WO2023032952A1 - リパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤 - Google Patents

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WO2023032952A1
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lipase
amino acid
transesterification
seq
acid sequence
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貫暉 松田
明紅 楊
侑朔 児玉
志帆 田伏
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天野エンザイム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a transesterification enzymatic agent containing lipase as an active ingredient and its use.
  • Lipases derived from Candida, Alcaligenes, Pseudomonas, Humicola (trade name: Novozyme, Lipozyme TL IM) can be used for enzymatic transesterification of fats and oils. However, there are few enzymes that are practical for food applications.
  • Patent Document 1 describes a lipase derived from Talaromyces thermophilus, which is used as a catalyst for biofuel synthesis (butyl oleate synthesis) and an esterification reaction.
  • Non-Patent Document 1 describes a lipase derived from Talaromyces thermophilus, and describes its use as a catalyst for a biofuel synthesis reaction (fatty acid methyl ester synthesis).
  • oils and fats containing stearic acid and palmitic acid as constituent fatty acids are solid at room temperature, it is necessary to maintain the temperature of the oils and fats at the melting point or higher during the reaction. Since lipases generally have low thermostability, development of lipases with better thermostability is desired. Furthermore, development of a lipase with high 1- and 3-position specificity is also required.
  • An object of the present invention is to provide a transesterification enzymatic agent containing, as an active ingredient, a lipase with excellent heat resistance and high 1,3-position specificity.
  • a further object of the present invention is to provide a method for producing modified fats and oils using the above transesterification enzymatic agent.
  • thermostable lipase from a strain library of more than 10,000 strains
  • Talaromyces thermophilus NBRC31798T strain sometimes referred to as Thermomyces dupontii NBRC31798T strain
  • the present invention was completed by discovering two types of thermostable lipases. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • a lipase consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • ⁇ 3> The enzymatic agent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the lipase is derived from Talaromyces thermophilus (also referred to as Thermomyces duponti).
  • ⁇ 4> A method for producing transesterified fats and oils, comprising allowing the enzymatic agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> to act on the fats and oils.
  • ⁇ 5> The method according to ⁇ 4>, wherein the enzymatic agent acts on fats and oils at a temperature of 60°C or higher.
  • ⁇ 6> A lipase comprising an amino acid sequence having 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, after treatment at 70 ° C. for 30 minutes in 50 mM PIPES buffer (pH 7.0) lipase, which still retains enzymatic activity.
  • ⁇ 7> A method for producing a lipase comprising the following steps (1) and (2): (1) culturing the microorganism having the ability to produce lipase according to ⁇ 6>; (2) recovering lipase from the culture medium and/or cells after culturing; ⁇ 8> The production method according to ⁇ 7>, wherein the microorganism is Talaromyces thermophilus (also referred to as Thermomyces duponti) strain NBRC31798T.
  • Talaromyces thermophilus also referred to as Thermomyces duponti
  • the lipase in the transesterification enzymatic agent of the present invention has high heat resistance and high 1- and 3-position specificity.
  • FIG. 1 shows the results of heat resistance evaluation.
  • the transesterification enzymatic agent of the present invention contains a lipase consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 as an active ingredient.
  • the lipase in the present invention is preferably a lipase derived from bacteria of the genus Talaromyces or Thermomyces, more preferably derived from Talaromyces thermophilus (also referred to as Thermomyces dupontii).
  • Lipase. “Derived from Talaromyces thermophilus” means a lipase produced by a microorganism classified as Talaromyces thermophilus (whether it is a wild strain or a mutant strain), or a lipase produced by Talaromyces thermophilus It means that it is a lipase obtained by a genetic engineering method using the lipase gene of Talaromyces thermophilus (or a modified gene).
  • a gene or a recombinant produced by a host microorganism into which a gene having a nucleotide sequence equivalent thereto has been introduced is also a lipase derived from Talaromyces thermophilus. is called the originating bacterium of the present enzyme, and the microorganism (Talaromyces thermophilus, host microorganism) used to produce the present enzyme is called the producing bacterium.
  • NBRC31798T strain A specific example of Talaromyces thermophilus is the Talaromyces thermophilus NBRC31798T strain.
  • the NBRC31798T strain is a strain (published as NBRC31798T in the NBRC Culture catalog) stored in the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture), and the prescribed procedure is performed. You can get it over time.
  • the amino acid sequences (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) of the lipase produced by the NBRC31798T strain were determined.
  • One aspect of the lipase in the present invention consists of a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4.
  • the protein after modification may have the same function as the protein before modification.
  • modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after modification.
  • a protein having an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having transesterification activity hereinafter also referred to as "equivalent protein" may be used.
  • the present invention relates to an enzymatic agent useful for transesterification of fats and oils (enzymatic agent for transesterification).
  • the enzyme agent of the present invention (hereinafter also referred to as “this enzyme agent”) contains transesterified lipase (hereinafter also referred to as “this enzyme”) as an active ingredient.
  • the active ingredient transesterification lipase that is, the present enzyme, consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence equivalent thereto.
  • the “equivalent amino acid sequence” is partially different from the reference amino acid sequence (amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or amino acid sequence of SEQ ID NO: 4), but the difference is related to protein function (here, transesterification ability).
  • the degree of activity is not particularly limited as long as it can exhibit its function as a transesterified lipase. However, it is preferably the same as or higher than the enzyme consisting of the reference amino acid sequence.
  • Partial difference in amino acid sequence includes, for example, deletion or substitution of one or more amino acids in the amino acids constituting the amino acid sequence, addition or insertion of one or more amino acids to the amino acid sequence, or caused by any combination of
  • a partial difference in the amino acid sequence is permissible as long as the transesterification activity is maintained (there may be some variation in the activity).
  • the positions where the amino acid sequences differ are not particularly limited.
  • differences in amino acid sequences may occur at multiple sites (sites).
  • the number of amino acids that cause partial differences in the amino acid sequence is, for example, a number corresponding to less than about 30%, preferably less than about 20%, more preferably a number corresponding to all amino acids constituting the amino acid sequence.
  • the equivalent protein is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, even more preferably about 90% or more, even more preferably about 93% or more, and further Even more preferably, they have an identity of about 95% or greater, more preferably about 97% or greater, even more preferably about 98% or greater, and most preferably about 99% or greater.
  • partial difference in amino acid sequence is 1 to 40 (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 1 to 40 (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, still more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3) amino acid addition, insertion, or a combination thereof to mutate (change) the amino acid sequence is occurring.
  • equivalent amino acid sequences are obtained by conservative amino acid substitutions at amino acid residues that are not essential for transesterification.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • Amino acid residues can have, depending on their side chain, a basic side chain (e.g. lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (e.g. aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine). , cysteine), nonpolar side chains (e.g.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine, Tryptophan, histidine) are classified into several families. Conservative amino acid substitutions are preferably between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences can be determined, for example, by the following procedure. First, the two sequences are aligned for optimal comparison (eg, gaps may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence). When the molecule (amino acid residue) at a particular position in the first sequence is the same as the molecule at the corresponding position in the second sequence, the molecules at that position are said to be identical.
  • the transesterified lipase which is the active ingredient of the enzymatic agent, that is, the enzyme may be part of a larger protein (eg, fusion protein).
  • Additional sequences in the fusion protein include, for example, sequences that aid in purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • the transesterification reaction refers to a reaction in which an acid group (carboxylic acid group) in an ester compound is exchanged with another acid (carboxylic acid). distinguished.
  • the transesterification reaction in the present invention refers to fatty acid residues constituting an acceptor substrate (oil (triglyceride), glycerin fatty acid ester (diglyceride, monoglyceride)) and a donor substrate (fatty acid, ester compound (fatty acid ester, etc.) or fat ( It refers to the reaction that exchanges the fatty acid of (which may be the same as the acceptor substrate)).
  • this enzymatic agent is used to modify and improve the physical properties of fats and oils and fat processed products, it will be possible to transesterify fats and oils with high melting points, resulting in a different fatty acid composition (especially the 2nd fatty acid) than before treatment. Improvement in quality (acquisition of desired physical properties) can be expected by becoming oils and fats with different compositions.
  • the content of the active ingredient (the present enzyme) in the enzymatic preparation is not particularly limited, but for example, the content of the active ingredient is set so that the enzymatic activity per gram of the enzymatic preparation is 1 U to 100000 U, preferably 10 U to 30000 U. or can be adjusted.
  • the enzymatic agent of the present invention is usually solid (for example, granules, powder, silica, diatomaceous earth, porous polymer, etc.). ) or in liquid form.
  • the enzyme preparation may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, and the like.
  • excipients include lactose, sorbitol, D-mannitol, maltodextrin, and sucrose.
  • Phosphate, citrate, acetate and the like can be used as buffers.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Preservatives that can be used include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like. As antiseptics, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the present invention further provides a lipase consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 99% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, wherein It relates to a lipase that retains enzymatic activity even after treatment.
  • the invention further relates to a lipase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4.
  • the present enzyme can be obtained by culturing a microorganism that produces transesterified lipase (transesterified lipase-producing strain).
  • the method for producing a lipase of the present invention may include the following steps (1) and (2).
  • the transesterified lipase-producing strain may be a wild strain or a mutant strain (for example, a mutant strain can be obtained by ultraviolet irradiation).
  • a specific example of the strain producing this enzyme is Talaromyces thermophilus NBRC31798T strain. Mutants can be obtained by irradiation with ultraviolet rays, X-rays, gamma rays, or the like, treatment with nitrous acid, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, or the like. Mutants are not limited as long as they produce the present enzyme. Mutant strains include strains with improved productivity of the present enzyme, strains with reduced productivity of contaminants, strains with easier culture, and strains with easier recovery from the culture medium.
  • a step of culturing a microorganism that produces this enzyme (step (1)) and a step of recovering lipase from the culture solution and/or bacterial cells after culturing (step (2)) are performed. can be done.
  • the culture conditions and culture method are not particularly limited as long as the enzyme is produced. That is, on the condition that the present enzyme is produced, a method and culture conditions suitable for culturing the microorganism to be used can be appropriately set.
  • a culture method either liquid culture or solid culture may be used, but liquid culture is preferably used. Taking liquid culture as an example, the culture conditions will be described.
  • the medium is not particularly limited as long as it allows the microorganisms to be used to grow.
  • glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses carbon sources such as organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate, or peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein.
  • Nitrogen sources such as hydrolysates, bran and meat extracts, and inorganic salts such as potassium salts, magnesium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, iron salts and zinc salts can be used. Vitamins, amino acids, etc.
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 8, preferably about 4 to 7, and the culture temperature is usually about 20 to 40°C, preferably about 25 to 35°C, for 1 to 20 days, preferably 3 to 3. Incubate under aerobic conditions for about 10 days.
  • a shake culture method and an aerobic submerged culture method using a jar fermenter can be used.
  • the target enzyme is recovered from the culture medium or the cells (step (2)).
  • the culture solution for example, after removing insoluble matter by filtering or centrifuging the culture supernatant, concentration with an ultrafiltration membrane, salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, ion exchange resin, etc.
  • the present enzyme can be obtained by separating and purifying by appropriately combining various chromatographic techniques.
  • the present enzyme when it is recovered from the cells, can be obtained by, for example, crushing the cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., followed by separation and purification in the same manner as described above.
  • the series of steps may be performed after collecting the bacterial cells from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like.
  • This enzyme can be easily prepared by genetic engineering techniques.
  • DNA encoding the present enzyme for example, the DNA sequence encoding the present enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is sequenced as SEQ ID NO: 1, and the DNA sequence encoding the present enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is sequenced. 3, respectively
  • transforming an appropriate host cell eg, E. coli
  • recovering the protein expressed in the transformant eg, E. coli
  • the recovered protein is appropriately purified depending on the purpose. If the present enzyme is obtained as a recombinant protein in this way, various modifications are possible.
  • the recombinant protein consists of any peptide or protein linked thereto.
  • This enzyme can be obtained.
  • addition of sugar chains and/or lipids, or modification that causes N-terminal or C-terminal processing may be performed. Such modifications enable extraction of recombinant proteins, simplification of purification, addition of biological functions, and the like.
  • an appropriate host-vector system is usually used to express the gene and recover the expression product (this enzyme), but a cell-free synthesis system may also be used.
  • the "cell-free synthesis system does not use living cells, but ribosomes derived from living cells (or obtained by genetic engineering techniques), It refers to the in vitro synthesis of mRNA or protein encoded by a template nucleic acid (DNA or mRNA) using transcription/translation factors.
  • a cell-free synthesis system generally uses a cell extract obtained by purifying a cell lysate as necessary.
  • Cell extracts generally contain various factors such as ribosomes and initiation factors necessary for protein synthesis, and various enzymes such as tRNA. When synthesizing proteins, other substances necessary for protein synthesis such as various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and creatine phosphate are added to the cell extract. Of course, ribosomes, various factors, and/or various enzymes prepared separately may be supplemented as necessary during protein synthesis.
  • cell-free transcription/translation system is used interchangeably with cell-free protein synthesis system, in vitro translation system or in vitro transcription/translation system.
  • In vitro translation systems use RNA as a template to synthesize proteins. Total RNA, mRNA, in vitro transcripts and the like are used as template RNA.
  • the other in vitro transcription/translation system uses DNA as a template.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably contains a suitable terminator sequence.
  • conditions are set such that factors necessary for each reaction are added so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • the purified enzyme obtained as described above can be powdered by, for example, freeze-drying, vacuum-drying, or spray-drying. At that time, the purified enzyme may be dissolved in advance in acetate buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, Tris-HCl buffer, or GOOD buffer. Preferably, acetate buffers, phosphate buffers and triethanolamine buffers can be used.
  • the GOOD buffer includes PIPES, MES or MOPS.
  • the degree of purification of the enzyme is not particularly limited, for example, it can be purified to have a specific hydrolytic activity of 1 to 100,000 (U/ ⁇ g), preferably 10 to 20,000 (U/ ⁇ g).
  • the final form may be liquid or solid (including powder).
  • transesterification method for oils and fats there is provided a method for producing transesterified fats and oils, which comprises allowing the present enzymatic agent to act on fats and oils. That is, according to the present invention, a method for transesterification of fats and oils using the present enzymatic agent is provided.
  • a step of acting the present enzymatic agent or the present enzyme on fats and oils is performed, and by this step, transesterification of fats and oils, i.e., triacylglycerol (abbreviated as TG or TAG) in fats and oils. are rearranged (rearranged).
  • Oils and fats that can be processed by the transesterification method of the present invention include soybean oil, rapeseed oil, rice oil, corn oil, sunflower oil, cottonseed oil, peanut oil, safflower oil, palm oil, soft palm oil, fractionated palm oil, and palm kernel.
  • Vegetable oils and fats such as oil, coconut oil and cacao butter, animal oils and fats such as fish oil, lard, beef tallow and milk fat, fractionated oils thereof, hydrogenated oils, and synthetic oils and fats such as trilaurin, triolein and tripalmitin can be exemplified.
  • the transesterification method of the present invention can be used for transesterification between fats and oils, as well as for transesterification between fats and oils and fatty acids or fatty acid esters.
  • fatty acids are stearic acid, palmitic acid, lauric acid, arachidic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid
  • fatty acid esters are ethyl stearate, ethyl palmitate, ethyl oleate, ethyl linoleate.
  • the present enzymatic agent or the present enzyme is added to oils and fats, and the is 60° C. to 100° C., more preferably 70° C. to 100° C., more preferably 80° C. to 100° C., for a predetermined time (for example, 10 minutes to 72 hours, 1 hour to 48 hours, 2 hours to 24 hours). react. In order to promote the reaction, it is preferable to stir during the reaction.
  • the enzymatic agent or the enzyme may be subjected to an immobilization treatment, and the reaction with the immobilized enzyme may be performed.
  • an immobilization treatment for reactions with immobilized enzymes, a batch stirred tank reactor, a flow stirred tank reactor, a packed bed reactor, a fluidized bed reactor, or the like can be used.
  • the transesterification method of the present invention is useful for modifying and improving the physical properties of fats and oils or fat processed products (eg, shortening, margarine, cocoa butter alternatives). For example, improvement of spreadability, improvement of emulsion stability, optimization of solid fat content (SFC), improvement of solidification property, selective concentration of specific fatty acids, production of low trans acid fat or low trans acid fat processed products For such purposes, the transesterification method of the present invention can be applied.
  • the oil or fat obtained by applying the transesterification method of the present invention or the oil-and-fat processed product containing the same has improved physical properties compared to before the treatment, and has high industrial utility value.
  • transesterified fats and oils can be produced. That is, the present invention also provides a method for producing a transesterified fat.
  • an acceptor substrate fat (triglyceride), glycerin fatty acid ester (diglyceride, monoglyceride)
  • a donor substrate fatty acid, ester compound (fatty acid ester, etc.) or fat (which may be the same as the acceptor substrate)
  • the present enzymatic agent or the present enzyme is allowed to act (that is, the enzymatic reaction is performed in the presence of the acceptor substrate and the donor substrate).
  • the fats, oils, fatty acids, and fatty acid esters used for the acceptor substrate and donor substrate are those described above.
  • the enzyme reaction conditions are the above conditions (for example, 30 to 100°C, preferably 40 to 100°C, more preferably 60 to 100°C, more preferably 70 to 90°C, for a predetermined time (for example, 1 hour to 48°C). time) to react) can be employed.
  • OEO triolein
  • SOS fat S: A method for producing stearic acid, O: oleic acid
  • SOS fat is a triglyceride in which stearic acid (S) and oleic acid (O) are bound to glycerin in the order of SOS.
  • Example 1 Determination of sequence ⁇ Preparation of TDL2 gene probe for Southern blotting> Using the genomic DNA of Talaromyces thermophilus NBRC31798T as a template, the primers shown in Table 1 were designed, and a TDL2 gene probe was prepared by PCR labeling using a PCR DIG Synthesis kit (manufactured by Roche).
  • a sample obtained by treating the genomic DNA of Talaromyces thermophilus NBRC31798T with BamHI overnight at 37°C and a TDL2 gene probe were used to perform Southern blotting, and two bands were detected. It was presumed that the band of about 3.0 kbp was a fragment containing the entire TDL2 gene, and the band of about 5.0 kbp was a fragment containing the entire length of TDL1. About 5.0 kbp and about 3.0 kbp fragments thought to contain the TDL1 gene and TDL2 gene, respectively, were used to carry out a ligation reaction to self-circularize the DNA.
  • PCR was performed using primer F2 and primer R2 in Table 2 using the self-circularized DNA (about 5.0 kbp) as a template.
  • self-circularized DNA approximately 3.0 kbp
  • PCR was performed with primer F3 and primer R3 of . The amplified DNA fragment was purified and subjected to sequence analysis.
  • TDL1 and TDL2 gene sequences are listed in Table 3, and the amino acid sequences translated based on the determined TDL1 and TDL2 gene sequences are listed in Table 4.
  • thermostable lipase gene Based on the identified thermostable lipase gene, the cDNA sequence was estimated by FGENESH (FGENESH - HMM-based gene structure prediction (softberry.com)).
  • Example 2 Evaluation of heat resistance ⁇ Preparation of purified enzyme>
  • Talaromyces thermophilus NBRC31798T was solid-cultured (cultivated at 40°C for 4 days) in an autoclaved wheat bran medium and filtered.
  • anion exchange chromatography HiPrep DEAE FF manufactured by GE Healthcare
  • 20 mM phosphate buffer pH 7.0
  • 20 mM phosphate buffer pH 7.0
  • a purified enzyme was obtained by hydrophobic chromatography (Hitrap Butyl FF manufactured by GE Healthcare) under linear gradient conditions of a liquid (pH 7.0).
  • TDL2 showed high heat resistance even after treatment at 70°C and 100°C for 30 minutes, as reaction products (diolein and oleic acid) were observed even in samples treated at 70°C and 100°C. I have confirmed that I have it.
  • TDL1 gene SEQ ID NO: 5
  • TDL2 gene SEQ ID NO: 6
  • the amplified DNA was ligated to a filamentous fungal expression vector (pUC19 containing an Aspergillus oryzae-derived ⁇ -amylase-modified promoter, an Aspergillus oryzae-derived FAD-GDH terminator and a pyrG gene) and introduced into A. oryzae by the protoplast-PEG method.
  • a filamentous fungal expression vector pUC19 containing an Aspergillus oryzae-derived ⁇ -amylase-modified promoter, an Aspergillus oryzae-derived FAD-GDH terminator and a pyrG gene
  • ⁇ Method for obtaining recombinant enzyme The resulting transformant was inoculated into a liquid medium (pH 6.0) containing starch, yeast extract and inorganic salts, and cultured at 30° C. for 90 hours with aeration. The culture supernatant was filtered through diatomaceous earth to remove producing cells, concentrated with an ultrafiltration membrane, and freeze-dried to obtain a dry powder of the enzyme.
  • a liquid medium pH 6.0
  • the culture supernatant was filtered through diatomaceous earth to remove producing cells, concentrated with an ultrafiltration membrane, and freeze-dried to obtain a dry powder of the enzyme.
  • Diatomaceous earth was used as an immobilization support.
  • the amount of protein in the dry enzyme powder was measured using the Bradford method kit (BIO-RAD), and based on the measured value, the dry enzyme powder was dissolved in 1 mL of purified water so that the protein amount was 0.1 g, and the enzyme was dissolved. liquid. According to a conventional method, it was immobilized on an immobilization carrier (Celite No. 535 (manufactured by Celite)), and immobilized enzymes (TDL1-IM, TDL2-IM) were prepared.
  • an immobilization carrier Celite No. 535 (manufactured by Celite)
  • immobilized enzymes TDL1-IM, TDL2-IM
  • ⁇ Evaluation method> 3.4 g of triolein (olein rich, manufactured by Showa Sangyo) and 5 g of methyl palmitate (manufactured by Wako) were added to a 50 mL tube, and the mixture was kept at the reaction temperature (40° C., 80° C.) for 30 minutes.
  • Lipozyme TL-IM (Novozymes), TDL1-IM and TDL2-IM were used as immobilized enzymes. After adding 0.05 g of each immobilized enzyme, the mixture was shaken to react. After 20 hours, the supernatant was collected and used as a reaction sample.
  • POP palmitic acid at the 1st and 3rd positions of glycerol, oleic acid at the 2nd position of glycerin
  • PPO palmitic acid at the 1st and 2nd positions of glycerin, oleic acid at the 3rd position
  • the acid-ester bond) ratio was analyzed by HPLC. After adding 0.9 mL hexane and 0.1 mL GC analysis sample to the vial and stirring well using a vortex mixer, HPLC analysis was performed under the following conditions. From the areas of POP and PPO, the POP ratio (%) was calculated by POP/(POP+PPO).
  • TDL1-IM and TDL2-IM showed a high POP ratio at 80°C. It was suggested that the 1,3-position specificity in the high-temperature reaction is higher than that of Lipozyme TL-IM.
  • the POP ratio was evaluated after reaction with each lipase so that the amount of OAME produced was about 20%.
  • the reaction temperature was 80° C. and the reaction was carried out according to the evaluation method described above. The amount of enzyme added and the reaction time were appropriately adjusted, and the supernatant was collected when the amount of OAME produced reached about 20%.
  • Table 2 shows the POP ratio (%) when using each lipase.
  • TDL1-IM and TDL2-IM showed a higher POP ratio than Lipozyme TL-IM, even when the amount of OAME produced was the same.
  • the enzymatic agent of the present invention is suitable for use in the fields of food and medical applications, and has high industrial utility value.
  • the enzymatic agent for transesterification of the present invention which contains a lipase with high heat resistance and high 1,3-position specificity, is useful for producing cocoa butter substitute fat.

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Abstract

本発明の課題は、耐熱性に優れ、１，３位特異性が高いリパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤を提供することである。本発明によれば、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤が提供される。

Description

リパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤
　本発明は、リパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤及びその用途に関する。
　油脂の物性の改質方法としては、化学的エステル交換と酵素的エステル交換の２つがある。しかし、化学的エステル交換は環境負荷が高いことから、酵素的エステル交換への期待が高まっている。油脂の酵素的エステル交換のための酵素としては、エステル交換能を有する一部のリパーゼを使用することができる。
　油脂の酵素的エステル交換には、キャンディダ属（Candida）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、シュードモナス属（Pseudomonas）、フミコーラ属（商品名：ノボザイム社、Lipozyme TL IM）等の由来のリパーゼが利用できるとされているが、食品用途に実用できる酵素は少ない。
　一方、特許文献１には、Talaromyces thermophilus由来リパーゼが記載されており、バイオ燃料の合成反応（オレイン酸ブチル合成）の触媒、及びエステル化反応の触媒として使用することが記載されている。非特許文献１には、Talaromyces thermophilus由来リパーゼが記載されており、バイオ燃料の合成反応（脂肪酸メチルエステル合成）の触媒として使用することが記載されている。
チュニジア特許出願番号TN/P/2011/193
Gene Volume 494, Issue 1, 15 February 2012, Pages 112-118
　上記の通り、油脂の物性を酵素的エステル交換により改質することが検討されている。ステアリン酸及びパルミチン酸を構成脂肪酸として有する油脂は常温で固体であることから、反応時に油脂を融点以上の温度に維持して反応させる必要がある。リパーゼは一般的に熱安定性が低いことから、より耐熱性に優れたリパーゼの開発が求められている。さらに１，３位特異性が高いリパーゼの開発も求められている。
　本発明は、耐熱性に優れ、１，３位特異性が高いリパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記のエステル交換用酵素剤を用いた改質された油脂の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、１万株以上の菌株ライブラリーから耐熱性リパーゼをスクリーニングした結果、Talaromyces thermophilus ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株（Thermomyces dupontii ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株と称する場合もある）由来の耐熱性リパーゼ２種類を見出することにより、本発明を完成するに至った。本発明によれば以下の発明が提供される。
＜１＞　配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤。
＜２＞　リパーゼが、タラロマイセス（サーモマイセスと称する場合もある）属細菌由来である、＜１＞に記載の酵素剤。
＜３＞　リパーゼが、タラロマイセス・サーモフィラス（サーモマイセス・デュポンティと称する場合もある）由来である、＜１＞又は＜２＞に記載の酵素剤。
＜４＞　＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の酵素剤を油脂に作用させることを含む、エステル交換された油脂の製造方法。
＜５＞　酵素剤を６０℃以上の温度において油脂に作用させる、＜４＞に記載の方法。
＜６＞　配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼであって、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で７０℃で３０分処理後も酵素活性が残存する、リパーゼ。
＜７＞　以下のステップ（１）及び（２）を含んでなる、リパーゼの製造法：
　（１）＜６＞に記載のリパーゼの産生能を有する微生物を培養するステップ；
　（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、リパーゼを回収するステップ；
＜８＞　微生物が、タラロマイセス・サーモフィラス（サーモマイセス・デュポンティと称する場合もある）ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株である、＜７＞に記載の製造法。
　本発明のエステル交換用酵素剤におけるリパーゼは、耐熱性が高く、かつ１，３位特異性が高い。
図１は、耐熱性評価の結果を示す。
＜１＞エステル交換用酵素剤及びその有効成分（リパーゼ）
　本発明のエステル交換用酵素剤は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを有効成分として含有する。
　本発明におけるリパーゼは、好ましくは、Talaromyces属又はThermomyces属細菌に由来するリパーゼであり、より好ましくはタラロマイセス・サーモフィラス（Talaromyces thermophilus）（サーモマイセス・デュポンティ（Thermomyces dupontii）と称する場合もある）に由来するリパーゼである。「タラロマイセス・サーモフィラス（Talaromyces thermophilus）に由来するとは、タラロマイセス・サーモフィラスに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するリパーゼ、あるいはタラロマイセス・サーモフィラス（野生株であっても変異株であってもよい）のリパーゼ遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたリパーゼであることを意味する。従って、タラロマイセス・サーモフィラスより取得したリパーゼ遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）又はそれと等価な塩基配列を有する遺伝子を導入した宿主微生物によって生産された組み換え体も、タラロマイセス・サーモフィラスに由来するリパーゼに該当する。本酵素がそれに由来することになるタラロマイセス・サーモフィラス（のことを、本酵素の由来菌という。また、本酵素を生産するために用いた微生物（タラロマイセス・サーモフィラス、宿主微生物）を生産菌という。
　タラロマイセス・サーモフィラスの具体例は、Talaromyces thermophilus ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株である。ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に保存された菌株（NBRC CultureカタログにＮＢＲＣ３１７９８Ｔとして掲載されている）であり、所定の手続を経ることにより、入手することができる。
　ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株が産生するリパーゼのアミノ酸配列（配列番号２及び配列番号４）が決定された。本発明におけるリパーゼの一態様は、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。本発明においては、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなり、エステル交換活性を有するタンパク質（以下、「等価タンパク質」ともいう）を使用してもよい。
　本発明は、油脂のエステル交換に有用な酵素剤（エステル交換用酵素剤）に関する。本発明の酵素剤（以下、「本酵素剤」とも呼ぶ）は有効成分としてエステル交換リパーゼ（以下、「本酵素」とも呼ぶ）を含有する。有効成分のエステル交換リパーゼ、即ち本酵素は、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなる。
　「等価なアミノ酸配列」とは、基準のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸配列）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではエステル交換能）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。従って、等価なアミノ酸配列を有する酵素はエステル交換反応を触媒する。活性の程度は、エステル交換リパーゼとしての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、基準となるアミノ酸配列からなる酵素と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。
　「アミノ酸配列の一部の相違」は、例えば、アミノ酸配列を構成するアミノ酸の中の１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、アミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの任意の組合せによって生じる。アミノ酸配列の一部の相違はエステル交換活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列の相違する位置は特に限定されない。また、アミノ酸配列の相違が複数の箇所（場所）で生じていてもよい。
　アミノ酸配列の一部の相違をもたらすアミノ酸の数は、アミノ酸配列を構成する全アミノ酸の例えば約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、より好ましくは約１５％に相当する数であり、更に好ましくは約１０％未満に相当する数であり、更に更に好ましくは約７％未満に相当する数であり、更に更に更に好ましくは約５％未満に相当する数であり、一層好ましくは約３％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約２％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。従って、等価タンパク質は、基準のアミノ酸配列と例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、更に好ましくは約９０％以上、更に更に好ましくは約９３％以上、更に更に更に好ましくは約９５％以上、一層好ましくは約９７％以上、より一層好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する。
　「アミノ酸配列の一部の相違」の典型例の一つは、アミノ酸配列を構成するアミノ酸の中の１～４０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～７個、更に更に好ましくは１～５個、より一層好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、アミノ酸配列に対して１～４０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～７個、更に更に好ましくは１～５個、より一層好ましくは１～３個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることである。
　好ましくは、エステル交換能に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換が生じることによって等価なアミノ酸配列が得られる。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　二つのアミノ酸配列の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
　二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。アミノ酸配列の同一性は例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のblastp(protein-protein BLAST)により得ることが出来る。パラメータはデフォルトのパラメータを用いれば良いが、例えばBLOSUM62マトリックスを使用してGap CostsをExistence:11、Extension:1に設定すればよい。
　本酵素剤の有効成分であるエステル交換リパーゼ、即ち本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　本酵素剤の有効成分である本酵素はエステル交換反応を触媒する。エステル交換反応とは、エステル化合物における酸基（カルボン酸基）を他の酸（カルボン酸）に交換する反応のことを言い、エステル化反応（カルボン酸とアルコールからエステルを生成する反応）とは区別される。本発明におけるエステル交換反応とは、受容体基質（油脂（トリグリセリド）、グリセリン脂肪酸エステル（ジグリセリド、モノグリセリド））を構成する脂肪酸残基と供与体基質（脂肪酸、エステル化合物（脂肪酸エステルなど）若しくは油脂（受容体基質と同じでもよい））の脂肪酸を交換する反応のことを言う。
　本酵素剤を油脂、油脂加工品等の物性の改質・改良に利用すれば、融点が高い油脂に対して、エステル交換が可能となり、処理前とは異なる脂肪酸組成（特に2位の脂肪酸が異なる組成）の油脂になることによる品質の向上（所望の物性の獲得）が期待できる。
　本酵素剤における有効成分（本酵素）の含有量は特に限定されないが、例えば、本酵素剤1g当たりの酵素活性が1U～100000U、好ましくは10U～30000Uになるように有効成分の含有量を設定ないし調整することができる。本発明の酵素剤は通常、固体状（例えば、顆粒、粉体、或いはシリカや珪藻土、また多孔質ポリマー等の担体表面又は内部に酵素を固定させうる素材に当該酵素を固定化した固定化酵素）又は液体状で提供される。
　本酵素剤は、有効成分（本酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、マルトデキストリン、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
　本発明はさらに、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼであって、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で７０℃で３０分処理後も酵素活性が残存する、リパーゼに関する。本発明はさらに、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列からなるリパーゼに関する。
＜２＞本酵素の製造方法
　本酵素は、エステル交換リパーゼを産生する微生物（エステル交換リパーゼ産生株）を培養することにより得ることができる。
　本発明のリパーゼの製造法は、以下のステップ（１）及び（２）を含んでいてもよい。
（１）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼであって、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で７０℃で３０分処理後も酵素活性が残存するリパーゼの産生能を有する微生物を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、リパーゼを回収するステップ。
　エステル交換リパーゼ産生株は野生株であっても変異株（例えば紫外線照射によって変異株が得られる）であってもよい。本酵素の産生株の具体例は、タラロマイセス・サーモフィラス（Talaromyces thermophilus）ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株である。変異株は、紫外線、Ｘ線、γ線などの照射、亜硝酸、ヒドロキルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジンなどによる処理等によって得ることができる。変異株は、本酵素を産生する限り限定されない。変異株として、本酵素の生産性が向上した株、夾雑物の生産性が低減した株、培養が容易になった株、培養液からの回収が容易になった株などが挙げられる。
　本酵素の製造方法としては、本酵素を産生する微生物を培養するステップ（ステップ(1)）と培養後の培養液及び／又は菌体よりリパーゼを回収するステップ（ステップ(2)）を行うことができる。
　培養条件や培養法は、本酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
　培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に限定されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3～8、好ましくは約4～7程度に調整し、培養温度は通常約20～40℃、好ましくは約25～35℃程度で、1～20日間、好ましくは3～10日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　以上の条件で培養した後、培養液又は菌体より目的の酵素を回収する（ステップ(2)）。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
　本酵素は、遺伝子工学的手法によっても容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNA（一例として、配列番号２のアミノ酸配列からなる本酵素をコードするDNA配列を配列番号１に、配列番号４のアミノ酸配列からなる本酵素をコードするDNA配列を配列番号３にそれぞれ示す）で適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　通常は、以上のように適当な宿主－ベクター系を利用して遺伝子の発現～発現産物（本酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
　用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
　上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予め酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
　酵素の精製度は特に限定されないが、例えば加水分解活性の比活性が1～100000（U/μg）、好ましくは比活性が10～20000（U/μg）の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
＜３＞本酵素剤／本酵素の用途（油脂のエステル交換法）
　本発明によれば、本酵素剤を油脂に作用させることを含む、エステル交換された油脂の製造方法が提供される。即ち、本発明によれば、本酵素剤を用いた油脂のエステル交換法が提供される。本発明のエステル交換法では本酵素剤又は本酵素を油脂に作用させるステップを行い、当該ステップによって油脂のエステル交換、即ち、油脂中のトリアシルグリセロール（TG又はTAGと略称される）の構成脂肪酸を再編成（再配列）させる。
　本発明のエステル交換法によって処理可能な油脂として、大豆油、ナタネ油、米油、コーン油、ひまわり油、綿実油、落花生油、サフラワー油、パーム油、パーム軟質油、パーム分別油、パーム核油、ヤシ油、カカオバター等の植物油脂、魚油、ラード、牛脂、乳脂等の動物油脂及びこれらの分別油、硬化油、トリラウリン、トリオレイン、トリパルミチン等の合成油脂を例示することができる。本発明のエステル交換法は、油脂同士のエステル交換の他、油脂と脂肪酸又は脂肪酸エステルとの間のエステル交換に利用可能である。脂肪酸の例はステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸であり、脂肪酸エステルの例はステアリン酸エチル、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチルである。
　本発明のエステル交換法では、本酵素剤又は本酵素を油脂に添加し、例えば１０～１１０℃、２０～１１０℃、３０～１０５℃、４０～１０５℃、好ましくは５０～１００℃、より好ましくは６０℃～１００℃、さらに好ましくは７０℃～１００℃、一層好ましくは８０℃～１００℃の条件下、所定時間（例えば１０分～７２時間、１時間～４８時間、２時間～２４時間）反応させる。反応を促進させるために、反応中は攪拌するとよい。
　本酵素剤又は本酵素を固定化処理に供し、固定化酵素による反応を行うことにしてもよい。固定化酵素による反応には、回分式攪拌槽型反応器、流通式攪拌槽型反応器、充填層型反応器、流動層型反応器等を利用できる。
　本発明のエステル交換法は油脂又は油脂加工品（例えばショートニング、マーガリン、カカオバター代替脂）の物性の改質・改良に有用である。例えば、展延性の向上、エマルジョン安定性の向上、固体脂含有値（ＳＦＣ）の最適化、固化性の向上、特定の脂肪酸の選択的濃縮、低トランス酸油脂又は低トランス酸油脂加工品の製造等を目的として、本発明のエステル交換法を適用することができる。本発明のエステル交換法を適用して得られる油脂又はそれを含む油脂加工品は、処理前に比して物性に改善を認め、産業上の利用価値が高い。
　本発明のエステル交換法によればエステル交換油脂を製造することができる。即ち、本発明はエステル交換油脂の製造方法も提供することになる。典型的には、本発明のエステル交換油脂の製造方法では、受容体基質（油脂（トリグリセリド）、グリセリン脂肪酸エステル（ジグリセリド、モノグリセリド））と供与体基質（脂肪酸、エステル化合物（脂肪酸エステルなど）若しくは油脂（受容体基質と同じでもよい））を準備し、本酵素剤又は本酵素を作用させる（即ち受容体基質と供与体基質の存在下での酵素反応を行う）。受容体基質や供与体基質に使用される油脂、脂肪酸、脂肪酸エステルは上記のものを使用することができる。酵素反応の条件は上記の条件（例えば３０～１００℃、好ましくは４０～１００℃、より好ましくは６０℃～１００℃、さらに好ましくは７０～９０℃の条件下、所定時間（例えば１時間～４８時間）反応させる）を採用することができる。本発明の一例によれば、受容体基質としてトリオレイン（ＯＯＯ）（Ｏ：オレイン酸）、および供与体基質としてステアリン酸又はステアリン酸メチルを準備する工程と、準備した受容体基質と供与体基質に本酵素剤又は本酵素を４０～１００℃、好ましくは６０～１００℃、より好ましくは７０～９０℃の条件下で作用させる工程を含む、カカオバターの主成分となる、ＳＯＳ脂（Ｓ：ステアリン酸、Ｏ：オレイン酸）の製造方法が提供される。ＳＯＳ脂とは、グリセリンにステアリン酸（Ｓ）とオレイン酸（Ｏ）がＳＯＳの順に結合したトリグリセリドである。
実施例１：配列の決定
＜サザンブロッティング用TDL2遺伝子プローブの調製＞
　鋳型として、Talaromyces thermophilus ＮＢＲＣ３１７９８ＴのゲノムDNAを用いて、表１のプライマーを設計してPCR DIG Synthesis kit（Roche社製）を用いたPCRラベリングにてTDL2遺伝子プローブを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Talaromyces thermophilus ＮＢＲＣ３１７９８ＴのゲノムDNAをBamHIにて37℃、一晩処理したサンプルと、TDL2遺伝子プローブを用いて、サザンブロッティングを行った結果、2本のバンドを検出した。約3.0kbpのバンドがTDL2遺伝子の全長を含んだ断片であり、約5.0kbpのバンドについては、TDL1の全長を含んだ断片が検出されたと推測した。TDL1遺伝子およびTDL2遺伝子のそれぞれが含まれると考えられる約5.0kbpおよび約3.0kbpの各断片を用いて、ライゲーション反応を行い、DNAを自己環化させた。
　TDL1遺伝子を含むDNA断片の増幅を行うため、自己環化させたDNA（約5.0kbp）をテンプレートとして用いて、表２のプライマーF2およびプライマーR2にてPCRを行った。
　TDL2遺伝子を含むDNA断片の増幅を行うため、自己環化させたDNA（約3.0kbp）をテンプレートとして用いて、表2．のプライマーF3およびプライマーR3にてPCRを行った。
　増幅したDNA断片を精製し、シーケンス解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　判明したTDL1遺伝子およびTDL2遺伝子の配列は表３に記載し、判明したTDL1遺伝子およびTDL2遺伝子の配列をもとに翻訳したアミノ酸配列は表４に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　判明した耐熱性リパーゼ遺伝子をもとに、FGENESH（FGENESH - HMM-based gene structure prediction (softberry.com)）にてcDNA配列を推定した。
TDL1のcDNA配列（配列番号１）
ATGAGGAGCTCGCTCGTGCTGTTCTTCGTTTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCAGTCCTGTCCGACGAGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTGACCAGTTCAACCTCTTTGCGCAGTACTCGGCGGCCGCATACTGCGCGAAGAACAACGATGCCCCGGCAGGTGGGAACGTAACGTGCAGGGGAAGTATTTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAGGATTCTGGAGTTGGCGATGTCACCGGGTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACAGACTGATCGTCCTCTCTTTCCGCGGCTCTCGTTCCCTGGAAAACTGGATCGGGAATATCAACTTGGACTTGAAAGGAATTGACGACATCTGCTCTGGCTGCAAGGGACATGACGGCTTCACTTCCTCCTGGAGGTCCGTTGCCAATACCTTGACTCAGCAAGTGCAGAATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTACCGCGTCGTCTTCACTGGGCACAGCTTGGGTGGTGCATTGGCAACTGTGGCCGGGGCATCTCTGCGTGGAAATGGGTACGATATAGATGTGTTCTCATATGGCGCTCCCCGCGTCGGAAACAGGGCTTTTGCGGAATTCCTGACCGCACAGACCGGCGGCACCTTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCGCCACGCGAATTGGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAGTATTGGATCACGTCTGGAACCCTCGTCCCAGTGACCAAGAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATCGATTCCACCGATGGAAACAACCAGCCAAATACCCCGGACATTGCTGCGCACCTATGGTACTTCGGGTCAATGGCGACGTGTTTGTAA
TDL2のcDNA配列（配列番号３）
ATGAGAGGTTTTCTCGTGCTGTTCTTCATCTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCAGGCCTGTTCGACGAGAAGTCTCGCAGGATCTGCTCGATCTGTTCAACCTCTTTGCACAATACTCGGCAGCCGCCTACTGCGCGGAAAACAACGACGCTCCAGTGGGCTCGAACGTAACGTGCTCGGAGAATGTCTGTCCCAAGGTAGAGGAGGCGGACGCAACATTCCTCTATTCTTTTGAAGATTCTGGACTGGGCGATGTCACCGGCCTTCTCGCGCTCGACAACACGAACAAACTGATCGTCCTTGCTTTCCGCGGCTCTCGCTCAATAGAGAACTGGATCGGGAATCTCATCGTCGGTCTGCGAGATATCGACGATATCTGCTCCGGCTGCGAGGGGCATACCGGCTTCGTGGCTTCCTGGAAGTCCGTAGCCAATACCCTGAGAGGACAGGTCGAGAATGCCGTGAAGGAGCATCCCGACTACCGCGTGGTCTTCACAGGACATAGTTTGGGTGGTGCACTGGCAACCATTGCTGGAGCCGCTCTGCGTGGGAATGGGTATAATATCGACGTGTTCTCATATGGCGCCCCCCGCGTCGGCAACAGGGCTTTTGCAGAATTTCTGACCGCACAGACCGGTGGCACCCTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCACCGCGAGACTGGGGTTACAGTCACTCCAGCCCAGAGTACTGGATCACGTCCGGCAATGACGCCCCAGTGACCGCAAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATTGATTCCACCGACGGTAACAACCAGCCGAATATCCCGGACATTCCTTCACATCTATGGTACTTTGGAGCCATTGCAGAGTGTGATTAA
実施例２；耐熱性の評価
＜精製酵素の調製＞
　Talaromyces thermophilus ＮＢＲＣ３１７９８Ｔをオートクレーブした小麦ふすま培地で固体培養（40℃、4日間培養）して得られた培養液をろ過後、20mMリン酸緩衝液（pH8.0）と1.0M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液（pH8.0）のリニアグラジエント条件にて陰イオン交換クロマトグラフィー（GE Healthcare製HiPrep DEAE FF）を行った後、1.0M硫酸アンモニウム含有20mMリン酸緩衝液（pH7.0）と20mMリン酸緩衝液（pH7.0）のリニアグラジエント条件にて疎水性クロマトグラフィー（GE Healthcare製Hitrap Butyl FF）によって精製酵素を得た。
＜熱処理＞
　TDL1およびTDL2の精製酵素をcOmplete ULTRA Tablets（Roche社製プロテインインヒビター）を含む、50mM PIPES緩衝液(pH7.0)を使用し2倍希釈後、水浴にて熱処理（70℃ あるいは 100℃ 30分間）を行い、熱処理サンプルとした。
実施例３：リパーゼのトリオレイン加水分解活性の確認方法
＜方法＞
　シリカゲルカラムを用いて、ヒマワリ油からトリオレインを分取後、ポリビニルアルコール溶液と混合し、乳化した。乳化トリオレイン溶液に各サンプルを添加し、加水分解反応（40℃、1時間）を行った。反応液に酢酸エチルを添加し、トリオレインおよび反応生成物（ジオレイン、モノオレイン、オレイン酸）を抽出した。抽出液をクロロホルム：アセトン＝96：4の展開溶媒条件にて薄層クロマトグラフィーによる分離・検出を行った。
＜結果＞
　耐熱性評価の結果（図１）、TDL1は70℃処理サンプルにおいても、反応生成物（ジオレイン、オレイン酸）が確認できることから、70℃で30分間処理後も活性が残存していることが判明した。
　一方、TDL2は70℃および100℃処理サンプルにおいても、反応生成物（ジオレイン、オレイン酸）が確認できることから、70℃および100℃で30分間処理後も活性が残存しており、高い耐熱性を持つことが確認できている。
実施例４：リパーゼのエステル交換活性の確認
＜組換え酵素発現株の取得＞
　タラロマイセス・サーモフィラス　ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ（サーモマイセス・デュポンティ ＮＣＢＩ：ｔｘｉｄ２８５６５）のゲノム ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、ＴＤＬ１遺伝子（配列番号５）およびＴＤＬ２遺伝子（配列番号６）を増幅した。増幅したＤＮＡを糸状菌発現ベクター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来α-アミラーゼ改変プロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤ－ＧＤＨのターミネーター及びｐｙｒＧ遺伝子を挿入したｐＵＣ１９）に連結し、プロトプラスト－ＰＥＧ法によってＡ. ｏｒｙｚａｅに導入した。
＜組換え酵素の取得方法＞
　得られた形質転換体を澱粉、酵母エキス、無機塩類を含む液体培地（ｐＨ６．０）に接種し、３０℃で９０時間、通気撹拌培養した。培養上清を珪藻土ろ過によって生産菌体除去後、限外ろ過膜で濃縮し、凍結乾燥にて酵素の乾燥粉末を得た。
＜固定化酵素の調製方法＞
　固定化担体として珪藻土を使用した。酵素の乾燥粉末中のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法キット（ＢＩＯ－ＲＡＤ）にて測定し、測定値をもとにタンパク質量0.1gになるように酵素の乾燥粉末を精製水１ｍLに溶解し、酵素溶解液とした。常法に従い、固定化担体（セライトＮｏ．５３５（Ｃｅｌｉｔｅ社製））に固定化し、固定化酵素（ＴＤＬ1－ＩＭ、ＴＤＬ2－ＩＭ）を調整した。
＜評価方法＞
　５０ｍLチューブに３．４ｇのトリオレイン（オレインリッチ、昭和産業製）と５ｇのパルミチン酸メチル（Ｗａｋｏ製）を加え、反応温度（４０℃、８０℃）で３０分保温した。固定化酵素としてＬｉｐｏｚｙｍｅ　ＴＬ－ＩＭ（ノボザイムス社）、ＴＤＬ1－ＩＭ、ＴＤＬ2－ＩＭを用いた。各固定化酵素を０．０５ｇ加えた後、振とうして反応させた。２０時間後の上清を回収し反応サンプルとした。
　反応サンプルに含まれる成分をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。１．５ｍＬチューブに９９０μＬヘキサンと１０μＬ反応サンプルを加え、ボルテックスミキサーを用いてよく撹拌した。０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過してＧＣ分析用サンプルを得た。以下の条件でＧＣ分析を実施した。エリア面積から全成分中のオレイン酸メチル（ＯＡＭＥ）の比率を算出した。生成したＯＡＭＥが多いほど、エステル交換反応が進んでおり、エステル交換活性が高いことを示唆する。
　使用機器：Agilent 8890 GC
　カラム：DB-1HT (5m, 0.25mm, 0.10μm)
　注入口温度：370℃
　注入量：1μL
　スプリット比：50
　検出器温度：370℃
　昇温条件：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　さらに、反応サンプルに含まれるトリグリセリド中のＰＯＰ（グリセリンの１位と３位にパルミチン酸、２位にオレイン酸がエステル結合）とＰＰＯ（グリセリンの１位と２位にパルミチン酸、３位にオレイン酸がエステル結合）の比率をＨＰＬＣで分析した。バイアルに０．９ｍＬヘキサンと０．１ｍＬＧＣ分析用サンプルを加え、ボルテックスミキサーを用いてよく撹拌したのち、以下の条件でＨＰＬＣ分析を実施した。ＰＯＰとＰＰＯのエリア面積から、ＰＯＰ／（ＰＯＰ＋ＰＰＯ）によってＰＯＰ比率（％）を算出した。ＰＯＰ比率が高いほど１，３位特異性が高いことを示唆する。
　使用機器：HPLC (Shimadzu)
　カラム：Silver column KANTO 250-4.6 (5μm)
　カラム温度：25℃
　溶離液：Acetone/Hexane = 3/97
　流速：1.0mL/min
　検出：ELSD-LT II (350kPa, 40 °C, gain 1)
　注入量：20μL
＜結果＞
　全てのリパーゼにおいてＯＡＭＥの生成が確認できた。ＴＤＬ１―ＩＭとＬｉｐｏｚｙｍｅ　ＴＬ－ＩＭは同等の生成量であり、ＴＤＬ２－ＩＭは他の２つに比べて６０％程度の生成量であった。各リパーゼを用いた場合のＰＯＰ比率（％）を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＴＤＬ１―ＩＭ、ＴＤＬ２－ＩＭともに８０℃において高いＰＯＰ比率を示した。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ　ＴＬ－ＩＭに比べて高温反応における１，３位特異性が高いことが示唆された。
　ＯＡＭＥ生成量が同等のときの１，３位特異性を評価するため、ＯＡＭＥ生成量が約２０％となるように各リパーゼで反応後、ＰＯＰ比率を評価した。上記評価方法に準じた方法で反応温度は８０℃で実施した。酵素添加量や反応時間を適宜調整してＯＡＭＥ生成量が約２０％となった時点で上清を回収した。
　各リパーゼを用いた場合のＰＯＰ比率（％）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＯＡＭＥ生成量が同等のときであっても、ＴＤＬ１－ＩＭ、ＴＤＬ２－ＩＭともにＬｉｐｏｚｙｍｅ　ＴＬ－ＩＭよりも高いＰＯＰ比率を示した。
　本発明の酵素剤は、食品や医療用途の分野での使用に適し、産業上の利用価値は高い。特に、耐熱性が高く、１，３位特異性が高いリパーゼを含む本発明のエステル交換用酵素剤は、カカオバター代替脂製造用途において有用である。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文及び特許文献などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (8)

  1. 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを有効成分として含有するエステル交換用酵素剤。
  2. リパーゼが、タラロマイセス（サーモマイセスと称する場合もある）属細菌由来である、請求項１に記載の酵素剤。
  3. リパーゼが、タラロマイセス・サーモフィラス（サーモマイセス・デュポンティと称する場合もある）由来である、請求項１又は２に記載の酵素剤。
  4. 請求項１から３の何れか一項に記載の酵素剤を油脂に作用させることを含む、エステル交換された油脂の製造方法。
  5. 酵素剤を６０℃以上の温度において油脂に作用させる、請求項４に記載の方法。
  6. 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼであって、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で７０℃で３０分処理後も酵素活性が残存する、リパーゼ。
  7. 以下のステップ（１）及び（２）を含んでなる、リパーゼの製造法。
    （１）請求項６に記載のリパーゼの産生能を有する微生物を培養するステップ；
    （２）培養後の培養液及び／又は菌体より、リパーゼを回収するステップ；
  8. 微生物が、タラロマイセス・サーモフィラス（サーモマイセス・デュポンティと称する場合もある）ＮＢＲＣ３１７９８Ｔ株である、請求項７に記載の製造法。
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