WO2023022414A1 - 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 - Google Patents
아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a new composition containing iris-derived exosomes as an active ingredient, and more particularly, to improve skin elasticity, skin wrinkles, skin regeneration, skin tone or skin brightness containing iris-derived exosomes as an active ingredient It relates to a composition for improving, skin whitening, anti-inflammatory, wound healing and/or promoting wound healing.
- the present invention relates to a cosmetic composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, improving skin tone or brightness, and/or whitening, and a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing, and/or promoting wound healing, including the above composition. it's about
- MMP matrix metalloproteinase
- Prostaglandin E2 Prostaglandin E2
- COX-2 an enzyme that produces inflammatory cytokines
- MMP muscle growth factor
- sunlight and ultraviolet rays are directly irradiated to the skin, a lot of free radicals are generated, and the antioxidant defense system of the skin is damaged by these free radicals, which accelerates skin aging by increasing wrinkles and relaxing the skin.
- Substances known to be effective in improving skin wrinkles include adenosine and retinoic acid, but adenosine has little clinical efficacy, and retinoic acid cannot be used for women of childbearing age and has side effects such as erythema.
- Human skin color is determined by the concentration and distribution of melanin in the skin. Melanin is synthesized through a non-enzymatic oxidation reaction after conversion from tyrosine to DOPA and dopaquinone by tyrosinase. When melanin is excessively produced, pigmentation occurs, and spots, dots, and freckles appear on the face, neck, and arms, making the appearance unattractive. Although skin whitening agents are being developed to improve blemishes, freckles, and dark skin tone, it is difficult to develop skin whitening agents that have excellent whitening effects and have no side effects. For example, a skin whitening agent that selectively attacks melanocytes that produce melanin has an excellent whitening effect, but has the side effect of skin toxicity.
- Inflammation is a defense reaction of a living body that appears in response to pathological conditions caused by physical or chemical trauma, infection by bacteria, fungi, or viruses, various allergens, and the like.
- the inflammatory response appears as part of the innate immune response.
- Various substances and physiological/chemical phenomena are involved in the inflammatory response, and recent studies have revealed that various inflammatory cytokines play an important role in the inflammatory response.
- IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-12, and IFN- ⁇ are major cytokines involved in the inflammatory response, and their expression and secretion increase and activation are inflammatory mediators. It is associated with a series of complex physiological reactions such as secretion, immune cell infiltration, cell migration and tissue destruction, and symptoms such as erythema, edema, fever and pain.
- the inflammatory response does not become a major problem when the infectious agent is removed and the damaged tissue is regenerated, and the diseased area is restored to normal. cause inflammatory diseases.
- Immunosuppressants such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs, steroidal anti-inflammatory drugs, neuropeptide antagonists, COX inhibitors, antihistamines, and cyclosporine A are used to alleviate or treat inflammatory reactions or inflammatory diseases caused by them, but skin atrophy, vasodilation, pigmentation There are problems causing side effects such as loss of blood, hypersensitivity, tolerance, and neutropenia. In addition, these drugs have limitations in helping control symptoms to an appropriate level rather than fundamental treatment.
- cell secretome contains various bioactive factors that regulate cell behavior. ' is included, and research on its ingredients and functions is actively underway.
- Extracellular vesicles are also referred to as cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, etc., and in some cases, they are used separately from exosomes.
- Exosomes are vesicles with a size of tens to hundreds of nanometers having a double-phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and contain proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo inside. It is known that the exosome cargo contains a wide range of signaling factors, and these signaling factors are cell type-specific and differently regulated depending on the environment of the secreting cell. Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cell signals transmitted through them regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. It is known.
- Exosomes contain specific genetic materials and bioactive factors depending on the nature and state of the derived cell. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, cell behaviors such as cell migration, proliferation, and differentiation are regulated, and characteristics of stem cells related to tissue regeneration are reflected (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
- exosomes called avatars of cells, contain bioactive factors such as growth factors similarly to cells, and play a role as a carrier for transporting bioactive factors between cells, that is, communication between cells.
- Exosomes are known to be released not only from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae. .
- exosomes can be isolated from cultures of cancer cells, immune cells, mesenchymal stem cells, etc., as well as plant cells or plant stem cell cultures.
- exosomes derived from plant cells or plant stem cells are still in its infancy, and most of them simply convert extracellular vesicles, which are mixed as a mixture in the filtrate of plant juice, into exosomes. It is a level that is being used for marketing. Therefore, more detailed characterization and function studies of exosomes derived from plant cells are required.
- Iris (Iris sp. ) is a perennial herbaceous plant belonging to the monocotyledonous lily order Iris family. Iris is distributed in various regions depending on the species. For example, Iris nertschinskia is distributed in Korea, Japan, northeastern China, and eastern Siberia, and is native to dry places at the foot of mountains. It has been reported that isoflavone-based substances in iris extracts exhibit anticancer or anti-inflammatory effects, but the components and action mechanisms of iris extracts have not been clearly identified. Therefore, it is necessary to accurately analyze the components of Iris and scientifically identify the pharmacological mechanism of action. The technology so far is at the level of using extracts obtained by hot water extraction or solvent extraction of iris flowers, leaves, stems, and roots as raw materials for cosmetics. However, the solvent extract has a problem of harmfulness to the human body in which the extraction solvent remains.
- callus which is called a stem cell of a plant
- a technology using callus culture obtained by culturing callus induced by scarring flowers and leaves of iris has been introduced. It is to the extent that the extract is used as a cosmetic ingredient.
- the callus culture contains growth regulators or callus inducers, it is difficult to say that it is a natural cosmetic raw material, and growth regulators contained in the culture may cause side effects such as skin trouble.
- the present inventors confirmed that Iris-derived exosomes are effective in improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, improving skin tone or brightness, skin whitening, anti-inflammatory, wound healing and/or promoting wound healing, and A cosmetic composition containing exosomes as an active ingredient for skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, skin tone or skin brightness improvement, and/or whitening, and a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing, and/or promoting wound healing have been developed. .
- An object of the present invention is to provide a composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, improving skin tone or brightness, skin whitening, anti-inflammatory, wound healing, and/or promoting wound healing, comprising exosomes derived from iris as an active ingredient.
- an object of the present invention is a cosmetic composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, improving skin tone or skin brightness and / or whitening containing the composition, and a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing and / or promoting wound healing to provide a composition.
- the present invention provides a composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, improving skin tone or brightness, skin whitening, anti-inflammatory, wound healing, and/or promoting wound healing, containing iris-derived exosomes as an active ingredient.
- the term "Iris” refers to a plant of the genus Iris ( Iris sp. ).
- the iris genus ( Iris sp. ) plants are iris ( Iris ensata ), dalmation iris ( Iris pallida ), blue flag iris ( Iris versicolor ), orris ( Iris florentina ), iris ( Iris nertschinskia ), yellow It may be iris ( Iris pseudacorus ), fan iris ( Iris setosa ), corkscrew iris ( Iris lactea ), jaman iris ( Iris germanica ) or yellow iris ( Iris odaesanensis ).
- exosomes refers to nano-sized vesicles having a membrane structure secreted or released from plant cells into the extracellular space, and may also be referred to as exosome-like vesicles or exosome-like particles. is defined
- skin elasticity refers to a property in which the skin deformed by an external force easily returns to its original shape when the external force is removed.
- Skin wrinkles refers to fine lines caused by skin deterioration, which can be caused by genes, reduction of collagen and elastin present in the skin dermis, external environment, and the like. Therefore, the term “improving skin wrinkles” as used herein means suppressing or inhibiting the formation of wrinkles on the skin, or alleviating wrinkles already formed.
- skin tone refers to a state in which the color of the skin is strong or weak.
- skin whitening includes increasing the brightness of the skin whose brightness has decreased due to excessive pigments such as melanin, or maintaining the brightness of the skin at a certain level.
- anti-inflammatory means to prevent, suppress, alleviate, improve or treat inflammation
- examples of inflammatory diseases that do not limit the present invention include dermatitis, atopic dermatitis, eczema, bacterial infection, virus Inflammation due to infection or fungal infection, burns, inflammation due to burns, wounds, inflammation due to wounds, and the like.
- wound or wound refers to a state in which a living body is damaged, and a tissue constituting an internal or external surface of a living body, such as skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organs or blood vessels. It encompasses pathological conditions in which tissues are divided or destroyed.
- wounds or wounds include abrasion, laceration, cut, cut, avulsion, decubitus, sore, destruction of tissue by irradiation, penetrating wound, It includes gunshot wounds, burns, frostbite, surgical wounds, sutures after plastic surgery, chemical wounds, etc., and may include damage to any part of the subject.
- Iontophoresis refers to a method of allowing ionized active ingredients to penetrate the skin with electrical repulsive force by changing the electrical environment of the skin by applying a potential difference by flowing a microcurrent through the skin to which the active ingredient is applied.
- Iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current from an external power source flows into an electrode patch on the skin and a microcurrent is introduced into the skin, and a battery is attached to the electrode patch itself to It may include a method in which microcurrent is introduced, a method in which microcurrent is introduced into the skin through a patch equipped with a reversed electrodialysis means that generates current through a difference in ion concentration between a high-concentration electrolyte solution and a low-concentration electrolyte solution, and the like.
- the present invention is not limited thereto, and various types of iontophoresis can be used, of course.
- exosomes derived from iris refers to, for example, iris plant cell culture medium, iris callus culture medium, iris plant stem cell culture medium, iris juice, or separated from biological solutions of iris equivalent thereto. or derived from iris plant cells or plant stem cells, eg secreted and/or released exosomes.
- the iris-derived exosomes may be separated and purified from a callus culture medium derived from the root of iris.
- composition comprising the iris-derived exosomes of one embodiment of the present invention as an active ingredient improves skin elasticity, improves skin wrinkles, regenerates skin, improves skin tone or brightness, whitens skin, anti-inflammatory, heals wounds and/or promotes wound healing. At least one efficacy may be exhibited.
- a composition comprising the exosomes derived from Iris of the present invention as an active ingredient may be a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
- the present invention provides a cosmetic composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, regenerating skin, improving skin tone or brightness, and/or whitening, containing exosomes derived from iris as an active ingredient.
- the cosmetic composition includes shampoo, soap, rinse, surfactant-containing cleansing, cream, lotion, ointment, tonic, treatment, conditioner, suspension, emulsion, paste, gel, oil, wax, spray, aerosol, It may be a mist or powder, preferably a lotion or cream.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing and/or promotion of wound healing comprising an iris-derived exosome as an active ingredient.
- the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be administered or treated by injection, microneedling, iontophoresis, application, or a combination thereof.
- the pharmaceutical composition may be in the form of an injection, an injection, a spray, a liquid or a patch.
- composition of one embodiment of the present invention when used as a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
- the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, but are not limited thereto.
- the effective amount of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect anti-inflammatory, wound healing and / or wound healing promoting effects.
- the blending ratio of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention can be appropriately selected according to the type, amount, form, etc. of the additional components as described above.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be included in about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight.
- a suitable dosage of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be adjusted according to the severity of the disease, the type of formulation, the formulation method, the patient's age, sex, weight, health condition, diet, excretion rate, administration time and administration method can For example, when administering the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention to an adult, it may be divided into 1 to several times at a dose of 0.001 mg/kg to 100 mg/kg per day.
- composition of one embodiment of the present invention is prepared as a cosmetic composition
- components commonly used in cosmetic compositions within a range that does not impair the effects of the present invention for example, moisturizers, antioxidants, oily ingredients, ultraviolet absorbers, Emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder components, coloring materials, aqueous components, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention has actions (eg, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, skin tone or brightness improvement, skin whitening, skin beauty, etc.) in addition to the iris-derived exosomes.
- actions eg, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, skin tone or brightness improvement, skin whitening, skin beauty, etc.
- Conventionally used skin improving agents, antioxidants, anti-aging agents, whitening agents, and/or moisturizing agents may be mixed and used as long as they are not damaged.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is, for example, a patch, mask pack, mask sheet, cream, tonic, ointment, suspension, emulsion, paste, lotion, gel, oil, pack, spray, aerosol, mist, foundation, It can be applied to various forms such as powder and oil paper.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be used for purposes such as improving skin elasticity, improving skin wrinkles, regenerating skin, improving skin tone or brightness, and/or skin whitening
- the cosmetic formulation may be any formulation conventionally prepared in the art.
- patches, mask packs, mask sheets, softening lotion, nourishing lotion, astringent lotion, nourishing cream, massage cream, eye cream, cleansing cream, essence, eye essence, cleansing lotion, cleansing foam, cleansing water, sunscreen, lipstick , Soap, shampoo, surfactant-containing cleansing, bath additives, body lotion, body cream, body oil, body essence, body cleanser, hair dye, hair tonic, etc. can be formulated, but is not limited thereto.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components commonly used in cosmetic compositions, and may include, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and conventional adjuvants such as fragrances and carriers.
- other ingredients may be appropriately selected and blended without difficulty by a person skilled in the art according to the type or purpose of use of the cosmetic composition.
- Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the skin condition of a mammal, except for treatment, using the cosmetic composition.
- skin condition control means improving skin condition and/or preventively controlling skin condition
- skin condition improvement means visual and/or tactile perception of the appearance and feel of the skin. It means positive change that can be made.
- improvement of skin condition may include improvement of skin elasticity, improvement of skin wrinkles, skin regeneration, improvement of skin tone or brightness, and/or skin whitening.
- step (a) directly applying the cosmetic composition to the skin of a mammal (b) applying a patch, mask pack or mask sheet on which the cosmetic composition is applied or deposited to the skin of a mammal It includes contacting or attaching to, or sequentially proceeding with (a) and (b) above.
- a lotion or cream may be used as a cosmetic composition.
- step (c) after step (b), the patch, mask pack or mask sheet is removed from the skin of the mammal, and the cosmetic composition is applied to the skin of the mammal.
- An application step may be further included.
- a lotion or cream may be used as a cosmetic composition.
- the mammal may be a human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.
- the present invention relates to inflammation treatment, wound treatment or promotion of wound healing, including the step of administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition to a mammal, or applying the pharmaceutical composition to the skin, inflammatory site or wound site ( It provides a method for accelerating wound healing.
- the mammal may be a human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.
- composition of the present invention is less likely to contain impurities such as residual solvents and growth regulators than conventional hot water extracts or solvent extracts of iris, filtrates of these extracts, and iris callus culture solutions, and improves skin elasticity, improves skin wrinkles, and regenerates skin. , skin tone or skin brightness improvement, skin whitening, anti-inflammatory, wound healing or wound healing promotion effects are excellent.
- FIG. 1 is a graph showing the particle size distribution and particle number obtained by performing NTA (nanoparticle tracking analysis) on the iris-derived exosomes of the present invention.
- FIG. 2 is a cell fluorescence microscopy image confirming the transfer of fluorescently-stained iris-derived exosomes to human dermal fibroblasts (green: exosomes delivered into cells, blue: cell nuclei).
- Figure 3 is a graph showing the relative amount of collagen increased after treating human skin fibroblasts with iris-derived exosomes.
- FIG. 4 is a graph showing the increase in migration of human skin fibroblasts after treating iris-derived exosomes with Scratch-Wound.
- 5 is a fluorescence microscopy image of a cell confirming that fluorescently stained iris-derived exosomes are delivered to melanoma cells (green: exosomes delivered into cells, blue: cell nuclei).
- 6 is a graph showing that the amount of melanin produced is decreased in a concentration-dependent manner in exosomes when melanoma cells are treated with iris-derived exosomes.
- FIG. 8 is a graph showing that IL-6 induced by LPS was reduced in a concentration-dependent manner when RAW 264.7 cells were treated with Iris-derived exosomes.
- Example 1 Preparation of iris callus culture medium
- callus derived from the root of iris is induced, and the induced iris callus is cell cultured.
- callus in a good growth state is selected and cultured in large quantities to prepare an iris callus culture medium.
- An iris callus culture medium ( Iris germanica callus culture medium) prepared in the same manner as in Example 1 was obtained from Biospectrum Co., Ltd. (an iris callus culture medium supplier located in Gyeonggi-do, Korea). The iris callus culture medium was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste products, and giant particles. Iris-derived exosomes were isolated from the filtered culture medium using a tangential flow filtration (TFF).
- TMF tangential flow filtration
- NTA nanoparticle tracking analysis
- Example 3 Iris-derived exosomes confirmation of skin fibroblast transmissibility
- PKH67 fluorescent dye
- a fluorescent dye PKH67 purchased from Sigma-Aldrich
- the reaction solution was fractionated with a MiniTrap-25 (purchased from Cytiva) column to remove free PHK67 (free PKH67) fluorescent dye not stained on the exosome membrane.
- PKH67 fluorescent dye was reacted with a buffer solution and then fractionated using a MiniTrap-25 column.
- Exosomes stained with PKH67 were cultured with human skin fibroblasts prepared by culturing in advance, and then intracellular delivery of exosomes over time was observed using a fluorescence microscope. Hoechst fluorescent dye (purchased from Thermo Fisher) was used to stain the cell nucleus, and CellMask Orange fluorescent dye (purchased from Thermo Fisher) was used to stain the cytoplasm. As a result of confirming whether the exosomes were intracellularly delivered, it was confirmed that the fluorescently stained exosomes were delivered into the cells and green fluorescence was accumulated inside the cells over time (FIG. 2).
- Human dermal fibroblasts (Human Dermal Fibroblast; purchased from ATCC) dispersed in DMEM medium containing fetal calf serum were seeded in a multi-well plate and cultured for 24 hours. Thereafter, the iris callus culture medium prepared in Example 1 and the iris-derived exosomes prepared in Example 2 were diluted in a serum-free medium, respectively, and treated with human skin fibroblasts, and the human skin fibroblasts were cultured for 24 hours. To confirm the efficacy of collagen production using human skin fibroblasts, the experimental groups were classified as follows.
- Negative control group (indicated by “N.C.” in FIG. 3): an experimental group treated only with serum-free medium;
- Iris callus culture solution treatment group (indicated as “Iris Callus CM” in FIG. high concentration: 240 ⁇ g/mL);
- Iris-derived exosome treatment group (indicated as “Iris Exosome” in FIG. 3): Experimental group treated by diluting the Iris-derived exosome prepared in Example 2 in a serum-free medium (treatment concentration - low concentration: 60 ⁇ g) /mL, high concentration: 240 ⁇ g/mL).
- Each of the above experimental groups was cultured for 24 hours after treatment with human skin fibroblasts, and the culture medium was collected and centrifuged, and then the centrifuged culture medium was prepared.
- the amount of collagen synthesized from human skin fibroblasts and accumulated in the culture medium was measured using an EIA kit (purchased from Takara) for procollagen type I C-peptide (PIP).
- the relative amount of collagen was determined by normalization by dividing by the total number of cells measured via the MTT assay kit (purchased from Sigma-Aldrich).
- the iris callus culture solution-treated group had no effect of increasing collagen synthesis in human skin fibroblasts, whereas the iris-derived exosomes of the present invention increased collagen synthesis in human skin fibroblasts, In particular, it was confirmed that collagen synthesis in human skin fibroblasts was remarkably increased when Iris-derived exosomes were treated at a high concentration (FIG. 3).
- the iris-derived exosomes of the present invention are superior in collagen synthesis increasing efficacy, that is, skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration efficacy, compared to the iris callus culture medium.
- the exosomes derived from iris of the present invention have a useful functional activity as a cosmetic for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration, that is, an activity to increase collagen synthesis. Therefore, the iris-derived exosomes of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a cosmetic composition for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration.
- Example 2 In order to evaluate whether the exosomes prepared in Example 2 promote wound healing in human dermal fibroblasts (purchased from ATCC), a scratch-wound assay was performed. Human dermal fibroblasts dispersed in DMEM medium containing fetal bovine serum were dispensed at a density of 5,000 cells/well on a culture plate for wound induction (ImageLock Plate; purchased from EssenBio) and incubated for 24 hours under 5% CO 2 and 37°C conditions. After culturing and confirming the density of 90% or more, scratches were induced using a WoundMaker (purchased from EssenBio). To confirm the skin regeneration effect using human skin fibroblasts, the experimental groups were classified as follows.
- Negative control group (indicated by “N.C.” in FIG. 4): an experimental group treated only with serum-free medium;
- Positive control group (indicated as “P.C.” in FIG. 4): an experimental group treated with a culture medium containing 10% fetal bovine serum;
- Iris callus culture solution treatment group (indicated as "Iris Callus CM” in FIG. 4): Experimental group treated by diluting the iris callus culture solution prepared in Example 1 in a serum-free medium (treatment concentration - low concentration: 50 ⁇ g / mL, high concentration: 200 ⁇ g/mL);
- Iris-derived exosome treatment group (indicated as “Iris Exosome” in FIG. 4): Experimental group treated by diluting the Iris-derived exosome prepared in Example 2 in a serum-free medium (treatment concentration - low concentration: 50 ⁇ g) /mL, high concentration: 200 ⁇ g/mL).
- the iris callus culture medium did not increase the migration of human skin fibroblasts compared to the negative control group, whereas the iris-derived exosome of the present invention increased the migration of human skin fibroblasts compared to the negative control group. It was confirmed that increased (Fig. 4).
- the iris-derived exosomes of the present invention are superior in the migration promoting effect of human skin fibroblasts, that is, the wound healing ability or skin regeneration effect, compared to the iris callus culture medium.
- the iris-derived exosome of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a cosmetic composition for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration, and a pharmaceutical composition for wound healing or promoting wound healing.
- Example 6 Iris-derived exosomes confirm melanoma cell delivery ability
- the following assay was performed to confirm whether the iris-derived exosomes were delivered into mouse melanoma (B16F10; purchased from ATCC).
- a fluorescent dye PKH67 purchased from Sigma-Aldrich.
- the reaction solution was fractionated with a MiniTrap-25 (purchased from Cytiva) column to remove free PHK67 (free PKH67) fluorescent dye not stained on the exosome membrane.
- PKH67 fluorescent dye was reacted with a buffer solution and then fractionated using a MiniTrap-25 column.
- Example 7 Melanin production inhibitory effect of iris-derived exosomes
- the whitening effect of the iris-derived exosomes was confirmed through inhibition of melanin production in melanoma cells.
- the melanoma cells are cells derived from mouse melanoma (B16F10; purchased from ATCC) and secrete a black pigment called melanin. After dispensing 8,000 melanoma cells per unit area in a 48-well plate, they were cultured for 24 hours under 5% CO 2 and 37°C conditions.
- the iris callus culture medium prepared in Example 1 and the iris-derived exosomes prepared in Example 2 were diluted in a culture medium mixed with a-MSH, a melanin synthesis stimulant, and then treated with melanoma cells. time incubated.
- the experimental groups were classified as follows.
- Negative control group (indicated by “N.C.” in FIG. 6): an experimental group treated with a culture medium mixed with a-MSH, a melanin synthesis stimulator;
- Iris callus culture solution treatment group (indicated as "Iris Callus CM" in FIG. 6): Experimental group treated with a culture medium mixed with the iris callus culture solution prepared in Example 1 and a-MSH, a melanin synthesis stimulator (treatment concentration - low concentration: 100 ⁇ g/mL, high concentration: 200 ⁇ g/mL);
- Iris-derived exosome treatment group (indicated as “Iris Exosome” in FIG. 6): Experimental group treated with a culture medium in which Iris-derived exosome prepared in Example 2 and a-MSH, a melanin synthesis stimulator, were mixed ( Treatment concentration - low concentration: 100 ⁇ g/mL, high concentration: 200 ⁇ g/mL).
- the recovered melanoma culture medium and CCK-8 assay reagent purchased from Dojindo
- the supernatant was transferred to a 96-well plate and the total cell number was measured by measuring the absorbance at 450 nm.
- the washed melanoma cells were treated with 1N NaOH (purchased from Merck-Milipore) mixed with 10% DMSO, and then the plate was sealed and incubated at 85°C.
- the melanin in the melanoma cells was extracted by heating for 20 minutes. The extracted melanin measured the absorbance at 405 nm to calculate the amount of melanin, and normalized to the absorbance value measured through the CCK-8 assay.
- the iris-derived exosomes of the present invention had an effect of inhibiting melanin synthesis in melanoma cells in a concentration-dependent manner compared to the negative control group, and that the melanin synthesis inhibitory effect was superior to that of the iris callus culture medium (Fig. 6).
- the cosmetic composition containing the iris-derived exosomes of the present invention as an active ingredient has a whitening effect, and the iris-derived exosomes of the present invention are effective in cosmetic compositions for skin tone improvement, skin brightness improvement and/or skin whitening. It can be usefully utilized as a component.
- Example 8 Iris-derived exosomes confirmation of macrophage delivery ability
- the membrane of the iris-derived exosome prepared in Example 2 was reacted with a fluorescent dye PKH67 (purchased from Sigma-Aldrich) in order to fluorescently stain the membrane.
- PKH67 purchased from Sigma-Aldrich
- the reaction solution was fractionated with a MiniTrap-25 (purchased from Cytiva) column to remove free PHK67 (free PKH67) fluorescent dye not stained on the exosome membrane.
- PKH67 fluorescent dye was reacted with a buffer solution and then fractionated with a MiniTrap-25 column.
- Exosomes stained with PKH67 were cultured with previously prepared mouse macrophages, and then intracellular delivery of exosomes over time was observed using a fluorescence microscope. Hoechst fluorescent dye (purchased from Thermo Fisher) was used to stain the cell nucleus, and CellMask Orange fluorescent dye (purchased from Thermo Fisher) was used to stain the cytoplasm. As a result of confirming whether the exosomes were intracellularly delivered, it was confirmed that the fluorescently stained exosomes were delivered into the cells and green fluorescence was accumulated inside the cells over time (FIG. 7).
- Example 9 Evaluation of anti-inflammatory efficacy of exosomes derived from iris
- the effect of the iris-derived exosomes on the amount of IL-6 produced in mouse macrophage RAW 264.7 cells was confirmed.
- RAW 264.7 cells suspended in DMEM medium containing 10% FBS were dispensed into each well of a 48-well plate to have a confluency of 80 to 90%.
- the iris callus culture medium prepared in Example 1 and each of the iris-derived exosomes prepared in Example 2 were mixed in a new LPS-containing medium [DMEM medium containing 1% FBS and 200 nM LPS (lipopolysaccharide)] to obtain RAW 264.7 cells
- RAW 264.7 cells were cultured for 24 hours.
- Experimental groups for anti-inflammatory efficacy evaluation were classified as follows.
- Negative control group (indicated by “N.C.” in FIG. 8): an experimental group in which only LPS medium was treated with RAW 264.7 cells;
- Positive control group (indicated as “P.C.” in FIG. 8): an experimental group treated with RAW 264.7 cells by mixing LPS medium with dexamethasone (final concentration: 200 ⁇ M);
- Iris callus culture solution treatment group (shown as "Iris Callus CM" in FIG. 8): Experimental group treated with RAW 264.7 cells by diluting the iris callus culture solution prepared in Example 1 in LPS medium (treatment concentration - low concentration: 50 ⁇ g) /mL, high concentration: 200 ⁇ g/mL);
- Iris-derived exosome treatment group Experimental group treated with RAW 264.7 cells by diluting the iris-derived exosome prepared in Example 2 in LPS medium (treatment concentration - low concentration: 50 ⁇ g / mL, high concentration: 200 ⁇ g / mL).
- IL-6 an inflammatory cytokine present in the culture supernatant
- IL-6 ELISA kit purchased from R&D systems
- the amount of production of IL-6 (inflammatory cytokine) in the group treated with only LPS and dexamethasone, iris callus culture medium and iris-derived exosomes were mixed with LPS medium.
- the amount of IL-6 produced in the treated experimental group was confirmed (FIG. 8).
- the exosomes derived from Iris of the present invention had excellent anti-inflammatory efficacy. Therefore, the iris-derived exosomes of the present invention can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing and/or promoting wound healing.
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Abstract
본 발명은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종래의 아이리스 열수 추출물이나 용매 추출물, 이러한 추출물의 여과물 및 아이리스 캘러스 배양액에 비해 잔류 용매, 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 미백용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.
피부 노화가 일어나면, 피부탄력이 감소하고 피부주름이 증가하게 되는데, 피부탄력 감소 및 피부주름 형성은 콜라겐의 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현이 촉진되어 나타나는 것으로 알려져 있다.
또한, 노화의 진행이나 자외선 등에 의해 피부 세포에서는 염증성 사이토카인을 생성하는 효소인 COX-2의 증가로 인한 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)의 합성이 증가하고, 염증유발인자들의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응들로 인해서 MMP의 생합성이 증가하여 콜라겐 분해가 일어나고 피부탄력 감소와 피부주름 형성이 나타나게 된다. 특히, 일광 및 자외선이 피부에 직접 조사될 경우 자유라디칼을 많이 발생시키며, 이러한 자유라디칼에 의해 피부의 항산화 방어체계는 손상을 받게 되어 주름을 증가시키고, 피부를 이완시키는 등 피부노화를 가속화시킨다. 피부주름개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있다.
사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌 농도와 분포에 따라 결정된다. 멜라닌은 티로시나아제에 의해 티로신으로부터 도파(DOPA), 도파퀴논으로 전환된 후 비효소적인 산화 반응을 거쳐 합성된다. 멜라닌이 과량 생성되면 색소 침착이 일어나고 얼굴, 목, 팔 등에 기미, 점, 주근깨 등이 생겨 외관상 보기 좋지 않다. 기미, 주근깨, 어두운 피부톤을 개선하기 위한 피부 미백제가 개발되고 있으나, 미백 효과가 우수하면서도 부작용이 없는 피부 미백제의 개발은 어려운 것이 현실이다. 예를 들어, 멜라닌을 생성하는 멜라노사이트를 선택적으로 공격하는 피부 미백제는 미백 효과는 탁월하지만 피부 독성의 부작용이 있다.
염증은 물리적 또는 화학적 외상, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스에 의한 감염, 각종 알레르기 유발 물질 등에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 생체의 방어 반응이다. 염증반응은 선천성 면역 반응의 일환으로 나타난다. 염증반응에는 다양한 물질 및 생리·화학적 현상이 관여하는데, 최근의 연구에 따르면 다양한 염증성 사이토카인이 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 염증반응에 관여하는 주요 사이토카인으로는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-β 등이 있으며, 이들의 발현량 및 분비량 증가와 활성화는 염증매개물질 분비, 면역세포 침윤, 세포 이동 및 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열 및 통증 등의 증상과 관련이 있다.
일반적으로, 염증반응은 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하면 큰 문제가 되지 않고 질환 부위가 정상으로 회복되지만, 감염원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 급·만성 염증성 질환을 유발하게 된다. 염증반응이나 이로 인한 염증성 질환의 완화 내지는 치료를 위해 비스테로이드계 항염제, 스테로이드계 항염제, 신경 펩타이드 길항제, COX 억제제, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제를 사용하지만, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 과민 반응, 내성, 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한, 이들 약제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 한계도 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 암세포, 면역세포, 중간엽 줄기세포 등의 배양액 외에도 식물세포 내지는 식물줄기세포 배양액으로부터도 분리될 수 있다.
그러나 식물세포 내지는 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대한 연구는 아직 초기 단계이며, 이들 중 대부분은 단순히 식물착즙의 여과물 내에 혼합물로 혼재되어 있는 세포외 소포체를 엑소좀이라고 하면서 마케팅에 활용하고 있는 수준이다. 따라서 식물세포로부터 유래된 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요하다.
아이리스(Iris sp.)는 외떡잎식물 백합목 붓꽃과의 다년생 초본식물이다. 아이리스는 종에 따라 다양한 지역에 분포한다. 예를 들어, 붓꽃(Iris nertschinskia)은 한국, 일본, 중국 북동부, 시베리아 동부에 분포하고, 산기슭의 건조한 곳이 자생지다. 아이리스 추출물 중 이소플라본(isoflavone) 계열의 물질이 항암 또는 항염증 효능을 나타낸다고 보고되어 있으나, 아이리스 추출물의 성분과 작용 기전은 명확하게 규명되지 않은 상태이다. 따라서 아이리스에 대한 정확한 성분 분석 및 약리학적 작용 기전에 대한 과학적 규명이 필요하다. 현재까지의 기술은 아이리스 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 등을 열수 추출이나 용매 추출하여 얻은 추출물을 화장품 원료로 사용하는 수준이다. 그러나 용매 추출물은 추출 용매가 잔류하는 인체 유해성의 문제가 있다.
최근에는 식물의 줄기세포라고 불리는 캘러스(callus)를 이용한 화장품 소재에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이와 관련하여 아이리스의 꽃, 잎 등에 상처를 내어 유도한 캘러스를 배양하여 얻은 캘러스 배양물을 이용하는 기술이 소개되고 있으나, 이 역시 캘러스 배양물 자체 또는 이를 건조한 후 열수 추출이나 용매 추출 등으로 추출하여 얻은 추출물을 화장품 성분으로 이용하고 있는 정도이다. 또한, 캘러스 배양물에는 생장조절물질이나 캘러스 유도물질이 포함되어 있어 천연물질의 화장품 원료라고 하기 어렵고 배양물 내에 포함된 생장조절물질 등이 피부 트러블 등의 부작용을 일으킬 우려가 있다.
본 발명자는 아이리스 유래의 엑소좀이 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 등에 효능이 있는 것을 확인하고, 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 미백용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 개발하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 미백용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "아이리스"는 아이리스 속(Iris sp.) 식물을 의미한다. 예를 들어, 상기 아이리스 속(Iris sp.) 식물은 꽃창포(Iris ensata), 달메이션아이리스(Iris pallida), 블루플래그아이리스(Iris versicolor), 오리스(Iris florentina), 붓꽃(Iris nertschinskia), 노랑꽃창포(Iris pseudacorus), 부채붓꽃(Iris setosa), 타래붓꽃(Iris lactea), 자아만아이리스(Iris germanica) 또는 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 식물세포로부터 세포외 공간으로 분비 또는 방출된 막 구조를 갖는 나노 사이즈의 소낭을 의미하며, 엑소좀-유사 베지클 또는 엑소좀-유사 파티클로도 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 탄력"은 외력에 의해 변형된 피부가 해당 외력이 제거되었을 때 쉽게 원형으로 복귀되는 특성을 의미한다. "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부톤"은 피부의 색깔이 강하거나 약한 정도의 상태를 의미한다. "피부 미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소한 피부의 명도를 증가시키거나, 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 용어, "항염"이란 염증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상처 또는 창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 상처 또는 창상은 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 명세서에서 사용된 "아이리스 유래의 엑소좀"이란 용어는 예를 들어, 아이리스 식물세포 배양액, 아이리스 캘러스 배양액, 아이리스 식물줄기세포 배양액, 아이리스 착즙물, 또는 이들과 동등한 아이리스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나 아이리스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된, 예를 들어 분비 및/또는 방출된 엑소좀을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스의 뿌리 유래 캘러스 배양액으로부터 분리 정제된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 중 적어도 하나의 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더일 수 있고, 바람직하게는 로션이나 크림일 수 있다.
또한, 본 발명은 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염증, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염증, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 아이리스 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(예를 들어, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부미백, 피부 미용 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제, 항산화제, 항노화제, 미백제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 피부 미백 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물의 피부 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부 상태 조절이란 피부 상태를 개선시키고/시키거나 피부 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부 상태 개선이란 피부의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 및/또는 피부 미백일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 약학 조성물을 피부, 염증 부위 또는 상처 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진(accelerating wound healing)을 위한 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 조성물은 종래의 아이리스 열수 추출물이나 용매 추출물, 이러한 추출물의 여과물 및 아이리스 캘러스 배양액에 비해 잔류 용매, 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선, 피부 미백, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진 효과가 우수하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀에 대해 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 형광 염색된 아이리스 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵).
도 3은 인체 피부 섬유아세포에 아이리스 유래의 엑소좀을 처리한 후 증가하는 상대적인 콜라겐 양을 도시한 그래프이다.
도 4는 아이리스 유래의 엑소좀을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리한 후 인체 피부 섬유아세포의 이동이 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 형광 염색된 아이리스 유래의 엑소좀이 멜라노마 세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵).
도 6은 멜라노마 세포에 아이리스 유래의 엑소좀을 처리한 경우 엑소좀 농도의존적으로 멜라닌 생성량이 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 7은 형광 염색된 아이리스 유래의 엑소좀이 RAW 264.7 세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵).
도 8은 아이리스 유래의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 엑소좀 농도의존적으로 LPS에 의해 유도되는 IL-6가 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 아이리스 캘러스 배양액의 제조
당업계에 알려진 식물 줄기세포 제조 및 배양 방법에 따라, 아이리스의 뿌리 유래 캘러스를 유도하고, 유도된 아이리스 캘러스를 세포 배양한다. 그리고, 성장상태가 좋은 캘러스를 선택하고 대량으로 배양하여 아이리스 캘러스 배양액을 준비한다.
실시예 2: 아이리스 유래의 엑소좀의 제조
실시예 1과 같은 방식으로 제조된 아이리스 캘러스 배양액[자아만아이리스(Iris germanica) 캘러스 배양액]을 바이오스펙트럼 주식회사(대한민국 경기도에 소재하는 아이리스 캘러스 배양액 공급업체)에서 입수하였다. 아이리스 캘러스 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 아이리스 유래의 엑소좀을 분리하였다.
분리된 아이리스 유래의 엑소좀의 크기와 농도는 NS300 (Malvern Panalytical에서 구입)을 이용한 나노입자트래킹분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 확인하였다(도 1).
실시예 3: 아이리스 유래의 엑소좀의 피부 섬유아세포 전달능의 확인
아이리스 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포(ATCC에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(Sigma-Aldrich에서 구입) 형광 염료와 반응시켰다. 반응 후 반응액을 MiniTrap-25(Cytiva에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67) 형광 염료를 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MiniTrap-25 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 인체 피부 섬유아세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트(Hoechst) 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였고, 세포질을 염색하기 위하여 CellMask Orange 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 4: 콜라겐 생성 촉진 효과의 확인
우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 인체 피부 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast; ATCC에서 구입)를 멀티웰 플레이트에 분주한 후 24시간 배양하였다. 이후 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액과 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀을 각각 무혈청 배지에 희석한 후 인체 피부 섬유아세포에 처리하고 인체 피부 섬유아세포를 24시간 배양하였다. 인체 피부 섬유아세포를 이용한 콜라겐 생성 효능의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다.
(1) 음성대조군 (도 3에서 "N.C."로 표시): 무혈청 배지만 처리한 실험군;
(2) 아이리스 캘러스 배양액 처리군 (도 3에서 "Iris Callus CM"으로 표시): 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액을 무혈청 배지에 희석하여 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 60 μg/mL, 고농도: 240 μg/mL);
(3) 아이리스 유래의 엑소좀 처리군 (도 3에서 "Iris Exosome"으로 표시): 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀을 무혈청 배지에 희석하여 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 60 μg/mL, 고농도: 240 μg/mL).
상기 각 실험군을 인체 피부 섬유아세포에 처리 후 24시간 배양하였고, 배양액을 회수하고 원심분리한 후, 원심분리된 배양액을 준비하였다. 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트(Takara에서 구입)를 이용하여 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다. 상대적인 콜라겐 양은 MTT 어세이 키트(Sigma-Aldrich에서 구입)를 통해 측정된 총 세포수로 나누어 정규화하여 결정하였다.
그 결과, 아이리스 캘러스 배양액 처리군은 음성대조군과 비교하여 인체 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 증가 효과가 없는 반면에, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 증가시켰으며, 특히 아이리스 유래의 엑소좀을 고농도로 처리한 경우 인체 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성을 현저히 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 3).
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스 캘러스 배양액 보다 콜라겐 합성 증가 효능, 즉 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생 효능이 우수한 것을 알 수 있다.
상기 결과에 따르면, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장품으로서 유용한 기능적 활성, 즉 콜라겐 합성을 증가시키는 활성을 갖는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 5: 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인
실시예 2와 같이 준비된 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast; ATCC에서 구입)에서 상처 회복능을 촉진하는지 여부를 평가하기 위하여 스크래치-운드 어세이(Scratch-Wound Assay)를 시행하였다. 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 인체 피부 섬유아세포를 상처 유도용 컬처 플레이트(ImageLock Plate; EssenBio에서 구입)에 5,000 세포/웰의 밀도로 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양하여 90% 이상의 밀집도를 확인한 후, 운드메이커(WoundMaker; EssenBio에서 구입)를 이용하여 스크래치를 유발하였다. 인체 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다.
(1) 음성대조군 (도 4에서 "N.C."로 표시): 무혈청 배지만 처리한 실험군;
(2) 양성대조군 (도 4에서 "P.C."로 표시): 10% 우태아혈청이 포함된 배양 배지를 처리한 실험군;
(3) 아이리스 캘러스 배양액 처리군 (도 4에서 "Iris Callus CM"으로 표시): 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액을 무혈청 배지에 희석하여 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 50 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL);
(4) 아이리스 유래의 엑소좀 처리군 (도 4에서 "Iris Exosome"으로 표시): 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀을 무혈청 배지에 희석하여 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 50 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL).
이후, 상기 실험군 각각을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 인체 피부 섬유아세포를 배양한 후 상처 회복능을 인큐사이트(Incucyte; Sartorius로부터 구입)로 측정하였다.
상처 회복능을 측정한 결과, 아이리스 캘러스 배양액은 음성대조군과 비교하여 인체 피부 섬유아세포의 이동을 증가시키지 않은 반면에, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 음성대조군과 비교하여 인체 피부 섬유아세포의 이동을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 4).
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스 캘러스 배양액 보다 인체 피부 섬유아세포의 이동 촉진 효능, 즉 상처 회복능 내지는 피부재생 효능이 우수한 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장료 조성물과, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 6: 아이리스 유래의 엑소좀의 멜라노마 세포 전달능의 확인
아이리스 유래의 엑소좀이 마우스 멜라노마(B16F10; ATCC에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(Sigma-Aldrich에서 구입) 형광 염료와 반응시켰다. 반응 후 반응액을 MiniTrap-25(Cytiva에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67) 형광 염료를 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MiniTrap-25 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 마우스 멜라노마 세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트(Hoechst) 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였고, 세포질을 염색하기 위하여 CellMask Orange 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 7: 아이리스 유래의 엑소좀의 멜라닌 생성 억제 효과
아이리스 유래의 엑소좀의 미백효과를 멜라노마 세포에 대한 멜라닌 생성 억제를 통해 확인하였다. 상기 멜라노마 세포는 마우스 흑색종에서 유래한 세포이며(B16F10; ATCC에서 구입), 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 멜라노마 세포를 48-웰 플레이트에 단위 면적당 8,000 세포씩 분주한 후 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양하였다.
이후, 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액과 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀을 각각 멜라닌 합성 자극제인 a-MSH가 혼합된 배양배지에 희석한 후 멜라노마 세포에 처리하고 멜라노마 세포를 48시간 배양하였다. 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효능의 확인을 위하여 실험군을 다음과 같이 분류하였다.
(1) 음성대조군(도 6에서 "N.C."로 표시): 멜라닌 합성 자극제인 a-MSH가 혼합된 배양배지를 처리한 실험군;
(2) 양성대조군(도 6에서 "P.C."로 표시): 멜라닌 합성 자극제인 a-MSH와 알부틴(Arbutin)(최종농도: 1mM)을 혼합한 배양배지를 처리한 실험군;
(3) 아이리스 캘러스 배양액 처리군 (도 6에서 "Iris Callus CM"으로 표시): 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액과 멜라닌 합성 자극제인 a-MSH가 혼합된 배양배지를 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 100 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL);
(4) 아이리스 유래의 엑소좀 처리군 (도 6에서 "Iris Exosome"으로 표시): 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀과 멜라닌 합성 자극제인 a-MSH가 혼합된 배양배지를 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 100 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL).
상기 각 실험군에 따른 멜라노마 배양배지를 회수한 후, 회수된 멜라노마 배양배지와 CCK-8 어세이 시약(Dojindo에서 구입)을 혼합하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 상층액을 96-웰 플레이트로 옮겨 450nm 흡광도를 측정하여 총 세포수를 측정하였다. 48-웰 플레이트 내의 멜라노마 세포는 세척 용액으로 세척한 후, 세척된 멜라노마 세포에 대해 10% DMSO를 혼합한 1N NaOH(Merck-Milipore에서 구입)를 처리한 후 플레이트를 밀봉하고 85℃ 조건에서 20분간 가열하여 멜라노마 세포 내 멜라닌을 추출하였다. 추출한 멜라닌은 405nm 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 계산하였고, CCK-8 어세이를 통해 측정된 흡광도 값으로 정규화하였다.
그 결과, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 음성대조군과 비교하여 농도 의존적으로 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성을 저해시키는 효능이 있으며, 아이리스 캘러스 배양액 보다 멜라닌 합성 저해 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 6).
따라서, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 미백 효과를 가지며, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 피부톤 개선, 피부 밝기 개선 및/또는 피부 미백을 위한 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 8: 아이리스 유래의 엑소좀의 대식 세포 전달능의 확인
아이리스 유래의 엑소좀이 마우스 대식세포(RAW 264.7; ATCC에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(Sigma-Aldrich에서 구입) 형광 염료와 반응시켰다. 반응 후 반응액을 MiniTrap-25(Cytiva에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67) 형광 염료를 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MiniTrap-25 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 마우스 대식세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트(Hoechst) 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였고, 세포질을 염색하기 위하여 CellMask Orange 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다 (도 7).
실시예 9: 아이리스 유래의 엑소좀의 항염 효능 평가
실시예 2와 같이 준비된 아이리스 유래의 엑소좀이 항염 효능을 나타내는지 확인하기 위해, 상기 아이리스 유래의 엑소좀이 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서의 IL-6의 생성량에 미치는 효과를 확인하였다. 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시킨 RAW 264.7 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 이후 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액과 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀 각각을 LPS가 포함된 새로운 배지[1% FBS와 200nM의 LPS(lipopolysaccharide)를 포함한 DMEM 배지]에 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 후 RAW 264.7 세포를 24시간 배양하였다. 항염 효능 평가를 위한 실험군은 다음과 같이 분류하였다.
(1) 음성대조군(도 8에서 "N.C."로 표시): LPS 배지만 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(2) 양성대조군(도 8에서 "P.C."로 표시): LPS 배지에 덱사메타손 (dexamethasone)(최종농도: 200 μM)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(3) 아이리스 캘러스 배양액 처리군 (도 8에서 "Iris Callus CM"으로 표시): 실시예 1에서 준비된 아이리스 캘러스 배양액을 LPS 배지에 희석하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 50 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL);
(4) 아이리스 유래의 엑소좀 처리군: 실시예 2에서 준비된 아이리스 유래의 엑소좀을 LPS 배지에 희석하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군 (처리농도 - 저농도: 50 μg/mL, 고농도: 200 μg/mL).
배양이 끝난 후 배양 상층액을 취하고 배양 상층액 내에 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성량을 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. ELSIA 키트(R&D systems에서 구입) 제조사의 매뉴얼에 따라 LPS만을 처리한 군에서의 IL-6(염증성 사이토카인)의 생성량과, 덱사메타손, 아이리스 캘러스 배양액 및 아이리스 유래의 엑소좀 각각을 LPS 배지와 혼합하여 처리한 실험군에서의 IL-6 생성량을 확인하였다(도 8).
도 8에 도시된 바와 같이, 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀을 처리한 실험군에서는 LPS만 RAW 264.7 세포에 처리한 음성대조군에 비해 IL-6의 생성이 현저하게 억제된 반면에, RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 아이리스 캘러스 배양액을 처리한 실험군에서는 IL-6의 생성 감소 효과가 나타나지 않았다. 또한, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀의 처리 농도가 증가함에 따라 IL-6의 생성이 더욱 억제되는 경향을 보여 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 농도의존적인 항염 효과가 있음을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 항염 효능이 우수한 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 아이리스 유래의 엑소좀은 항염, 창상 치료 및/또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (18)
- 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 미백용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더인, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 미백용 화장료 조성물.
- 제2항에 있어서,크림 또는 로션인, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 미백용 화장료 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스 식물세포 배양액, 아이리스 캘러스 배양액, 아이리스 식물줄기세포 배양액, 아이리스 착즙물, 또는 이들과 동등한 아이리스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나, 아이리스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된 것인, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 미백용 화장료 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스의 뿌리 유래 캘러스 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 미백용 화장료 조성물.
- 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서,주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리되는, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서,주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스 식물세포 배양액, 아이리스 캘러스 배양액, 아이리스 식물줄기세포 배양액, 아이리스 착즙물, 또는 이들과 동등한 아이리스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나, 아이리스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된 것인, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
- 제9항에 있어서,상기 아이리스 유래의 엑소좀은 아이리스의 뿌리 유래 캘러스 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
- 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물의 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 피부톤이나 피부밝기 개선 또는 피부 미백을 하는 미용방법.
- 제11항에 있어서,(a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 미용방법.
- 제12항에 있어서,상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
- 제14항에 있어서,상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
- 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계, 또는 아이리스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물의 피부, 염증 부위 또는 상처 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진을 위한 방법.
- 제17항에 있어서,상기 포유동물은 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진을 위한 방법.
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