WO2023008553A1 - 変異型コロナウイルスに対するニワトリ抗体 - Google Patents

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WO2023008553A1
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antibody
coronavirus
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康文 村上
弘匡 秋山
脩一郎 柏葉
洋子 岡部
英治 岡
聖之 福岡
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株式会社オーダーメードメディカルリサーチ
Ｄｄサプライ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to chicken antibodies against mutant coronaviruses and uses thereof.
  • SARS-CoV-2 The virus that causes COVID-19, is classified as a betacoronavirus and has a single-stranded RNA genome.
  • spike protein There is a protruding protein called spike protein on the surface of the virus particle, and this spike protein interacts with Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) expressed on the surface of human cells to transform the virus. Direct contact between particles and human cells is established (Non-Patent Document 1).
  • COVID-19 can cause severe respiratory distress, and although the global death toll exceeded 1.9 million by the end of 2020, there is still no curative medicine that can be called a silver bullet.
  • mutations have occurred in the spike protein of SARS-CoV-2, and mutations in the amino acid sequence of SARS-CoV-2 have been reported one after another, and it is expected to increase in the future. .
  • the present inventors have found a mutant coronavirus that can neutralize the binding of the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein of the mutant coronavirus to ACE2.
  • RBD receptor-binding domain
  • [1] A chicken antibody that binds to the spike protein of a mutant coronavirus.
  • the chicken antibody according to [1] above which is capable of neutralizing binding between the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein of the mutant coronavirus and angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • RBD receptor-binding domain
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • [3] The chicken antibody of [1] or [2] above, wherein the mutant coronavirus infects cells via ACE2.
  • the chicken antibody according to any one of [1] to [3] above which further binds to the wild-type coronavirus spike protein.
  • the chicken antibody according to any one of [1] to [4] above which is a polyclonal antibody.
  • a composition for treating or preventing coronavirus infection comprising the chicken antibody of any one of [1] to [5] above.
  • the composition according to [6] above, wherein the coronavirus infection is a disease or condition caused by infection with a coronavirus that infects cells via ACE2.
  • the disease or symptom is at least one selected from the group consisting of respiratory disease, fever, malaise, chills, pain, taste or smell disorder, rash, gastrointestinal symptom, speech disorder, cognitive disorder and cardiovascular symptom.
  • a reagent or kit comprising the chicken antibody according to any one of [1] to [5] above.
  • a method for treating or preventing coronavirus infection which comprises administering a therapeutically effective amount of the chicken antibody of any one of [1] to [5] above or a composition containing the same to a subject.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the reactivity of the antibody of the present invention to the receptor binding domains (RBDs) of various mutant forms of SARS-CoV-2 spike proteins.
  • FIG. 2 shows the results of binding inhibition tests between various mutant types of RBD and ACE2 using the antibodies of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of binding inhibition tests between various mutant types of RBD and ACE2 using the antibodies of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of binding inhibition tests between various mutant types of RBD and ACE2 using the antibodies of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of binding inhibition tests between various mutant types of RBD and ACE2 using the antibodies of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of a neutralization test of the antibodies of the present invention against pseudoviruses.
  • FIG. 2 shows the results of a neutralization test of the antibodies of the present invention against pseudoviruses.
  • FIG. 1 shows the results of a neutralization test of the antibodies of the present invention against pseudoviruses.
  • FIG. 2 shows the results of a neutralization test of the antibodies of the present invention against live viruses of various mutant SARS-CoV-2.
  • FIG. 2 shows the results of a neutralization test of the antibodies of the present invention against live viruses of various mutant SARS-CoV-2.
  • FIG. 3 shows the results of comparison tests between chicken antibodies and chicken plasma and plasma derived from other animals.
  • RBD Receptor binding domain of coronavirus spike protein
  • Antibodies of the invention bind to a mutant coronavirus spike protein, such as its receptor binding domain (RBD), and neutralize binding of the mutant coronavirus spike protein RBD to angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • RBD is a domain that exists in the spike protein of coronavirus (hereinafter also referred to as "S protein") and binds to ACE2 that exists in the cell membrane of human cells.
  • S protein spike protein of coronavirus
  • S protein the coronaviruses SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 can infect human cells by binding the RBD of their S proteins to ACE2.
  • ACE2 is mainly expressed in cells such as the lung, digestive system, heart, blood vessels, eyes, kidney, cerebral cortex, amygdala, brain stem, and medulla oblongata. Therefore, the present invention inhibits the infection of coronaviruses to the cells of these organs by neutralizing the binding between the RBD of the S protein of the coronavirus and ACE2 expressed in these organs, thereby preventing respiratory diseases and the like. can contribute to the treatment or prevention of various diseases and symptoms associated with coronavirus infection.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the coronavirus S protein in the present invention the nucleotide sequence and amino acid sequence of the wild-type SARS-CoV-2 S protein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the nucleotide sequence of the wild-type SARS-CoV-2 genome and the amino acid sequence of the S protein (SEQ ID NO: 2) are available in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /), it is registered with the following prescribed accession number (Accession No.).
  • Genome Sequence of SARS-CoV-2 NC_045512 SARS-CoV-2 S protein amino acid sequence: YP_009724390 That is, the wild-type SARS-CoV-2 S protein is a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • the nucleotide sequence encoding the wild-type SARS-CoV-2 S protein is disclosed on the web page showing the above-mentioned SARS-CoV-2 genome nucleotide sequence (NCBI accession number: NC_045512) in the NCBI database. ing.
  • the S protein of coronaviruses may mutate, but the antibodies of the present invention bind not only to wild-type coronaviruses, but also to spike proteins of mutant coronaviruses with various mutations. It can neutralize the binding of the RBD of the spike protein of type coronavirus to angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • the S protein of the mutant coronavirus in the present invention includes the following proteins (a) and (b).
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, (i) 1 to 10 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1) amino acid sequences deleted, (ii) 1 to 40 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, 1 to 36, 1 to 35, 1 to 34, 1 to 33, 1 to 32, 1 to 31, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 25, 1 to 24, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20, 1 to 19, 1 to 18, 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, amino acid sequences in which 1 to 3, 2, 1) amino acids are replaced
  • ACE2-binding activity can be determined by known methods such as immunoprecipitation, Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (e.g., using a polypeptide). ELISA, cell ELISA, etc.) and methods such as pull-down assay.
  • ACE2 binding activity means at least 10% or more, 20% or more, 30% or more, and 40% when the activity of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is taken as 100. It means having an activity of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more.
  • the S protein of the mutant coronavirus in the present invention includes a protein containing an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having activity to bind to ACE2.
  • Such proteins include about 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Those containing an amino acid sequence with a sequence identity of 10% or more and having activity to bind to ACE2 are also included.
  • homology searches such as FASTA, BLAST, and PSI-BLAST can be used on internet homology search sites such as the DNA Data Bank of Japan (DDBJ). You can also search using BLAST at the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • a mutagenesis kit using a site-directed mutagenesis method such as the Kunkel method or the gapped duplex method, such as QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TakaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio) etc.
  • methods such as site-directed mutagenesis described in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and the like can be used.
  • overlap extension PCR R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367
  • the antibodies of the present invention can bind to the S protein of mutant coronaviruses having various mutations and neutralize the binding of the RBD of the S protein of the mutant coronavirus to ACE2. Therefore, the S protein of the mutant coronavirus in the present invention is not limited.
  • the S protein of the mutant coronavirus in the present invention includes, for example, counting from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a leucine (L) to phenylalanine (F) substitution at the fifth amino acid (L5F); a serine (S) to isoleucine (I) substitution at the 13th amino acid (S13I), substitution of threonine (T) to arginine (R) or isoleucine (I) at amino acid 19 (T19R or T19I); a leucine (L) to serine (S) substitution at the 24th amino acid (L24S), deletion of the 24th amino acid, leucine (L); deletion of the 25th amino acid, proline (P), deletion of proline (P), the 26th amino acid; deletion of the 27th amino acid, alanine (A); an alanine (A) to serine (S) substitution at the 27th amino acid (A27S), an alanine (A) to
  • the S protein of the mutant coronavirus in the present invention includes, for example, counting from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a glycine (G) to aspartic acid (D) substitution at amino acid 339 (G339D); an arginine (R) to lysine (K) substitution at amino acid position 346 (R346K); substitution of serine (S) to phenylalanine (F) or leucine (L) at amino acid 371 (S371F, S371L); a serine (S) to proline (P) substitution at amino acid 373 (S373P), a serine (S) to phenylalanine (F) substitution at amino acid 375 (S375F); an aspartic acid (D) to asparagine (N) substitution at amino acid 405 (D405N); substitution of lysine (K) to asparagine (N) or threonine (T) at amino acid 417 (K4
  • Mutant coronaviruses in the present invention include, for example, B.1.1.7 lineage mutant (alpha strain), B.1.351 lineage mutant (beta strain), P.1 lineage mutant (gamma strain), B.1.617.2 strain, mutant strain of AY.1 or AY.2 strain (delta strain), mutant strain of B.1.427/B.1.429 strain (epsilon strain), mutant strain of P.2 strain (zeta strain) ), B.1.525 lineage mutant (eta strain), P.3 lineage mutant (theta strain), B.1.526 lineage mutant (iota strain), B.1.617.1 lineage mutant (kappa strain ), C.37 strain mutant (lambda strain), B.1.621 strain mutant (mu strain), B.1.1.529 strain mutant (omikron strain).
  • Substrains of the B.1.1.529 strain include mutants of the BA.1, BA.2, BA.3, BA.4, and BA.5 strains.
  • the notation of the above lineage follows the PANGO lineage, and the name of the strain is based on the WHO designation.
  • the mutant strain (alpha strain) of the B.1.1.7 lineage contains at least N501Y as the main mutation
  • the mutant strain (beta strain) of the B.1.351 lineage contains at least K417N, E484K and N501Y as the main mutations
  • Mutant strains of the P.1 strain (gamma strain) contain at least K417T, E484K and N501Y as major mutations
  • mutant strains of the B.1.617.2 strain, AY.1 strain or AY.2 strain (delta strain) contains at least L452R and T478K as the main mutations
  • the B.1.427/B.1.429 strain Epsilon strain
  • the P.2 strain (Zeta strain) has , contains at least E484K as a major mutation
  • the B.1.525 strain (Eta strain) contains at least E484K as a major mutation
  • the P.3 strain has at least E48
  • the B.1.526 strain (Iota strain) contains at least E484K as the main mutation
  • the B.1.617.1 strain (Kappa strain) has at least L452R and E484Q as the main mutations
  • the C.37 lineage mutant (lambda strain) contains at least L452Q and F490S as the main mutations
  • the B.1.621 lineage mutant (mu strain) has at least R346K, E484K and N501Y as the main mutations.
  • B.1.1.529 strain (Omicron strain) has at least G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, Including G496S, Q498R, N501Y and Y505H.
  • a variant of lineage BA.1, a substrain of lineage B.1.1.529 has at least G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R as the major mutations.
  • N501Y and Y505H and variants of the BA.2 lineage have at least G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, N501Y as major mutations. and Y505H.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the RBD in the present invention are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. That is, in the present invention, the RBD of wild-type SARS-CoV-2 is a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4.
  • spike proteins of mutant coronaviruses include spike proteins having mutations in the RBD.
  • the RBD of the S protein of the mutant coronavirus in the present invention includes the following proteins (a) and (b).
  • a protein comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:4" includes a protein consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:4.
  • Examples of “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4" include: (i) 1 to 10 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (for example, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1) amino acid sequences deleted, (ii) 1 to 20 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (for example, 1 to 19, 1 to 18, 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, amino acid sequences in which 1 to 3, 2, 1) amino acids are replaced with other amino acids; (iii) 1 to 10 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 4 (for example, 1 to 9, 1
  • ACE2-binding activity in the present invention, the presence or absence of "ACE2-binding activity" can be determined by known methods such as immunoprecipitation, Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (e.g., using a polypeptide). ELISA, cell ELISA, etc.) and methods such as pull-down assay.
  • ACE2-binding activity means at least 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more when the activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is defined as 100. % or higher, 50% or higher, 60% or higher, 70% or higher, 80% or higher, preferably 90% or higher.
  • the RBD of the S protein of the mutant coronavirus in the present invention contains an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a polypeptide having ACE2-binding activity.
  • polypeptides include about 80% or more, about 81% or more, about 82% or more, about 83% or more, about 84% or more, 85% or more, about 86% or higher, about 87% or higher, about 88% or higher, about 89% or higher, about 90% or higher, about 91% or higher, about 92% or higher, about 93% or higher, about 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher , comprising an amino acid sequence with a sequence identity of 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and having activity to bind to ACE2.
  • homology searches such as FASTA, BLAST, and PSI-BLAST can be used on internet homology search sites such as the DNA Data Bank of Japan (DDBJ). You can also search using BLAST at the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the RBD of the S protein of the mutant coronavirus in the present invention is not limited. Glycine (G), amino acid 339, 346 amino acid arginine (R), Serine (S), amino acid 371, Serine (S), amino acid 373, Serine (S), amino acid 375, Threonine (T), the 376th amino acid, Aspartic acid (D), the 405th amino acid Arginine (R), the 408th amino acid, Lysine (K), the 417th amino acid, Asparagine (N), amino acid 439, Asparagine (N), amino acid 440, Glycine (G), amino acid 446, Leucine (L), amino acid 452, Tyrosine (Y), amino acid 453, Serine (S), amino acid 477, Threonine (T), amino acid 478, 484 amino acid glutamic acid (E), 486 amino acid phenylalanine (F), 490 amino acid phenylalanine (F), 493 amino acid glutamine (Q), Glycine (
  • the RBD of the mutant coronavirus S protein in the present invention is not limited. a glycine (G) to aspartic acid (D) substitution at amino acid 339 (G339D), an arginine (R) to lysine (K) substitution at amino acid position 346 (R346K); substitution of serine (S) to phenylalanine (F) or leucine (L) at amino acid 371 (S371F, S371L); a serine (S) to proline (P) substitution at amino acid 373 (S373P), a serine (S) to phenylalanine (F) substitution at amino acid 375 (S375F), a threonine (T) to alanine (A) substitution at amino acid 376 (T376A); an aspartic acid (D) to asparagine (N) substitution at amino acid 405 (D405N); an arginine (R) to serine (S) substitution at amino acid position 408 (R)
  • the "corresponding amino acid” corresponds to an amino acid at a specific position counted from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of the RBD of the S protein of the wild-type or mutant coronavirus.
  • Amino acid For example, in the case of wild-type RBD, the 501st amino acid asparagine (N) counting from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the 183rd amino acid counting from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. corresponds to the amino acid asparagine (N). The same is true for mutant RBD.
  • the position and amino acid type of mutation in RBD are indicated by the position and amino acid type counted from the N-terminus of the corresponding amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • the mutation in the RBD is denoted as N501Y.
  • the term "amino acid corresponding to" can be omitted when describing a mutated or mutated amino acid.
  • the chicken antibody of the present invention binds to at least one or all of RBDs selected from the group consisting of the following (i) to (xii) RBDs or S proteins containing the same or S proteins containing the same can do: (i) an RBD containing at least N501Y as a major mutation or an S protein containing this; (ii) an RBD containing at least K417N, E484K and N501Y as major mutations or an S protein containing the same; (iii) RBD or S protein containing at least K417T, E484K and N501Y as major mutations; (iv) an RBD containing at least L452R and T478K as major mutations or an S protein containing this; (v) an RBD containing at least L452R as a major mutation or an S protein containing this; (vi) an RBD containing at least E484K as a major mutation or an S protein containing this; (vii) an RBD containing at least E48
  • the method of introducing mutations into the DNA encoding the proteins in order to prepare the proteins having the above mutations is as described above.
  • the ACE2 to which the RBD of the S protein of the mutant coronavirus in the present invention binds may be derived from any mammal.
  • mammals include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, cats, dogs, goats, monkeys, and humans, preferably mice, rats, cats, dogs, and humans.
  • these ACE2 base and amino acid sequences the base and amino acid sequences of human ACE2 are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively, but the base and amino acid sequences of ACE2 are not limited to these.
  • the base sequence and amino acid sequence of human ACE2 are in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and have the following accession No. registered by
  • the region to which the antibody of the present invention binds can be determined by a known method, for example, preparing a plurality of full-length or partial polypeptides of the RBD, It can be identified by examining which RBD polypeptide the antibody of the invention binds to. Moreover, by using a polypeptide with a three-dimensional structure, an epitope with a three-dimensional (steric) structure can also be identified.
  • a polypeptide having a three-dimensional structure can be produced, for example, by expressing RBD using mammalian cells.
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds and the region containing the epitope are not limited as long as the antibody of the present invention can neutralize the binding between the RBD of the coronavirus S protein and ACE2.
  • a person skilled in the art can understand that a subject antibody can neutralize the binding between the RBD of the coronavirus S protein and ACE2 without specifying the epitope of the subject antibody. you can check if it is possible. That is, according to the description herein, a person skilled in the art can use a subject's It is not necessary to specify the epitope of the antibody.
  • the antibodies of the invention are chicken antibodies that bind to the spike (S) protein of mutant coronaviruses.
  • the chicken antibody that binds to the S protein of the mutant coronavirus of the present invention preferably includes a chicken antibody that binds to the RBD of the S protein of the mutant coronavirus of the present invention.
  • Chicken antibodies include IgY, IgM and IgA, and among these, IgY, which is functionally equivalent to mammalian IgG, is selectively transferred to egg yolk. Therefore, chicken antibodies can be easily purified in large amounts from egg yolk, and can be provided at low cost. In addition, chicken antibodies purified from food eggs are safe for intranasal, buccal, and oral administration, and can be used for therapeutic or preventive methods using nebulizers, sprays, and the like. In addition, IgY has advantages such as (i) high safety because it does not activate mammalian complement, (ii) not binding to mammalian Fc receptors, and (iii) not cross-reacting with mammalian IgG. .
  • chicken antibodies since chickens can recognize biomolecules that are highly conserved among mammals as foreign substances, chicken antibodies have an advantage in reactivity with such biomolecules compared to mammalian-derived antibodies. is. Furthermore, unlike mouse antibodies or human antibodies, the chicken antibodies of the present invention show no reduction in binding-inhibitory activity against omicron-type mutants. That is, the chicken antibody of the present invention, compared to the antibody obtained by immunizing other species, is capable of Has neutralizing activity (can be maintained).
  • Antibodies of the present invention may be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • "bind to spike (S) protein” or “bind to RBD of spike (S) protein” means that hydrogen bond, hydrophobic interaction, electrostatic force, van der Waals force, etc. It means forming a reversible non-covalent bond with the S protein or the RBD of the S protein.
  • “bind” includes “specifically bind”.
  • “specifically binds” means recognizing an epitope in a target protein or target polypeptide and selectively or preferentially binding to that epitope compared to a protein or polypeptide that does not have that epitope.
  • Antibodies of the invention also include antigen-binding fragments of monoclonal antibodies.
  • the "antigen-binding fragment” includes, for example, scFv (single chain Fv), sc(Fv) 2 , Fab, Fab', diabody (dsFv), F(ab') 2 , multispecific Examples include, but are not limited to, antibodies and the like.
  • the above antibody-binding fragments can be obtained by known methods such as genetic engineering techniques, papain digestion, pepsin digestion, and the like.
  • the antibody of the invention is an isolated antibody.
  • the antibody of the present invention can neutralize the binding between the RBD of the mutant coronavirus S protein and ACE2.
  • the antibodies of the present invention can neutralize (have neutralizing activity against) coronaviruses.
  • a coronavirus means a coronavirus that infects cells via ACE2.
  • Such coronaviruses include, for example, SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2, with SARS-CoV-2 being preferred. These coronaviruses infect cells by binding the RBD of their S protein to ACE2.
  • coronavirus includes both wild-type and mutant types.
  • neutralizing means inhibiting the interaction (for example, binding) between the RBD of the coronavirus S protein and ACE2, or inhibiting the activity of the coronavirus S protein.
  • neutralize coronavirus means suppressing or inhibiting the cell-binding activity or cell-invasion activity of coronavirus. Whether the antibody to be tested inhibits the interaction between the RBD of the coronavirus S protein and ACE2 can be determined, for example, by using a His-tagged RBD that binds to ACE2 with a fluorescent-labeled antibody that can bind to the His-tag (fluorescent-labeled antibody His tag antibody) can be used for detection.
  • the reaction product is added to ACE2-expressing cells.
  • the antibody to be tested inhibits the binding of the His-tagged RBD to ACE2 on ACE2-expressing cells by binding to the His-tagged RBD, fluorescently-labeled anti-His bound to the His-tagged RBD No fluorescence signal of the tag antibody is detected.
  • the His-tagged RBD binds to ACE2 on ACE2-expressing cells. A fluorescence signal of the bound fluorescently labeled anti-His tag antibody is detected.
  • whether the subject antibody inhibits the interaction of the RBD of the coronavirus S protein with ACE2 can be determined, for example, by inhibiting the RBD bound to ACE2, as described in Example 3 herein. , by detecting with a mouse anti-SARS-CoV-2 Spike antibody and a labeled secondary antibody (mouse anti-IgG-Fc antibody) that binds to this antibody. Specifically, after the subject antibody and RBD are allowed to react, the reaction product is added to ACE2-expressing cells.
  • the antibody under test inhibits the binding of the RBD to ACE2 on ACE2-expressing cells by binding to the RBD, the fluorescent No fluorescent signal of the labeled secondary antibody is detected.
  • the antibody to be tested does not inhibit the binding of RBD to ACE2 on ACE2-expressing cells, since RBD binds to ACE2 on ACE2-expressing cells, mouse anti-SARS-CoV-2 Spike antibody to the RBD The fluorescent signal of the fluorescently labeled secondary antibody bound via is detected.
  • the subject antibody does not detect the fluorescence signal of the RBD, it can be determined that the subject antibody inhibits the interaction between the RBD and ACE2.
  • whether or not the antibody to be tested can neutralize the coronavirus can be determined, for example, by mixing the antibody to be tested and the coronavirus in a predetermined ratio, bringing them into contact with cultured cells, and changing the morphology of the cultured cells.
  • test antibody has neutralizing activity against coronavirus at the antibody concentration used in the test (eg, Example 7).
  • the immunogen for producing the antibody of the present invention or the antigen used for the reactivity test of the antibody of the present invention is not limited, and examples thereof include the full-length S protein of coronavirus or its Partial polypeptides can be used.
  • Partial polypeptides of the coronavirus S protein include, but are not limited to, for example, polypeptides containing the RBD of the coronavirus S protein.
  • polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein for example, the polypeptide containing the RBD described in "2.” above can be used.
  • a polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein can be obtained, for example, by expressing it in mammalian cells (HEK293 cells, CHO cells) from a polynucleotide encoding a polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein.
  • immunogens for producing the antibodies of the present invention or antigens used for reactivity testing of the antibodies of the present invention include polypeptides containing the RBD of the coronavirus S protein expressed in mammalian cells.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein to be introduced into the mammal can be appropriately codon-optimized to be suitable for expression in mammalian cells.
  • a polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein can be synthesized by a person skilled in the art by specifying the amino acid sequence using a known protein synthesis method such as a solid phase method or a commercially available protein synthesizer. can also The synthesized peptide can be bound to a carrier protein such as Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) or Thyroglobulin and used as an immunogen.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • Thyroglobulin used as an immunogen.
  • the method for producing an immunogen for producing the antibody of the present invention is not limited to these methods.
  • the RBD of the coronavirus S protein includes, for example, the RBD of the S protein of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2, and the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 is preferred.
  • the mutant polypeptide expresses the nucleic acid encoding the polypeptide in the mammalian cells, It can be obtained by synthesizing the polypeptide by the above method. Mutant polypeptides thus obtained can be used as antigens/immunogens.
  • mutant polypeptides as immunogens for obtaining antibodies that bind to spike proteins of mutant coronaviruses, and wild-type polypeptides may be used.
  • egg-type chickens such as Julia Light, Boris Brown, and White Leghorn can be used. Immunization is performed by administering the antigen polypeptide prepared in (1) above together with an adjuvant to chickens.
  • Adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), aluminum hydroxide adjuvant and the like. Immunization is mainly performed by injecting intramuscularly, intravenously, subcutaneously, or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and is several days to several weeks (eg, 1 to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks) or several months (eg, about 1 to 6 months, preferably about 1 , 2-, 3-, or 4-month intervals), and the immunizations are performed 2 to 10 times in total, preferably 2 to 5 times in total (for example, 4 times).
  • a person skilled in the art can set the interval and number of immunizations in consideration of the obtained antibody titer.
  • a person skilled in the art can appropriately set the interval of egg collection according to the experimental plan.
  • ELISA can be used to measure the antibody titer.
  • the concentration of the purified chicken antibody is determined by measuring the absorbance at a wavelength of 280 nm using a spectrophotometer, and calculating the concentration based on the molar extinction coefficient (1.33) of the chicken antibody and the Lambert-Beer law.
  • concentration based on the molar extinction coefficient (1.33) of the chicken antibody and the Lambert-Beer law.
  • the present invention provides a method for producing a chicken polyclonal antibody, comprising the following steps (a) and (b). (a) immunizing one or more chickens with a polypeptide comprising the RBD of the coronavirus S protein, and (b) purifying chicken polyclonal antibodies from eggs laid by one or more chickens immunized in step (a);
  • the number of chickens to be immunized can be, for example, 1 or more, 2 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more, and, for example, 1000 or less, 900 800 or less, 500 or less, 400 or less, 300 or less, 200 or less, 100 or less, 50 or less, 10 or less, 2 or less, but are not limited to these.
  • step (b) further comprises randomly selecting a plurality of eggs from the eggs laid by the immunized one or more chickens, and purifying chicken polyclonal antibodies from the selected eggs. be able to.
  • step (b) above can include mixing egg yolks from a plurality of selected eggs and purifying chicken polyclonal antibodies from the mixed egg yolks.
  • the number of eggs selected is not limited, and may be, for example, 1 or more, 2 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more, and 200 or less, 150 or less, 100 or less. It may be 1 or less, 50 or less, 10 or less, 2 or less, but is not limited to these.
  • polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein to be immunized in step (a) above, the polypeptide containing the RBD described in "2.” above can be used.
  • polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein to be immunized in step (a) above, a polypeptide containing the RBD of the coronavirus S protein expressed in mammalian cells can be used.
  • Chicken monoclonal antibodies can be prepared by known methods such as cell fusion method (S. Nishinaka et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989;89(4):416-9), phage display method ( JP-A-2001-238676).
  • One of the embodiments of the antibody of the present invention is a genetically engineered antibody.
  • examples of recombinant antibodies include, but are not limited to, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • a chimeric antibody refers to an antibody produced by linking immunoglobulin gene fragments of a different animal.
  • chimeric antibodies include, for example, human chimeric antibodies, but the types of animals from which the variable regions and constant regions of chimeric antibodies are derived are not limited.
  • Human chimeric antibodies include, for example, antibodies in which the variable region of a chicken antibody is linked (joined) to the constant region of a human-derived antibody.
  • a chimeric antibody can be easily constructed by gene recombination technology.
  • CDR transplantation when producing a humanized antibody, a technique called so-called CDR grafting (CDR transplantation) can be adopted.
  • CDR grafting involves grafting the complementarity determining regions (CDRs) from the variable region of a chicken antibody to a human variable region, with the framework regions (FRs) of human origin and the CDRs of chicken origin. It is a method of making a constructed variable region. These humanized reshaped human variable regions are then ligated to human constant regions.
  • Fully human antibodies can be produced, for example, using mammals capable of producing human antibodies according to known techniques (WO96/9634096, WO98/24893, etc.).
  • chimeric antibodies and humanized antibodies can be produced from hybridomas or DNA or RNA extracted from such hybridomas as raw materials according to the above-described known methods.
  • a protein fused with an antibody of the present invention can be produced by fusing an antibody variable region with another protein using a known genetic recombination method.
  • the fusion protein can be produced by cross-linking a monoclonal antibody and another protein using a cross-linker.
  • the antigen-binding fragment of the antibody of the present invention binds to the S protein of the mutant coronavirus.
  • An antigen-binding fragment of an antibody refers to a polypeptide comprising a portion of the antigen-binding portion of the antibody of the invention.
  • antigen-binding fragments include scFv (single chain Fv), sc(Fv) 2 , Fab, Fab', diabody (dsFv), F(ab') 2 , multispecific antibodies and the like. , but not limited to.
  • the above antibody-binding fragments can be obtained by known methods such as genetic engineering techniques, papain digestion, pepsin digestion, and the like.
  • Binding Affinity The affinity of an antibody for an antigen can generally be expressed by the equilibrium dissociation constant (KD), with lower values of KD indicating higher affinity of the antibody.
  • KD equilibrium dissociation constant
  • Antibody affinity can be measured using known instruments and methods (eg, Biacore®-3000 (GE Healthcare), ProteON XPR36 (Bio-Rad), etc.).
  • composition of the present invention is a composition for treating or preventing coronavirus infection, containing the antibody described in "3. Antibody of the present invention” as an active ingredient.
  • the present invention also includes pharmaceutical compositions for treating or preventing coronavirus infections, which contain the antibodies described in "3. Antibodies of the present invention” as active ingredients.
  • a coronavirus infection that is the target of the composition of the present invention means a disease or condition caused by infection with a coronavirus.
  • Such coronavirus infections include, for example, diseases or conditions caused by infection with coronaviruses that infect cells via ACE2.
  • coronavirus that infects cells via ACE2 is not limited, and includes, for example, SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2, preferably SARS-CoV-2.
  • Examples of "diseases or symptoms caused by infection with a coronavirus that infects cells via ACE2" include organs or tissues in which ACE2 is mainly expressed, such as lungs, digestive system, heart, blood vessels, eyes, and kidneys. , cerebral cortex, amygdala, brain stem, medulla oblongata, etc., diseases or symptoms based on immune response, and the like.
  • Such diseases or symptoms include, for example, respiratory diseases, fever, malaise, chills, pain, taste or smell disorders, rashes, gastrointestinal symptoms, speech disorders, cognitive disorders, cardiovascular symptoms, It is not limited to these.
  • Compositions containing the antibodies of the present invention are effective in treating or preventing various diseases or symptoms associated with coronavirus infection by inhibiting coronavirus infection that infects cells via ACE2.
  • the term “treatment” refers to contacting (e.g., administering) the antibody of the present invention or a composition containing the same to a subject after the onset of the disease, thereby reducing the symptoms of the disease compared to the case of no contact. Means alleviation, not necessarily total suppression of disease symptoms.
  • "onset of disease” includes not only symptoms of the disease appearing in the body, but also a positive result in a test for coronavirus infection (such as a PCR test) even if no symptoms appear.
  • “treatment” of coronavirus infection includes suppression or inhibition of aggravation of coronavirus infection.
  • prevention means suppression or inhibition of the onset of coronavirus infection, suppression or inhibition of aggravation, but does not necessarily mean complete suppression of the onset.
  • prevention means contacting (e.g., administering) the composition, etc. of the present invention to a subject before the onset of the disease, thereby reducing symptoms after the onset of the disease compared to the case of no contact. For example.
  • composition of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to an antibody that binds to ACE2.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” means any carrier suitable for the composition (liposomes, lipid vesicles, micelles, etc.), diluents, excipients, wetting agents, buffers, suspending agents, lubricants, adjuvants , emulsifiers, disintegrants, absorbents, preservatives, surfactants, colorants, flavorants or sweeteners.
  • Antibodies and compositions of the present invention can be sprays, freeze-dried products, tablets, hard capsules, soft capsules, granules, powders, pills, syrups, suppositories, poultices, ointments, creams, and eye drops. It can take dosage forms such as drugs and injections.
  • a nebulizer, spray, etc. can be used to administer (spray) the antibody and composition of the present invention.
  • the antibody of the present invention can inhibit coronavirus infection of nasal and oral mucosa.
  • Liquid preparations such as injections may be in the form of powders (for example, freeze-dried powders) for preparation before use, which are dissolved in physiological saline or the like before use.
  • Antibodies and compositions of the present invention can be applied (e.g., carried) to products (protective products such as masks, filters, sprays, etc.) and devices used for the prevention of coronavirus infections, in order to prevent coronavirus infections. )be able to.
  • the antibodies and compositions of the present invention can be administered locally or systemically by any means known to those skilled in the art.
  • the administration route of the composition of the present invention can be either oral administration or parenteral administration, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intranasal administration, intraoral administration, intramuscular administration, or the like.
  • the compositions of the invention can be administered in dosage forms suitable for these administration routes.
  • the dosage of the antibody and composition of the present invention varies depending on factors such as the subject's age, body weight, health condition, sex, symptoms, animal species, administration route, administration frequency, and dosage form. can be set by those skilled in the art.
  • the dosage of the antibody of the present invention for treating coronavirus infection is, but is not limited to, for example, 0.1 mg to 100 mg/day, preferably 0.1 mg to 15 mg/day, per kg body weight of the subject. .
  • As for the administration frequency it can be administered 1 to 5 times a day.
  • the timing of administration of the antibody and composition of the present invention can be appropriately determined according to symptoms, and multiple doses can be administered simultaneously or separately at intervals.
  • the composition of the present invention may be administered to a subject before the onset of the disease or after the onset of the disease.
  • composition of the present invention can be administered to mammals as subjects.
  • Mammals include, for example, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, goats, pigs, sheep, cows, horses, monkeys, humans and the like.
  • a chicken antibody that binds to the S protein of a mutant coronavirus or a composition containing the same is administered to a subject to treat or prevent coronavirus infection.
  • the present invention provides a method of treating or preventing coronavirus infection comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of an antibody of the present invention or a composition comprising same.
  • a therapeutically effective amount of the antibody of the present invention or a composition comprising the same varies depending on factors such as subject's age, body weight, health condition, sex, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • subject includes a subject in need of treatment or prevention of coronavirus infection.
  • mammals to be treated or prevented as “subjects” are as described above.
  • Treatment in the method for treating or preventing coronavirus infection of the present invention are as described above.
  • the dosage forms, administration routes, doses, administration periods, etc. of the antibody of the present invention or the composition containing it are also described above.
  • the present invention provides an inhibitor of the binding between the RBD of the S protein of the mutant coronavirus and ACE2, or the S protein of the mutant coronavirus, which comprises the antibody described in "3. Antibodies of the present invention" as an active ingredient.
  • Compositions are provided for inhibiting the binding of protein RBDs to ACE2.
  • the inhibitor of the present invention can be used as a test reagent or for the treatment or prevention of mammals. can be appropriately selected according to the description. However, the inhibitor of the present invention may contain only the antibody of the present invention.
  • Antibodies of the present invention can be used in methods of treating or preventing coronavirus infections, or in the manufacture of medicaments for treating or preventing coronavirus infections.
  • the present invention provides antibodies of the present invention for use in methods of treating or preventing coronavirus infection.
  • the invention also provides an antibody of the invention for use in the manufacture of a medicament for treating or preventing coronavirus infection.
  • the present invention provides the antibody of the present invention for use in the production of an inhibitor of binding between S protein of mutant coronavirus and ACE2.
  • compositions of the invention can be used for co-administration with at least one other therapeutic agent.
  • Other therapeutic agents for use in the present invention include, for example, remdesivir, dexamethasone, favipiravir, nafamostat, camostat, ivermectin, tricizumab, baricitinib, and the like.
  • compositions of the present invention are expected to provide even better effects than using each agent alone.
  • the excellent effect includes the effect of reducing side effects more than before while maintaining the therapeutic effect.
  • “combination” means administering the composition of the present invention and at least one of the other therapeutic agents simultaneously or separately.
  • Simultaneously means administered at the same timing in one administration schedule, and the timing of administration need not be exactly the same.
  • “Separately” means administered at different times in one administration schedule.
  • the dosage form, administration route, and administration target of the composition and other therapeutic agents used in the combination therapy of the present invention are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the description in "4. Compositions" above.
  • the dosage forms or dosages of drugs to be used in combination may be different from each other, and can be appropriately adjusted depending on the combination to be used in combination.
  • doses may be reduced accordingly. Therefore, in combination with the compositions of the present invention and other therapeutic agents: (i) an effective amount of a composition of the invention and an effective amount of another therapeutic agent; (ii) an effective amount of the composition of the invention and an ineffective amount of the other therapeutic agent; (iii) an ineffective amount of a composition of the invention and an effective amount of another therapeutic agent; and (iv) Combinations of ineffective amounts of the compositions of the invention and ineffective amounts of other therapeutic agents can be employed. Even if one or both of the composition and the other therapeutic agent are used in an ineffective amount, if the combined use can exhibit a pharmacological effect, the combined administration can be performed in such a manner.
  • Reagents, Kits Antibodies of the invention can be included in reagents or kits.
  • the invention provides reagents and kits comprising the antibodies of the invention.
  • the reagents and kits of the present invention can be used, for example, as test reagents or kits for coronaviruses.
  • the antibody of the present invention can be used, for example, after making it easy to handle by a method such as freezing, or can be mixed with known pharmaceutically acceptable additives such as excipients, extenders, binders, and lubricants.
  • kit of the present invention can also contain buffers, enzyme solutions, secondary antibodies, diluent solutions, instructions for use, and the like.
  • SARS-CoV-2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 expressed in mammalian cells (HEK293 cells or CHO cells) was used as an immunogen.
  • a spike protein RBD polypeptide (hereinafter, “RBD polypeptide”) was used.
  • the polynucleotide encoding the RBD polypeptide (SEQ ID NO: 7) was codon-optimized for expression in mammalian cells.
  • Polyethylene glycol 6000 was added to a final concentration of 12% and dissolved by stirring well.
  • the chicken antibody was precipitated by centrifugation, and the precipitate was washed with ice-cold 50% ethanol to remove residual polyethylene glycol. After washing, the chicken antibody was dissolved in PBS(-).
  • the concentration of the purified chicken antibody was determined by measuring the absorbance at a wavelength of 280 nm using a spectrophotometer, and calculating the concentration based on the molar extinction coefficient (1.33) of the chicken antibody and the Lambert-Beer law. As a result, a chicken polyclonal antibody could be produced.
  • mutant RBD polypeptides were alpha (having N501Y) (SEQ ID NO: 10), beta (having K417N, E484K and N501Y) (sequence No. 12), gamma (theta) (having E484K, N501Y) (SEQ ID NO: 14), epsilon (having L452R) (SEQ ID NO: 16), kappa (having L452R, E484Q) (SEQ ID NO: 18) , and eta-type (with E484K) (SEQ ID NO: 20) RBD polypeptides were used.
  • a wild-type (WT) RBD polypeptide (SEQ ID NO: 8) was also used.
  • a mutant RBD polypeptide encodes an RBD polypeptide introduced with various mutations based on the overlap extension PCR method (R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367). It was prepared by making each DNA and expressing it in mammalian cells (HEK293 cells or CHO cells). A wild-type (WT) RBD polypeptide was also prepared in a similar manner.
  • the nucleotide sequences of polynucleotides encoding wild-type, alpha-type, beta-type, gamma-type (theta-type), epsilon-type, kappa-type and eta-type RBD polypeptides are SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19.
  • Each mutant RBD polypeptide was diluted with carbonate buffer to 1 ⁇ g/mL, 100 ⁇ L was added to each well of an ELISA plate (MaxiSorp, Nunc), and allowed to stand at 37° C. for 1 hour to immobilize the antigen.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the reactivity between the chicken antibody of the present invention and each mutant RBD polypeptide.
  • Binding inhibition test between mutant RBD polypeptide and human ACE2 the inhibitory (neutralizing) activity of the chicken antibody of the present invention against binding between mutant RBD polypeptide and human ACE2 was tested.
  • the mutant RBD polypeptide the mutant RBD polypeptide used in Example 2, that is, the alpha, beta, gamma (theta), epsilon, kappa, and eta RBD polypeptides were used. .
  • a wild-type (WT) RBD polypeptide was also used.
  • the binding inhibition test in this example was performed as follows.
  • the chicken antibody solution in the 96-well plate was removed by decantation, and each well was washed twice with 250 ⁇ L of D-PBS(-).
  • 30 ⁇ L of S28 antibody solution in which mouse anti-SARS-CoV-2 Spike antibody (clone S28) was diluted with blocking buffer to 1 ⁇ g/mL, was added to each well and allowed to stand at 4° C. for 1 hour.
  • the S28 antibody solution was removed by decantation, and each well was washed twice with 250 ⁇ L of D-PBS(-). 50 ⁇ L of 10% formalin solution was added to each well of a 96-well plate, and the plate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes to immobilize the cells.
  • the 10% formalin solution was removed by decantation, and each well was washed twice with 250 ⁇ L of washing buffer (D-PBS(-) containing 0.05% Tween20).
  • 50 ⁇ L of a 3% hydrogen peroxide solution was added to each well of a 96-well plate and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to deactivate endogenous peroxidase.
  • the 3% hydrogen peroxide solution was removed by decantation, and each well was washed three times with 250 ⁇ L of washing buffer (D-PBS(-) containing 0.05% Tween20).
  • Absorbance at 490 nm was measured using an absorptiometer to detect the RBD polypeptide of the SARS-CoV-2 spike protein bound to ACE2 on the cell membrane.
  • the rate of inhibition by the antibody of the present invention on the binding between the mutant RBD polypeptide and human ACE2 was calculated.
  • wells to which each RBD polypeptide alone was added were used as positive controls, and wells to which the antibody of the present invention alone was added were used as negative controls.
  • FIG. 2 shows the results of the binding inhibition test between the mutant RBD polypeptide and human ACE2 using a chicken antibody.
  • No RBD polypeptide bound to ACE2 was detected at an antibody concentration of 125 ⁇ g/ml using either of the two lots of chicken antibody, #I2 and #I22. This result demonstrated 100% inhibitory activity of the chicken antibody of the present invention against the binding of all mutant RBD polypeptides to ACE2.
  • Table 1 shows the IC50 values of the antibodies of the present invention in the competitive binding of the antibodies of the present invention to the above mutant RBD polypeptides (inhibition of the binding of the mutant RBD polypeptides to human ACE2).
  • Table 1 shows that the IC50 values with wild-type and mutant RBD polypeptides are 9.02-22.55 ⁇ g/mL. This result indicates that the chicken antibodies of the present invention have equivalent neutralizing activity against all mutant RBD polypeptides.
  • WT is a wild-type RBD polypeptide
  • Alpha is an alpha mutant RBD polypeptide
  • Beta is a beta mutant RBD polypeptide
  • Gamma is RBD polypeptide of the gamma (theta) mutant
  • Epsilon is the RBD polypeptide of the epsilon mutant
  • Kappa is the RBD polypeptide of the kappa mutant
  • Eta is the eta mutant Represents an RBD polypeptide.
  • IgY conc represents the concentration of the antibody of the present invention.
  • the results of this example demonstrate that the antibody of the present invention can bind to the spike protein of the mutant coronavirus and can neutralize the binding of the RBD of the spike protein of the mutant coronavirus to ACE2. rice field.
  • mutant RBD polypeptides include the alpha, beta, gamma (in this example, referred to as "theta"), epsilon, kappa, and eta RBD polypeptides used in Examples 2 and 3.
  • the delta version having L452R and T478K
  • WT wild-type RBD polypeptide
  • the chicken antibody of the present invention As the chicken antibody of the present invention, the chicken antibody lot #I22 used in Examples 2 and 3 was used. The same method as in Example 3 was used for the binding inhibition test between the mutant RBD polypeptide and human ACE2. In addition, in this example, the rate of inhibition by the antibodies of the present invention on the binding of mutant RBD polypeptides to human ACE2 was calculated. In the calculation of the inhibition rate, wells to which each RBD polypeptide alone was added were used as positive controls, and wells to which the antibody of the present invention alone was added were used as negative controls.
  • the results are shown in Table 2 and FIG.
  • the antibody of the present invention exhibited a binding inhibition rate of 96% or more against binding of all mutant RBD polypeptides to ACE2 at an antibody concentration of 60 ⁇ g/ml or more.
  • the chicken antibody used in this example showed 96% binding of the epsilon-type RBD polypeptide to human ACE2, and 96% binding of the eta-type and theta-type RBD polypeptides to human ACE2 at an antibody concentration of 60 ⁇ g/ml or higher.
  • Table 3 shows the IC 50 values of the antibodies of the present invention in the competitive binding of the antibodies of the present invention to the above mutant RBD polypeptides (inhibition of the binding of the mutant RBD polypeptides to human ACE2).
  • Table 3 shows that the IC50 values with wild-type and mutant RBD polypeptides were 11.34-29.08 ⁇ g/mL. This result indicates that the chicken antibodies of the present invention have equivalent neutralizing activity against all mutant RBD polypeptides.
  • the results of this example demonstrate that the antibody of the present invention can bind to the spike protein of the mutant coronavirus and can neutralize the binding of the RBD of the spike protein of the mutant coronavirus to ACE2. rice field.
  • Binding inhibition test between mutant RBD polypeptide and human ACE2 In this example, as in Examples 3 and 4, inhibition (neutralization) of the chicken antibody of the present invention against binding between mutant RBD polypeptide and human ACE2 was performed. ) was tested for activity.
  • Mutant RBD polypeptides include gamma-type (having K417T, L452R and T478K) (SEQ ID NO: 24), mu-type (having R346K, E484K and N501Y) (SEQ ID NO: 28), and omicron-type (G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y and Y505H) (SEQ ID NO:30) was used. Wild-type (WT) RBD polypeptides used in Examples 2-4 were also used.
  • chicken antibodies of the present invention lot #I2 chicken antibody used in Example 2 and lot #I22 chicken antibody used in Examples 2 to 4 were used. The same method as in Examples 3 and 4 was used for the binding inhibition test between the mutant RBD polypeptide and human ACE2.
  • the rate of inhibition by the antibodies of the present invention on the binding of mutant RBD polypeptides to human ACE2 was calculated. In the calculation of the inhibition rate, wells to which each RBD polypeptide alone was added were used as positive controls, and wells to which the antibody of the present invention alone was added were used as negative controls.
  • FIG. 4 The results are shown in FIG. The inhibitory rate of the antibodies of the present invention on the binding of mutant RBD polypeptides to human ACE2 increased in an antibody concentration-dependent manner.
  • WT is a wild-type RBD polypeptide
  • Gamma is a gamma-type mutant RBD polypeptide
  • Mo is a mu-type mutant RBD polypeptide
  • Omicron is Omicron.
  • Figure 3 shows the RBD polypeptides of the type variants.
  • IgY Conc represents the concentration of the antibody of the present invention.
  • Table 4 shows the IC50 values of the antibodies of the present invention in the competitive binding of the antibodies of the present invention to the above mutant RBD polypeptides (inhibition of the binding of the mutant RBD polypeptides to human ACE2).
  • Table 4 shows that the IC50 values with wild-type and mutant RBD polypeptides were 19.47-35.50 ⁇ g/mL with lot #I2 chicken antibody and with lot #I22 chicken antibody. indicates that it was 7.93-17.83 ⁇ g/mL.
  • the results of this example demonstrate that the antibody of the present invention can bind to the spike protein of the mutant coronavirus and can neutralize the binding of the RBD of the spike protein of the mutant coronavirus to ACE2. rice field.
  • Mutant RBDs include alpha (having N501Y) (SEQ ID NO: 10), beta (having K417N, E484K and N501Y) (SEQ ID NO: 12), gamma (having K417T, E484K and N501Y) (SEQ ID NO: 24), delta (with L452R, T478K) (SEQ ID NO: 22), eta (with E484K) (SEQ ID NO: 20), theta (with E484K and N501Y) (SEQ ID NO: 14), epsilon (L452R) ) (SEQ ID NO: 16), kappa (having L452R, E484Q) (SEQ ID NO: 18), lambda (having L452Q, F490S) (SEQ ID NO: 26), mu (having R346K, E484K and N501Y) A polynucleotide encoding the RBD of (SEQ ID NO: 28) was used
  • a polynucleotide encoding a full-length S protein (SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 32)) containing a wild-type RBD was also used.
  • the nucleotide sequence (3,822 bp) encoding the wild-type full-length S protein was obtained from the nucleotide sequence of the SARS-CoV-2 genome (NCBI accession number: NC_045512), and the nucleotide sequence was used for human cell expression. Codon optimization was performed.
  • a DNA containing the codon-optimized base sequence of the full-length S protein (SEQ ID NO: 31) was artificially synthesized and incorporated into a mammalian expression vector.
  • SEQ ID NO: 32 shows the amino acid sequence encoded by the codon-optimized base sequence of the full-length S protein. This amino acid sequence matches the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • DNA encoding RBD with various mutations was prepared based on the overlap extension PCR method (R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367). By substituting the RBD-encoding portion of the DNA encoding the wild-type full-length S protein with the DNA encoding the mutant RBD, a DNA encoding the S protein in which only the RBD was mutated was prepared. .
  • nucleotide sequences of polynucleotides encoding wild-type, alpha-type, beta-type, gamma-type, delta-type, epsilon-type, kappa-type, eta-type, lambda-type, and mu-type RBD polypeptides are SEQ ID NOs: 7 and 9, respectively. , 11, 23, 21, 15, 17, 19, 25 and 27.
  • the base sequences of these polynucleotides are codon-optimized for expression in human cells.
  • Pseudoviruses expressing each S protein were generated using human 293T cells and a lentiviral vector system.
  • plasmids carrying DNAs encoding various mutant S proteins were introduced into human 293T cells.
  • a plasmid containing a DNA encoding a luciferase protein into human 293T cells. 48 hours after plasmid introduction into human 293T cells, the culture supernatant was collected and centrifuged. This supernatant was collected as a pseudovirus fluid and stored at -80°C until use.
  • Results Table 5 and FIG. 5 show the results of evaluating the reactivity of the chicken antibody of the present invention to each mutant pseudovirus. 60-100% inhibition of each mutant pseudovirus at 50 nM (9 ⁇ g/mL) chicken antibody concentration (final concentration) using both lots #I2 and #I22 chicken antibody rate.
  • WT is a wild-type RBD polypeptide
  • Alpha is an alpha mutant RBD polypeptide
  • Beta is a beta mutant RBD polypeptide
  • Gamma is a gamma mutant.
  • strain RBD polypeptide "Delta” is the RBD polypeptide of the delta variant, “Eta” is the RBD polypeptide of the eta variant, “Theta” is the RBD polypeptide of theta variant, “Kappa” is Kappa mutant RBD polypeptides, “Epsilon” for epsilon mutant RBD polypeptides, “Lambda” for lambda mutant RBD polypeptides, and “Mu” for mu mutant RBD polypeptides.
  • the omicron-type pseudoviruses were produced by polymorphism encoding the full-length S protein in which not only the RBD but also the entire S protein region was mutated. Nucleotides were used.
  • the nucleotide sequence encoding the full-length S protein of the omicron type (B.1.1.529/BA.1) was obtained from pLV-SpikeV11 (Invivogen) by PCR amplification.
  • the nucleotide sequence encoding the full length S protein of omicron type (BA.2) was obtained from pLV-SpikeV12 (Invivogen) by PCR amplification.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the full-length S proteins of the omicron type (B.1.1.529/BA.1) and omicron type (BA.2) are shown in SEQ ID NOs: 33 and 35, respectively.
  • the amino acid sequences of the Omicron-type (B.1.1.529/BA.1) and Omicron-type (BA.2) RBDs are shown in SEQ ID NOS: 38 and 40, respectively.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the Omicron-type (B.1.1.529/BA.1) and Omicron-type (BA.2) RBDs are shown in SEQ ID NOs: 37 and 39, respectively.
  • a pseudovirus expressing each S protein was produced by the same method as described in Example 6.
  • the luminescence signal (Count Per Signal: CPS) of each well was measured using ONE-Glo TM EX Luciferase Assay System (Promega) and ARVO SX (PerkinElmer). Based on the CPS values of the wells to which the chicken antibody solution was not added and the CPS values of the chicken antibody-added wells, the pseudovirus cell entry inhibition rate (Inhibition rate (%)) was calculated.
  • Results Table 6 and FIG. 6 show the results of evaluating the reactivity of the chicken antibody of the present invention to the omicron pseudovirus.
  • #I2 chicken antibody When #I2 chicken antibody was used, it showed inhibition rates of 63.6% and 77.2% against BA.1 and BA.2 omicron pseudoviruses at 50 nM (9 ⁇ g/mL) (final concentration). At 100 nM (18 ⁇ g/mL) (final concentration), it showed 77.6% and 87.9% inhibition against BA.1 and BA.2 omicron pseudoviruses, respectively.
  • WT is the wild-type full-length S protein
  • Delta is the full-length S protein in which only the RBD is substituted with the delta type
  • Omicron (BA.1) is the omicron type (B.1.1.529/BA .1) the full-length S protein of the mutant
  • Omicron(BA.2) represents the full-length S protein of the Omicron-type (BA.2) mutant.
  • Example 6 the chicken antibody of the present invention significantly inhibits the entry of all mutant pseudoviruses, including the omicron type, into human cells. It was shown to have high neutralizing activity in
  • Example 2 Preparation of Chicken Antibody
  • the same RBD polypeptide as in Example 1 was used as an immunogen.
  • Boris Brown chickens of egg breed were used as immunized animals.
  • Immunization was carried out by intramuscularly administering 10 to 25 ⁇ g/chicken of the above RBD polypeptide together with an adjuvant into the chest muscle of chickens.
  • the immunogen was administered 3 times every 2 weeks, the 4th dose about 1 month after the 3rd dose, and the 5th dose about 3 months after the 4th dose, for a total of 5 doses ( 25 ⁇ g/chicken for the first time, 10 ⁇ g/chicken for the 2nd to 4th times, and 25 ⁇ g/chicken for the 5th time).
  • Example 1 In order to obtain chicken polyclonal antibodies on a larger scale than in Example 1, the above immunization was performed on several hundred chickens. About 100 eggs were randomly selected from the eggs of several hundred immunized chickens, and the about 100 eggs were used as one lot. Egg yolks were pooled (mixed) for each of the multiple lots, and chicken polyclonal antibodies were purified in the same manner as in Example 1. Multiple lots of purified chicken polyclonal antibody were thus obtained.
  • live virus refers to a virus that can infect and proliferate in living cells.
  • virus strains were used as the live virus of SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 JPY/JPY/TY/WK-521 wild-type strain ii) SARS-CoV-2 QHN001 (VOC-202012/01 lineage strain) alpha mutant strain
  • SARS-CoV-2 TY8-612 B.1.351 lineage) beta variant
  • iv SARS-CoV-2 TY7-503 (501Y.V3, P.1 lineage) gamma variant
  • SARS-CoV-2 TY11- 927 B.1.617.2 lineage
  • VeroE6/TMPRSS2 cells JCRB1819 were used in this example.
  • the above SARS-CoV-2 virus suspension was prepared as follows. (i) Cell growth medium [Dulbecco modified Eagle medium (Nacalai Tesque, Inc.) containing 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 ⁇ g/mL), geneticin (G418) (1 mg/mL) was added] and VeroE6/TMPRSS2 cells were grown in monolayers in tissue culture flasks.
  • Cell growth medium Dulbecco modified Eagle medium (Nacalai Tesque, Inc.) containing 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 ⁇ g/mL), geneticin (G418) (1 mg/mL) was added
  • VeroE6/TMPRSS2 cells were grown in monolayers in tissue culture flasks.
  • the chicken antibody of the present invention has neutralizing activity against the live virus of the SARS-CoV-2 mutant strain. That is, the chicken antibody of the present invention was shown to be extremely effective in treating or preventing coronavirus infections caused by SARS-CoV-2 wild strains or mutant strains.
  • live virus refers to a virus that can infect and proliferate in living cells.
  • virus strains were used as the live virus of SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 TY11-927 B.1.617.2 strain
  • delta mutant iii
  • SARS-CoV -2 TY38-873 BA.1 strain
  • VeroE6/TMPRSS2 cells JCRB1819 were used in this example.
  • the above SARS-CoV-2 virus suspension was prepared as follows. (i) Cell growth medium [Dulbecco modified Eagle medium (Nacalai Tesque, Inc.) containing 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 ⁇ g/mL), geneticin (G418) (1 mg/mL) was added] and VeroE6/TMPRSS2 cells were grown in monolayers in tissue culture flasks.
  • Cell growth medium Dulbecco modified Eagle medium (Nacalai Tesque, Inc.) containing 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 ⁇ g/mL), geneticin (G418) (1 mg/mL) was added
  • VeroE6/TMPRSS2 cells were grown in monolayers in tissue culture flasks.
  • Example 8 demonstrated that the chicken antibodies of the present invention have neutralizing activity against live viruses of SARS-CoV-2 variants including the Omicron strain. That is, the chicken antibody of the present invention was shown to be extremely effective in treating or preventing coronavirus infections caused by SARS-CoV-2 wild strains or mutant strains.
  • chicken antibodies exhibited superior effects as compared with antibodies derived from animals of other species with respect to the inhibitory activity against the binding of mutant RBD polypeptides to human ACE2. It was tested whether it shows.
  • chicken antibodies of the invention (ii) chicken plasma immunized with RBD polypeptides, (iii) mouse plasma, (iv) vaccinated and Omicron-type pre-epidemic infections
  • the inhibitory (neutralizing) activity of these antibodies or plasma against the binding of mutant RBD polypeptides to human ACE2 was tested in the same manner as in Examples 3-5 using human plasma.
  • the IC50 value of the above (i) to (iv) antibodies or plasma against the wild-type RBD polypeptide is set to "1"
  • the IC50 value of the antibody or plasma against the mutant RBD polypeptide The ratio was calculated and compared. Since the plasma IC50 value indicates the dilution rate at which 50% inhibitory activity is observed, the higher the dilution rate, that is, the higher the IC50 value, the higher the inhibitory activity.
  • the IC50 value was calculated based on the dilution factor in the same manner as for the plasma. Delta-type and omicron-type (BA.1) RBD polypeptides were used as mutant RBD polypeptides.
  • the wild-type (WT) RBD polypeptide used in Examples 2-5 was used.
  • the chicken antibodies of the present invention 10 lots of chicken antibodies purified by the same purification method as used in Example 8 were used. Plasma from 13 mice and 12 chickens were used as plasmas obtained by immunization with the RBD polypeptide. Fifteen specimens were used as human plasma. The same method as described in Examples 3-5 was used for the binding inhibition test between the mutant RBD polypeptide and human ACE2. Mouse plasma and chicken plasma were used by serially diluting 2-fold from the 64-fold dilution. A 2-fold dilution of the human plasma was serially diluted 2-fold for use.
  • the inhibitory rate of the binding between the mutant RBD polypeptide and human ACE2 by the antibody of the present invention and plasma was calculated.
  • wells to which each RBD polypeptide alone was added were used as positive controls, and wells to which the antibody of the present invention or plasma alone were added were used as negative controls.
  • mouse plasma and human plasma showed an inhibitory activity equivalent to that of the wild type against delta-type RBD polypeptides, but a tendency toward lower inhibitory activity against omicron-type RBD polypeptides was observed.
  • chicken antibody (IgY) and chicken plasma tended to have similar inhibitory activities against the delta type and the omicron type compared to the inhibitory activity against the wild type.
  • FIG. 9 and Table 9 show the results obtained by averaging the results for each specimen.
  • Chicken antibody (IgY) and chicken plasma also showed similar inhibitory activity in delta type and omicron type (BA.1) compared to wild type.
  • mouse plasma and human plasma showed decreased activity in the omicron form.
  • Table 9 shows the relative IC50 value of each antibody or plasma against the delta-type and omicron-type (BA.1) RBD polypeptides when the IC50 value of each antibody or plasma against the wild-type RBD polypeptide is set to "1". Shows the average of the values.
  • the IC50 value when using chicken antibody (IgY) is 0.95 for delta type and 0.97 for omicron type
  • the IC50 value when using chicken plasma is 1.03 for delta type.
  • the IC50 values are 1.03 for Delta and 0.74 for Omicron
  • the IC50 values are 1.02 for Delta and 1.02 for Omicron. was 0.68 for
  • the delta type which has two mutations in the RBD polypeptide, showed no reduction in inhibitory activity in chicken, mouse, and human
  • the omicron type, which has 15 mutations showed no reduction in inhibitory activity in mice and humans. showed a decrease in inhibitory activity in
  • SEQ ID NOS: 7-40 synthetic DNA or synthetic peptide

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Abstract

本発明は、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和する新規分子の提供を目的とする。本発明は、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合するニワトリ抗体を提供する。

Description

変異型コロナウイルスに対するニワトリ抗体
　本発明は、変異型コロナウイルスに対するニワトリ抗体及びその使用に関する。
　2019年12月に中国武漢市で発生した新型コロナウイルス感染症(COVID-19)は瞬く間に世界中に拡がり、多くの死者を出すにとどまらず、世界経済に深刻な打撃を与えた。
　COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2は、ベータコロナウイルスに分類され、一本鎖のRNAをゲノムとして有する。ウイルス粒子の表面にはスパイクタンパク質と呼ばれる突起状のタンパク質が存在しており、このスパイクタンパク質がヒト細胞表面に発現するアンジオテンシン変換酵素2（ACE2：Angiotensin Converting Enzyme 2)と相互作用することで、ウイルス粒子とヒト細胞の直接的な接触が成立する(非特許文献1)。
　COVID-19は重篤な呼吸器困難を引き起こす場合があり、全世界における死者数は2020年末までに190万人を超えたものの、特効薬と言える治療効果を示す治療薬は未だない。
　また、長引く世界的な流行の中、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質に変異が生じ、アミノ酸配列が変化した変異型SARS-CoV-2の報告が相次いでおり、今後も増えることが予想される。
Wrapp et al., Science 367, 1260-1263 (2020)
　このような状況においては、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質とアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を中和する新規物質の開発が望まれる。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)とACE2との結合を中和することができる、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する新規ニワトリ抗体の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］
　変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する、ニワトリ抗体。
［２］
　変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)とアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を中和することができる、上記［１］に記載のニワトリ抗体。
［３］
　変異型コロナウイルスが、ACE2を介して細胞に感染するものである、上記［１］又は［２］に記載のニワトリ抗体。
［４］
　野生型コロナウイルスのスパイクタンパク質にさらに結合する、上記［１］～［３］のいずれかに記載のニワトリ抗体。
［５］
　ポリクローナル抗体である、上記［１］～［４］のいずれかに記載のニワトリ抗体。
［６］
　上記［１］～［５］のいずれかに記載のニワトリ抗体を含む、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための組成物。
［７］
　コロナウイルス感染症が、ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患又は症状である、上記［６］に記載の組成物。
［８］
　前記疾患又は症状が、呼吸器疾患、発熱、倦怠感、悪寒、疼痛、味覚若しくは嗅覚の障害、発疹、消化器症状、言語障害、認知障害及び循環器症状からなる群から選択される少なくとも一つのものである、上記［７］に記載の組成物。
［９］
　上記［１］～［５］のいずれかに記載のニワトリ抗体を含む、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合阻害剤。
［１０］
　上記［１］～［５］のいずれかに記載のニワトリ抗体を含む、試薬又はキット。
［１１］
　治療上有効量の上記［１］～［５］のいずれか一項に記載のニワトリ抗体又はこれを含む組成物を被験者に投与する工程を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防方法。
［１２］
　コロナウイルス感染症の治療又は予防において使用するための、上記［１］～［５］のいずれかに記載のニワトリ抗体又はこれを含む組成物。
［１３］
　コロナウイルス感染症を治療又は予防するための医薬の製造における、上記［１］～［５］のいずれかに記載のニワトリ抗体の使用。
　本発明により、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができる。
各種変異型のSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）に対する、本発明の抗体の反応性を評価した結果を示す図である。 本発明の抗体を用いた、各種変異型のRBDとACE2との結合阻害試験の結果を示す図である。 本発明の抗体を用いた、各種変異型のRBDとACE2との結合阻害試験の結果を示す図である。 本発明の抗体を用いた、各種変異型のRBDとACE2との結合阻害試験の結果を示す図である。 シュードウイルスに対する本発明の抗体の中和試験の結果を示す図である。 シュードウイルスに対する本発明の抗体の中和試験の結果を示す図である。 各種変異型SARS-CoV-2の生ウイルスに対する本発明の抗体の中和試験の結果を示す図である。 各種変異型SARS-CoV-2の生ウイルスに対する本発明の抗体の中和試験の結果を示す図である。 ニワトリ抗体及びニワトリ血漿と他の動物由来の血漿との比較試験結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2021年7月30日に出願された日本国特許出願（特願2021-125338号）、2021年12月9日に出願された日本国特許出願（特願2021-200190号）及び2022年2月21日に出願された日本国特許出願（特願2022-024653号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
　新型コロナウイルス感染症（COVID-19）による全世界における死者数は2020年末までに190万人を超えたものの、特効薬と言える治療効果を示す治療薬は未だない。COVID-19の治療薬としては、ファビピラビルやレムデシビルといった化合物が挙げられるが、これらは元々インフルエンザやエボラ出血熱等を対象とした感染症の治療薬であり、COVID-19に最適な治療薬であるかについては不明である。また、トシリズマブやラブリズマブなどの抗体医薬も治療薬の候補とされているが、いずれもウイルスを直接認識する抗体ではなく、免疫系に関与する生体内因子であるIL-6R、補体(C5)を標的としていることから、その作用は間接的である。
　さらに、長引く世界的な流行の中、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質に変異が生じ、アミノ酸配列が変化した変異型SARS-CoV-2の報告が相次いでおり、今後も増えることが予想される。
　このような状況においては、変異型コロナウイルスによる感染症の治療又は予防に使用することができる、新たな薬剤の開発が望まれる。
　本発明者は、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体について鋭意検討を行った結果、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができる、新規ニワトリ抗体の開発に成功した。
２．コロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)
　本発明の抗体は、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質、例えばその受容体結合ドメイン(RBD)に結合し、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を中和することができる。
　RBDは、コロナウイルスのスパイクタンパク質（以下、「Sタンパク質」とも称する）に存在し、ヒト細胞の細胞膜に存在するACE2に結合するドメインである。具体的には、コロナウイルスであるSARS-CoV-1及びSARS-CoV-2は、そのSタンパク質のRBDがACE2に結合することにより、ヒト細胞に感染することができる。
　ACE2は、主に肺、消化器系、心臓、血管、眼、腎臓、大脳皮質、扁桃体、脳幹、延髄などの細胞で発現する。したがって、本発明は、コロナウイルスのSタンパク質のRBDとこれらの器官に発現するACE2との結合を中和することにより、コロナウイルスのこれらの器官の細胞への感染を阻害し、呼吸器疾患等のコロナウイルス感染症に伴う多様な疾患及び症状の治療又は予防に寄与することができる。
　本発明におけるコロナウイルスのSタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列の一例として、野生型のSARS-CoV-2のSタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１及び２で示す。野生型のSARS-CoV-2のゲノムの塩基配列及びSタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において、下記の所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている。
 
　SARS-CoV-2のゲノムの塩基配列：NC_045512
　SARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列：YP_009724390
 
　すなわち、野生型のSARS-CoV-2のSタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
　また、野生型のSARS-CoV-2のSタンパク質をコードする塩基配列は、NCBIデータベースにおける上記SARS-CoV-2のゲノムの塩基配列（NCBIアクセッション番号: NC_045512）が示されるウェブページに開示されている。
　上述したとおり、コロナウイルスのSタンパク質は変異する可能性があるが、本発明の抗体は、野生型コロナウイルスのみならず、多様な変異を有する変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質にも結合し、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を中和することができる。
　本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質には、以下の（a）及び（b）のタンパク質が含まれる。
(a) 配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するタンパク質
(b) 配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するタンパク質
　本発明において、「配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
　(i) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
　(ii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１～４０個（例えば、１～３９個、１～３８個、１～３７個、１～３６個、１～３５個、１～３４個、１～３３個、１～３２個、１～３１個、１～３０個、１～２９個、１～２８個、１～２７個、１～２６個、１～２５個、１～２４個、１～２３個、１～２２個、１～２１個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
　(iii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列に１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
　(iv) 配列番号２で示されるアミノ酸配列に１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、
　(v) 上記(i)～(iv) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
　などが挙げられる。
　本発明において、「ACE2と結合する活性」の有無については、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、EIA（enzyme immunoassay）、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)（例えば、ポリペプチドを用いたELISA、cell ELISA等）などの免疫学的手法やプルダウンアッセイ等の方法を用いることにより測定することができる。また、「ACE2と結合する活性」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を100としたときと比較して、少なくとも10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
　また、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質には、配列番号２で示されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、約80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するものも含まれる。配列同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
　上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードするDNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。さらに、overlap extension PCR(R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367)を用いて、目的のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することができる。
　上記のとおり、本発明の抗体は、多様な変異を有する変異型コロナウイルスのSタンパク質に結合し、変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができる。したがって、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質としては、限定されるものではなく、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて、
　5番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　13番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　19番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　24番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　25番目のアミノ酸であるプロリン（P）における変異、
　26番目のアミノ酸であるプロリン（P）における変異、
　27番目のアミノ酸であるアラニン（A）における変異、
　67番目のアミノ酸であるアラニン（A）における変異、
　69番目のアミノ酸であるヒスチジン（H）における変異、
　70番目のアミノ酸であるバリン（V）における変異、
　75番目のアミノ酸であるグリシン（G）における変異、
　76番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　80番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異、
　95番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　142番目のアミノ酸であるグリシン（G）における変異、
　143番目のアミノ酸であるバリン（V）における変異、
　144番目のアミノ酸であるチロシン（Y）における変異、
　145番目のアミノ酸であるチロシン（Y）における変異、
　152番目のアミノ酸であるトリプトファン（W）における変異、
　154番目のアミノ酸であるグルタミン酸（E）における変異、
　156番目のアミノ酸であるグルタミン酸（E）における変異、
　157番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）における変異、
　158番目のアミノ酸であるアルギニン（R）における変異、
　211番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　212番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　213番目のアミノ酸であるバリン（V）における変異、
　214番目のアミノ酸であるアルギニン（R）における変異、
　242番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　243番目のアミノ酸であるアラニン（A）における変異、
　244番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　247番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　253番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異、
　339番目のアミノ酸であるグリシン（G）における変異、
　346番目のアミノ酸であるアルギニン（R）における変異、
　371番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　373番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　375番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　376番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　405番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異
　408番目のアミノ酸であるアルギニン（R）における変異、
　417番目のアミノ酸であるリジン（K）における変異、
　439番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　440番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　446番目のアミノ酸であるグリシン（G）における変異、
　452番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　453番目のアミノ酸であるチロシン（Y）における変異、
　477番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　478番目のアミノ酸であるスレオニン(T)における変異、
　484番目のアミノ酸であるグルタミン酸（E）における変異、
　486番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）における変異、
　490番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）における変異、
　493番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）における変異、
　496番目のアミノ酸であるグリシン（G）における変異、
　498番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）における変異、
　501番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　505番目のアミノ酸であるチロシン（Y）における変異、
　547番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　570番目のアミノ酸であるアラニン（A）における変異、
　614番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異、
　655番目のアミノ酸であるヒスチジン（H）における変異、
　677番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）における変異、
　679番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　681番目のアミノ酸であるプロリン（P）における変異、
　701番目のアミノ酸であるアラニン（A）における変異、
　704番目のアミノ酸であるセリン（S）における変異、
　764番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　791番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　796番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異、
　856番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　859番目のアミノ酸であるスレオニン（T）における変異、
　888番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）における変異、
　950番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）における変異、
　954番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）における変異、
　969番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）における変異、
　981番目のアミノ酸であるロイシン（L）における変異、
　1071番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）における変異、及び
　1176番目のアミノ酸であるバリン（V）における変異
からなる群から選択される少なくとも1つの変異
を含むものが挙げられる。上記「変異」としては、例えば、欠失、置換、挿入が挙げられる。
　より具体的には、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて、
　5番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換（L5F）、
　13番目のアミノ酸におけるセリン（S）からイソロイシン（I）への置換（S13I）、
　19番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からアルギニン（R）又はイソロイシン（I）への置換（T19R又はT19I）、
　24番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からセリン（S）への置換（L24S）、
　24番目のアミノ酸であるロイシン（L）の欠失、
　25番目のアミノ酸であるプロリン（P）の欠失、
　26番目のアミノ酸であるプロリン（P）の欠失、
　27番目のアミノ酸であるアラニン（A）の欠失、
　27番目のアミノ酸におけるアラニン（A）からセリン（S）への置換（A27S）、
　67番目のアミノ酸におけるアラニン（A）からバリン（V）への置換（A67V）、
　69番目のアミノ酸であるヒスチジン（H）の欠失、
　70番目のアミノ酸であるバリン（V）の欠失、
　75番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からバリン（V）への置換（G75V）、
　76番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からイソロイシン（I）への置換（T76I）、
　80番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からグリシン（G）への置換（D80G）、
　95番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からイソロイシン（I）への置換（T95I）、
　142番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からアスパラギン酸（D）への置換（G142D）、
　143番目のアミノ酸であるバリン（V）の欠失、
　144番目のアミノ酸であるチロシン（Y）の欠失、
　145番目のアミノ酸であるチロシン（Y）の欠失、
　152番目のアミノ酸におけるトリプトファン（W）からシステイン（C）への置換（W152C）、
　154番目のアミノ酸におけるグルタミン酸（E）からリジン（K）への置換（E154K）、
　156番目のアミノ酸であるグルタミン酸（E）の欠失、
　157番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）の欠失、又はフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換（F157S）、
　158番目のアミノ酸であるアルギニン（R）の欠失、又はアルギニン（R）からグリシン（G）への置換（R158G）、
　211番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）の欠失、
　212番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からイソロイシン（I）への置換（L212I）、
　213番目のアミノ酸におけるバリン（V）からグリシン（G）への置換（V213G）、
　214番目のアミノ酸であるアルギニン（R）の直後に３アミノ酸（グルタミン酸（E）、プロリン（P）およびグルタミン酸（E））の挿入（ins214EPE）、
　242番目のアミノ酸であるロイシン（L）の欠失、
　243番目のアミノ酸であるアラニン（A）の欠失、
　244番目のアミノ酸であるロイシン（L）の欠失、
　247番目のアミノ酸であるセリン（S）の欠失、
　253番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）の欠失、又はアスパラギン酸（D）からグリシン（G）への置換（D253G）、
　339番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からアスパラギン酸（D）への置換（G339D）、
　346番目のアミノ酸におけるアルギニン（R）からリジン（K）への置換（R346K）、
　371番目のアミノ酸におけるセリン（S）からフェニルアラニン（F）又はロイシン（L）への置換（S371F、S371L）、
　373番目のアミノ酸におけるセリン（S）からプロリン（P)への置換（S373P)、
　375番目のアミノ酸におけるセリン（S）からフェニルアラニン（F)への置換（S375F)、
　376番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からアラニン（A）への置換（T376A)、
　405番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換（D405N)、
　408番目のアミノ酸におけるアルギニン（R）からセリン（S）への置換（R408S)、
　417番目のアミノ酸におけるリジン（K）からアスパラギン（N）又はスレオニン（T）への置換（K417N又はK417T）、
　439番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N439K）、
　440番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N440K）、
　446番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G446S）、
　452番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からアルギニン（R）又はグルタミン（Q）への置換(L452R又はL452Q)、
　453番目のアミノ酸におけるチロシン（Y）からフェニルアラニン（F）への置換（Y453F）、
　477番目のアミノ酸におけるセリン（S）からアスパラギン（N）への置換（S477N）、
　478番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からリジン（K）への置換（T478K）、
　484番目のアミノ酸におけるグルタミン酸（E）から、リジン（K）、グルタミン（Q）又はアラニン（A）への置換（E484K、E484Q又はE484A）、
　486番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F486V）、
　490番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換（F490S）、
　493番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からリジン（K）又はアルギニン（R）への置換（Q493K、Q493R）、
　496番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G496S）、
　498番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）アルギニン（R）への置換（Q498R）、
　501番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からチロシン（Y）への置換（N501Y）、
　505番目のアミノ酸におけるチロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換（Y505H）、
　547番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からリジン（K）への置換（T547K）、
　570番目のアミノ酸におけるアラニン（A）からアスパラギン酸（D）への置換（A570D）、
　614番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からグリシン（G）への置換（D614G）、
　655番目のアミノ酸におけるヒスチジン（H）からチロシン（Y）への置換（H655Y）、
　677番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からヒスチジン（H）への置換（Q677H）、
　679番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N679K）、
　681番目のアミノ酸におけるプロリン（P）からアルギニン（R）又はヒスチジン（H）への置換（P681R、P681H）、
　701番目のアミノ酸におけるアラニン（A）からバリン（V）への置換（A701V）、
　704番目のアミノ酸におけるセリン（S）からロイシン（L）への置換（S704L）、
　764番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N764K）、
　791番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からイソロイシン（I）への置換（T791I）、
　796番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からチロシン（Y）への置換（D796Y）、
　856番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N856K）、
　859番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からアスパラギン（N）への置換（T859N）、
　888番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換（F888L）、
　950番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換（D950N）、
　954番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からヒスチジン（H）への置換（Q954H）、
　969番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N969K）、
　981番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換（L981F）、
　1071番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からヒスチジン（H）への置換（Q1071H）、及び
　1176番目のアミノ酸におけるバリン（V）からフェニルアラニン（F）への置換（V1176F）
からなる群から選択される少なくとも1つの変異を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「N番目のアミノ酸における」は、「N番目のアミノ酸位置における」を意味する。
　より具体的には、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて、
　339番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からアスパラギン酸（D）への置換（G339D）、
　346番目のアミノ酸におけるアルギニン（R）からリジン（K）への置換（R346K）、
　371番目のアミノ酸におけるセリン（S）からフェニルアラニン（F）又はロイシン（L）への置換（S371F、S371L）、
　373番目のアミノ酸におけるセリン（S）からプロリン（P)への置換（S373P)、
　375番目のアミノ酸におけるセリン（S）からフェニルアラニン（F)への置換（S375F)、
　405番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換（D405N)、
　417番目のアミノ酸におけるリジン（K）からアスパラギン（N）又はスレオニン（T）への置換（K417N又はK417T）、
　440番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N440K）、
　446番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G446S）、
　417番目のアミノ酸におけるリジン（K）からアスパラギン（N）又はスレオニン（T）への置換（K417N又はK417T）、
　452番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からアルギニン（R）又はグルタミン（Q）への置換(L452R又はL452Q)、
　477番目のアミノ酸におけるセリン（S）からアスパラギン（N）への置換（S477N）、
　478番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からリジン（K）への置換（T478K）、
　484番目のアミノ酸におけるグルタミン酸（E）からリジン（K）、グルタミン（Q）又はアラニン（A）への置換（E484K、E484Q又はE484A）、及び
　486番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F486V）、
　490番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換（F490S）、
　493番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からリジン（K）又はアルギニン（R）への置換（Q493K、Q493R）、
　496番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G496S）、
　498番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）アルギニン（R）への置換（Q498R）、
　501番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からチロシン（Y）への置換（N501Y）、
　505番目のアミノ酸におけるチロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換（Y505H）、
からなる群から選択される少なくとも1つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は全ての変異を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明における変異型コロナウイルスとしては、例えば、B.1.1.7系統の変異株（アルファ株）、B.1.351系統の変異株（ベータ株）、P.1系統の変異株（ガンマ株）、B.1.617.2系統、AY.1系統又はAY.2系統の変異株（デルタ株）、B.1.427/B.1.429系統の変異株（イプシロン株）、P.2系統の変異株（ゼータ株）、B.1.525系統の変異株（イータ株）、P.3系統の変異株（シータ株）、B.1.526系統の変異株（イオタ株）、B.1.617.1系統の変異株（カッパ株）、C.37系統の変異株（ラムダ株）、B.1.621系統の変異株（ミュー株）、B.1.1.529系統の変異株（オミクロン株）が挙げられるが、これらに限定されない。また、B.1.1.529系統の変異株の亜系統として、BA.1系統、BA.2系統、BA.3系統、BA.4系統、BA.5系統の変異株が挙げられる。上記系統の表記は、PANGO系統（pango lineage）に従うものであり、株の名称は、WHOの呼称に基づくものである。
　B.1.1.7系統の変異株（アルファ株）は、主な変異として少なくともN501Yを含み、B.1.351系統の変異株（ベータ株）は、主な変異として少なくともK417N、E484K及びN501Yを含み、P.1系統の変異株（ガンマ株）は、主な変異として少なくともK417T、E484K及びN501Yを含み、B.1.617.2系統、AY.1系統又はAY.2系統の変異株（デルタ株）は、主な変異として少なくともL452R及びT478Kを含み、B.1.427/B.1.429系統の変異株（イプシロン株）は、主な変異として少なくともL452Rを含み、P.2系統の変異株（ゼータ株）は、主な変異として少なくともE484Kを含み、B.1.525系統の変異株（イータ株）は、主な変異として少なくともE484Kを含み、P.3系統の変異株（シータ株）は主な変異として少なくともE484K及びN501Yを含み、B.1.526系統の変異株（イオタ株）は、主な変異として少なくともE484Kを含み、B.1.617.1系統の変異株（カッパ株）は、主な変異として少なくともL452R及びE484Qを含み、C.37系統の変異株（ラムダ株）は、主な変異として少なくともL452Q及びF490Sを含み、B.1.621系統の変異株（ミュー株）は、主な変異として少なくともR346K、E484K及びN501Yを含み、B.1.1.529系統の変異株（オミクロン株）は、主な変異として少なくともG339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、
G496S、Q498R、N501Y及びY505Hを含む。B.1.1.529系統の亜系統であるBA.1系統の変異株は、主な変異として少なくともG339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y及びY505Hを含み、BA.2系統の変異株は、主な変異として少なくともG339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y及びY505Hを含む。
　本発明におけるRBDの塩基配列及びアミノ酸配列の一例として、野生型SARS-CoV-2のRBDの塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３及び４で示す。
　すなわち、本発明において、野生型SARS-CoV-2のRBDは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。 
　本発明において、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質には、RBDに変異を有するスパイクタンパク質が含まれる。本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDには、以下の（a）及び(b)のタンパク質が含まれる。
(a) 配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するタンパク質
(b) 配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するタンパク質
　本発明において、「配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」には、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
　また、「配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
　(i) 配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
　(ii) 配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１～２０個（例えば、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
　(iii) 配列番号４で示されるアミノ酸配列に１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、
　(iv) 配列番号４で示されるアミノ酸配列に１～１０個（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
　(v) 上記(i)～(iv) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
　などが挙げられる。
　本発明において、「ACE2と結合する活性」の有無については、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、EIA（enzyme immunoassay）、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)（例えば、ポリペプチドを用いたELISA、cell ELISA等）などの免疫学的手法やプルダウンアッセイ等の方法を用いることにより測定することができる。また、「ACE2と結合する活性」とは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を100としたときと比較して、少なくとも10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
　また、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDには、配列番号４で示されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、約80％以上、約81％以上、約82％以上、約83％以上、約84％以上、85％以上、約86％以上、約87％以上、約88％以上、約89％以上、90％以上、約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつACE2と結合する活性を有するものも含まれる。配列同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
　本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとしては、限定されるものではなく、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて、
　339番目のアミノ酸であるグリシン（G）、
　346番目のアミノ酸であるアルギニン（R）、
　371番目のアミノ酸であるセリン（S)、
　373番目のアミノ酸であるセリン（S)、
　375番目のアミノ酸であるセリン（S)、
　376番目のアミノ酸であるスレオニン（T）、
　405番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（D）
　408番目のアミノ酸であるアルギニン（R）、
　417番目のアミノ酸であるリジン（K）、
　439番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）、
　440番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）、
　446番目のアミノ酸であるグリシン（G）、
　452番目のアミノ酸であるロイシン（L）、
　453番目のアミノ酸であるチロシン（Y）、
　477番目のアミノ酸であるセリン（S）、
　478番目のアミノ酸であるスレオニン（T）、
　484番目のアミノ酸であるグルタミン酸（E）、
　486番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）、
　490番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（F）、
　493番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）、
　496番目のアミノ酸であるグリシン（G）、
　498番目のアミノ酸であるグルタミン（Q）、
　501番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）、
　505番目のアミノ酸であるチロシン（Y）、及び
　547番目のアミノ酸であるスレオニン（T）、
からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異の少なくとも1つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は全てを含むものが挙げられる。
　より具体的には、本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとしては、限定されるものではなく、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて、
　339番目のアミノ酸におけるグリシン (G)からアスパラギン酸（D)への置換（G339D)、
　346番目のアミノ酸におけるアルギニン（R）からリジン（K）への置換（R346K）、
　371番目のアミノ酸におけるセリン（S）からフェニルアラニン（F）又はロイシン（L）への置換（S371F、S371L）、
　373番目のアミノ酸におけるセリン (S)からプロリン（P)への置換（S373P)、
　375番目のアミノ酸におけるセリン (S)からフェニルアラニン（F)への置換（S375F)、
　376番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からアラニン（A）への置換（T376A)、
　405番目のアミノ酸におけるアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換（D405N)、
　408番目のアミノ酸におけるアルギニン（R）からセリン（S）への置換（R408S) 、
　417番目のアミノ酸におけるリジン（K）からアスパラギン（N）又はスレオニン（T）への置換（K417N又はK417T）、
　439番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N439K）、
　440番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からリジン（K）への置換（N440K）、
　446番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G446S）、
　452番目のアミノ酸におけるロイシン（L）からアルギニン（R）又はグルタミン（Q）への置換(L452R又はL452Q)、
　453番目のアミノ酸におけるチロシン（Y）からフェニルアラニン（F）への置換（Y453F）、
　477番目のアミノ酸におけるセリン (S)からアスパラギン (N)への置換（S477N)
　478番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からリジン（K）への置換（T478K）、
　484番目のアミノ酸におけるグルタミン酸（E）からリジン（K）、グルタミン（Q）又はアラニン（A）への置換（E484K、E484Q又はE484A）、
　486番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F486V）、
　490番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換（F490S）、
　493番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）からリジン（K）又はアルギニン（R）への置換（Q493K、Q493R）、
　496番目のアミノ酸におけるグリシン（G）からセリン（S）への置換（G496S）、
　498番目のアミノ酸におけるグルタミン（Q）アルギニン（R）への置換（Q498R）、
　501番目のアミノ酸におけるアスパラギン（N）からチロシン（Y）への置換（N501Y）
　505番目のアミノ酸におけるチロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換（Y505H）、及び
　547番目のアミノ酸におけるスレオニン（T）からリジン（K）への置換（T547K）、
からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異の少なくとも1つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は全てを含むものが挙げられる。
　ここで、「対応するアミノ酸」とは、野生型又は変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えた特定の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸をいう。例えば、野生型RBDの場合、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて501番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）は、配列番号４で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて183番目のアミノ酸であるアスパラギン（N）に対応する。変異型RBDの場合も同様である。本明細書において、RBDにおける変異の位置及びアミノ酸の種類は、それに対応する、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えた位置及びアミノ酸の種類で表す。例えば、RBDが、配列番号２で示されるアミノ酸配列のN末端から数えて501番目のアミノ酸に対応するアミノ酸において、アスパラギン（N）からチロシン（Y）への変異を有する場合は、当該RBDにおける変異をN501Yと表記する。また、本明細書においては、変異又は変異したアミノ酸を表記する際に「に対応するアミノ酸」という用語を省略することができる。
　一態様において、本発明のニワトリ抗体は、以下の(i)～(xii)のRBD若しくはこれを含むSタンパク質からなる群から選択されるRBD若しくはこれを含むSタンパク質の少なくとも一つ若しくは全てに結合することができる：
(i) 主な変異として少なくともN501Yを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(ii) 主な変異として少なくともK417N、E484K及びN501Yを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(iii) 主な変異として少なくともK417T、E484K及びN501Yを含むRBD又はこれを含むSタンパク質;
(iv) 主な変異として少なくともL452R及びT478Kを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(v) 主な変異として少なくともL452Rを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(vi) 主な変異として少なくともE484Kを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(vii) 主な変異として少なくともE484K及びN501Yを含むRBD又はこれを含むSタンパク質;
(viii) 主な変異として少なくともL452R及びE484Qを含むRBD又はこれを含むSタンパク質;
(ix) 主な変異として少なくともL452Q及びF490Sを含むRBD又はこれを含むSタンパク質;
(x) 主な変異として少なくともR346K、E484K及びN501Yを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；
(xi) 主な変異として少なくともG339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y及びY505Hを含むRBD又はこれを含むSタンパク質；並びに
(xii) 主な変異として少なくともG339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y及びY505Hを含むRBD又はこれを含むSタンパク質。
　上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードするDNAに変異を導入する方法は、上記のとおりである。
　本発明における変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDが結合するACE2は、任意の哺乳動物に由来するものであってよい。そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、ヒトなどが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒトであるが、これらに限定されない。これらのACE2の塩基配列及びアミノ酸配列の一例として、ヒトACE2の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５及び６で示すが、当該ACE2の塩基配列及びアミノ酸配列はこれらに限定されない。ヒトACE2の塩基配列及びアミノ酸配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において、下記の所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている。
　ヒトACE2をコードするDNAの塩基配列：NM_001371415（配列番号５）
　ヒトACE2のアミノ酸配列：NP_001358344.1（配列番号６）
　RBDにおいて、本発明の抗体が結合する領域（本発明の抗体が結合するエピトープを含む領域）は、当業者であれば、公知の方法、例えばRBDの全長又は部分ポリペプチドを複数作製し、本発明の抗体がどのRBDポリペプチドに結合するかを調べることにより特定することができる。また、三次元構造を有するポリペプチドを用いることにより、三次元的（立体的）な構造を有するエピトープを特定することもできる。三次元構造を有するポリペプチドは、例えば、哺乳動物細胞を用いてRBDを発現させることにより作製することができる。
　本発明の抗体が結合するエピトープ及び当該エピトープを含む領域は、本発明の抗体が、コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができる限り、限定されない。また、当業者は、本明細書の記載に基づいて、被験対象の抗体のエピトープを特定することなく、被験対象の抗体がコロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができるかどうかを確認することができる。すなわち、本明細書の記載によれば、当業者は、被験対象の抗体がコロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができるかどうかを確認するために、被験対象の抗体のエピトープを特定する必要はない。
３．本発明の抗体
　本発明の抗体は、変異型コロナウイルスのスパイク（S）タンパク質に結合するニワトリ抗体である。本発明の変異型コロナウイルスのSタンパク質に結合するニワトリ抗体としては、好ましくは、本発明の変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDに結合するニワトリ抗体が挙げられる。
　ニワトリ抗体には、IgY、IgM及びIgAが存在し、このうち、機能的に哺乳動物のIgGに相当するIgYは、卵黄に選択的に移行する。そのため、ニワトリ抗体は、卵黄から大量かつ容易に精製することが可能であり、安価に提供することができる。また、食べ物である卵から精製したニワトリ抗体は、鼻腔内投与、口腔内投与、経口投与などにおいて安全であり、ネブライザーやスプレーなどを用いた治療法又は予防法に用いることが可能である。そのほか、IgYは、(i) 哺乳動物の補体を活性化しないため、安全性が高い、(ii) 哺乳類Fcレセプターと結合しない、(iii) 哺乳動物IgGと交差反応しない、などの利点を有する。さらに、ニワトリは哺乳動物間で高度に保存された生体分子を異物として認識することができるため、ニワトリ抗体は、哺乳動物由来の抗体と比較して、このような生体分子との反応性において有利である。
　さらに、本発明のニワトリ抗体については、マウス抗体又はヒト抗体と異なり、オミクロン型変異株に対して結合阻害活性の低下が認められない。すなわち、本発明のニワトリ抗体については、他の生物種に免疫することで得られた抗体と比較して、より広範な種類の変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合に対し、中和活性を有する（維持できる）。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
　本発明において、「スパイク（S）タンパク質に結合する」又は「スパイク（S）タンパク質のRBDに結合する」とは、水素結合、疎水性相互作用、静電力、ファン・デル・ワールス力等により、Sタンパク質又はSタンパク質のRBDとの可逆的な非共有結合を形成することを意味する。本発明において、「結合する」には、「特異的に結合する」ことが含まれる。本発明において、「特異的に結合する」とは、標的タンパク質又は標的ポリペプチドにおけるエピトープを認識して、そのエピトープを有さないタンパク質又はポリペプチドと比較して、選択的又は優先的にそのエピトープを有するタンパク質又はポリペプチドに結合することをいう。
　本発明の抗体には、モノクローナル抗体の抗原結合断片も含まれる。本発明において、「抗原結合断片」としては、例えば、scFv（single chain Fv）、sc(Fv)2、Fab、Fab'、ダイアボディ（diabody、dsFv）、F(ab')2、多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗体結合断片は、遺伝子工学的手法や、パパイン消化、ペプシン消化など、公知の方法により取得することができる。
　本発明の一態様において、本発明の抗体は、単離された抗体である。
　本発明の抗体は、変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができる。また、本発明の抗体は、コロナウイルスを中和することができる（コロナウイルスに対する中和活性を有する）。
　本発明において、コロナウイルスとは、ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスを意味する。そのようなコロナウイルスとしては、例えば、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2が挙げられ、SARS-CoV-2が好ましい。これらのコロナウイルスは、そのSタンパク質のRBDがACE2に結合することにより、細胞に感染する。本明細書において、「コロナウイルス」には、野生型及び変異型の双方が含まれる。本発明において「中和する」とは、コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との相互作用（例えば結合）を阻害すること、又はコロナウイルスのSタンパク質の活性を阻害することを意味する。また、本発明において、「コロナウイルスを中和する」とは、コロナウイルスが細胞に結合する活性又は侵入する活性を抑制又は阻害することを意味する。
　被験対象の抗体がコロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との相互作用を阻害するかどうかは、例えば、ACE2に結合したHisタグ融合RBDを、Hisタグに結合可能な蛍光標識抗体（蛍光標識抗Hisタグ抗体）を用いて検出することにより調べることができる。具体的には、被験対象の抗体とHisタグ融合RBDとを反応させた後、その反応産物をACE2発現細胞に添加する。ここで、被験対象の抗体が、Hisタグ融合RBDと結合することにより、Hisタグ融合RBDとACE2発現細胞上のACE2との結合を阻害する場合は、Hisタグ融合RBDに結合した蛍光標識抗Hisタグ抗体の蛍光シグナルは検出されない。一方、被験対象の抗体が、Hisタグ融合RBDとACE2発現細胞上のACE2との結合を阻害しない場合は、Hisタグ融合RBDはACE2発現細胞上のACE2に結合するため、当該Hisタグ融合RBDに結合した蛍光標識抗Hisタグ抗体の蛍光シグナルが検出される。
　あるいは、被験対象の抗体がコロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との相互作用を阻害するかどうかは、本明細書の実施例３に記載されているように、例えば、ACE2に結合したRBDを、マウス抗SARS-CoV-2 Spike抗体及びこの抗体に結合する標識二次抗体（マウス抗IgG-Fc抗体）を用いて検出することにより調べることができる。具体的には、被験対象の抗体とRBDとを反応させた後、その反応産物をACE2発現細胞に添加する。ここで、被験対象の抗体が、RBDと結合することにより、RBDとACE2発現細胞上のACE2との結合を阻害する場合は、RBDにマウス抗SARS-CoV-2 Spike抗体を介して結合する蛍光標識二次抗体の蛍光シグナルは検出されない。一方、被験対象の抗体が、RBDとACE2発現細胞上のACE2との結合を阻害しない場合は、RBDはACE2発現細胞上のACE2に結合するため、当該RBDにマウス抗SARS-CoV-2 Spike抗体を介して結合した蛍光標識二次抗体の蛍光シグナルが検出される。
　このように、被験対象の抗体により、RBDの蛍光シグナルが検出されない場合、被験対象の抗体はRBDとACE2との相互作用を阻害すると判断することができる。
　また、被験対象の抗体がコロナウイルスを中和することができるかどうかは、例えば、被験対象の抗体とコロナウイルスとを所定の割合で混合し、培養細胞と接触させ、当該培養細胞の形態変化（細胞変性効果：CPE）の有無を観察することで確認することができる。当該培養細胞の形態変化が認められなければ、当該被験抗体は、試験に用いた抗体濃度においてコロナウイルスに対する中和活性を有することを確認することができる（例えば実施例７）。
　以下、本発明の抗体の作製方法について説明する。
（１）抗原の調製
　本発明の抗体を作製するための免疫原又は本発明の抗体の反応性試験に用いる抗原としては、限定されるものではなく、例えば、コロナウイルスのSタンパク質の全長又はその部分ポリペプチドを用いることができる。コロナウイルスのSタンパク質の部分ポリペプチドとしては、限定されるものではなく、例えば、コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドが挙げられる。「コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチド」としては、例えば、上記「２．」に記載されたRBDを含むポリペプチドを用いることができる。コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドは、例えば、哺乳動物細胞（HEK293細胞、CHO細胞）において、コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから発現させることにより得ることができる。すなわち、本発明の抗体を作製するための免疫原又は本発明の抗体の反応性試験に用いる抗原には、哺乳動物細胞において発現したコロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドが含まれる。また、哺乳動物に導入される、コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞での発現に適するように、適宜コドンを最適化することができる。
　また、コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドは、当業者であれば、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。合成したペプチドは、Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）又はThyroglobulinなどの担体タンパク質と結合させ、免疫原として用いることができる。ただし、本発明の抗体を作製するための免疫原の作製方法は、これらの方法に限定されない。
　本発明において、コロナウイルスSタンパク質のRBDとしては、例えば、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2のSタンパク質のRBDが挙げられ、SARS-CoV-2のSタンパク質のRBDが好ましい。
　また、治療対象疾患の原因となるコロナウイルスのSタンパク質（例えばRBD）に変異が生じた場合、その変異型のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を上記哺乳動物細胞で発現させたり、上記手法により当該ポリペプチドを合成することにより取得することができる。このようにして得られた変異型ポリペプチドは、抗原/免疫原として使用することができる。
　ただし、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する抗体を得るための免疫原としては、必ずしも変異型のポリペプチドを用いる必要はなく、野生型のポリペプチドであってもよい。
（２）ポリクローナル抗体の作製
　免疫動物としては、卵用種のニワトリ、例えば、ジュリアライト、ボリスブラウン、白色レグホーンなどを用いることができる。
　免疫は、上記（１）で調製した抗原ポリペプチドをアジュバントとともにニワトリに投与することにより行う。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として筋肉内、静脈内、皮下等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔（例えば1～3週間間隔、好ましくは1～2週間間隔）又は数ヶ月間隔（例えば約1～6ヶ月間隔、好ましくは約1、2、3若しくは4ヶ月間隔）で、計2～10回、好ましくは計2～5回（例えば4回）免疫を行う。免疫の間隔や回数は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。
　集卵の間隔は、当業者であれば実験計画に応じて適宜設定することができ、例えば1～2週間（例えば2週間）に１度集卵し、卵黄中の抗体価を測定する。抗体価の測定には、ELISAを用いることができる。
（３）抗体の精製
　採取した卵の卵殻を割り、卵黄を取り分ける。卵黄に緩衝液を加えてよく撹拌し、ポリエチレングリコールを加えて溶解させる。遠心することで脂質成分を除いた上清にポリエチレングリコールを加えて撹拌し、溶解させる。さらに遠心し、ニワトリ抗体を含むタンパク質を沈殿させ、沈殿物に緩衝液を加えて溶解させる。さらにポリエチレングリコールを加えてよく撹拌し、溶解させる。遠心し、ニワトリ抗体を沈殿させ、沈殿に氷冷50%エタノールを加え洗浄し残留ポリエチレングリコールを除去する。洗浄後のニワトリ抗体を緩衝液に溶解させる。緩衝液としては、PBS、TBSなど、公知の緩衝液を使用することができる。
　精製したニワトリ抗体の濃度は、分光光度計を用いて波長280 nmの吸光度を測定し、ニワトリ抗体のモル吸光係数(1.33)とLambert-Beerの法則を基に濃度を算出する。
　このようにして、精製したニワトリポリクローナル抗体を得ることができる。
　すなわち、本発明は、下記の工程(a)及び(b)を含む、ニワトリポリクローナル抗体の製造方法を提供する。
(a) コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドを１又は複数羽のニワトリに免疫する工程、及び
(b) 工程(a)で免疫された１又は複数羽のニワトリが産んだ卵から、ニワトリポリクローナル抗体を精製する工程。
　上記工程(a)において、免疫されるニワトリの数は、例えば、1羽以上、2羽以上、10羽以上、50羽以上又は100羽以上であり得、かつ、例えば、1000羽以下、900羽以下、800羽以下、500羽以下、400羽以下、300羽以下、200羽以下、100羽以下、50羽以下、10羽以下、2羽以下、であり得るが、これらに限定されない。
　上記工程(b)は、一態様において、さらに、免疫された１又は複数羽のニワトリが産んだ卵から複数の卵を無作為に選択し、選択した卵からニワトリポリクローナル抗体を精製する工程を含むことができる。さらに、上記工程(b)は、選択した複数の卵の卵黄を混合し、混合した卵黄からニワトリポリクローナル抗体を精製する工程を含むことができる。
　選択される卵の個数は限定されるものではなく、例えば、1個以上、2個以上、10個以上、50個以上、100個以上であり得、かつ、200個以下、150個以下、100個以下、50個以下、10個以下、2個以下であり得るが、これらに限定されない。
　上記工程(a)において免疫される「コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチド」としては、上記「２．」に記載されたRBDを含むポリペプチドを用いることができる。また、上記工程(a)において免疫される「コロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチド」としては、哺乳動物細胞において発現したコロナウイルスSタンパク質のRBDを含むポリペプチドを用いることができる。
（４）モノクローナル抗体の作製
　ニワトリモノクローナル抗体は、公知の方法、例えば細胞融合法（S. Nishinaka et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989;89(4):416-9）、ファージディスプレイ法（特開2001-238676）に基づき作製することができる。
（５）遺伝子組換え抗体の作製
　本発明の抗体の態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定されるものではなく、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体、完全ヒト抗体が挙げられる。
　キメラ抗体は、異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片を連結して作製された抗体をいう。本発明において、キメラ抗体としては、例えば、ヒト型キメラ抗体が挙げられるが、キメラ抗体の可変領域及び定常領域が由来する動物の種類は限定されない。ヒト型キメラ抗体としては、例えば、ニワトリ抗体の可変領域をヒト由来抗体の定常領域に連結（接合）した抗体が挙げられる。キメラ抗体は、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
　本発明において、ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング（CDR移植）と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、ニワトリ抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来のものでCDRはニワトリ由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。
　本発明において、完全ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生することができる哺乳動物を用いて、公知の手法に準じて作製することができる（WO96／9634096、WO98/24893など）。
　本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した公知の方法に準じてキメラ抗体及びヒト型化抗体を作製することができる。
　さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いて融合することにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
（６）抗体結合断片の作製
　本発明の抗体の抗原結合断片は、変異型コロナウイルスのSタンパク質に結合する。
　抗体の抗原結合断片は、本発明の抗体における抗原結合部分の一部を含むポリペプチドを意味する。抗原結合断片としては、例えば、scFv（single chain Fv）、sc(Fv)2、Fab、Fab'、ダイアボディ（diabody、dsFv）、F(ab')2、多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗体結合断片は、遺伝子工学的手法や、パパイン消化、ペプシン消化など、公知の方法により取得することができる。
（７）結合親和性
  抗体の抗原に対する親和性は、一般に、平衡解離定数（KD）で表すことができ、KDの値が低いほど、抗体が高い親和性を有することを示す。
　抗体の親和性は、公知の機器及び方法を用いて測定することができる（例えばBiacore（登録商標）-3000 (GE Healthcare社）、ProteON XPR36 (Bio-Rad社)など）。
４．組成物
　本発明の組成物は、上記「３．本発明の抗体」に記載した抗体を有効成分として含有し、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための組成物である。また、本発明には、上記「３．本発明の抗体」に記載した抗体を有効成分として含有し、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物が含まれる。
　本発明の組成物の対象となるコロナウイルス感染症としては、コロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患又は症状を意味する。このようなコロナウイルス感染症としては、例えば、ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患又は症状が挙げられる。「ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルス」としては、限定されるものではなく、例えば、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2が挙げられ、SARS-CoV-2が好ましい。
「ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患又は症状」としては、例えば、ACE2が主に発現する器官又は組織、例えば、肺、消化器系、心臓、血管、眼、腎臓、大脳皮質、扁桃体、脳幹、延髄などに関連する疾患又は症状、免疫応答に基づく疾患又は症状などが挙げられる。このような疾患又は症状としては、例えば、呼吸器疾患、発熱、倦怠感、悪寒、疼痛、味覚若しくは嗅覚の障害、発疹、消化器症状、言語障害、認知障害、循環器症状が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の抗体を含む組成物は、ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスの感染を阻害することにより、コロナウイルス感染症に伴う多様な疾患又は症状の治療又は予防に有効である。
　本発明において、「治療」とは、疾患の発症後に本発明の抗体又はそれを含む組成物を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の症状を軽減することを意味し、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することを意味するものではない。本発明における「疾患の発症」には、疾患の症状が身体に現れることに加えて、症状が現れていなくてもコロナウイルス感染に関する検査（PCR検査など）において陽性であることも含まれる。また、本発明において、コロナウイルス感染症の「治療」には、コロナウイルス感染症の重篤化の抑制又は阻害が含まれる。
　本発明において、「予防」とは、コロナウイルス感染症の発症の抑制又は阻害、重篤化の抑制又は阻害を意味するが、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。本発明において、「予防」には、疾患の発症前に本発明の組成物等を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、疾患の発症後の症状を軽減することが含まれる。
　本発明の組成物は、ACE2に結合する抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料又は甘味料を指す。
　本発明の抗体及び組成物は、噴霧剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤、注射剤等の剤型をとることができる。
　本発明の抗体及び組成物を噴霧剤として使用する場合は、例えば、ネブライザー、スプレーなどを用いて、本発明の抗体及び組成物を投与（噴霧）することができる。これにより、本発明の抗体が、コロナウイルスの鼻腔粘膜や口腔粘膜への感染を阻害することができる。注射剤などの液体製剤は、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
　本発明の抗体及び組成物は、コロナウイルス感染症を予防するために、コロナウイルス感染症の予防に用いる製品（防護製品、例えば、マスク、フィルター、スプレーなど）や機器に適用する（例えば担持させる）ことができる。
　本発明の抗体及び組成物は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与することができる。本発明の組成物の投与経路としては、経口投与及び非経口投与のいずれも可能であり、非経口投与の場合は、鼻腔内投与、口腔内投与、筋肉内投与などにより投与することができる。本発明の組成物は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
　本発明の抗体及び組成物の投与量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、動物種、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。コロナウイルス感染症の治療のための本発明の抗体の投与量としては、被験者の体重1 kgあたり、例えば0.1mg～100mg/日、好ましくは0.1mg～15mg/日であるが、これに限定されない。投与回数としては、一日に１～５回投与することができる。
　本発明の抗体及び組成物の投与時期は、症状に応じて適宜定めることができ、複数回分を同時に又は時間をおいて別々に投与することができる。また、本発明の組成物は、疾患の発症前に被験者に投与してもよいし、疾患の発症後に投与してもよい。
　本発明の組成物は、哺乳動物を被験者として投与することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどが挙げられる。
５．コロナウイルス感染症の治療又は予防方法
　本発明においては、変異型コロナウイルスのSタンパク質に結合するニワトリ抗体又はこれを含む組成物を被験者に投与することにより、コロナウイルス感染症を治療又は予防することができる。すなわち、本発明は、治療上有効量の本発明の抗体又はそれを含む組成物を被験者に投与する工程を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防方法を提供する。本発明の抗体又はそれを含む組成物の治療上の有効量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化する。当業者であれば、コロナウイルス感染症の治療又は予防に必要な治療上の有効量を容易に決定することができる。本発明において、「被験者」には、コロナウイルス感染症の治療又は予防を必要とする被験者が含まれる。また、「被験者」として治療又は予防の対象となる哺乳動物は、上記の通りである。
　本発明のコロナウイルス感染症の治療又は予防方法において、「コロナウイルス感染症」、「治療」及び「予防」についての説明は上記の通りである。また、本発明の抗体又はそれを含む組成物の剤形、投与経路、投与量、投与時期などの説明についても上記の通りである。
６．変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合阻害剤
　本発明の抗体は、変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を中和（阻害）するため、当該結合によるコロナウイルス感染を阻害することができる。すなわち、本発明は、上記「３．本発明の抗体」に記載された抗体を有効成分として含む、変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合阻害剤、又は変異型コロナウイルスのSタンパク質のRBDとACE2との結合を阻害するための組成物を提供する。
　本発明の阻害剤は、試験用試薬として、あるいは哺乳動物の治療又は予防に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「４．組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。ただし、本発明の阻害剤は、本発明の抗体のみを含有するものであってもよい。
７．抗体の使用
　本発明の抗体は、コロナウイルス感染症の治療又は予防方法において、あるいはコロナウイルス感染症を治療又は予防するための医薬の製造において、使用することができる。すなわち、本発明は、コロナウイルス感染症の治療又は予防方法において使用するための、本発明の抗体を提供する。また、本発明は、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、本発明の抗体を提供する。さらに、本発明は、変異型コロナウイルスのSタンパク質とACE2との結合阻害剤の製造において使用するための、本発明の抗体を提供する。
８．併用療法
　本発明の組成物は、他の治療剤の少なくとも１種と併用投与するために用いることができる。本発明に使用される他の治療剤としては、例えば、レムデシビル、デキサメタゾン、ファビピラビル、ナファモスタット、カモスタット、イベルメクチン、トリシズマブ、バリシチニブなどが挙げられる。
　本発明の組成物と他の治療剤の少なくとも1種とを併用投与することにより、それぞれ単独で用いるよりもさらに優れた効果が期待される。優れた効果には、治療効果を維持しつつ従来よりも副作用を軽減するという効果が含まれる。
　本発明において「併用」とは、本発明の組成物と前記他の治療剤の少なくとも1種とを、同時又は別々に投与することを意味する。「同時」とは、一つの投与スケジュールにおいて同一のタイミングで投与されることを意味し、投与の時分が完全に同一である必要はない。「別々」とは、一つの投与スケジュールにおいて異なるタイミングで投与されることを意味する。
　本発明の併用療法に用いる組成物及び他の治療剤の投与形態、投与経路、投与対象は特に限定されず、上記「４．組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。また、併用する薬剤の投与形態又は投与量が互いに異なっていてもよく、その併用する組み合わせにより、適宜調整することができる。
　本発明の組成物を他の治療剤と併用する場合は、投与量を適宜減らすことも可能である。従って、本発明の組成物と他の治療剤との組合せにおいては、
(i) 本発明の組成物の有効量と、他の治療剤の有効量、
(ii) 本発明の組成物の有効量と、他の治療剤の非有効量、
(iii) 本発明の組成物の非有効量と、他の治療剤の有効量、及び
(iv) 本発明の組成物の非有効量と、他の治療剤の非有効量
の組合せを採用することができる。
　組成物及び他の治療剤の一方又は両者が非有効量の使用態様であっても、併用により薬理効果を発揮することができる場合は、そのような態様により併用投与することができる。
９．試薬、キット
　本発明の抗体は、試薬又はキットに含めることができる。すなわち、本発明は、本発明の抗体を含む試薬及びキットを提供する。本発明の試薬及びキットは、例えば、コロナウイルスに関する試験用試薬又はキットとして使用することができる。
　本発明の試薬及びキットにおいて、本発明の抗体は、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等の公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる）などと混合してもよい。
　本発明のキットには、本発明の抗体のほか、緩衝液、酵素液、二次抗体、希釈用溶液、使用説明書などを含めることもできる。
  以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ニワトリ抗体の作製
（１）免疫原
　本実施例においては、免疫原として、哺乳動物細胞（HEK293細胞又はCHO細胞）において発現させた、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、SARS-CoV-2スパイクタンパク質RBDのポリペプチド（以下、「RBDポリペプチド」）を用いた。当該RBDポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号７）は、哺乳動物細胞における発現に適するようにコドンが最適化されたものを用いた。
（２）免疫
　免疫動物としては、ジュリアライトやボリスブラウンなどの卵用品種のニワトリを用いた。
　免疫は、伊藤忠飼料株式会社研究所にて、上記（１）に記載のRBDポリペプチド100μg/羽を、アジュバントとともに、ニワトリの胸部筋肉内に投与することにより行った。免疫原は、２週間おきに計４回投与した。週に1度集卵し、卵黄中の抗体価を調べた。
（３）ニワトリ抗体の精製
　卵殻表面は次亜塩素酸ナトリウムで消毒した後、水で洗浄した。卵殻についた水分を拭き取った後に卵殻を割り、卵黄を取り分けた。卵黄は水で洗浄し卵白成分を除いた。卵黄に4倍量のPBS(-)を入れて良く撹拌し、終濃度3.5％になるようにポリエチレングリコール6000を加え溶解させた。遠心し脂質成分を除いた上清に終濃度12%になるようにポリエチレングリコール6000を加え撹拌し、溶解させた。遠心しニワトリ抗体を含むタンパク質を沈殿させ、沈殿物にPBS(-)を加え溶解させた。終濃度12%になるようにポリエチレングリコール6000を加え良く撹拌し溶解させた。遠心しニワトリ抗体を沈殿させ、沈殿に氷冷50%エタノールを加え洗浄し残留ポリエチレングリコールを除去した。洗浄後のニワトリ抗体はPBS(-)に溶解させた。精製したニワトリ抗体の濃度は、分光光度計を用いて波長280 nmの吸光度を測定し、ニワトリ抗体のモル吸光係数(1.33)とLambert-Beerの法則を基に濃度を算出した。
　その結果、ニワトリポリクローナル抗体を作製することができた。
ニワトリ抗体と変異型RBDポリペプチドとの結合試験
　本実施例では、変異型RBDポリペプチドとして、アルファ型（N501Yを有する）（配列番号１０）、ベータ型（K417N、E484K及びN501Yを有する）（配列番号１２）、ガンマ型（シータ型）（E484K、N501Yを有する）（配列番号１４）、イプシロン型（L452Rを有する）（配列番号１６）、カッパ型（L452R、E484Qを有する）（配列番号１８）、及びイータ型（E484Kを有する）（配列番号２０）のRBDポリペプチドを用いた。また、野生型（WT）のRBDポリペプチド（配列番号８）も用いた。
　変異型RBDポリペプチドは、overlap extension PCR法 (R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367)に基づき、各種変異を導入したRBDポリペプチドをコードするDNAをそれぞれ作製し、これを哺乳動物細胞（HEK293細胞又はCHO細胞）において発現させることにより調製した。野生型（WT）のRBDポリペプチドも同様の方法で調製した。
　野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型（シータ型）、イプシロン型、カッパ型及びイータ型のRBDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示す。
　各変異型RBDポリペプチドを1μg/mLになるように炭酸バッファーで希釈し、ELISAプレート(MaxiSorp, Nunc)の各ウェルに100μL入れ、37℃で1時間静置し抗原を固相化させた。マイクロプレートウォッシャーを用いて、300μLのPBS-T (0.05% Tween20を含むD-PBS(-))で3回洗浄した後、ELISAプレートの各ウェルに300μLのブロッキングBuffer（5%スキムミルクを含むPBS-T）を添加し37℃で1時間静置した。マイクロプレートウォッシャーを用いて、300μLのPBS-Tで3回洗浄した。ELISAプレートの各ウェルに希釈Buffer (2%スキムミルク、0.2% Tween20を含むD-PBS(-))で希釈したニワトリ抗体を100μL添加し37℃で1時間静置した。マイクロプレートウォッシャーを用いて、300μLのPBS-Tで3回洗浄した。ELISAプレートの各ウェルに希釈Bufferで10,000倍希釈した二次抗体 (Rabbit anti-Chicken IgG (IgY)-heavy and light chain cross-adsorbed Antibody HRP Conjugated, Bethyl, A30-207P)を100μL添加し37℃で30分間静置した。マイクロプレートウォッシャーを用いて、300μLのPBS-Tで5回洗浄した。ELISAプレートの各ウェルにOPD溶液を100μL添加し、発色を見ながら室温で静置し、各ウェルに3N 硫酸溶液を100μL添加し発色反応を停止させた。吸光度計を用い490 nmの吸光度を測定した。
　本発明のニワトリ抗体と各変異型RBDポリペプチドとの反応性を評価した結果を図１に示す。2羽のニワトリ（系統：ジュリアライト）からそれぞれ得られた2つのロット#I2と#I22のニワトリ抗体は、双方とも全ての変異型RBDポリペプチドに結合した。
　この結果から、本発明のニワトリ抗体が、全ての変異型RBDポリペプチド及びこれらの変異型RBDをそれぞれ含む変異型コロナウイルスのSタンパク質に結合することが示された。
変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験
　本実施例では、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する、本発明のニワトリ抗体の阻害（中和）活性について試験した。
　変異型RBDポリペプチドとしては、実施例２で用いた変異型RBDポリペプチド、すなわち、アルファ型、ベータ型、ガンマ型（シータ型）、イプシロン型、カッパ型及びイータ型のRBDポリペプチドを用いた。また、野生型（WT）のRBDポリペプチドも用いた。
　本実施例における結合阻害試験は、次のようにして行った。
　まず、ヒトACE2を安定的に強制発現させたマウス4T1細胞の細胞懸濁液を、細胞培養用96ウェルプレートの各ウェルに１ウェル当たり10,000細胞になるように100μL播種し、37℃、5% CO2存在下で2日間培養した。
　終濃度5 nMになるように各変異型RBDポリペプチドをBlocking Buffer (3%BSA, 0.2%FCSを含むD-PBS(-))に添加し、この変異型RBDポリペプチド含有Blocking Bufferでニワトリ抗体を希釈してニワトリ抗体溶液を調製した。
　96ウェルプレートの培地をデカンテーションで除去し、調製したニワトリ抗体溶液を各ウェルに30μL添加し、4℃で１時間静置した。96ウェルプレートのニワトリ抗体溶液をデカンテーションで除去し、各ウェルを250μLのD-PBS(-)で2回洗浄した。
　Blocking Bufferで1μg/mLになるようにマウス抗SARS-CoV-2 Spike抗体 (クローンS28)を希釈したS28抗体溶液を各ウェルに30μL添加し、4℃で1時間静置した。S28抗体溶液をデカンテーションで除去し、各ウェルを250μLのD-PBS(-)で2回洗浄した。96ウェルプレートの各ウェルに10%ホルマリン溶液を50μL添加し、室温で10分間静置し細胞を固定化した。10%ホルマリン溶液をデカンテーションで除去し、各ウェルを250μLの洗浄Buffer (0.05% Tween20を含むD-PBS(-))で2回洗浄した。96ウェルプレートの各ウェルに3%過酸化水素溶液を50μL添加し、室温で5分間静置し内在性ペルオキシダーゼを失活させた。3%過酸化水素溶液をデカンテーションで除去し、各ウェルを250μLの洗浄Buffer (0.05% Tween20を含むD-PBS(-))で3回洗浄した。96ウェルプレートの各ウェルにBlocking Bufferで10,000倍希釈した二次抗体 (Mouse IgG-Fc Fragment cross-adsorbed Antibody HRP Conjugated, Bethyl, A90-231P)溶液を50μL添加し、室温暗所で1時間静置した。二次抗体溶液をデカンテーションで除去し、各ウェルを250μLの洗浄Buffer (0.05% Tween20を含むD-PBS(-))で3回洗浄した。96ウェルプレートの各ウェルにOPD溶液を100μL添加し、発色を見ながら室温で静置し、各ウェルに3N 硫酸溶液を100μL添加し発色反応を停止させた。吸光度計を用い490 nmの吸光度を測定し、細胞膜上のACE2と結合したSARS-CoV-2スパイクタンパク質のRBDポリペプチドを検出した。
　また、本実施例においては、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する本発明の抗体による阻害率を計算した。当該阻害率の計算においては、各RBDポリペプチドのみを添加したウェルを陽性対照とし、本発明の抗体のみを添加したウェルを陰性対照として用いた。
　ニワトリ抗体を用いた変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験の結果を図２に示す。2つのロット#I2と#I22のいずれのニワトリ抗体を用いた場合も、125μg/mlの抗体濃度において、ACE2と結合したRBDポリペプチドは検出されなかった。この結果から、全ての変異型RBDポリペプチドのACE2への結合に対する、本発明のニワトリ抗体の100%の阻害活性が示された。
　また、本発明の抗体の上記変異型RBDポリペプチドへの競合的結合（変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合阻害）における本発明の抗体のIC50値を表１に示す。表１は、野生型および変異型RBDポリペプチドを用いたIC50値が、9.02-22.55μg/mLであることを示す。この結果は、本発明のニワトリ抗体は、全ての変異型RBDポリペプチドに対して同等の中和活性を有することを示す。
　表１、図１及び図２において、「WT」は野生型RBDポリペプチド、「Alpha」はアルファ型変異株のRBDポリペプチド、「Beta」はベータ型変異株のRBDポリペプチド、「Gamma」はガンマ型（シータ型）変異株のRBDポリペプチド、「Epsilon」はイプシロン型変異株のRBDポリペプチド、「Kappa」は、カッパ型変異株のRBDポリペプチド、「Eta」は、イータ型変異株のRBDポリペプチドを表す。また、図１及び２において、「IgY conc.」は、本発明の抗体の濃度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　すなわち、本実施例の結果により、本発明の抗体が、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合し、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができることが示された。
変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験
　本実施例では、実施例３と同様に、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する、本発明のニワトリ抗体の阻害（中和）活性について試験した。
　変異型RBDポリペプチドとしては、実施例２及び３で用いたアルファ型、ベータ型、ガンマ型（本実施例では「シータ型」と表記する）、イプシロン型、カッパ型及びイータ型のRBDポリペプチドに加えて、デルタ型（L452R及びT478Kを有する）（配列番号２２）のRBDポリペプチドを用いた。また、実施例２及び３で用いた野生型（WT）のRBDポリペプチドも用いた。
　また、本発明のニワトリ抗体としては、実施例２及び３で用いたロット#I22のニワトリ抗体を用いた。
　上記変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験の方法は、実施例３と同じ方法を用いた。
　また、本実施例においては、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する本発明の抗体による阻害率を計算した。当該阻害率の計算においては、各RBDポリペプチドのみを添加したウェルを陽性対照とし、本発明の抗体のみを添加したウェルを陰性対照として用いた。
　その結果を表２及び図３に示す。変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対する本発明の抗体の阻害率は、抗体濃度依存的に増加した。そして、本発明の抗体は、60μg/ml以上の抗体濃度において、全ての変異型RBDポリペプチドのACE2への結合に対し、96％以上の結合阻害率を示した。より具体的には、本実施例で用いたニワトリ抗体は、60μg/ml以上の抗体濃度において、イプシロン型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対しては96%、イータ型及びシータ型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対しては99%、アルファ型、ベータ型及びデルタ型BDポリペプチドのヒトACE2への結合に対しては、100%以上の阻害率を示した。
　表２、図３及び後述の表３において、「WT」は野生型RBDポリペプチド、「Alpha」はアルファ型変異株のRBDポリペプチド、「Beta」はベータ型変異株のRBDポリペプチド、「Delta」はデルタ型変異株のRBDポリペプチド、「Epsilon」はイプシロン型変異株のRBDポリペプチド、「Eta」は、イータ型変異株のRBDポリペプチド、「Theta」はシータ型変異株のRBDポリペプチド、「Kappa」はカッパ型変異株のRBDポリペプチドを表す。また、図３において、「IgY Conc.」は、本発明の抗体の濃度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
 
　この結果から、本発明の抗体は、全ての変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対し、極めて高い阻害活性を有することが示された。
　また、本発明の抗体の上記変異型RBDポリペプチドへの競合的結合（変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合阻害）における本発明の抗体のIC50値を表３に示す。表３は、野生型および変異型RBDポリペプチドを用いたIC50値が11.34-29.08μg/mLであったことを示す。この結果は、本発明のニワトリ抗体は、全ての変異型RBDポリペプチドに対して同等の中和活性を有することを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　すなわち、本実施例の結果により、本発明の抗体が、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合し、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができることが示された。
変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験
　本実施例では、実施例３及び４と同様に、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する、本発明のニワトリ抗体の阻害（中和）活性について試験した。
　変異型RBDポリペプチドとしては、ガンマ型（K417T、L452R及びT478Kを有する）（配列番号２４）、ミュー型（R346K、E484K及びN501Yを有する）（配列番号２８）、及びオミクロン型（G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、
G496S、Q498R、N501Y及びY505Hを有する）（配列番号３０）のRBDポリペプチドを用いた。また、実施例２～４で用いた野生型（WT）のRBDポリペプチドも用いた。
　本発明のニワトリ抗体としては、実施例２で用いたロット#I2のニワトリ抗体及び実施例２～４で用いたロット#I22のニワトリ抗体を用いた。
　上記変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験の方法は、実施例３及び４と同じ方法を用いた。
　また、本実施例においては、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する本発明の抗体による阻害率を計算した。当該阻害率の計算においては、各RBDポリペプチドのみを添加したウェルを陽性対照とし、本発明の抗体のみを添加したウェルを陰性対照として用いた。
　その結果を図４に示す。変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対する本発明の抗体の阻害率は、抗体濃度依存的に増加した。
　図４及び後述の表４において、「WT」は野生型RBDポリペプチド、「Gamma」はガンマ型変異株のRBDポリペプチド、「Mu」はミュー型変異株のRBDポリペプチド、「Omicron」はオミクロン型変異株のRBDポリペプチドを表す。また、図４において、「IgY Conc.」は、本発明の抗体の濃度を表す。
　この結果から、本発明の抗体は、全ての変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合に対し、極めて高い阻害活性を有することが示された。
　また、本発明の抗体の上記変異型RBDポリペプチドへの競合的結合（変異型RBDポリペプチドのヒトACE2への結合阻害）における本発明の抗体のIC50値を表４に示す。
　表４は、野生型および変異型RBDポリペプチドを用いたIC50値が、ロット#I2のニワトリ抗体を用いた場合は19.47-35.50μg/mLであり、ロット#I22のニワトリ抗体を用いた場合は7.93-17.83μg/mLであったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
 
 
 
　この結果は、本発明のニワトリ抗体は、全ての変異型RBDポリペプチドに対して同等の中和活性を有することを示す。
　すなわち、本実施例の結果により、本発明の抗体が、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合し、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合を中和することができることが示された。
変異型シュードウイルス（pseudovirus）に対する中和試験
　本実施例では、本発明のニワトリ抗体が、変異型シュードウイルスのヒト細胞への侵入に対する阻害活性を有するか（変異型シュードウイルスに対する中和活性を有するか）について試験した。
１．各種変異型シュードウイルスの作製
　本実施例では、シュードウイルスの作製において、野生型RBDを変異型RBDに置換した全長Sタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いた。変異型RBDとしては、アルファ型（N501Yを有する）（配列番号１０）、ベータ型（K417N、E484K及びN501Yを有する）（配列番号１２）、ガンマ型（K417T、E484K及びN501Yを有する）（配列番号２４）、デルタ型（L452R、T478Kを有する）（配列番号２２）、イータ型（E484Kを有する）（配列番号２０）、シータ型（E484K及びN501Yを有する）（配列番号１４）、イプシロン型（L452Rを有する）（配列番号１６）、カッパ型（L452R、E484Qを有する）（配列番号１８）、ラムダ型（L452Q、F490Sを有する）（配列番号２６）、ミュー型（R346K、E484K及びN501Yを有する）（配列番号２８）のRBDをコードするポリヌクレオチドを用いた。また野生型のRBDを含む全長Sタンパク質（配列番号２（配列番号３２））をコードするポリヌクレオチドも用いた。
　野生型の全長Sタンパク質をコードする塩基配列（3,822bp）は、SARS-CoV-2のゲノムの塩基配列（NCBIアクセッション番号: NC_045512）から取得し、当該塩基配列に対してヒト細胞発現用にコドン最適化を行った。コドン最適化を行った当該全長Sタンパク質の塩基配列（配列番号３１）を含むDNAは人工的に合成し、哺乳類発現用ベクターに組み込んだ。コドン最適化を行った当該全長Sタンパク質の塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号３２に示す。このアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列と一致する。
　各種変異を導入したRBDをコードするDNAは、overlap extension PCR法（R Higuchi, et al., Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11; 16(15): 7351-7367）に基づき作製した。上記野生型の全長Sタンパク質をコードするDNAのうちRBDをコードする部分を、変異型RBDをコードするDNAと置換することで、RBDのみが変異型となったSタンパク質をコードするDNAを作製した。
　野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型、デルタ型、イプシロン型、カッパ型、イータ型、ラムダ型、ミュー型のRBDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ、配列番号７、９、１１、２３、２１、１５、１７、１９、２５及び２７で示す。なお、これらのポリヌクレオチドの塩基配列は、ヒト細胞発現用にコドンが最適化されたものである。
　各Sタンパク質を発現するシュードウイルスは、ヒト293T細胞およびレンチウイルスベクターシステムを利用して作製した。本実施例では、レンチウイルスのエンベロープタンパク質を各種変異型Sタンパク質に置換するため、各種変異型Sタンパク質をコードするDNAを搭載したプラスミドをヒト293T細胞に導入した。また、シュードウイルスの細胞内への侵入の有無を評価するため、ルシフェラーゼタンパク質をコードするDNAを搭載したプラスミドもヒト293T細胞に導入した。
　ヒト293T細胞へのプラスミド導入から48時間後、培養上清を回収し遠心した。この上清をシュードウイルス液として回収し、使用するまで-80℃で保存した。
２．各種シュードウイルスのタイトレーション
　ヒトACE2を安定的に強制発現させたヒト293T細胞の細胞懸濁液を、細胞培養用96ウェルプレートの各ウェルに1ウェルあたり10,000細胞となるように100 μL播種し、37℃、5% CO2存在下で24時間培養した。1ウェル当たり25 μLの各シュードウイルス液を滴下し、さらに24時間培養した。培養上清を除去後、ONE-GloTM EX Luciferase Assay System (Promega)およびARVO SX (パーキンエルマー)を用いて各ウェルの発光シグナル（Count Per Signal: CPS）を測定した。
３．ニワトリ抗体を用いたシュードウイルス中和試験
　ヒトACE2を安定的に強制発現させたヒト293T細胞の細胞懸濁液を、細胞培養用96ウェルプレートの各ウェルに1ウェルあたり10,000細胞となるように100 μL播種し、37℃、5% CO2存在下で24時間培養した。シュードウイルスのタイトレーションの結果から、それぞれのシュードウイルスのCPSが同一となるよう各ウイルスの液量を調整した。調製した各シュードウイルス25 μLに対し300 nM (54 μg/mL)ニワトリ抗体（IgY）溶液 25 μLを混和した。5分間室温で静置した後、シュードウイルスとIgYとの混合液50 μLを各ウェルに滴下し、37℃、5% CO2存在下で24時間培養した。培養上清を除去後、ONE-GloTM EX Luciferase Assay System (Promega)およびARVO SX (パーキンエルマー)を用いて各ウェルの発光シグナル（Count Per Signal: CPS）を測定した。ニワトリ抗体溶液を添加していないウェルのCPS値およびニワトリ抗体添加ウェルのCPS値をもとに、シュードウイルスの細胞への侵入阻害率（Inhibition rate (%)）を算出した。
４．結果
　本発明のニワトリ抗体の各変異型シュードウイルスへの反応性を評価した結果を表５及び図５に示す。2つのロット#I2と#I22のいずれのニワトリ抗体を用いた場合も、50 nM (9 μg/mL)のニワトリ抗体濃度（終濃度）において、各変異型シュードウイルスに対し60～100%の阻害率を示した。
　表５及び図５において、「WT」は野生型RBDポリペプチド、「Alpha」はアルファ型変異株のRBDポリペプチド、「Beta」はベータ型変異株のRBDポリペプチド、「Gamma」はガンマ型変異株のRBDポリペプチド、「Delta」はデルタ型変異株のRBDポリペプチド、「Eta」は、イータ型変異株のRBDポリペプチド、「Theta」はシータ型変異株のRBDポリペプチド、「Kappa」はカッパ型変異株のRBDポリペプチド、「Epsilon」はイプシロン型変異株のRBDポリペプチド、「Lambda」はラムダ型変異株のRBDポリペプチド、「Mu」はミュー型変異株のRBDポリペプチドを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
 
　この結果は、本発明のニワトリ抗体が、全ての変異型シュードウイルスのヒト細胞への侵入を顕著に阻害すること、すなわち、全ての変異型シュードウイルスに対して高い中和活性を有することを示す。
変異型シュードウイルス（pseudovirus）に対する中和試験
　本実施例では、実施例6と同様に、本発明のニワトリ抗体が、変異型シュードウイルスのヒト細胞への侵入に対する阻害活性を有するか（変異型シュードウイルスに対する中和活性を有するか）について試験した。
１．各種変異型シュードウイルスの作製
　本実施例では、実施例6で用いた野生型とデルタ型のRBDをコードするポリヌクレオチドに加えて、オミクロン型(B.1.1.529/BA.1)（A67V, deletion (Δ)H69-V70, T95I, G142D, ΔV143-Y145, ΔN211, L212I, ins214EPE, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K及びL981Fを有する)の全長Sタンパク質(配列番号３４)をコードするポリヌクレオチドと、オミクロン型(BA.2)(T19I, ΔL24-P26, A27S, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, N501Y, Y505H, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, Q954H, N969Kを有する)の全長Sタンパク質(配列番号３６)をコードするポリヌクレオチドを用いた。
　上記のとおり、本実施例において、オミクロン型シュードウイルスの作製には、他の変異型シュードウイルスの作製と異なり、RBDのみでなくSタンパク質全ての領域に変異を入れた全長Sタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いた。
　オミクロン型(B.1.1.529/BA.1)の全長Sタンパク質をコードする塩基配列はpLV-SpikeV11 (Invivogen)からPCR法で増幅することにより取得した。オミクロン型(BA.2)の全長Sタンパク質をコードする塩基配列は、pLV-SpikeV12 (Invivogen)からPCR法で増幅することにより取得した。
　オミクロン型(B.1.1.529/BA.1)とオミクロン型(BA.2)の全長Sタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ、配列番号３３及び３５で示す。
　オミクロン型(B.1.1.529/BA.1)とオミクロン型(BA.2)のRBDのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３８及び４０で示す。また、オミクロン型(B.1.1.529/BA.1)とオミクロン型(BA.2)のRBDをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ、配列番号３７及び３９で示す。
　各Sタンパク質を発現するシュードウイルスは、実施例６に記載の方法と同様の方法により製造した。
２．各種シュードウイルスのタイトレーション
　実施例６に記載の方法と同様の方法を用いて、オミクロン型シュードウイルスのタイトレーションを行った。
３．ニワトリ抗体を用いたシュードウイルス中和試験
　ヒトACE2を安定的に強制発現させたヒト293T細胞の細胞懸濁液を、細胞培養用96ウェルプレートの各ウェルに1ウェルあたり10,000細胞となるように100 μL播種し、37℃、5% CO2存在下で24時間培養した。シュードウイルスのタイトレーションの結果から、それぞれのシュードウイルスのCPSが同一となるよう各ウイルスの液量を調整した。調製した各シュードウイルス25 μLに対し300 nM (54 μg/mL)ニワトリ抗体（IgY）溶液 25 μL（終濃度50 nM）もしくは600 nM (108 μg/mL)ニワトリ抗体（IgY）溶液 25 μL（終濃度100 nM）を混和した。5分間室温で静置した後、シュードウイルスとIgYとの混合液50 μLを各ウェルに滴下し、37℃、5% CO2存在下で24時間培養した。本発明のニワトリ抗体としては、実施例６で用いたロット#I2のニワトリ抗体を用いた。培養上清を除去後、ONE-GloTM EX Luciferase Assay System (Promega)およびARVO SX (パーキンエルマー)を用いて各ウェルの発光シグナル（Count Per Signal: CPS）を測定した。ニワトリ抗体溶液を添加していないウェルのCPS値およびニワトリ抗体添加ウェルのCPS値をもとに、シュードウイルスの細胞への侵入阻害率（Inhibition rate (%)）を算出した。
４．結果
　本発明のニワトリ抗体のオミクロン型シュードウイルスへの反応性を評価した結果を表６及び図６に示す。#I2ニワトリ抗体を用いた場合、50 nM (9 μg/mL)（終濃度）においてBA.1とBA.2のオミクロン型シュードウイルスに対しそれぞれ63.6%、77.2%の阻害率を示した。100 nM（18 μg/mL）（終濃度）においては、BA.1とBA.2のオミクロン型シュードウイルスに対しそれぞれ77.6%、87.9%の阻害率を示した。
表６及び図６において「WT」は野生型全長Sタンパク質、「Delta」はRBDのみデルタ型に置換した全長Sタンパク質、「Omicron(BA.1)」はオミクロン型(B.1.1.529/BA.1)変異株の全長Sタンパク質、「Omicron(BA.2)」はオミクロン型(BA.2) 変異株の全長Sタンパク質を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
 
 
　この結果と実施例６の結果から、本発明のニワトリ抗体が、オミクロン型を含む全ての変異型シュードウイルスのヒト細胞への侵入を顕著に阻害すること、すなわち、全ての変異型シュードウイルスに対して高い中和活性を有することが示された。
生ウイルスに対する中和試験
１．ニワトリ抗体の作製
　本実施例において、免疫原としては実施例１と同じRBDのポリペプチドを用いた。免疫動物としては、卵用品種のニワトリであるボリスブラウンを用いた。
　免疫は、上記RBDポリペプチド10～25μg/羽を、アジュバントとともに、ニワトリの胸部筋肉内に投与することにより行った。具体的には、免疫原を、2週間おきに3回、3回目の投与から約1ヶ月後に4回目の投与、4回目の投与から約3ヶ月後に5回目の投与というスケジュールで計５回（初回25μg/羽、2-4回目10μg/羽、5回目25μg/羽）投与した。
　実施例１より大きなスケールでニワトリポリクローナル抗体を取得するため、上記免疫は数百羽のニワトリに対して行った。免疫した数百羽のニワトリの卵から、無作為に約100個の卵を選択し、当該約100個の卵を1ロットとした。複数のロットのそれぞれについて卵黄をプール（混合）し、実施例１と同様の方法でニワトリポリクローナル抗体を精製した。
　このようにして複数のロットの精製ニワトリポリクローナル抗体を得た。
２．RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験
　上記１．で得られた複数のロットのニワトリ抗体について、実施例３と同様に、野生型（WT）のRBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験を行い、その結合阻害活性を確認した。
３．生ウイルスに対する中和試験
（１）使用したニワトリ抗体及び試験の概要
　本中和試験においては、上記２．において結合阻害活性を有することが確認できたロットのうち、代表例として、複数のロットのニワトリ抗体（以下「IgY1」～「IgY5」）、及び実施例２～６で用いたロット#I22のニワトリ抗体（以下「IgY6」）を使用した。
　本中和試験の試験方法は、国立感染症研究所「COVID-19 血清学的検査マニュアル」を基本とした。具体的には、上記ニワトリ抗体のロットIgY1～IgY6の希釈液（IgY1～IgY5については120倍希釈、IgY6については180倍希釈）と、100TCID50/50μLに濃度調整したSARS-CoV-2浮遊液とを等量混合し、37℃で１時間作用させ、IgY1～IgY6の中和抗体価を測定した。
（２）使用したウイルス
　本実施例において、「生ウイルス」（live virus）とは、生きた細胞に感染し増殖することができるウイルスのことをいう。
　本実施例において、SARS-CoV-2の生ウイルスとしては、次のウイルス株を用いた。
　(i) SARS-CoV-2 JPY/JPY/TY/WK-521 野生型株
　(ii) SARS-CoV-2 QHN001（VOC-202012/01系統株）アルファ型変異株
　(iii) SARS-CoV-2 TY8-612 （B.1.351系統株）ベータ型変異株
　(iv) SARS-CoV-2 TY7-503 （501Y.V3、P.1系統株）ガンマ型変異株
　(v) SARS-CoV-2 TY11-927（B.1.617.2 系統株）デルタ型変異株
　また、本実施例においては、VeroE6/TMPRSS2細胞（JCRB1819）を用いた。
（３）ウイルス浮遊液の調製
　上記SARS-CoV-2のウイルス浮遊液は、次のようにして調製した。
　(i) 細胞増殖培地［ダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク株式会社）に10％量の牛胎児血清、ペニシリン（100U/ｍL）、ストレプトマイシン（100μg/ｍL）、ジェネティシン（G418）（1mg/ｍL）を添加］を用い、VeroE6/TMPRSS2細胞を組織培養フラスコ内に単層培養した。
　(ii) 細胞培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、各種SARS-CoV-2を接種し、細胞維持培地［ダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク株式会社）に2％量の牛胎児血清、ペニシリン（100U/ｍL）、ストレプトマイシン（100μg/ｍL）、ジェネティシン（G418）（1mg/ｍL）を添加］を加えて37℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（CO2濃度：5％）内で3日間培養した。
　(iii) 3日間培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化（細胞変性効果：CPE）が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離（3500rpm/min、10min）し、得られた上清を試験ウイルス浮遊原液とした。
（４）中和抗体価の測定
　細胞増殖培地を用い、VeroE6/TMPRSS2細胞を組織培養用マイクロプレート（平底96穴）内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き、細胞維持培地で洗浄し、細胞維持培地を取り除いた。
　次に、1.5倍で段階希釈したIgY1～IgY6の希釈液100μLをそれぞれ4穴に接種し、37℃±1℃の炭酸ガスインキュベーター（CO2濃度：5％）内で3日間培養した。
　培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化（細胞変性効果：CPE）の有無を観察し、上清を除去し細胞を固定し水洗した。
　固定した細胞を染色・水洗後、2穴以上でCPE出現が抑制された最高希釈倍数を算出し、当該最高希釈倍数と抗体量から中和に必要な抗体濃度を算出し、これを中和抗体価とした。この試験を2回繰り返した。
　その結果、IgY1～IgY6はいずれも、上記生ウイルスの全てに対して中和活性を示した。このうち、代表例としてIgY2及びIgY4についての中和抗体力価（neutralizing antibody titer(μg/ml)）を表７及び図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　この結果から、本発明のニワトリ抗体は、SARS-CoV-2変異株の生ウイルスに対して中和活性を有することが示された。
　すなわち、本発明のニワトリ抗体は、SARS-CoV-2の野生株又は変異株によるコロナウイルス感染症の治療又は予防に極めて有効であることが示された。
生ウイルスに対する中和試験
１．ニワトリ抗体の作製
　本実施例に用いるニワトリ抗体は、実施例８に記載の方法と同様の方法により調製した。
２．RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験
　上記１．で得られた複数のロットのニワトリ抗体について、実施例３と同様に、野生型（WT）のRBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験を行い、その結合阻害活性を確認した。
３．生ウイルスに対する中和試験
（１）使用したニワトリ抗体及び試験の概要
　本中和試験においては、上記２．において結合阻害活性を有することが確認できたロットのうち、代表例として、複数のロットのニワトリ抗体（以下「IgY7」～「IgY10」）、及び実施例２～８で用いたロット#I22のニワトリ抗体（IgY6）を使用した。
　本中和試験の試験方法は、国立感染症研究所「COVID-19 血清学的検査マニュアル」を基本とした。具体的には、上記ニワトリ抗体のロットIgY6～IgY10の希釈液（150倍希釈）と、100TCID50/50μLに濃度調整したSARS-CoV-2浮遊液とを等量混合し、37℃で１時間作用させ、IgY6～IgY10の中和抗体価を測定した。
（２）使用したウイルス
　本実施例において、「生ウイルス」（live virus）とは、生きた細胞に感染し増殖することができるウイルスのことをいう。
　本実施例において、SARS-CoV-2の生ウイルスとしては、次のウイルス株を用いた。
　(i) SARS-CoV-2 JPY/JPY/TY/WK-521 野生型株
　(ii) SARS-CoV-2 TY11-927（B.1.617.2 系統株）デルタ型変異株
　(iii) SARS-CoV-2 TY38-873 （BA.1系統株）オミクロン型変異株
　また、本実施例においては、VeroE6/TMPRSS2細胞（JCRB1819）を用いた。
（３）ウイルス浮遊液の調製
　上記SARS-CoV-2のウイルス浮遊液は、次のようにして調製した。
　(i) 細胞増殖培地［ダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク株式会社）に10％量の牛胎児血清、ペニシリン（100U/ｍL）、ストレプトマイシン（100μg/ｍL）、ジェネティシン（G418）（1mg/ｍL）を添加］を用い、VeroE6/TMPRSS2細胞を組織培養フラスコ内に単層培養した。
　(ii) 細胞培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、各種SARS-CoV-2を接種し、細胞維持培地［ダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク株式会社）に2％量の牛胎児血清、ペニシリン（100U/ｍL）、ストレプトマイシン（100μg/ｍL）、ジェネティシン（G418）（1mg/ｍL）を添加］を加えて37℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（CO2濃度：5％）内で3日間培養した。
　(iii) 3日間培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化（細胞変性効果：CPE）が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離（3500rpm/min、10min）し、得られた上清を試験ウイルス浮遊原液とした。
（４）中和抗体価の測定
　細胞増殖培地を用い、VeroE6/TMPRSS2細胞を組織培養用マイクロプレート（平底96穴）内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き、細胞維持培地で洗浄し、細胞維持培地を取り除いた。
　次に、1.5倍で段階希釈したIgY7～IgY11の希釈液100μLをそれぞれ4穴に接種し、37℃±1℃の炭酸ガスインキュベーター（CO2濃度：5％）内で3日間培養した。
　培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化（細胞変性効果：CPE）の有無を観察し、上清を除去し細胞を固定し水洗した。
　固定した細胞を染色・水洗後、2穴以上でCPE出現が抑制された最高希釈倍数を算出し、当該最高希釈倍数と抗体量から中和に必要な抗体濃度を算出し、これを中和抗体価とした。この試験を2回繰り返した。
　その結果、IgY6～IgY10はいずれも、上記生ウイルスの全てに対して中和活性を示した。このうち、代表例としてIgY6(ロット#I22)についての中和抗体力価（neutralizing antibody titer(μg/ml)）を表８及び図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
 
　この結果及び実施例８の結果から、本発明のニワトリ抗体は、オミクロン株を含むSARS-CoV-2変異株の生ウイルスに対して中和活性を有することが示された。
　すなわち、本発明のニワトリ抗体は、SARS-CoV-2の野生株又は変異株によるコロナウイルス感染症の治療又は予防に極めて有効であることが示された。
ニワトリ抗体の他種動物由来抗体に対する優位性
　本実施例では、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する阻害活性について、ニワトリ抗体が、他種動物由来の抗体と比較して優れた効果を示すかについて試験した。
　具体的には、本実施例では、(i)本発明のニワトリ抗体、(ii) RBDポリペプチドを免疫したニワトリ血漿、(iii) マウス血漿、(iv) ワクチン接種者及びオミクロン型流行前の感染者の血漿を用いて、実施例３～５と同様に、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対するこれらの抗体又は血漿の阻害（中和）活性について試験した。この試験においては、野生型のRBDポリペプチドに対する上記(i)～(iv)の抗体又は血漿のIC50値を「1」としたときの、変異型RBDポリペプチドに対する当該抗体又は血漿のIC50値の割合を算出し比較を行った。血漿のIC50値は、50%の阻害活性が認められる希釈倍率を示すものであるため、希釈倍率が高いほど、すなわちIC50値が高いほど阻害活性が高いことを示す。上記(i)の本発明のニワトリ抗体についても、血漿と同様に希釈倍率に基づいてIC50値を算出した。
　変異型RBDポリペプチドとしては、デルタ型、及びオミクロン型(BA.1)のRBDポリペプチドを用いた。また、実施例２～５で用いた野生型（WT）のRBDポリペプチドを用いた。
　本発明のニワトリ抗体としては、実施例８で用いた精製方法と同様の方法で精製した10種類のロットのニワトリ抗体を用いた。RBDポリペプチドを免疫して得られた血漿としては、13匹のマウスの血漿および12羽のニワトリの血漿を用いた。ヒト血漿としては15人の検体を用いた。
　上記変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合阻害試験の方法は、実施例３～５に記載された方法と同じ方法を用いた。マウス血漿とニワトリ血漿は、64倍希釈した希釈液を2倍段階希釈して用いた。ヒト血漿は2倍希釈した希釈液を、2倍段階希釈して用いた。
　また、本実施例においては、変異型RBDポリペプチドとヒトACE2との結合に対する本発明の抗体および血漿による阻害率を計算した。当該阻害率の計算においては、各RBDポリペプチドのみを添加したウェルを陽性対照とし、本発明の抗体もしくは血漿のみを添加したウェルを陰性対照として用いた。
　その結果、マウス血漿及びヒト血漿は、デルタ型RBDポリペプチドには野生型と同等の阻害活性を示すが、オミクロン型RBDポリペプチドへの阻害活性は低下する傾向が見られた。これに対し、ニワトリ抗体(IgY)及びニワトリ血漿は、デルタ型とオミクロン型に対する阻害活性が、野生型に対する阻害活性と比較して、同等の活性を有する傾向が見られた。
　各検体の結果を平均した結果を図９及び表９に示す。ニワトリ抗体(IgY)及びニワトリ血漿は、野生型と比較してデルタ型及びオミクロン型(BA.1)においても同等の阻害活性が示された。一方、マウス血漿及びヒト血漿は、オミクロン型で活性の低下が示された。
　表９は、野生型のRBDポリペプチドに対する各抗体又は血漿のIC50値を「1」とした場合の、デルタ型及びオミクロン型(BA.1)RBDポリペプチドに対する各抗体又は血漿のIC50値の相対値の平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　ニワトリ抗体(IgY)を用いた場合のIC50値は、デルタ型に対しては0.95、オミクロン型に対しては0.97であり、ニワトリ血漿を用いた場合のIC50値は、デルタ型に対しては1.03、オミクロン型に対しては1.16であった。マウス血漿を用いた場合のIC50値は、デルタ型に対しては1.03、オミクロン型に対しては0.74であり、ヒト血漿を用いた場合のIC50値は、デルタ型に対しては1.02、オミクロン型に対しては0.68であった。
　RBDポリペプチド内に2つの変異を有するデルタ型に対しては、ニワトリ、マウス及びヒトにおいて阻害活性の低下が示されなかったが、15ヵ所の変異を有するオミクロン型に対しては、マウス及びヒトにおいて阻害活性の低下が示された。
　この結果は、本発明のニワトリ抗体が、他の生物種に免疫することで得られた抗体と比較して、より広範な種類の変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合に対し、中和活性を有する（維持できる）ことを示している。
　本発明により、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合することができる新規ニワトリ抗体を提供することができる。
　配列番号７～４０：合成DNA又は合成ペプチド

Claims (13)

  1. 　変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合する、ニワトリ抗体。
  2. 　変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)とアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を中和することができる、請求項１に記載のニワトリ抗体。
  3. 　変異型コロナウイルスが、ACE2を介して細胞に感染するものである、請求項１又は２に記載のニワトリ抗体。
  4. 　野生型コロナウイルスのスパイクタンパク質にさらに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載のニワトリ抗体。
  5. 　ポリクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載のニワトリ抗体。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体を含む、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための組成物。
  7. 　コロナウイルス感染症が、ACE2を介して細胞に感染するコロナウイルスの感染によって引き起こされる疾患又は症状である、請求項６に記載の組成物。
  8. 　前記疾患又は症状が、呼吸器疾患、発熱、倦怠感、悪寒、疼痛、味覚若しくは嗅覚の障害、発疹、消化器症状、言語障害、認知障害及び循環器症状からなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項７に記載の組成物。
  9. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体を含む、変異型コロナウイルスのスパイクタンパク質のRBDとACE2との結合阻害剤。
  10. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体を含む、試薬又はキット。
  11. 　治療上有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体又はこれを含む組成物を被験者に投与する工程を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防方法。
  12. 　コロナウイルス感染症の治療又は予防において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体又はこれを含む組成物。
  13. 　コロナウイルス感染症を治療又は予防するための医薬の製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載のニワトリ抗体の使用。
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