WO2023026747A1 - 卵子又は受精卵の凍結保存用具 - Google Patents

卵子又は受精卵の凍結保存用具 Download PDF

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WO2023026747A1
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ova
fertilized
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Inventor
義隆 谷口
雅英 塩谷
Original Assignee
シーエステック株式会社
医療法人社団英ウィメンズクリニック
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation tool for cryopreserving eggs or fertilized eggs.
  • the vitrification method is known as a technique for cryopreserving eggs or fertilized eggs (embryos).
  • the vitrification freezing method eggs or fertilized eggs (hereinafter collectively referred to as “eggs, etc.”) are immersed in liquid nitrogen together with a small amount of cryoprotectant (vitrification liquid) to rapidly cool them.
  • This is a method of freezing in an amorphous glass state without crystallizing the water inside and outside the cells. According to this method, it is possible to suppress the damage to the eggs and the like due to ice crystal formation, and to increase the survival rate of the eggs and the like during subsequent melting.
  • cryopreservation tools are widely used that include a rod-shaped main body provided with a thin plate-shaped mounting portion for placing eggs and the like on the tip, and a cylindrical cover that accommodates the main body. used (see, for example, Patent Document 1).
  • a cryopreservation tool When freezing ova or the like using such a cryopreservation tool, first, the ova that have been immersed in a cryoprotectant in advance are collected with a pipette or the like, and placed on the mounting section together with a small amount of the cryoprotectant. place. Then, after the tip of the main body including the mounting portion is immersed in liquid nitrogen for rapid cooling, the main body is fitted with the cover and stored in a liquid nitrogen tank.
  • Patent Document 2 proposes a cryopreservation tool that can remove excess cryoprotectant with a simple operation.
  • the placement section for placing the ova and the like is formed in a mesh shape. Excess cryoprotectant can be removed by manipulation.
  • the present invention has been made in view of the above points, and its object is to make the amount of cryoprotective solution around eggs, etc. appropriate without performing complicated work, and to thaw them. To provide a cryopreservation tool from which an ovum or the like can be easily removed from a placing part.
  • the oocyte or fertilized egg cryopreservation tool according to the present invention which was made to solve the above problems, a main body having a bar-shaped handle, and a mesh-shaped ovum or the like holding section provided at the tip of the handle; a tubular cover portion in which the main body portion is accommodated; , and the opening size of the mesh in the ovum or the like holding portion is 170 ⁇ m or more.
  • cryopreservation tool for oocytes or fertilized eggs having the above configuration, it is possible to make the amount of cryoprotectant around the oocytes appropriate without performing complicated work, and furthermore, during thawing, Eggs and the like can be easily removed from the cryopreservation device.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a cryopreservation tool according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a procedure for freezing ova or fertilized eggs using the cryopreservation tool.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a procedure for thawing oocytes or fertilized eggs cryopreserved using the cryopreservation tool. Photographs taken from directly above showing the state in which blastocysts are held in various holding parts for ova and the like having different mesh hole sizes (opening dimensions).
  • the oocyte or fertilized egg cryopreservation tool (hereinafter simply referred to as "cryopreservation tool") according to the present embodiment includes a main body 10 and a cylindrical cover part that accommodates the main body 10. 20 and.
  • the body portion 10 includes a handle portion 11 and an ovum or the like holding portion 12 provided at the tip of the handle portion 11 .
  • the handle portion 11 is a rod-shaped member made of a low temperature resistant material.
  • the length of the handle 11 is not particularly limited, but is preferably 9 cm to 11 cm.
  • a material forming the handle portion 11 for example, a metal such as stainless steel or a synthetic resin can be used.
  • the ovum holding part 12 is composed of a mesh made of fibers 13 and has a flat plate shape with a width of 3 mm to 10 mm and a length of 5 mm to 30 mm as a whole.
  • the fiber 13 synthetic resin such as polyester can be suitably used, but the fiber is not limited to this, and for example, metal such as stainless steel may be used. If the mesh holes of the ovum holding part 12 are too small, it becomes difficult for the ova to come out of the mesh holes during melting.
  • the size of the mesh holes (opening size) of the ovum holding portion 12 in the present embodiment is 170 ⁇ m. 190 ⁇ m or more (preferably 190 ⁇ m or more).
  • the upper limit of the opening size is not particularly limited as long as the cryoprotectant can be retained by surface tension. It is desirable that the thickness is 250 ⁇ m or less (more preferably 250 ⁇ m or less).
  • the wire diameter (dimension B in FIG. 2) of the fibers 13 forming the mesh is not particularly limited, but is, for example, 40 ⁇ m to 70 ⁇ m (more preferably 50 ⁇ m to 60 ⁇ m).
  • the cover portion 20 is a thin tubular member made of a low-temperature resistant material (for example, a synthetic resin such as polypropylene, or a metal such as stainless steel). It's becoming In addition, the cover portion 20 has a length that can accommodate the entire ovum holding portion 12 of the main body portion 10 and at least a portion of the handle portion 11 .
  • a low-temperature resistant material for example, a synthetic resin such as polypropylene, or a metal such as stainless steel.
  • the procedure for freezing eggs or fertilized eggs using the cryopreservation tool according to the present embodiment will be described with reference to FIG.
  • the cryopreservation tool according to the present embodiment can be suitably used particularly for cryopreservation of human ova or fertilized eggs, but is not limited to this, and is not limited to this, and can be used for ova or fertilized eggs of animals other than humans. It can also be used for cryopreservation.
  • the "egg" to be frozen using the cryopreservation tool according to the present embodiment can include mature eggs, and the "fertilized egg” includes pronuclear stage embryos, division stage embryos (early embryos ), morula, or blastocyst, but are not limited thereto.
  • ova or fertilized eggs to be cryopreserved (hereinafter referred to as "eggs 30") are immersed in the cryoprotectant 41 to permeate the ova 30 with the cryoprotectant 41.
  • the operator collects the ovum or the like 30 together with a small amount of the cryoprotectant 41 using the pipette 42, and discharges them onto the ovum or the like holding portion 12 of the cryopreservation tool according to the present embodiment under a microscope. do.
  • the ova and the like 30 and a small amount of the cryoprotectant 41 are retained in the meshes (mesh holes) of the ovum and the like holding section 12 due to the surface tension of the cryoprotectant 41 .
  • the surplus cryoprotectant 41 that cannot be retained by the surface tension falls through the mesh of the mesh and falls below the ovum holding section 12. 41 need not be removed.
  • the operator since the mesh size of the mesh forming the ovum holding unit 12 is relatively large, the operator can visually recognize the ova 30 held in the ovum holding unit 12. It also has the advantage of being easy. Subsequently, the operator grips the handle 11 and immerses the tip of the main body 10 in the liquid nitrogen 43, thereby rapidly cooling the ova 30 and the cryoprotectant 41 held in the ovum holding unit 12. .
  • the ovum or the like 30 is held in the mesh of the mesh by the surface tension of the cryoprotectant 41, and is cooled from all directions. It is possible to improve the freezing speed of the ovum or the like 30.
  • the body portion 10 is housed in the cover portion 20 and the body portion 10 and the cover portion 20 are stored in the liquid nitrogen tank 44 .
  • an operator takes out the cryopreservation tool according to the present embodiment from the liquid nitrogen tank 44 , removes the cover part 20 from the body part 10 , and then immerses the tip of the body part 10 in the melting liquid 45 .
  • the mesh size of the mesh forming the ovum holding section 12 is relatively large, and the ova 30 can be retained by simply immersing the ovum holding section 12 in the lysing liquid 45. Since it is separated from the part 12, it is not necessary for the operator to manually remove the ovum or the like 30 from the ovum or the like holding part 12 using a pipette or the like.
  • each cryopreservation device was almost the same as that shown in FIG. 1, and the meshes constituting the ovum holding part were all made of polyester fibers with a wire diameter of 55 ⁇ m.
  • the opening size of the mesh was 100 ⁇ m (Comparative Example 1), 150 ⁇ m (Comparative Example 2), 200 ⁇ m (Example 1), 250 ⁇ m (Example 2), and 300 ⁇ m (Example 3).
  • the photograph in Fig. 5 is taken from directly above the state in which the blastocyst is held in the ovum, etc. holding part made of mesh with each of the above-mentioned opening sizes.
  • the photograph of FIG. 6 is a side view of the blastocyst and the cryoprotectant held in the ovum holding part with an opening size of 200 ⁇ m. As shown in these photographs, the blastocyst and the cryoprotectant could be retained in the meshes of the ovum, etc., regardless of the opening size of the ovum holder.
  • FIG. 7 shows the retention of early embryos 2 days after fertilization (D2)
  • FIG. 7(b) shows the retention of early embryos 3 days after fertilization (D3)
  • FIG. 7(c) shows grade 3 (G3) blastocysts (BL embryos) retained
  • FIG. 7(d) shows grade 4 (G4) blastocysts.
  • ) shows grade 5 (G5) blastocysts
  • FIG. 7(f) shows grade 6 (G6) blastocysts.
  • the size of each fertilized egg is indicated at the top of each figure.
  • fertilized eggs of various types and sizes can be stored in the mesh of the mesh. , was confirmed to be retained by the surface tension of the cryoprotectant.
  • the fertilized egg could be removed from the holding part for ova and the like simply by immersing the holding part for ova and the like after freezing in the thawing solution.
  • a cryopreservation tool having a mesh opening size of 167 ⁇ m and a cryopreservation tool having a mesh opening size of 183 ⁇ m are prepared, and human fertilized eggs are frozen using these cryopreservation tools. / Melting experiments were performed.
  • the structure of each cryopreservation device is almost the same as that shown in Fig. 1, but for the cryopreservation device with an opening size of 167 ⁇ m, the mesh that constitutes the ovum holding part is made of polyester fiber with a wire diameter of 45 ⁇ m.
  • a cryopreservation tool with an opening size of 183 ⁇ m was made of polyester fiber with a wire diameter of 71 ⁇ m.
  • the mesh opening size is smaller than that of the cryopreservation tools of Examples 1 to 3 (that is, the mesh opening size is 200 ⁇ m, 250 ⁇ m, or 300 ⁇ m), it is difficult to hold the fertilized egg. There was an impression that it was difficult to visually check the mesh holes when confirming whether or not the was held. In addition, when the opening size is 167 ⁇ m, it may not be possible to hold the fertilized egg and the cryoprotectant in the mesh holes at the same time. A two-stage operation was required, first holding the fertilized egg and then placing the fertilized egg in the mesh hole.
  • a cryopreservation tool with a mesh opening size of 200 ⁇ m ie, the cryopreservation tool of Example 1
  • a cryopreservation tool with a mesh opening size of 250 ⁇ m ie, the cryopreservation tool of Example 2.
  • a frozen mouse early embryo Day 3 embryo, 4 to 8 cells
  • the embryos were frozen using a tool and then thawed immediately. Freezing and thawing were performed in the same manner as described above.
  • Embryos were cultured at 37.0°C using SAGE 1 step medium (Origio).
  • Table 1 shows the culture results of embryos after freezing and thawing using the cryopreservation tool of Example 1
  • BL incidence indicates the ratio of embryos that have grown to blastocyst
  • good BL incidence means the ratio of embryos with a grade of 3AA or higher.
  • the culture performance of the embryos after thawing was evaluated. Specifically, first, a frozen mouse early embryo (same as above) was thawed and cultured for 1 or 2 days until the early embryo grew into a blastocyst. The culture was performed under the same conditions as above. The blastocysts were then frozen and thawed using the cryopreservation device of Example 1 or the cryopreservation device of Example 2. Freezing and thawing were performed in the same manner as described above.
  • the thawed embryos were cultured for 1 day under the same conditions as above, and the cultured embryos (that is, Day 5 embryos and Day 6 embryos) were observed.
  • Table 3 shows the culture results of embryos frozen and thawed using the cryopreservation tool of Example 1
  • Table 4 shows the culture results of embryos frozen and thawed using the cryopreservation tool of Example 2.

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Abstract

本発明に係る卵子又は受精卵の凍結保存用具は、棒状の柄部（１１）と、柄部の先端に設けられたメッシュ状の卵子等保持部（１２）と、を備えた本体部（１０）と、本体部が収容される筒状のカバー部（２０）と、を備え、卵子等保持部のメッシュの目開き寸法が170μm以上であることを特徴としている。これにより、煩雑な作業を行うことなく卵子等の周囲の凍結保護液を適量にすることができ、なお且つ融解時に卵子等を容易に外すことができる。

Description

卵子又は受精卵の凍結保存用具
　本発明は、卵子又は受精卵を凍結保存するための凍結保存用具に関する。
　ヒトの不妊治療等の分野において、卵子又は受精卵（胚）を凍結保存するための技術としてガラス化凍結法が知られている。ガラス化凍結法は、卵子又は受精卵（以下、総称する場合には「卵子等」とよぶことがある）を、少量の凍結保護液（ガラス化液）と共に液体窒素に浸漬して急速冷却することによって、細胞内外の水を結晶化させることなく非晶質のガラス状態で凍結させる手法である。この手法によれば、氷晶形成による卵子等のダメージを抑えることができ、その後の融解時における卵子等の生存率を高めることができる。
　こうしたガラス化凍結法では、先端に卵子等を載せるための薄板状の載置部が設けられた棒状の本体部と、前記本体部を収容する筒状のカバーとを備えた凍結保存用具が広く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。このような凍結保存用具を用いて卵子等を凍結させる際には、まず、予め凍結保護液に浸漬しておいた卵子をピペット等で採取し、少量の凍結保護液と共に前記載置部に載置する。そして、前記載置部を含む本体部の先端を液体窒素に浸漬して急速冷却したのち、本体部に前記カバーを装着し、液体窒素タンク中で保存する。
　但し、ガラス化凍結法において、卵子等の周囲に存在する凍結保護液の量が多いと、液体窒素による冷却速度が低下して卵子等の生存率が低下するおそれがある。そのため、上記のような凍結保存用具において、卵子等と共に載置部に載せた凍結保護液の量が多い場合には、ピペット等を用いて余分な凍結保護液を除去して適量に調整する必要があったが、卵子を傷つけたり乾燥させたりすることなしに凍結保護液を適量に調整する操作は熟練を要するものであった。
　そこで、特許文献２には、簡単な操作で余分な凍結保護液を除去可能な凍結保存用具が提案されている。この凍結保存用具では、卵子等を載せるための載置部が網状に形成されており、当該網状の載置部に卵子等と凍結保護液を載置した後、前記載置部の下方から吸引操作を行うことによって余分な凍結保護液を除去することができる。
特開2002-315573号公報 国際公開第2011/070973号
　しかしながら、上記のような網状の載置部を備えた凍結保存用具では、凍結保存後に液体窒素タンクから凍結保存用具を取り出し、載置部を融解液中に浸漬して卵子等を融解させた際に、卵子等が載置部から外れにくい場合があった。そのような場合、作業担当者が卵子をピペット等で吸引して載置部から取り外す必要があるが、このときに卵子等を傷つけるおそれがあるという問題や、作業担当者の負担が増大するという問題があった。
　本発明は、上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、煩雑な作業を行うことなく卵子等の周囲の凍結保護液を適量にすることができ、なお且つ融解時に卵子等を容易に載置部から外すことのできる凍結保存用具を提供することにある。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る卵子又は受精卵の凍結保存用具は、
　棒状の柄部と、前記柄部の先端に設けられたメッシュ状の卵子等保持部と、を備えた本体部と、
　前記本体部が収容される筒状のカバー部と、
　を備え、前記卵子等保持部におけるメッシュの目開き寸法が170μm以上であることを特徴としている。
　上記のような構成を有する本発明に係る卵子又は受精卵の凍結保存用具によれば、煩雑な作業を行うことなく卵子等の周囲の凍結保護液を適量とすることができ、なお且つ融解時に卵子等を容易に凍結保存用具から外すことができる。
本発明の一実施形態における凍結保存用具の全体構成を示す模式図。 前記実施形態における本体部の先端部分を拡大して示す図。 前記凍結保存用具を用いた卵子又は受精卵の凍結手順を示す模式図。 前記凍結保存用具を用いて凍結保存した卵子又は受精卵の融解手順を示す模式図。 メッシュ孔の大きさ（目開き寸法）が異なる種々の卵子等保持部に胚盤胞を保持させた状態を真上から撮影した写真。 メッシュの目開き寸法が200μmである卵子等保持部に胚盤胞を保持させた状態を真横から撮影した写真。 メッシュの目開き寸法が200μmである卵子等保持部に種々の受精卵を保持させた状態を真上から撮影した写真。
　本発明を実施するための形態について、図面を参照しつつ説明する。
　図１に示すように、本実施形態に係る卵子又は受精卵の凍結保存用具（以下、単に「凍結保存用具」とよぶ）は、本体部１０と、本体部１０を収容する筒状のカバー部２０と、を備えている。
　本体部１０は、柄部１１と、柄部１１の先端に設けられた卵子等保持部１２とを備えている。柄部１１は、耐低温性の素材から成る棒状の部材である。柄部１１の長さは、特に限定されるものではないが、9cm～11cmとすることが望ましい。柄部１１を構成する素材としては、例えば、ステンレス等の金属、又は合成樹脂等を用いることができる。
　卵子等保持部１２は、図２に示すように、繊維１３から成るメッシュで構成されており、全体として幅3mm～10mm、長さ5mm～30mm程度の平板形状を有している。繊維１３としては、ポリエステル等の合成樹脂から成るものを好適に用いることができるが、これに限定されるものではなく、例えば、ステンレス等の金属から成るものを用いるようにしてもよい。卵子等保持部１２のメッシュ孔が小さすぎると、融解時に卵子がメッシュ孔から外れ難くなる。更に、メッシュ孔が小さすぎると、比較的高粘性の液体である凍結保護液を卵子等と共に卵子等保持部１２に乗せた際に、凍結保護液（及び卵子等）がメッシュ孔（網目）の内部に入り込まずに網目上に乗ったような状態となり、適切に凍結できないおそれもある。そのため、本実施形態における卵子等保持部１２のメッシュ孔の大きさ（目開き寸法）、すなわち前記メッシュを構成する繊維１３のうち隣接するもの同士の間隔（図２中における寸法Ａ）は、170μm以上（好ましくは190μm以上）とする。前記目開き寸法の上限は、表面張力によって凍結保護液を保持できる範囲であれば特に限定されるものではないが、卵子等保持部１２に保持される凍結保護液の量を抑える観点から、300μm以下（より望ましくは250μm以下）とすることが望ましい。また、前記メッシュを構成する繊維１３の線径（図２中における寸法Ｂ）は特に限定されるものではないが、例えば、40μm～70μm（より望ましくは50μm～60μm）とする。
　カバー部２０は、耐低温性の素材（例えばポリプロピレン等の合成樹脂、又はステンレス等の金属）から成る細管状の部材であり、その内径は本体部１０の幅方向の最大寸法よりも僅かに大きくなっている。また、カバー部２０は、本体部１０の卵子等保持部１２の全体と柄部１１の少なくとも一部とを収容可能な長さを有している。
　上記本実施形態に係る凍結保存用具を用いて卵子又は受精卵を凍結させる際の手順について図３を参照しつつ説明する。なお、本実施形態に係る凍結保存用具は、特にヒトの卵子又は受精卵の凍結保存に好適に用いることができるが、これに限定されるものではなく、ヒト以外の動物の卵子又は受精卵の凍結保存に利用することもできる。また、本実施形態に係る凍結保存用具を用いた凍結処理の対象となる「卵子」としては成熟卵を挙げることができ、「受精卵」としては、前核期胚、分割期胚（初期胚）、桑実胚、又は胚盤胞などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　まず、凍結保存の対象とする卵子又は受精卵（以下、「卵子等３０」とよぶ）を凍結保護液４１に浸漬することによって、凍結保護液４１を卵子等３０に浸透させておく。そして、作業担当者が、ピペット４２を用いて少量の凍結保護液４１と共に卵子等３０を採取し、それらを、顕微鏡下で、本実施形態に係る凍結保存用具の卵子等保持部１２上に吐出する。これにより、卵子等３０及び少量の凍結保護液４１が、凍結保護液４１の表面張力によって、卵子等保持部１２を構成するメッシュの網目（メッシュ孔）内に保持される。このとき、表面張力によって保持しきれない余剰な凍結保護液４１は、メッシュの網目を通って卵子等保持部１２の下方に落下するため、作業担当者がピペット等を用いて余剰な凍結保護液４１を除去する必要がない。また、本実施形態に係る凍結保存用具では、卵子等保持部１２を構成するメッシュの網目のサイズが比較的大きいため、作業担当者が、卵子等保持部１２に保持された卵子等３０を視認しやすいという利点もある。続いて、作業担当者が柄部１１を把持して本体部１０の先端を液体窒素４３に浸漬することにより、卵子等保持部１２に保持された卵子等３０及び凍結保護液４１を急速冷却させる。本実施形態に係る凍結保存用具では、卵子等３０が凍結保護液４１の表面張力によって前記メッシュの網目内に保持されており、その全周方向から冷却を受けるため、従来の凍結保存用具と比べて卵子等３０の凍結速度を向上することができる。その後は、本体部１０をカバー部２０に収容し、本体部１０及びカバー部２０を液体窒素タンク４４内で保管する。
　次に、以上によって凍結保存された卵子等３０を融解させる際の手順について図４を参照しつつ説明する。まず、作業担当者が液体窒素タンク４４から本実施形態に係る凍結保存用具を取り出し、本体部１０からカバー部２０を取り外した上で、本体部１０の先端を融解液４５に浸漬する。本実施形態に係る凍結保存用具では、卵子等保持部１２を構成するメッシュの網目のサイズが、比較的大きく、卵子等保持部１２を融解液４５に浸けるだけで、卵子等３０が卵子等保持部１２から離れるため、作業担当者がピペット等を用いて手作業で卵子等保持部１２から卵子等３０を取り外す必要がない。
　以下、メッシュ孔の大きさによる影響を確認するために行った受精卵の凍結／融解実験について説明する。本実験では、卵子等保持部を構成するメッシュの目開き寸法が異なる５種類の凍結保存用具を使用した。各凍結保存用具の構成は、図１に示したものとほぼ同様であり、卵子等保持部を構成するメッシュとしては、いずれも線径55μmのポリエステル繊維から成るものを使用した。前記メッシュの目開き寸法は、100μm（比較例１）、150μm（比較例２）、200μm（実施例１）、250μm（実施例２）、300μm（実施例３）とした。凍結対象とする受精卵としてはヒトの胚盤胞を使用し、上記図３及び図４で示した手順で、当該胚盤胞の凍結及び融解を行った（なお、サンプル数は、メッシュの目開き寸法が100μm、150μm、250μm、及び300μmのものでは各々n＝8とし、200μmのものではn＝10とした）。その際、凍結保護液としては、富士フイルム和光純薬株式会社製の「Vit Kit-Freeze NX」を使用し、融解液としては、同じく富士フイルム和光純薬株式会社製の「Vit Kit-Warm NX」を使用した。
　図５の写真は、上記各目開き寸法のメッシュから成る卵子等保持部に胚盤胞を保持させた状態を真上から撮影したものである。また、図６の写真は、目開き寸法200μmの卵子等保持部に胚盤胞及び凍結保護液を保持させた状態を真横から撮影したものである。これらの写真に示す通り、いずれの目開き寸法の卵子等保持部を用いた場合にも、メッシュの網目の中に胚盤胞及び凍結保護液を保持させることができた。しかしながら、凍結後の胚盤胞及び凍結保護液の融解時には、目開き寸法が200μmのもの、250μmのもの、及び300μmのもの（すなわち実施例１～３）では、融解液に浸けた瞬間に胚盤胞が卵子等保持部から外れたが、100μmのもの及び150μmのもの（すなわち比較例１、２）では融解液に浸けても胚盤胞が外れない場合があった。
　更に、前記実施例１の凍結保存用具（すなわち目開き寸法が200μmのもの）を使用し、ヒトの様々な受精卵を対象として凍結／融解実験を行った。なお、受精卵の凍結及び融解は上記と同様にして行った。図７の写真は、実施例１の凍結保存用具に、凍結保護液と共に様々な受精卵を保持させた状態を真上から撮影したものである。図７（ａ）は受精後２日（Ｄ２）の初期胚を保持させたものであり、図７（ｂ）は受精後３日（Ｄ３）の初期胚を保持させたものである。また、図７（ｃ）はグレード３（Ｇ３）の胚盤胞（ＢＬ胚）を保持させたものであり、図７（ｄ）はグレード４（Ｇ４）の胚盤胞を、図７（ｅ）はグレード５（Ｇ５）の胚盤胞を、図７（ｆ）はグレード６（Ｇ６）の胚盤胞を、それぞれ保持させたものである。また、各受精卵のサイズは、各図の上部に記載している。これらの写真から明らかなように、目開き寸法が200μmの卵子等保持部を備えた凍結保存用具を用いた場合には、メッシュの網目の中に、様々な種類及び様々なサイズの受精卵を、凍結保護液の表面張力によって保持できることが確認された。また、いずれの場合にも、凍結後の卵子等保持部を融解液に浸けるだけで、卵子等保持部から受精卵を外すことができた。
　卵子等保持部を構成するメッシュの目開き寸法が167μmである凍結保存用具と、該目開き寸法が183μmである凍結保存用具を作成し、これらの凍結保存用具を使用してヒト受精卵の凍結／融解実験を行った。各凍結保存用具の構成は図１に示したものとほぼ同様であるが、目開き寸法が167μmである凍結保存用具では、卵子等保持部を構成するメッシュとして線径45μmのポリエステル繊維から成るものを使用し、目開き寸法が183μmである凍結保存用具では、線径71μmのポリエステル繊維から成るものを使用した。凍結対象とする受精卵としては、分割前の受精卵（直径が約150μm～160μmのもの）又は分割期の受精卵（直径が約150μm～175μmのもの）を使用し、凍結及び融解は上記と同様にして行った（なお、サンプル数はどちらの凍結保存用具を用いる場合もn＝8とした）。その結果、どちらの凍結保存用具を用いた場合にも、メッシュの網目の中に受精卵及び凍結保護液を保持させて凍結させることができた。ただし、いずれも実施例１～３の凍結保存用具（すなわち目開き寸法が200μm、250μm、又は300μmのもの）に比べてメッシュの目開き寸法が小さいために、受精卵を保持させる際や受精卵が保持されたか否かを確認する際に、メッシュ孔を目視しづらい印象があった。また、目開き寸法が167μmのものでは、メッシュ孔に受精卵と凍結保護液とを一度に保持させることができない場合があり、そのような場合には、先に凍結保護液のみをメッシュ孔に保持させてから受精卵を前記メッシュ孔に収めるという２段階の作業が必要となった。一方、凍結後の受精卵を融解させる際には、目開き寸法が183μmのものでは融解液に浸けるだけで瞬時に受精卵を卵子等保持部から外すことができたが、目開き寸法が167μmのものでは、融解液に浸けただけでは受精卵がメッシュから外れない場合があり、そのような場合には、凍結保存用具の先端を融解液中で振り動かして受精卵をメッシュから外すという作業が必要となった。
　次に、メッシュの目開き寸法が200μmである凍結保存用具（すなわち実施例１の凍結保存用具）と、メッシュの目開き寸法が250μmである凍結保存用具（すなわち実施例２の凍結保存用具）を用いて、凍結融解後の初期胚の培養成績を評価した。具体的には、まず、凍結状態のマウス初期胚（Day 3胚、4 cell～8 cell）を融解し、10分程度静置した後、実施例１の凍結保存用具又は実施例２の凍結保存用具を使用して前記胚を凍結し、その後直ちに融解した。なお、凍結及び融解は上記と同様にして行った。その後、融解後の胚を３日間培養し、培養２日目と３日目の胚（すなわちDay 5胚とDay 6胚）を観察した。なお、胚の培養は、SAGE 1 step medium（Origio社製）を使用して37.0℃で行った。実施例１の凍結保存用具を用いて凍結及び融解した後の胚の培養成績を表１に、実施例２の凍結保存用具を用いて凍結及び融解した後の胚の培養成績を表２に示す。なお、サンプル数はそれぞれｎ＝２０である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
上記の表において、「ＢＬ発生率」とは胚盤胞（blastocyst）まで生育した胚の比率を示し、「良好ＢＬ発生率」とは、グレードが３ＡＡ以上であった胚の比率を意味している。表１及び表２に示す通り、実施例１及び実施例２のいずれの凍結保存用具を用いた場合でも、Day 5において90％の胚が良好なグレードの胚盤胞に生育し、透明帯亀裂、細胞漏出、及びフラクチャー障害はいずれも発生しなかった。
　更に、胚盤胞まで生育させたマウス胚を、前記実施例１の凍結保存用具又は実施例２の凍結保存用具を用いて凍結及び融解した場合における、融解後の胚の培養成績を評価した。具体的には、まず、凍結状態のマウス初期胚（上記と同様のもの）を融解し、該初期胚が胚盤胞に生育するまで１日又は２日間培養した。なお、培養は上記同様の条件で行った。その後に、実施例１の凍結保存用具又は実施例２の凍結保存用具を使用して前記胚盤胞の凍結及び融解を行った。なお、凍結及び融解は上記と同様にして行った。その後、融解後の胚を上記同様の条件で１日間培養し、培養後の胚（すなわちDay 5胚とDay 6胚）を観察した。実施例１の凍結保存用具を用いて凍結及び融解した胚の培養成績を表３に、実施例２の凍結保存用具を用いて凍結及び融解した胚の培養成績を表４に示す。なお、サンプル数は前者がｎ＝５１であり、後者がｎ＝５５である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記の表において、「孵化」とは胚盤胞がステージＧ５に到達することを意味し、「完全脱出」とは胚盤胞がステージＧ６に到達することを意味している。表３及び表４から明らかなように、実施例１及び実施例２のいずれの凍結保存用具を用いた場合でも、Day 5において90 ％の胚が良好なグレードの胚盤胞に生育しており、透明帯亀裂、細胞漏出、及びフラクチャー障害はいずれも発生しなかった。
１０…本体部
１１…柄部
１２…卵子等保持部
１３…繊維
２０…カバー部
３０…卵子等
４１…凍結保護液
４２…ピペット
４３…液体窒素
４４…液体窒素タンク
４５…融解液

Claims (4)

  1. 　棒状の柄部と、前記柄部の先端に設けられたメッシュ状の卵子等保持部と、を備えた本体部と、
    　前記本体部が収容される筒状のカバー部と、
    　を備え、
    　前記卵子等保持部のメッシュの目開き寸法が170μm以上である卵子又は受精卵の凍結保存用具。
  2. 　前記卵子等保持部のメッシュの目開き寸法が190μm以上である請求項１に記載の卵子又は受精卵の凍結保存用具。
  3. 　前記卵子等保持部のメッシュの目開き寸法が300μm以下である請求項１又は２に記載の卵子又は受精卵の凍結保存用具。
  4. 　前記卵子等保持部のメッシュの目開き寸法が250μm以下である請求項３に記載の卵子又は受精卵の凍結保存用具。
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