WO2023041712A1 - Souche bactérienne dans la prévention et/ou le traitement de pathologies inflammatoires - Google Patents

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WO2023041712A1
WO2023041712A1 PCT/EP2022/075781 EP2022075781W WO2023041712A1 WO 2023041712 A1 WO2023041712 A1 WO 2023041712A1 EP 2022075781 W EP2022075781 W EP 2022075781W WO 2023041712 A1 WO2023041712 A1 WO 2023041712A1
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WO
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strain
dsm
composition according
inflammatory
diseases
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Application number
PCT/EP2022/075781
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English (en)
Inventor
Georges Rawadi
Sandrine Paule CLAUS
Héloïse TUDELA
Katy LE CORF
Karima RELIZANI
Frédéric Elustondo
Original Assignee
Ysopia Biosciences
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Publication date
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a new bacterial strain belonging to the genus Christensenella, a composition comprising it and its uses, in particular as a medicament in the treatment and/or prevention of diseases such as metabolic diseases and/or inflammatory diseases.
  • intestinal microbiota or "intestinal flora” is made up of a set of bacteria, viruses, parasites and non-pathogenic fungi, i.e. 10 12 to 10 14 microorganisms present in the digestive tract of each individual, which represents 2 10 times more than the number of cells present in our body. Therefore, its role has been increasingly studied in recent years.
  • a microbiologist identified and cultured a new species from human faeces: Christensenella minuta, belonging to the gram-negative Clostridiales. (Morotomi et al., Description of Christensenella minuta gen. nov., sp.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • IBD chronic inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease and ulcerative colitis are the main ones.
  • These are recent, multifactorial diseases whose origin is unknown. In a certain number of cases, the appearance of these diseases could be linked to a genetic predisposition, to the environment, but also to the microbiota.
  • These diseases all have the particularity of presenting an inflammation of the intestine which induces a modification of the microbiota and then maintains the inflammation.
  • An objective of the present invention is therefore to provide a solution which is simple, effective and economical for restoring a healthy intestinal microbiota and therefore treating dysbiosis of the intestinal microbiota, in particular treating chronic inflammatory diseases, preferably by avoiding the administration of lifelong treatment and thus reduce the prevalence of these diseases.
  • the inventors have identified, among the multitude of bacteria present in the intestinal microbiota and among the strains already known belonging to the species Christensenella minuta, a new bacterial strain of specific Christensenella minuta deposited with the Leibniz DSMZ Institute (Deutsche Sammlung von Mikro expn und Zellkulturen GmbH, in French German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) under the number DSM 33715, particularly suitable for the prevention and / or treatment of intestinal dysbiosis, preferentially chronic inflammatory bowel diseases.
  • the invention relates to a bacterial strain of Christensenella minuta deposited under the number DSM 33715 and having for 16S rDNA sequence, the sequence SEQ ID NO: 1, as well as any strain comprising a nucleotide sequence having at least 99 90% identity of ANI (Average Nucleotide Identity - Average Nucleotide Identity) with the nucleotide sequence of the genome of the bacterial strain DSM 33715.
  • ANI Average Nucleotide Identity
  • the invention also relates to the supernatant of the culture of the bacterial strain according to the invention but also to a composition comprising (i) at least the bacterial strain according to the invention and/or (ii) the supernatant of the culture according to the invention and (iii) at least one acceptable excipient.
  • Said acceptable excipient preferably being a pharmaceutically acceptable excipient in the case of a product intended to be used as a medicament for human use or veterinary use.
  • the invention is particularly suitable for using said bacterial strain, said supernatant or said composition according to the invention as a medicament.
  • the present invention is particularly suitable for the prevention and/or treatment of so-called “non-transmissible” pathologies associated with dysbiosis of the intestinal microbiota or diseases associated with dysbiosis of the intestinal microbiota, in particular diseases such as diseases metabolic, inflammatory and other diseases which will be detailed below.
  • the invention aims to prevent and/or treat chronic inflammatory bowel diseases, more preferably Crohn's disease, or ulcerative colitis.
  • the invention also relates to the non-therapeutic use of the bacterial strain according to the invention, and/or of the supernatant according to the invention or of the composition according to the invention for maintaining and/or strengthening the intestinal microbiota and/or support the diversity of the intestinal microbiota and/or promote the increase of beneficial bacteria in the intestinal microbiota in a healthy subject.
  • Figure IA shows an image of a bacterium Christensenella minuta according to the invention produced by transmission electron microscopy in negative staining (magnification: 36kX).
  • Figure IB shows a characteristic MALDI spectrum of a pure culture of a Christensenella minuta strain according to the invention.
  • Figure 2A represents the immunomodulatory effect of the DSM 33715 bacterium on PBMCs cells (3 healthy donors tested)
  • FIG. 2B represents the anti-inflammatory effect of the bacterium DSM 33715 on a THP-1 line differentiated into MO type macrophages by treatment with PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate).
  • Figure 3 shows the immunomodulatory effect of the DSM 33715 bacterium and its supernatant on the colon adenocarcinoma line HT-29 producing IL-8 after stimulation with TNF- ⁇ .
  • Figure 4A shows the anti-inflammatory effect of DSM 33715 on the NF-0B inflammation signaling pathway. Activation of the NF-0B pathway by DSM 33715 in HT-29 cells transfected with a reporter system and stimulated with TNF- ⁇ , measured by luciferase activity and normalized by Renilla luminescence.
  • Figure 4B shows the anti-inflammatory effect of DSM 33715 on the JAK/STAT inflammation signaling pathway. Activation of the JAK/STAT pathway by DSM 33715 in HT-29 cells transfected with a reporter system and stimulated with IFN- ⁇ , measured by luciferase activity and normalized by Renilla luminescence.
  • Figure 5 represents the immunomodulatory effect of the supernatant of DSM 33715 on the colon adenocarcinoma line HT-29 producing IL-8 after stimulation with TNF-a, in the presence of an anti-inflammatory agent used in therapy, 5-ASA or Budesonide.
  • FIG. 6 represents the anti-inflammatory effect of DSM 33715 associated or not with Tofacitinib on the modulation of the signaling pathway of JAK/STAT inflammation induced by IFN- ⁇ -
  • the JAK/STAT pathway is activated in HT-29 cells transfected with a reporter system and stimulated with IFN- ⁇ , measured by luciferase activity and normalized by Renilla luminescence.
  • Figure 7 represents the effect of the DSM 33715 strain on the integrity of the intestinal barrier by measuring the transepithelial electrical resistance.
  • the PBS-Glycerol +/- TNF-a condition (control) corresponds to the bacteria resuspension medium.
  • Figure 8A is a histogram representing the average length of the colons, at the end of the experiment. The data is represented by the mean +/- SEM in centimeters for the length and in grams for the weight of the colon.
  • Figure 8B represents the inflammation of the colon at the macroscopic level calculated by the Wallace score.
  • Figure 8C represents the inflammation at the histological level calculated by the Ameho score. Data shown are means +/- SEM. MGG staining of colon sections for histological score evaluation (Ameho)
  • Figure 8D shows the levels of I L-ip (panel A) and Lipocalin-2 (panel B) in the colon.
  • the data represented correspond to the mean +/- SEM in ng/mg of protein.
  • Figure 9 represents the intensity of the inflammation and the lesions of the colon which were evaluated at the macroscopic level according to the Wallace score (panel A) and the intensity of the inflammatory lesions at the tissue level evaluated according to the histological score (panel B).
  • bacteria within the meaning of the invention, is meant a unicellular microorganism capable of reproducing by cell division. Bacteria are classified by family, genus, species. Each bacterial species includes a diversity of bacterial strains.
  • the bacterial strain according to the invention belongs to the Christensenellaceae family, the Christensenella genus and the minuta species.
  • bacterial strain or “strain” within the meaning of the invention, is therefore meant a specific bacterial strain but also all the bacteria derived from the strain or obtained from the strain or corresponding to the bacterial strain and having the same functions metabolic, for example, at least one bacterium taken from a colony derived from the strain.
  • bacteria(s) according to the invention within the meaning of the invention, is therefore also meant a bacterial strain according to the invention.
  • derived bacterial strain or “mutant strain” or “derived strain” within the meaning of the invention, is meant a bacterial strain having a strong similarity with the bacterial strain deposited under the number DSM 33715.
  • the strain comprises a nucleotide sequence having at least 99.90% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33715, more preferably at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93% , at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, or at least 99.99%
  • ANL identity [ 0040]
  • supernatant within the meaning of the invention is meant the culture supernatant of the bacterial strain according to the invention optionally comprising cellular compounds of said strain and/or cell debris of said strain, and/or metabolites and/or molecules secreted by said strain.
  • prevention within the meaning of the invention, is meant the reduction to a lesser degree of the risk or the probability of occurrence of a given phenomenon, that is to say, in the context of the present invention, dysbiosis of the intestinal microbiota and associated diseases, more preferably chronic inflammatory diseases, for example Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • treatment within the meaning of the invention, is meant a reduction in the progression of the disease, a stabilization, an inversion or regression, or even an interruption or inhibition of the progression of a dysbiosis of the intestinal microbiota and the associated diseases, more preferably chronic inflammatory diseases, for example Crohn's disease or ulcerative colitis. In the context of the invention, these terms also apply to one or more symptoms of said diseases of the present invention.
  • physiologically acceptable medium within the meaning of the invention is meant a medium which is compatible with the body of the individual to whom said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water, buffer, saline solutions. In particular, said medium is compatible with oral administration.
  • acceptable excipient within the meaning of the invention is meant any compound making it possible to facilitate the shaping of the composition and not modifying the nature of the biological activity of the active principle.
  • An acceptable excipient can be a solvent, buffer, saline solution, plasticizer, lubricant, dispersing medium, agents delaying absorption, flow agent, isotonic agent.
  • they are pharmaceutically acceptable excipients which are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients known to those skilled in the art and suitable for human and/or veterinary use. The excipient will thus be chosen according to the route of administration, for example suitable for oral, intravenous, intramuscular, topical administration, etc.
  • disease associated with a dysbiosis of the intestinal microbiota within the meaning of the invention, is meant the diseases associated with a dysbiosis of the intestinal microbiota such as certain metabolic diseases, for example diseases linked to obesity whose obesity, diabetes, NASH, hepatic or pancreatic steatosis; inflammatory diseases, in particular inflammatory bowel diseases, eg Crohn's disease, colitis ulcer disease, diverticulitis, gastritis, pancreatitis, or irritable bowel syndrome; but also chronic diseases associated with dysbiosis, heart and vascular diseases, cancers, for example metabolism-related cancers.
  • certain metabolic diseases for example diseases linked to obesity whose obesity, diabetes, NASH, hepatic or pancreatic steatosis
  • inflammatory diseases in particular inflammatory bowel diseases, eg Crohn's disease, colitis ulcer disease, diverticulitis, gastritis, pancreatitis, or irritable bowel syndrome
  • chronic diseases associated with dysbiosis heart and vascular
  • dysbiosis of the intestinal microbiota is meant within the meaning of the invention an imbalance of this microbiota which could favor the initiation, the maintenance or the severity of the inflammation.
  • a family of Escherichia coli (AIEC) more adherent to the cells of the intestinal wall and more invasive than the usual strains, which facilitate a local inflammatory reaction.
  • Potential causes of dysbiosis could be dietary (fatty and sugary diet, lacking fiber, which limits bacteria producing beneficial short-chain fatty acids), infectious (acute episodes of infectious gastroenteritis), or environmental (antibiotic treatments repeated, insufficient exposure to pathogens during childhood).
  • anti-inflammatory agent within the meaning of the invention a molecule, an active principle, a medicament, a pharmaceutical composition intended to combat inflammation.
  • a group of drugs intended to treat an inflammatory reaction and the resulting diseases such as inflammatory bowel diseases.
  • anti-inflammatory drugs of corticosteroids (or glucocorticoids or steroidal anti-inflammatory drugs) and non-steroidal anti-inflammatory drugs.
  • health subject within the meaning of the invention, is meant a subject who is not sick and not suffering from disease, in particular not suffering from a disease chosen from among chronic diseases and/or obesity and/ or metabolic diseases and/or inflammatory diseases and/or cancers.
  • the inventors discovered the bacterial strain of Christensenella minuta deposited under number DSM 33715, then isolated it from feces of a healthy human donor and demonstrated, in in vitro models, anti-inflammatory effects , in particular an immunomodulatory effect such as the induction of higher production of IL-10, an anti-inflammatory cytokine; and a decrease in certain signaling pathways such as the NF-0B pathway or the JAK/STAT pathway.
  • Results on a pre-clinical model of colitis induced by TNBS in rats confirm the anti-inflammatory effects of the strain, in especially in chronic inflammatory bowel disease.
  • said bacterial strain DSM 33715 makes it possible to restore or strengthen and therefore preserve the integrity of the intestinal barrier.
  • anti-inflammatory agents used clinically such as Pentasa (5-ASA), Tofacitinib or Budesonide, thus making it possible to consider the administration lower doses of such anti-inflammatory agents known for their toxicity and their undesirable effects in patients.
  • the present invention therefore relates to a bacterial strain of Christensenella minuta deposited under the number DSM 33715 hereinafter referred to as strain DSM 33715 having for 16S rDNA sequence, the sequence SEQ ID NO: 1.
  • 16S ribosomal RNA (16S rRNA) is the ribosomal RNA constituting the small subunit of the ribosomes of prokaryotes.
  • the genes encoding this RNA are called 16S rDNA.
  • the 16S rDNA sequence is widely used in phylogeny because of its highly conserved structure which makes it possible to reconstruct the evolutionary history of organisms and in particular prokaryotes and bacteria.
  • the percentage identity of the 16S rDNA sequence between two bacterial strains, more particularly between two strains of Christensenella minuta can be determined by the so-called BLAST method which is a heuristic research method well known to those skilled in the art. art. It makes it possible to find the similar regions between two or more sequences of nucleotides or amino acids, and to achieve an alignment of these homologous regions.
  • the 16S rDNA sequence does not always make it possible to differentiate between two strains of the same species which nevertheless have different properties, for example anti-inflammatory properties. Consequently, the person skilled in the art with his general knowledge is able to characterize a bacterial strain according to other parameters such as the calculation of phylogenetic distance based on the complete genome (ANI), the size of the genome, the number of CDS (Coding DNA Sequence or in French Coding DNA Sequence), but also the identification of genes specific to said strain of interest.
  • ANI complete genome
  • CDS Coding DNA Sequence
  • French Coding DNA Sequence French Coding DNA Sequence
  • ANI is meant in the sense of the invention the average percentage identity of the nucleotides calculated from the two-by-two comparison of all the genome sequences shared between the two bacterial strains.
  • the genomic DNA can be extracted from a pure bacterial culture derived from said strain of interest, followed by DNA sequencing according to various well-known methods, for example Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore then the genome sequenced is assembled by bioinformatics and the sequences obtained are analyzed. Finally, the genomes of interest are compared two by two to calculate the ANI.
  • the invention also relates to a bacterial strain derived from Christensenella minuta, characterized in that it comprises a nucleotide sequence having at least 99.90% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33715.
  • said strain according to the invention comprises a nucleotide sequence having at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, at least 99.99% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33715.
  • Such a strain is therefore a bacterial strain of Christensenella minuta derived from the bacterial strain deposited under the number DSM 33715 making it possible to maintain or improve the described capacities of the strain DSM 33715 in the context of the present invention.
  • Said derived strain can thus be produced naturally or intentionally, by mutagenesis methods known in the state of the art.
  • the mutagenesis methods that can be implemented in the context of the present invention are the growth of the original microorganism in the presence of mutagenic or stress-producing agents, or by genetic engineering aimed at modifying genes specific or not such as directed mutagenesis or random mutagenesis.
  • the strain derived from the DSM 33715 strain of C. minuta is a genetically modified mutant.
  • the invention relates to the strain of Christensenella minuta deposited under number DSM 33715 with the Leibniz DSMZ Institute (Deutsche Sammlung von Mikroorganisationn und Zellkulturen GmbH, in French German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH).
  • Said strain has the 16S rDNA sequence, the sequence SEQ ID NO:1.
  • the culture supernatant obtained from the bacterial strain DSM 33715 and/or the derived strain comprises at least one of the constituents chosen from a bacterial cell compound, a bacterial cell debris, a metabolite and/or a molecule(s) secreted by the strain and/or the derived strain, or combinations thereof.
  • the cellular compounds and/or cellular debris can be wall components, nucleic acids, membrane components, proteins, lipids, etc.
  • the metabolites or molecules secreted can be any molecule produced or modified by the bacterium due to its metabolic activity during its growth, its use in technological processes (for example, but not limited to, production of food or medicine).
  • the metabolites or molecules can be proteins, amino acids, enzymes, lipids, nucleic acids, etc.
  • metabolite and/or one or more molecule(s) secreted by the strain and/or the derived strain is meant a molecule produced and exported or released outside the bacterium by the bacterium.
  • the invention also relates to the culture supernatant obtained from the bacterial strain according to the invention.
  • strain(s) according to the invention or derived strain(s) and/or the culture supernatant described above and the bacteria derived from said strains are advantageously administered in a composition.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising: (i) at least one bacterial strain according to the invention and/or (ii) a supernatant according to the invention and (iii) at least one acceptable excipient.
  • the composition comprises at least one bacterial strain deposited under the number DSM 33715 and/or at least one strain having at least 99.5% identity with the 16S rDNA sequence of the DSM 33715 strain and / or the culture supernatant obtained from said strains and at least one acceptable excipient and/or a physiologically acceptable medium.
  • the composition may comprise the bacterial strain according to the invention in any form producing the expected effects and the efficacy described in the present application.
  • the strain can be in living form (cultivable or not), dead, semi-living, attenuated or inactivated.
  • the dead, semi-living, attenuated or inactivated form can be obtained by various techniques known to those skilled in the art. Examples include the following techniques: irradiation, thermal inactivation or lyophilization, in particular by heat, exposure to an appropriate pH, UV, gamma rays, X-rays or high pressure.
  • semi-living is meant a bacterium with low physiological activity whose ability to proliferate is reduced, temporarily or permanently.
  • inactivated designates a bacterium which is no longer capable, temporarily or permanently, of proliferating.
  • dead designates a bacterium which is no longer capable, definitively, of proliferating.
  • Dead or inactivated bacteria may have intact or ruptured cell membranes.
  • inactivated also designates the extracts and lysates of bacteria obtained.
  • composition according to the invention may also comprise at least one additional compound.
  • An additional compound may in particular be an ingredient, a molecule, an active principle, a microorganism, a bacterium or a mixture of bacteria.
  • the additional compound is a different microorganism from the bacterial strain according to the invention or from the derived strain.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Christensenella.
  • the additional compound is a probiotic and/or a prebiotic.
  • the prebiotic may, for example, be at least one prebiotic chosen from galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, inulins, arabinoxylans, beta-glucans, lactoglobulins and/or beta-caseins.
  • the additional compound can be:
  • At least one bacterium producing lactic acid which makes it possible to create an anaerobic environment favorable to Christensenellacées, such as at least one bacterium chosen from bacteria of the genus Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. and or
  • At least one bacterium producing butyric acid which makes it possible to create an environment favorable to Christensenellacées such as a bacterium of the genera Ruminococcaceae and Lachnospiraceae,
  • At least one other organism favoring the anaerobic conditions necessary for the survival of Christensenellacées such as at least one yeast chosen from Saccharomyces spp. or microorganisms of the Methanobacteriaceae family
  • bacterium associated with the Christensenellaceae ecosystem because they facilitate their survival in the intestine, such as at least one bacterium chosen from bacteria of the phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, and Verrucomicrobia, and/or
  • At least one polyphenol such as for example at least one polyphenol chosen from quercetin, kaempferol, resveratrol, flavones (such as luteolin), flavan-3-ols or catechins, flavanones (such as naringinin), isoflavones, anthocyanidins, oligo-proanthocyanidins, and/or
  • non-steroidal anti-inflammatories antibodies directed against pro-inflammatory targets (such as anti-TNF-alpha or anti-IL6), antirheumatics, analgesics, antimicrobials, corticosteroids, anabolics steroids, antidiabetics, thyroid agents, antidiarrheals, antitussives, antiemetics, antiulcers, laxatives, anticoagulants, erythropoietin, immunoglobulins, immunosuppressants, growth hormones, hormonal drugs, modulators of estrogen receptors, alkylating agents, antimetabolites, mitotic inhibitors, radiopharmaceuticals, anti-depressants, antipsychotics, anxiolytics, hypnotics, sympathomimetics, stimulants, donepezil, tacrine, asthma medications , beta-agonists, inhaled steroids, leukotriene inhibitors, cro moglycates or cromoglycidic acids,
  • pro-inflammatory targets such as anti-TNF-
  • the microorganism is preferably chosen from Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii, Anaerobutiryricum hallii, Hafnia alvei, Roseburia intestinalis, Roseburia hominis, Roseburia faecis, Roseburia inulinivorans, Dysosmobacter welbionis, Oscillospira guillermondii, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus casei, Latilactobacillus sakei, Ligilactobacillus salivarius, Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Levilactobacillus brevis, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animal
  • the additional compound is a pharmaceutical active ingredient
  • it is preferably an active ingredient chosen from 5-ASA, mesalamine, olsalazine, budesonide, tofacitinib, filgotinib, upadacitinib, infliximab, adalimumab, golimumab, certolizumab, vedolizumab and ustekinumab.
  • the composition according to the invention is in any form acceptable for administration to a subject, preferably a human or non-human animal subject.
  • the composition according to the invention is also aimed at veterinary uses.
  • composition according to the invention is in solid, liquid or freeze-dried form.
  • composition when in liquid form, it may in particular comprise bacterial strains according to the invention and/or the derived strain and/or a physiologically acceptable culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as, for example, preferably anaerobic Columbia agar medium enriched with sheep's blood, or an equivalent medium containing no product derived from animal origin.
  • bacterial strains according to the invention and/or the derived strain and/or a physiologically acceptable culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as, for example, preferably anaerobic Columbia agar medium enriched with sheep's blood, or an equivalent medium containing no product derived from animal origin.
  • the bacterial strains according to the invention and/or the derived strain may be present in freeze-dried form, and may also comprise excipients such as, for example, microcrystalline cellulose. , lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum, calcium lactate, magnesium sulfate, sodium citrate, calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, maltodextrin , galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, pectins, beta-glucans, lactoglobulins, isomaltooligosaccharides, polydextroses, mannitol, sorbitol and/or glycerol.
  • excipients such as, for example, microcrystalline cellulose. , lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amy
  • the composition according to the invention is in a form suitable for oral, nasal, parenteral, rectal, sublingual, ocular, auricular, intramuscular, intravenous, inhaled or cutaneous administration.
  • composition can be in any suitable form.
  • the composition according to the invention may be in a form chosen from a powder, powder capsule, capsule, tablet, lozenge, granules, emulsion, suspension, suppository, inhaler and syrup.
  • the composition according to the invention may be in a gastro-resistant form, for example a coated tablet containing microencapsulated bacteria.
  • Said composition can thus be provided with an enteric coating that is resistant to gastric juice, in order to ensure that the bacterium or bacteria included in said composition can cross the stomach. The release of the bacterium(ies) may thus occur for the first time in the upper intestinal tract.
  • the composition comprises 10 4 to 10 12 colony forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered preferably 10 6 to 10 12 colony forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered.
  • CFU colony forming units
  • this corresponds to a daily dose of bacteria to be administered, regardless of the weight of the person or the animal.
  • this dose is administered all at once.
  • the useful composition comprises 10 5 to 10 11 CFU or 10 7 to 10 11 CFU of bacteria per daily dose to be administered, even more preferentially 10 9 CFU.
  • Said bacteria are a mixture of bacteria corresponding to or originating from the bacterial strain DSM 33715 and/or corresponding to the derived strain.
  • CFU Cold Forming Unit
  • UFC Coldy Forming Unit
  • the daily dose is measured per gram or milliliter of the composition according to the final invention.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of bacteria, said mixture comprising at least live bacteria
  • the composition preferably comprises at least 1% of live bacteria (by number), more preferably at least 10% live bacteria (by number), even more preferably at least 50% live bacteria (by number).
  • the live bacteria are preferably a mixture of bacteria corresponding to the bacterial strain DSM 33715 and/or corresponding to the derived strain having at least 99.90% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33715
  • the composition according to the invention including it may in particular comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 5 to 95% by weight, in particular from 10 to 90% by weight and more particularly from 15 to 85% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a composition according to the invention may comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 5 to 95%, in particular from 10 to 90% by weight, more particularly from 15 to 85% by weight, of supernatant relative to the total weight of the composition.
  • the composition when the composition is intended for therapeutic use, the composition may comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the composition according to the invention is preferably a pharmaceutical composition.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more ingredients included in the composition according to the invention and according to any one of the embodiments described above.
  • Said pharmaceutical composition according to the invention has at least one application in improving the physical, physiological or psychological well-being of a sick subject, which results in an improvement in the general state of health of said subject or reduced risk of disease.
  • Said pharmaceutical composition is a medicine.
  • composition according to the invention may be in the form of a food product, a drink, a nutraceutical, a food additive, a food supplement or a dairy product.
  • composition according to the invention when included in a food supplement for oral administration, it may be in the form of capsules, capsules, soft capsules, tablets, sugar-coated tablets, pills , pastes, lozenges, gums, drinkable solutions or emulsions, syrup or gel.
  • a food supplement according to the present invention may further comprise a sweetener, a stabilizer, an antioxidant, an additive, a flavoring agent and/or a colorant.
  • the formulation thereof is carried out by means of the usual methods for producing sugar-coated tablets, capsules, gels, hydrogels for controlled release, emulsions, tablets or capsules.
  • a composition according to the present invention can also be in the form of a nutritional composition.
  • a nutritional composition according to the present invention may be in the form of a yoghurt, a cereal bar, a breakfast cereal, a dessert, a frozen food, a soup, a pet food, a suspension liquid, powder, tablet, gum or candy.
  • a nutritional composition according to the present invention may also comprise at least one ingredient chosen from: antioxidants, fish oils, DHA, EPA, vitamins, minerals, phytonutrients, a protein, a lipid, probiotics , prebiotics and combinations thereof.
  • the invention therefore relates to the bacterial strain according to the invention and/or the derived strain, the supernatant according to the invention, more particularly the composition according to the invention for its use as a medicament.
  • the invention makes it possible to provide an effective quantity of bacterial strains according to the invention or of the derived strain, for its use as a medicament.
  • medicament in the context of the present invention refers to human or veterinary use, said medicament is then administered to a human subject or a non-human animal subject.
  • human subject it is also meant an adult or a child or a baby, including a newborn or an infant.
  • the composition according to the invention is intended for use in the prevention and/or treatment of dysbiosis of the microbiota, in particular of the intestinal microbiota and/or diseases associated with dysbiosis of the intestinal microbiota and/ or chronic diseases and/or obesity and/or metabolic diseases and/or inflammatory diseases and/or cancers.
  • composition according to the invention is intended for use in the prevention and/or treatment of chronic inflammatory bowel diseases, in particular of a disease chosen from Crohn's disease, ulcerative colitis, ulcerative-hemorrhagic recto-colitis, diverticulitis, esophagitis, gastritis, pancreatitis, ulcer gastroduodenal, irritable bowel syndrome.
  • chronic inflammatory bowel diseases in particular of a disease chosen from Crohn's disease, ulcerative colitis, ulcerative-hemorrhagic recto-colitis, diverticulitis, esophagitis, gastritis, pancreatitis, ulcer gastroduodenal, irritable bowel syndrome.
  • the invention also relates to the composition according to the invention for its use as a medicament, in the prevention and/or treatment of at least one disease chosen from:
  • Metabolic diseases chosen from non-insulin-dependent diabetes, gestational diabetes, NASH, hepatic steatosis, pancreatic steatosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, infertility linked to overweight, urinary incontinence linked to overweight,
  • vascular diseases chosen from among atherosclerosis, thrombopathies, acute pericarditis and chronic constrictive pericarditis, arterial hypertension, vasculitis
  • liver and bile ducts chosen from hepatitis, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, cirrhosis, hepatic encephalopathy, vesicular lithiasis
  • osteopenia chosen from osteopenia, osteoporosis, osteoarthritis, inflammation of the vertebral discs
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease
  • motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, primary lateral sclerosis and Kennedy's disease
  • cancers linked to metabolism and/or dysbiosis of the microbiota chosen from hepatocarcinomas, cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer, pancreatic carcinoma, neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system, hepatic tumors, tumors of the gallbladder and bile ducts, kidney tumors, glioblastomas, lymphomas, multiple myelomas, chronic myeloid leukemia, chronic myeloproliferative diseases, lung carcinomas
  • hepatocarcinomas cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer
  • pancreatic carcinoma neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system
  • hepatic tumors tumors of the gallbladder and bile ducts
  • kidney tumors glioblastomas
  • lymphomas multiple myelomas
  • chronic myeloid leukemia chronic myelop
  • autoimmune diseases chosen from insulin-dependent diabetes, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus, polyendocrine autoimmune syndrome
  • atopic dermatological diseases chosen from eczema, psoriasis - chronic inflammatory bowel diseases, chosen from Crohn's disease, ulcerative-hemorrhagic recto-colitis, diverticulitis, esophagitis, gastritis, pancreatitis, peptic ulcer, irritable bowel syndrome
  • - respiratory function disorders chosen from asthma, cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary diseases and chronic bronchitis, interstitial lung diseases and pulmonary fibrosis, sleep apnea syndrome (OSAS)
  • - pneumonia chosen from infectious pneumonia, influenza pneumonia and avian flu, severe acute respiratory syndrome (SARS), Pneumocystis pneumonia
  • Infectious diarrhoea chosen from Clostridium difficile infection, EHEC infection, Salmonella gastroenteritis, Campylobacter enteritis, food poisoning by enterotoxin-producing bacteria, cholera, yersiniosis, shigellosis, cryptosporidiosis, listeriosis
  • nephrology linked to a dysbiosis of the microbiota, chosen from urethritis, chronic renal failure, urolithiasis
  • the invention also relates to a non-therapeutic use of the composition according to the invention for maintaining and/or strengthening the intestinal microbiota and/or supporting the diversity of the intestinal microbiota and/or promoting the increase in beneficial bacteria in the intestinal microbiota and/or promote weight loss in a healthy subject.
  • the composition aims to strengthen the intestinal microbiota and/or support the diversity of the intestinal microbiota and/or promote the increase of beneficial bacteria in the intestinal microbiota and/or promote weight loss in a healthy subject
  • the composition is in the form of a food product, a drink, a nutraceutical, food additive, food supplement or dairy product.
  • the invention is now illustrated by examples of useful bacteria according to the invention, methods for culturing these bacteria, examples of compositions containing them and test results demonstrating their effectiveness, presented solely as an indication. 'drawing.
  • Example 1 Characterization of C. minuta according to the invention filed under number DSM 33715.
  • the bacterial strain C. minuta DSM 33715 can be characterized according to the following methods.
  • the native bacteria of the DSM 33715 strain (10 ⁇ L of culture medium dosed at 10 9 CFU/mL) were deposited on ionized carbon grids (Delta Microscopy, Toulouse, France) and a negative staining was carried out with Nano-Tungsten (Nano-W, Nanoprobes, LFG Distribution, France).
  • the oxidase activity was determined using oxidase test strips (Sigma-Aldrich) by evaluating the color change after adding a drop of liquid bacterial culture.
  • the catalase activity was determined at two concentrations of FbCh (3 and 15%), added to a colony of DSM 33715, the catalase status being assessed visually by the formation of bubbles.
  • Bile and pH tolerance were evaluated in liquid modified GAM (HyServe) medium.
  • media containing 0-2-4-6 and 8% Oxgall (Difco Laboratories) were used, corresponding to 0-20-40-60 and 80% bile, respectively.
  • pH tolerance media at pH 4-5-6-7 and 8 were used. All the media were degassed in the anaerobic chamber before inoculation with 10 ⁇ l of a McFarland 0.5 bacterial suspension. The optical density at 600 nm was taken at Oh, 24h, 48h, 72h and 96h.
  • the antibiotic resistance tests were carried out using the minimum concentration (MIC) according to the reference method of dilution in agar medium of the CLSI (Clinical and laboratory Standards Institute).
  • Stock solutions of each antibiotic were prepared and sterilized by filtration at 0.2 ⁇ : ampicillin (Sigma-Aldrich), tetracycline (Sigma-Aldrich, Chloramphenicol (Sigma-Aldrich), clindamycin (Sigma-Aldrich), meropenem (USP) , piperacillin (USP), tazobactam (USP), and ceftriaxone (USP) Brucella agar medium (BD BBL) supplemented with 5 ⁇ g/ml hemin (Sigma-Aldrich), 1 ⁇ g/ml vitamin Kl (Sigma-Aldrich) Aldrich) and 5% (v/v) hemolyzed (laced) sheep blood (Hemostat) was used as test medium.Agar plates with different MIC
  • the inoculum of DSM 33715 was resuspended in McFarland's standard 0.5 in peptone water. 2 ⁇ l of the inoculum were deposited on the surface of the agar (each spot corresponding approximately to 10 5 CFU/ml). triplicate is carried out by concentration of antibiotic. The dishes were then incubated for 6 days at 37°C under anaerobic conditions. eu. MIC values were determined according to CLSI guidelines and were interpreted as susceptible, intermediate, or resistant, based on CLSI anaerobe breakpoints.
  • the DSM 33715 strain is strictly anaerobic with an exponential growth phase between 20 and 40 h and a stationary phase beginning at 40 h, non-motile, non-spore forming, negative for oxidase and catalase activity and is gram negative. DSM 33715 is negative for the majority of the enzymes tested, except for the acidification of glucose, xylose, rhamnose and arabinose, which is consistent with the description of Christensenella minuta made by Morotomi et al.
  • DSM 33715 also shows growth in a medium with a pH ranging from 6 to 9. Finally, the DSM 33715 strain shows resistance to ampicillin and tetracycline.
  • FIG. 1A represents the image of a bacterium Christensenella minuta according to the invention produced by transmission electron microscopy in negative staining (magnification: 36kX).
  • the stump has a short shape with the ends tapered, occurring in singlet, pairs or rosettes.
  • the strain according to the invention can also be characterized by the analysis of a MALDI spectrum.
  • a pure culture of the DSM 33715 strain is incubated in an agar medium and subjected to matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) analysis using a MALDI Biotyper instrument (Bruker) and using the standard method recommended by the manufacturer.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption-ionization
  • FIG. 1 Identification by MALDI is a known method for identifying a bacterial colony at the genus and species level. This is characteristic of the molecular composition of the surface of said bacterium.
  • Figure IB represents the characteristic MALDI spectrum of a pure culture of Christensenella minuta according to the invention (DSM 33715). This makes it possible to confirm that said strain belongs to the species C. minuta and thus to validate the purity of the culture.
  • Example 2 Comparison between the strain according to the invention (DSM 33715) and strains of C. minuta of the prior art.
  • the inventors also compared the strain according to the invention (DSM 33715) with known strains of C. minuta such as the reference strain deposited under number DSM 22607, the strain deposited under number DSM 32891 and the strain filed under DSM number 33407 according to several parameters such as 16S rDNA sequence, genome size in base pair (bp), phylogenetic distance based on the whole genome (ANI), coding sequence number (CDS ) and examples of strain-specific genes.
  • DSM 33715 known strains of C. minuta
  • known strains of C. minuta such as the reference strain deposited under number DSM 22607, the strain deposited under number DSM 32891 and the strain filed under DSM number 33407 according to several parameters such as 16S rDNA sequence, genome size in base pair (bp), phylogenetic distance based on the whole genome (ANI), coding sequence number (CDS ) and examples of strain-specific genes.
  • the strain according to the invention (DSM 33715) has the same 16S rDNA sequence as the three other strains of C. minuta already known, despite different metabolic properties and anti-inflammatory potential.
  • the size of the genome, the whole of the genome, the number of coding sequences and certain genes specific to said strain make it possible to characterize and differentiate between the strains.
  • the strain according to the invention has the largest genome and a greater number of coding sequences than the strains already known.
  • Example 2 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the inventors studied the pro- and anti-inflammatory immunomodulatory effect of the DSM 33715 strain.
  • the study protocol is as follows.
  • PBMCs from 3 healthy donors were seeded in 24-well plates at 1 ⁇ 10 6 with 11 ⁇ l/well in RPMI medium (Gibco) supplemented with 2% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37°C/5% CO2 for 24 hours in the presence of the DSM 33715 bacterium at an MOI of 50 or bacterial medium-Glycerol as a control. After 24 h, the cell culture supernatants were collected and stored at ⁇ 80° C. until quantification of IL-10 by ELISA. The IL-10 assay was performed by specific BioLegend ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 460 nm was read using the FluoStar Omega microplate reader, BMG Labtech.
  • the THP-1 cells (ECACC) were seeded at 5 ⁇ 10 5 cells/well in 24-well plates in RPMI medium (Gibco) supplemented with 10% FCS (Gibco) in the presence of 100 ng/ml of PMA ( Enzo Life Sciences) for 48 hours, in order to differentiate monocytic cells into MO type macrophages.
  • the cells were then washed with PBS-1X (Gibco) and cultured for an additional 24 hours in RPMI medium with 2% FCS.
  • the cells were then stimulated for 24 hours with the bacterium DSM 33715 at an MOI of 50 or with PBSIX-Glycerol as a control. After 24 h, the cell culture supernatants were collected and stored at ⁇ 80° C.
  • IL-10 assay was performed by specific BioLegend ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 460 nm was read using the FluoStar Omega microplate reader, BMG Labtech.
  • the chemokine IL-10 is an anti-inflammatory cytokine.
  • the values represent the secretion of IL-10 induced by the strain according to the invention (DSM 33715).
  • DSM 33715 induces a production of IL-10 greater than a reference strain of C. minuta DSM 22607 (FIG. 2A).
  • the induction of production of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, by DSM 33715 was also demonstrated by the THP-1 cell model differentiated into macrophage type MO by treatment with PMA (FIG. 2B) .
  • the DSM 33715 strain thus exhibits a greater anti-inflammatory immunomodulatory effect than the reference strain of C. minuta and therefore has a high therapeutic potential in inflammatory diseases.
  • Example 3 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of the DSM 33715 strain on a colon adenocarcinoma line HT-29 producing IL-8 after TNF- ⁇ stimulation.
  • the HT-29 cells (ECACC) were seeded in 24-well plates at 3x10 5 cells/well in McCoy's 5A medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37° C/5% CO2 for 24 hours. The cells were washed with PBS-1X (Gibco) and cultured for an additional 24 h in McCoy's 5A medium at 2% FCS. The cells were then stimulated for 6 hours with 5 ng/ml of TNF-a in the presence of 50 bacteria per 1 HT-29 cell (MOI 50) of DSM 33715 or 10% of supernatant or PBSIX-Glycerol or culture medium bacterial as controls (ctrl).
  • DSM 22607 is the reference strain.
  • 5-ASA (20 mM) is an anti-inflammatory agent used in control.
  • the cell culture supernatants were collected and stored at ⁇ 80° C. until quantification of IL-8 by ELISA.
  • the IL-8 assay was performed by specific BioLegend ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 460 nm was read using the FluoStar Omega microplate reader, BMG Labtech. 6 independent experiments were carried out in duplicate.
  • the HT-29 cells were stimulated with the pro-inflammatory cytokine TNF-a and the DSM 33715 bacterium at an MOI of 50 at the start of the stationary phase of growth or of its supernatant, for 6 hours.
  • the chemokine IL-8 is secreted by HT-29 in a TNF-a (Ctrl)-induced inflammatory state.
  • the values represent the average normalized in percentage compared to the control + TNF-a (PBS-Glycerol for the bacteria and the bacterial culture medium for the supernatant), representing the secretion of IL-8 induced by stimulation with TNF-a, i.e. 100%.
  • the secretion of IL-8 is reduced by 50% compared with the control (p ⁇ 0.0001, Dunnett's multiple comparisons test).
  • the DSM 33715 strain and its supernatant exhibits an anti-inflammatory immunomodulatory effect.
  • Example 4 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of the DSM 33715 strain on the NF-0B and JAK/STAT inflammation signaling pathways.
  • Transfection complexes were mixed gently and incubated at room temperature for 15 minutes. After incubation, the transfection complexes were added to freshly resuspended HT-29 cells at the appropriate density in McCoy's 5A medium supplemented with 10% FCS, then the cell/transfection complex mixtures were gently homogenized and plated. The plates were incubated for 24 hours in a humid atmosphere at 5% CO2 and the medium was then replaced with medium containing 2% FCS for 12 hours, after washing in PBS IX.
  • the medium was removed and replaced with 2% FCS medium +/- 5 ng/ml of TNF-a (NF-0B reporter system) or 100 pg/ml of IFN- ⁇ (system JAK/STAT reporter) and 10% of DSM 33715 supernatant or bacterial culture medium as control or the specific inhibitor of the signaling pathway (5 pM BAY11-7082 for the NF-0B pathway and 1 pM Tofacitinib for the JAK/STAT).
  • TNF-a NF-0B reporter system
  • IFN- ⁇ system JAK/STAT reporter
  • the cells were washed with PBS IX and lysed in 50 ⁇ l of passive lysis buffer (Promega) for 15 min at room temperature with orbital agitation, the protein lysates were then transferred into microtubes.
  • a Luciferase reporter assay (Dual-Luciferase reporter assay, Promega) was performed with minor modifications to the manufacturer's instructions. Briefly, 2x20 ⁇ l of lysate was transferred to a white 96-well plate, and 50 ⁇ l of LAR II reagent was added. Firefly luciferase activity was read.
  • the supernatant of DSM 33715 leads to a decrease in the activation of the NF-0B pathway induced by TNF- ⁇ by 25% and a decrease in the activation of the JAK/STAT pathway induced by IFN- y of 40%.
  • these pathways are particularly relevant because they are hyperactive in patients with chronic inflammation such as Crohn's disease, but also certain cancers.
  • the N F-KB pathway is involved in cancers of epithelial origin, such as breast cancer; in gastrointestinal cancers, such as colorectal cancer.
  • Jak/STAT pathway is overactivated in mainly solid cancers, such as breast, lung, liver, head, neck and stomach cancer.
  • Example 5 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention in combination with an anti-inflammatory agent.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of the DSM 33715 strain in combination with 5-ASA or Budesonide.
  • the HT-29 cells (ECACC) were seeded in a 24-well plate at 3 ⁇ 10 5 cells/well in McCoy's 5A medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37° C/5% CO2 for 24 hours.
  • the cells were washed with PBS-1X (Gibco) and cultured for an additional 24 h in McCoy's 5A medium at 2% FCS.
  • the cells were then stimulated for 6 hours with 5 ng/ml of TNF- ⁇ in the presence of 10% of stationary phase supernatant of DSM 33715 or of bacterial culture medium as control (ctrl), in the presence or not of agents anti-inflammatories.
  • 5-ASA (10 mM) and budesonide (20 pM) are molecules used in the treatment of inflammatory diseases, such as rectocolitis and Crohn's disease.
  • the cell culture supernatants were collected and stored at ⁇ 80° C. until quantification of IL-8 by ELISA.
  • the IL-8 assay was performed by specific BioLegend ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 460 nm was read using the FluoStar Omega microplate reader, BMG Labtech. Statistics: Sidak's multiple comparisons test. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001.
  • the HT-29 cells were stimulated with the pro-inflammatory cytokine TNF-a and 10% of the DSM supernatant. 33715 in the presence or absence of 5-ASA or Budesonide, for 6 hours.
  • the chemokine IL-8 is secreted by HT-29 in a TNF-a (Ctrl)-induced inflammatory state.
  • the values represent the average normalized in percentage compared to the control + TNF-a, representing the secretion of IL-8 induced by stimulation with TNF-a, that is to say 100%.
  • Example 6 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention in combination with a JAK inhibitor.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of DSM 33715 associated or not with Tofacitinib on the modulation of the signaling pathway of JAK/STAT inflammation induced by IFN- ⁇ .
  • Transfection complexes were mixed gently and incubated at room temperature for 15 minutes. After incubation, the transfection complexes were added to freshly resuspended HT-29 cells at the appropriate density in McCoy's 5A medium supplemented with 10% FCS, then the cell/transfection complex mixtures were gently homogenized and plated. The plates were incubated for 24 hours in a humid atmosphere at 5% CO2 and the medium was then replaced with medium containing 2% FCS for 12 hours, after washing in PBS IX.
  • the medium was removed and replaced with 2% FCS medium +/- 100 pg/ml IFN- ⁇ (JAK/STAT reporter system) and 10% DSM 33715 supernatant or medium of bacterial culture as a control or the specific inhibitor of the signaling pathway (5 pM BAY11-7082 for the NF-0B pathway and 1 pM Tofacitinib for the JAK/STAT pathway).
  • the cells were washed with PBS IX and lysed in 50 ⁇ l of passive lysis buffer (Promega) for 15 min at room temperature with orbital agitation, the protein lysates were then transferred into microtubes.
  • a Luciferase reporter assay (Dual-Luciferase reporter assay, Promega) was performed with minor modifications to the manufacturer's instructions. Briefly, 2x20 ⁇ l of lysate was transferred to a white 96-well plate, and 50 ⁇ l of LAR II reagent was added. Firefly luciferase activity was read. Then 50 ⁇ l of Stop&GIo reagent were added and the Renilla activity measurement was read with the FLUOstar Omega plate reader (BMG Labtech). The results were reported as the Firefly/Renilla ratio. Statistics: Sidak's multiple comparisons test. * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001, **** p ⁇ 0.0001 [0165] Results
  • the supernatant of DSM 33715 leads to a decrease in the activation of the JAK/STAT pathway induced by IFN- ⁇ by 40%, Tofacitinib to a decrease by 49% and the association of the supernatant with Tofacitinib leads to a decrease in the activation of the JAK/STAT pathway induced by IFN- ⁇ , by 64%. There is therefore an enhanced effect of supernatant and Tofacitinib in modulating IFN- ⁇ -mediated inflammation.
  • Example 7 Effect of the strain according to the invention in the protection of the intestinal epithelium.
  • the inventors studied the effect of the DSM 33715 strain on the integrity of the intestinal barrier by measuring the transepithelial resistance.
  • the Caco-2 cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells per well in 24-well plates containing inserts with a transwell polyester permeable membrane (Corning Life Science). The cells were cultured in DMEM medium supplemented with 20% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37° C./5% CO2. Transepithelial electrical resistance was checked daily from the seventh day of culture using an EVOM3 (WPI) ohmmeter. The medium was replaced every 2 days for 8 to 10 days, until the optimum TEER was reached (2000 Q.cm 2 ).
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were treated in the apical compartment with DSM 33715 or DSM 22607 at an MOI of 50 or PBS IX / Glycerol 10% (control) for 3 hours, then 100 ng/ml of TNF-a was added or not in the basal compartment.
  • the TEER was measured just before the addition of TNF-a (T0) and 6 h (T6H) after the addition of TNF-a.
  • the polarized monolayer Caco-2 cells were pretreated with DSM 33715, then sensitized with TNF- ⁇ .
  • TEER was compared to T0 (before addition of TNF) and T6H. Values represent mean normalized to control - TNF- ⁇ , representing basal TEER.
  • treatment of Caco-2 with TNF-a induced an increase in permeability (Ctrl+TNF-a).
  • the DSM33715 strain is able to restore the barrier epithelial, with a return to the basal level.
  • Example 8 Effect of the strain according to the invention in an in vivo model of colitis.
  • Sprague Dawley rats were anesthetized for 2 hours and received an intra rectal injection of TNBS (Trinitrobenzene sulfonic acid, 80 mg/kg dissolved in 40% ethanol).
  • TNBS Trinitrobenzene sulfonic acid, 80 mg/kg dissolved in 40% ethanol.
  • the animals were sacrificed 4 days after the injection of TNBS.
  • DSM 33715 was administered orally at a dose of 10 9 CFU/ml, gavage starting 14 days before the induction of colitis and until the day of euthanasia.
  • the animals of the "positive control" group received the Pentasa mixed in their feed, at a dose of 150 mg/kg.
  • the anti-inflammatory effect of the products tested was evaluated at sacrifice, following a total treatment period of 18 days.
  • the variations in weight were monitored throughout the entire period of the experiment. Colon length was assessed on the day of autopsy. Macroscopic and microscopic scores were performed by two different operators to validate the scores. The colon of each rat was examined to assess macroscopic lesions according to the Wallace score.
  • the Wallace score is an assessment of gross lesions on a scale of 0 to 10, and this score is based on characteristics reflecting inflammation, such as hyperemia, bowel thickness, and extent of ulcerations .
  • Inflammation was assessed in the colon by measuring the production of IL-ip (pro-inflammatory cytokine) (eBioscience kit), as well as the level of Lipocalin-2 (Lcn-2), marker of neutrophil infiltration (Clinisciences) by ELISA quantification. Briefly, one centimeter of distal colon was collected and homogenized in a Tris-HCl solution containing a cocktail of protease inhibitors (Sigma-Aldrich) using the Precellys homogenizer using ceramic beads (1.4 and 2.8mm). The samples obtained were centrifuged for 20 min and the supernatants collected and stored at -80° C., until their use for the ELISAs.
  • IL-ip pro-inflammatory cytokine
  • Figure 8A The inventors observed a significant decrease in the length of the colon in the group of rats treated with TNBS and having received the vehicle as treatment compared to the control group having received the vehicle, as expected. A significant increase in colon length was seen in the group of TNBS-treated rats given the DSM 33715 strain compared to the TNBS-Vehicle group. The DSM 33715 strain has a protective effect on the colon in the TNBS-induced colitis model.
  • Figure 8B The intensity of the inflammation and lesions of the colon was evaluated at the macroscopic level according to the Wallace score. A significant increase in the Wallace score was observed in the rats of the TNBS-Vehicle group compared to the group of "healthy" rats, with a score of 7.00+/-0.41 vs 0.0+/-0 respectively. .0, p ⁇ 0.0001. This result indicates that the rats exhibited severe colitis 4 days after induction with an ulcerative or inflammatory site greater than 3 cm from the colon (corresponding to a score of 7, on a scale ranging from 0 to 10). A significant decrease in the score was observed in the TNBS-Pentasa group and the TNBS-DSM 33715 group.
  • FIG. 8D The level of lipocalin-2, a marker of neutrophil infiltration, is significantly increased in colic rats (TNBS-Vehicle) compared to the healthy control, confirming the development of severe colitis. A decreasing trend is observed for Pentasa and a significant decrease in LCN-2 is observed in the group of TNBS rats treated with the DSM 33715 strain.
  • the strain according to the invention has a certain therapeutic potential in intestinal dysbiosis and in particular in the prevention and/or treatment of inflammatory diseases.
  • Example 9 Comparative test in an in vivo model of colitis
  • the inventors studied the in vivo effect of the strain according to the invention and of the reference strain C. minuta (DSM22607) in a model of colitis induced by TNBS in the rat.
  • the test was carried out according to the same protocol as that described in Example 8.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle souche bactérienne appartenant au genre Christensenella, une composition la comprenant et ses utilisations, notamment comme médicament dans le traitement et/ou la prévention de maladies telles que les maladies métaboliques et/ou les maladies inflammatoires.

Description

Souche bactérienne dans la prévention et/ou le traitement de pathologies inflammatoires
[0001] Domaine technique
[0002] L'invention concerne une nouvelle souche bactérienne appartenant au genre Christensenella, une composition la comprenant et ses utilisations, notamment comme médicament dans le traitement et/ou la prévention de maladies telles que les maladies métaboliques et/ou les maladies inflammatoires.
[0003] Etat de l'art
[0004] Notre microbiote intestinal ou « flore intestinale » est constitué d'un ensemble de bactéries, virus, parasites et champignons non pathogènes, soit 1012 à 1014 micro-organismes présents dans le tube digestif de chaque individu, ce qui représente 2 à 10 fois plus que le nombre de cellules présent dans notre corps. Dès lors, son rôle est de plus en plus étudié ces dernières années. En 2012, un microbiologiste a identifié et cultivé à partir de fèces humaines une nouvelle espèce : Christensenella minuta, appartenant aux Clostridiales gram-négatifs. (Morotomi et al., Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov, isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales, and proposal of Christensenellaceae fam. nov., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2012), 62, 144-149).
[0005] Il est dorénavant admis par la communauté scientifique que le microbiote intestinal humain est lié à l'apparition de certaines pathologies dites « non transmissibles » et associées à une dysbiose du microbiote, telles que l'obésité, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires intestinales, ou encore la dépression. Or, la prévalence de ces maladies ne cesse d'augmenter, sans aucun traitement satisfaisant.
[0006] Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) ou Inflammatory Bowel Disease (IBD) en Anglais regroupent les maladies liées à l'inflammation de l'intestin à caractère chronique. La maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique en sont les principales. Il s'agit de maladies récentes, multifactorielles dont l'origine est inconnue. Dans un certain nombre de cas, l'apparition de ces maladies pourrait être liée à une prédisposition génétique, à l'environnement, mais encore au microbiote. Ces maladies ont toutes la particularité de présenter une inflammation de l'intestin ce qui induit une modification du microbiote et entretient alors l'inflammation.
[0007] Dans le cadre de la maladie de Crohn, l'inflammation est le plus souvent regroupée au niveau de l'iléon et du côlon. La rectocolite hémorragique (RCH) ou colite ulcéreuse affecte quant à elle plus particulièrement l'extrémité distale du tube digestif, c'est-à-dire le côlon et le rectum. Son incidence est restée stable, à 4,4 cas pour 100 000 habitants en France alors que celle de la maladie de Crohn a augmenté de 5,3 à 7,6 cas pour 100 000 habitants en France entre 1988 et 2014.
[0008] Ce sont des pathologies handicapantes pour lesquels aucun traitement curatif n'est disponible et dont la prévalence augmente fortement dans les pays occidentaux. Ces maladies ont la particularité d'agir par poussée dont la période de rémission est plus ou moins longue. L'objectif des traitements actuels est de prolonger la durée des rémissions le plus possible et donc d'améliorer la qualité de vie des patients malgré des traitements à vie.
[0009] Malgré des progrès dans la compréhension, et le diagnostic de ces pathologies, la médecine moderne n'a pas de solution curative satisfaisante, ce qui cause des problèmes de santé publique majeurs, notamment chez les adolescents dont la prévalence a fortement augmenté ces dernières années.
[0010] Il existe donc un besoin médical fort pour un produit capable d'agir sur le microbiote intestinal, en particulier dans la prévention et le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[0011] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution qui soit simple, efficace et économique pour restaurer un microbiote intestinal sain et donc traiter la dysbiose du microbiote intestinal, en particulier traiter les maladies inflammatoires chroniques, préférentiellement en évitant l'administration d'un traitement à vie et ainsi faire reculer la prévalence de ces maladies.
[0012] Résumé de l'invention
[0013] Pour répondre à cet objectif, les inventeurs ont identifié, parmi la multitude de bactéries présentes dans le microbiote intestinal et parmi les souches déjà connues appartenant à l'espèce Christensenella minuta, une nouvelle souche bactérienne de Christensenella minuta spécifique déposée auprès de l'institut Leibniz DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en français Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH) sous le numéro DSM 33715, particulièrement adaptée dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose intestinale, préférentiellement les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[0014] Ainsi, l'invention concerne une souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715 et ayant pour séquence d'ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1, ainsi que toute souche comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI (Average Nucleotide Identity - Identité Nucléotidique Moyenne) avec la séquence nucléotidique du génome de la souche bactérienne DSM 33715.
[0015] L'invention vise aussi le surnageant de la culture de la souche bactérienne selon l'invention mais également à une composition comprenant (i) au moins la souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) le surnageant de la culture selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable. Ledit excipient acceptable étant préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable lorsqu'il s'agit d'un produit destiné à être utilisé comme médicament pour un usage humain ou un usage vétérinaire.
[0016] Enfin, l'invention est particulièrement adaptée pour utiliser ladite souche bactérienne, ledit surnageant ou ladite composition selon l'invention comme médicament. En effet, la présente invention est particulièrement adaptée dans la prévention et/ou le traitement de pathologies dites « non transmissibles » et associées à une dysbiose du microbiote intestinal ou maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal, en particulier les maladies telles que les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires et d'autres qui seront détaillées ci-après.
[0017] Préférentiellement, l'invention vise à prévenir et/ou traiter les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, plus préférentiellement la maladie de Crohn, ou la colite ulcéreuse.
[0018] Enfin, l'invention concerne également l'utilisation non thérapeutique de la souche bactérienne selon l'invention, et/ou du surnageant selon l'invention ou de la composition selon l'invention pour maintenir et/ou renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l'augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal chez un sujet sain.
[0019] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
[0020] Brève description des Figures
[0021] La Figure IA représente une image d'une bactérie Christensenella minuta selon l'invention réalisée en microscopie électronique à transmission en coloration négative (grossissement : 36kX). [0022] La Figure IB représente un spectre MALDI caractéristique d'une culture pure d'une souche Christensenella minuta selon l'invention.
[0023] La Figure 2A représente l'effet immunomodulateur de la bactérie DSM 33715 sur des cellules PBMCs (3 donneurs sains testés)
[0024] La Figure 2B représente l'effet anti-inflammatoire de la bactérie DSM 33715 sur une lignée THP-1 différenciées en macrophages de type MO par traitement à la PMA (Phorbol 12- myristate 13-acetate).
[0025] La Figure 3 représente l'effet immunomodulateur de la bactérie DSM 33715 et de son surnageant sur la lignée d'adénocarcinome du côlon HT-29 productrice d'IL-8 après stimulation au TNF-a.
[0026] La Figure 4A représente l'effet anti-inflammatoire de DSM 33715 sur la voie de signalisation de l'inflammation NF-0B. Activation de la voie NF-0B par DSM 33715 dans les cellules HT-29 transfectées avec un système rapporteur et stimulées par le TNF-a, mesurée par l'activité luciférase et normalisée par la luminescence de la Renilla.
[0027] La Figure 4B représente l'effet anti-inflammatoire de DSM 33715 sur la voie de signalisation de l'inflammation JAK/STAT. Activation de la voie JAK/STAT par DSM 33715 dans les cellules HT-29 transfectées avec un système rapporteur et stimulées par l'IFN-y, mesurée par l'activité luciférase et normalisée par la luminescence de la Renilla.
[0028] La Figure 5 représente l'effet immunomodulateur du surnageant de DSM 33715 sur la lignée d'adénocarcinome du côlon HT-29 productrice d'IL-8 après stimulation au TNF-a, en présence d'un agent anti-inflammatoire utilisé en thérapeutique, le 5-ASA ou le Budésonide.
[0029] La Figure 6 représente l'effet anti-inflammatoire de DSM 33715 associé ou non au Tofacitinib sur la modulation de la voie de signalisation de l'inflammation JAK/STAT induite par l'IFN-y- La voie JAK/STAT est activée dans les cellules HT-29 transfectées avec un système rapporteur et stimulées par l'IFN-y, mesurée par l'activité luciférase et normalisée par la luminescence de la Renilla.
[0030] La Figure 7 représente l'effet de la souche DSM 33715 sur l'intégrité de la barrière intestinale par mesure de la résistance électrique transépithéliale. La condition PBS-Glycérol +/- TNF-a (contrôle) correspond au milieu de resuspension des bactéries.
[0031] La Figure 8A est un histogramme représentant la longueur moyenne des côlons, en fin d'expérimentation. Les données sont représentées par la moyenne +/- SEM en centimètre pour la longueur et en gramme pour le poids du côlon. [0032] La Figure 8B représente l'inflammation du côlon au niveau macroscopique calculé par le score de Wallace.
[0033] La Figure 8C représente l'inflammation au niveau histologique calculé par le score Ameho. Les données représentées sont les moyennes +/-SEM. Coloration MGG des coupes de colon pour l'évaluation du score histologique (Ameho)
[0034] La Figure 8D représente les niveaux d' I L-ip (panel A) et de Lipocaline-2 (panel B) dans le côlon. Les données représentées correspondent à la moyenne +/- SEM en ng/mg de protéines.
[0035] La Figure 9 représente l'intensité de l'inflammation et les lésions du côlon qui ont été évaluées au niveau macroscopique selon le score de Wallace (panel A) et l'intensité des lésions inflammatoires au niveau tissulaire évaluée selon le score histologique (panel B).
[0036] Description détaillée de l'invention
[0037] Définition
[0038] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. La souche bactérienne selon l'invention appartient à la famille Christensenellaceae, le genre Christensenella et l'espèce minuta. Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Par « bactérie(s) selon l'invention », au sens de l'invention, on entend donc également une souche bactérienne selon l'invention.
[0039] Par « souche bactérienne dérivée » ou « souche mutante » ou « souche dérivée » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33715. Préférentiellement, la souche comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33715, plus préférentiellement au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, ou au moins 99,99% d'identité d'ANL [0040] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention comprenant éventuellement des composés cellulaires de ladite souche et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.
[0041] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention, une dysbiose du microbiote intestinal et les maladies associées, plus préférentiellement les maladies inflammatoires chroniques, par exemple la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse.
[0042] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression d'une dysbiose du microbiote intestinal et les maladies associées, plus préférentiellement les maladies inflammatoires chroniques, par exemple la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.
[0043] Par « milieu physiologiquement acceptable » au sens de l'invention on entend un milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau, de tampon, solutions salines. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale.
[0044] Par « excipient acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient acceptable peut être un solvant, tampon, solution saline, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, agent isotonique. Préférentiellement, il s'agit d'excipients pharmaceutiquement acceptables qui sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels et connus de l'homme du métier et apte à un usage humain et/ou vétérinaire. L'excipient sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration, par exemple approprié pour une administration orale, intraveineuse, intramusculaire, topique etc.
[0045] Par « maladie associée à une dysbiose du microbiote intestinal » au sens de l'invention, on entend les maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal telles que certaines maladies métaboliques, par exemple les maladies liées à l'obésité dont l'obésité, le diabète, la NASH, la stéatose hépatique ou pancréatique ; des maladies inflammatoires, en particulier les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, par exemple la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, les diverticulites, les gastrites, les pancréatites, ou le syndrome du côlon irritable ; mais également des maladies chroniques associées à une dysbiose, des maladies cardiaques et vasculaires, des cancers, par exemple les cancers liés au métabolisme.
[0046] Par « dysbiose du microbiote intestinal » on entend au sens de l'invention un déséquilibre de ce microbiote qui pourrait favoriser l'initiation, le maintien ou la sévérité de l'inflammation. A titre d'exemple, chez environ 5% des patients atteints de la maladie de Crohn, on trouve par exemple une famille d' Escherichia coli (AIEC), plus adhérentes aux cellules de la paroi intestinale et plus invasives que les souches habituelles, qui facilitent une réaction inflammatoire locale. Les causes potentielles de la dysbiose pourraient être d'origine alimentaire (régime gras et sucré, sans fibre, qui limite les bactéries productrices d'acides gras à courtes chaînes bénéfiques), infectieuse (épisodes aigus de gastroentérite infectieuse), ou environnementale (traitements antibiotiques répétés, exposition insuffisante aux pathogènes pendant l'enfance).
[0047] Par « agent anti-inflammatoire » on entend au sens de l'invention une molécule, un principe actif, un médicament, une composition pharmaceutique destinée à combattre une inflammation. En particulier, on entend un groupe de médicaments destinés à traiter une réaction inflammatoire et les maladies qui en résultent telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. A titre d'exemple, on peut citer comme médicaments antiinflammatoires, les corticoïdes (ou glucocorticoïdes ou anti-inflammatoires stéroïdiens) et les anti-inflammatoires non stéroïdiens.
[0048] Par « sujet sain », au sens de l'invention on entend un sujet non malade et ne souffrant pas de maladie, en particulier ne souffrant pas d'une maladie choisie parmi les maladies chroniques et/ou l'obésité et/ou les maladies métaboliques et/ou les maladies inflammatoires et/ou les cancers.
[0049] Souche bactérienne ou surnageant selon l'invention
[0050] Les inventeurs ont découvert la souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715, puis l'ont isolée à partir de fèces d'un donneur humain sain et ont démontré, dans des modèles in vitro, des effets anti-inflammatoires, en particulier un effet immunomodulateur tel que l'induction d'une production d'IL-10, une cytokine antiinflammatoire, supérieure ; et une diminution de certaines voies de signalisation telles que la voie NF-0B ou la voie JAK/STAT. Des résultats sur un modèle pré-clinique de colite induite par du TNBS chez le rat permettent de confirmer les effets anti-inflammatoires de la souche, en particulier sur les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[0051] Les inventeurs ont également démontré que ladite souche bactérienne DSM 33715 permettait de restaurer ou renforcer et donc préserver l'intégrité de la barrière intestinale. Enfin, une synergie d'action a été établie lorsque la souche est utilisée en combinaison avec des agents anti-inflammatoires utilisés en clinique tel que le Pentasa (5-ASA), le Tofacitinib ou le Budésonide, permettant ainsi d'envisager l'administration de doses moins importantes de tels agents anti-inflammatoires connus pour leur toxicité et leurs effets indésirables auprès des patients.
[0052] La présente invention a donc pour objet une souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715 ci-après dénommée souche DSM 33715 ayant pour séquence d'ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1.
[0053] L'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) est l'ARN ribosomique constituant la petite sous- unité des ribosomes des procaryotes. Les gènes codant cet ARN sont appelés ADNr 16S (16S rDNA en anglais). La séquence ADNr 16S est très utilisée en phylogénie du fait de sa structure très conservée qui permet de reconstruire l'histoire évolutive des organismes et en particulier des procaryotes et bactéries.
[0054] Le pourcentage d'identité de la séquence d'ADNr 16S entre deux souches bactériennes, plus particulièrement entre deux souches de Christensenella minuta peut être déterminé par la méthode dite BLAST qui est une méthode de recherche heuristique bien connu de l'homme de l'art. Il permet de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés, et de réaliser un alignement de ces régions homologues.
[0055] Or, la séquence d'ADNr 16S ne permet pas toujours de différencier deux souches d'une même espèce ayant pour autant des propriétés différentes, par exemple des propriétés antiinflammatoires. Par conséquent, l'Homme du métier de par ses connaissances générales est en mesure de caractériser une souche bactérienne selon d'autres paramètres tels que le calcul de distance phylogénétique basé sur le génome complet (ANI), la taille du génome, le nombre de CDS (Coding DNA Sequence ou en Français Séquence d'ADN Codante), mais également l'identification de gènes spécifiques à ladite souche d'intérêt.
[0056] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences de génome partagées entre les deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt déposée auprès de la DSMZ, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome séquencé est assemblé par bio-informatique et les séquences obtenues sont analysées. Enfin, les génomes d'intérêt sont comparés deux à deux pour calculer l'ANI.
[0057] Selon une variante, l'invention se rapporte également à une souche bactérienne dérivée de Christensenella minuta, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33715.
[0058] Préférentiellement ladite souche selon l'invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33715.
[0059] Une telle souche est donc une souche bactérienne de Christensenella minuta dérivée de la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33715 permettant de maintenir ou d'améliorer les capacités décrites de la souche DSM 33715 dans le cadre de la présente invention.
[0060] Ladite souche dérivée peut ainsi être produite naturellement ou intentionnellement, par des méthodes de mutagénèse connues dans l'état de la technique. A titre d'exemple les méthodes de mutagénèse pouvant être mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont la croissance du micro-organisme original en présence d'agents mutagènes ou producteurs de stress, ou par le génie génétique visant à modifier des gènes spécifiques ou non telle que la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire. Selon un objet de l'invention, la souche dérivée de la souche DSM 33715 de C. minuta est un mutant génétiquement modifié. [0061] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne la souche de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715 auprès de l'institut Leibniz DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en français Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH). Ladite souche a pour séquence d'ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1.
[0062] Un autre objet de l'invention se rapporte au surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne DSM 33715 et/ou la souche dérivée. Préférentiellement, le surnageant de culture comprend au moins un des constituants choisis parmi un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaire bactérien, un métabolite et/ou une(des) molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée, ou leurs combinaisons.
[0063] Ainsi, les composés cellulaires et/ou débris cellulaires peuvent être des composants de la paroi, des acides nucléiques, des composants membranaires, des protéines, des lipides etc. Les métabolites ou molécules sécrété(s) peuvent être toute molécule produite ou modifiée par la bactérie en raison de son activité métabolique au cours de sa croissance, de son utilisation dans des procédés technologiques (par exemple, mais sans s'y limiter, des procédés de production d'aliments ou de médicaments). A titre d'exemple, les métabolites ou molécules peuvent être des protéines, acides aminées, enzymes, lipides, acides nucléiques etc. Par « métabolite et/ou une(des) molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée », on entend une molécule produite et exportée ou libérée à l'extérieur de la bactérie par la bactérie.
[0064] Ainsi l'invention se rapporte également au surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne selon l'invention.
[0065] Composition
[0066] La ou les souches selon l'invention ou souche(s) dérivée(s) et/ou le surnageant de culture précédemment décrit et les bactéries issues desdites souches, sont avantageusement administrées dans une composition.
[0067] Ainsi, l'invention concerne une composition comprenant : (i) au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) un surnageant selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable.
[0068] En particulier, la composition comprend au moins une souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33715 et/ou au moins une souche ayant au moins 99,5% d'identité avec la séquence d'ADNr 16S de la souche DSM 33715 et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.
[0069] Selon un mode de réalisation, la composition peut comprendre la souche bactérienne selon l'invention sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée. La forme morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée peut être obtenue par différentes techniques connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.
[0070] Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues.
[0071] La composition selon l'invention peut également comprendre au moins un composé additionnel. Un composé additionnel peut être en particulier un ingrédient, une molécule, un principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries.
[0072] Préférentiellement, le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche bactérienne selon l'invention ou de la souche dérivée. Plus préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Christensenella. A titre d'exemple on peut citer une bactérie appartenant à l'espèce C. minuta, C. timonensis, C. massiliensis et leurs mélanges.
[0073] Selon une variante, le composé additionnel est un probiotique et/ou un prébiotique. Le prébiotique peut-être, par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylanes, les béta- glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines.
[0074] Selon une autre variante, le composé additionnel peut être :
- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou
- au moins une bactérie produisant de l'acide butyrique qui permet de créer un environnement favorable aux Christensenellacées telle qu'une bactérie des genres Ruminococcaceae et Lachnospiraceae,
- au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des micro-organismes de la famille des Methanobacteriaceae, et/ou - au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Verrucomicrobia, et/ou
- au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempférol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan-3-ols ou les catéchines, les flavanones (comme la naringinine), les isoflavones, les anthocyanidines, les oligo-proanthocyanidines, et/ou
- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou
- au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les antiinflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles proinflammatoires (tel que anti-TNF-alpha ou anti-IL6), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux oestrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l'épinéphrine, la dornase alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines, les inhibiteurs de la Janus Kinase, les immunomodulateurs, les hypolipémiants, les hypocholestérolémiant, les anti-hypertenseurs.
[0075] Lorsque le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche selon l'invention, le microorganisme est préférentiellement choisi parmi Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii, Anaerobutiryricum hallii, Hafnia alvei, Roseburia intestinalis, Roseburia hominis, Roseburia faecis, Roseburia inulinivorans, Dysosmobacter welbionis, Oscillospira guillermondii, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus casei, Latilactobacillus sakei, Ligilactobacillus salivarius, Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Levilactobacillus brevis, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium stercoris et Bifidobacterium thermophilum.
[0076] Lorsque le composé additionnel est un principe actif pharmaceutique, il s'agit préférentiellement d'un principe actif choisi parmi le 5-ASA, la mesalamine, l'olsalazine, le budésonide, le Tofacitinib, le filgotinib, l'upadacitinib, l'infliximab, l'adalimumab, le golimumab, le certolizumab, le vedolizumab et l'ustekinumab.
[0077] Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un sujet, préférentiellement un sujet humain ou animal non-humain. Ainsi, la composition selon l'invention vise également les usages vétérinaires.
[0078] De façon préférée, la composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[0079] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle peut notamment comprendre des souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée et/ou un milieu de culture physiologiquement acceptable pour lesdites bactéries qui permet de les conserver, comme, par exemple, préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de mouton, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.
[0080] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcrystalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol et/ou le glycérol.
[0081] Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée.
[0082] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre microencapsulée, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, émulsion, suspension, suppositoire, inhalateur et un sirop.
[0083] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme gastro-résistante, par exemple un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées. Ladite composition peut ainsi être pourvue d'un enrobage gastro-résistant soit résistant au suc gastrique, afin d'assurer que la ou les bacté rie(s) comprise(s) dans ladite composition puisse traverser l'estomac. La libération de(s) la bacté rie(s) peut ainsi se produire pour la première fois dans le tractus intestinal supérieur.
[0084] De façon particulièrement préférée, la composition comprend 104 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer préférentiellement 106 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer.
[0085] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. Plus préférentiellement, la composition utile comprend 105 à 1011 CFU ou 107 à 1011 CFU de bactéries par dose quotidienne à administrer, encore plus préférentiellement 109 CFU.
[0086] Lesdites bactéries sont un mélange de bactéries correspondant à ou issues de la souche bactérienne DSM 33715 et/ou correspondant à la souche dérivée.
[0087] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition, et au contraire, elles peuvent exercer un effet sur elles-mêmes.
[0088] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.
[0089] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactéries, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement, au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre). [0090] Les bactéries vivantes sont préférentiellement un mélange de bactéries correspondant à la souche bactérienne DSM 33715 et/ou correspondant à la souche dérivée ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33715. [0091] Dans le cas de la mise en oeuvre d'un surnageant de l'une des quelconques souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
[0092] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0093] Lorsque la composition est destinée à un usage thérapeutique, la composition peut comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0094] Lorsque la composition comprend un tel excipient pharmaceutique ment acceptable, la composition selon l'invention est préférentiellement une composition pharmaceutique.
[0095] L'invention concerne donc également une composition pharmaceutique comprenant un ou des ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment.
[0096] Ladite composition pharmaceutique selon l'invention a au moins une application dans l'amélioration du bien-être physique, physiologique ou psychologique d'un sujet malade, qui se traduit par une amélioration de l'état général de santé dudit sujet ou une réduction du risque de maladie. Ladite composition pharmaceutique est un médicament.
[0097] Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[0098] Lorsque, la composition selon l'invention est comprise dans un complément alimentaire pour une administration par voie orale, celle-ci peut être sous forme de capsules, de gélules, de capsules molles, de comprimés, de comprimés dragéifiés, de pilules, de pâtes, de pastilles, de gommes, de solutions ou émulsions buvables, de sirop ou de gel.
[0099] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre en outre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent aromatisant et/ou un colorant. La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour produire des comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération contrôlée, des émulsions, des comprimés ou des capsules.
[0100] Une composition selon la présente invention peut également être sous la forme d'une composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon la présente invention peut être sous la forme d'un yaourt, une barre de céréale, des céréales pour le petit-déjeuner, un dessert, un aliment congelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie, une suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.
[0101] Une composition nutritionnelle selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, DHA, EPA, des vitamines, des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques, des prébiotiques et des combinaisons de ceux-ci.
[0102] Utilisation
[0103] L'invention concerne donc la souche bactérienne selon l'invention et/ou la souche dérivée, le surnageant selon l'invention, plus particulièrement la composition selon l'invention pour son utilisation comme médicament.
[0104] En particulier, l'invention permet de fournir une quantité efficace de souches bactériennes selon l'invention ou de la souche dérivée, pour son utilisation comme médicament.
[0105] L'utilisation comme médicament dans le contexte de la présente invention se réfère à une utilisation humaine ou vétérinaire, ledit médicament est alors administré à un sujet humain ou un sujet animal non-humain. Par sujet humain, on entend également un adulte ou un enfant ou un bébé, y compris un nouveau-né ou un nourrisson.
[0106] Préférentiellement, la composition selon l'invention est destinée à être utilisée dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose du microbiote, en particulier du microbiote intestinal et/ou des maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal et/ou des maladies chroniques et/ou de l'obésité et/ou des maladies métaboliques et/ou des maladies inflammatoires et/ou des cancers.
[0107] De façon plus préférée, la composition selon l'invention est destinée à être utilisée dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, en particulier d'une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, les gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable.
[0108] Selon une variante, l'invention se rapporte également à la composition selon l'invention pour son utilisation comme médicament, dans la prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi :
- Les maladies métaboliques, choisies parmi le diabète non-insulinodépendant, le diabète gestationnel, la NASH, la stéatose hépatique, la stéatose pancréatique, les hyperlipidémies, les hypercholestérolémie, l'infertilité liée au surpoids, l'incontinence urinaire liée au surpoids,
- Les autres maladies métaboliques chroniques, dont les thyroïdites,
- les maladies cardiaques et vasculaires, choisies parmi l'athérosclérose, les thrombopathies, les péricardites aiguës et la péricardite chronique constrictive, l'hypertension artérielle, les vascularites
- les maladies du foie et des canaux biliaires, choisies parmi les hépatites, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, la cirrhose, l'encéphalopathie hépatique, les lithiases vésiculaires
- les maladies articulaires liées au surpoids, choisies parmi l'ostéopénie, l'ostéoporose, l'arthrose, l'inflammation des disques vertébraux
- les maladies neurodégénératives, choisies parmi la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, les maladies du motoneurone telles que la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primitive et la maladie de Kennedy
- les cancers liés au métabolisme et/ou à une dysbiose du microbiote, choisies parmi les hépatocarcinomes, les cancers du tube digestif tel que de l'œsophage, de l'estomac et cancer colorectal, carcinome pancréatique, les tumeurs neuroendocrines (TNE) du système gastro-entéro-pancréatique, les tumeurs hépatiques, les tumeurs de la vésicule biliaire et des voies biliaires, les tumeurs rénales, les glioblastomes, les lymphomes, les myélomes multiples, la leucémie myéloïde chronique, les maladies myéloprolifératives chroniques, les carcinomes pulmonaires
- les maladies auto-immunes, choisies parmi le diabète insulino-dépendant, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, le lupus érythémateux disséminé, le syndrome auto-immun polyendocrinien
- les maladies dermatologiques atopiques, choisies parmi l'eczéma, le psoriasis - les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, choisies parmi la maladie de Crohn, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, les gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable
- les troubles de la fonction respiratoire, choisies parmi l'asthme, la mucoviscidose, les maladies pulmonaires chroniques obstructives et la bronchite chronique, les maladies pulmonaires interstitielles et fibroses pulmonaires, le syndrome d'apnée du sommeil (SAOS)
- les pneumonies, choisies parmi les pneumonies infectieuses, la pneumonie à influenza et la grippe aviaire, le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), la pneumonie à Pneumocystis
- Les diarrhées infectieuses, choisies parmi l'infection par Clostridium difficile, l'infection par EHEC, la gastro-entérite à salmonelles, l'entérite à Campylobacter, les toxiinfections alimentaires par bactéries productrices d'entérotoxines, le choléra, la yersiniose, la shigellose, la cryptosporidiose, la listériose
- Les allergies alimentaires, choisies parmi la maladie cœliaque, l'intolérance au lactose, le syndrome de malabsorption des sels biliaires
- Les néphrologies inflammatoires ou en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'urétrite, l'insuffisance rénale chronique, les urolithiases
- Autres désordres inflammatoires, choisies parmi la sclérose en plaque, la lymphangite
- Les maladies neurologiques en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'anorexie, la boulimie, la dépression, le syndrome bipolaire, l'autisme, la schizophrénie, le syndrome de Tourette.
[0109] Selon un dernier objet, l'invention concerne également une utilisation non thérapeutique de la composition selon l'invention pour maintenir et/ou renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l'augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal et/ou promouvoir la perte de poids chez un sujet sain.
[0110] Préférentiellement, lorsque la composition vise à renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l'augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal et/ou promouvoir la perte de poids chez un sujet sain, alors la composition est sous la forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier. [0111] L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d'essais démontrant leur efficacité, présentés uniquement à titre d'illustration.
[0112] Exemples
[0113] Exemple 1 : Caractérisation de C. minuta selon l'invention déposée sous le numéro DSM 33715.
[0114] La souche bactérienne C. minuta DSM 33715 peut être caractérisée selon les méthodes suivantes.
[0115] Les bactéries natives de la souche DSM 33715 (10 pL de milieu de culture dosé à 109 CFU/mL) ont été déposées sur des grilles en carbone ionisé (Delta Microscopy, Toulouse, France) et une coloration négative a été réalisée avec du Nano-Tungsten (Nano-W, Nanoprobes, LFG Distribution, France).
[0116] L'observation des bactéries montées sur grille a été réalisée avec un microscope électronique à transmission (Talos F200S G2 - Thermofisher - Eindhoven) à 200kV, équipé d'une camera 4K*4K One View (Gatan, Paris, France). La préparation des échantillons, ainsi que les acquisitions ont été réalisées au Bordeaux Imaging Center (membre de France- Biolmaging, ANR-10-INBS-04).
[0117] L'activité oxidase a été déterminée par l'utilisation de bandelettes de test oxidase (Sigma-Aldrich) par évaluation du changement de couleur après ajout d'une goutte de culture bactérienne liquide.
[0118] L'activité catalase a été déterminée à deux concentrations d'FbCh (3 et 15%), ajoutées sur une colonie de DSM 33715, le statut catalase étant évalué visuellement par la formation de bulles.
[0119] La coloration de gram a été réalisée suivant la procédure classique.
[0120] La tolérance à la bile et au pH ont été évaluées en milieu GAM modifié (HyServe) liquide. Pour la tolérance à la bile, des milieux contenant 0-2-4-6 et 8% d'Oxgall (Difco Laboratories) ont été utilisés, correspondant respectivement à 0-20-40-60 et 80% de bile. Pour la tolérance au pH, des milieux à pH 4-5-6-7 et 8 ont été utilisés. L'ensemble des milieux a été dégazés dans la chambre anaérobiques avant inoculation avec 10 pl d'une suspension bactérienne au 0,5 de McFarland. La densité optique à 600 nm a été prise à Oh, 24h, 48h, 72h et 96h.
[0121] Les tests d'antibiorésistance ont été réalisé par l'utilisation de concentration minimale inhibitrice (CMI) selon la méthode de référence de dilution en milieu gélosé du CLSI (Clinical and laboratory Standards Institute). Les solutions stock de chaque antibiotique ont été préparées et stérilisées par filtration à 0,2 p : ampicilline (Sigma-Aldrich), tétracycline (Sigma- Aldrich, Chloramphénicol (Sigma-Aldrich), clindamycine (Sigma-Aldrich), méropénème (USP), pipéracilline (USP), tazobactam (USP), et ceftriaxone (USP). Le milieu Brucella agar (BD BBL) supplémenté avec 5 pg/ml d'hémine (Sigma-Aldrich), 1 pg/ml de vitamine Kl (Sigma-Aldrich) et 5% (v/v) de sang de mouton hémolysé (laked) (Hemostat) a été utilisé comme milieu de test. Les boîtes agar avec différentes dilutions d'antibiotique ont été préparées et dégazées dans la chambre anaérobique avant inoculation. L'inoculum de DSM 33715 a été resuspendu au standard 0,5 de McFarland en eau peptonée. 2 pl de l'inoculum ont été déposés à la surface de l'agar (chaque spot correspondant approximativement à 105 CFU/ml). Un triplicat est réalisé par concentration d'antibiotique. Les boîtes ont ensuite été incubées pendant 6 jours à 37°C en condition anaérobique. Les valeurs de CMI ont été déterminées selon les directives du CLSI et ont été interprétées comme sensible, intermédiaire ou résistante, basées sur les points de rupture des anaérobes du CLSI.
[0122] Résultats de caractérisation
[0123] La souche DSM 33715 est strictement anaérobique avec une phase exponentielle de croissance entre 20 et 40h et une phase stationnaire commençant à 40h, non motile, non sporulante, négative pour l'activité oxydase et catalase et est gram négative. DSM 33715 est négative pour la majorité des enzymes testées, à l'exception de l'acidification du glucose, du xylose, du rhamnose et de l'arabinose, ce qui est cohérent avec la description des Christensenella minuta faite par Morotomi et al. Elle présente les activités enzymatiques suivantes : 0-Glucosidase, 0-Arabinosidase, Glutamic Acid Décarboxylase, ainsi qu'Estérase, Acid Phosphatase et Napthol-AS-BI-Phosphatase. Une résistance aux acides biliaires a été observée jusqu'à 80g/l d'Oxgall, correspondant à 80% de bile. DSM 33715 présente également une croissance en milieu avec un pH allant de 6 à 9. Enfin, la souche DSM 33715 montre une résistance à l'ampicilline et la tétracycline.
[0124] La Figure IA représente l'image d'une bactérie Christensenella minuta selon l'invention réalisée en microscopie électronique à transmission en coloration négative (grossissement : 36kX). Les dimensions moyennes d'une bactérie de la souche DSM 33715 sont : longueur 1,27 +- 0,28 mm ; largeur= 0,507 +- 0,04 mm ; avec une épaisseur de membrane= 29,4 nm (moyenne réalisée à partir de 41 bactéries). La souche a une forme courte avec les extrémités effilées, se présentant en singulet, paires ou rosaces.
[0125] La souche selon l'invention peut également être caractérisée par l'analyse d'un spectre MALDI.
[0126] Ainsi, une culture pure de la souche DSM 33715 est incubé dans un milieu gélosé et soumis à une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) en utilisant un instrument MALDI Biotyper (Bruker) et en employant la méthode standard recommandée par le fabriquant.
[0127] L'identification par MALDI est une méthode connue permettant d'identifier une colonie bactérienne au niveau du genre et de l'espèce. Celui-ci est caractéristique de la composition moléculaire de la surface de ladite bactérie. Ainsi, la Figure IB représente le spectre MALDI caractéristique d'une culture pure de Christensenella minuta selon l'invention (DSM 33715). Celui-ci permet de confirmer l'appartenance de ladite souche à l'espèce C. minuta et ainsi de valider la pureté de la culture. [0128] Exemple 2 : Comparaison entre la souche selon l'invention (DSM 33715) et des souches de C. minuta de l'art antérieur.
[0129] Les inventeurs ont également comparé la souche selon l'invention (DSM 33715) à des souches connues de C. minuta telles que la souche de référence déposée sous le numéro DSM 22607, la souche déposée sous le numéro DSM 32891 et la souche déposée sous le numéro DSM 33407 selon plusieurs paramètres tels que la séquence de l'ADNr 16S, la taille du génome en paire de base (bp), la distance phylogénétique basée sur le génome complet (ANI), le nombre de séquence codante (CDS) et des exemples de gènes spécifiques à la souche.
[0130] Les résultats sont présentés dans les tableaux 1 à 3 ci-après.
[0131] [Tableau 1]
Figure imgf000022_0001
[0132] [Tableau 2]
Figure imgf000023_0001
[0133] [Tableau 3]
Figure imgf000023_0002
[0134] Ainsi, la souche selon l'invention (DSM 33715) possède la même séquence d'ADNr 16S que les trois autres souches de C. minuta déjà connues et ce malgré des propriétés métaboliques et un potentiel anti-inflammatoire différent. Toutefois, la taille du génome, l'ensemble du génome, le nombre de séquences codantes et certains gènes spécifiques de ladite souche permettent de caractériser et de différencier les souches entre-elles. Notamment, la souche selon l'invention possède le génome le plus grand et un nombre de séquence codante plus important que les souches déjà connues.
[0135] Exemple 2 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention. [0136] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet immunomodulateur pro- et anti-inflammatoire de la souche DSM 33715.
[0137] Le protocole d'étude est le suivant.
[0138] Des PBMCs issues de 3 donneurs sains (Lonza) ont été ensemencées en plaques 24 puits à lxlO6 ce 11 u les/puits en milieu RPMI (Gibco) supplémenté de 2% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 24h en présence de la bactérie DSM 33715 à une MOI de 50 ou de milieu bactérien-Glycérol comme contrôle. Après 24h, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et stockés à - 80°C jusqu'à la quantification de l'IL-10 par ELISA. Le dosage de l'IL-10 a été effectué par ELISA spécifique de BioLegend, selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 460 nm a été lue en utilisant le lecteur de microplaques FluoStar Omega, BMG Labtech.
[0139] Les cellules THP-1 (ECACC) ont été ensemencées à 5xl05 cellu les/puits en plaques 24 puits en milieu RPMI (Gibco) supplémenté de 10% de SVF (Gibco) en présence de 100 ng/ml de PMA (Enzo Life Sciences) pendant 48h, afin de différencier les cellules monocytaires en macrophages de type MO. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS-1X (Gibco) et cultivées pendant 24h supplémentaires en milieu RPMI à 2% de SVF. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 24h avec la bactérie DSM 33715 à une MOI de 50 ou du PBSIX-Glycérol comme contrôle. Après 24h, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et stockés à - 80°C jusqu'à la quantification de l'IL-10 par ELISA. Le dosage de l'IL-10 a été effectué par ELISA spécifique de BioLegend, selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 460 nm a été lue en utilisant le lecteur de microplaques FluoStar Omega, BMG Labtech.
[0140] Statististiques: one-way ANOVA suivi par Dunett's multiple comparisons, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
[0141] Résultats
[0142] Pour évaluer l'effet immunomodulateur de la souche DSM 33715, les cellules PBMCs ont été incubées 24h en présence de la bactérie DSM 33715 à une MOI de 50. La chimiokine IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire. Les valeurs représentent la sécrétion d'IL-10 induite par la souche selon l'invention (DSM 33715). Pour 2 des 3 donneurs DSM 33715 induit une production d'IL-10 supérieur à une souche de référence de C. minuta DSM 22607 (Figure 2A). [0143] L'induction de production d'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, par DSM 33715 a également été mise en évidence par le modèle cellulaire THP-1 différencié en macrophage type MO par traitement à la PMA (Figure 2B).
[0144] La souche DSM 33715 présente ainsi un effet immunomodulateur anti-inflammatoire plus important que la souche de référence de C. minuta et possède donc un fort potentiel thérapeutique dans les maladies inflammatoires.
[0145] Exemple 3 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention.
[0146] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33715 sur une lignée d'adénocarcinome du côlon HT-29 productrice d'IL-8 après stimulation au TNF-a.
[0147] Les cellules HT-29 (ECACC) ont été ensemencées en plaques 24 puits à 3xl05 cellules/ puits en milieu McCoy's 5A (Gibco) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 24h. Les cellules ont été lavées au PBS-1X (Gibco) et cultivées pendant 24h supplémentaires en milieu McCoy's 5A à 2% de SVF. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 6 heures avec 5 ng/ml de TNF-a en présence de 50 bactéries pour 1 cellule HT-29 (MOI 50) de DSM 33715 ou 10% de surnageant ou de PBSIX-Glycérol ou milieu de culture bactérien comme contrôles (ctrl). DSM 22607 est la souche de référence. Le 5-ASA (20 mM) est un agent anti-inflammatoire utilisé en contrôle. Après 6h, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et stockés à - 80°C jusqu'à la quantification de l'IL-8 par ELISA. Le dosage de l'IL-8 a été effectué par ELISA spécifique de BioLegend, selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 460 nm a été lue en utilisant le lecteur de microplaques FluoStar Omega, BMG Labtech. 6 expériences indépendantes ont été réalisées en duplicat. Statististiques: one-way ANOVA suivi par Dunett's multiple comparisons, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
[0148] Résultats
[0149] Pour évaluer l'effet immunomodulateur de la souche DSM 33715, les cellules HT-29 ont été stimulées avec la cytokine pro-inflammatoire TNF-a et la bactérie DSM 33715 à une MOI de 50 en début de phase stationnaire de croissance ou de son surnageant, pendant 6H. La chimiokine IL-8 est sécrétée par les HT-29 dans un état inflammatoire induit par le TNF-a (Ctrl). Les valeurs représentent la moyenne normalisée en pourcentage par rapport au contrôle + TNF-a (PBS-Glycérol pour la bactérie et le milieu de culture bactérien pour le surnageant), représentant la sécrétion d'IL-8 induite par stimulation au TNF-a, soit 100%. En présence de DSM 33715 ou de son surnageant, la sécrétion de l'IL-8 est diminuée de 50% par rapport au contrôle (p<0.0001, Dunnett's multiple comparisons test). Ainsi, la souche DSM 33715 et son surnageant présente un effet immunomodulateur anti-inflammatoire.
[0150] Exemple 4 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention.
[0151] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33715 sur les voies de signalisation de l'inflammation NF-0B et JAK/STAT.
[0152] Les cellules HT-29 à une densité de 3xl05 cellules/puits, en plaque 24 puits, ont été transfectées selon un protocole de reverse-transfection, avec 200 ng de vecteur pRelA-luc (voie de signalisation NF-0B) ou pGL4 luc2P GAS-RE (voie de signalisation JAK/STAT dépendante de l'IFN-y) et 10 ng de vecteur pRL-TK (Promega), utilisant le réactif de transfection X-tremeGENE HP DNA avec un ration 3:1 (Roche). Brièvement, les complexes de transfection réactif/ADN ont été préparés dans un volume final de 50 pl de milieu McCoy's 5A sans sérum et sans antibiotique, la quantité appropriée de chaque plasmide a été ajoutée et homogénéisée, puis l'agent de transfection a été ajouté (3:1). Les complexes de transfection ont été mélangés délicatement et incubés à température ambiante pendant 15 minutes. Après incubation, les complexes de transfection ont été ajoutés aux cellules HT-29 fraîchement resuspendue à la densité appropriée en milieu McCoy's 5A supplémenté de 10 % de SVF, puis les mélanges cellules/complexe de transfection ont été délicatement homogénéisés et mis en plaque. Les plaques ont été incubées pendant 24h en atmosphère humide à 5% de CO2 et le milieu a ensuite été remplacé par du milieu à 2% de SVF pendant 12h, après lavage en PBS IX. Après 12h de privation de sérum, le milieu a été retiré et remplacé par du milieu 2% SVF +/- 5 ng/ml de TNF-a (système rapporteur NF-0B) ou 100 pg/ml d'IFN-y (système rapporteur JAK/STAT) et 10% de surnageant de DSM 33715 ou de milieu de culture bactérien comme contrôle ou l'inhibiteur spécifique de la voie de signalisation (5 pM BAY11-7082 pour la voie NF-0B et 1 pM Tofacitinib pour la voie JAK/STAT). Après 6h de co-incubation, les cellules ont été lavées au PBS IX et lysées dans 50 pl de tampon lyse passif (Promega) pendant 15 min à température ambiante avec agitation orbitale, les lysats protéiques ont ensuite été transférés en microtubes. Un test rapporteur Luciférase (Dual-Luciferase reporter assay, Promega) a été réalisé avec des modifications mineures des instructions du fabricant. Brièvement, 2x20 pl de lysat ont été transférés en plaque 96 puits blanche, et 50 pl de réactif LAR II ont été ajoutés. L'activité de la luciférase Firefly a été lue. Puis 50 pl de réactif Stop&GIo ont été ajoutés et la mesure de l'activité Renilla a été lue avec le lecteur de plaque FLUOstar Omega (BMG Labtech). Les résultats ont été reportés comme le ratio Firefly/Renilla. Statistiques : Sidak's multiple comparisons test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001
[0153] Résultats
[0154] Le surnageant de DSM 33715 conduit à une diminution de l'activation de la voie NF-0B induite par le TNF-a de 25% et une diminution de l'activation de la voie JAK/STAT induite par l'IFN-y de 40%. Or, ces voies sont particulièrement pertinentes car hyperactives chez les patients atteints d'inflammation chroniques comme dans la maladie de Crohn, mais également certains cancers. La voie N F-KB est impliquée dans les cancers d'origine épithéliale, tels que le cancer du sein ; dans les cancers gastro-intestinaux, tels que le cancer colorectal. La voie Jak/STAT est suractivée dans les cancers solides principalement, tels que le cancer du sein, du poumon, du foie, de la tête, du cou et de l'estomac.
[0155] Exemple 5 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention en combinaison avec un agent anti-inflammatoire.
[0156] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33715 en combinaison avec le 5-ASA ou le Budésonide.
[0157] Les cellules HT-29 (ECACC) ont été ensemencées en plaque 24 puits à 3xl05 cellules/ puits en milieu McCoy's 5A (Gibco) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 24h. Les cellules ont été lavées au PBS-1X (Gibco) et cultivées pendant 24h supplémentaires en milieu McCoy's 5A à 2% de SVF. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 6 heures avec 5 ng/ml de TNF-a en présence de 10% de surnageant en phase stationnaire de DSM 33715 ou de milieu de culture bactérien comme contrôle (ctrl), en présence ou non d'agents anti-inflammatoires. Le 5-ASA (10 mM) et le budésonide (20 pM) sont des molécules utilisées dans le traitement de maladies inflammatoires, comme la rectocolite et la maladie de Crohn. Après 6h, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et stockés à - 80°C jusqu'à la quantification de l'IL-8 par ELISA. Le dosage de l'IL-8 a été effectué par ELISA spécifique de BioLegend, selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 460 nm a été lue utilisant le lecteur de microplaques FluoStar Omega, BMG Labtech. Statistiques: Sidak's multiple comparisons test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
[0158] Résultats
[0159] Pour évaluer l'effet immunomodulateur de la souche DSM 33715 en combinaison avec un agent anti-inflammatoire utilisé en thérapeutique, les cellules HT-29 ont été stimulées avec la cytokine pro-inflammatoire TNF-a et 10% du surnageant de DSM 33715 en présence ou non de 5-ASA ou de Budésonide, pendant 6H. La chimiokine IL-8 est sécrétée par les HT-29 dans un état inflammatoire induit par le TNF-a (Ctrl). Les valeurs représentent la moyenne normalisée en pourcentage par rapport au contrôle + TNF-a, représentant la sécrétion d'IL-8 induite par stimulation au TNF-a, soit 100%.
[0160] En présence de DSM 33715, la sécrétion de ITL-8 est diminuée de 28% par rapport au contrôle, et de 38% en présence de 5-ASA. La combinaison du surnageant et du 5-ASA conduit à une diminution de 64% (Panel A). Il y a donc un effet amélioré du surnageant et du 5-ASA dans la modulation de l'inflammation. [0161] En présence de DSM 33715, la sécrétion de l'IL-8 est diminuée de 32% par rapport au contrôle, et de 38% en présence de Budésonide. La combinaison du surnageant et du budésonide conduit à une diminution de 67% (Panel B). Il y a donc un effet amélioré du surnageant et du budésonide dans la modulation de l'inflammation induite par le TNF-a.
[0162] Exemple 6 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention en combinaison avec un inhibiteur JAK.
[0163] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de DSM 33715 associé ou non au Tofacitinib sur la modulation de la voie de signalisation de l'inflammation JAK/STAT induite par l'IFN-y.
[0164] Les cellules HT-29 à une densité de 3xl05 cellules/puits, en plaque 24 puits, ont été transfectées selon un protocole de reverse-transfection, avec 200 ng de vecteur pGL4 luc2P GAS-RE (voie de signalisation JAK/STAT dépendante de l'IFN-y) et 10 ng de vecteur pRL-TK (Promega), utilisant le réactif de transfection X-tremeGENE HP DNA avec un ration 3:1 (Roche). Brièvement, les complexes de transfection réactif/ADN ont été préparés dans un volume final de 50 pl de milieu McCoy's 5A sans sérum et sans antibiotique, la quantité appropriée de chaque plasmide a été ajoutée et homogénéisée, puis l'agent de transfection a été ajouté (3:1). Les complexes de transfection ont été mélangés délicatement et incubés à température ambiante pendant 15 minutes. Après incubation, les complexes de transfection ont été ajoutés aux cellules HT-29 fraîchement resuspendue à la densité appropriée en milieu McCoy's 5A supplémenté de 10 % de SVF, puis les mélanges cellules/complexe de transfection ont été délicatement homogénéisés et mis en plaque. Les plaques ont été incubées pendant 24h en atmosphère humide à 5% de CO2 et le milieu a ensuite été remplacé par du milieu à 2% de SVF pendant 12h, après lavage en PBS IX. Après 12h de privation de sérum, le milieu a été retiré et remplacé par du milieu 2% SVF +/- 100 pg/ml d'IFN-y (système rapporteur JAK/STAT) et 10% de surnageant de DSM 33715 ou de milieu de culture bactérien comme contrôle ou l'inhibiteur spécifique de la voie de signalisation (5 pM BAY11-7082 pour la voie NF-0B et 1 pM Tofacitinib pour la voie JAK/STAT). Après 6h de co-incubation, les cellules ont été lavées au PBS IX et lysées dans 50 pl de tampon lyse passif (Promega) pendant 15 min à température ambiante avec agitation orbitale, les lysats protéiques ont ensuite été transférés en microtubes. Un test rapporteur Luciférase (Dual-Luciferase reporter assay, Promega) a été réalisé avec des modifications mineures des instructions du fabricant. Brièvement, 2x20 pl de lysat ont été transférés en plaque 96 puits blanche, et 50 pl de réactif LAR II ont été ajoutés. L'activité de la luciférase Firefly a été lue. Puis 50 ni de réactif Stop&GIo ont été ajoutés et la mesure de l'activité Renilla a été lue avec le lecteur de plaque FLUOstar Omega (BMG Labtech). Les résultats ont été reportés comme le ratio Firefly/Renilla. Statistiques : Sidak's multiple comparisons test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 [0165] Résultats
[0166] Le surnageant de DSM 33715 conduit à une diminution de l'activation de la voie JAK/STAT induite par l'IFN-y de 40%, le Tofacitinib à une diminution de 49% et l'association du surnageant avec le Tofacitinib conduit à une diminution de l'activation de la voie JAK/STAT induite par l'IFN-y, de 64%. Il y a donc un effet amélioré du surnageant et du Tofacitinib dans la modulation de l'inflammation médiée par l'IFN-y.
[0167] Exemple 7 : Effet de la souche selon l'invention dans la protection de l'épithélium intestinal.
[0168] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet de la souche DSM 33715 sur l'intégrité de la barrière intestinale par mesure de la résistance transépithéliale.
[0169] Les cellules Caco-2 (ECACC) ont été ensemencées à 2xl04 cellules par puits en plaques 24 puits contenant des inserts avec une membrane perméable en polyesterTranswell (Corning Life Science). Les cellules ont été cultivées en milieu DMEM supplémenté de 20% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C / 5% CO2. La résistance électrique transépithéliale a été vérifiée tous les jours à partir du septième jour de culture à l'aide d'un ohmmètre EVOM3 (WPI). Le milieu a été remplacé tous les 2 jours durant 8 à 10 jours, jusqu'à ce que la TEER optimale ait été atteinte (2000 Q.cm2). A l'atteinte de la TEER de référence, les cellules ont été traitées dans le compartiment apical avec DSM 33715 ou DSM 22607 à une MOI de 50 ou du PBS IX / Glycérol 10% (contrôle) pendant 3h, puis 100 ng/ml de TNF-a a été ajouté ou non dans le compartiment basal. La TEER a été mesurée juste avant l'addition de TNF-a (T0) et 6h (T6H) après l'ajout de TNF-a.
[0170] Résultats
[0171] Pour évaluer la capacité de la souche DSM 33715 à restaurer ou renforcer la barrière intestinale, les cellules Caco-2 en monocouche polarisées ont été prétraitées avec DSM 33715, puis sensibilisées au TNF-a. La TEER a été comparée à T0 (avant ajout du TNF) et T6H. Les valeurs représentent la moyenne normalisée par rapport au contrôle - TNF-a, représentant la TEER basale. Comme attendu, le traitement des Caco-2 avec le TNF-a induit une augmentation de la perméabilité (Ctrl + TNF-a). La souche DSM33715 est capable de restaurer la barrière épithéliale, avec un retour au niveau basal.
[0172] Exemple 8 : Effet de la souche selon l'invention dans un modèle in vivo de colite.
[0173] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet in vivo de colite induite par le TNBS chez le rat. L'essai a été réalisé par un prestataire accrédité (Intestinal Biotech Development, Lille) selon les directives gouvernementales.
[0174] Pour l'induction de la colite, des rats Sprague Dawley ont été anesthésiés pendant 2h et ont reçu une injection intra rectale de TNBS (Trinitrobenzene sulfonic acid, 80 mg/kg dissous en éthanol 40%).
[0175] Les animaux ont été sacrifiés 4 jours après l'injection de TNBS. DSM 33715 a été administrée par voie orale à une dose de 109 CFU/ml, gavage débutant 14 jours avant l'induction de la colite et jusqu'au jour de l'euthanasie. Les animaux du groupe "contrôle positif" ont reçu le Pentasa mixé dans leur alimentation, à une dose de 150 mg/kg. L'effet antiinflammatoire des produits testés a été évalué au sacrifice, suite à une période totale de traitement de 18 jours.
[0176] Les variations de poids ont été suivies durant la totalité de la période de l'expérience. La longueur du côlon a été évaluée le jour de l'autopsie. Les scores macroscopique et microscopique ont été réalisés par deux opérateurs différents pour valider les scores. Le côlon de chaque rat a été examiné pour évaluer les lésions macroscopiques selon le score de Wallace. Le score de Wallace est une évaluation des lésions macroscopiques sur une échelle de 0 à 10, et ce score est basé sur des caractéristiques reflétant l'inflammation, telles que l'hyperémie, l'épaisseur de l'intestin et l'étendue des ulcérations.
[0177] La méthode est décrite par Wallace JL et al. Gastroenterology. 1992 Jan;102(l):18-27. PMID: 1309357 ou Wallace JL et al. Inhibition of leukotriene synthesis markedly accelerates healing in a rat model of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 1989 Jan;96(l):29- 36. PMID: 2535830.
[0178] Pour l'évaluation histologique, basée sur les critères d'Ameho, une coupe à 2 cm au- dessus du canal anal a été réalisée. Les coupes obtenues ont été colorées selon la technique de coloration MGG (May-Grünwald Giemsa). Ce classement sur une échelle de 0 à 6 prend en compte le degré de l'infiltrat inflammatoire, la présence d'érosion, d'ulcération ou de nécrose, ainsi que la profondeur et l'étendue des lésions. La méthode est décrite par Ameho et al., 1997, Gut.
[0179] L'inflammation a été évaluée dans le côlon par mesure de la production d'IL-ip (cytokine pro-inflammatoire) (kit eBioscience), ainsi que le niveau de la Lipocaline-2 (Lcn-2), marqueur de l'infiltration par les neutrophiles (Clinisciences) par quantification ELISA. Brièvement, un centimètre de côlon distal a été collecté et homogénéisé dans une solution de Tris-HCI contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma-Aldrich) par l'utilisation de l'homogénéisateur Precellys utilisant des billes de céramique (1,4 et 2,8 mm). Les échantillons obtenus ont été centrifugés pendant 20 min et les surnageants collectés et conservés à -80°C, jusqu'à leur utilisation pour les ELISAs.
[0180] Résultats
[0181] Figure 8A : Les inventeurs ont observé une diminution significative de la longueur du côlon dans le groupe de rats traité au TNBS et ayant reçu le véhicule en traitement par rapport au groupe contrôle ayant reçu le véhicule, comme attendue. Une augmentation significative de la longueur du côlon a été constatée dans le groupe de rats traités au TNBS ayant reçu la souche DSM 33715 par rapport au groupe TNBS-Véhicule. La souche DSM 33715 a un effet protecteur sur le côlon dans le modèle de colite induite par le TNBS.
[0182] Figure 8B : L'intensité de l'inflammation et des lésions du côlon a été évaluée au niveau macroscopique selon le score de Wallace. Une augmentation significative du score de Wallace a été observée dans les rats du groupe TNBS-Véhicule par rapport au groupe de rats "sains", avec respectivement un score de 7,00+/-0,41 vs 0,0+/-0,0, p<0,0001. Ce résultat indique que les rats présentaient une colite sévère 4 jours après l'induction avec un site ulcératif ou inflammatoire supérieur à 3 cm de colon (correspondant au score de 7, sur une échelle allant de 0 à 10). Une diminution significative du score a été observée dans le groupe TNBS-Pentasa et le groupe TNBS-DSM 33715. DSM 33715 améliore de 38% les lésions inflammatoires observées au niveau macroscopique par rapport au groupe TNBS-véhicule, avec un score de Wallace respectivement de 4,33+/-0,33 vs 7,00+/-0,41, p=0,049. Il en résulte que le traitement induit un effet anti-inflammatoire important.
[0183] Figure 8C : Une amélioration significative du score histologique - intensité des lésions inflammatoires- est observée dans le groupe de rats TNBS ayant reçu le Pentasa, contrôle positif, et la souche DSM 33715, par rapport aux rats TNBS ayant reçu le véhicule. Le Pentasa améliore le score de 13% et DSM 33715 de 36%.
[0184] Figure 8D : Le niveau de lipocaline-2, marqueur de l'infiltration des neutrophiles, est significativement augmenté chez les rats colitiques (TNBS-Véhicule) par rapport au contrôle sain, confirmant le développement d'une colite sévère. Une tendance à la diminution est observée pour le Pentasa et une diminution significative de la LCN-2 est observée dans le groupe de rats TNBS traités par la souche DSM 33715.
[0185] Comme attendu, une augmentation significative de l'IL-1 a été mesurée dans le côlon des rats du groupe TNBS-Véhicule, corrigée en partie par le traitement avec le Pentasa, validant le modèle. L'administration de DSM 33715 chez les rats colitiques a montré une diminution significative des niveaux d'IL-1 , indiquant un effet anti-inflammatoire de DSM 33715 dans le modèle de colite aigue induite par le TNBS chez le rat.
[0186] L'ensemble de ces résultats est en corrélation pour mettre en évidence des propriétés anti-inflammatoire de la souche DSM 33715, en particulier par rapport au traitement de référence sur ce type de pathologies mais également en comparaison avec la souche de référence de C. minuta. Ainsi, la souche selon l'invention possède un potentiel thérapeutique certain dans la dysbiose intestinales et en particulier dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires.
[0187] Exemple 9 : Essai comparatif dans un modèle in vivo de colite
[0188] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet in vivo de la souche selon l'invention et de la souche de référence C. minuta (DSM22607) dans un modèle de colite induite par le TNBS chez le rat. L'essai a été réalisé selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 8.
[0189] Une induction de TNBS ayant eu lieu après 2 semaines de prétraitement avec C. minuta ou le contrôle chez le rat, les scores macroscopiques et microscopiques ont été évalués.
[0190] Les scores macroscopiques (évaluations physiologiques reflétant l'inflammation sur la base de l'hyperémie, de l'épaississement de l'intestin, de la diarrhée et de l'étendue de l'ulcération), l'évolution du poids corporel et le poids du côlon ont été analysés 4 jours après l'induction au TNBS.
[0191] Résultats
[0192] Les résultats sont présentés en Figure 9. Les résultats présentés dans le panel A démontrent l'intensité de l'inflammation et des lésions du côlon qui ont été évaluées au niveau macroscopique selon le score de Wallace dans un modèle de colite aiguë induite par TNBS chez le rat. Ce résultat indique que les rats non traités présentaient une colite sévère 4 jours après l'induction. Un effet anti-inflammatoire a également été observé dans le groupe TNBS- DSM 22607 et plus encore dans le groupe TNBS-DSM 33715 (Invention). Ainsi, la souche DSM 22607 diminue de 27% l'apparition des lésions alors que la souche selon l'invention (DSM 33715) les décroît de 38% par rapport au groupe TNBS-véhicule. (Statistiques : p=0,02 et p= 0,0001 respectivement).
[0193] Les résultats présentés dans le panel B démontrent, dans ce même modèle de colite aiguë chez le rat, une diminution significative de 36% du score histologique des coupes de côlon dans le groupe de rats TNBS ayant reçu la souche selon l'invention (DSM 33715) alors que ce n'est pas le cas chez les animaux ayant reçu le traitement avec DSM 22607. Le score histologique étant le reflet de l'intensité des lésions inflammatoires au niveau tissulaire, ce résultat met en évidence une supériorité de la souche DSM 33715 par rapport à DSM 22607 dans le traitement de l'inflammation gastro-intestinale. [0194] Ainsi, l'ensemble de ces résultats indique des propriétés anti-inflammatoires importantes de la souche DSM 33715 et un effet supérieur par rapport à la souche de référence DSM 22607 dans le modèle de colite aiguë induite par le TNBS chez le rat.
TRAITÉ DE BUDAPEST SUR LA RECONNAISSANCE INTERNATIONALE
Figure imgf000034_0001
Ysopia Bioscience
REÇU DANS LE CAS D'UN DÉPÔT ORIGINAL
17 Place de la Bourse délivré conformément à la règle 7.1 par L'AUTORITÉ DE DÉPÔT INTERNATIONALE
33076 Bordeaux identifiée au bas de cette page FRANCE
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1 Lorsque la règle 6.4 d) s'applique, cette date est la date à laquelle le statut d'autorité de dépôt internationale a été acquis. TRAITÉ DE BUDAPEST SUR LA RECONNAISSANCE INTERNATIONALE
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Ysopia Bioscience
DÉCLARATION DE VIABILITÉ
17 Place de la Bourse délivrée conformément à la règle 10.2 par
L'AUTORITÉ DE DÉPÔT INTERNATIONALE
33076 Bordeaux identifiée au bas de cette page
FRANCE
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1 Indiquez la date du dépôt initial ou, lorsqu'un nouveau dépôt ou un transfert a été effectué, la date pertinente la plus récente (date du nouveau dépôt ou date du transfert).
2 Dans les cas visés à la règle 10.2(a) (ii) et (iii), se référer au test de viabilité le plus récent.
3 Marquez d'une croix la case appropriée.
4 A remplir si les informations ont été demandées et si les résultats du test étaient négatifs.
Formulaire DSMZ-BP/9 (page unique) 07/2019

Claims

Revendications
[Revendication 1] Souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715.
[Revendication 2] Surnageant de culture caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de la souche bactérienne selon la revendication précédente.
[Revendication 3] Composition comprenant (i) au moins une souche bactérienne selon la revendication 1 et/ou (ii) un surnageant selon la revendication 2 et (iii) au moins un excipient acceptable.
[Revendication 4] Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la bactérie est vivante, morte, atténuée ou inactivée.
[Revendication 5] Composition selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[Revendication 6] Composition selon l'une des revendications 3 à 5, ladite composition est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée.
[Revendication 7] Composition selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de poudre, de poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension, de suppositoire, d'un inhalateur ou de sirop.
[Revendication 8] Composition selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre).
[Revendication 9] Composition selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que les bactéries vivantes représentent entre 105 à 1011 CFU.
[Revendication 10] Composition selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de boisson, d'un produit alimentaire, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[Revendication 11] Composition selon l'une des revendications 3 à 9, comprenant également au moins un probiotique et/ou au moins une bactérie de la famille Christensenellacées et/ou un agent anti-inflammatoire.
[Revendication 12] Composition selon la revendication précédente, comprenant également une bactérie choisie parmi Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii, Anaerobutiryricum hallii, Hafnia alvei, Roseburia intestinalis, Roseburia hominis, Roseburia faecis, Roseburia inulinivorans, Dysosmobacter welbionis, Oscillospira guillermondii, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus casei, Latilactobacillus sakei, Ligilactobacillus salivarius, Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Levilactobacillus brevis, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium stercoris et Bifidobacterium thermophilum.
[Revendication 13] Composition selon l'une des revendications 11 ou 12, comprenant également un principe actif pharmaceutique choisi parmi la mesalamine, l'olsalazine, le budésonide, le tofacitinib, le filgotinib, l'upadacitinib, l'infliximab, l'adalimumab, le golimumab, le certolizumab, le vedolizumab et l'ustekinumab.
[Revendication 14] Composition selon l'une des revendications 3 à 9 et 11 à 13, pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.
[Revendication 15] Composition selon l'une des revendications 3 à 13, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose du microbiote.
[Revendication 16] Composition selon l'une des revendications 3 à 13, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie choisie parmi les maladies chroniques, les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires, les troubles de la fonction respiratoire, et les cancers.
[Revendication 17] Composition pour son utilisation selon la précédente revendication dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[Revendication 18] Composition pour son utilisation selon la précédente revendication, dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, les gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable.
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