WO2022244807A1 - Ｌｔｋ融合遺伝子 - Google Patents

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WO2022244807A1 PCT/JP2022/020673 JP2022020673W WO2022244807A1 WO 2022244807 A1 WO2022244807 A1 WO 2022244807A1 JP 2022020673 W JP2022020673 W JP 2022020673W WO 2022244807 A1 WO2022244807 A1 WO 2022244807A1
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功一 後藤
慎吾 松本
大樹 泉
進 小林
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国立研究開発法人国立がん研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a fusion gene involved in canceration of cells. More specifically, the present invention relates to a novel LTK fusion gene involved in canceration of cells.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2, Patent Documents 1-3.
  • These driver mutations have been found in non-small cell lung cancer among lung cancers, especially non-squamous non-small cell lung cancer (mainly adenocarcinoma).
  • the purpose of the present invention is to provide a novel oncogenic driver gene that serves as a new therapeutic target for cancer.
  • the present invention further provides a means for identifying cancer patients or subjects at risk of cancer for whom a drug targeting a gene having the mutation or the protein encoded by the gene has a therapeutic effect, based on a novel oncogenic driver gene. for the purpose of providing
  • the present inventors discovered a novel LTK fusion gene in the genetic screening platform (LC-SCRUM-Asia) constructed by the present inventors. Furthermore, in in vitro studies, we performed a functional analysis of the novel LTK fusion gene and clarified that it is involved in canceration of cells, and that its activity is suppressed by tyrosine kinase inhibitors. The present invention was completed by discovering that treatment with a tyrosine kinase inhibitor is effective for positive patients. That is, the present invention includes, but is not limited to, the following aspects.
  • a method for detecting a gene fusion that is an oncogenic driver mutation comprising: in an isolated sample from a subject with cancer, a fusion polynucleotide represented by formula (I) below or a polypeptide encoded thereby: A method comprising detecting: 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position)
  • the fusion polynucleotide encodes a polypeptide comprising the kinase domain of LTK and having kinase activity.
  • a method according to aspect 4, wherein the fusion polynucleotide is a CLIP1-LTK fusion polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c) below: (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity; and (c) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • fusion polynucleotide is any of (a') to (d') below: (a') a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b') a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes a polypeptide having kinase activity , (c') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding a polypeptide having kinase activity; or (d') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence
  • Aspect 8 Aspect 7, wherein the mutation in the LTK gene portion is a mutation resulting in an LTK mutation selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof. the method of.
  • a method comprising the steps of: (1) a method comprising detecting, in an isolated sample from a subject, a fusion polynucleotide represented by formula (I) below or a polypeptide encoded thereby: 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position) wherein said fusion polynucleotide encodes a polypeptide comprising the kinase domain of LTK and having kinase activity; and (2) when said fusion polynucleotide or a polypeptide encoded
  • fusion polynucleotide is a CLIP1-LTK fusion polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c): (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity; and (c) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • fusion polynucleotide is any of (a') to (d'): (a') a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b') a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes a polypeptide having kinase activity , (c') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding a polypeptide having kinase activity; or (d') a polynucle
  • the mutation in the LTK gene portion is a mutation resulting in an LTK mutation selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof. the method of.
  • a kit for detecting gene fusions that are oncogenic driver mutations comprising any of (A) to (C) or a combination thereof:
  • the fusion polynucleotide is a CLIP1-LTK fusion polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c): (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity; and (c) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • a kit according to aspects 24 or 25, wherein the fusion polynucleotide is any of (a') to (d'): (a') a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b') a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes a polypeptide having kinase activity , (c') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding a polypeptide having kinase activity; or (d') a polynucle
  • the mutation in the LTK gene portion is a mutation resulting in an LTK mutation selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof. kit.
  • FIG. 30 An isolated fusion polynucleotide of formula (I): 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position)
  • the fusion polynucleotide encodes a polypeptide comprising the kinase domain of LTK and having kinase activity.
  • the fusion polynucleotide according to aspect 33 which is a CLIP1-LTK fusion polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c): (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity; and (c) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • a fusion polynucleotide according to aspects 33 or 34 which is any of (a') to (d'): (a') a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b') a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes a polypeptide having kinase activity , (c') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding a polypeptide having kinase activity; or (d') a polynucleot
  • the mutation in the LTK gene portion is a mutation resulting in an LTK mutation selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof.
  • Aspect 42 Determined by the method according to any one of aspects 11 to 20 that a substance that suppresses the expression and/or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is an oncogenic driver mutation has a therapeutic effect
  • a method for screening an active ingredient of a cancer therapeutic agent comprising the steps of: (1) contacting a cell expressing the fusion polypeptide according to any one of aspects 38 to 41 with a test substance; (2) determining whether the expression and/or activity of said fusion polypeptide is inhibited; Selecting as an active ingredient of a drug.
  • a cancer therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a substance selected by the screening method according to aspect 47.
  • a method for treating cancer wherein the method according to any one of aspects 11 to 20 suppresses expression and/or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is an oncogenic driver mutation. administering a substance that suppresses the expression and/or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide to a cancer patient or a subject determined to be at risk of cancer, for whom the substance that performs including, method.
  • the present invention makes it possible to provide novel oncogenic driver genes that serve as new therapeutic targets for cancer. Furthermore, according to the present invention, a cancer patient or a subject at risk of cancer for whom a drug targeting a gene having the mutation or a protein encoded by the mutation produces a therapeutic effect is identified based on the novel oncogenic driver gene. It becomes possible to provide a method, a method of treating a patient with cancer, a cancer therapeutic agent, a screening method for a cancer therapeutic agent, and the like.
  • FIG. 1 shows the CLIP1-LTK fusion gene identified by total RNA sequencing analysis of non-small cell lung cancer patients. Spanning reads (top) and junction reads (bottom) of the detected CLIP1-LTK fusion gene transcript are shown.
  • FIG. 2 shows schematic representations of wild-type CLIP1 protein (top), wild-type LTK protein (middle), and CLIP1-LTK fusion protein (bottom). Straight lines indicate breakpoints. CC, coiled-coil domain; TM, transmembrane domain.
  • FIG. 3 shows RT-PCR detection of CLIP1-LTK gene transcripts in patient #1. Primer positions are indicated at the top.
  • FIG. 4 shows an electropherogram of Sanger sequencing analysis of the CLIP1-LTK fusion gene transcript.
  • cDNA was purified from patient-derived RNA and subjected to RT-PCR using CLIP1-LTK-F3 and CLIP1-LTK-R3 primers. PCR products were directly sequenced using each primer.
  • FIG. 4 shows an electropherogram of Sanger sequencing analysis of the CLIP1-LTK fusion gene transcript.
  • FIG. 5 shows screening of lung cancer specimens for CLIP1-LTK gene transcripts using the primer set of primer F5 and primer R3.
  • a representative RT-PCR screen panel including two positive samples (#2 and #3) and GAPDH is shown.
  • Figure 6 shows the constitutive tyrosine kinase activity of the CLIP1-LTK fusion protein.
  • NIH3T3 cells were transiently transfected with empty vector, wild-type LTK expression plasmid, or CLIP1-LTK expression plasmid. Cell extracts were subjected to Western blotting analysis.
  • FIG. 7 shows light microscope images of NIH3T3 stably expressing cells.
  • Figure 9 shows LTK phosphorylation by CLIP1-LTK (a, Ba/F3 cells; b, NIH3T3 cells).
  • FIG. 10 shows IL-3 independent proliferation (Ba/F3 cells) by CLIP1-LTK.
  • FIG. 11 shows the screening of chemical inhibitors of CLIP1-LTK.
  • NIH3T3 cells were transiently transfected with pCMV3-CLIP1-LTK, cultured for 24 hours, and then treated with the indicated drugs for 6 hours. Cell extracts were subjected to Western blotting analysis.
  • FIG. 12 shows inhibition of anchorage-independent colony formation in NIH3T3-CLIP1-LTK cells.
  • Figure 13 shows a cell viability assay of Ba/F3-CLIP-LTK cells. Ba/F3-CLIP-LTK cells were treated with increasing concentrations of the indicated drugs for 48 hours.
  • Figure 14 shows inhibition of CLIP-LTK kinase activity and its downstream signaling by lorlatinib.
  • FIG. 1 shows the time course of CT scan images of the right lung and liver of patient 1 who received 100 mg of lorlatinib orally per day.
  • FIG. 16 shows evaluation of transforming activity by CLIP1-LTK in vivo.
  • Figure 17 shows the effect of lorlatinib on CLIP1-LTK expressing tumors in vivo.
  • FIG. 18 shows the time course of lung and liver CT scan images (baseline, 2 months, 5 months) of patient 1 who received lorlatinib 100 mg orally per day.
  • FIG. 1 shows the time course of CT scan images of the right lung and liver of patient 1 who received 100 mg of lorlatinib orally per day.
  • FIG. 16 shows evaluation of transforming activity by CLIP1-LTK in vivo.
  • Figure 17 shows the effect of lorlatinib on CLIP1-LTK expressing tumors in vivo.
  • FIG. 18 shows the time course of lung and liver CT scan images (baseline, 2 months, 5 months) of patient 1 who received lorlatini
  • FIG. 19 shows the time series of whole-body PET images of patient 1 who was orally administered 100 mg of lorlatinib per day.
  • FIG. 20 shows detection of LTK gene rearrangements in human tumor and non-tumor cells by break-apart fluorescence in situ hybridization (FISH) assay.
  • Figures 21A-C show the effect of LTK gene mutations in LTK fusion genes on lorlatinib sensitivity.
  • Figures 21A-C show the effect of LTK gene mutations in LTK fusion genes on lorlatinib sensitivity.
  • Figures 21A-C show the effect of LTK gene mutations in LTK fusion genes on lorlatinib sensitivity.
  • Figures 22A to 22C show evaluation of sensitivity to various drugs having ALK/LTK inhibitory activity in cells expressing CLIP1-LTK fusion protein with LTK mutation.
  • Figures 22A to 22C show evaluation of sensitivity to various drugs having ALK/LTK inhibitory activity in cells expressing CLIP1-LTK fusion protein with LTK mutation.
  • Figures 22A to 22C show evaluation of sensitivity to various drugs having ALK/LTK inhibitory activity in cells expressing CLIP1-LTK fusion protein with LTK mutation.
  • the present inventors were the first to discover an LTK gene fusion as an oncogenic driver mutation. Based on such findings, the present invention provides a method for detecting the gene fusion, a method for identifying a cancer patient or a subject at risk of cancer for whom cancer treatment based on the presence of the oncogenic driver mutation is effective, The present invention provides therapeutic methods, cancer therapeutic agents, screening methods for cancer therapeutic agents, and the like.
  • a gene that directly causes carcinogenesis is called an oncogenic driver gene (herein, sometimes simply referred to as a driver gene).
  • a mutation that occurs in an oncogenic driver gene is referred to as an oncogenic driver mutation (herein, sometimes simply referred to as a driver mutation), which is a term used interchangeably with cancer-responsible mutations.
  • driver mutations driver mutations listed in the National Comprehensive Cancer Network (NCCN) guidelines
  • NCCN National Comprehensive Cancer Network
  • EGFR / ALK / ROS1 / BRAF / MET / NTRK / HER2 / RET / KRAS gene mutations are not present (i.e., if the mutation is mutually exclusive with the known driver mutation), the mutation is It can be said to be an oncogenic driver mutation.
  • fusions which are specific oncogenic driver mutations in the present invention, are described below.
  • a gene resulting from gene fusion is called a fusion gene.
  • the "fusion point" in the fusion polynucleotide means the boundary where the 5'-side gene portion and the 3'-side gene portion are connected, which is the boundary between the two nucleotide residues. Boundary.
  • the "fusion point” in the fusion polypeptide means the boundary where the N-terminal side polypeptide and the C-terminal side polypeptide are connected, and this is the boundary between two amino acid residues, or, if the gene fusion occurred within a single codon, the single amino acid residue encoded by that codon itself.
  • a gene fusion that is an oncogenic driver mutation in the present invention is a mutation that results in the expression of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide represented by formula (I) below: 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position).
  • formula (I) represented by formula (I) below: 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position).
  • the fusion polynucleotide encodes a polypeptide containing the kinase domain of LTK and having kinase activity.
  • LTK is a member of the insulin receptor superfamily that forms the ALK/LTK subfamily together with ALK, is encoded by a gene located at 15q15 in humans, and is typically represented by SEQ ID NO: 4. It is a protein consisting of an amino acid sequence (NCBI Accession No. NP_002335.2). The LTK protein is characterized by having a kinase domain, which corresponds to the amino acid sequence of positions 510-786 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in humans. The LTK gene has never been reported as a driver gene either alone or as a fusion gene.
  • the present invention is based on the discovery for the first time that the LTK gene functions as a driver when fused with other genes. Therefore, the partner gene that serves as a fusion partner for the LTK gene is not limited as long as it can be fused with the LTK gene and as a result, the gene exhibits a function as a driver.
  • a partner gene in the present invention is, for example, the CLIP1 gene.
  • CLIP1 protein is a member of the microtubule plus-end accumulation protein family, is encoded by a gene present at 12q24 in humans, and typically has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (NCBI Accession No. NP_001234926.1 ) is a protein consisting of The CLIP1 protein is characterized by having a coiled-coil domain, which corresponds to the amino acid sequence of positions 350-1353 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in humans.
  • the fusion polypeptide of the present invention is a polypeptide that contains the kinase domain of the LTK protein and has kinase activity.
  • the fusion polypeptide of the present invention may contain the entire kinase domain of the LTK protein, or may contain a portion of the kinase domain as long as the fusion polypeptide of the present invention has kinase activity.
  • the fusion polypeptide of the present invention "has kinase activity” means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from the LTK protein.
  • Kinase activity of LTK fusion polypeptides is measured by standard methods, usually by detecting phosphorylated tyrosine of the substrate after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions. It can also be measured using a commercially available measurement kit.
  • the fusion polypeptide of the present invention may contain the dimerization domain of the partner gene.
  • a fusion polypeptide of the invention may contain all of the dimerization domain or, as long as the fusion polypeptide of the invention is capable of dimerizing, the dimer is It may also contain part of a somatogenic domain.
  • Whether or not the fusion polypeptide of the present invention forms dimers can be confirmed by known methods such as gel filtration chromatography, combination of cross-linking agent treatment and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the like.
  • the fusion polypeptides of the present invention dimerize via a coiled-coil domain present on the N-terminal side, autophosphorylate, and constitutively activate. It is thought that it contributes to the
  • kinase domain As used by protein domains, “kinase domain”, “dimerization domain”, and “coiled-coil domain” are also used for the corresponding gene domains.
  • the polynucleotide encoding the fusion polypeptide of the present invention is a fusion polynucleotide represented by the following formula (I): 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position).
  • the fusion polynucleotide of the present invention may be mRNA, cDNA or genomic DNA.
  • the partner gene polynucleotide may contain a dimerization domain such as a coiled-coil domain.
  • the partner gene polynucleotide may be the CLIP1 gene polynucleotide.
  • a fusion polynucleotide of the invention can be, for example, a CLIP1-LTK fusion polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c) below: (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity, or (c) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence encoded by a CLIP1-LTK fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples below.
  • the fusion point is located between positions 1083 and 1084 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2. That is, CLIP1 is up to 1083rd place, and LTK is after 1084th place.
  • one or more amino acids usually means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to several (e.g., 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) amino acids.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more sequence identity.
  • Amino acid sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) It can be determined using a program (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters for each program. Specific methods of these analysis methods are well known to those skilled in the art (eg, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the fusion polynucleotide of the present invention can be, for example, any of the following (a') to (d') polynucleotides: (a') a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b') a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and that encodes a polypeptide having kinase activity , (c') a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding a polypeptide having kinase activity; or (d')
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of a CLIP1-LTK fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples below.
  • the fusion point is located between positions 4383 and 4384 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:1. In other words, up to 4383th place is CLIP1, and 4384th place and later is LTK.
  • under stringent conditions refers to moderately or highly stringent conditions, unless otherwise specified.
  • Moderately stringent conditions can be easily designed by those skilled in the art, for example, based on the length of the target polynucleotide. Basic conditions are presented in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Typically, moderately stringent conditions are prewash conditions of 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) for nitrocellulose filters; % formamide, 2-6 ⁇ SSC (or other similar hybridization solution such as Stark's solution in about 50% formamide at about 42° C.); Includes wash conditions of 6 ⁇ SSC, 0.1% SDS. Moderately stringent conditions preferably include hybridization conditions at about 50° C., 6 ⁇ SSC, and may include washing conditions and/or washing conditions as described above.
  • Highly stringent conditions can also be easily designed by those skilled in the art, for example, based on the length of the target polynucleotide.
  • Highly stringent conditions include higher temperatures and/or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • it includes hybridization conditions of about 65° C., 0.2-6 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, even more preferably 0.2 ⁇ SSC.
  • wash conditions of about 65-68°C, 0.2 x SSC, 0.1% SDS.
  • SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, and 1.25 mM EDTA, pH 7.4.
  • washing can be performed for about 15 minutes after hybridization is complete.
  • nucleotides is usually 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to several (e.g., 1-5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) nucleotides.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% sequence identity above.
  • the fusion polynucleotide of the present invention may have mutations in its LTK gene portion.
  • the LTK gene portion refers to the portion after position 4384 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the case of humans, and refers to the orthologue corresponding to the human LTK gene portion in the case of organisms other than humans.
  • Mutations in the LTK gene portion are preferably mutations leading to LTK mutations selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof, more preferably , mutations that lead to LTK mutations, including L650F.
  • the present invention provides a method for detecting gene fusion (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention).
  • the detection methods of the present invention comprise detecting any of the fusion polynucleotides or polypeptides encoded thereby in an isolated sample from a subject with cancer.
  • subjects are not particularly limited as long as they are mammals.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, chipmunks and guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, Examples include primates such as orangutans and chimpanzees, but humans are preferred.
  • a subject with cancer may be not only a subject with cancer, but also a subject suspected of having cancer or a subject at risk of developing cancer in the future.
  • the “cancer” to which the detection method of the present invention is applied is not particularly limited as long as the gene fusion can be detected, but lung cancer is preferred, and non-small cell lung cancer is more preferred.
  • isolated samples derived from subjects include not only biological samples (e.g., cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive juices, sputum, alveolar/bronchial lavage, urine, stool), Nucleic acid extracts (genomic DNA extracts, mRNA extracts, cDNA preparations and cRNA preparations prepared from mRNA extracts, etc.) and protein extracts obtained from these biological samples are also included. Genomic DNA, mRNA, cDNA or protein can be prepared by a person skilled in the art by selecting a suitable known technique in consideration of the type and condition of the sample. Moreover, the sample may be formalin-fixed, alcohol-fixed, frozen, or paraffin-embedded.
  • biological samples e.g., cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive juices, sputum, alveolar/bronchial lavage, urine, stool
  • Nucleic acid extracts genomic DNA extracts, mRNA extracts,
  • the "isolated sample” is preferably derived from an organ where the cancer exists or is suspected to exist, for example, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, Examples include those derived from the pancreas, aorta, etc., and more preferably those derived from the lung.
  • the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded by it can be detected using a technique known per se.
  • RNA or cDNA prepared from mRNA When targeting transcripts from genomic DNA (mRNA or cDNA prepared from mRNA), RT-PCR, sequencing, TaqMan probe method, northern blotting, dot blotting, cDNA microarray analysis, etc. Fusion polynucleotides that are mRNA or cDNA can be detected.
  • ISH in situ hybridization
  • genomic PCR method sequencing
  • TaqMan probe method Southern blotting
  • genomic microarray analysis etc. are used to detect fusion polynucleotides that are genomic DNA. can do.
  • each of these methods can be used independently, but they can also be used in combination.
  • the gene fusion is thought to contribute to canceration by expressing the fusion polypeptide
  • when detecting a fusion polynucleotide that is genomic DNA for example, by in situ hybridization, etc.
  • transcription it is also preferable to further confirm that the product or protein is produced (eg, by RT-PCR, immunostaining, etc.).
  • the fusion polynucleotide is detected by hybridization technology (e.g., TaqMan probe method, Northern blotting, Southern blotting, dot blotting, microarray analysis, in situ hybridization (ISH), etc.), the fusion polynucleotide is Polynucleotides can be used that are probes designed to recognize
  • “specifically recognizing a fusion polynucleotide” includes wild-type genes from which the 5'-end and 3'-end portions of the fusion point of the fusion polynucleotide are derived under stringent conditions. It refers to distinguishing and recognizing the fusion polynucleotide from polynucleotides other than the fusion polynucleotide.
  • genomic DNA to be detected is stable even under formalin-fixation. It is preferable to use in situ hybridization from the viewpoint of high detection sensitivity.
  • the following ( ⁇ ) or ( ⁇ ) having a chain length of at least 15 bases as a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize the fusion polynucleotide in the biological sample
  • the genomic DNA encoding the fusion polypeptide (fusion polynucleotide) can be detected by hybridizing the polynucleotides of .
  • ( ⁇ ) For each fusion gene at least one selected from the group consisting of a probe that hybridizes to the nucleotide sequence of the 5' fusion partner gene (e.g. CLIP1 gene) and a probe that hybridizes to the nucleotide sequence of the 3' LTK gene.
  • the 5'-side fusion partner gene of the present invention is typically a gene specified by NCBI Entrez Gene: 6249 if it is human-derived.
  • the LTK gene according to the present invention is typically a gene specified by NCBI Entrez Gene: 4058 if it is human-derived.
  • the DNA sequence of a gene can change naturally (that is, non-artificially) due to its mutation. Therefore, such naturally occurring mutants can also be subject of the present invention (the same shall apply hereinafter).
  • the present inventors have found that the fusion gene of the present invention containing a mutated LTK gene segment can also serve as a therapeutic target.
  • the polynucleotide that is the probe according to ( ⁇ ) of the present invention is the base sequence of the 5'-side fusion partner gene (for example, CLIP1 gene) and/or the base of the 3'-side LTK gene, which is the target base sequence of the polynucleotide.
  • Any polynucleotide that can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to the sequence but is preferably a polynucleotide described in ( ⁇ 1) to ( ⁇ 3) below.
  • ( ⁇ 1) A polynucleotide that hybridizes to the nucleotide sequence of the upstream region on the 5′ side of the breakpoint of the 5′ fusion partner gene (hereinafter also referred to as “5′ fusion partner gene probe 1”), and the 3′ fusion Combination with a polynucleotide that hybridizes to the nucleotide sequence of the downstream region on the 3' side of the breakpoint of the partner gene (hereinafter also referred to as “3' fusion partner gene probe 1"); ( ⁇ 2) A polynucleotide hybridizing to the nucleotide sequence of the upstream region on the 5′ side of the breakpoint of the 5′ fusion partner gene (hereinafter also referred to as “5′ fusion partner gene probe 1”), and the 5′ fusion combination with a polynucleotide that hybridizes to the nucleotide sequence of the downstream region on the 3' side of the breakpoint of the partner gene (hereinafter also referred to as "5'
  • the nucleotide sequence of the upstream region on the 5′ side of the breakpoint of the gene includes the entire coiled-coil domain of the CLIP1 protein or Some coding regions are included.
  • the nucleotide sequence of the downstream region on the 3' side of the breakpoint of the 3' LTK gene includes the coding region of all or part of the kinase domain of the LTK protein.
  • polynucleotides described in ( ⁇ 1) above include combinations of the following polynucleotides ( ⁇ 1-1) to ( ⁇ 1-3): ( ⁇ 1-1) A polynucleotide that hybridizes to the coding region of all or part of the dimerization domain of the 5′-side fusion partner protein and a polynucleotide that hybridizes to the coding region of all or part of the kinase domain of LTK a combination of nucleotides; ( ⁇ 1-2) A combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the coiled-coil domain of the 5′-side fusion partner protein and a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the kinase domain of LTK ;or ( ⁇ 1-3) A combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the coiled-coil domain of CLIP1 and a
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in ( ⁇ ) used for in situ hybridization hybridizes from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection, the 5′ side A region within 1,000,000 bases from the fusion point between the fusion partner gene (eg CLIP1 gene) and the 3'-side LTK gene is preferred.
  • the polynucleotide described in ( ⁇ ) used for in situ hybridization is a fusion point between the 5' fusion partner gene and the 3' LTK gene, which is the target nucleotide sequence of the polynucleotide.
  • the polynucleotide according to ( ⁇ ) or ( ⁇ ) used for in situ hybridization covers the entire target nucleotide sequence from the viewpoint of specificity and detection sensitivity for the target nucleotide sequence.
  • a population consisting of multiple types of polynucleotides is preferred.
  • the length of the polynucleotides constituting the population is at least 15 bases, preferably 100-1000 bases.
  • the polynucleotide described in ( ⁇ ) or ( ⁇ ) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, Cy5.
  • radioactive isotopes eg 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 33 P, 32 P, etc.
  • enzymes eg ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, Malate dehydrogenase, etc.
  • luminescent substances eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), etc.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • labeling of polynucleotides can be performed by a known method.
  • a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like can be incorporated into a polynucleotide to label the polynucleotide.
  • the conditions for hybridizing the polynucleotide described in ( ⁇ ) or ( ⁇ ) with the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • Stringent hybridization conditions include, for example, 0.2 x SSC and 65°C conditions
  • low stringency hybridization conditions include, for example, 2.0 x SSC and 50°C conditions.
  • a surfactant By appropriately selecting various conditions such as the concentration of NP-40, etc., the concentration of formamide, and pH, stringent hybridization conditions similar to those described above can be achieved.
  • Examples of methods for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide described in ( ⁇ ) or ( ⁇ ) include Southern blotting, Northern blotting and dot blotting, in addition to the in situ hybridization. be done.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in ( ⁇ ) or ( ⁇ ) to a membrane onto which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transcribed.
  • polynucleotide ( ⁇ ) When the polynucleotide ( ⁇ ) was used, a polynucleotide hybridizing to the nucleotide sequence of the 5′-side fusion partner gene and a polynucleotide hybridizing to the nucleotide sequence of the 3′-side LTK gene were developed on the membrane. When the same band is recognized, it can be judged that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • Methods for detecting the genomic DNA encoding the fusion polypeptide using the ( ⁇ ) polynucleotide further include genome microarray analysis and DNA microarray analysis.
  • an array is prepared by immobilizing the polynucleotide ( ⁇ ) on a substrate, and the genomic DNA is detected by contacting the biological sample with the polynucleotide on the array.
  • the substrate is not particularly limited as long as the oligo or polynucleotide can be immobilized thereon, and examples thereof include glass plates, nylon membranes, microbeads, silicon chips and capillaries.
  • the detection method of the present invention it is also preferable to detect the fusion polynucleotide using PCR.
  • PCR it is possible to use a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify a fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template.
  • DNA genomic DNA, cDNA
  • RNA RNA prepared from the biological sample as a template.
  • “capable of specifically amplifying the fusion polynucleotide” means that the fusion polynucleotide can be It means that only nucleotides can be amplified, and the whole of the fusion polynucleotide may be amplified, or a part of the fusion polynucleotide containing the fusion point may be amplified.
  • the "polynucleotide that is a pair of primers" used in PCR etc. consists of a sense primer (forward primer) and an antisense primer (reverse primer) that specifically amplify the target fusion polynucleotide. It is designed from the nucleotide sequence on the 5'-terminal side from the fusion point of the fusion polynucleotide, and the antisense primer is designed from the nucleotide sequence on the 3'-terminal side from the fusion point of the fusion polynucleotide. These primers are usually designed so that the PCR product is 5 kb or less from the viewpoint of detection accuracy and sensitivity by PCR.
  • Primers can be appropriately designed by a known technique, for example, Primer Express (registered trademark) software (Applied Biosystems) can be used.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 bases or more (preferably 16, 17, 18, 19 or 20 bases or more, more preferably 21 bases or more) and 100 bases or less (preferably 90, 80, 70, 60, 50 or 40 bases or less, more preferably 30 bases or less).
  • Preferred examples of the "polynucleotide that is a pair of primers" include a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and/or a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8 as a forward primer for the CLIP1-LTK fusion polynucleotide. and a primer set consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 as a reverse primer (see Table 1 below).
  • direct sequencing is performed on the PCR product, and by determining the base sequence including the fusion point, the 5' side gene part and the 3' side gene part are identified. are linked in-frame and/or the inclusion of a given domain in the fusion polynucleotide. Sequencing can be performed by a known technique, and can be easily performed by using a sequencer (e.g., ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.), etc.) according to the instruction manual.
  • a sequencer e.g., ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.), etc.
  • the TaqMan probe method confirms that the 5'-side gene portion and the 3'-side gene portion are linked in-frame and/or in the fusion polynucleotide. You can check that the given domain is included.
  • Probes used in the TaqMan probe method include, for example, the polynucleotides described in ( ⁇ ) or ( ⁇ ) above. Probes are labeled with a reporter dye (eg, FAM, FITC, VIC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, Eclipse, DABCYL, MGB, etc.).
  • the above primers and probes may be DNA, RNA, or DNA/RNA chimeras, but are preferably DNA.
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked nucleic acid, Bridged Nucleic Acid, crosslinked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C) -Ethylene-bridged nucleic acid
  • GNA Glycerol nucleic acid, glycerol nucleic acid
  • TNA threose nucleic acid, threose nucleic acid
  • the primers and probes may be double-stranded or single-stranded, but are preferably single-stranded.
  • primers and probes may contain one or more nucleotide mismatches as long as they can specifically hybridize to the target sequence. 91, 92, 93, 94% or greater, more preferably 95, 96, 97, 98, 99% or greater identity, most preferably 100% identity.
  • primers and probes can be synthesized according to conventional methods using a DNA/RNA automatic synthesizer, for example, based on the nucleotide sequence information described in this specification.
  • the fusion polynucleotide may be detected by whole transcriptome sequencing (RNA sequencing) or genome sequencing.
  • RNA sequencing whole transcriptome sequencing
  • genome sequencing e.g., Genome Analyzer IIx (Illumina), Hi-Sec Sequencer (HiSeq2000, Illumina), Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a next-generation sequencer e.g., Genome Analyzer IIx (Illumina), Hi-Sec Sequencer (HiSeq2000, Illumina), Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a commercially available kit e.g., mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina), etc.
  • Illumina mRNA-Seq sample preparation kit
  • fusion polynucleotides examples include immunostaining, Western blotting, RIA, ELISA, flow cytometry, and immunoprecipitation. , antibody array analysis, etc. can be used to detect the translation product.
  • Antibodies that specifically recognize the fusion polypeptide are used in these methods.
  • the term "specifically recognizes the fusion polypeptide” refers to proteins other than the fusion polypeptide, including wild-type proteins derived from the N-terminal and C-terminal portions of the fusion point of the fusion polypeptide. It means recognizing only the fusion polypeptide without recognizing it.
  • An antibody that "specifically recognizes a fusion polypeptide" used in the detection method of the present invention may be a single antibody or a combination of two or more antibodies.
  • Antibody that specifically recognizes a fusion polypeptide includes an antibody specific to a polypeptide containing a fusion point of the fusion polypeptide (hereinafter also referred to as a "fusion point-specific antibody”).
  • fusion point-specific antibody means an antibody that specifically binds to a polypeptide containing the fusion point, but does not bind to the wild-type protein from which the N-terminal and C-terminal portions are derived. do.
  • the "antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide” includes an antibody that binds to the polypeptide consisting of the region on the N-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide and the region on the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide. Also included are combinations of antibodies that bind to different polypeptides.
  • the fusion polypeptide can be detected by sandwich ELISA, immunostaining, immunoprecipitation, western blotting, or the like using these two antibodies.
  • antibodies include polyclonal antibodies, natural antibodies such as monoclonal antibodies (mAb), chimeric antibodies, humanized antibodies, single-chain antibodies that can be produced using genetic recombination technology, and binding fragments thereof. including but not limited to.
  • a binding fragment means a partial region of the antibody having specific binding activity, and specifically includes, for example, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, and single-chain antibodies.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and the antibody may have any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, but IgG is more preferable in consideration of ease of purification and the like.
  • an "antibody that specifically recognizes a fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known technique.
  • known techniques include a polypeptide containing the fusion point of the fusion polypeptide, a polypeptide consisting of a region on the N-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide, or a region on the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide.
  • a method for producing a monoclonal antibody Commercially available antibodies may be used. Moreover, by using an antibody to which a labeling substance is bound, it is possible to directly detect the target protein by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and is detectable.
  • thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances a method of indirectly detecting the target protein using a secondary antibody conjugated with a labeling substance, protein G or protein A, etc. can also be used.
  • the gene fusion is an oncogenic driver mutation, and is thought to contribute to malignant transformation of cancer and the like by constitutively activating LTK kinase activity. Therefore, in cancer patients in whom such gene fusion is detected, there is a high probability that treatment with a substance that suppresses the expression and/or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the gene fusion will be effective. .
  • the present invention provides cancer patients or cancer risks for whom a substance that suppresses the expression and/or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by a gene fusion that is an oncogenic driver mutation has a therapeutic effect.
  • a method for identifying a subject with the disease (hereinafter also referred to as the identification method of the present invention) is provided.
  • the identification method of the invention includes the following steps: (1) a method comprising detecting, in an isolated sample from a subject, a fusion polynucleotide represented by formula (I) below or a polypeptide encoded thereby: 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position) wherein said fusion polynucleotide encodes a polypeptide comprising the kinase domain of LTK and having kinase activity; and (2) when said fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected, said Determining that a substance that inhibits the expression and/or activity of a polypeptide has a therapeutic effect in said subject.
  • formula (I) a fusion polynucleotide represented by formula (I) below or a polypeptide encoded thereby
  • the present inventors have found that even the fusion gene of the present invention having a mutation in the LTK gene portion can serve as a therapeutic target. Therefore, the fusion polynucleotide used in the identification method of the present invention may have a mutation in its LTK gene portion.
  • the LTK gene portion refers to the portion after position 4384 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the case of humans, and refers to the orthologue corresponding to the human LTK gene portion in the case of organisms other than humans.
  • Mutations in the LTK gene portion are preferably mutations leading to LTK mutations selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof, more preferably , mutations that lead to LTK mutations, including L650F.
  • the fusion polypeptide used in the identification method of the present invention may have mutations in the LTK portion.
  • a "cancer patient or a subject at risk of cancer” is a mammal, preferably a human, suffering from cancer or suspected of suffering from cancer.
  • the "cancer” to which the identification method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a cancer in which any of the gene fusions can be detected, preferably lung cancer, and more preferably non-small cell cancer. have lung cancer.
  • the "therapeutic effect” is the effect of cancer treatment, and is not particularly limited as long as it is a beneficial effect on the patient, for example, tumor reduction effect, progression-free survival effect, prolongation of life effects, etc.
  • expression of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by a gene fusion that is an oncogenic driver mutation which is an object for evaluating the efficacy of cancer treatment with respect to gene fusion that is an oncogenic driver mutation and/or activity
  • a target substance in the identification method of the present invention is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and/or function of the fusion polypeptide of the present invention. is not particularly limited.
  • Substances that inhibit the expression of the fusion polypeptide of the present invention include, for example, siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), and antisense that suppress the expression of the fusion polypeptide of the present invention.
  • Nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, low-molecular-weight compounds, and the like are included.
  • Substances that inhibit the function of the fusion polypeptide of the present invention include, for example, substances that inhibit LTK kinase activity (eg, low-molecular-weight compounds), antibodies that bind to the fusion polypeptide of the present invention, and the like.
  • substances that inhibit LTK kinase activity eg, low-molecular-weight compounds
  • antibodies that bind to the fusion polypeptide of the present invention and the like.
  • substances may be substances that specifically suppress the expression and/or activity of the fusion polypeptide of the present invention, or substances that also suppress the expression and/or activity of the wild-type LTK protein. good.
  • substances include, for example, substances having ALK inhibitory activity, but are not limited to crizotinib, ceritinib, alectinib, brigatinib, lorlatinib, entrectinib ( entrectinib), repotrectinib, and giltertinib.
  • These substances can be prepared by methods known per se, for example, based on the sequence information of the CLIP1-LTK fusion polynucleotide and/or CLIP1-LTK fusion polypeptide disclosed herein.
  • a substance selected by a screening method, which will be described later, may be used, or a commercially available substance may be used.
  • These substances are cancer therapeutic agents administered to a subject with cancer when a CLIP1-LTK fusion polynucleotide or a polypeptide encoded by it is detected in an isolated sample derived from a subject with cancer. can be used as an active ingredient in
  • Step (1) in the identification method of the present invention can be performed in the same manner as the steps included in the detection method of the present invention.
  • step (2) in the identification method of the present invention the fusion polynucleotide or its When the polypeptide encoded by is detected, the substance of interest in the identification method of the present invention is determined to have a therapeutic effect in the subject, while the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded by it is not detected If so, it is determined that the target substance in the identification method of the present invention is unlikely to have a therapeutic effect in the subject.
  • the identification method of the present invention positive examples of gene fusion newly found as an oncogenic driver mutation are detected from cancer patients or subjects at risk of cancer, and fusion polynucleotides generated by the gene fusion are detected. It is possible to identify cancer patients or subjects at risk of cancer for whom a substance that suppresses the expression and/or activity of a polypeptide encoded by It is useful in that it enables appropriate treatment.
  • a fusion polynucleotide resulting from a gene fusion that is an oncogenic driver mutation or a polypeptide encoded thereby can be detected using the primers, probes, antibodies, or combinations thereof, and can detect the gene fusion.
  • kits for the detection of gene fusions that are oncogenic driver mutations comprising any or a combination of the following:
  • B a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify the fusion polynucleotide represented by the formula (I); or
  • C the fusion polynucleotide represented by the formula
  • the present inventors have found that even the fusion gene of the present invention having a mutation in the LTK gene portion can serve as a therapeutic target. Therefore, when the fusion gene is an LTK fusion gene, the fusion polynucleotide used in the kit of the present invention may have a mutation in the LTK gene portion.
  • the LTK gene portion refers to the portion after position 4384 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the case of humans, and refers to the orthologue corresponding to the human LTK gene portion in the case of organisms other than humans.
  • Mutations in the LTK gene portion are preferably mutations leading to LTK mutations selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof, more preferably , mutations that lead to LTK mutations, including L650F.
  • kits of the present invention include substrates necessary for detecting labels attached to polynucleotides and antibodies, positive controls (for example, fusion polynucleotides of the present invention, or cells harboring these). and negative controls, PCR reagents, counterstaining reagents (DAPI, etc.) used in in situ hybridization, molecules necessary for antibody detection (e.g., secondary antibodies, protein G, protein A), sample dilution and A buffer or the like used for washing can be included in an appropriate combination. Kits of the invention can also include instructions for use. By using the kit of the present invention, the detection method of the present invention can be easily carried out.
  • the kit of the present invention is used to determine whether a subject is a cancer patient for whom a substance that suppresses the expression and/or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is an oncogenic driver mutation produces a therapeutic effect. It can also be used to diagnose whether or not you are at risk for cancer.
  • the detection method and detection kit of the present invention make it possible to detect gene fusions newly found as carcinogenic driver mutations, and as described later, identify positive cases of the gene fusions and apply personalized medicine. It is extremely useful for
  • the identification method of the present invention identifies cancer patients in whom a substance that suppresses the expression and/or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide resulting from gene fusion produces therapeutic effects. Therefore, cancer can be treated efficiently by selectively administering the substance to patients carrying the fusion gene among cancer patients. Therefore, the present invention provides a method for treating cancer, comprising the step of administering the substance to a subject determined by the identification method of the present invention that the substance has a therapeutic effect (hereinafter referred to as the method of the present invention). (also referred to as methods of treatment of
  • the present invention further provides expression of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by the gene fusion and/or A therapeutic agent for cancer (hereinafter also referred to as a therapeutic agent for cancer of the present invention) containing, as an active ingredient, a substance that suppresses its activity is provided.
  • a therapeutic agent for cancer hereinafter also referred to as a therapeutic agent for cancer of the present invention
  • the active ingredient of the cancer therapeutic agent of the present invention is described as a substance that suppresses the expression and/or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the gene fusion. substances that have
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and/or other additives that are commonly used for their formulation.
  • the administration method of the cancer therapeutic agent of the present invention is appropriately selected according to the type of the inhibitor and the type of cancer. (aerosol), rectal, intravaginal, etc. modes of administration can be employed.
  • the dosage of the therapeutic agent for cancer of the present invention depends on the activity and type of the active ingredient, mode of administration (e.g., oral, parenteral), severity of disease, animal species to be administered, drug acceptability of the subject to be administered, It can be determined as appropriate in consideration of body weight, age, and the like.
  • the therapeutic method and cancer therapeutic agent of the present invention are useful because they enable the treatment of patients with specific oncogenic driver mutations that were previously unknown and clarified by the present invention.
  • the present invention provides a method of screening for an active ingredient of a cancer therapeutic agent that exerts a therapeutic effect on cancer patients having the gene fusion (hereinafter also referred to as the screening method of the present invention).
  • a substance that suppresses the expression and/or activity of any of the fusion polypeptides of the present invention eg, CLIP1-LTK
  • CLIP1-LTK fusion polypeptides of the present invention
  • a test substance to be subjected to the screening method of the present invention may be any compound or composition, such as nucleic acids (eg, nucleosides, oligonucleotides, polynucleotides), carbohydrates (eg, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides), lipids (e.g., saturated or unsaturated linear, branched and/or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (e.g., oligopeptides, polypeptides), low-molecular-weight compounds, compound libraries, Examples include random peptide libraries, natural ingredients (eg, ingredients derived from microorganisms, animals, plants, marine organisms, etc.), foods, and the like.
  • nucleic acids eg, nucleosides, oligonucleotides, polynucleotides
  • carbohydrates eg, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides
  • lipids e.g.,
  • the screening method of the present invention may take any form as long as it can evaluate whether or not a test substance suppresses the expression and/or activity of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the screening methods of the invention comprise the following steps: (1) contacting cells expressing the fusion polypeptide of the present invention with a test substance; (2) determining whether the expression and/or activity of said fusion polypeptide is inhibited; Selecting as an active ingredient of a drug.
  • step (1) cells expressing the fusion polypeptide of the present invention are brought into contact with the test substance.
  • a solvent eg, DMSO, etc.
  • the contacting can take place in a medium.
  • the medium is appropriately selected depending on the type of cells used. 199 medium, etc.
  • the culture conditions are also appropriately determined depending on the type of cells used. 12 to about 72 hours.
  • Cells expressing the fusion polypeptide of the present invention include, for example, cancer tissue-derived cells endogenously expressing the fusion polypeptide, cell lines derived from the cell, and genetically engineered cells. cell lines, etc., which have been identified, but are not limited to these. Whether or not a certain cell expresses the fusion polypeptide of the present invention can also be confirmed using the detection method of the present invention. Also, the cells are usually mammalian cells, preferably human cells.
  • step (2) it is determined whether the expression and/or activity of the fusion polypeptide is suppressed.
  • Fusion polypeptide expression can be measured by determining mRNA levels or protein levels in cells using known analytical methods such as Northern blotting, quantitative PCR, immunoblotting, ELISA, and the like. .
  • the activity of the fusion polypeptide can also be measured by known analysis methods (eg, kinase activity measurement, etc.).
  • the measured values obtained are compared with the measured values in control cells which have not been contacted with the test substance. Comparison of measured values is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. If the measured value in cells contacted with the test substance is significantly lower compared to controls, it can be determined that the test substance inhibits the expression and/or activity of the fusion polypeptide.
  • proliferation of the cells can be used as an index for determination in this step.
  • the proliferation of the cells contacted with the test substance is measured. Measurement of cell proliferation can be performed by a method known per se such as cell counting, 3H thymidine incorporation, BRDU method and the like.
  • the growth of the cells contacted with the test substance is then compared to the growth of control cells not contacted with the test substance. Comparison of proliferation levels is preferably performed on the basis of the presence or absence of significant differences.
  • the proliferation of the control cells not contacted with the test substance may be a value measured beforehand or at the same time as the measurement of the proliferation of the cells contacted with the test substance, but the accuracy of the experiment, From the viewpoint of reproducibility, values measured simultaneously are preferred. As a result of the comparison, it can be determined that the test substance inhibits the expression and/or activity of the fusion polypeptide if the proliferation of the cells contacted with the test substance is inhibited.
  • step (3) the test substance determined to suppress the expression and/or activity of the fusion polypeptide in step (2) is selected as the active ingredient of the cancer therapeutic agent.
  • the present inventors have found that even the fusion gene of the present invention having a mutation in the LTK gene portion can serve as a therapeutic target. Therefore, when the fusion gene is an LTK fusion gene, the fusion polypeptide used in the screening method of the present invention may have mutations in the LTK portion.
  • the mutation in the LTK portion is preferably a mutation that, in humans, results in a LTK mutation selected from the group consisting of I565N, F568C, L590M, L592F, G596R, D597N, L650F, G663A, and combinations of two or more thereof. , more preferably mutations that lead to LTK mutations, including L650F.
  • mutations in the LTK portion are preferably mutations that result in LTK mutations at positions corresponding to the human mutations described above.
  • the screening method of the present invention it is possible to obtain cancer therapeutic agents applicable to the treatment of patients with previously unknown carcinogenic driver mutations. Furthermore, it is also possible to obtain effective cancer therapeutic agents for patients with carcinogenic driver mutations in which the LTK gene portion is further mutated. For example, by the screening method of the present invention, it is possible to obtain a cancer therapeutic agent that targets an oncogenic driver mutation that does not have a mutation in the LTK gene portion, and furthermore, it is possible to develop resistance to such a cancer therapeutic agent. It is also possible to obtain alternative cancer therapeutic agents that target oncogenic driver mutations with mutations in the LTK gene portion as shown.
  • the present invention provides an isolated fusion polynucleotide of formula (I): 5'-A-B-3' (Formula I) (Wherein, 5' represents the 5' terminal position, A represents the partner gene polynucleotide, B represents the LTK gene polynucleotide, and 3' represents the 3' terminal position)
  • the fusion polynucleotide encodes a polypeptide comprising the kinase domain of LTK and having kinase activity.
  • an "isolated" substance means a substance in the environment in which it naturally exists (e.g., within the cells of an organism) other substances (preferably biological agents) (e.g., nucleic acids). in some cases, substantially separated or purified from non-nucleic acid factors and nucleic acids containing nucleic acid sequences other than the nucleic acid of interest; if proteins, non-protein factors and proteins containing amino acid sequences other than the protein of interest, etc.). It means what was done.
  • isolated preferably means 75 wt% or more, more preferably 85 wt% or more, even more preferably 95 wt% or more, and most preferably 96 wt% or more, 97 wt% or more. , having a purity of 98% by weight or more, 99% by weight or more, or 100%.
  • isolated polynucleotides and polypeptides include polynucleotides and polypeptides purified by standard purification methods, and also include chemically synthesized polynucleotides and polypeptides.
  • the polynucleotide of the present invention may be mRNA, cDNA or genomic DNA. Moreover, it may be double-stranded or single-stranded.
  • a typical example of cDNA encoding the fusion polypeptide of the present invention is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by a method known per se. For example, it can be extracted using a known hybridization technique from a cDNA library or a genomic library prepared from cancer tissue or the like that retains the fusion polynucleotide of the present invention. It can also be prepared by amplifying mRNA, cDNA or genomic DNA prepared from the cancer tissue or the like as a template using a known gene amplification technique (PCR). Furthermore, using the cDNA of the wild-type gene from which the 5'-terminal side and 3'-terminal side of each fusion polynucleotide are derived, as a material, PCR, restriction enzyme treatment, site-directed mutagenesis method (Kramer) , W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.) and other known gene amplification techniques or recombinant techniques.
  • PCR gene amplification technique
  • the present invention also provides an isolated fusion polypeptide encoded by the fusion polynucleotide of the present invention, comprising the kinase domain of an LTK protein and having kinase activity (hereinafter also referred to as the fusion polypeptide of the present invention), or Also provide fragments.
  • “Fragment” refers to a fragment of the fusion polypeptide of the present invention, consisting of a continuous partial sequence including sequences upstream and downstream of the fusion point.
  • the sequence upstream of the fusion point contained in the partial sequence is 1 or more amino acid residues from the fusion point (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more), and may include up to the N-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the sequence downstream of the fusion point contained in the partial sequence is 1 or more amino acid residues from the fusion point (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more), and may include up to the C-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the length of the fragment is not particularly limited, but is usually 8 amino acid residues or more (eg, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 100 amino acid residues or more).
  • a fusion polypeptide of the invention can be, for example, an isolated fusion polypeptide of: An isolated CLIP1-LTK fusion polypeptide comprising all or part of the coiled-coil domain of the CLIP1 protein and the kinase domain of the LTK protein and having kinase activity.
  • a fusion polypeptide of the invention can be, for example, an isolated fusion polypeptide of: (i) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (ii) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 2 and having kinase activity.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can also be produced by a method known per se. For example, by inserting the polynucleotide prepared as described above into an appropriate expression vector, introducing the vector into a cell-free protein synthesis system (e.g., reticulocyte extract, wheat germ extract) and incubating, Alternatively, the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into suitable cells (eg, E. coli, yeast, insect cells, animal cells) and culturing the resulting transformants.
  • suitable cells eg, E. coli, yeast, insect cells, animal cells
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can be used as a marker in the detection method and the like of the present invention, and can also be used to prepare antibodies against the fusion polypeptide of the present invention.
  • the isolated fusion polynucleotides and fusion polypeptides of the present invention may have mutations in the LTK gene portion or LTK portion.
  • NIH3T3 cells and Phoenix-AMPHO cells were purchased from the American Type Culture Collection (CRL-1658 and CRL-3213, respectively).
  • Ba/F3, WEHI, and BOSC23 cells were provided by Dr. Daniel G. Tennen (Harvard Medical School).
  • PC9 cells were provided by Dr. Pasi Jannet (Dana-Farber Cancer Institute).
  • Crizotinib, ceritinib, alectinib, brigatinib, lorlatinib, entrectinib, repotrectinib, and giltertinib were purchased from CEREC.
  • LC-SCRUM-Asia National Industry-Academia Collaborative Cancer Genome Screening Project
  • LC-SCRUM-Asia Multicenter Lung Cancer Genomic Screening Project Platform
  • DNA/RNA was extracted from fresh and frozen tissues and/or formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples using the AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen).
  • ALK, ROS1, and RET fusion genes were analyzed by RT-PCR and positive by FISH.
  • Molecular screening was also performed using targeted next-generation sequencing (NGS) systems (Oncomine Comprehensive Assay (version 1 or 3), Oncomine Precision Assay, and multigene quantitative PCR (qPCR) assays.
  • NGS next-generation sequencing
  • qPCR multigene quantitative PCR
  • RNA samples (20-100 ng) using TruSeq RNA Exome (Illumina, San Diego, CA, USA). The library was subjected to paired-end sequencing of 75 bp reads using the NextSeq 500/550 High Output Kit version 2.5 on the NextSeq 550 (Illumina).
  • a kinase-dead (KD) CLIP1-LTK-K1440M (corresponding to LTK K544M) expression plasmid was generated using the QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (#210518, Agilent).
  • MIGR1 retroviral vector which encodes the EGFR-L858R fusion gene, has been previously reported (Yasuda, H. et al. Structural, biochemical, and clinical characterization of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 insertion mutations in lung cancer. Sci Transl Med 5, 216ra177, doi:10.1126/scitranslmed.3007205 (2013)).
  • the oligonucleotides shown in Table 1 were used for cloning. The integrity of all vector constructs was confirmed by Sanger sequencing analysis.
  • NIH3T3 cells and PC9 cells were transfected with 8 ⁇ g/mL polybrene (#12996-81, Nacalai Tesque). Transfected cells were selected by GFP sorting.
  • Ba/F3 stably expressing cells were maintained in RPMI medium supplemented with 10% FBS, 5% WEHI conditioned medium (as IL-3 source), 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin.
  • NIH3T3 and PC9 stably expressing cells were maintained in DMEM medium supplemented with 10% FBS, 100 units/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin.
  • Phospho-ALK/LTK (pTyr1278/672: #6941), Phospho-Akt (pS473: #4060), Phospho-ERK 1/2 (pT202/pY204: #9106), total Akt (#4685), total Erk 1/ 2 (#9102), BIM (#2819), CLIP1 (#8977), PARP (#9532), and cleaved PARP (#5625) antibodies were purchased from Cell Signaling Technologies, Inc. (Beverly, MA, USA). Images were acquired using an ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
  • ⁇ Cell viability assay> Bs/F3 cells (10,000 cells per well) were seeded in a 96-well plate, treated with the drug described in the ⁇ Reagent> section for 48 hours, and treated using Cell Counting Kit-8 (CK04, Fujifilm). and incubated for 2 hours at 37°C. Absorbance was read at 450 nm.
  • a PCR product of the expected size was specifically detected from two metastatic sites (supraclavicular lymph node and liver) (Fig. 3).
  • the CLIP1-LTK fusion protein is constitutively activated and exhibits oncogenic potential>
  • CLIP1-LTK or LTK expression constructs were transiently introduced into NIH3T3 cells, strong phosphorylation of CLIP1-LTK protein was detected, but phosphorylation of wild-type LTK was much weaker (Fig. 6).
  • Antibodies against phosphorylated LTK detected strong phosphorylated bands in CLIP1-LTK-expressing NIH3T3 cells or Ba/F3 cells (NIH3T3-CLIP1-LTK or Ba/F3-CLIP1-LTK), but LTK or No phosphorylated bands were detected in CLIP1-LTK-K1140M-expressing NIH3T3 cells or Ba/F3 cells despite the expression of these foreign proteins. These results confirmed that the CLIP1-LTK fusion protein was constitutively activated, ie phosphorylated, in the stably expressed cell lines.
  • the NIH3T3 cell line a mouse fibroblast cell line, is widely used as a model for oncogenic activity.
  • NIH3T3 cells expressing CLIP1 (NIH3T3-CLIP1) or NIH3T3 cells expressing LTK (NIH3T3-LTK) were contact inhibited and morphologically indistinguishable from NIH3T3 mock cells (cobblestone fibroblast).
  • NIH3T3 cells expressing CLIP1-LTK (NIH3T3-CLIP1-LTK) displayed a round morphology and lost contact inhibition (Fig. 7).
  • NIH3T3 cells expressing CLIP1-LTK-K1140M lost their ability to change morphology and proliferated in a density-dependent manner.
  • soft agar colony formation assays revealed that NIH3T3-CLIP1-LTK colonies were significantly larger after 2 weeks of growth compared to mock cell colonies, NIH3T3-CLIP1 colonies, or NIH3T3-LTK colonies.
  • NIH3T3-CLIP1-LTK colonies were also larger than NIH3T3 cells expressing EGFR-L858R, which is known to have oncogenic potential and served as a positive control.
  • NIH3T3 cells expressing CLIP1-LTK-K1140M lost the ability to induce anchorage-independent growth.
  • the present inventors further evaluated the oncogenic potential of the CLIP1-LTK fusion protein.
  • Ba/F3 are murine B progenitor cells that require IL-3 for proliferation and expression of oncogenic kinases renders them IL-3 independent.
  • Ba/F3-CLIP1-LTK a Ba/F3 cell transfected with the CLIP1-LTK fusion gene, the LTK protein was constitutively activated (phosphorylated) (Fig. 9), and even in the absence of IL-3. Survival and proliferation were allowed (Fig. 10).
  • Lorlatinib also inhibited anchorage-independent growth in soft agar colony formation assays ( Figure 12). Furthermore, in a cell viability assay using Ba/F3-CLIP1-LTK cells, lorlatinib exhibited a high 50% cytostatic concentration ( IC50 ) of 4.2 nM, and other tyrosine kinase inhibitors also had an IC50 of 20 nM. It showed a cell growth inhibitory effect as high as below (Fig. 13). In contrast, the EGFR tyrosine kinase inhibitor osimertinib was not as effective as the ALK inhibitor, with an IC 50 greater than 100 nM.
  • ALK inhibitor is effective as a substance that suppresses the activity of the LTK fusion protein of the present invention.
  • LTK fusion gene as a therapeutic target>
  • Patient 1 an NSCLC patient, is a 44-year-old Asian female with a history of light smoking and stage IV lung adenocarcinoma.
  • the patient received first-line therapy with 4 cycles of carboplatin, pemetrexed, and pembrolizumab, resulting in tumor regression.
  • CT computed tomography
  • PET positron emission tomography
  • FIG. 15 A tumor was shown (Fig. 15).
  • WTS and Sanger sequencing analysis of the patient's tumor sample detected the CLIP1-LTK fusion gene.
  • lorlatinib After consenting to treatment with LTK-targeted therapy, lorlatinib at the usual dose of 100 mg per day was started in the patient. Two-week and four-week follow-up imaging in this patient showed a dramatic reduction in tumor size at the primary site and all metastatic sites ( Figure 15). These results demonstrate hypersensitivity to lorlatinib in LTK kinase-dependent tumors. And it is suggested that LTK kinase inhibitors such as lorlatinib show high therapeutic efficacy in NSCLC patients with LTK fusion gene such as CLIP1-LTK fusion gene.
  • LTK fusion gene as a therapeutic target>
  • NSCLC patient 2 months and 5 months after initiation of the usual dose of lorlatinib at 100 mg per day, follow-up CT images showed rapid and dramatic tumor progression in the primary tumor and multiple metastatic tumors. It showed a reduction in size (Fig. 18).
  • all primary and metastatic tumors at baseline responded dramatically to lorlatinib treatment, as shown by whole-body positron emission tomography (PET) imaging (FIG. 19).
  • PET whole-body positron emission tomography
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the probe showed an orange (5′)-green (3′) fusion signal (FIG. 20, left panel), whereas tumor cells had only one fusion signal and a kinase domain.
  • a single green (3') signal was shown (Fig. 20, right panel). This result indicates the presence of LTK gene rearrangement in the tumor. Loss of the orange signal (5') in tumor cells suggests deletion of this chromosomal region.
  • the present inventors focused on secondary ALK gene mutations that occur during lorlatinib treatment for the ALK fusion gene, and LTK mutations homologous to them was tested for its effect on lorlatinib susceptibility.
  • LTK gene mutations especially the L650F mutation, could contribute to resistance to lorlatinib therapy targeting the LTK fusion gene.
  • Gilteritinib is a molecular targeted drug approved for FLT3 gene mutation-positive acute myeloid leukemia and has LTK inhibitory activity.
  • NIH3T3 cells transfected with CLIP1-LTK were subcutaneously injected into nude mice, and lorlatinib (10 mg/kg, once daily), gilteritinib (30 mg/kg , once daily) or vehicle control for 2 weeks. Similar to the cell viability assay results, gilteritinib treatment significantly inhibited tumor growth, whereas lorlatinib failed to reduce tumor size (FIG. 22C).

Abstract

本発明は、がんの新たな治療標的となる新規発がん性ドライバー遺伝子を提供。さらに、本発明は、新規発がん性ドライバー遺伝子に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法、そのようながんの患者に適した治療を行う方法およびがん治療剤、ならびにがん治療剤のスクリーニング方法等を提供する。

Description

ＬＴＫ融合遺伝子
　本発明は、細胞のがん化に関与する融合遺伝子に関する。より具体的には、本発明は、細胞のがん化に関与する新規LTK融合遺伝子に関する。
　肺がんは、もっともアグレッシブな腫瘍の一つであり、世界で年間１８０万人の死をもたらす。ほとんどの肺がん症例が進行したステージにおいて診断され、ステージ４で診断された症例の５年生存率は１０％未満である。過去２０年にわたり、EGFR遺伝子変異およびALK融合遺伝子のような発がん性ドライバー変異が発見され、それらに対応するチロシンキナーゼ阻害剤（TKI)が開発されたことにより、これらの変異を有する肺がんのサブセットにおける治療戦略の変革と、生存率の改善がもたらされてきた（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１～３）。これらのドライバー変異は、肺がんのうちの非小細胞肺がん、特に非扁平上皮非小細胞肺がん（主に腺がん）で見つかっており、本発明者らが構築した遺伝子スクリーニング基盤（LC-SCRUM-Asia）では、非扁平上皮非小細胞肺がんの６０～６５％に標的となる何らかのドライバー変異が同定されている。また、これらのドライバー変異は、通常個々のがんで重複せず、相互排他的に起こることも明らかになっている。現在のところ進行非小細胞肺癌では、EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET、TRKを標的とする分子標的薬が既に承認されており、さらに、RET、HER2、KRAS等を標的とする治療開発も進行中である。しかし、これらのドライバー変異が同定されるのは肺がん全体の約４０％であり、ドライバー変異が特定されない患者では、従来の殺細胞性抗がん剤や免疫チェックポイント阻害薬を用いた薬物療法が行われ、予後が不良である。
特開2019-189646号公報 特開2017-29058号公報 特開2015-163592号公報
Mok, T. et al. Updated overall survival and final progression-free survival data for patients with treatment-naive advanced ALK-positive non-small-cell lung cancer in the ALEX study. Ann Oncol 31, 1056-1064, doi:10.1016/j.annonc.2020.04.478 (2020) Ramalingam, S. S. et al. Overall Survival with Osimertinib in Untreated, EGFR-Mutated Advanced NSCLC. N Engl J Med 382, 41-50, doi:10.1056/NEJMoa1913662 (2020)
　本発明は、がんの新たな治療標的となる新規発がん性ドライバー遺伝子を提供することを目的とする。本発明はさらに、新規発がん性ドライバー遺伝子に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが構築した遺伝子スクリーニング基盤（LC-SCRUM-Asia）において、新規LTK融合遺伝子を発見した。さらに、in vitro研究において、新規LTK融合遺伝子の機能解析を行い、これが細胞のがん化に関与していること、チロシンキナーゼ阻害薬によりその活性が抑制されることを明らかにし、新規LTK融合遺伝子陽性の患者には、チロシンキナーゼ阻害薬による治療が有効であることを見出して、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の態様を含むが、これらに限定されるものではない。
［態様１］
　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料において、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
［態様２］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、態様１に記載の方法。
［態様３］
　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、態様２に記載の方法。
［態様４］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、態様３に記載の方法。
［態様５］
　融合ポリヌクレオチドが、下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、態様４に記載の方法：
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
（c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［態様６］
　融合ポリヌクレオチドが下記（a'）～（d'）のいずれかである、態様４または５に記載の方法：
（a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様７］
　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、態様１～６のいずれか一項に記載の方法。
［態様８］
　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異である、態様７に記載の方法。
［態様９］
　がんが肺がんである、態様１～８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］
　がんが非小細胞肺がんである、態様９に記載の方法。
［態様１１］
　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）被験者由来の単離された試料において、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
［態様１２］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、態様１１に記載の方法。
［態様１３］
　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、態様１２に記載の方法。
［態様１４］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、態様１３に記載の方法。
［態様１５］
　融合ポリヌクレオチドが、下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、態様１４に記載の方法：
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
（c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［態様１６］
　融合ポリヌクレオチドが下記（a'）～（d'）のいずれかである、態様１４または１５に記載の方法：
（a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様１７］
　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、態様１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
［態様１８］
　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異である、態様１７に記載の方法。
［態様１９］
　がんが肺がんである、態様１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
［態様２０］
　がんが非小細胞肺がんである、態様１９に記載の方法。
［態様２１］
　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
（A）以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；
（B）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［態様２２］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、態様２１に記載のキット。
［態様２３］
　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、態様２２に記載のキット。
［態様２４］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、態様２３に記載のキット。
［態様２５］
　融合ポリヌクレオチドが、下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、態様２４に記載のキット：
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
（c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［態様２６］
　融合ポリヌクレオチドが下記（a'）～（d'）のいずれかである、態様２４または２５に記載のキット：
（a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様２７］
　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、態様２１～２６のいずれか一項に記載のキット。
［態様２８］
　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異である、態様２７に記載のキット。
［態様２９］
　被験者が、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者であるか否かまたはがんのリスクを有するか否かを診断するための、態様２１～２８のいずれか一項に記載のキット。
［態様３０］
　以下の式（I)で表される単離された融合ポリヌクレオチド：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
［態様３１］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、態様３０に記載の融合ポリヌクレオチド。
［態様３２］
　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、態様３１に記載の融合ポリヌクレオチド。
［態様３３］
　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、態様３２に記載の融合ポリヌクレオチド。
［態様３４］
　下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、態様３３に記載の融合ポリヌクレオチド：
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
（c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［態様３５］
　下記（a'）～（d'）のいずれかである、態様３３または３４に記載の融合ポリヌクレオチド：
（a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様３６］
　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、態様３０～３５のいずれか一項に記載の融合ポリヌクレオチド。
［態様３７］
　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異である、態様３６に記載の融合ポリヌクレオチド。
［態様３８］
　態様３０～３７のいずれか一項に記載の融合ポリヌクレオチドにコードされ、LTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離された融合ポリペプチド、またはその断片。
［態様３９］
　CLIP1タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部およびLTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたCLIP1-LTK融合ポリペプチドまたはその断片。
［態様４０］
　そのLTK遺伝子部分において変異を有する、態様３９に記載の単離されたCLIP1-LTK融合ポリペプチドまたはその断片。
［態様４１］
　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異である、態様４０に記載の単離されたCLIP1-LTK融合ポリペプチドまたはその断片
［態様４２］
　態様１１～２０のいずれか一項に記載の方法により発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者のためのがん治療剤であって、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を含む、前記治療剤。
［態様４３］
　前記物質がALK阻害活性を有する物質である、態様４２に記載の治療剤。
［態様４４］
　前記ALK阻害活性を有する物質がロルラチニブである、態様４３に記載の治療剤。
［態様４５］
　態様１～１０のいずれか一項に記載の方法により発がん性ドライバー変異である遺伝子融合が検出された被験者のためのがん治療剤であって、ALK阻害活性を有する物質を含む、前記治療剤。
［態様４６］
　前記ALK阻害活性を有する物質がロルラチニブである、態様４５に記載の治療剤。
［態様４７］
　がん治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）態様３８～４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤の有効成分として選択する工程。
［態様４８］
　態様４７に記載のスクリーニング方法によって選択された物質を有効成分として含むがん治療剤。
［態様４９］
　がんの治療方法であって、態様１１～２０のいずれか一項に記載の方法により発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有すると判定された被験者に、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を投与する工程を含む、方法。
　本発明により、がんの新たな治療標的となる新規発がん性ドライバー遺伝子を提供することが可能となる。さらに、本発明により、新規発がん性ドライバー遺伝子に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法、そのようながんの患者に適した治療を行う方法およびがん治療剤、ならびにがん治療剤のスクリーニング方法等を提供することが可能となる。
図１は、非小細胞肺がん患者の全RNAシーケンス解析で同定されたCLIP1-LTK融合遺伝子を示す。検出されたCLIP1-LTK融合遺伝子転写産物のスパニングリード（上段）およびジャンクションリード（下段）を示す。 図２は、野生型CLIP1タンパク質（上段）、野生型LTKタンパク質（中段）、およびCLIP1-LTK融合タンパク質（下段）の略図を示す。直線はブレークポイントを示す。CC、コイルドコイルドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン。 図３は、患者番号１におけるCLIP1-LTK遺伝子転写産物のRT-PCRによる検出を示す。プライマーの位置を上部に示す。CLIP1-LTK融合タンパク質を発現しているPC9細胞から単離したcDNAを陽性対照として使用し、モック細胞から単離したcDNAを陰性対照として使用した。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）mRNAも示す。Mは100bp　DNAラダーマーカーである。 図４は、CLIP1-LTK融合遺伝子転写産物のサンガーシーケンス解析の電気泳動図を示す。患者由来RNAからcDNAを精製し、CLIP1-LTK-F3プライマーおよびCLIP1-LTK-R3プライマーを用いたRT-PCRに供した。PCR産物は、各プライマーを用いて直接シーケンス解析した。 図５は、プライマーF5およびプライマーR3のプライマーセットを用いた、CLIP1-LTK遺伝子転写産物についての、肺がん検体のスクリーニングを示す。２例の陽性試料（#2および#3）、およびGAPDHを含む代表的なRT-PCRスクリーニングのパネルを示す。 図６は、CLIP1-LTK融合タンパク質の恒常的なチロシンキナーゼ活性を示す。NIH3T3細胞に、空ベクター、野生型LTK発現プラスミド、またはCLIP1-LTK発現プラスミドを一過性に導入した。細胞抽出物をウェスタンブロッティング解析に供した。 図７は、NIH3T3安定発現細胞の光学顕微鏡画像を示す。NIH3T3安定発現細胞は、１０ｃｍプレートに、２×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、細胞が１００％コンフルエントに達するまで、２～３日間培養した。バー＝１００μｍ。 図８は、軟寒天コロニー形成アッセイによるNIH3T3安定発現細胞の足場非依存的コロニーの代表的な画像（左）、および測定したコロニー径の平均±標準偏差（右）を示す。バー＝１００μｍ。 図９は、CLIP1-LTKによるLTKリン酸化（ａ、Ba/F3細胞；ｂ、NIH3T3細胞）を示す。 図１０は、CLIP1-LTKによるIL-3非依存性の増殖（Ba/F3細胞）を示す。 図１１は、CLIP1-LTKの化学的阻害剤のスクリーニングを示す。NIH3T3にpCMV3-CLIP1-LTKを一過性に導入し、２４時間培養した後、示す通りの薬剤によって６時間処理した。細胞抽出物をウェスタンブロッティング解析に供した。 図１２は、NIH3T3-CLIP1-LTK細胞における足場非依存的コロニー形成の抑制を示す。 図１３は、Ba/F3-CLIP-LTK細胞の細胞生存率アッセイを示す。Ba/F3-CLIP-LTK細胞は、示す通りの薬剤で、濃度を増加させながら、４８時間処理した。 図１４は、ロルラチニブによるCLIP-LTKキナーゼ活性およびその下流のシグナル伝達の阻害を示す。Ba/F3-CLIP1-LTK細胞（６ウェルプレート中、４×１０５細胞／ウェル）を、ロルラチニブで、濃度を増加させながら２４時間処理し、細胞抽出物をウェスタンブロッティング解析に供した。 ロルラチニブを１日当たり１００ｍｇ経口投与した患者１の右肺および肝臓のＣＴスキャン画像の時系変化を示す。 図１６は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＣＬＩＰ１－ＬＴＫによる形質転換活性の評価を示す。 図１７は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＣＬＩＰ１－ＬＴＫ発現腫瘍に対するロルラチニブの効果を示す。 図１８は、ロルラチニブを１日当たり１００ｍｇ経口投与した患者１の肺および肝臓のＣＴスキャン画像の時系変化（ベースライン、２ヶ月後、５ヶ月後）を示す。 図１９は、ロルラチニブを１日当たり１００ｍｇ経口投与した患者１の全身ＰＥＴ画像の時系変化を示す。 図２０は、ｂｒｅａｋ－ａｐａｒｔ蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイによる、ヒト腫瘍細胞およびヒト非腫瘍細胞におけるＬＴＫ遺伝子再編成の検出を示す。 図２１Ａ～Ｃは、LTK融合遺伝子におけるLTK遺伝子変異の、ロルラチニブ感受性に対する影響を示す。 図２１Ａ～Ｃは、LTK融合遺伝子におけるLTK遺伝子変異の、ロルラチニブ感受性に対する影響を示す。 図２１Ａ～Ｃは、LTK融合遺伝子におけるLTK遺伝子変異の、ロルラチニブ感受性に対する影響を示す。 図２２Ａ～Ｃは、LTK変異を有するCLIP1-LTK融合蛋白を発現させた細胞におけるALK/LTK阻害活性を有する各種薬剤の感受性の評価を示す。 図２２Ａ～Ｃは、LTK変異を有するCLIP1-LTK融合蛋白を発現させた細胞におけるALK/LTK阻害活性を有する各種薬剤の感受性の評価を示す。 図２２Ａ～Ｃは、LTK変異を有するCLIP1-LTK融合蛋白を発現させた細胞におけるALK/LTK阻害活性を有する各種薬剤の感受性の評価を示す。
　後述する実施例において示すとおり、本発明者らは、発がん性ドライバー変異として、LTK遺伝子融合を初めて見出した。本発明はかかる知見に基づき、当該遺伝子融合の検出方法、当該発がん性ドライバー変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者の同定方法、がんの治療方法およびがん治療剤、がん治療剤のスクリーニング方法等を提供する。
＜発がん性ドライバー変異＞
　発がんの直接的な原因となる遺伝子を発がん性ドライバー遺伝子（本明細書では、単にドライバー遺伝子と呼ぶことがある）という。発がん性ドライバー遺伝子に生じる変異を発がん性ドライバー変異（本明細書では、単にドライバー変異と呼ぶことがある）といい、これは、がんの責任変異と互換的に用いられる用語である。典型的には、ある変異が見出されたがん組織において、既知のドライバー変異（全米総合がんネットワーク（National Comprehensive Cancer Network (NCCN)）ガイドラインに記載されたドライバー変異。本願出願時においては、EGFR/ALK/ROS1/BRAF/MET/NTRK/HER2/RET/KRAS遺伝子変異）がいずれも存在しない場合（すなわち、当該変異が前記既知のドライバー変異と相互排他的に存在する場合）、当該変異は発がん性ドライバー変異であるということができる。
＜具体的な発がん性ドライバー変異＞
　以下、本発明における具体的な発がん性ドライバー変異である遺伝子融合について説明する。遺伝子融合が生じた遺伝子を融合遺伝子と呼ぶ。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
　本発明における発がん性ドライバー変異である遺伝子融合は、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現を生じる変異である：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）。
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
　LTKは、インスリン受容体スーパーファミリーの中で、ALKと共にALK/LTKサブファミリーを形成するメンバーであり、ヒトであれば15q15に存在する遺伝子にコードされ、典型的には配列番号４で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_002335.2）からなるタンパク質である。LTKタンパク質は、キナーゼドメインを有することを特徴としており、キナーゼドメインは、ヒトであれば配列番号４で表されるアミノ酸配列の510～786位のアミノ酸配列に該当する。LTK遺伝子は、これまで単独でも融合遺伝子としてもドライバー遺伝子としての報告はなかった。
　本発明は、LTK遺伝子が他の遺伝子と融合することにより、ドライバーとしての機能を発揮することを初めて見出したことに基づくものである。したがって、LTK遺伝子の融合パートナーとなるパートナー遺伝子は、LTK遺伝子と融合することができ、その結果、ドライバーとしての機能が発揮される遺伝子であれば限定はされないが、たとえば融合ポリペプチドを二量体形成することができる二量体形成ドメインを含む遺伝子である。二量体形成ドメインは、融合ポリペプチドを二量体形成することができるタンパク質ドメインであれば特に限定はされないが、たとえばコイルドコイルドメインが挙げられる。本発明におけるパートナー遺伝子は、たとえばCLIP1遺伝子である。CLIP1タンパク質は、微小管プラス端集積タンパク質ファミリーのメンバーであり、ヒトであれば12q24に存在する遺伝子にコードされ、典型的には配列番号６で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001234926.1）からなるタンパク質である。CLIP1タンパク質は、コイルドコイルドメインを有することを特徴としており、コイルドコイルドメインは、ヒトであれば配列番号６で表されるアミノ酸配列の350～1353位のアミノ酸配列に該当する。
　本発明の融合ポリペプチドは、LTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　本発明の融合ポリペプチドには、LTKタンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、本発明の融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　本発明の融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、LTKタンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。LTK融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　本発明の融合ポリペプチドには、パートナー遺伝子の二量体形成ドメインが含まれていてもよい。本発明の融合ポリペプチドが、パートナー遺伝子の二量体形成ドメインを含む場合、二量体形成ドメインの全部を含んでもよいし、本発明の融合ポリペプチドを二量体形成し得る限り、二量体形成ドメインの一部を含んでもよい。本発明の融合ポリペプチドが二量体形成するか否かは、ゲルろ過クロマトグラフィー、架橋剤処理とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の組合せなどの公知の方法により確認することができる。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明の融合ポリペプチドは、N末端側に存在するコイルドコイルドメインを介して二量体形成して自己リン酸化し、恒常活性化することによりがん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、「キナーゼドメイン」「二量体形成ドメイン」「コイルドコイルドメイン」等のタンパク質ドメインに関する用語は、対応する遺伝子ドメインについても用いられる。
　本発明において、上記本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、本発明の融合ポリヌクレオチドとも称する）は、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドである：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）。本発明の融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明の融合ポリヌクレオチドにおいて、パートナー遺伝子ポリヌクレオチドは、コイルドコイルドメインのような二量体形成ドメインを含むものであってよい。本発明の融合ポリヌクレオチドにおいて、パートナー遺伝子ポリヌクレオチドは、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドであってよい。
　本発明の融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドであり得る：
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号2で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号2で表されるアミノ酸配列中、融合点は、1083位と1084位の間に位置する。すなわち1083位までがCLIP1、1084位以降がLTKである。
　上記(b)において、「1若しくは複数のアミノ酸」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のアミノ酸を意味する。
　上記(c)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくBLASTXまたはBLASTPと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
　また本発明の融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記（a'）～（d'）のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（a'）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（b'）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（d'）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号１で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号１で表される塩基配列中、融合点は、4383位および4384位の間に位置する。すなわち4383位までがCLIP1、4384位以降がLTKである。
　上記(b')において、「ストリンジェントな条件下」とは、特に記載した場合を除き、中程度または高程度にストリンジェントな条件をいう。
　中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40～50℃での、約50％ホルムアミド、2～6×SSC（または、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；および約40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件および／または洗浄条件を含んでいてもよい。
　高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度が含まれる。典型的には、約65℃、0.2～6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65～68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
　いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄および洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、および1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
　上記(c')において、「1若しくは複数のヌクレオチド」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のヌクレオチドを意味する。
　上記(d')において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。塩基配列の同一性は、前記アルゴリズムBLASTに基づくBLASTNと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。
　本発明の融合ポリヌクレオチドは、そのLTK遺伝子部分において変異を有するものであってもよい。LTK遺伝子部分とは、ヒトの場合は配列番号１で表される塩基配列における4384位以降の部分をいい、ヒト以外の生物の場合は、前記ヒトLTK遺伝子部分に対応するオーソログをいう。LTK遺伝子部分における変異は、好ましくはI565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異であり、より好ましくは、L650Fを含むLTK変異をもたらす変異である。
＜発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出方法＞
本発明は、前記遺伝子融合の検出方法（以下、本発明の検出方法とも称する）を提供する。本発明の検出方法は、がんを有する被験者由来の単離された試料における前記いずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、被験者は、哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、ヒトが好ましい。
　がんを有する被験者は、がんに罹患している被験者のみならず、がんに罹患している疑いのある被験者、又は将来がんになるリスクを有する被験者であってもよい。本発明の検出方法を適用する対象となる「がん」としては、前記遺伝子融合が検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは肺がんであり、さらに好ましくは非小細胞肺がんである。
　被験者由来の「単離された試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムDNA抽出物、mRNA抽出物、mRNA抽出物から調製されたcDNA調製物やcRNA調製物等）やタンパク質抽出物も含む。ゲノムDNA、mRNA、cDNA又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　また「単離された試料」は、前記がんが存在するか又は存在すると疑われる臓器由来であることが好ましく、例えば、小腸、脾臓、腎臓、肝臓、胃、肺、副腎、心臓、脳、膵臓、大動脈等に由来するものが挙げられるが、より好ましくは肺由来である。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドの検出は、自体公知の手法を用いて行なうことができる。
　ゲノムDNAからの転写産物（mRNAまたはmRNAから調製したcDNA）を対象とする場合、例えば、RT-PCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、cDNAマイクロアレイ解析等を利用してmRNA又はcDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　またゲノムDNAを対象とする場合、例えば、in situハイブリダイゼーション（ISH）、ゲノムPCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析等を利用してゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　これらの手法はそれぞれ単独で利用することができるが、組み合わせて利用してもよい。例えば、前記遺伝子融合は、融合ポリペプチドを発現することによりがん化に寄与すると考えられることから、ゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出する場合（例えばin situハイブリダイゼーション等による）には、転写産物またはタンパク質が生成することをさらに確認すること（例えばRT-PCR、免疫染色法等による）も好ましい。
　ハイブリダイゼーション技術（例えば、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット法、マイクロアレイ解析、in situハイブリダイゼーション（ISH）など）により融合ポリヌクレオチドを検出する場合には、前記融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識する」とは、ストリンジェントな条件で、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を含めて当該融合ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドから、当該融合ポリヌクレオチドを識別して認識することをいう。
　本発明の検出方法においては、治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いため、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、in situハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
　in situハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドとして少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（融合ポリヌクレオチド）を検出することができる。
（α）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子（たとえばCLIP1遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側LTK遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（β）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子と3’側LTK遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　本発明にかかる5’側融合パートナー遺伝子、たとえばCLIP1遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはNCBI Entrez Gene: 6249で特定される遺伝子である。
　また、本発明にかかるLTK遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはNCBI Entrez Gene: 4058で特定される遺伝子である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変化しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。後述するように、本発明者らは、変異が生じたLTK遺伝子部分を含む本発明の融合遺伝子も治療標的となり得ることを見出した。
　本発明の（α）に記載のプローブであるポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子（たとえばCLIP1遺伝子）の塩基配列および／または3’側LTK遺伝子の塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（α１）～（α３）に記載のポリヌクレオチドである：
（α１）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ；
（α２）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）との組み合わせ；
（α３）　3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ。
　上記（α１）～（α３）において、5’側融合パートナー遺伝子がCLIP1遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、CLIP1タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（α１）～（α３）において、3’側LTK遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、LTKタンパク質のキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　前記（α１）に記載のポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の(α1-1)～(α1-3)のポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる：
(α1-1) 5’側融合パートナータンパク質の二量体形成ドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、LTKのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ；
(α1-2) 5’側融合パートナータンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、LTKのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ；または
(α1-3) CLIP1のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、LTKのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
　本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（α）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、5’側融合パートナー遺伝子（たとえばCLIP1遺伝子）と3’側LTK遺伝子との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（β）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子と3’側LTK遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：1に記載の塩基配列中の融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　た、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外に放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、33Ｐ、32Ｐ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）等）、によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と3’側LTK遺伝子プローブ１とを用いる場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と5’側融合パートナー遺伝子２とを用いる場合、または3’側LTK遺伝子プローブ２と3’側LTK遺伝子プローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてin situハイブリダイゼーションを行った場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と3’側LTK遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルと5’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルとの分離、3’側LTK遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルと3’側LTK遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（
ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
　前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドを用いて、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記in situハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（α）のポリヌクレオチドを用いた場合、5’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと3’側LTK遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（β）のポリヌクレオチドを用いて融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（β）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。基板としては、オリゴまたはポリヌクレオチドを固相化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーなどを挙げることができる。
　本発明の検出方法においては、PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出することも好ましい。
　PCRにおいては、前記生体試料から調製したDNA（ゲノムDNA、cDNA）やRNAを鋳型として融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できる」とは、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を増幅することなく、当該融合ポリヌクレオチドのみを増幅できることをいい、当該融合ポリヌクレオチドの全部が増幅されてもよいし、融合点を含む当該融合ポリヌクレオチドの一部が増幅されてもよい。
　PCR等で利用する「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマー（フォワードプライマー）とアンチセンスプライマー（リバースプライマー）とからなり、センスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側の塩基配列から設計し、アンチセンスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から3’末端側の塩基配列から設計する。またこれらのプライマーは、PCR法による検出の精度や感度の観点から、通常PCR産物が5 kb以下になるよう設計される。プライマーの設計は、公知の手法により適宜行なうことができ、例えば、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems）を利用することができる。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常15塩基以上（好ましくは16、17、18、19または20塩基以上、より好ましくは21塩基以上）であり、100塩基以下（好ましくは90、80、70、60、50または40塩基以下、より好ましくは30塩基以下）である。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、CLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドに対してはフォワードプライマーとして配列番号7で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび／または配列番号８で表される塩基配列からなるポリペプチドと、リバースプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、が挙げられる（後述の表１を参照のこと）。
　PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、PCR産物を対象としてダイレクトシークエンシングを行い、融合点を含む塩基配列を決定することで、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。シークエンシングは公知の手法により行うことができ、シークエンサー（例えば、ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）などを）を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
　またPCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、TaqManプローブ法により、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。TaqManプローブ法において使用するプローブとしては、例えば前記（α）または（β）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。プローブは、レポーター色素（例えば、FAM、FITC、VIC等）とクエンチャー（例えば、TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGBなど）で標識される。
　上記プライマー及びプローブは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。またその一部又は全部において、PNA（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、LNA（登録商標、locked nucleic acid、Bridged Nucleic Acid、架橋化核酸）、ENA（登録商標、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、GNA（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、TNA（Threose nucleic acid、トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。また上記プライマー及びプローブは、二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
　また上記プライマーおよびプローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含んでいてもよく、標的配列の相補配列に対して通常80％以上、好ましくは90、91、92、93、94％以上、より好ましくは95、96、97、98、99％以上の同一性を有し、最も好ましくは100％の同一性を有する。
　上記プライマー及びプローブは、例えば、本明細書に記載された塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　本発明の検出方法においては、全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング）またはゲノムシークエンシングにより融合ポリヌクレオチドを検出してもよい。これらの手法は、例えば、次世代シークエンサー（例えば、ゲノムアナライザーIIx（Illumina社）、ハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社）ゲノムシークエンサー FLX System（Roche社）など）を使用して製造者の説明書に従って行なうことができる。RNAシークエンシングは、例えば、市販のキット（例えば、mRNA-Seqサンプル調製キット（Illumina社）など）を用いて製造者の説明書に従ってトータルRNAからcDNAライブラリーを調製し、これを次世代シークエンサーを使用するシークエンシングに供することにより行なうことができる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（すなわち、融合ポリヌクレオチド）を対象とする場合、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、RIA法、ELISA法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析などを利用して当該翻訳産物を検出することができる。これらの方法においては、融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体が用いられる。ここで「融合ポリペプチドを特異的に認識する」とは、当該融合ポリペプチドの融合点からN末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質を含めて当該融合ポリペプチド以外のタンパク質を認識することなく、当該融合ポリペプチドのみを認識することをいう。本発明の検出方法において使用される「融合ポリペプチドを特異的に認識する」抗体は、1つの抗体であってもよいし、2つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、N末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質には結合しない抗体を意味する。
　また「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせも挙げられる。これら2つの抗体を用いてサンドイッチELISA、免疫染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などを行なうことにより、融合ポリペプチドを検出することができる。
　本発明において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前記抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばFab、Fab’、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体などが挙げられる。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEなどのいずれのアイソタイプを有する抗体であってもよいが、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチド、前記融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチド、または前記融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。市販の抗体を利用してもよい。また標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインGまたはプロテインA等を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜がんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法＞
　前記遺伝子融合は発がん性ドライバー変異であり、LTKキナーゼ活性の恒常活性化により、がんの悪性化等に寄与していると考えられる。そのため、このような遺伝子融合が検出されるがん患者においては、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質による治療が有効である蓋然性が高い。
　したがって、本発明は、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法（以下、本発明の同定方法とも称する）を提供する。
　本発明の同定方法は、下記の工程を含む：
（1）被験者由来の単離された試料において、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
　本発明者らは、LTK遺伝子部分に変異を有する本発明の融合遺伝子であっても、治療標的となり得ることを見出した。したがって、本発明の同定方法に用いる融合ポリヌクレオチドは、そのLTK遺伝子部分において変異を有するものであってよい。LTK遺伝子部分とは、ヒトの場合は配列番号１で表される塩基配列における4384位以降の部分をいい、ヒト以外の生物の場合は、前記ヒトLTK遺伝子部分に対応するオーソログをいう。LTK遺伝子部分における変異は、好ましくはI565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異であり、より好ましくは、L650Fを含むLTK変異をもたらす変異である。同様に、本発明の同定方法に用いる融合ポリペプチドは、LTK部分において変異を有するものであってよい。
　本発明の同定方法において、「がんの患者またはがんのリスクを有する被験者」は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している疑いのある哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の同定方法を適用する対象となる「がん」としては、前記遺伝子融合のうちいずれかが検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは肺がんであり、さらに好ましくは非小細胞肺がんである。
　本発明の同定方法において、「治療効果」とは、がん治療の効果であって、患者に対する有益な効果であれば特に限定されず、例えば、腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果、延命効果などが挙げられる。
　本発明の同定方法において、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合に関してがん治療の有効性を評価する対象となる「発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質」（以下、本発明の同定方法における対象物質とも称する）としては、本発明の融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　本発明の融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、本発明の融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　本発明の融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、LTKキナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、本発明の融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、本発明の融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型LTKタンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質としては、たとえばALK阻害活性を有する物質が挙げられ、非限定的に、クリゾチニブ（crizotinib）、セリチニブ（ceritinib）、アレクチニブ（alectinib）、ブリガチニブ（brigatinib）、ロルラチニブ（lorlatinib）、エヌトレクチニブ（entrectinib）、レポトレクチニブ（repotrectinib）、およびギルテリチニブ（giltertinib）を含む。
　これらの物質は、たとえば、本明細書中に開示されたCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドおよび／またはCLIP1-LTK融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また、後述するスクリーニング方法によって選択された物質を利用してもよく、市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対して投与するがん治療剤の有効成分として利用することができる。
　本発明の同定方法における工程(1)は、前記本発明の検出方法に含まれる工程と同様に実施することができる。
　本発明の同定方法における工程(2)では、工程(1)でがんを有する被験者（すなわちがんの患者またはがんのリスクを有する被験者）由来の単離された試料において融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定され、一方、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されなかった場合には、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらす可能性
が低いと判定される。
　本発明の同定方法によれば、がんの患者またはがんのリスクを有する被験者の中から発がん性ドライバー変異として新たに見出した遺伝子融合の陽性例を検出し、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であり、本発明はそのような対象に適した治療を行うことが可能になる点で有用である。
＜発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出用キット＞
　以上のように、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出用キット（以下、本発明のキットとも称する）を提供する：
（A）以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；
（B）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
　本発明者らは、LTK遺伝子部分に変異を有する本発明の融合遺伝子であっても、治療標的となり得ることを見出した。したがって、融合遺伝子がLTK融合遺伝子である場合、本発明のキットに用いる融合ポリヌクレオチドは、そのLTK遺伝子部分において変異を有するものであってよい。LTK遺伝子部分とは、ヒトの場合は配列番号１で表される塩基配列における4384位以降の部分をいい、ヒト以外の生物の場合は、前記ヒトLTK遺伝子部分に対応するオーソログをいう。LTK遺伝子部分における変異は、好ましくはI565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異であり、より好ましくは、L650Fを含むLTK変異をもたらす変異である。
　本発明のキットには、ポリヌクレオチドや抗体に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、本発明の融合ポリヌクレオチド、あるいはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、PCR用試薬、in situハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（DAPI等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインG、プロテインA）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を適宜組み合わせて含めることができる。本発明のキットには、使用説明書を含めることもできる。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の検出方法を容易に実施することが可能である。
　本発明のキットは、被験者が、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者であるか否かまたはがんのリスクを有するか否かを診断するためにも利用することができる。
　本発明の検出方法及び検出用キットは、発がん性ドライバー変異として新たに見出した遺伝子融合の検出を可能にするものであり、後述のように当該遺伝子融合の陽性例を同定し個別化医療を適用する上で極めて有用である。
＜がんの治療方法およびがん治療剤＞
　上記の通り、本発明の同定方法により、前記遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがん患者が同定される。そのため、がん患者のうち、当該融合遺伝子を保持する患者に選択的に当該物質を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんの治療方法であって、上記本発明の同定方法により当該物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、当該物質を投与する工程を含む方法（以下、本発明の治療方法とも称する）を提供する。
　また、本発明の治療方法において投与される物質はがん治療剤の有効成分として機能することから、本発明はさらに、前記遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分とするがん治療剤（以下、本発明のがん治療剤とも称する）を提供する。
　本発明のがん治療剤の有効成分としては、上記本発明の同定方法に関連して、前記遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質として記載した物質が挙げられる。
　本発明のがん治療剤は、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、および／またはその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
　本発明のがん治療剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
　本発明のがん治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。
　本発明の治療方法およびがん治療剤は、従来知られておらず本願発明により明らかとなった特定の発がん性ドライバー変異を有する患者の治療を可能にするため有用である。
＜がん治療剤のスクリーニング方法＞
　本発明は、前記遺伝子融合を有するがん患者に対して治療効果をもたらすがん治療剤の有効成分のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法とも称する）を提供する。本発明のスクリーニング方法により、前記本発明の融合ポリペプチド（たとえばCLIP1-LTK）のうちいずれかの発現および／または活性を抑制する物質を、がん治療剤の有効成分として得ることができる。
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、低分子化合物、化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品等が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、被験物質が本発明の融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制するか否かを評価可能である限り、いかなる形態であってもよい。典型的には、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む：
（1）本発明の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤の有効成分として選択する工程。
　工程（1）では、本発明の融合ポリペプチドを発現している細胞と被験物質を接触させる。対照として、被験物質を含まない溶媒（例えば、DMSOなど）を用いることができる。当該接触は、培地中で行うことができる。培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6～約8であり、培養温度は約30～約40℃であり、培養時間は約12～約72時間である。
　本発明の融合ポリペプチドを発現している細胞としては、例えば、内在的に当該融合ポリペプチドを発現しているがん組織由来の細胞、当該細胞から誘導された細胞株、遺伝子工学的に作製された細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。ある細胞が本発明の融合ポリペプチドを発現しているか否かは、上記本発明の検出方法を利用して確認することもできる。また細胞は、通常哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒトの細胞である。
　工程（2）では、前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かが決定される。融合ポリペプチドの発現は、細胞におけるmRNAレベルまたはタンパク質レベルを公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット法、定量的PCR法、イムノブロット法、ELISA法等を用いて決定することにより測定することができる。また融合ポリペプチドの活性も、公知の分析方法（例えば、キナーゼ活性測定など）により測定することができる。得られた測定値を被験物質と接触させない対照細胞における測定値と比較する。測定値の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被験物質と接触させた細胞における測定値が対照と比較して有意に低い場合、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　あるいは、これらの融合ポリペプチドを発現している細胞は、増殖が亢進していることから、当該細胞の増殖を本工程における決定のための指標とすることができる。この場合、まず、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を測定する。細胞増殖の測定は、セルカウント、3Hチミジンの取り込み、BRDU法等の自体公知の方法により行うことができる。次に、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を、被験物質と接触させない対照細胞の増殖と比較する。増殖レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質と接触させない対照細胞の増殖は、被験物質と接触させた細胞の増殖の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。比較の結果、被験物質と接触させた当該細胞の増殖が抑制された場合に、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　工程（3）では、工程（2）において融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された被験物質をがん治療剤の有効成分として選択する。
　本発明者らは、LTK遺伝子部分に変異を有する本発明の融合遺伝子であっても、治療標的となり得ることを見出した。したがって、融合遺伝子がLTK融合遺伝子である場合、本発明のスクリーニング方法に用いる融合ポリペプチドは、そのLTK部分において変異を有するものであってよい。LTK部分における変異は、好ましくは、ヒトの場合、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす変異であり、より好ましくは、L650Fを含むLTK変異をもたらす変異である。ヒト以外の生物の場合、LTK部分における変異は、上記ヒトの場合の変異に対応する位置にLTK変異をもたらす変異であることが好ましい。
　以上のように、本発明のスクリーニング方法によれば、従来知られていなかった発がん性ドライバー変異を有する患者の治療に適用可能ながん治療剤を取得することが可能となる。さらに、LTK遺伝子部分にさらに変異を生じた発がん性ドライバー変異を有する患者に対しても、有効ながん治療剤を取得することも可能となる。たとえば、本発明のスクリーニング方法によって、LTK遺伝子部分に変異を有しない発がん性ドライバー変異を標的とするがん治療剤を取得することも可能である上に、そのようながん治療剤に耐性を示すようなLTK遺伝子部分における変異を有する発がん性ドライバー変異を標的とする、別のがん治療剤を取得することも可能である。
＜単離された融合ポリヌクレオチド、およびそれにコードされる単離された融合ポリペプチドまたはその断片＞
　本発明は、以下の式（I)で表される単離された融合ポリヌクレオチドを提供する：
　5'－A－B－3'（式I）
　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
　本明細書中、「単離された」物質とは、ある物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。本明細書において「単離された」とは、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、よりさらに好ましくは９５重量％以上、そして最も好ましくは９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、又は１００％の純度を有することを意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、また化学的に合成したポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含まれる。
　その他の各用語の意味については、上記＜具体的な発がん性を有するドライバー変異＞において記載した通りである。
　本発明のポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
　本発明の融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、本発明の融合ポリヌクレオチドを保持するがん組織等から調製したcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記がん組織等から調製したmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（PCR）を用いて増幅することにより調製することもできる。さらに、各融合ポリヌクレオチドの5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子のcDNAを材料とし、PCR、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
　本発明はまた、本発明の融合ポリヌクレオチドにコードされ、LTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離された融合ポリペプチド（以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する）、またはその断片をも提供する。
　「断片」とは、本発明の融合ポリペプチドの断片であって、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなるものをいう。当該部分配列に含まれる融合点の上流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのN末端までを含みうる。当該部分配列に含まれる融合点の下流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのC末端までを含みうる。断片の長さは、特に限定されないが、通常8アミノ酸残基以上（例えば、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100アミノ酸残基以上）である。
　本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る：
　CLIP1タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部およびLTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたCLIP1-LTK融合ポリペプチド。
　本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片も、自体公知の方法により作製することができる。例えば、上記のようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片は、本発明の検出方法等におけるマーカーとして使用することができ、また本発明の融合ポリペプチドに対する抗体の作製等にも使用することができる。
　本発明の単離された融合ポリヌクレオチドや融合ポリペプチドが、LTK遺伝子部分またはLTK部分に変異を有するものであってよいことは上述した通りである。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試薬＞
　NIH3T3細胞およびPhoenix-AMPHO細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションより購入した（それぞれ、CRL-1658およびCRL-3213）。Ba/F3細胞、WEHI細胞、およびBOSC23細胞は、ダニエル・G・テネン博士（ハーバード大学医学部）より提供された。PC9細胞は、パシ・ジャンネ博士（ダナファーバーがん研究所）より提供された。クリゾチニブ（crizotinib）、セリチニブ（ceritinib）、アレクチニブ（alectinib）、ブリガチニブ（brigatinib）、ロルラチニブ（lorlatinib）、エヌトレクチニブ（entrectinib）、レポトレクチニブ（repotrectinib）、およびギルテリチニブ（giltertinib）はセレック社より購入した。
＜産学連携全国がんゲノムスクリーニングプロジェクト（LC-SCRUM-Asia）＞
　本発明者らは、発がん性ドライバー変異を有する肺がん患者を同定して、有効な分子標的療法を提供するために、多施設共同肺がんゲノムスクリーニングプロジェクトプラットフォーム（LC-SCRUM-Asia）を２０１３年に設立し、２０２１年３月までに１万２千例を超える患者を解析してきた。
　DNA/RNAは、新鮮組織および凍結組織、および／またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から、AllPrep DNA/RNA Mini Kit（キアゲン社）を用いて抽出した。ALK、ROS1、RET融合遺伝子についてはRT-PCRで解析し、FISHで陽性を確認した。ターゲット次世代シーケンス解析（NGS）システム（Oncomine Comprehensive Assay（バージョン１または３）、Oncomine Precision Assay、および多遺伝子定量PCR（qPCR）アッセイも使用して、分子スクリーニングを行った。
＜全トランスクリプトームシーケンス解析（WTS）＞
　ターゲットNGSアッセイおよび多遺伝子qPCRによる最初の分子スクリーニングにより、既知の発がん性ドライバー変異を有さないことが確認された非扁平上皮NSCLC試料を優先的に選択した。TruSeq RNA Exome（イルミナ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて、残りのRNA試料（２０－１００ｎｇ）からcDNAライブラリーを調製した。ライブラリーは、NextSeq 550（イルミナ社）上で、NextSeq 500/550 High Output Kit バージョン２．５を用いた75bpリードのペアードエンドシーケンス解析に供した。STAR-fusion pipelineを用いて、読み取った配列のアラインメントおよび融合転写産物検出を実施し、検出した融合転写産物は、CTATデータベース（https://github.com/FusionAnnotator/CTAT_HumanFusionLib/releases）を用いてアノテーションした。
＜RT-PCRおよびサンガーシーケンス解析＞
　Superscript（商標） VILO（商標） MasterMix（インビトロジェン社）を使用して、全RNA（２０～２００ｎｇ）をCDNAに逆転写した。cDNAは、HotStarTaq DNA ポリメラーゼ（キアゲン社）を使用したPCR増幅に供した。PCR反応は、以下の条件下で、サーマルサイクラー中で実施した：９５℃で１５分、９４℃で１分および５５℃で１分および７２℃で１分を４０サイクル、最終伸長を７２℃で１０分。PCR産物は、ABI PRISM 3500×I Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、両方向から直接シーケンス解析した。PCRに用いたプライマーの配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜CLIP1-LTK融合遺伝子の機能的解析のためのDNA構築物＞
　空の（CV012）、CLIP1遺伝子をコードしている（HG18526-UT）、およびLTK遺伝子をコードしている（HG16063-CF）pCMV3ベクターは、シノバイオロジカル社から購入した。CLIP1-LTK融合遺伝子のcDNAは、In-fusion HD Cloning Plus kit（Z8910N、タカラバイオ株式会社）を用いて構築した。キナーゼ機能を破壊（kinase-dead、KD）したCLIP1-LTK-K1440M（LTK K544Mに対応）発現プラスミドは、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（#210518、アジレント社）を用いて生成した。また、CLIP1遺伝子、LTK遺伝子、CLIP1-LTK遺伝子、およびCLIP1-LTK-KD遺伝子のcDNAはPCR増幅して、MIGR１レトロウイルスベクター（#27490、アドジーン社）中にIn-fusion HD Cloning Plus kitを用いてサブクローニングした。EGFR-L858R融合遺伝子をコードするMIGR1は、既報のもの（Yasuda, H. et al. Structural, biochemical, and clinical characterization of  epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 insertion mutations in lung cancer. Sci Transl Med 5, 216ra177, doi:10.1126/scitranslmed.3007205 (2013)）を用いた。クローニングのためのオリゴヌクレオチドは表１に示したものを用いた。すべてのベクター構築物の完全性は、サンガーシーケンス解析によって確認した。
＜ウイルスの細胞導入＞
　空の、CLIP1遺伝子をコードしている、LTK遺伝子をコードしている、CLIP1-LTK遺伝子をコードしている、CLIP1-LTK-K1440M遺伝子をコードしている、およびEGFR-L858R遺伝子をコードしているMIGR1ベクターを、BOSC23細胞またはPhoenix-AMPHO細胞にトランスフェクションして、レトロウイルス粒子を産生した。トランスフェクションの２日後および３日後にレトロウイルス含有上清を回収し、Retro-X（商標） concentrator（Z1456N、タカラバイオ株式会社）を用いて、一晩、４℃で濃縮した。RetroNectinコートしたプレートにレトロウイルス粒子をあらかじめ装填しておいたRetroNectin-bound Infection Methodを用いて（T100A、タカラバイオ株式会社）、Ba/F3細胞に細胞導入した。NIH3T3細胞およびPC9細胞は、８μｇ／ｍＬのポリブレン（#12996-81、ナカライテスク社）を用いて細胞導入した。細胞導入された細胞は、ＧＦＰソーティングによって選択した。１０％のＦＢＳ、５％のWEHI条件培地（IL-3源として）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地中で、Ba/F3安定発現細胞を維持した。１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、NIH3T3安定発現細胞およびPC9安定発現細胞を維持した。
＜Ba/F3がん化アッセイ＞
　Ba/F3安定化細胞を3回洗浄し、１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中に再懸濁して、12ウェルプレートに、５×１０４の密度で三つ組みで播種した。
＜ウェスタンブロッティング＞
　細胞を５，０００ｒｐｍで2分間遠心分離し、ＳＤＳサンプルバッファー中に再懸濁して、速やかに5分間ボイルした。溶解物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社）にブロッティングした。ホスホ-ALK/LTK（pTyr1278/672：#6941）、ホスホ-Akt（pS473：#4060）、ホスホ-ERK 1/2（pT202/pY204：#9106）、total Akt（#4685）、total Erk 1/2（#9102）、BIM（#2819）、CLIP1（#8977）、PARP（#9532）、およびcleaved PARP（#5625）抗体は、セルシグナリングテクノロジー社（米国、マサチューセッツ州、ビバリー）から購入した。画像は、ImageQuant LAS 4000（GEヘルスケア社）を用いて取得した。
＜細胞生存率アッセイ＞
　Bs/F3細胞（１ウェルあたり１０，０００個）を９６ウェルプレートに播種し、＜試薬＞の項に記載した薬剤で４８時間処理し、Cell Counting Kit-8（CK04、富士フイルム社）を用いて、２時間、３７℃でインキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
＜軟寒天コロニー形成アッセイ＞
　足場非依存性増殖は、既報（Gainor, J. F. et al. Molecular Mechanisms of Resistance to First- and Second-Generation ALK Inhibitors in ALK-Rearranged Lung Cancer. Cancer Discov 6, 1118-1133, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-0596 (2016)）に従ってアッセイした。
＜統計解析＞
　スチューデントのt検定を用いて、統計的有意差を決定した。
＜結果：CLIP1-LTK遺伝子融合の同定＞
　今回、新規融合転写物を同定するために、本発明者らは、LC-SCRUM-Asiaコホートにおける非小細胞肺がん（NSCLC）患者由来の単離された試料のうち、全米総合がんネットワーク（National Comprehensive Cancer Network (NCCN)）ガイドラインに記載された既知のドライバー変異（EGFR/ALK/ROS1/BRAF/MET/NTRK/HER2/RET/KRAS遺伝子変異）について陰性の試料について、全RNAシーケンス解析（全トランスクリプトームシーケンス（WTS)）を実施した。
　解析した７５例の試料のうち、１例の患者において、染色体12q24上のCLIP1遺伝子とおよび染色体15q15上のLTK遺伝子とのインフレーム融合転写産物を同定した（図１）。CLIP1-LTK融合タンパク質は、完全なLTKキナーゼドメインおよび２つのCLIP1コイルドコイルドメインを有すると推定された（図２）。
＜結果：腫瘍試料に存在する遺伝子融合の、RT-PCRによる検出＞
　腫瘍試料に存在する遺伝子融合を評価することを目的として、RT-PCRのための２セットのプライマーを設計した。
　２例の転移部位（鎖骨上リンパ節および肝臓）から、予想したサイズのPCR産物が特異的に検出された（図３）。
　サンガーシーケンス解析により、発現している転写産物において、CLIP1のエキソン１６が、LTKのエキソン１１に融合していることが確認された（図４）。
＜結果：組織試料におけるLTK融合遺伝子の検出＞
　上記特異的プライマーを用いて、CLIP1-LTK融合遺伝子転写産物を検出するために、３２８例の肺がん患者由来腫瘍試料を調査した。その結果、２７９例の非扁平上皮NSCLCのうち２例（０．７％）が、当該融合遺伝子転写産物を発現していた（図５）。
　当該遺伝子融合について陽性であった、最初に同定された患者由来のものを含むすべての腫瘍において、他の既知の発がん性ドライバー変異が陰性であり、組織的に腺癌であった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらの結果は、CLIP1-LTK融合タンパク質が、他の既知の発がん性ドライバー変異とは排他的に発現していることを示唆する。小細胞肺がんからの３０例または扁平細胞肺がんからの１９例は、CLIP1-LTK融合タンパク質について陰性だった。
＜結果：CLIP1-LTK融合タンパク質は恒常的に活性化していて、がん化能を示す＞
　NIH3T3細胞に、CLIP1-LTKまたはLTKの発現構築物を一過性に導入した際、CLIP1-LTKタンパク質のリン酸化は強く検出されたが、野生型LTKのリン酸化はそれよりもかなり弱かった（図６）。
　次に、CLIP1-LTK融合タンパク質が、正常細胞をがん化する能力を有しているか否かについて調べた。この目的のために、広く使用されている２つの細胞株モデルを使用した：NIH3T3細胞およびBa/F3細胞。まず、上述したヒトのCLIP1、LTK、CLIP1-LTK、およびK1140M変異を有するCLIP1-LTK（CLIP1-LTK-K1140M、EML4-ALK K589Mに対応し、融合タンパク質のキナーゼ機能を破壊する変異）を含有するレトロウイルス構築物を生成した。リン酸化LTKに対する抗体により、CLIP1-LTKを発現しているNIH3T3細胞またはBa/F3細胞（NIH3T3-CLIP1-LTKまたはBa/F3-CLIP1-LTK）において強いリン酸化バンドが検出されたが、LTKまたはCLIP1-LTK-K1140Mを発現しているNIH3T3細胞またはBa/F3細胞では、これらの外来タンパク質が発現しているにもかかわらず、リン酸化バンドは検出されなかった。これらの結果により、CLIP1-LTK融合タンパク質が、安定発現細胞株において恒常的に活性化していること、すなわちリン酸化されていることが確認された。
　マウス線維芽細胞株であるNIH3T3細胞株は、がん化活性のためのモデルとして広く使用されている。CLIP1を発現しているNIH3T3細胞（NIH3T3-CLIP1）またはLTKを発現しているNIH3T3細胞（NIH3T3-LTK）は接触阻害されていて、形態的にはNIH3T3モック細胞と区別がつかなかった（敷石状線維芽細胞）。これとは対照的に、CLIP1-LTKを発現しているNIH3T3細胞（NIH3T3-CLIP1-LTK）は円形の形態を示し、接触阻害を喪失していた（図７）。興味深いことに、CLIP1-LTK-K1140Mを発現しているNIH3T3細胞（NIH-3T3-CLIP1-LTK-K1140M）は形態を変化させる能力を喪失し、密度依存的に増殖した。さらに、軟寒天コロニー形成アッセイにより、NIH3T3-CLIP1-LTKコロニーは、モック細胞コロニー、NIH3T3-CLIP1コロニー、またはNIH3T3-LTKコロニーと比較して、２週間の増殖の後、有意に大きいことが明らかになった（図８）。NIH3T3-CLIP1-LTKコロニーはさらに、がん化能を有することが知られていて陽性対照としての役割を果たすEGFR-L858Rを発現しているNIH3T3細胞よりも大きかった。CLIP1-LTK-K1140Mを発現しているNIH3T3細胞は、足場非依存的増殖を誘導する能力を喪失していた。
　本発明者らは、CLIP1-LTK融合タンパク質のがん化能をさらに評価した。Ba/F3は、増殖のためにIL-3を要求するマウスＢ前駆細胞であり、発がん性キナーゼの発現により、IL-3非依存性になる。CLIP1-LTK融合遺伝子を導入したBa/F3細胞であるBa/F3-CLIP1-LTKにおいて、LTKタンパク質が恒常的に活性化（リン酸化）し（図９）、IL-3非存在下でも細胞の生存及び増殖が可能となった（図１０）。
　これらの結果は、CLIP1-LTK融合タンパク質が、そのキナーゼ活性に依存的に、がん化を誘導することを実証する。
＜結果：キナーゼ阻害剤によるLTK融合タンパク質のキナーゼ活性の阻害および腫瘍の抑制＞
　LTKのキナーゼドメインとALKのキナーゼドメインは、およそ８０％の配列同一性を有する。ALKを阻害することが知られている７種のFDA承認または開発中チロシンキナーゼと、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるオシメルチニブ（osimertinib）の効果について、CLIP1-LTK発現構築物を一過性に導入したNIH3T3細胞において試験した。これらの阻害剤の内、ロルラチニブが最も強力な効果を示し、１０ｎＭにおいてCLIP1-LTKのリン酸化をほぼ完全に阻害した（図１１）。ロルラチニブは、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて、足場非依存的増殖も阻害した（図１２）。さらに、Ba/F3-CLIP1-LTK細胞を用いた細胞生存率アッセイにおいて、ロルラチニブは4.2ｎＭの高い５０％細胞増殖抑制濃度（IC50）を示し、その他のチロシンキナーゼ阻害剤も、IC50が２０ｎＭ以下と高い細胞増殖抑制効果を示した（図１３）。対照的に、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるオシメルチニブは、ALK阻害剤のような効果を示さず、そのIC50は１００ｎＭを超えた。
　また、Ba/F3-CLIP1-LTK細胞を、IL-3を含有するWEHI培地の存在下で培養した場合、ロルラチニブは細胞生存率を阻害する能力を完全に喪失した。このことは、ロルラチニブが非特異的な毒性を有する可能性を排除する。さらに、ロルラチニブによるCLIP1-LTKキナーゼ活性の阻害が、細胞増殖およびアポトーシスに関わる経路に影響し得るかどうかを調べた。ウェスタンブロット解析の結果、ロルラチニブは、１０ｎＭという低い濃度で、CLIP1-LTK、AKT、およびERKのリン酸化を阻害し、Bimの非リン酸化形態およびPARPの分解形態を誘導することが明らかになった（図１４）。
　これらの結果は、ALK阻害剤が本発明のLTK融合タンパク質の活性を抑制する物質として有効であることを示唆する。
＜結果：治療標的としてのLTK融合遺伝子＞
　NSCLC患者である患者１は４４歳のアジア人女性であり、軽度の喫煙歴を有し、ステージＩＶの肺腺癌を有する。当該患者は、４サイクルのカルボプラチン、ペメトレキセド、およびペムブロリズマブによる一次治療（first-line therapy）を受け、腫瘍縮小がもたらされた。しかし、ペメトレキセドおよびペムブロリズマブによるその後の維持療法に続いて、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）およびポジトロン断層法（ＰＥＴ）画像は急速な疾患の増悪を示し、原発腫瘍の拡大と、肝転移を含む複数の転移腫瘍を示した（図１５）。当該患者の腫瘍試料のＷＴＳおよびサンガーシーケンス解析により、CLIP1-LTK融合遺伝子が検出された。LTK標的療法による治療の同意を得た後、当該患者において、１日当たり１００ｍｇの通常用量のロルラチニブを開始した。当該患者における２週間および４週間のフォローアップ画像は、原発部位およびすべての転移部位における劇的な腫瘍サイズの減少を示した（図１５）。これらの結果は、ＬＴＫキナーゼ依存的腫瘍においてロルラチニブが高感受性であることを示している。そしてCLIP1-LTK融合遺伝子のようなLTK融合遺伝子を有するNSCLC患者において、ロルラチニブのようなLTKキナーゼ阻害剤が高い治療効果を示すことが示唆される。
＜結果：ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＣＬＩＰ１－ＬＴＫによる形質転換活性＞
　モック、ＣＬＩＰ１、ＬＴＫ、ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ、またはＣＬＩＰ１－ＬＴＫ－Ｋ１１４０Ｍを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ヌードマウスの側腹部に皮下注入した。その結果、ＣＬＩＰ１－ＬＴＫを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ）を注入したヌードマウスにおいてのみ、腫瘍が検出された（図１６）。興味深いことに、ＮＩＨ３Ｔ３－ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ－Ｋ１１４０Ｍを注入したマウスでは、腫瘍は観察されなかった。これらの結果は、ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ融合タンパク質のようなＬＴＫ融合タンパク質が、そのキナーゼ活性依存的に発がん性形質転換を誘導するという結論を指示する。
＜結果：ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＣＬＩＰ１－ＬＴＫ発現腫瘍に対するロルラチニブの効果＞
　ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ融合タンパク質のようなＬＴＫ融合タンパク質を発現している腫瘍に対するロルラチニブのようなＬＴＫキナーゼ阻害剤の活性を、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した。具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３－ＣＬＩＰ１－ＬＴＫ細胞を、ヌードマウスの側腹部に皮下注入し、腫瘍が概ね１００ｍｍ３の体積に達したときに、ロルラチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）またはビヒクル対照で２週間にわたり処置した。細胞生存率アッセイの結果と一致して、ロルラチニブ処置は、腫瘍増殖を顕著に阻害した（図１７）。
＜結果：治療標的としてのLTK融合遺伝子＞
　NSCLC患者である上記患者１において、１日当たり１００ｍｇの通常用量のロルラチニブを開始した後、２ヶ月及び５ヶ月のフォローアップＣＴ画像は、原発腫瘍、及び複数の転移腫瘍において、迅速かつ劇的な腫瘍サイズの減少を示した（図１８）。さらに、全身の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像によって示される通り、ベースラインにおけるすべての原発腫瘍及び転移腫瘍が、ロルラチニブ処置に対して劇的に応答した（図１９）。これらの結果は、ＬＴＫキナーゼ依存的腫瘍においてロルラチニブが高感受性であることをさらに指示する。そしてCLIP1-LTK融合遺伝子のようなLTK融合遺伝子を有するNSCLC患者において、ロルラチニブのようなLTKキナーゼ阻害剤が高い治療効果を示すことをさらに指示する。
＜結果：ヒト腫瘍細胞およびヒト非腫瘍細胞におけるＬＴＫ遺伝子再編成の検出＞
　上記患者１においてＬＴＫ遺伝子再編成を評価するために、ｂｒｅａｋ－ａｐａｒｔ蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行った。ＦＩＳＨアッセイは４μｍ厚切片のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を用いて実施した。ＬＴＫ遺伝子に隣接するように設計されたＬＴＫ　ＢＡ　プローブセット（ＬＴＫＢＡ２０－ＧＲＯＲ、Ｅｍｐｉｒｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）を、製造者のプロトコールに従ってプローブとして使用した。
　患者１由来非腫瘍細胞では、プローブはオレンジ（５’）－緑（３’）融合シグナルを示したが（図２０、左パネル）、腫瘍細胞は、わずか１個の融合シグナル、及びキナーゼドメインを含む１個の緑（３’）のシグナルを示した（図２０、右パネル）。この結果は、腫瘍におけるＬＴＫ遺伝子再編成の存在を示す。腫瘍細胞におけるオレンジのシグナル（５’）の欠損は、この染色体領域の欠失を示唆する。
＜結果：LTK融合遺伝子を標的としたロルラチニブ治療に対する耐性機序＞
　分子標的治療は、EGFR遺伝子変異やALK融合遺伝子を初めとするドライバー遺伝子に対して初期に高い抗腫瘍効果を認めるものの、ほぼ全例が耐性化を来すことがこれまでの知見によりわかっている。その耐性機序の約半数は、標的となるドライバー遺伝子に二次的変異が加わることによって生じる（Resistance mechanisms to osimertinib in EGFR-mutated non-small cell lung cancer. Br J Cancer. 2019 Oct;121(9):725-737；Targeting ALK: Precision Medicine Takes on Drug Resistance. Cancer Discov. 2017 Feb;7(2):137-155）。従って、LTK融合遺伝子を標的として、たとえばロルラチニブ治療を行った場合も、耐性、特にLTK遺伝子の遺伝子変異によるロルラチニブ耐性が生じることが予想された。
　上述のように、LTK遺伝子はALK遺伝子と高い相同性を示すことから、本発明者らはALK融合遺伝子に対するロルラチニブ治療中に生じる二次的なALK遺伝子変異に着目し、それらに相同するLTK変異の、ロルラチニブ感受性への影響を検証した。
　実験では、LTK変異（I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、またはG663A）を有するLIP1-LTK融合蛋白を発現させたBa/F3細胞、NIH3T3細胞を用いた（図２１Ａ）。野生型、および上記の遺伝子変異を有するCLIP1-LTK融合蛋白を発現させた細胞に対するロルラチニブの感受性を評価したところ、いずれの変異体においても野生型と比較し、IC50値の上昇が認められた（図２１Ｂ）。特にL650F変異ではロルラチニブのIC50は変異なしの場合と比較して10,000倍以上と高度耐性を示した。変異体ではロルラチニブによるLTKのリン酸化の抑制効果が減弱しており、細胞増殖試験と同様に、L650F変異においてロルラチニブの効果が減弱していた（図２１Ｃ）。
　これらの結果より、LTK融合遺伝子を標的としたロルラチニブ治療に対して、LTK遺伝子変異、特にL650F変異が耐性に寄与しうることが示された。
＜結果：LTK変異によるロルラチニブ耐性を克服する治療薬＞
　次に、本発明者らは、LTK変異を有するCLIP1-LTK融合蛋白を発現させた細胞に対するALK/LTK阻害活性を有する薬剤（ロルラチニブ、クリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、エヌトレクチニブ、レポトレクチニブ、ギルテリチニブ）の感受性を評価した。
　上述のようにL650F変異ではロルラチニブに対して高度に耐性（IC50=11,700 nM）となるが、ギルテリチニブはIC50=23.7 nMであった（図２２Ａ）。ギルテリチニブはFLT3遺伝子変異陽性急性骨髄性白血病に対して承認されている分子標的薬であり、LTK阻害活性を有している。承認用量（120 mg、1日1回）における、反復投与での血中濃度は680.23 ng/ml (1,230 nM)であり（医薬品インタビューフォーム(ゾパスタ40mg錠)　https://amn.astellas.jp/content/dam/jp/amn/jp/ja/di/doc/Pdfs/DocNo202109509_y.pdf）、L650F変異によるロルラチニブ耐性を克服しうると考えられた。ギルテリチニブはL650F変異体であっても、用量依存性にLTKキナーゼを阻害し、またアポトーシスを誘導した（図２２Ｂ）。
　次に、CLIP1-LTK（L650F変異）を導入したNIH3T3細胞をヌードマウスの皮下に注入し、形成した腫瘍に対して、ロルラチニブ（10 mg/kg、1日1回）、ギルテリチニブ（30 mg/kg、1日1回）、またはビヒクル対象で2週間治療した。細胞生存率アッセイの結果と同様、ロルラチニブでは腫瘍縮小効果が得られないのに対して、ギルテリチニブ治療により、腫瘍増殖を顕著に阻害した（図２２Ｃ）。

Claims (29)

  1. 　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料において、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
    　5'－A－B－3'（式I）
    　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
    　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
  2. 　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、請求項２に記載の方法。
  4. 　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
  5. 　融合ポリヌクレオチドが、下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、請求項４に記載の方法：
    （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
    （c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
  6. 　融合ポリヌクレオチドが下記（a'）～（d'）のいずれかである、請求項４に記載の方法：
    （a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  7. 　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす、請求項７に記載の方法。
  9. 　がんが肺がんである、請求項１に記載の方法。
  10. 　がんが非小細胞肺がんである、請求項９に記載の方法。
  11. 　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）被験者由来の単離された試料において、以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
    　5'－A－B－3'（式I）
    　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
    　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；ならびに
    （2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
  12. 　発がん性ドライバー変異である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
    （A）以下の式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド：
    　5'－A－B－3'（式I）
    　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
    　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；
    （B）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
    （C）前記式（I)で表される融合ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
  13. 　被験者が、発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者であるか否かまたはがんのリスクを有するか否かを診断するための、請求項１２に記載のキット。
  14. 　以下の式（I)で表される単離された融合ポリヌクレオチド：
    　5'－A－B－3'（式I）
    　（式中、5'は5'末端の位置を表し、Aはパートナー遺伝子ポリヌクレオチドを表し、BはLTK遺伝子ポリヌクレオチドを表し、3'は3'末端の位置を表す）
    　ここで、前記融合ポリヌクレオチドは、LTKのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
  15. 　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが二量体形成ドメインを含む、請求項１４に記載の融合ポリヌクレオチド。
  16. 　二量体形成ドメインが、コイルドコイルドメインである、請求項１５に記載の融合ポリヌクレオチド。
  17. 　パートナー遺伝子ポリヌクレオチドが、CLIP1遺伝子ポリヌクレオチドである、請求項１６に記載の融合ポリヌクレオチド。
  18. 　下記（a）～（c）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするCLIP1-LTK融合ポリヌクレオチドである、請求項１７に記載の融合ポリヌクレオチド：
    （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
    （c）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
  19. 　下記（a'）～（d'）のいずれかである、請求項１７に記載の融合ポリヌクレオチド：
    （a'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （b'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （c'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （d'）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  20. 　融合ポリヌクレオチドが、そのLTK遺伝子部分において変異を有する、請求項１４に記載の融合ポリヌクレオチド。
  21. 　前記LTK遺伝子部分における変異が、I565N、F568C、L590M、L592F、G596R、D597N、L650F、G663A、および２以上のこれらの組み合わせからなる群より選択されるLTK変異をもたらす、請求項２０に記載の融合ポリヌクレオチド。
  22. 　請求項１４～２１のいずれか一項に記載の融合ポリヌクレオチドにコードされ、LTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離された融合ポリペプチド、またはその断片。
  23. 　CLIP1タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部およびLTKタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたCLIP1-LTK融合ポリペプチドまたはその断片。
  24. 　請求項１１に記載の方法により発がん性ドライバー変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者のためのがん治療剤であって、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を含む、前記治療剤。
  25. 　前記物質がALK阻害活性を有する物質である、請求項２４に記載の治療剤。
  26. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により発がん性ドライバー変異である遺伝子融合が検出された被験者のためのがん治療剤であって、ALK阻害活性を有する物質を含む、前記治療剤。
  27. 　前記ALK阻害活性を有する物質がロルラチニブである、請求項２６に記載の治療剤。
  28. 　がん治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）請求項２２に記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
    （2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
    （3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤の有効成分として選択する工程。
  29. 　請求項２８に記載のスクリーニング方法によって選択された物質を有効成分として含むがん治療剤。
     
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US20160010068A1 (en) * 2013-02-22 2016-01-14 Boris C. Bastian Fusion polynucleotides and fusion polypeptides associated with cancer and particularly melanoma and their uses as therapeutic and diagnostic targets

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