CN112175074A - 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 - Google Patents
基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112175074A CN112175074A CN202011075127.1A CN202011075127A CN112175074A CN 112175074 A CN112175074 A CN 112175074A CN 202011075127 A CN202011075127 A CN 202011075127A CN 112175074 A CN112175074 A CN 112175074A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igy
- egg yolk
- antibodies
- coronavirus
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 title claims description 11
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 claims abstract description 4
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 42
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 42
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 36
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 21
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 7
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 6
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N sodium oxide Chemical compound [O-2].[Na+].[Na+] KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910001948 sodium oxide Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 5
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 claims description 3
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 claims description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 claims 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 abstract description 8
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 abstract description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000002769 b effector cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
- A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了基于基因重组抗Covid‑19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,包括以下步骤:S1:新冠病毒S蛋白基因的克隆表达:S2:抗原的制备,通过生物反应器进行昆虫细胞的Baculovirus‑Insect Cell(杆状病毒昆虫细胞)表达、His‑tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93%;S3:动物的选择,选择高产母鸡,鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳;S4:对选择的动物进行免疫,使用油佐剂、免疫增强剂免疫。本发明通过构建和表达S蛋白,纯化获得高纯度抗原蛋白免疫母鸡,使鸡蛋中持续产生特异性的针对S蛋白的特异性卵黄抗体,经过纯化提取针对SARS‑CoV特异性IgY抗体,制备成喷雾剂,用于人口腔喷雾消毒。
Description
技术领域
本发明涉及抗体产业化应用,特别涉及基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,属于生物技术领域。
背景技术
抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌,被免疫***用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质,仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中,及其B细胞的细胞膜表面,抗体能识别特定外来物的一个独特特征,该外来目标被称为抗原。
在COVID-19中,病毒表面的S蛋白介导受体识别和膜融合,在病毒感染过程中,三聚体S蛋白被切割成S1和S2亚基,S1蛋白的受体结合域(RBD),直接与靶细胞表面受体ACE2的肽酶域(peptidase domain,PD)结合,而S2负责膜融合,但是目前通过无法实现通过构建和表达S蛋白实现对SARS-CoV特异性IgY抗体的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,以解决上述背景技术中提出的目前通过无法实现通过构建和表达S蛋白实现对SARS-CoV特异性IgY抗体的生产的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:包括以下步骤:
S1:新冠病毒S蛋白基因的克隆表达;
S2:抗原的制备,通过生物反应器进行昆虫细胞的Baculovirus-Insect Cell(杆状病毒昆虫细胞)表达、His-tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93%;
S3:动物的选择,选择高产母鸡,鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳;
S4:对选择的动物进行免疫,使用油佐剂、免疫增强剂免疫,免疫的周期为2个月左右,免疫的次数为3次,第三次免疫结束后,时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋;
S5:对母鸡进行抗体的检测,用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度,ELISA测OD(光密度)值,公式为:样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表;
S6:抗体的制备;
S7:抗体含量的测定,抗体纯度的测定;
S8:加入各种添加剂,包括防腐剂和稳定剂。调整IgY含量大于3mg/ml,0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤S1中新冠病毒S蛋白基因的克隆表达,根据已知探针克隆新冠病毒S蛋白基因,首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来,克隆到特定的载体。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤S6中包括一次离心和二次离心,一次离心包括以下步骤:
a1:对收集的鸡蛋进行称重;a2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);a3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;a4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;a5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;a6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理;a:7:对离心处理后的蛋黄进行过滤处理;a8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,并进行定容,定容时长为12小时,a9:对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌;a10:通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
作为本发明的一种优选技术方案,所述二次离心包括以下步骤:b1对收集的鸡蛋进行称重;b2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);b3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;b4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;b5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;b6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理,并在离心时,加入0.45um膜过滤;b7:对上清液加入沉淀剂,搅拌,通过离心机进行二次离心,对二次离心的清液进行溶解沉淀,溶解沉淀时长为至少12小时;b8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量;b9:加入0.22um膜过滤除菌;b10通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤a8中加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,对步骤a7过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂,加入氧化钠试剂和进行沉淀,沉淀后进行定容,保证IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量在90%左右。
作为本发明的一种优选技术方案,所述IgY检测方法,包括电泳、SEC、结合活性、假病毒中和活性、ACE2竞争活性和HPLC法。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,通过构建和表达S蛋白,纯化获得高纯度抗原蛋白免疫母鸡,使鸡蛋中持续产生特异性的针对S蛋白的特异性卵黄抗体,经过纯化提取针对SARS-CoV特异性IgY抗体,制备成喷雾剂,用于人口腔喷雾消毒。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图;
图2为本发明的IgY抗体纯化流程图;
图3为本发明的HPLC法IgY蛋白纯度检测图;
图4为本发明图ELISA法检测SARS-COV2-RBD蛋白和抗体结合活性检测图;
图5为本发明的IgY和SEC活性图
图6为本发明的IgY与RBD S1h结合活性图;
图7为本发明的IgY假病毒中活性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-7,本发明提供了基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用的技术方案:
根据图1-7所示,包括以下步骤:
S1:新冠病毒S蛋白基因的克隆表达;
S2:抗原的制备,通过生物反应器进行昆虫细胞的Baculovirus-Insect Cell(杆状病毒昆虫细胞)表达、His-tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93%;
S3:动物的选择,选择高产母鸡,鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳;
S4:对选择的动物进行免疫,使用油佐剂、免疫增强剂免疫,免疫的周期为2个月左右,免疫的次数为3次,第三次免疫结束后,时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋;
S5:对母鸡进行抗体的检测,用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度,ELISA测OD(光密度)值,公式为:样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表;
S6:抗体的制备;
S7:抗体含量的测定,抗体纯度的测定;
S8:加入各种添加剂,包括防腐剂和稳定剂。调整IgY含量大于3mg/ml,0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。
步骤S1中新冠病毒S蛋白基因的克隆表达,根据已知探针克隆新冠病毒S蛋白基因,首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来,克隆到特定的载体。
步骤S6中包括一次离心和二次离心,一次离心包括以下步骤:a1:对收集的鸡蛋进行称重;a2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);a3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;a4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;a5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;a6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理;a:7:对离心处理后的蛋黄进行过滤处理;a8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,并进行定容,定容时长为12小时,a9:对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌;a10:通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
二次离心包括以下步骤:
b1对收集的鸡蛋进行称重;b2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);b3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;b4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;b5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;b6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理,并在离心时,加入0.45um膜过滤;b7:对上清液加入沉淀剂,搅拌,通过离心机进行二次离心,对二次离心的清液进行溶解沉淀,溶解沉淀时长为至少12小时;b8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量;b9:加入0.22um膜过滤除菌;b10通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
步骤a8中加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,对步骤a7过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂,加入氧化钠试剂和进行沉淀,沉淀后进行定容,保证IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量在90%左右。
IgY检测方法,包括电泳、SEC、结合活性、假病毒中和活性、ACE2竞争活性和HPLC法。
在本发明的描述中,需要理解的是,指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系,除非另有明确的限定,对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于,包括以下步骤:
S1:新冠病毒S蛋白基因的克隆表达;
S2:抗原的制备,通过生物反应器进行昆虫细胞的Baculovirus-Insect Cell(杆状病毒昆虫细胞)表达、His-tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93%;
S3:动物的选择,选择高产母鸡,鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳;
S4:对选择的动物进行免疫,使用油佐剂、免疫增强剂免疫,免疫的周期为2个月左右,免疫的次数为3次,第三次免疫结束后,时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋;
S5:对母鸡进行抗体的检测,用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度,ELISA测OD(光密度)值,公式为:样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表;
S6:抗体的制备;
S7:抗体含量的测定,抗体纯度的测定;
S8:加入各种添加剂,包括防腐剂和稳定剂,调整IgY含量大于3mg/ml,0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。
2.根据权利要求1所述的基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于:所述步骤S1中新冠病毒S蛋白基因的克隆表达,根据已知探针克隆新冠病毒S蛋白基因,首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来,克隆到特定的载体。
3.根据权利要求1所述的基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于:所述步骤S6中包括一次离心和二次离心,一次离心包括以下步骤:
a1:对收集的鸡蛋进行称重;a2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);a3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;a4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;a5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;a6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理;a:7:对离心处理后的蛋黄进行过滤处理;a8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,并进行定容,定容时长为12小时,a9:对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌;a10:通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
4.根据权利要求3所述的基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于:所述二次离心包括以下步骤:
b1对收集的鸡蛋进行称重;b2:配PBS(磷酸缓冲盐溶液);b3:将鸡蛋打到玻璃器皿中,且将蛋黄与蛋清分离;b4:对分离的蛋黄进行搅拌,搅拌时长控制在0.5小时;b5:对搅拌的蛋黄进行沉淀,沉淀时间控制为0.5小时;b6:对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理,并在离心时,加入0.45um膜过滤;b7:对上清液加入沉淀剂,搅拌,通过离心机进行二次离心,对二次离心的清液进行溶解沉淀,溶解沉淀时长为至少12小时;b8:加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量;b9:加入0.22um膜过滤除菌;b10通过巴斯德消毒,控制消毒时间为0.5小时,消毒后进行灌装打包。
5.根据权利要求3所述的基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于:所述步骤a8中加入添加剂,调节IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量,对步骤a7过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂,加入氧化钠试剂和进行沉淀,沉淀后进行定容,保证IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)含量在90%左右。
6.根据权利要求1所述的基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用,其特征在于:所述IgY检测方法,包括电泳、SEC、结合活性、假病毒中和活性、ACE2竞争活性和HPLC法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011075127.1A CN112175074A (zh) | 2020-10-09 | 2020-10-09 | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011075127.1A CN112175074A (zh) | 2020-10-09 | 2020-10-09 | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112175074A true CN112175074A (zh) | 2021-01-05 |
Family
ID=73948963
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011075127.1A Pending CN112175074A (zh) | 2020-10-09 | 2020-10-09 | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112175074A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114699522A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-07-05 | 上海亚健医学科技有限公司 | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 |
WO2023008553A1 (ja) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ | 変異型コロナウイルスに対するニワトリ抗体 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1556113A (zh) * | 2004-01-07 | 2004-12-22 | 珠海百奥生物技术有限公司 | 抗sars冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂 |
CN101100680A (zh) * | 2007-06-15 | 2008-01-09 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 高效表达sars冠状病毒s蛋白的重组杆状病毒及构建 |
CN111411118A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-14 | 鲲羽生物科技(江门)有限公司 | 抗病原高免卵黄抗体及基于aav载体疫苗制备的方法和制剂 |
CN111474344A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-07-31 | 西安国联质量检测技术股份有限公司 | 新型冠状病毒IgY抗体免疫检测试剂的制备方法 |
CN111548413A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-18 | 成都钰康生物科技有限公司 | 一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法与应用 |
CN111574622A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-08-25 | 刘会芳 | 一种抗人新型冠状病毒肺炎的抗体及其制备方法 |
CN111574623A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
-
2020
- 2020-10-09 CN CN202011075127.1A patent/CN112175074A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1556113A (zh) * | 2004-01-07 | 2004-12-22 | 珠海百奥生物技术有限公司 | 抗sars冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂 |
CN101100680A (zh) * | 2007-06-15 | 2008-01-09 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 高效表达sars冠状病毒s蛋白的重组杆状病毒及构建 |
CN111474344A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-07-31 | 西安国联质量检测技术股份有限公司 | 新型冠状病毒IgY抗体免疫检测试剂的制备方法 |
CN111411118A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-14 | 鲲羽生物科技(江门)有限公司 | 抗病原高免卵黄抗体及基于aav载体疫苗制备的方法和制剂 |
CN111574622A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-08-25 | 刘会芳 | 一种抗人新型冠状病毒肺炎的抗体及其制备方法 |
CN111548413A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-18 | 成都钰康生物科技有限公司 | 一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法与应用 |
CN111574623A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FUJITA R.等: "Efficient production of recombinant SARS-CoV-2 spike protein using the baculovirus-silkworm system", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023008553A1 (ja) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ | 変異型コロナウイルスに対するニワトリ抗体 |
CN114699522A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-07-05 | 上海亚健医学科技有限公司 | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111228483A (zh) | 用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂 | |
CN112175074A (zh) | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 | |
CN111548413B (zh) | 一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法与应用 | |
CN107299086A (zh) | 一种抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体及应用 | |
CN103002909A (zh) | 包含含有至少一个cxxc基序的多肽和异源抗原的药物组合物及其用途 | |
CN111471103A (zh) | 一种新冠病毒(2019-nCOV)的异源抗体及其制备方法 | |
US9890206B2 (en) | H1N1 flu virus neutralizing antibodies | |
CN111574623A (zh) | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 | |
CN112724208A (zh) | 一种SADS-CoV重组S蛋白胞外段及其制备方法与应用 | |
CN110272473A (zh) | 甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用 | |
CN102816246B (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN105349499B (zh) | 一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品和用途 | |
CN104548088A (zh) | 一种鸡新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒N-S多表位蛋白二联疫苗制备方法 | |
CN112125832B (zh) | 刺突蛋白受体结合结构域纳米凝胶及其制备方法与应用 | |
CN109111507B (zh) | 病毒重组糖蛋白及其真核细胞高效表达方法与应用 | |
US20210253632A1 (en) | Process for purifying an antibody from egg yolk, products and uses thereof | |
CN105218668B (zh) | 马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用 | |
KR20020020260A (ko) | 서코바이러스를 생장시키거나 생물학적 물질로부터제거하는 방법 | |
CN116327910A (zh) | 一种新冠病毒、流感病毒和/或rsv的联合疫苗、其制备方法与应用 | |
Singh et al. | Blood plasma from survivors of COVID-19: a novel and next frontier approach to fight against pandemic coronavirus | |
Hongo et al. | The functions of oligosaccharide chains associated with influenza C viral glycoproteins: II. The role of carbohydrates in the antigenic properties of influenza C viral glycoproteins | |
US20200231633A1 (en) | MGAT1-Deficient Cells for Production of Vaccines and Biopharmaceutical Products | |
CN100347195C (zh) | 抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法 | |
León et al. | Development and pre-clinical characterization of two therapeutic equine formulations towards SARS-CoV-2 proteins for the potential treatment of COVID-19 | |
CN116621973A (zh) | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体制备及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210105 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |