WO2023002943A1 - がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキット - Google Patents

がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキット Download PDF

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cancer
seq
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俊行 高井
克典 岡田
早希子 熊田
ミジ ソ
章太 遠藤
泰嗣 野津田
遼太 田中
涼子 齊藤
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国立大学法人東北大学
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • Immune checkpoint inhibitors inhibit the transmission of immunosuppressive signals by binding to immune checkpoint molecules or their ligands that suppress immune responses to self and suppress excessive immune responses. It is a drug that releases the suppression of activation of T cells and other cells of the immune system by checkpoint molecules.
  • immune checkpoint inhibitors suppress the transmission of immunosuppressive signals by binding to immune checkpoint molecules or their ligands that have the effect of suppressing immune responses to tumors, T by immune checkpoint molecules Releases suppression of activation of cells and other immune system cells, and exerts anti-tumor effects.
  • LILRB4 Leukocyte Ig-like receptor B4, hereinafter also referred to as B4
  • B4 is an immunosuppressive receptor for an unknown ligand
  • Patent Document 2 reports that the physiological ligand of B4 is fibronectin, and that substances that inhibit the binding of B4 and fibronectin are effective in treating immune checkpoint-related diseases.
  • B4 supports the infiltration of tumor cells into tissues, the onset of acute leukemia is suppressed in B4 knockout cell lines of tumor cells, and tumor-bearing mice with B4 knockout cell lines It has been reported that the survival rate is better than that of the parental tumor-bearing mouse (Non-Patent Document 1).
  • TILs Tumor infiltrating lymphocytes
  • Non-Patent Document 3 the prognosis of patients positive for TIL immunosuppressive receptor PD-1 expression is poor
  • Non-Patent Document 4 the expression level of PD-1 on TIL did not affect the overall survival rate and recurrence-free survival rate
  • the expression of immunosuppressive receptors on TIL is still uncertain.
  • the present invention provides a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients, a method for predicting the prognosis of cancer patients, and a method for predicting the effects of cancer therapeutic agents in cancer patients, comprising LILRB4. , and to provide a kit for predicting the prognosis of cancer patients.
  • LILRB4 or the LILRB4 gene is useful as a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients, and completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients comprising an immunosuppressive receptor LILRB4 or an immunosuppressive receptor LILRB4 gene.
  • the biomarker of [1], wherein the cancer is lung cancer.
  • a method for predicting the prognosis of a cancer patient comprising the step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in a biological sample of the cancer patient.
  • the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the sample, and the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the control is indicative of a poor prognosis for said cancer patient.
  • the step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 is a step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 using an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody or an antibody fragment thereof. , [3] or [4].
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) of the anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody is SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of CDR1 of the chain variable region (hereinafter also referred to as VL) consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • a method for predicting the effect of a substance that inhibits the binding of fibronectin and the immunosuppressive receptor LILRB4 as a cancer therapeutic drug in a cancer patient comprising: A step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene, wherein the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the sample.
  • the fact that the expression level is higher than the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in a control indicates that the cancer therapeutic agent has an effect on the cancer patient. show, how.
  • the method of [10], wherein the cancer is lung cancer.
  • the method of [10] or [11], wherein the substance that inhibits binding between fibronectin and immunosuppressive receptor LILRB4 is an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 antibody.
  • the step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 is a step of measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 using an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody or an antibody fragment thereof. , the method according to any one of [10] to [12].
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) of the anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody is SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of CDR1 of the chain variable region (hereinafter also referred to as VL) consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8.
  • the kit of [15], wherein the cancer is lung cancer.
  • the method of [15] or [16], wherein the reagent for measuring the expression level of the biomarker comprises an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody or an antibody fragment thereof.
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) of the anti-immunosuppressive receptor LILRB4 monoclonal antibody is SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of CDR1 of the chain variable region (hereinafter also referred to as VL) consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the VL The kit of [17], wherein the amino acid sequence of the CDR3 of A consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8.
  • a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients a method for predicting the prognosis of cancer patients, comprising LILRB4 or the LILRB4 gene, a method for predicting the prognosis of cancer patients, and the effects of cancer therapeutic agents in cancer patients.
  • a method for prediction and a kit for predicting the prognosis of cancer patients can be provided.
  • FIG. 10 shows representative examples of LILRB4 immunohistochemical staining of TIL regions in lung adenocarcinoma patients in Experimental Example 4.
  • FIG. The upper figure (No. 9605) shows a micrograph of immunohistochemical staining of a TIL region with low LILRB4 expression
  • the lower figure (No. 0577) shows a micrograph of immunohistochemical staining of a TIL region with high LILRB4 expression.
  • the portion enclosed by the dotted line is the tumor portion, and the portion except for that indicates the TIL region.
  • the left figure shows a 10-fold enlarged photograph
  • the right figure shows a 40-fold enlarged photograph.
  • FIG. 10 is a diagram showing the overall survival rate of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing the recurrence-free survival rates of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 5.
  • FIG. 10 shows representative examples of LILRB4 immunohistochemical staining of TIL regions in lung squamous cell carcinoma patients in Experimental Example 7.
  • FIG. 10 is a diagram showing the overall survival rate of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 9.
  • FIG. 10 is a diagram showing the overall survival rate of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 9.
  • FIG. 10 is a diagram showing the recurrence-free survival rates of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 9.
  • FIG. 10 shows the overall survival rate of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 10.
  • FIG. 10 is a diagram showing the recurrence-free survival rates of the LILRB4 high expression group and the LILRB4 low expression group in Experimental Example 10.
  • the present invention provides a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients consisting of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the LILRB4 gene.
  • LILRB4 The base sequence and amino acid sequence of LILRB4 can be found in the database provided by the US Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI US Center for Biotechnology Information
  • Entrez Gene ID is 11006 (as of June 17, 2019)
  • RefSeq Protein ID is NP_001265355.2, NP_001265356.2, NP_001265357.2, NP_001265357.2, NP_001265356 (isoform NP_0012653502) to 5).
  • Mouse (Mus musculus) LILRB4 includes GeneID 14728 (as of June 24, 2016) and NP_038560.1, and rat (Rattus norvegicus) LILRB4 has GeneID 292594 (as of April 18, 2019).
  • RefSeq ProteinID is NP_001013916, and other animals are also known to have LILRB4.
  • cancer patients with high levels of LILRB4 or LILRB4 gene expression in tumor-infiltrating immune system cells containing TIL have a poor prognosis.
  • the marker for predicting the prognosis of cancer patients is useful for predicting the prognosis of cancer patients and as an appropriate selection index for cancer treatment strategies. For example, by measuring the expression of PD-1 or PD-L1 on the cancer tissue of cancer patients, it is possible to determine whether the patient is an application of an anti-PD-1 inhibitory antibody or an anti-PD-L1 inhibitory antibody.
  • anti-PD-1 inhibitory antibody or PD-L1 inhibitory antibody is expected to be effective for patients with low expression levels of PD-1 and its ligand PD-L1 in cancer tissues. may not be possible.
  • cancer patients with high expression levels of LILRB4 or LILRB4 gene in tumor-infiltrating immune system cells of cancer patients have a poor prognosis. Therefore, cancer patients with high LILRB4 or LILRB4 gene expression on tumor-infiltrating immune system cells are judged to have a poor prognosis.
  • a substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 such as an anti-LILRB4 inhibitory antibody.
  • LILRB4 or the LILRB4 gene is preferably human for predicting the prognosis of cancer patients. That is, the biomarker for predicting the prognosis of cancer patients in this embodiment is preferably human LILRB4 or human LILRB4 gene.
  • the LILRB4 gene may be mRNA of the LILRB4 gene, or cDNA obtained by reverse transcription of the mRNA of the LILRB4 gene.
  • the cancer targeted by the biomarker for predicting the prognosis of cancer in cancer patients of the present embodiment is not particularly limited, but examples thereof include solid cancer, and more specifically, lung cancer. , breast cancer, liver cancer, colon cancer, malignant melanoma, etc., and is preferably used for lung cancer.
  • Lung cancer includes non-small cell lung cancer and small cell lung cancer.
  • Non-small cell lung cancer may be lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • the present invention is a method for predicting the prognosis of a cancer patient, wherein the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in a biological sample of the cancer patient wherein the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the sample is equal to the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor in the control
  • a method is provided wherein a high relative expression level of the somatic LILRB4 gene is indicative of a poor prognosis for said cancer patient.
  • the method of this embodiment can be used to predict the prognosis of cancer patients.
  • the method of this embodiment can also be said to be a method for predicting the prognosis of cancer patients.
  • a poor prognosis means a lower survival rate, a higher rate of cancer recurrence, and the like.
  • a good prognosis means a higher survival rate, a lower rate of cancer recurrence, and the like. That is, the present invention is a method for predicting the prognosis of a cancer patient, comprising measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in a biological sample of the cancer patient.
  • the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the sample is equal to the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the control
  • a method in which an expression level equal to or lower than the expression level of is indicative of a good prognosis for the cancer patient.
  • the method of the present embodiment can be used to select patients for cancer therapy using a substance that inhibits the binding of LILRB4 to fibronectin. That is, in the method of the present embodiment, the application of a substance that inhibits the binding of LILRB4 and fibronectin to patients with high LILRB4 expression or LILRB4 gene expression and a poor prognosis, It can be judged to be effective for cancer treatment.
  • the substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 is not particularly limited as long as it has an activity to inhibit the binding of fibronectin to LILRB4. fibronectin analogs and the like.
  • the method of the present embodiment can be used to predict the effects of cancer therapeutic drugs in cancer patients. That is, in the method of the present embodiment, LILRB4 expression or LILRB4 gene expression is high for patients shown to have a poor prognosis. It can be predicted that the application of substances that do Therefore, the method of the present embodiment can be used as a method for predicting the effect of a substance that inhibits the binding of fibronectin as a cancer therapeutic drug to the immunosuppressive receptor LILRB4 in cancer patients, which will be described later. can.
  • the cancer targeted by the method of the present embodiment is not particularly limited, but examples include solid cancer, more specifically lung cancer, breast cancer, liver cancer, and the like. It is preferably used.
  • Lung cancer includes non-small cell lung cancer and small cell lung cancer.
  • Non-small cell lung cancer may be lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • the biological samples of cancer patients include, in addition to tumor specimens collected by biopsy or surgery, blood such as serum, plasma or whole blood of cancer patients, lymph fluid, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, body cavity fluids, digestive fluids, nasal mucus, tears, sweat, urine and the like.
  • the biological sample may be a biological sample itself collected from a cancer patient, or may be a sample obtained by subjecting the collected biological sample to processing such as dilution and concentration that are usually performed.
  • the biological sample may be one collected or prepared at the time of performing the measuring method, or one previously collected or prepared and stored.
  • LILRB4 Specific binding substances for LILRB4 include antibodies, antibody fragments, aptamers, and the like. Antibodies that specifically bind to LILRB4 (hereinafter also referred to as anti-LILRB4 antibodies) can be produced, for example, by immunizing animals such as mice with LILRB4 or fragments thereof as antigens. Alternatively, it can be generated, for example, by screening a phage library.
  • the expression level of LILRB4 reflects the expression level of LILRB4 to which fibronectin binds, so that the binding of LILRB4 and fibronectin is more accurately inhibited. This is because the patient to whom the substance is applied can be selected.
  • Human LILRB4 containing a signal sequence consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the human LILRB4 signal sequence is from the 1st methionine to the 23rd alanine in SEQ ID NO: 1, and the mature human LILRB4 is from the 24th glycine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to the 258th tryptophan.
  • consists of the amino acid sequence of Fibronectin, a ligand of LILRB4 can bind to human LILRB4 via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in fibronectin. That is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the target sequence of human LILRB4 in fibronectin.
  • monoclonal antibodies For the production of monoclonal antibodies, known methods for producing monoclonal antibodies, for example, Kamei Nagamune and Hiroshi Terada, “Monoclonal Antibodies” Hirokawa Shoten (1990), James W. et al. Golding, “Monoclonal Antibody”, 3rd edition, Academic Press, 1996. Monoclonal antibodies can also be produced by the DNA immunization method, which is described in Nature 1992 Mar 12; 356 152-154 and J. Am. Immunol Methods Mar 1; 249 147-154.
  • a LILRB4 protein, a partial fragment (peptide) thereof, or a vector incorporating a cDNA encoding the LILRB4 protein can be used.
  • the full-length LILRB4 vector which is a construct containing the full-length LILRB4 gene, is the optimal antigen gene for immunization. Constructs can also be used as antigen genes for immunization.
  • the partial region of the human LILRB4 sequence is preferably a region of LILRB4 where the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which is the target sequence of human LILRB4 in fibronectin, binds to human LILRB4 (fibronectin binding site).
  • various gene introduction methods e.g., intramuscular injection, electroporation, gene gun, etc.
  • immunize animals mae, or It can be carried out by subcutaneously injecting into rats, etc.
  • the antibody fragment is preferably an antibody fragment comprising an antigen-binding portion, such as F(ab') 2 , F(ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv, variants thereof, fusions comprising antibody portions Proteins, fusion peptides, and the like can be mentioned.
  • the antibody fragment can be produced according to a known antibody fragment production method.
  • an antibody “specifically binds” means that LILRB4 binds to LILRB4 without substantially binding to other different polypeptides.
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) is represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the light chain variable region (hereinafter , also referred to as VL) consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of CDR3 of VL is an anti-LILRB4 monoclonal antibody consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of VL is represented by SEQ ID NO: 10 An anti-LILRB4 monoclonal antibody, etc., comprising an amino acid sequence can be mentioned.
  • the anti-LILRB4 monoclonal antibody can be used after further purification if necessary.
  • Techniques for purifying and isolating the anti-LILRB4 monoclonal antibody include conventionally known methods, for example, salting-out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex or the like, ion-exchange chromatography, affinity purification using a protein A column, and the like. etc.
  • An aptamer is a substance that has specific binding ability to a target substance.
  • Aptamers include nucleic acid aptamers, peptide aptamers, and the like.
  • Nucleic acid aptamers having specific binding ability to the target peptide can be selected by, for example, systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to the target peptide can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • Method for measuring expression level of LILRB4 or LILRB4 gene As a method for measuring the expression level of LILRB4, an immunological measuring method such as ELISA, Western blotting, or immunohistochemical staining using the aforementioned specific binding substance to LILRB4 can be used. As a method for measuring the expression level of the LILRB4 gene, microarray, RT-PCR, quantitative RT-PCR and the like can be used.
  • an immunological measurement method using an anti-LILRB4 monoclonal antibody after reacting LILRB4 in a biological sample with the anti-LILRB4 monoclonal antibody or antibody fragment thereof, a label is bound to the anti-LILRB4 monoclonal antibody or antibody fragment thereof.
  • the labeled antibody or labeled antibody fragment is added to generate an immune complex consisting of LILRB4, the anti-LILRB4 monoclonal antibody or antibody fragment thereof, and the labeled antibody or labeled antibody fragment, and the generated immune complex
  • Examples thereof include an immunological measurement method for LILRB4 in a biological sample, which measures the amount of labeling in the sample.
  • the immunological measurement method includes enzyme immunoassay (EIA or ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA), depending on the labeling of the labeled detection antibody. ), electrochemiluminescence immunoassay, immunohistochemical staining, etc., and any of these can be used in the immunological measurement method. Immunohistochemical staining is preferred because it allows easy and rapid measurement of the target to be detected.
  • LILRB4 in the biological sample can be measured by measuring the label in the immune complex.
  • LILRB4 in a biological sample can be measured by reacting a labeling enzyme with a substrate of the enzyme and measuring the absorbance of the colored product (sandwich method).
  • an unlabeled anti-LILRB4 monoclonal antibody or antibody fragment thereof (primary antibody) is added, and this unlabeled LILRB4 in a biological sample can also be measured by further adding an enzyme-labeled secondary antibody to an antibody (secondary antibody) against the antibody or its antibody fragment and measuring the label of the secondary antibody.
  • the secondary antibody is labeled with biotin, bound with enzyme-labeled avidin or streptavidin to biotin, the secondary antibody is labeled with an enzyme or the like, and the label of the secondary antibody is measured.
  • LILRB4 can also be measured in biological samples.
  • an unlabeled anti-LILRB4 monoclonal antibody or antibody fragment thereof is added to LILRB4 immobilized on a solid support or a conjugate of LILRB4 and a protein such as BSA, and LILRB4 and primary antibody are added to the solid support.
  • a biological sample is added, a secondary antibody labeled with an antibody (secondary antibody) against this unlabeled antibody is added, and the labeled secondary antibody is labeled.
  • LILRB4 in a biological sample can also be measured by measuring (competitive method).
  • the step of measuring the expression level of the LILRB4 gene in the biological sample can be performed by RT-PCR, quantitative RT-PCR, etc. using a primer set capable of amplifying the LILRB4 gene.
  • the expression level of the LILRB4 gene may be measured by DNA microarray analysis, northern blotting, or the like using a probe that specifically hybridizes to the mRNA of the LILRB4 gene.
  • the mRNA of the LILRB4 gene has the nucleotide sequence described in the RefSeq database entry identified by the above ID.
  • the mRNA of the LILRB4 gene is not limited to that specified by the above-mentioned RefSeq ID.
  • the mRNA of the LILRB4 gene in the biological sample can be detected.
  • the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to the mRNA of the LILRB4 gene.
  • the probes may be immobilized on a carrier to constitute a DNA microarray or the like.
  • the prognosis of cancer patients can be predicted by contacting the DNA microarray described above with mRNA extracted from cancer patient tissues and detecting LILRB4 gene mRNA hybridized to the probe.
  • the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the biological sample is higher than the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in the control, the prognosis of the cancer patient is bad. That is, when the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the biological sample is higher than the LILRB4 or LILRB4 gene expression level in the control, the prognosis of the cancer patient is poor. can be determined.
  • the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the cancer patient's biological sample is equal to or lower than the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in the control. It indicates that the prognosis of cancer patients is good. That is, when the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the cancer patient's biological sample is equal to or lower than the LILRB4 or LILRB4 gene expression level in the control, the prognosis of the cancer patient is improved. It can be determined to be good.
  • Controls include, for example, biological samples derived from healthy individuals, blood such as serum, plasma or whole blood derived from healthy individuals, lymph, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, body cavity fluid, digestive fluid, nasal mucus, tears, sweat and urine.
  • blood such as serum, plasma or whole blood derived from healthy individuals
  • lymph interstitial fluid
  • cerebrospinal fluid cerebrospinal fluid
  • body cavity fluid body cavity fluid
  • digestive fluid nasal mucus, tears, sweat and urine.
  • a normal tissue derived from a cancer patient and the like can be mentioned.
  • the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene is higher in the tumor-infiltrating immune system cells in the cancer patient's biological sample than the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the control.
  • an expression level of LILRB4 or the LILRB4 gene that is equal to or lower than that in the control indicates that the prognosis of the cancer patient is good.
  • a reference value is set in advance based on the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in a control, and a higher LILRB4 or LILRB4 gene expression level than the reference value indicates that the prognosis of the cancer patient is poor. , and being equal to or lower than the reference value may indicate that the prognosis of the cancer patient is good.
  • the control may be LILRB4 or the average expression level of the LILRB4 gene in the TIL regions of multiple cancer patients.
  • the average value of the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in the TIL region of multiple cancer patients is obtained in advance, and this is set as a reference value, and the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene is higher than the reference value.
  • the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene is higher than the reference value.
  • Tumor-infiltrating immune system cells are immune system cells found in tumors, including tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), bone marrow-derived suppressor cells (MDSC), tumor-associated macrophages (TAM), tumor-associated neutrophils (TAN), Tumor-infiltrating dendritic cells and the like can be mentioned.
  • TILs include intratumoral tumor-infiltrating lymphocytes (Intratumoral TIL) and intrastromal tumor-infiltrating lymphocytes (Stromal TIL).
  • the TIL region means the tumor stroma where tumor-infiltrating immune system cells containing TIL are found.
  • TIL regions in biological samples are evaluated qualitatively and quantitatively by microscopic examination of histopathological specimens of tumor specimens (hematoxylin and eosin (HE) stained specimens, immunohistochemically stained specimens, etc.) and cell analysis by flow cytometry. can do.
  • the TIL region is preferably a stromal region that is not a tumor region, ie, a region where mononuclear cell infiltration is observed.
  • TIL regions are also rich in stroma-associated granulocytes, tertiary lymphoid structures, i.e., follicular or distal lymphocyte aggregates with germinal centers, areas with necrosis, tumor borders. ie, outside the paratumor stromal area, other than areas such as TIL areas found in normal lung tissue.
  • Non-small cell lung carcinoma (NSCLC, most of which are adenocarcinoma and squamous cell carcinoma to be resected) has also been reported to have a better prognosis as the number of stromal TILs increases. .
  • NSCLC Non-small cell lung carcinoma
  • the number of immune cells in the tumor site reflects the treatment response and prognosis of cancer-bearing patients.
  • the prognosis of cancer patients is poor.
  • the present invention provides a method for predicting the effect of a substance that inhibits the binding of fibronectin and immunosuppressive receptor LILRB4 as a cancer therapeutic drug in cancer patients, wherein the cancer measuring the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in a patient's biological sample, The expression level of the sex receptor LILRB4 gene is higher than the expression level of the immunosuppressive receptor LILRB4 or the immunosuppressive receptor LILRB4 gene in the control, and the cancer therapeutic drug is effective for the cancer patient A method is provided that shows that the
  • the method of the present embodiment can be used to predict the effect of a substance that inhibits the binding of fibronectin and the immunosuppressive receptor LILRB4 as a cancer drug in cancer patients. That is, the method of the present embodiment can also be said to be a method of predicting the effect of a substance that inhibits the binding of fibronectin as a cancer therapeutic drug to the immunosuppressive receptor LILRB4 in cancer patients.
  • a poor prognosis means a lower survival rate, a higher rate of cancer recurrence, and the like.
  • the cancer targeted by the method of the present embodiment is not particularly limited, but examples include solid cancer, more specifically lung cancer, breast cancer, liver cancer, and the like. It is preferably used.
  • Lung cancer includes non-small cell lung cancer and small cell lung cancer. Non-small cell lung cancer may be lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • the cancer patient's biological sample and the control are the same as those used in the method for predicting the prognosis of the cancer patient, and the expression level of LILRB4 in the cancer patient's biological sample is
  • the step of measuring and the step of measuring the expression level of the LILRB4 gene in the cancer patient's biological sample are the same as the steps in the method for predicting the prognosis of the cancer patient.
  • the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in the tumor-infiltrating immune system cells in the biological sample of the cancer patient is higher than the expression level of the LILRB4 or LILRB4 gene in the control.
  • a substance that inhibits the binding of fibronectin and the immunosuppressive receptor LILRB4 as a cancer therapeutic agent administered to patients is shown to be effective for cancer patients. That is, when the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in tumor-infiltrating immune system cells in a biological sample of a cancer patient is higher than the expression level of LILRB4 or LILRB4 gene in a control, the cancer therapeutic agent is It can be expected to have an effect on the cancer patients.
  • the substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 is not particularly limited as long as it has an activity to inhibit the binding of fibronectin to LILRB4.
  • Anti-fibronectin antibodies , anti-LILRB4 antibodies, fibronectin analogues, and the like are particularly limited as long as it has an activity to inhibit the binding of fibronectin to LILRB4.
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the light chain variable region (hereinafter referred to as The amino acid sequence of CDR1 of VL) consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of CDR3 of VL consists of , an anti-human LILRB4 monoclonal antibody consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence of VH consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of VL being represented by SEQ ID NO: 10
  • An anti-human LILRB4 monoclonal antibody which consists of an amino acid sequence, and the like can be mentioned.
  • the fibronectin analogue includes any fibronectin analogue as long as it has an inhibitory effect on the binding of fibronectin to LILRB4. , any one of the following (a) to (c) peptides.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) contains an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and against the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4 a peptide capable of binding, (c) a peptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the ability to bind to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4;
  • the identity of the above amino acid sequences is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more.
  • the number of deletions, substitutions or additions in the above amino acid sequence is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, even more preferably 1 to 3, even more preferably 1 to 2.
  • Amino acid sequence identity can be determined by BLAST searches provided on the GenBank database.
  • the fibronectin analog may be a fibronectin analog in which any one of the peptides (a) to (c) and the Fc region of immunoglobulin G are fused.
  • the cells were suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 8.0), sonicated and centrifuged to collect inclusion bodies containing exB4.
  • the resulting inclusion bodies were solubilized with a denaturing buffer (6 M guanidine-HCl, 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 8.0).
  • denatured exB4 solution was added dropwise to refolding buffer (100 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0.4 M L-arginine-HCl, 0.5 mM oxidized glutathione) at 4°C.
  • the refolded exB4 was dialyzed against PBS(-) and used as an immunogen.
  • the value of SUVmax in the FDG-PET test is significantly higher in the LILRB4 high expression group, and the LILRB4 high expression group has a high degree of malignancy and is determined to have a poor cancer prognosis. be able to.
  • the LILRB4 high-expressing group also had a significantly higher number of patients with positive vascular invasion, which is a factor of poor prognosis.
  • the result was that multiple poor prognostic factors were observed in the LILRB4 high expression group.
  • FN30-Fc mouse IgG2a Fc recombinant protein
  • LILRB4 reporter cells were harvested from cultures and kept on ice until the start of the study. 5 ⁇ 10 4 B4 reporter cells were suspended in 50 ⁇ L of hybridoma culture supernatant containing anti-LILRB4 monoclonal antibody and incubated on ice for 30 minutes with gentle mixing every 10 minutes. LILRB4 reporter cells were then added directly to FN30-Fc coated or uncoated 96-well plates without washing. Next, the medium containing 60 ⁇ g/mL recombinant human ApoE (manufactured by Novoprotein, #CI02) (10% FBS, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, 0.1 U/ml penicillin, RPMI- 1640) was added to the LILRB4 reporter cells.
  • LILRB4 reporter cells 50 ⁇ L of medium without human ApoE was added to the LILRB4 reporter cells. Plates were then centrifuged at 400 xg for 3 minutes to attach the LILRB4 reporter cells to the bottom of the plate. LILRB4 reporter cells were incubated at 37° C. for 24 hours, GFP protein expression levels were measured by flow cytometry BDFACSAria TM III (BD Biosciences), and data were analyzed with FlowJo TM software (BD Biosciences). As a result, anti-human LILRB4 monoclonal antibody #10 was confirmed to have a good effect of inhibiting the binding of fibronectin and ApoE to human LILRB4.
  • mRNA was extracted by a conventional method from the hybridoma strain producing anti-human LILRB4 monoclonal antibody #10, and the VH and VL nucleotide sequences of anti-human LILRB4 monoclonal antibody #10 were determined by the dideoxy method, and their nucleotide sequences were determined. determined the amino acid sequence encoded by Furthermore, amino acid sequences corresponding to the CDR regions were specified among the obtained amino acid sequences, and the base sequences and amino acid sequences of VH and VL were defined as CDR regions.
  • the amino acid sequence of CDR1 of VH of anti-human LILRB4 monoclonal antibody #10 consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of CDR1 of VL consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL consists of SEQ ID NO: 7
  • the amino acid sequence of CDR3 of VL was determined to consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8.

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Abstract

免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備える、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備える、がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法、及び、前記バイオマーカーの発現量を測定するための試薬を含む、がん患者の予後を予測するためのキット。

Description

がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキット
　本発明は、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキットに関する。
　本願は、２０２１年７月２０日に、日本に出願された特願２０２１－１１９７５７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、免疫チェックポイント阻害剤を用いる癌免疫療法が注目されている。免疫チェックポイント阻害薬とは、自己に対する免疫応答を抑制し、過剰な免疫反応を抑制する作用を有する免疫チェックポイント分子もしくはそのリガンドに結合して、免疫抑制シグナルの伝達を阻害することで、免疫チェックポイント分子によるＴ細胞および他の免疫系細胞の活性化抑制を解除する薬剤である。癌免疫療法において、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍に対する免疫応答を抑制する作用を有する免疫チェックポイント分子もしくはそのリガンドに結合して免疫抑制シグナルの伝達を抑制することで、免疫チェックポイント分子によるＴ細胞および他の免疫系細胞の活性化抑制を解除し、抗腫瘍作用を発現する。
　特許文献１には、未知のリガンドに対する免疫抑制性受容体であるＬＩＬＲＢ４（白血球Ｉｇ様受容体（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｉｇ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｂ４、以下、Ｂ４とも称する）を用いることにより、感染又は自己免疫に由来する炎症性疾患を判定できることが報告されている。
　特許文献２には、Ｂ４の生理的リガンドが、フィブロネクチンであり、Ｂ４とフィブロネクチンの結合を阻害する物質が、免疫チェックポイント関連疾患の治療に有効であることが報告されている。
　また、Ｂ４については、急性白血病に関し、Ｂ４が組織への腫瘍細胞の浸潤をサポートし、腫瘍細胞のＢ４ノックアウト細胞株では急性白血病の発症は抑えられ、Ｂ４ノックアウト細胞株の担がんマウスは、親株の担がんマウスと比較して生存率が良好であることが報告されている（非特許文献１）。
　腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ　ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；以下、ＴＩＬとも称する）は、腫瘍内に認められるリンパ球であり、ステージＩ～IIIの非小細胞肺がん患者群では、がん組織中でのＴＩＬ数の増加と、良好な予後とは有意に相関することが報告されている（非特許文献２）。
　免疫抑制受容体のＴＩＬ上の発現と、がんの予後の関係については、腎細胞癌においては、ＴＩＬ上の免疫抑制受容体ＰＤ－１発現陽性患者の予後が悪いという報告（非特許文献３）があるが、ＴＩＬ上のＰＤ－１の発現量は、全生存率及び無再発生存率に影響を与えなかったという報告（非特許文献４）もあり、ＴＩＬ上の免疫抑制受容体の発現が、がんの予後と関係があるか否かについては未だ未確定である。
特開２０１８－２５５５４号公報 国際公開第２０２１／０２９３１８号
Nature. 2018 Oct;562(7728):605-609. Hum Pathol. 2018. 79,188-198 J Clin Med. 2019.24;8:743. Onco Targets Ther. 2020.9;13:215-224.
　本発明は、ＬＩＬＲＢ４からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子が、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー。
［２］　前記がんが、肺がんである、［１］に記載のバイオマーカー。
［３］　がん患者の予後を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん患者の予後が不良であることを示す、方法。
［４］　前記がんが、肺がんである、［３］に記載の方法。
［５］　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程である、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、［３］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］　前記がん患者が、がん治療薬を投与したがん患者である、［３］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］　前記がん治療薬が、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質である、［７］に記載の方法。
［９］　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体である、［８］に記載の方法。
［１０］　がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん治療薬が、前記がん患者に対して効果を有することを示す、方法。
［１１］　前記がんが、肺がんである、［１０］に記載の方法。
［１２］　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体である、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程である、［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、［１３］に記載の方法。
［１５］　［１］又は［２］に記載のバイオマーカーの発現量を測定するための試薬を含む、がん患者の予後を予測するためのキット。
［１６］　前記がんが、肺がんである、［１５］に記載のキット。
［１７］　前記バイオマーカーの発現量を測定するための試薬が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、［１７］に記載のキット。
　本発明によれば、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキットを提供することができる。
実験例４における、肺腺がん患者における、ＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４免疫組織化学染色の代表例を示した図である。上図（Ｎｏ．９６０５）がＬＩＬＲＢ４低発現のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の顕微鏡写真、下図（Ｎｏ．０５７７）がＬＩＬＲＢ４高発現のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の顕微鏡写真をそれぞれ示す。点線で囲った部分が腫瘍部分であり、それ例外の部分が、ＴＩＬ領域を示す。上図、下図とも、左図が１０倍拡大写真、右図が４０倍拡大写真を示す。 実験例５における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の全生存率を示した図である。 実験例５における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の無再発生存率を示した図である。 実験例７における、肺扁平上皮がん患者における、ＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４免疫組織化学染色の代表例を示した図である。上図がＬＩＬＲＢ４高発現のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の顕微鏡写真、中図が、ＬＩＬＲＢ４が中程度発現のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の顕微鏡写真、下図がＬＩＬＲＢ４低発現のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の顕微鏡写真をそれぞれ示す。点線で囲った部分が拡大した部分を示す。なお、上図、中図、下図とも、左から順に４０倍拡大写真、２００倍拡大写真、４００倍拡大写真をそれぞれ示す。 実験例９における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の全生存率を示した図である。 実験例９における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の無再発生存率を示した図である。 実験例１０における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の全生存率を示した図である。 実験例１０における、ＬＩＬＲＢ４高発現群とＬＩＬＲＢ４低発現群の無再発生存率を示した図である。
［がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー］
　１実施形態において、本発明は、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカーを提供する。
　ＬＩＬＲＢ４の塩基配列及びアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により提供されているデータベースから知ることができる。ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）ＬＩＬＲＢ４の場合、例えばＥｎｔｒｅｚ　ＧｅｎｅＩＤは１１００６（２０１９年６月１７日時点）、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿００１２６５３５５．２、ＮＰ＿００１２６５３５６．２、ＮＰ＿００１２６５３５７．２、ＮＰ＿００１２６５３５８．２、ＮＰ＿００１２６５３５９．２（アイソフォーム１～５に相当）が挙げられる。マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＬＩＬＲＢ４としては、ＧｅｎｅＩＤは１４７２８（２０１６年６月２４日時点）、ＮＰ＿０３８５６０．１が挙げられ、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＬＩＬＲＢ４としては、ＧｅｎｅＩＤは２９２５９４（２０１９年４月１８日時点）、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿００１０１３９１６が挙げられ、他の動物もＬＩＬＲＢ４を有することが知られている。
　実施例において後述するように、本発明者らは、ＴＩＬを含む腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が多いがん患者は、予後が不良であることを見出した。
　したがって、本実施形態のがん患者の予後を予測するためのマーカーは、がん患者の予後の予測や、がんの治療方針の適切な選択指標として有用である。例えば、がん患者のがん組織上のＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１の発現を測定することによって、抗ＰＤ－１阻害抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１阻害抗体の適用患者であるかを判断することが行われているが、がん組織において、ＰＤ－１や、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１の発現量が低い患者に対しては、抗ＰＤ－１阻害抗体又はＰＤ－Ｌ１阻害抗体の奏功が期待できない可能性がある。しかしながら、実施例において後述するように、がん患者の腫瘍浸潤免疫系細胞において、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高い患者は、予後が不良であることが見出された。したがって、腫瘍浸潤免疫系細胞上のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現が高いがん患者であれば、予後が不良と判断されるため、腫瘍浸潤免疫系細胞上のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現が高い患者に対しては、抗ＬＩＬＲＢ４阻害抗体等のフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を選択することが好ましいと判断される。
　本実施形態のがん患者の予後を予測するためのバイオマーカーにおいて、がん患者の予後の予測のためには、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子は、ヒトのものであることが好ましい。すなわち、本実施形態のがん患者の予後を予測するためのバイオマーカーは、ヒトＬＩＬＲＢ４又はヒトＬＩＬＲＢ４遺伝子であることが好ましい。
　本実施形態のがん患者の予後を予測するためのバイオマーカーにおいて、ＬＩＬＲＢ４遺伝子は、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡであってもよいし、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡであってもよい。
　また、本実施形態のがん患者のがんの予後を予測するためのバイオマーカーが対象とするがんとしては、特に限定されないが、例えば固形がんが挙げられ、より具体的には、肺がん、乳がん、肝臓がん、大腸がん、悪性黒色腫等が挙げられるが、肺がんに対して好ましく用いられる。肺がんとしては、非小細胞肺がん、小細胞肺がんが挙げられる。非小細胞肺がんは、肺腺がんであっても、肺扁平上皮がんであってもよい。
［がん患者の予後を予測するための方法］
　１実施形態において、本発明は、がん患者の予後を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん患者の予後が不良であることを示す、方法を提供する。
　本実施形態の方法は、がん患者の予後を予測するために用いることができる。すなわち、本実施形態の方法は、がん患者の予後の予測方法であるということもできる。本実施形態の方法において、予後が不良であるとは、生存率がより低いこと、がんを再発する割合が高いこと等を意味する。反対に、本実施形態の方法において、予後が良好であるとは、生存率がより高いこと、がんを再発する割合が低いこと等を意味する。すなわち、本発明は、がん患者の予後を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と同等又は低いことが、前記がん患者の予後が良好であることを示す、方法を包含する。
　また、本実施形態の方法は、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する物質を用いるがん治療の適用患者を選択するために用いることができる。すなわち、本実施形態の方法において、ＬＩＬＲＢ４の発現又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現が高く、予後が不良であることが示された患者に対しては、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する物質の適用が、がん治療に有効と判断することができる。フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質としては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質であれば特に制限はないが、後述する抗フィブロネクチン抗体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体、フィブロネクチンアナログ等が挙げられる。
　また、本実施形態の方法は、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するために用いることができる。すなわち、本実施形態の方法において、ＬＩＬＲＢ４の発現又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現が高く、予後が不良であることが示された患者に対しては、がん治療薬として、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する物質の適用が、がん患者に対して効果を有すると予測することができる。したがって、本実施形態の方法は、後述する、がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法として用いることができる。
　本実施形態のがん患者の予後を予測するための方法において、対象とするがん患者としては、がん治療薬を投与したがん患者であってもよい。すなわち、本実施形態のがん患者の予後を予測するための方法において、がん治療薬を投与した生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、がん治療薬を投与する前のがん患者の生体試料と比較して低ければ、がん治療薬を投与した患者は、予後が良好であると予測することができる。したがって、本発明のがん患者の予後を予測するための方法は、がん治療薬を投与したがん患者における、がん治療薬の効果を評価するために用いることができる。がん治療薬としては、がんに対する治療薬であれば特に制限はないが、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、分子標的薬等が挙げられる。前記免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ－１阻害抗体、抗ＰＤ－Ｌ１阻害抗体、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質等が挙げられるが、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質は、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量が高い患者に対して、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害することにより治療効果を発揮するため好ましい。フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質としては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質であれば特に制限はないが、後述する抗フィブロネクチン抗体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体、フィブロネクチンアナログ等が挙げられる。
　本実施形態の方法が対象とするがんとしては、特に限定されないが、例えば固形がんが挙げられ、より具体的には、肺がん、乳がん、肝臓がん等が挙げられるが、肺がんに対して好ましく用いられる。肺がんとしては、非小細胞肺がん、小細胞肺がんが挙げられる。非小細胞肺がんは、肺腺がんであっても、肺扁平上皮がんであってもよい。
　本実施形態の方法において、がん患者の生体試料としては、生検や手術により採取された腫瘍検体のほか、がん患者の血清、血漿又は全血等の血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗及び尿等が挙げられる。また、前記生体試料は、がん患者から採取した生体試料そのものであっても、採取した生体試料に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。また、生体試料は、前記測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
　生体試料中のＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程は、ＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合物質を用いた、ＥＬＩＳＡ等の免疫化学的測定方法、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、フローサイトメトリーを用いた細胞解析等により行うことができる。また、ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程は、マイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。
（特異的結合物質）
　ＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。ＬＩＬＲＢ４に特異的に結合する抗体（以下、抗ＬＩＬＲＢ４抗体とも称する）は、例えば、マウス等の動物にＬＩＬＲＢ４又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。
　抗ＬＩＬＲＢ４抗体としては、ＬＩＬＲＢ４と結合する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
　抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体は、ＬＩＬＲＢ４に特異的に結合する。抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体は、ＬＩＬＲＢ４と特異的に結合するモノクローナル抗体であれば、いずれでもよく、ＬＩＬＲＢ４とそのリガンドである、フィブロネクチンとの結合を阻害する抗体であっても、阻害しない抗体であってもいずれでもよいが、本発明のがん患者の予後を予測するための方法を用いてＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する物質を用いるがん治療の適用患者を選択する場合は、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する抗体が好ましい。これは、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する抗体を用いた場合、ＬＩＬＲＢ４の発現量は、フィブロネクチンが結合するＬＩＬＲＢ４の発現量を反映するため、より正確に、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合を阻害する物質を適用する患者を選択することができるからである。
　シグナル配列を含むヒトＬＩＬＲＢ４は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。なお、ヒトＬＩＬＲＢ４シグナル配列は配列番号１において１番目のメチオニンから２３番目のアラニンまでであり、成熟ヒトＬＩＬＲＢ４は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２４番目のグリシンから、２５８番目のトリプトファンまでのアミノ酸配列からなる。ＬＩＬＲＢ４のリガンドである、フィブロネクチンは、フィブロネクチン中の配列番号２で表されるアミノ酸配列を介して、ヒトＬＩＬＲＢ４と結合することができる。すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒトＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン中の標的配列である。
　モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「モノクローナル抗体」廣川書店（１９９０年）や、Ｊａｍｅ　Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６年に従い作製することができる。また、ＤＮＡ免疫法によりモノクローナル抗体を作製することもでき、Ｎａｔｕｒｅ　１９９２　Ｍａｒ１２；３５６　１５２－１５４やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍａｒ　１；２４９　１４７－１５４を参考に作製することができる。
　抗ＬＩＬＲＢ４抗体作製に用いられる抗原としては、ＬＩＬＲＢ４タンパク質、又はその一部断片（ペプチド）、或いはＬＩＬＲＢ４タンパクをコードするｃＤＮＡを組み込んだベクターを用いることができる。ＬＩＬＲＢ４の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るために、ＬＩＬＲＢ４全長遺伝子が入った構築物である全長ＬＩＬＲＢ４ベクターが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、ＬＩＬＲＢ４配列の一部領域が挿入された構築物も、免疫用抗原遺伝子として使用できる。ヒトＬＩＬＲＢ４配列の一部領域としては、フィブロネクチン中のヒトＬＩＬＲＢ４の標的配列である、配列番号２で表されるアミノ酸配列が、ヒトＬＩＬＲＢ４に結合するＬＩＬＲＢ４の領域（フィブロネクチン結合部位）が好ましい。ＤＮＡ免疫法は、上記遺伝子構築物を単独又は混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃など）のいずれかを用いて、動物（マウス、又はラット等）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。
　前記抗体断片としては、抗原結合部分を含む抗体断片が好ましく、例えば、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド等を挙げることができる。前記抗体断片は、公知の抗体断片の製造方法に従って製造することができる。
　本明細書において、抗体が「特異的に結合する」とは、ＬＩＬＲＢ４は異なる他のポリペプチドに実質的に結合することなく、ＬＩＬＲＢ４に結合することを意味する。
　抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体としては、例えば、重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体、ＶＨのアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体等が挙げられる。
　抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体は、必要に応じてそれをより精製して使用することができる。抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法等が挙げられる。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
（ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量の測定方法）
　ＬＩＬＲＢ４の発現量の測定方法としては、上述のＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合物質を用いた、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等の免疫学的測定方法により行うことができる。また、ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量の測定方法としては、マイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。
　抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体を用いる免疫学的測定方法としては、生体試料中のＬＩＬＲＢ４と、前記抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片とを反応させた後、前記抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片に標識が結合した標識化抗体又は標識化抗体断片を添加し、ＬＩＬＲＢ４、前記抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片、及び前記標識化抗体又は標識化抗体断片からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、生体試料中のＬＩＬＲＢ４の免疫学的測定方法等が挙げられる。
　前記免疫学的測定方法としては、前記標識化検出抗体の標識により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ) 、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ、免疫組織化学染色等に分類され、これらのいずれも前記免疫学的測定方法に用いることができるが、液相の試料に対してＥＬＩＳＡが、組織切片などの固体試料については免疫組織化学染色が、簡便且つ迅速に検出対象を測定することができ好ましい。
　上記免疫複合体を洗浄後、免疫複合体中の標識を測定することにより、生体試料中のＬＩＬＲＢ４を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡの場合、標識である酵素と当該酵素の基質とを反応させ、発色した生成物の吸光度を測定することにより、生体試料中のＬＩＬＲＢ４を測定することができる（サンドイッチ法）。また、固体支持体に固定した抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片と生体試料中のＬＩＬＲＢ４とを反応させた後、非標識抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加し、この非標識抗体又はその抗体断片に対する抗体（二次抗体）に酵素標識した標識化二次抗体をさらに添加し、当該二次抗体の標識を測定することにより、生体試料中のＬＩＬＲＢ４を測定することもできる。また、当該二次抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンと結合させて、当該二次抗体を酵素等で標識し、当該二次抗体の標識を測定することにより生体試料中のＬＩＬＲＢ４を測定することもできる。
　また、固体支持体に固定したＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４とＢＳＡ等の蛋白質とのコンジュゲートに、非標識抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナ抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加して、固体支持体に、ＬＩＬＲＢ４と一次抗体とからなる免疫複合体を生成させた後、生体試料を添加し、さらに、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を標識化した二次抗体を添加し、当該標二次抗体の標識を測定することにより、生体試料中のＬＩＬＲＢ４を測定することもできる（競合法）。
　前記固体支持体としては、抗体又は抗体断片を安定に保持できるものであれば特に制限はない。固体支持体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。固体支持体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられる。
　前記標識としては、ＥＬＩＳＡでは、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ等の酵素と各酵素で発光物質に変化する発光基質、及びルシフェリン、エクオリン等の発光物質を用いることができる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子を標識として用いることもできる。
　ＥＬＩＳＡにおいて、標識となる酵素の基質は、酵素がパーオキシダーゼの場合３、３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＤＡＢ)、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＴＭＢ)、Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ(ＯＰＤ)等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ(ｐＮＰＰ)等を用いることができる。
　また、生体試料中のＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程は、ＬＩＬＲＢ４遺伝子を増幅可能なプライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。あるいは、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定してもよい。
（プライマーセット）
　ＬＩＬＲＢ４遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。
　ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡは、上述したＩＤで特定されるＲｅｆＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡは上述したＲｅｆＳｅｑ　ＩＤで特定されるものに限られるものではない。
　例えば、がん患者の生体試料に用い、前記プライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ等を行うことにより、生体試料中のＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。
（プローブ）
　プローブとしては、ＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、がん患者の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、がん患者の予後を予測することができる。
　本実施形態の方法では、生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん患者の予後が不良であることを示す。すなわち、生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高い場合には、前記がん患者の予後が不良であると判定することができる。また、本実施形態の方法では、がん患者の生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と同等又は低ければ、前記がん患者の予後が良好であることを示す。すなわち、がん患者の生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と同等又は低い場合には、前記がん患者の予後が良好であると判定することができる。
　対照としては、例えば、健常人由来の生体試料、例えば、健常人由来の血清、血漿又は全血等の血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗及び尿がん患者由来の正常組織等が挙げられる。前記対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して、がん患者の生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高いことが、前記がん患者の予後が不良であり、上記対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して同等又は低いことが、前記がん患者の予後が良好であることを示す。あるいは、予め対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高いことが、前記がん患者の予後が不良であり、当該基準値と同等又は低いことが、前記がん患者の予後が良好であることを示すとしてもよい。また、対照としては、複数のがん患者のＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量の平均値であってもよい。例えば、予め複数のがん患者のＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量の平均値を求めて、これを基準値として設定し、当該基準値と比較してＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高いことが、前記がん患者の予後が不良であり、当該基準値と同等又は低いことが、前記がん患者の予後が良好であることを示すとしてもよい。
　腫瘍浸潤免疫系細胞とは、腫瘍内に認められる免疫系細胞で、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ），腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、腫瘍浸潤樹状細胞等が挙げられる。ＴＩＬとしては、腫瘍内腫瘍浸潤リンパ球（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ　ＴＩＬ）ならびに間質内腫瘍浸潤リンパ球（Ｓｔｒｏｍａｌ　ＴＩＬ）が挙げられる。なお、本明細書において、ＴＩＬ領域とは、ＴＩＬを含む腫瘍浸潤免疫系細胞が見られる腫瘍間質を意味する。生体試料中のＴＩＬ領域は、腫瘍検体の病理組織標本（ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色標本、免疫組織化学染色標本等）の検鏡やフローサイトメトリーによる細胞解析等により質的・量的に評価することができる。ＴＩＬ領域は、腫瘍領域ではない間質領域、すなわち単核細胞の浸潤が観察される領域が好ましい。また、ＴＩＬ領域は、間質関連顆粒球の豊富な領域、三次リンパ構造、すなわち、胚中心を有する濾胞性リンパ球凝集体または遠位リンパ球凝集体の領域、壊死がある領域、腫瘍の境界、すなわち、傍腫瘍間質領域の外側、正常肺組織中に見られるＴＩＬ領域等の領域以外がより好ましい。
　非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；　Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ、切除対象となる腺がんや扁平上皮がんがその大部分を占める）についても、ｓｔｒｏｍａｌ　ＴＩＬが多いほど予後が良いことが報告されている。
　このように、腫瘍局所の免疫細胞の数が、担がん患者の治療反応性や予後を反映することが明らかになっている。実施例で後述するように、がん患者の生体試料中のＴＩＬが多くても、ＴＩＬを含む腫瘍浸潤免疫系細胞上のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高ければ、がん患者の予後が不良となることが示される。すなわち、がん患者の生体試料中のＴＩＬが多くても、ＴＩＬを含む腫瘍浸潤免疫系細胞上のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が高ければ、がん患者の予後が不良と判定することができる。
［がん治療薬の効果を予測するための方法］
　１実施形態において、本発明は、がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん治療薬が、前記がん患者に対して効果を有することを示す、方法を提供する。
　本実施形態の方法は、がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するために用いることができる。すなわち、本実施形態の方法は、がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果の予測方法であるということもできる。本実施形態の方法において、予後が不良であるとは、生存率がより低いこと、がんを再発する割合が高いこと等を意味する。本実施形態の方法が対象とするがんとしては、特に限定されないが、例えば固形がんが挙げられ、より具体的には、肺がん、乳がん、肝臓がん等が挙げられるが、肺がんに対して好ましく用いられる。肺がんとしては、非小細胞肺がん、小細胞肺がんが挙げられる。非小細胞肺がんは、肺腺がんであっても、肺扁平上皮がんであってもよい。
　本実施形態の方法において、がん患者の生体試料及び対照は、前記がん患者の予後を予測するための方法において用いるものと同じであり、がん患者の生体試料中のＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程、及びがん患者の生体試料中のＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程は、前記がん患者の予後を予測するための方法における前記工程と同様である。
　本実施形態の方法では、がん患者の生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、がん患者に投与するがん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、がん患者に対して有効であることを示す。すなわち、がん患者の生体試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照におけるＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高い場合には、前記がん治療薬は前記がん患者に対して効果を有すると予測することができる。
　本実施形態の方法において、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質としては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質であれば特に制限はないが、抗フィブロネクチン抗体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体、フィブロネクチンアナログ等が挙げられる。
　抗ＬＩＬＲＢ４抗体としては、例えば、重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体、ＶＨのアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体等が挙げられる。
　本実施形態のがん治療薬の効果を予測するための方法において、フィブロネクチンアナログとしては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する作用を有していれば、いかなるフィブロネクチンのアナログも包含するが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
　上記アミノ酸配列の同一性は、８０％以上であるが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、上記のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加の数は、１～５個が好ましく、１～４個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１～２個がさらに好ましい。アミノ酸配列の同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
　前記フィブロネクチンアナログとしては、前記（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドと免疫グロブリンＧのＦｃ領域とが融合したフィブロネクチンアナログであってもよい。
［がん患者の予後を予測するためのキット］
　１実施形態において、本発明は、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカーの発現量を測定するための試薬を含む、がん患者の予後を予測するためのキットを提供する。本実施形態のキットは、本発明のがん患者の予後を予測するための方法に用いることができる。
　本実施形態のキットにより、がん患者の予後を予測することができる。また、がんの治療方針の適切な選択指標を得ることができる。本実施形態のがん患者の予後を予測するためのキットは、がんの予後予測用診断薬であるということもできる。本実施形態のがん患者の予後を予測するためのキットが対象とするがんとしては、特に限定されないが、例えば固形がんが挙げられ、より具体的には、肺がん、乳がん、肝臓がん等が挙げられるが、肺がんに対して好ましく用いられる。肺がんとしては、非小細胞肺がん、小細胞肺がんが挙げられる。非小細胞肺がんは、肺腺がんであっても、肺扁平上皮がんであってもよい。
（バイオマーカーの発現量を測定するための試薬）
　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカーの発現量を測定するための試薬としては、上述したＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合物質、ＬＩＬＲＢ４遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ等が挙げられる。ＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合物質としては、前記抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその抗体断片、アプタマー等が挙げられる。ＬＩＬＲＢ４遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＬＩＬＲＢ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブとしては、上述した、プライマーセット、プローブ等が挙げられる。
　本実施形態のキットには、公知の免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、又はＲＴ－ＰＣＲ用の試薬等、例えば、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、並びに測定に必要な器具、コントロール、対照のＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量の基準値を示した基準書等をさらに含んでいてもよい。
　本実施形態のがん患者の予後を予測するためのキットは、がん治療薬を投与したがん患者の予後を予測するために用いることもできるため、本実施形態のキットは、がん治療薬を投与した患者における、がん治療薬の効果を評価するための方法に用いることもできる。例えば、本実施形態のキットを用いてがん患者の予後を予測し、予後が不良と予測されたがん患者に対してがん治療薬を投与して治療を行い、治療後に本実施形態のキットを用いてがん患者の予後を再度予測し、予後が良好であることが示されれば、がん患者に対して投与したがん治療薬は効果があると評価することができる。また、本実施形態のがん患者の予後を予測するためのキットは、本発明のがん治療薬としてのフィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法に用いることもできる。例えば、本実施形態のキットを用いてがん患者の予後を予測し、予後が不良と予測されたがん患者に対しては、がん治療薬として、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質を適用することが、がん治療効果があると予測することができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］非小細胞肺がん患者の予後評価
　非小細胞肺がん患者４０例（年齢平均値６８歳、３５％が女性）の組織試料について、病理学的予後因子とされる、ＳＵＶｍａｘ、ＥＧＦＲ変異（ＥＧＦＲ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）、分化度（Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ）、リンパ節転移（Ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ）、脈管侵襲（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）、リンパ管侵襲（Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）、胸膜浸潤（Ｐｌｅｕｒａｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）の有無等を調べた。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実験例で用いた組織試料は、切除例であるため早期肺がんが多かった。そのため、表１に示したように、全例がＩ期もしくはII期であった。また、平均腫瘍径は３０ｍｍであった。
　がん細胞はブドウ糖代謝が活発であることから、擬似ブドウ糖に放射性標識をした１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース；ＦＤＧ）を投与したときのがん細胞で取り込みが多くなる。このＦＤＧの体内分布を画像化して診断を行う検査がＦＤＧ－ＰＥＴ検査であり、ＦＤＧ－ＰＥＴ検査において、患者体積で標準化した後の最高値がＳＵＶｍａｘである。ＳＵＶｍａｘの良悪性の閾値は、２程度とする報告が多い。表１に示したように、本実験例における組織試料では、ＳＵＶｍａｘは、４．７であった。
　ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、細胞の増殖に関わるタンパク質の一つであり、ＥＧＦＲ遺伝子に変異が起こると、異常のあるＥＧＦＲが作られ、必要のないときにも細胞が増殖し、がんが発生しやすくなると考えられている。一般に、ＥＧＦＲ変異が高くなると、がん患者の予後が不良となることが知られている。表１に示したように、本実験例における組織試料では、ＥＧＦＲ変異が認められたのは全体の３１．６％であった。
　分化度（Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ）とは、がんの起源である細胞（肺胞上皮細胞）の形態をどれだけ保っているかを示す指標である。Ｇ１からＧ３になるにつれて分化度が低くなり、Ｇ４は未分化である。高分化がんは肺胞上皮細胞に近い形態だが、分化度が低くなるにつれて異形性が上がり、一般的には悪性度も高くなる。表１に示したように、本実験例における生体試料では、Ｇ１が４２．１％、Ｇ２が４２．１％、Ｇ３が１５．８％、Ｇ４が０％であった。
　脈管侵襲（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）及びリンパ管侵襲（Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）とは、腫瘍組織内の微小な血管やリンパ管内に腫瘍浸潤があるかを示すものであり、これらがあると同じ病期でも予後が不良となることが知られている。胸膜浸潤（Ｐｌｅｕｒａｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ）とは、肺表面の胸膜に浸潤があるかどうかを示すものであり、胸膜はリンパ球が豊富なので、胸膜浸潤があると同じ病期でもがんの予後が不良となることが知られている。表１に示したように、本実験例においては、脈管侵襲がある患者は、全体の４２．５％、リンパ管侵襲がある患者は、全体の２０．０％、胸膜浸潤がある患者は、全体の３２．５％であった。
［実験例２］組換えヒトＬＩＬＲＢ４の製造
　Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化されたコドンである、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＬＩＬＲＢ４の１５６番目のイソロイシンがシステインに置換され、１６６番目のヒスチジンがシステインに置換されたヒトＬＩＬＲＢ４の細胞外ドメイン（２４番目のグリシンから２１９番目のグリシンまで；以下、ｅｘＢ４とも称する）のｃＤＮＡを、化学合成し、ｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入し、プラスミドｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮ／ｅｘＢ４（Ｉ１５６Ｃ／Ｈ１６６Ｃ）を構築した。
　このプラスミドをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、得られたＬＩＬＲＢ４ｃＤＮＡ断片を、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ－ＮｃｏＩ間をＧｌｙ－×６　Ｈｉｓ　ｔａｇ－Ａｌａに改変したｐＥＴ－２６ＭのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドｐＥＴ－２６Ｍ／ｅｘＢ４（Ｉ１５６Ｃ／Ｈ１６６Ｃ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクトし、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することによりＬＩＬＲＢ４タンパク質の発現を誘導した。大腸菌を培養した後、菌体を溶解緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理し、遠心分離をして、ｅｘＢ４を含む封入体を採取した。得られた封入体を変性バッファー（６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で可溶化した。ｅｘＢ４をリフォールディングするために、変性したｅｘＢ４溶液をリフォールディングバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．４Ｍ　Ｌ－アルギニン－ＨＣｌ、０．５ｍＭ　酸化型グルタチオン）に、４℃で滴下した。リフォールディングされたｅｘＢ４をＰＢＳ（－）に透析し、免疫原とした。
［実験例３］抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の作製
　ヒトＬＩＬＲＢ４特異的モノクローナル抗体は、マウス腸骨リンパ節法（Ｙ　Ｓａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｃｔａ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３９：８９－９４、２００６）を使用して、実験例２で得られたｅｘＢ４でマウスを免疫することにより作製した。次に、以下の組換えタンパク質を用いたＥＬＩＳＡで、モノクローナル抗体含有培養上清をスクリーニングすることにより、ヒトＬＩＬＲＢ４特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択した。次に、選択されたヒトＬＩＬＲＢ４特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養し、得られた培養液から、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体を得た。
組換えヒトＬＩＬＲＢ１（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１６０１４－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＢ２（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１４１３２－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＢ３（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１１９７８－Ｊ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＢ４（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１６７４２－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＢ５（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１７２２１－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＡ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃９２２６－Ｔ４－０５０）
組換えヒトＬＩＬＲＡ２（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃９０４０－Ｔ４－０５０）
組換えヒトＬＩＬＲＡ３（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃１３５４９－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＡ４（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、　＃１６０５８－Ｈ０８Ｈ）
組換えヒトＬＩＬＲＡ５（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃８９５６－Ｔ４－０５０）
組換えヒトＬＩＬＲＡ６（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、＃９０８８－Ｔ４－０５０）
組換えマウスＬＩＬＲＢ４（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃９０９５－Ｔ４－０５０）
　ＥＬＩＳＡは、Ｆ（ａｂ’）２マウス抗６×Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（アイティーエム社製、クローンＮｏ．２１－４８）を捕捉抗体として使用し、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ（アイティーエム社製）を検出抗体として用いて行った。
［実験例４］非小細胞肺がん患者のＴＩＬ領域上のＬＩＬＲＢ４の発現の評価（１）
　ヤギ抗ＬＩＬＲＢ４ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、実験例１で用いた非小細胞肺がん患者４０例のＳｔｒｏｍａｌ　ＴＩＬ領域の免疫組織化学染色を行い、ＬＩＬＲＢ４の発現量を、２人の検者がダブルブラインドで評価した。乳がんで一般的に用いられている方法に倣い、ＬＩＬＲＢ４陽性細胞数は、腫瘍間質面積中に占めるＬＩＬＲＢ４陽性細胞の面積の割合によって以下の０－５の陽性細胞スコアに分類して評価した。
０：１％未満
１：１％以上５％未満
２：５％以上１０％未満
３：１０％以上２０％未満
４：２０％以上５０％未満
５：５０％以上
　図１に、肺腺がんのＬＩＬＲＢ４の免疫組織化学染色の代表例を示した。Ｎｏ．９６０５は腫瘍細胞を除いた間質におけるＬＩＬＲＢ４陽性細胞はほとんど認められず、「ゼロ」と評価した。それに対して、Ｎｏ．０５７７は、間質の面積におけるＬＩＬＲＢ４陽性細胞数を２０％以上５０％未満と判定し、「４」と評価した。
　実験例１で用いたがん患者の組織試料４０例において、ＬＩＬＲＢ４のＴＩＬ領域の免疫組織化学染色の評価の中央値は２であったので、腫瘍間質面積に占めるＬＩＬＲＢ４陽性細胞面積が１０％未満（陽性細胞スコア：０～２）を低発現群、腫瘍間質面積に占めるＬＩＬＲＢ４陽性細胞面積が１０％以上（陽性細胞スコア：３以上）を高発現群とした。低発現群と高発現群のそれぞれについて、実験例１と同様にして、病理学的予後因子とされる、ＳＵＶｍａｘ、ＥＧＦＲ変異（ＥＧＦＲ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）、分化度、リンパ節転移、脈管侵襲、リンパ管侵襲、胸膜浸潤の有無等を調べた。その結果を表２に示す。上記４０例のうち、高発現群は９例、低発現群は３１例で、それぞれの項目の患者数や割合は表２に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示したように、ＦＤＧ－ＰＥＴ検査におけるＳＵＶｍａｘの値はＬＩＬＲＢ４高発現群で有意に高値であり、ＬＩＬＲＢ４高発現群は、悪性度が高く、がんの予後が不良であると判定することができる。また、予後不良因子である脈管侵襲の陽性者もＬＩＬＲＢ４高発現群で有意に多かったことから、今回の解析は早期肺がんが対象で全体的に予後が良く、両群間で差がつきにくいと推測される中ではあるが、ＬＩＬＲＢ４高発現群で予後不良因子が複数認められる結果であった。この結果から、がん患者のＴＩＬ領域の腫瘍浸潤免疫系細胞における、ＬＩＬＲＢ４の発現を調べることにより、がん患者の予後を予測できることが明らかとなった。
　なお、ＥＧＦＲ変異と組織型において、有意差が認められたが、日本人肺腺がん患者において、ＥＧＦＲ変異は約５０％で認められるが、扁平上皮がんでは５％以下と報告されている。今回の検討においても、ＥＧＦＲ変異と組織型について、同様の傾向が見られた。
　表２に示したように、ＬＩＬＲＢ４高発現群において、肺扁平上皮がん患者の割合が７７．８％と高かった。このことから、肺扁平上皮がんにおいては、ＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４発現が高いことが明らかとなった。
［実験例５］非小細胞肺がん患者の予後の解析
　実験例１の患者において、ＬＩＬＲＢ４高発現群と低発現群について、全生存率（全患者に対する、全患者から死亡患者を除く患者数の割合）、無再発生存率（全患者に対する、死亡患者及び再発患者を除く患者数の割合）を調べた。全生存率を図２Ａに、無再発生存率を図２Ｂに示す。
　図２Ａ及び図２Ｂに示したように、全生存率及び無再発生存率ともに有意差は認められなかったが、全期間で全生存率、無再発生存率いずれもＬＩＬＲＢ４低発現群の方が上回っていた。この結果からも、ＴＩＬ領域においてＬＩＬＲＢ４が高発現している場合は、がん患者の予後が不良となると考えられる。
［実験例６］抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体のＬＩＬＲＢ４－ＬＩＬＲＢ４リガンド結合の阻害試験
　実験例３で得られた抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体について、フィブロネクチンがヒトＬＩＬＲＢ４に結合することを阻害できるかについて、ＬＩＬＲＢ４キメラ受容体ＧＦＰレポーター細胞を用いて調べた。
　マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞２Ｂ４に由来するレポーター細胞は、ヒト活性化ペア免疫グロブリン様受容体β（ＰＩＬＲβ）と活性化シグナルアダプタータンパク質ＤＡＰ１２とに融合されたヒトＬＩＬＲＢ４の細胞外ドメインからなるキメラ受容体を発現し、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の核内転写因子の制御下で発現が誘導される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を持つ（Ｋ　Ｈｉｒａｙａｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：１６０５４、２０１６）。このＬＩＬＲＢ４レポーター細胞を用いて、実験例３で得られた抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の、ＬＩＬＲＢ４とフィブロネクチンとの結合阻害効果を調べた。なお、試験を開始する前に、ヒトフィブロネクチンのＮ末端３０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ社製、＃９９１１、以下、ＦＮ３０とも称する）をマウスＩｇＧ２ａのＦｃと融合させた組換えタンパク質（以下、ＦＮ３０－Ｆｃとも称する）を、ＷＯ２０２１／０２９３１８に記載された方法で作製し、９６ウェル平底プレートの各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ　ＦＮ３０－Ｆｃを含むＰＢＳ（－）を室温でプレコートした。
　ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞を加える直前に、１時間ウェルをＰＢＳ（－）で３回洗浄した。一部のウェルは、ネガティブコントロールのためにコーティングされていない状態に維持した。ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞を培養物から回収し、試験開始まで氷上に静置した。５×１０４個のＢ４レポーター細胞を、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体を含む５０μＬのハイブリドーマ培養上清に懸濁し、１０分ごとに穏やかに混合しながら氷上で３０分間インキュベートした。次に、ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞を洗浄せずに、ＦＮ３０－Ｆｃコーティングまたは非コーティングの９６ウェルプレートに直接加えた。次に、６０μｇ／ｍＬ組換えヒトＡｐｏＥ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社製、＃ＣＩ０２）を含む培地（１０％ＦＢＳ、５０μＭ　２－メルカプトエタノール、０．１Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、０．１μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０）５０μＬをＬＩＬＲＢ４レポーター細胞に添加した。コントロールとして、ヒトＡｐｏＥを含まない５０μＬの培地をＬＩＬＲＢ４レポーター細胞に添加した。次に、ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞をプレートの底に付けるために、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、ＧＦＰタンパク質の発現レベルをフローサイトメトリーＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定し、データをＦｌｏｗＪｏＴＭソフトウェア（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。その結果、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０に良好なフィブロネクチン及びＡｐｏＥとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する効果が確認された。
　次に、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０を産生するハイブリドーマ株から常法によりｍＲＮＡを抽出し、ジデオキシ法により、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０のＶＨ及びＶＬの塩基配列を決定し、それらの塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定した。さらに得られたアミノ酸配列中でＣＤＲ領域に相当するアミノ酸配列を特定し、ＶＨ、ＶＬそれぞれの塩基配列及びアミノ酸配列をＣＤＲ領域とした。その結果、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなることが決定された。また、抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなることが決定された。
［実験例７］肺扁平上皮がん患者のＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４の発現の評価
　ヤギ抗ＬＩＬＲＢ４ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で予めＬＩＬＲＢ４発現が強陽性（Ｈｉｇｈ），中陽性（Ｍｅｄｉｕｍ），弱陽性（Ｌｏｗ）と判定された肺扁平上皮がん組織標本各１検体について、実験例６で得られた、フィブロネクチンとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する抗ヒトＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体＃１０を用いて免疫組織化学染色を行った。その結果を図３に示す。図３に示したように、フィブロネクチンとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する抗ヒトＬＩＬＲＢ４抗体を用いることにより、肺扁平上皮がん患者のＴＩＬ領域で、ＬＩＬＲＢ４が発現していることが確認された。フィブロネクチンとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する抗ＬＩＬＲＢ４抗体は、フィブロネクチンが結合するＬＩＬＲＢ４の発現量をその生理的機能の観点で正確に反映するため、この結果は、フィブロネクチンとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する抗ＬＩＬＲＢ４抗体が、フィブロネクチンとヒトＬＩＬＲＢ４との結合を阻害しない抗体よりも正確に抗ＬＩＬＲＢ４抗体が有効な患者を選択することに用いることができることを示している。
［実験例８］非小細胞肺がん患者のＴＩＬ領域のＬＩＬＲＢ４の発現の評価（２）
　ヤギ抗ＬＩＬＲＢ４ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、肺腺がん患者１４２例、肺扁平上皮がん患者９７例、合計２３９例を用い、実験例４と同様にして、ＳＵＶｍａｘ、ＥＧＦＲ変異（ＥＧＦＲ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）、分化度、リンパ節転移、脈管侵襲、リンパ管侵襲、胸膜浸潤の有無等を調べた。その結果を表３に示す。上記２３９例のうち、高発現群は７５例、低発現群は１６４例で、それぞれの項目の患者数や割合は表３に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示したように、ＦＤＧ－ＰＥＴ検査におけるＳＵＶｍａｘの値はＬＩＬＲＢ４高発現群で有意に高値であり、ＬＩＬＲＢ４高発現群は、悪性度が高く、がんの予後が不良であると判定することができる。また、上記したように、分化度（Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ）は、がんの起源である細胞（肺胞上皮細胞）の形態をどれだけ保っているかを示す指標である。Ｇ１からＧ３になるにつれて分化度が低くなる。高分化がんは肺胞上皮細胞に近い形態だが、分化度が低くなるにつれて異形性が上がり、一般的には悪性度も高くなり、予後が不良となるが、表３に示したように、分化度がＧ３である患者が、ＬＩＬＲＢ４高発現群で有意に多かった。さらに、ＬＩＬＲＢ４高発現群は、また、予後不良因子である脈管侵襲の陽性者もＬＩＬＲＢ４高発現群で有意に多かったことから、ＬＩＬＲＢ４高発現群で予後不良因子が複数認められる結果であった。この結果から、がん患者のＴＩＬ領域における、ＬＩＬＲＢ４の発現を調べることにより、がん患者の予後を予測できることが明らかとなった。
　なお、ＥＧＦＲ変異と組織型において、有意差が認められたが、日本人肺腺がん患者において、ＥＧＦＲ変異は約５０％で認められるが、扁平上皮がんでは５％以下と報告されている。今回の検討においても、ＥＧＦＲ変異と組織型について、同様の傾向が見られた。
　また、実験例４と同様に、ＬＩＬＲＢ４高発現群において、肺扁平上皮がん患者の割合が６５．３％と高かった。このことから、肺扁平上皮がんにおいては、ＴＩＬ領域の腫瘍浸潤免疫系細胞上のＬＩＬＲＢ４発現が高いことが明らかとなった。
　次に上記２３９例のがん患者について、ＬＩＬＲＢ４低発現に対するＬＩＬＲＢ４高発現、ｐＴＮＭ分類のステージＩに対するステージII～IV、性別が女性に対する男性、年齢が７０歳未満に対する７０歳以上、組織型が肺腺がんに対する肺扁平上皮がん（ＳＣＣ）、の５項目について、多変量解析を行った。無再発生存率に対する尤度比検定の結果を表４に、無再発生存率に対するＷａｌｄ検定の結果を表５に示す。全生存率に対する尤度比検定の結果を表６に、全生存率に対するＷａｌｄ検定の結果を表７示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表４～７に示したように、無再発生存率、全生存率のいずれにおいても、ＬＩＬＲＢ４高発現は、ｐＴＮＭ分類、性別、年齢、組織型と独立して予後不良因子であった。
［実験例９］非小細胞肺がん患者の予後の解析
　実験例８の患者において、ＬＩＬＲＢ４高発現群と低発現群について、全生存率、無再発生存率を調べた。全生存率を図４Ａに、無再発生存率を図４Ｂに示す。
　図４Ａ及び図４Ｂに示したように、全生存率及び無再発生存率ともに、ＬＩＬＲＢ４低発現群の方が有意に高かった。この結果からも、ＴＩＬ領域においてＬＩＬＲＢ４が高発現している場合は、がん患者の予後が不良となることが示された。
［実験例１０］肺扁平上皮がん患者の予後の解析
　実験例８で用いたがん患者２３９例のうち、肺扁平上皮がん患者９７例のみを用いて、ＬＩＬＲＢ４高発現群と低発現群について、全生存率、無再発生存率を調べた。全生存率を図５Ａに、無再発生存率を図５Ｂに示す。
　図５Ａに示したように、全生存率は、有意差には至らないもののＬＩＬＲＢ４低発現群の方が高い傾向にあった。また、図５Ｂに示したように、無再発生存率はＬＩＬＲＢ４低発現群の方が有意に高かった。この結果から、肺扁平上皮がん患者においても、ＴＩＬ領域においてＬＩＬＲＢ４が高発現している場合は、予後が不良となることが示された。
　本発明によれば、ＬＩＬＲＢ４又はＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー、がん患者の予後を予測するための方法、がん患者における、がん治療薬の効果を予測するための方法、及び、がん患者の予後を予測するためのキットを提供することができる。

Claims (18)

  1. 　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子からなる、がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー。
  2. 　前記がんが、肺がんである、請求項１に記載のバイオマーカー。
  3. 　がん患者の予後を予測するための方法であって、
    　前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、
    　前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん患者の予後が不良であることを示す、方法。
  4. 　前記がんが、肺がんである、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程である、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記がん患者が、がん治療薬を投与したがん患者である、請求項３又は４に記載の方法。
  8. 　前記がん治療薬が、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗ヒト免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体である、請求項８に記載の方法。
  10. 　がん患者における、がん治療薬としてのフィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質の効果を予測するための方法であって、前記がん患者の生体試料における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量を測定する工程を備え、前記試料中の腫瘍浸潤免疫系細胞における、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量が、対照における免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４又は免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４遺伝子の発現量と比較して高いことが、前記がん治療薬が、前記がん患者に対して効果を有することを示す、方法。
  11. 　前記がんが、肺がんである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗ヒト免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４の発現量を測定する工程である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  14. 　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の方法。
  15. 　請求項１又は２に記載のバイオマーカーの発現量を測定するための試薬を含む、がん患者の予後を予測するためのキット。
  16. 　前記がんが、肺がんである、請求項１５に記載のキット。
  17. 　前記バイオマーカーの発現量を測定するための試薬が、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、請求項１５に記載のキット。
  18. 　前記抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載のキット。
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