WO2020022731A1 - 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement or skin wrinkle improvement comprising exosomes derived from rose stem cells as an active ingredient.
- MMP matrix metalloproteinase
- prostaglandin E2 due to the increase of COX-2, an enzyme that produces inflammatory cytokines, is increased in skin cells due to the progress of aging and ultraviolet rays, and the production of inflammatory factors is known to increase.
- Inflammatory reactions increase MMP biosynthesis, leading to collagen breakdown, decreased skin elasticity and wrinkle formation.
- sunlight and UV rays are directly irradiated to the skin, a lot of free radicals are generated, and the antioxidant defenses of the skin are damaged by these free radicals, thereby increasing wrinkles and relaxing skin, thereby accelerating skin aging. Therefore, in order to reduce skin wrinkles and maintain elasticity, it is necessary to protect the skin by promoting reactive oxygen species and free radical generation inhibition, inflammatory response inhibition and skin regeneration from wounds.
- Adenosine, retinoic acid, and the like are known to be effective in improving skin wrinkles, but adenosine is ineffective in clinical practice, and retinoic acid cannot be used in women of childbearing potential and has side effects such as erythema. Accordingly, functional cosmetics for skin anti-aging using active ingredients of plants and natural products have recently attracted attention. However, functional cosmetics containing a plant extract as an active ingredient may cause a foreign body in the process of evaporating the solution after applying to the skin, there is a problem that the effect duration is short.
- the cell secretome contains a variety of bioactive factors that control the behavior (behavior) of the cell, especially in the cell secretion 'exosome (exosome) that has an intercellular signaling function 'Is included, the research on the ingredients and functions are actively in progress.
- Extracellular vesicles are called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, may be used separately from exosomes.
- Exosomes are tens to hundreds of nanometers of endoplasmic reticulum consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
- Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
- Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
- Exosomes contain specific genetic materials and bioactive factors depending on the nature and state of the cells from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, it regulates cellular behavior such as cell migration, proliferation and differentiation and reflects stem cell characteristics related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
- Exosomes are known to be released not only from stem cells and cancer cells but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae.
- exosomes can be isolated from plant stem cell culture in addition to mesenchymal stem cell culture and fibroblast culture.
- Roses are grown in a variety of varieties, such as the northern hemisphere cold, subtropical, temperate, and subtropical, the extract is used in perfumes and cosmetics.
- the technology to date is that the extract obtained by drying the petals of roses by hot water extraction or solvent extraction is used for perfumes and fragrances.
- the rose callus culture contains growth regulators or callus inducers, so it is difficult to call it a cosmetic raw material of natural substances, and growth regulators contained in the culture may cause side effects such as skin troubles.
- the present inventors confirm that exosomes derived from rose stem cells are effective in skin regeneration, skin elasticity improvement and / or skin wrinkle improvement, and skin regeneration and skin elasticity containing exosomes derived from rose stem cells as an active ingredient.
- a cosmetic composition for improving or improving skin wrinkles has been developed.
- the present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement or skin wrinkle improvement comprising exosomes derived from rose stem cells as an active ingredient.
- Rosa spp Refers to dicotyledonous plants, rosacea, rosaceae and plants belonging to the genus Rose, and includes both wild and improved horticultural species.
- exosomes refers to nano-sized vesicles having a membrane structure secreted or released from plant cells into extracellular space, and also referred to as exosome-like vesicles or exosome-like particles. Is defined.
- skin elasticity refers to the property that the skin deformed by external force is easily returned to the original shape when the external force is removed.
- Skin wrinkles refers to the skin lines produced by the decay of the skin, which may be caused by a gene, a decrease in collagen and elastin in the skin dermis, external environment, and the like.
- improved of skin wrinkles means to inhibit or inhibit the generation of wrinkles on the skin, or to alleviate wrinkles that have already been produced.
- the rose stem cells may be obtained by inducing cell culture after inducing a rose (pear) or leaf-derived callus.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be a cream or lotion, for example.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is a component that is commonly used in cosmetics, such as moisturizers, antioxidants, oily ingredients, ultraviolet absorbers, emulsifiers, surfactants, thickeners, within the range that does not impair the effects of the present invention, Alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients and the like can be appropriately blended as necessary.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention in addition to exosomes derived from rose stem cells, skin improvers conventionally used so long as they do not impair its action (improve skin wrinkles, regenerate skin, improve skin elasticity, skin beauty, etc.). And / or humectants may be mixed together.
- the exosomes derived from the rose stem cells of the present invention may be supported or mixed in at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or a hyaluronic acid gel.
- the type of the hydrogel is not limited, but preferably may be a hydrogel obtained by dispersing the gelling polymer in a polyhydric alcohol.
- the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum.
- the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, aerosols, mists, foundations, It can be applied to various forms such as powder and oil paper.
- the cosmetic composition may be applied or deposited on at least one side of the patch, mask pack or mask sheet.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is used for the purpose of skin regeneration, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, etc.
- the cosmetic formulation may be prepared in any formulation commonly prepared in the art.
- the cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components conventionally used in cosmetics, and may include, for example, conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
- auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
- other components can be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty depending on the kind or purpose of use of the cosmetic composition.
- controlling the condition of the skin means improving the condition of the skin and / or prophylactically controlling the condition of the skin, and improving the condition of the skin means visual and / or the appearance and feel of the skin tissue. Or it means a positive change that can be perceived tactilely.
- skin condition improvement may be skin regeneration, skin elasticity improvement, and / or skin wrinkle improvement.
- the cosmetic method of one embodiment of the present invention (a) applying the cosmetic composition directly to the skin of the mammal, (b) a patch, mask pack or mask sheet to which the cosmetic composition is applied or deposited, the skin of the mammal Contacting or attaching to, or sequentially proceeding with (a) and (b).
- a lotion or cream may be used as the cosmetic composition.
- the cosmetic method of one embodiment of the present invention (c) after the step (b) to remove the patch, mask pack or mask sheet from the skin of the mammal, the cosmetic composition to the skin of the mammal
- the method may further include applying.
- a lotion or cream may be used as the cosmetic composition.
- the mammal may be human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.
- the cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement or wrinkle improvement containing exosomes derived from rose stem cells of the present invention as an active ingredient contains impurities such as growth regulators as compared to conventional rose filtrates, simple extracts and callus culture medium. The likelihood of low cytotoxicity is lower than that of rose stem cell culture filtrate.
- the cosmetic composition of the present invention has excellent effects such as skin regeneration, skin elasticity improvement and / or skin wrinkle improvement.
- FIG. 1A is a particle image photograph of rose stem cell-derived exosomes obtained according to one embodiment of the present invention by TEM (transmitted electron microscopy), and FIG. 1B is an enlarged photograph of FIG. 1A.
- Figure 2 is a graph showing the results of NTA analysis of rose stem cell-derived exosomes.
- FIG. 3 is a cell fluorescence microscopic image confirming that fluorescently stained exosomes are delivered to human skin fibroblasts (green: exosomes delivered into cells, blue: cell nucleus, red: bleeding membrane).
- Figure 4 is a graph showing the relative amount of collagen increased after treatment with rose stem cell-derived exosomes in human skin fibroblasts.
- Figure 5 is an optical micrograph taken 48 hours after treatment and cultured human dermal papilla cells with rose stem cell culture filtrate or rose stem cell-derived exosomes.
- Figure 5 when treated with 20% of the rose stem cell culture filtrate, it can be seen that almost all human dermal papilla cells have lost their original form and are dead.
- Figure 6 is a negative cell survival rate when the human dermal papilla cells treated with rose stem cell culture filtrate and cultured for 48 hours and the cell survival rate when treated with rose stem cell-derived exosomes and cultured for 48 hours It is a graph expressed as a percentage of the control group (experiment group using only culture medium).
- rose embryos and / or leaf-derived callus are induced, and the induced rose callus is cell cultured. Then, select a good growth state callus and culture in large quantities to prepare a rose stem cell culture.
- the rose stem cell culture solution prepared in the same manner as in Example 1 was obtained from Bio FDNC Co., Ltd. (Incheon Metropolitan City, Korea).
- the rose stem cell culture was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste and macroparticles. From the filtered culture, exosomes derived from rose stem cells were isolated using Tangential Flow Filtration (TFF).
- the size of the exosomes derived from the isolated rose stem cells was confirmed using a transmitted electron microscopy (TEM). As shown in Figure 1A and 1B, the isolated exosomes derived from rose stem cells were confirmed to be nano-sized vesicles. The size and concentration of rose stem cell-derived exosomes were confirmed by nanoparticle tracking analysis (NTA) using NS300 (purchased from Malvern Panalytical) (FIG. 2).
- NTA nanoparticle tracking analysis
- exosomes derived from rose stem cells are delivered into human skin fibroblasts (purchased from cell bio).
- PKH67 purchased from Sigma
- the reaction solution was fractionated with a MW3000 (purchased from Thermo Fisher Scientific) column to remove free PHK67 (free PKH67), which was not stained on the exosome membrane.
- a PKH67 fluorescent dye was reacted with a buffer solution and fractionated with a MW3000 column.
- Exosomes stained with PKH67 were incubated with human skin fibroblasts prepared in advance, and then intracellular delivery of exosomes over time was observed using a fluorescence microscope.
- a pest fluorescent dye purchased from Sigma
- CellMask Orange fluorescent dye was used to stain cell membranes.
- the culture solution was recovered and centrifuged, and then the cultured medium was prepared.
- the amount of collagen synthesized from human skin fibroblasts and accumulated in culture was measured using an EIA kit (produced from Takara) for procollagen type I C-peptide (PIP).
- the total protein amount of cell lysate was measured with the BCA Protein Quantitation Kit (purchased from ThermoFisher Scientific). Relative collagen amount was corrected to total protein amount.
- exosomes derived from rose stem cells of the present invention increased collagen synthesis in human skin fibroblasts (FIG. 4).
- the filtered culture reduced collagen synthesis compared to the negative control (Fig. 4).
- the cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement or wrinkle improvement containing exosomes derived from rose stem cells of the present invention as an active ingredient has a useful functional activity as a functional cosmetic, that is, to increase collagen synthesis
- the exosome derived from the rose stem cells of the present invention can be usefully used as an active ingredient of the functional cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement or wrinkle improvement.
- HDP Human hair follicle dermal papilla cells
- HDP culture medium purchased from CellBio
- 1.5 ⁇ 10 4 HDP cells were inoculated per well and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours.
- Rose stem cell culture filtrate or rose stem cell derived exosomes were added to HDP culture medium to 2%, 6% and 20%, respectively.
- the concentration of exosomes derived from rose stem cells was 1.0 ⁇ 10 8 particles / mL (2%), 3.0 ⁇ 10 8 particles / mL (6%), and 1.0 ⁇ 10 9 particles / mL (20%, respectively). ).
- Human dermal papilla cells were treated with rose stem cell culture filtrate or rose stem cell-derived exosomes and cultured, and the state of the cells was photographed under an optical microscope. As shown in Figure 5, in the experimental group treated with high concentration (6% and 20%) rose stem cell culture filtrate, it was confirmed that a significant number of human dermal papilla cells are in their original form and died. On the other hand, when the rose stem cell-derived exosome of the present invention, human dermal papilla cells were observed to be in a normal state with little death.
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Abstract
본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 피부재생, 피부탄력개선 및/또는 피부주름 개선 등의 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 노화가 일어나면, 피부탄력이 감소하고 피부주름이 증가하게 되는데, 피부탄력 감소 및 피부주름 형성은 콜라겐의 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현이 촉진되어 나타나는 것으로 알려져 있다.
또한, 노화의 진행이나 자외선 등에 의해 피부 세포에서는 염증성 사이토카인을 생성하는 효소인 COX-2의 증가로 인한 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)의 합성이 증가하고, 염증유발인자들의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응들로 인해서 MMP의 생합성이 증가하여 콜라겐 분해가 일어나고 피부탄력 감소와 피부주름 형성이 나타나게 된다. 특히, 일광 및 자외선이 피부에 직접 조사될 경우 자유라디칼을 많이 발생시키며, 이러한 자유라디칼에 의해 피부의 항산화 방어체계는 손상을 받게 되어 주름을 증가시키고, 피부를 이완시키는 등 피부노화를 가속화시킨다. 따라서, 피부주름 감소 및 탄력 유지를 위해서는 활성산소종 및 자유라디칼 생성 억제, 염증 반응 억제 및 상처로부터 피부재생을 촉진시켜 피부를 보호하여야 한다.
피부주름개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있다. 이에 따라 식물이나 천연물의 유효성분을 활용한 피부 항노화용 기능성 화장품이 최근 주목을 받고 있다. 그러나 식물 추출물을 유효성분으로 포함한 기능성 화장품은 피부에 도포한 후 용액이 증발하는 과정에서 이물감이 발생할 수 있고, 효과 지속시간이 짧은 문제가 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 줄기세포 및 암세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 중간엽 줄기세포 배양액, 섬유아세포 배양액 외에도 식물줄기세포 배양액으로부터도 분리될 수 있다.
그러나 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대한 연구는 아직 미진한 상태이다. 따라서 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요하다.
장미는 북반구의 한대, 아한대, 온대, 및 아열대 등 넓은 지역에서 다양한 품종이 재배되고 있고, 그 추출물은 향수나 화장품 등에 사용되고 있다. 그러나 현재까지의 기술은 장미의 꽃잎을 건조하여 열수 추출하거나 용매 추출하여 얻은 추출물을 향수, 방향제 등에 사용하고 있는 수준이다. 또한, 장미 캘러스 배양물에는 생장조절물질이나 캘러스 유도물질이 포함되어 있어 천연물질의 화장품 원료라고 하기 어렵고 배양물 내에 포함된 생장조절물질 등이 피부 트러블 등의 부작용을 일으킬 우려가 있다.
본 발명자들은 장미 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 피부재생, 피부탄력개선 및/또는 피부주름 개선 등에 효능이 있는 것을 확인하고, 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 개발하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "장미(Rosa spp.)"는 쌍떡잎 식물군, 장미목, 장미과 및 장미속에 속하는 식물을 총칭하며, 야생종과 개량을 가한 원예종을 모두 포함한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 식물세포로부터 세포외 공간으로 분비 또는 방출된 막 구조를 갖는 나노 사이즈의 소낭을 의미하며, 엑소좀-유사 베지클 또는 엑소좀-유사 파티클로도 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 탄력"은 외력에 의해 변형된 피부가 해당 외력이 제거되었을 때 쉽게 원형으로 복귀되는 특성을 의미한다. "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에 있어서, 상기 장미 줄기세포는 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스를 유도한 후 세포 배양하여 얻은 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들어, 크림 또는 로션일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부주름 개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부 미용 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부재생, 피부탄력개선, 피부주름 개선 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부재생, 피부탄력개선 및/또는 피부주름 개선일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물은 종래의 장미 여과물, 단순 추출물, 캘러스 배양액에 비해 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 장미 줄기세포 배양액 여과물 등에 비해 세포 독성이 적은 장점이 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 피부재생, 피부탄력개선 및/또는 피부주름 개선 등의 효과가 우수하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1A는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 장미 줄기세포 유래 엑소좀을 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이고, 도 1B는 도 1A를 확대한 사진이다.
도 2는 장미 줄기세포 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 형광 염색된 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵, 적색: 세모막).
도 4는 인체 피부 섬유아세포에 장미 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 증가하는 상대적인 콜라겐 양을 도시한 그래프이다.
도 5는 장미 줄기세포 배양액 여과물 또는 장미 줄기세포 유래 엑소좀으로 인체 모유두 세포를 처리하고 배양한 후 48시간째에 촬영한 광학현미경 사진이다. 도 5에는 20%의 장미 줄기세포 배양액 여과물을 처리한 경우 거의 모든 인체 모유두 세포들이 본래의 형태를 잃고 죽은 상태인 것을 확인할 수 있다.
도 6은 인체 모유두 세포를 장미 줄기세포 배양액 여과물로 처리하고 48시간 동안 배양한 경우의 세포생존율과 인체 모유두 세포를 장미 줄기세포 유래 엑소좀으로 처리하고 48시간 동안 배양한 경우의 세포생존율을 음성대조군(배양 배지만 사용한 실험군)에 대한 백분율로 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 장미 줄기세포의 제조
당업계에 알려진 식물 줄기세포 제조 및 배양 방법에 따라, 장미의 배(胚) 및/또는 잎 유래 캘러스를 유도하고, 유도된 장미 캘러스를 세포 배양한다. 그리고, 성장상태가 좋은 캘러스를 선택하고 대량으로 배양하여 장미 줄기세포 배양액을 준비한다.
실시예 2: 장미 줄기세포 유래의 엑소좀의 제조
실시예 1과 같은 방식으로 제조된 장미 줄기세포 배양액을 (주)바이오에프디엔씨(대한민국 인천광역시 소재)에서 입수하였다. 장미 줄기세포 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 분리하였다.
분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀의 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 확인하였다. 도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같이, 상기 분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 나노 사이즈의 소낭임을 확인할 수 있었다. 장미 줄기세포 유래 엑소좀의 크기와 농도는 NS300(Malvern Panalytical에서 구입)을 이용한 나노입자트래킹분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 확인하였다(도 2).
실시예 3: 장미 줄기세포 유래 엑소좀의 피부 섬유아세포 전달능의 확인
장미 줄기세포 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포(세포바이오에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 2에서 준비된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(시그마에서 구입) 형광 염료와 반응하였다. 반응 후 반응액을 MW3000(Thermo Fisher Scientific에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67)을 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MW3000 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 인체 피부 섬유아세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트 형광 염료(시그마에서 구입)를 사용하였고, 세포막을 염색하기 위하여 CellMask Orange 형광 염료를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 4: 콜라겐 생성 촉진 효과의 확인
우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 인체 피부 섬유아세포(세포바이오에서 구입)를 멀티웰 플레이트에 분주한 후 24시간 배양하고 무혈청 배지에서 추가로 48시간 배양하였다. 이후 실시예 2에서 준비된 장미 줄기세포 배양액 혹은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 무혈청 배지에 각각 20%, 6%, 2%가 되도록 희석한 후 인체 피부 섬유아세포에 처리하고 인체 피부 섬유아세포를 배양하였다. 이때 처리된 장미 줄기세포 엑소좀의 농도는 각각 1.0×109 입자(particles)/mL (20%), 3.0×108 입자/mL (6%), 및 1.0×108 입자/mL (2%)이 되도록 하였다. 이후, 배양액을 회수하여 원심분리한 후, 원심분리된 배양액을 준비하였다. 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트(Takara에서 구입)를 이용하여 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다. 세포 파쇄액의 총 단백질 양은 BCA 단백질 정량 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)로 측정하였다. 상대적인 콜라겐 양은 총 단백질 양으로 보정하였다. 콜라겐 양을 측정한 결과, 본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 증가시켰다(도 4). 반면, 여과된 배양액은 음성대조군과 비교하여 콜라겐 합성을 감소시켰다(도 4).
상기 결과에 따르면, 본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물은 기능성 화장품으로서 유용한 기능적 활성, 즉 콜라겐 합성을 증가시키는 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선을 위한 기능성 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 5: 세포 생존율에 대한 영향 확인
인체 모유두세포(human hair follicle dermal papilla cell (HDP); 세포바이오에서 구입)는 HDP 배양 배지(세포바이오에서 구입)에서 배양하였다. 웰 당 1.5×104 개의 HDP 세포를 접종한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 장미 줄기세포 배양액 여과물 또는 장미 줄기세포 유래 엑소좀을 HDP 배양 배지에 각각 2%, 6% 및 20%가 되도록 첨가하였다. 이때, 장미 줄기세포 유래 엑소좀의 농도는 각각 1.0×108 입자(particles)/mL (2%), 3.0×108 입자/mL (6%), 및 1.0×109 입자/mL (20%)이 되도록 하였다.
장미 줄기세포 배양액 여과물 또는 장미 줄기세포 유래 엑소좀으로 인체 모유두 세포를 처리하고 배양한 후 세포의 상태를 광학현미경으로 촬영하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 고농도(6% 및 20%)의 장미 줄기세포 배양액 여과물을 처리한 실험군에서는 상당 수의 인체 모유두 세포들이 본래의 형태를 잃고 죽은 상태인 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 본 발명의 장미 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 경우에는 인체 모유두 세포들이 거의 죽지 않고 정상적인 상태인 것으로 관찰되었다.
또한, 상기 관찰 결과를 정량적으로 평가하기 위해, 장미 줄기세포 배양액 여과물 혹은 장미 줄기세포 유래 엑소좀이 첨가된 배양 배지에서 HDP 세포를 48시간 동안 배양한 후 CCK-8 분석 키트(Dojindo에서 구입)를 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 세포 생존율 측정 결과, 장미 줄기세포 배양액 여과물을 처리한 경우에는 농도 의존적으로 세포 생존율이 떨어지는 반면에, 본 발명의 장미 줄기세포 유래 엑소좀 처리한 경우에는 세포 생존율의 변화가 없어 세포 생존율에 미치는 영향, 즉 세포 독성이 적은 것을 확인하였다(도 6).
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (9)
- 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,크림 또는 로션인, 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 장미 줄기세포는 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스를 유도한 후 세포 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
- 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부재생, 피부탄력개선 또는 피부주름개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
- 제4항에 있어서,(a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 미용방법.
- 제5항에 있어서,상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
- 제7항에 있어서,상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
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