证实A化合物具有治疗脑部肿瘤(脑转移)的效果，而AST-3424对于相同的模型没有治疗效果；
(4)化合物A在血浆和脑组织中的半衰期均较AST-3424长，因此，新化合物A在给药周期与剂量的设计等方面更优于AST-3424，而且能在脑组织中存在一定的时间而发挥药效；
(5)化合物A的最大耐受剂量(MTD)比AST-3424要大，显示化合物A可能具有更宽的给药剂量，患者更耐受；
(6)化合物A的R/S异构体化合物B和C具有与A相当的体外癌细胞增殖抑制活性，而且化合物A、B、C经AKR1C3酶的作用后释放出DNA烷化剂的作用机理相同，与R/S构型无关，因此可以判定化合物B、C同化合物A一样，也可以透过血脑屏障，进入中枢神经***特别是原发性脑部肿瘤或癌症组织以及转移至脑的转移性癌症、肿瘤组织而发挥抑癌疗效。

Claims (32)

  1. 具有以下任一结构式的化合物，或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100001
  2. 根据权利要求1所述的化合物，其中，所述盐为碱式盐或酸式盐，所述溶剂合物为水合物或醇合物。
  3. 根据权利要求2所述的化合物，其中，所述醇合物为乙醇合物。
  4. 根据权利要求1所述的化合物，其中，所述同位素变体的结构式如下：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100002
    其中，A各自独立地为H或D，且9个A中至少一个为D。
  5. 根据权利要求1或4所述的化合物，其中，所述同位素变体对应选自以下结构的氘代化合物：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100003
    Figure PCTCN2021129077-appb-100004
    Figure PCTCN2021129077-appb-100005
    Figure PCTCN2021129077-appb-100006
  6. 含有权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体的药物。
  7. 权利要求6所述的药物或权利要求1-5任一项所述的化合物用于治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的用途。
  8. 根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症或肿瘤为肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌。
  9. 根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症或肿瘤为原发性脑癌、脑肿瘤或转移至脑的转移性癌症或肿瘤。
  10. 权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药或溶剂合物或同位素变体在制备治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的药物中的用途。
  11. 根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症或肿瘤为肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌。
  12. 根据权利要求8或11所述的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌。
  13. 根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症或肿瘤为原发性脑癌、脑肿瘤或转移至脑的转移性癌症或肿瘤。
  14. 治疗癌症或肿瘤的方法，其包含a或b的步骤：
    a.测定患者癌细胞或组织的AKR1C3还原酶含量，如测得该AKR1C3还原酶含量等于或大于预定值，则向该患者投与权利要求6所述的药物；
    b.测定患者癌细胞或组织的AKR1C3还原酶对应RNA的表达水平，如测得该RNA的表达水平在预定值范围内，则向该患者投与权利要求6所述的药物。
  15. 治疗癌症或肿瘤的方法，其包含AKR1C3还原酶含量或表达水平调节步骤，当调节使得该AKR1C3还原酶含量或表达水平等于或大于预定值，则向该患者投与权利要求6所述的药物。
  16. 一种制备以下结构的任一化合物的方法，其包括使化合物I-1、I-2或I-3分别发生关环反应得到对应的化合物A、B或C：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100007
    Figure PCTCN2021129077-appb-100008
    其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘。
  17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述关环反应使用氧化银或硝酸银作为催化剂，反应中加入或不加入有机碱。
  18. 根据权利要求16所述的方法，其中，X均为溴。
  19. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺或三乙胺。
  20. 具有以下任一结构的化合物：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100009
    其中，X各自独立地为氟、氯、溴、碘。
  21. 权利要求20所述化合物的用途，其作为合成权利要求1所述化合物的中间体或用于制备治疗癌症患者或肿瘤患者或由癌症或肿瘤引发的病症或细胞增生性疾病的药物的用途。
  22. 一种制备以下结构的任一化合物的方法，其包括以化合物II-1、II-2或II-3作为起始反应物分别与三卤氧磷发生第一次反应得到中间体，然后该中间体与卤代乙胺或卤代乙胺的氢卤酸盐发生第二次反应，最后分别得到对应的化合物I-1、I-2或I-3：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100010
    其中，化合物I-1、I-2或I-3中的两个X各自独立地为氟、氯、溴、碘；
    三卤氧磷选自三氟氧磷、三氯氧磷、三溴氧磷、三碘氧磷，优选为三氯氧磷；
    三卤氧磷中的卤素原子与化合物I-1、I-2或I-3中的两个X可以相同也可以不同。
  23. 根据权利要求22所述的方法，其中，化合物I-1、I-2或I-3中的X均为溴，卤代乙胺为溴代乙胺，卤代乙胺的氢卤酸盐为溴代乙胺的氢溴酸盐。
  24. 具有以下任一结构的化合物：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100011
  25. 一种制备以下结构的任一化合物的方法，将化合物III-3与TMSCF 3接触反应，并经脱保护操作后水解得到消旋的醇II-1，对消旋的醇II-1进行手性拆分操作分别得到手性醇II-2和手性醇II-3。
    Figure PCTCN2021129077-appb-100012
  26. 根据权利要求25所述的方法，其中，脱保护操作使用的脱保护试剂为四丁基氟化铵，水解操作使用的是氟化铵、氯化铵水溶液或盐酸。
  27. 根据权利要求25所述的方法，其中，手性拆分的方法包括结晶法和化学拆分法。
  28. 一种用于将如权利要求1所述的化合物的外消旋体：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100013
    分离以得到其中一种对映异构体或在化合物中增浓该外消旋体的任一对映异构体过量的方法，其包含以下步骤：使该外消旋体化合物经过光学解析处理，其中通过包含固定相及流动相的手性层析法，其中该固定相包含以官能化多糖浸渍的硅胶，且其中该流动相包含醇及另一溶剂；
    所述醇为乙醇，另一溶剂为正己烷；
    所述手性层析法的操作过程中色谱柱的温度为38℃；
    所述官能化多糖为直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)。
  29. 一种用于将如权利要求1所述的化合物的外消旋体：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100014
    分离以得到其中一种对映异构体或在化合物中增浓该外消旋体的任一对映异构体过量的HPLC方法，其中，色谱柱为CHIRALPAK AD，流动相为乙醇，柱温为35℃。
  30. 制备以下结构的任一氘代化合物的方法，其包括使化合物IV-1至IV-21分别发生关环反应得到对应的氘代化合物V-1至V-15：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100015
    Figure PCTCN2021129077-appb-100016
    Figure PCTCN2021129077-appb-100017
    其中，IV-1至IV-21任一化合物中的两个X原子各自独立地为氟、氯、溴、碘，优选为溴；
    所述关环反应使用氧化银或硝酸银作为催化剂，反应中加入或不加入碱。
  31. 制备权利要求30所述IV-1至IV-21中任一化合物的方法，其包括以化合物II-1、II-2、II-3或其氘代物II-1a、II-2a、II-3a作为起始反应物分别与三卤氧磷发生第一次反应得到中间体，然后该中间体与对应的氘代卤代乙胺VI-1或VI-2，或氘代卤代乙胺VI-1或VI-2的氢卤酸盐发生第二次反应，最后得到对应的化合物IV-1至IV-21：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100018
    其中，化合物VI-1或VI-2中的X原子各自独立地为氟、氯、溴、碘，且与化合物IV-1至IV-21中的X原子具有对应关系；
    三卤氧磷选自三氟氧磷、三氯氧磷、三溴氧磷、三碘氧磷，优选为三氯氧磷；
    三卤氧磷中的卤素与任一化合物IV-1至IV-21中的两个X原子、化合物VI-1或VI-2中的X原子可以相同也可以不同；
    所述氘代卤代乙胺氢卤酸盐中氢卤酸盐中的卤素与氘代卤代乙胺中的卤素相同；
    优选地，卤代乙胺为溴代乙胺，卤代乙胺氢卤酸盐为溴代乙胺氢溴酸盐。
  32. 制备以下结构的任一化合物的方法，其包括以下步骤：以化合物
    Figure PCTCN2021129077-appb-100019
    为起始原料，反应得到化合物
    Figure PCTCN2021129077-appb-100020
    然后与式I-7-1、I-7-2或I-7-3分别反应得到相应的式A、B或C化合物：
    Figure PCTCN2021129077-appb-100021
    Figure PCTCN2021129077-appb-100022
    其中，Y 1和Y 2为卤素或OM，M为氢、钠、钾、镁或钙，卤素优选为溴。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530556A (zh) * 2015-03-10 2018-01-02 深圳艾衡昊医药科技有限公司 Dna烷化剂
CN108136214A (zh) * 2015-04-02 2018-06-08 深圳艾衡昊医药科技有限公司 硝基苄基衍生物抗癌试剂
CN108290911A (zh) * 2015-11-16 2018-07-17 深圳艾衡昊医药科技有限公司 (r)-及(s)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n’-双(伸乙基)胺基磷酸酯、组合物及其使用及制备方法
WO2020228685A1 (zh) * 2019-05-13 2020-11-19 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 含氟化合物及抗癌医药用途
WO2021083310A1 (zh) * 2019-11-01 2021-05-06 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 作为非pgp底物的抗癌化合物
WO2021120717A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 抗癌化合物及其医药用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530556A (zh) * 2015-03-10 2018-01-02 深圳艾衡昊医药科技有限公司 Dna烷化剂
CN108136214A (zh) * 2015-04-02 2018-06-08 深圳艾衡昊医药科技有限公司 硝基苄基衍生物抗癌试剂
CN108290911A (zh) * 2015-11-16 2018-07-17 深圳艾衡昊医药科技有限公司 (r)-及(s)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n’-双(伸乙基)胺基磷酸酯、组合物及其使用及制备方法
WO2020228685A1 (zh) * 2019-05-13 2020-11-19 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 含氟化合物及抗癌医药用途
WO2021083310A1 (zh) * 2019-11-01 2021-05-06 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 作为非pgp底物的抗癌化合物
WO2021120717A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 抗癌化合物及其医药用途

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