WO2016084883A1 - 胆道がんにおける新規治療標的融合遺伝子 - Google Patents

胆道がんにおける新規治療標的融合遺伝子 Download PDF

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龍弘 柴田
康仁 新井
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国立研究開発法人国立がん研究センター
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    • G01N2800/7028—Cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a gene fusion that is a responsible mutation of cancer, and a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by the gene fusion has a therapeutic effect.
  • the present invention relates to a method for identifying a subject having a cancer risk.
  • Biliary tract cancer is a highly invasive cancer arising from bile duct epithelial cells in the liver (intrahepatic biliary tract cancer) and extrahepatic (extrahepatic biliary tract cancer).
  • the frequency of occurrence is high mainly in East Asia, but in recent years the frequency of occurrence is increasing worldwide, including Europe and the United States. In many cases, it is often detected in the advanced stage because of the lack of clinical symptoms in the early onset, and the prognosis is poor.
  • Surgical resection is the only complete cure, but the recurrence rate is high, and the 5-year survival rate is 15-25% of operable cases.
  • KRAS and BRAF gene mutations have been reported as responsible mutations (driver mutations) in biliary tract cancer, and GOPC-ROS1, which has recently been identified in brain tumors as a tyrosine kinase fusion gene, has also been reported in biliary tract cancers.
  • Driver mutations in cases without these abnormalities remain unidentified.
  • the FGFR (Fibroblast growth factor receptor) family is a general term for transmembrane tyrosine kinase molecules that function as receptors for FGF (Fibroblast growth factor receptor).
  • FGF Fibroblast growth factor receptor
  • four types of molecules belonging to the FGFR family, FGFR1 to FGFR4 are known. It has three Ig-like (immunoglobulon-like) regions in the extracellular region, one transmembrane region, and a tyrosine kinase region in the intracellular region.
  • the FGFR family is known to contribute to the development and progression of many cancers, including stomach cancer, breast cancer, uterine cancer, and bladder cancer, and is activated by various types of genomic abnormalities in cancer. It has been reported that this has occurred (Non-patent Document 1).
  • FGFR1 is known to cause gene amplification in breast cancer and ovarian cancer, gene mutation in melanoma, and gene translocation in leukemia and breast cancer.
  • FGFR2 it is known that gene amplification occurs in stomach cancer and breast cancer, and gene mutation occurs in uterine cancer and stomach cancer.
  • FGFR3 it is known that gene amplification occurs in bladder cancer and salivary gland cancer, and gene mutation occurs in bladder cancer, uterine cancer, myeloma, and prostate cancer.
  • Non-patent Document 2 FGFR1OP2-FGFR1
  • ZNF198-FGFR1 Non-patent Document 3
  • solid tumors including ERLIN2-FGFR1, FGFR2-AFF3, FGFR2-CASP7, and FGFR2-CCDC6 in breast cancer, BAG4-FGFR1 and FGFR2-KIAA1967 in lung cancer, and FGFR3- in brain and bladder cancer.
  • TACC3 has been reported (Non-patent Document 4).
  • the expression of its ligand FGF has been reported in literature (Non-patent Document 5).
  • FGFR2-BICC1 gene fusion (hereinafter referred to as FGFR2) in which exons 3 to 21 of the BICC1 gene are fused in-frame to exons 1 to 19 of the FGFR2 gene -BICC1 type 1) and FGFR2-AHCYL1 gene fusion in which exons 5 to 21 of AHCYL1 gene were fused in-frame to exons 1 to 19 of FGFR2 gene (Patent Document 1). It has been demonstrated that this gene fusion leads to activation of the FGFR2 protein, causing canceration of cells, and suppression of canceration by FGFR kinase inhibitors. At present, other research groups have reported FGFR2-TACC3, FGFR2-MGEA5, and FGFR2-KIAA1598 gene fusions (Non-patent Documents 6 and 7).
  • Non-patent Document 1 As the low-molecular-weight inhibitory compounds targeting FGFR, clinical development of AZD4547, TKI258, E3810, E7090, BIBF1120, Masitinib, BGJ398, PD173307 is currently underway. Development of antibody therapeutics targeting FGFR is also ongoing (Non-patent Document 1).
  • a fusion gene generated from two specific genes may have multiple variants with different fusion points, and by identifying such individual variants, stratification of patients in personalized medicine It is possible to further increase the accuracy of the conversion.
  • the present invention provides a means for detecting a mutation that identifies a mutation that can be a target for molecular therapy in cancers such as biliary tract cancer and can be an index for predicting the effectiveness of treatment with a drug
  • An object is to provide a means for identifying a cancer patient or a subject at risk of cancer for which a drug targeting a gene having the mutation or a protein encoded by the gene based on the mutation has a therapeutic effect. To do.
  • the present inventors have used a high-speed DNA sequence analysis technology, and in biliary tract cancers, FGFR2-TXLNA fusion gene, FGFR2-KCTD1 fusion gene, and FGFR2-BICC1 fusion gene.
  • FGFR2-BICC1 type 2 novel kinase fusion gene
  • cancer patients with biliary tract cancer or the like have a therapeutic effect based on the gene fusion, and a drug targeting the gene or a protein encoded by the gene has a therapeutic effect. Or it discovered that it was possible to identify the test subject who has the risk of cancer, and came to complete this invention.
  • fusion polynucleotide is any of the following (a) to (c): (A) FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more of sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 6 and having kinase activity.
  • the fusion polynucleotide is any of the following (a) to (c): (A) (i) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or
  • Cancer patients or cancer patients whose substances that suppress the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer have a therapeutic effect
  • a method for identifying a subject at risk comprising the following steps: (1) Detecting a fusion polynucleotide of any of the following (a) to (c) or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject: (A) a FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a coiled-coil domain of TXL
  • a kit for detecting gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) for cancer comprising any of the following (A) to (C) or a combination thereof: (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide; or (C) FGFR2 -An antibody that specifically recognizes a TXLNA fusion polypeptide, FGFR2-KCTD1 fusion polypeptid
  • An isolated FGFR2-TXLNA fusion polypeptide or fragment thereof comprising an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA and having kinase activity.
  • FGFR2-BICC1 type 2 fusion comprising an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a SAM domain of BICC1, but not a KH domain of BICC1 and having kinase activity A polypeptide or fragment thereof.
  • A a FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a coiled-coil domain of TXLNA
  • B a FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a BTB / PO
  • a substance that inhibits FGFR2 kinase activity is 3- [2,4-dimethyl-5-[[(Z) -2,3-dihydro-2-oxo-1H-indole-3-ylidene] methyl]- 1H-pyrrol-3-yl] propanoic acid, N- ⁇ 5- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) ethyl] -1H-pyrazol-3-yl ⁇ -4-[(3R, 5S) -3, 5-dimethylpiperazin-1-yl] benzamide, 1-[(2R, 4S, 5S) -4-azido-5- (hydroxymethyl) oxolan-2-yl] -5-methylpyrimidine-2,4-dione FGFR2-IIIb specific antibody, 3- (2,6-dichloro-3,5-dimethoxyphenyl) -1- [6-[[4- (4-ethylpiperazin-1-yl) phenyl
  • a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps: (1) A step of bringing a test substance into contact with a cell expressing a fusion polypeptide of any one of (a) to (c) below: (A) a FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, comprising a FGFR2 Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA and having kinase activity; (B) an FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide comprising an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a BTB / POZ domain of KCTD1 and having kinase activity; and (c) FGFR2- A BICC1 type 2 fusion polypeptide comprising a FGFR2 Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase
  • the present invention it becomes possible to detect an unknown responsible mutation of a specific cancer that has been clarified for the first time by the present invention, and a cancer patient in which cancer treatment based on the presence of the responsible mutation is effective or It becomes possible to identify a subject who has a risk of cancer and to treat the cancer patient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the domain structure of FGFR2-TXLNA, FGFR2-KCTD1, and FGFR2-BICC1 type2 fusion proteins.
  • Ig Ig-like domain
  • TM transmembrane region
  • CC coiled-coil domain
  • BT BTB / POZ domain
  • KH KH domain
  • SAM SAM domain.
  • the down arrow indicates the fusion point.
  • FIG. 2 shows the result of analyzing the activation of MAPK by expressing the wild type or kinase activity mutant (KD) of the FGFR2 fusion gene in the mouse fibroblast cell line NIH3T3. An asterisk indicates a phosphorylated FGFR2 fusion protein.
  • KD wild type or kinase activity mutant
  • FIG. 3 shows anchorage-independent growth of NIH3T3 cells expressing the FGFR2 fusion gene and its suppression by FGFR inhibitors (BGJ398 or PD173074). Bar: 100 ⁇ m.
  • FIG. 4 shows the results of examining the in vivo vivo tumorigenicity of the fusion polypeptide of the present invention. Arrowheads indicate tumor formation. The values in the lower left of each panel indicate that tumors were formed in all 4 sites when cells expressing wild-type FGFR2 fusion gene were transplanted (4/4) and 4 for the KD mutant FGFR2 fusion gene. It shows that no tumor was formed in all the sites (0/4).
  • the present inventors in cancer tissue, as cancer responsible mutation (driver mutation), three novel gene fusions, namely, FGFR2-TXLNA gene fusion, FGFR2-KCTD1 gene fusion, and A novel fusion type FGFR2-BICC1 gene fusion was found. Based on such findings, the present invention provides a method for detecting the gene fusion, a method for identifying a cancer patient or a subject having a cancer risk that is effective for cancer treatment based on the presence of the responsible mutation, and a method for treating cancer. Also provided are cancer therapeutic agents, screening methods for cancer therapeutic agents, and the like.
  • “responsible mutation of cancer” is a term used interchangeably with driver mutation, and refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • driver mutation refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • the mutation is responsible for cancer.
  • the “fusion point” in the fusion polynucleotide means a boundary where the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion are connected, and this is a boundary between two nucleotide residues. It is a boundary.
  • the “fusion point” in the fusion polypeptide means a boundary where the N-terminal polypeptide and the C-terminal polypeptide are connected, and is this a boundary between two amino acid residues, Or, if the gene fusion occurs within one codon, it is the single amino acid residue itself encoded by that codon.
  • FGFR2-TXLNA gene fusion This gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of FGFR2 protein and TXLNA protein (hereinafter also referred to as FGFR2-TXLNA fusion polypeptide).
  • FGFR2-TXLNA fusion polypeptide a mutation that causes the expression of a fusion protein of FGFR2 protein and TXLNA protein (hereinafter also referred to as FGFR2-TXLNA fusion polypeptide).
  • 10q26.1 and 1p35 A mutation caused by a translocation (t (1; 10)) with a breakpoint in the region of .1.
  • FGFR2 protein is a protein encoded by a gene present at 10q26.1 in humans.
  • the “FGFR2 protein” is human-derived, for example, a protein (isoform 1) identified by NCBI accession number NP_000132.3 (25- May-2014), NP_075259.4 (25 - May-2014) protein (isoform 2), NP_001138385.1 (10- May-2014) protein (isoform 3), NP_001138386.1 (25-May-2014) Protein (isoform 4), protein identified by NP_001138387.1 (25- May-2014) (isoform 5), protein identified by NP_001138388.1 (25- May-2014) (isoform 6), Protein identified by NP_001138389.1 (25- May-2014) (isoform 7), protein identified by NP_001138390.1 (25- May-2014) (isoform 8), and NP_001138391.1 (10- May -2014) protein (isoform 9) It is.
  • the “FGFR2 protein” in the present invention is typically a protein (isoform 2) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 as long as it is derived from human.
  • the FGFR2 protein is characterized by having an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain (FIG. 1).
  • the Ig-like domain corresponds to the amino acid sequence of positions 53 to 347
  • the transmembrane region corresponds to the amino acid sequence of positions 376 to 398
  • the kinase domain corresponds to positions 482 to 758. Corresponds to the amino acid sequence.
  • the TXLNA protein is a protein encoded by a gene present in 1p35.1 in humans, and is typically a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (NCBI accession number NP_787048.1).
  • the TXLNA protein is characterized by having a coiled coil domain (FIG. 1), which corresponds to the amino acid sequence at positions 186 to 491 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide is a polypeptide having an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA and having kinase activity.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide may include the entire kinase domain of the FGFR2 protein, or may include a portion of the kinase domain as long as the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide has kinase activity.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide has“ kinase activity ”means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from the FGFR2 protein.
  • the kinase activity of the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide is measured by a conventional method. Usually, after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, phosphorylated tyrosine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide may contain all or part of the coiled-coil domain of the TXLNA protein.
  • a polynucleotide encoding an FGFR2-TXLNA fusion polypeptide includes an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA. And a polynucleotide encoding a polypeptide having kinase activity.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA, and genomic DNA.
  • the FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 2 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence encoded by an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located between glutamic acid at position 653 and glutamic acid at position 654.
  • the “one or more amino acids” is usually 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) amino acids.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • Amino acid sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST (Proc. ⁇ ⁇ ⁇ Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur It can be determined using the program (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • the FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples described later.
  • the fusion point is located between GTP at position 1959 and GTP at position 1960.
  • stringent conditions refers to moderately or highly stringent conditions unless otherwise specified.
  • the moderately stringent conditions can be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • the basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • moderately stringent conditions for nitrocellulose filters are 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) prewash conditions; about 50-50 ° C. at about 50-50 ° C.
  • the moderately stringent conditions preferably include hybridization conditions of about 50 ° C. and 6 ⁇ SSC, and may include the aforementioned washing conditions and / or washing conditions.
  • High stringent conditions can also be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • High stringency conditions include higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • hybridization conditions of about 65 ° C., 0.2-6 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, and even more preferably 0.2 ⁇ SSC are included.
  • cleaning conditions of about 65 to 68 ° C., 0.2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 in place of SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 ⁇ M NaCl and 15 ⁇ mM sodium citrate)) as a buffer for hybridization, pre-washing and washing.
  • washing can be performed for about 15 minutes after hybridization is complete.
  • the “one or more nucleotides” usually means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) nucleotides.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • FGFR2-KCTD1 gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of FGFR2 protein and KCTD1 protein (hereinafter also referred to as FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide).
  • FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide a fusion protein of FGFR2 protein and KCTD1 protein
  • 18q11.2 and 10q26 A mutation caused by a translocation (t (10; 18)) with a breakpoint in the region of .1.
  • the FGFR2 protein is as described above in “(1) FGFR2-TXLNA gene fusion”.
  • the KCTD1 protein is a protein encoded by a gene present in 18q11.2 in humans, and is typically a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (NCBI accession number NP_001136202.1).
  • the KCTD1 protein is characterized by having a BTB / POZ domain (FIG. 1), which corresponds to the amino acid sequence at positions 638 to 740 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide is a polypeptide that includes an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, a kinase domain, and a BTB / POZ domain of KCTD1, and has kinase activity.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide may include the entire kinase domain of the FGFR2 protein, or may include a portion of the kinase domain as long as the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide has kinase activity.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide has“ kinase activity ”means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from the FGFR2 protein.
  • the kinase activity of the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide is measured by a conventional method. Usually, after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, phosphorylated tyrosine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide may contain all or part of the BTB / POZ domain of the KCTD1 protein.
  • a polynucleotide encoding an FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide (hereinafter also referred to as FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide) is an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a BTB / POZ domain of KCTD1. And a polynucleotide encoding a polypeptide having kinase activity.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA, and genomic DNA.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 4 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence encoded by an FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located between glutamic acid at position 679 and aspartic acid at position 680.
  • the FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, consisting of a base sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more with the polynucleotide
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples below.
  • the fusion point is located between GTP at position 2037 and GTP at position 2038.
  • FGFR2-BICC1 type2 gene fusion This gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of FGFR2 protein and BICC1 protein (hereinafter also referred to as FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide). It is a mutation caused by an inversion (inv (10)) with a breakpoint in the region of 1 and 10q26.1.
  • the FGFR2 protein is as described above in “(1) FGFR2-TXLNA gene fusion”.
  • the BICC1 protein is a protein encoded by a gene present in 10q21.1 in humans, and is typically a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (NCBI accession number NP_001073981.1).
  • the BICC1 protein is characterized by having a KH domain that is an RNA binding region and a SAM (sterile ⁇ motif) domain that is involved in protein interaction (FIG. 1).
  • the KH domain corresponds to the amino acid sequence at positions 131 to 204 and 283 to 353
  • the SAM domain corresponds to the amino acid sequence at positions 871 to 936.
  • the BICC1 protein is known to negatively regulate the Wnt pathway, and due to dysfunction of this protein, it has been reported to cause multiple renal cysts and abnormal pancreatic development (Kraus MR. Et al., Hum Mutat., 2012, 33, 86-90).
  • FGFR2-BICC1 type2 fusion polypeptide is a polypeptide having an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a SAM domain of BICC1, but not a KH domain of BICC1 and having kinase activity.
  • a fusion protein of FGFR2 protein and BICC1 protein a fusion polypeptide produced by fusing exons 1 to 19 of FGFR2 gene and exons 3 to 21 of BICC1 gene in frame is known (International Publication No. 1).
  • the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide may include the entire kinase domain of the FGFR2 protein, or may include a portion of the kinase domain as long as the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide has kinase activity. Also good.
  • FGFR2-BICC1CCtype 2 fusion polypeptide has “kinase activity” means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from FGFR2 protein.
  • the kinase activity of the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide is measured by a conventional method. Usually, after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, phosphorylated tyrosine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide may contain all or part of the SAM domain of the BICC1 protein.
  • the polynucleotide encoding the FGFR2-BICC1 type2 fusion polypeptide (hereinafter also referred to as FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide) is an FGFR2 Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain, and BICC1 SAM.
  • the FGFR2-BICC1 type2 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA, and genomic DNA.
  • the FGFR2-BICC1 type2 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, a polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 6 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence encoded by an FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located between glutamic acid at position 653 and glycine at position 654.
  • the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, consisting of a base sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more with a polynucle
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples described later.
  • the fusion point is located between GTP at position 1959 and GTP at position 1960.
  • the present invention provides a method for detecting the three kinds of gene fusions (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention).
  • the detection method of the present invention comprises a step of detecting any of the above fusion polynucleotides or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject having cancer.
  • the subject is not particularly limited as long as the subject is a mammal.
  • mammals include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters, chipmunk, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, Primates such as orangutans and chimpanzees can be mentioned, and humans are preferred.
  • the subject having cancer may be not only a subject suffering from cancer but also a subject suspected of suffering from cancer or a subject having a risk of developing cancer in the future.
  • the “cancer” to which the detection method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a cancer that can detect any of the three types of gene fusions, but is preferably a biliary tract cancer.
  • An “isolated sample” derived from a subject includes not only biological samples (eg, cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive fluid, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool), Also included are nucleic acid extracts (genomic DNA extracts, mRNA extracts, cDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts obtained from these biological samples.
  • a person skilled in the art can prepare genomic DNA, mRNA, cDNA or protein by selecting a known method suitable for the sample in consideration of the type and condition of the sample.
  • the sample may be subjected to formalin fixing treatment, alcohol fixing treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • the “isolated sample” is preferably derived from an organ in which the cancer is present or suspected to exist, for example, small intestine, spleen, kidney, liver, biliary tract, stomach, lung, adrenal gland, heart, Examples include those derived from the brain, pancreas, aorta, etc., but more preferably derived from the biliary tract.
  • the detection of the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby can be performed using a technique known per se.
  • transcripts from genomic DNA for example, using RT-PCR, sequencing, TaqMan probe, Northern blotting, dot blotting, cDNA microarray analysis, etc. Fusion polynucleotides that are mRNA or cDNA can be detected.
  • genomic DNA is targeted, for example, detection of fusion polynucleotides that are genomic DNA using in situ hybridization (ISH), genomic PCR, sequencing, TaqMan probe, Southern blotting, genomic microarray analysis, etc. can do.
  • ISH in situ hybridization
  • the fusion polynucleotide is specific.
  • Polynucleotides that are probes designed to recognize can be used.
  • “specifically recognize a fusion polynucleotide” includes a wild-type gene derived from the fusion point of the fusion polynucleotide from the 5 ′ terminal side and the 3 ′ terminal part under stringent conditions. This refers to identifying and recognizing the fusion polynucleotide from a polynucleotide other than the fusion polynucleotide.
  • the genomic DNA to be detected is stable even under formalin fixation. From the viewpoint of high detection sensitivity, it is preferable to use in situ hybridization.
  • the biological sample described in the following (a) or (b) having a chain length of at least 15 bases as a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize a fusion polynucleotide By hybridizing these polynucleotides, genomic DNA (fusion polynucleotide) encoding the fusion polypeptide can be detected.
  • Polynucleotide (b) which is at least one probe selected from the group consisting of: a probe that hybridizes to a base sequence including a fusion point between a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene for each fusion gene Polynucleotide.
  • FGFR2 gene which is a 5 ′ fusion partner gene according to the present invention, is derived from human, it is typically the DNA of positions 121478330 to 121598458 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000010.11. It is a gene consisting of a sequence (complementary strand).
  • TXLNA gene which is a 3 ′ fusion partner gene according to the present invention, is derived from a human, it is typically the 32179695-32198285th DNA in the genomic sequence identified by Genbank accession number NC_000001.11. A gene consisting of a sequence.
  • KCTD1 gene which is a 3′-side fusion partner gene according to the present invention, is derived from a human, typically, it is the DNA of the 26454910-26657401th of the genomic sequence specified by Genbank accession number NC_000018.10. It is a gene consisting of a sequence (complementary strand).
  • the BICC1 gene which is a 3 ′ fusion partner gene according to the present invention, is derived from a human, it is typically the DNA of 58513016-58831435 in the genomic sequence identified by Genbank accession number NC_000010.11. A gene consisting of a sequence.
  • DNA sequence of a gene can change in nature (ie, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, such natural mutants can also be the subject of the present invention (hereinafter the same).
  • the polynucleotide described in (a) of the present invention is a nucleotide sequence of a 5 ′ fusion partner gene (FGFR2 gene) and / or a 3 ′ fusion partner gene (TXLNA, KCTD1 or Any substance can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to the base sequence of (BICC1 gene).
  • FGFR2 gene 5 ′ fusion partner gene
  • TXLNA 3 ′ fusion partner gene
  • KCTD1 3 fusion partner gene
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the 5 ′ fusion partner gene includes all or all of the Ig-like domain, transmembrane region, and kinase domain of the FGFR2 protein. Some code regions are included.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the coiled coil domains of TXLNA. Part of the code area.
  • the base sequence of the upstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or the BTB / POZ domain of KCTD1 Some code regions are included.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the SAM domains of BICC1. Part of the coding region is included, but the coding region of the KH domain is not included.
  • Examples of the polynucleotide described in (a1) include combinations of the following polynucleotides (a1-1) to (a1-3): (a1-1) A polynucleotide that hybridizes to the coding region of all or part of the Ig-like domain, transmembrane region, and kinase domain of FGFR2, and hybridizes to the coding region of all or part of the coiled-coil domain of TXLNA A combination of polynucleotides, (a1-2) A polynucleotide that hybridizes to the coding region of all or part of the Ig-like domain, transmembrane region, and kinase domain of FGFR2, and hybridizes to the coding region of all or part of the BTB / POZ domain of KCTD1.
  • Combinations of soy polynucleotides, and (a1-3) A polynucleotide that hybridizes to the coding region of all or part of the Ig-like domain, transmembrane region, and kinase domain of FGFR2, and hybridizes to the coding region of all or part of the SAM domain of BICC1 A combination of polynucleotides.
  • the “probe designed to specifically recognize the fusion polynucleotide” includes the fusion gene. And a probe for identifying the variant may be further included. Examples of such a probe include a polynucleotide that hybridizes to a region contained only in one of the fusion gene and the variant.
  • the FGFR2-BICC1 type 1 gene is known as a variant of the FGFR2-BICC1 type 2 gene. In order to distinguish these genes, the FGFR2-BICC1 type 1 gene is hybridized to the exon 3-17 region of BICC1 (for example, the coding region of the KH domain). Polynucleotides that soy can be used.
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in (a) used for in situ hybridization hybridizes is the 5 ′ side from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • the region is preferably within 1 million bases from the fusion point of the fusion partner gene (FGFR2 gene) and the 3 ′ fusion partner gene (TXLNA, KCTD1 or BICC1 gene).
  • the polynucleotide described in (b) used in in situ hybridization is a fusion of a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene, which is a target base sequence of the polynucleotide.
  • Any nucleic acid can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to a base sequence containing a point. Typical examples include SEQ ID NO: 1, 3, or 5.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in-situ hybridization covers the entire target base sequence from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a group consisting of a plurality of types of polynucleotides is preferable.
  • the length of the polynucleotide constituting the population is at least 15 bases, preferably 100 to 1000 bases.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, and Cy5.
  • radioisotopes eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 33 P, 32 P, etc.
  • enzymes eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase
  • the polynucleotide may be labeled with a malate dehydrogenase, etc.
  • a luminescent substance eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), etc.
  • in situ hybridization when 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 5 ′ fusion partner gene 2 are used, or When 3 ′ fusion partner gene probe 2 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, these probes are preferably labeled with different dyes.
  • the signal for example, fluorescence
  • the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected when an overlap with the signal emitted by the label of the gene probe 1 is observed.
  • the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 1 is separated from the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 2, the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2 and the signal 3 ′ from the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2.
  • separation from the signal emitted by the label of the fusion partner gene probe 1 is observed, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • labeling of the polynucleotide can be performed by a known technique.
  • the polynucleotide can be labeled by incorporating a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like into the polynucleotide by a nick translation method or a random prime method.
  • conditions for hybridizing the polynucleotide according to (a) or (b) and the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • conditions for stringency hybridization include 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • conditions for low stringency hybridization include 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • a person skilled in the art appropriately selects various conditions such as the concentration of surfactant (NP-40, etc.), the concentration of formamide, pH, etc. in addition to the salt concentration (SSC dilution ratio, etc.) and temperature.
  • SSC dilution ratio etc.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide described in (a) or (b) include Southern blotting, Northern blotting, and dot blotting in addition to the in-situ hybridization. It is done.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in (a) or (b) to a membrane to which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transferred.
  • the polynucleotide (a) When the polynucleotide (a) is used, the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ fusion partner gene and the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ fusion partner gene are developed on the membrane. When the same band is recognized, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide (b) include genomic microarray analysis and DNA microarray analysis.
  • an array in which the polynucleotide (b) is immobilized on a substrate is prepared, and the genomic DNA is detected by bringing the biological sample into contact with the polynucleotide on the array.
  • the substrate is not particularly limited as long as it can immobilize oligo or polynucleotide, and examples thereof include glass plates, nylon membranes, micro beads, silicon chips, capillaries and the like.
  • the detection method of the present invention it is also preferable to detect the fusion polynucleotide using PCR.
  • a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify a fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template can be used.
  • the fusion polynucleotide can be specifically amplified means that the fusion polynucleotide is not amplified without amplifying the wild-type gene from which the 5′-end and 3′-end portions are derived from the fusion point of the fusion polynucleotide. It means that only nucleotides can be amplified, and all of the fusion polynucleotide may be amplified, or a part of the fusion polynucleotide including the fusion point may be amplified.
  • Polynucleotide which is a pair of primers” used in PCR, etc. consists of a sense primer (forward primer) and an antisense primer (reverse primer) that specifically amplify the target fusion polynucleotide.
  • the base sequence on the 5 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide is designed, and the antisense primer is designed from the base sequence on the 3 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide.
  • These primers are usually designed so that the PCR product is 5 kb or less from the viewpoint of accuracy and sensitivity of detection by PCR.
  • the design of the primer can be appropriately performed by a known method, and for example, Primer Express (registered trademark) software (Applied Biosystems) can be used.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 bases or more (preferably 16, 17, 18, 19 or 20 bases or more, more preferably 21 bases or more), and 100 bases or less (preferably 90, 80, 70, 60, 50 or 40 bases or less, more preferably 30 bases or less).
  • a polynucleotide that is a pair of primers for a FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16
  • a primer set consisting of a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 for the FGFR2-BICC1 type2 fusion polynucleotide (See
  • sequencer for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)
  • the TaqMan probe method When detecting a fusion polynucleotide using PCR, the TaqMan probe method is used to connect the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion in-frame and / or in the fusion polynucleotide. Can be confirmed to contain a predetermined domain.
  • Examples of the probe used in the TaqMan probe method include the polynucleotides described in the above (a) or (b).
  • the probe is labeled with a reporter dye (eg, FAM, FITC, VIC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, Eclipse, DABCYL, MGB, etc.).
  • the primer and probe may be DNA, RNA, or DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked nucleic acid, Bridged Nucleic acid, cross-linked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C Nucleotides
  • the primers and probes may be double-stranded or single-stranded, but are preferably single-stranded.
  • the primers and probes may contain one or a plurality of nucleotide mismatches as long as they can specifically hybridize to the target sequence, and are usually 80% or more, preferably 90, relative to the complementary sequence of the target sequence. 91, 92, 93, 94% or more, more preferably 95, 96, 97, 98, 99% or more identity, most preferably 100% identity.
  • primers and probes can be synthesized according to a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer based on, for example, information on the base sequence described in the present specification.
  • the fusion polynucleotide may be detected by whole transcriptome sequencing (RNA sequencing) or genome sequencing. These methods are performed according to the manufacturer's instructions using, for example, a next-generation sequencer (eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.) Can be done.
  • a next-generation sequencer eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a cDNA library is prepared from total RNA using a commercially available kit (eg, mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina) etc.) according to the manufacturer's instructions, and this is used as a next-generation sequencer. This can be done by subjecting it to the sequencing used.
  • a translation product of a fusion polynucleotide that is, a fusion polynucleotide
  • the translation product can be detected using antibody array analysis or the like.
  • an antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide is used.
  • “specifically recognize a fusion polypeptide” means a protein other than the fusion polypeptide, including wild-type proteins derived from the N-terminal side and the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide. Recognizing only the fusion polypeptide without recognizing.
  • the antibody “specifically recognizes the fusion polypeptide” used in the detection method of the present invention may be one antibody or a combination of two or more antibodies.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” examples include an antibody specific to the polypeptide containing the fusion point of the fusion polypeptide (hereinafter also referred to as “fusion point-specific antibody”).
  • fusion point-specific antibody means an antibody that specifically binds to a polypeptide containing the fusion point but does not bind to a wild-type protein from which the N-terminal and C-terminal portions are derived. To do.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” refers to an antibody that binds to a polypeptide consisting of the N-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide and a C-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide. Also included are combinations of antibodies that bind to the polypeptide.
  • the fusion polypeptide can be detected by performing sandwich ELISA, immunostaining, immunoprecipitation, Western blotting, etc. using these two antibodies.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” includes the fusion gene and the variant. And an antibody for discriminating between them may be further included. Examples of such an antibody include an antibody that binds to a region contained only in either one of the polypeptide encoded by the fusion gene and the peptide encoded by the variant.
  • the FGFR2-BICC1 type 1 gene is known as a variant of the FGFR2-BICC1 type 2 gene.
  • the region encoded by the exon 3-17 region of BICC1 for example, KH domain
  • Antibodies that bind to can be used.
  • antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, and binding fragments thereof. Is included, but is not limited thereto.
  • the binding fragment means a partial region of the antibody having specific binding activity, and specific examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and a single chain antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and may be an antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, but IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • “An antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • a known technique includes a polypeptide comprising a fusion point of the fusion polypeptide, a polypeptide comprising a region N-terminal from the fusion point of the fusion polypeptide, or a C-terminal side of the fusion polypeptide.
  • the animal's serum (polyclonal antibody) is recovered, the hybridoma method, the recombinant DNA method, the phage display method, etc. And a method for producing a monoclonal antibody.
  • the target protein can be directly detected by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and can be detected.
  • peroxidase ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isotope
  • HRP horseradish peroxidase
  • fluorescein isotope examples include thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances.
  • a method for indirectly detecting the target protein using a secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can also be used.
  • a fusion polynucleotide produced by gene fusion that is a responsible mutation of cancer or a polypeptide encoded thereby can be detected using the primer, probe, or antibody, or a combination thereof, Thereby, the gene fusion can be detected.
  • kits for detecting a gene fusion that is a responsible mutation for cancer comprising any of the following or a combination thereof: (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide; or (C) FGFR2 -An antibody that specifically recognizes a TXLNA fusion polypeptide, FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide
  • the kit of the present invention includes, in addition to the polynucleotide and antibody, a substrate necessary for detection of a label added to the polynucleotide or antibody, a positive control (for example, FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide, FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide, or cells carrying these), negative controls, PCR reagents, in Appropriate combinations of counterstaining reagents (such as DAPI) used in situ hybridization, molecules necessary for antibody detection (eg, secondary antibodies, protein G, protein A), and buffers used for sample dilution and washing Can be included. Instructions for use can also be included in the kit of the present invention. By using the kit of the present invention, the
  • the detection method and detection kit of the present invention enable detection of a newly discovered gene fusion as a responsible mutation of cancer, and identify a positive example of the gene fusion as described later to enable individualized medicine. It is extremely useful in application.
  • the three gene fusions are responsible mutations in cancer, and are thought to contribute to canceration of cells by constitutive activation of FGFR2 kinase. Therefore, in cancer patients in which such gene fusion is detected, there is a high probability that treatment with a substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the gene fusion is effective. .
  • the present invention relates to a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer has a therapeutic effect or Provided is a method for identifying a subject at risk of cancer (hereinafter also referred to as the identification method of the present invention).
  • the identification method of the present invention includes the following steps: (1) Detecting a fusion polynucleotide of any of the following (a) to (c) or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject: (A) a FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a coiled-coil domain of TXLNA; (B) a FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a BTB / POZ domain of
  • a cancer patient or a subject at risk for cancer is a mammal, preferably a human, who is suffering from cancer or suspected of having cancer.
  • the “cancer” to which the identification method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it can detect any of the three types of gene fusions, but is preferably a biliary tract cancer.
  • the “therapeutic effect” is not particularly limited as long as it is an effect of cancer treatment and is beneficial to the patient.
  • the tumor reduction effect, the progression-free survival extension effect, the life extension The effect etc. are mentioned.
  • a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer which is a target for evaluating the effectiveness of cancer treatment with respect to FGFR2-TXLNA gene fusion
  • “Substance that suppresses the expression and / or activity” (hereinafter also referred to as the target substance in the identification method of the present invention) is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide If it is, it will not specifically limit.
  • substances that inhibit the expression of FGFR2-TXLNA fusion polypeptide include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses the expression of FGFR2-TXLNA fusion polypeptide
  • siRNA smallRNAinterfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense antisense that suppresses the expression of FGFR2-TXLNA fusion polypeptide
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of FGFR2-TXLNA fusion polypeptide include substances that inhibit FGFR2 kinase activity (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type FGFR2 protein.
  • Specific examples of such substances include 3- [2,4-dimethyl-5-[[(Z) -2,3-dihydro-2-oxo-1H-indole-3-ylidene] methyl] -1H- Pyrrol-3-yl] propanoic acid (eg, SU6668 (generic name; orantinib)), N- ⁇ 5- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) ethyl] -1H-pyrazol-3-yl ⁇ -4-[(3R, 5S) -3,5-dimethylpiperazin-1-yl] benzamide (for example, AZD4547), 1-[(2R, 4S, 5S) -4-azido-5- (hydroxymethyl) Oxo
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide and / or FGFR2-TXLNA fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as cancer therapeutic agents for a subject when an FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample from a subject having cancer It is.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide.
  • substances that inhibit the expression of FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide include siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses the expression of FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense antisense that suppresses the expression of FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide.
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide include substances that inhibit FGFR2 kinase activity (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type FGFR2 protein. Good. Specific examples of such substances include those described above as substances that suppress the expression and / or activity of the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide and / or FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as a cancer therapeutic agent for a subject when an FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample from a subject having cancer. It is.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide. .
  • Examples of substances that inhibit the expression of FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide include siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA) that suppresses the expression of FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide. ), Antisense nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, low molecular weight compounds and the like.
  • substances that inhibit the function of FGFR2-BICC1CCtype 2 fusion polypeptide include substances that inhibit FGFR2 kinase activity (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide, and the like. It is done.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type FGFR2 protein. May be. Specific examples of such substances include those described above as substances that suppress the expression and / or activity of the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide and / or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide disclosed in the present specification. . Commercially available materials may also be used.
  • These substances are used as therapeutic agents for cancer when an FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample derived from a subject having cancer. It is effective as
  • Step (1) in the identification method of the present invention can be carried out in the same manner as the step included in the detection method of the present invention.
  • step (2) of the identification method of the present invention in the isolated sample derived from the subject having cancer in the step (1) (that is, a subject having cancer or a subject at risk of cancer),
  • the polypeptide encoded by is detected, it is determined that the target substance in the identification method of the present invention has a therapeutic effect in the subject, whereas the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is not detected. In such a case, it is determined that the target substance in the identification method of the present invention is unlikely to have a therapeutic effect in the subject.
  • a positive example of gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer is detected from cancer patients or subjects at risk of cancer, and the fusion poly- gram generated by the gene fusion is detected.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a nucleotide is capable of identifying a cancer patient or a subject having a risk of cancer, and the present invention provides such a subject. It is useful in that it is possible to perform treatment suitable for the above.
  • ⁇ Cancer treatment method and cancer treatment agent> As described above, according to the identification method of the present invention, a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by any one of the three gene fusions has a therapeutic effect. Identified. Therefore, cancer can be efficiently treated by selectively administering the substance to cancer patients who have the fusion gene. Therefore, the present invention provides a method for treating cancer, which comprises a step of administering the substance to a subject (hereinafter also referred to as the treatment method of the present invention).
  • the subject is typically a FGFR2-TXLNA, FGFR2-KCTD1, or FGFR2-BICC1 type 2 gene fusion positive cancer patient.
  • cancer is not particularly limited, it is desirable that the cancer be biliary tract cancer.
  • FGFR2-TXLNA, FGFR2-KCTD1, or FGFR2-BICC1 type 2 gene fusion positive cancer is a cancer in which each fusion polynucleotide or polypeptide encoded thereby is detected by the detection method of the present invention. Means.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for FGFR2-TXLNA, FGFR2-KCTD1, or FGFR2-BICC1 type 2 gene fusion positive cancer (hereinafter also referred to as the cancer therapeutic agent of the present invention).
  • the cancer therapeutic agent of the present invention provides a novel therapeutic means effective for the three types of gene fusion positive cancers.
  • cancer is not particularly limited, but biliary tract cancer is desirable.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention typically contains, as an active ingredient, a substance that suppresses the expression and / or activity of any of the following fusion polypeptides (a) to (c):
  • A a FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a coiled-coil domain of TXLNA
  • B a FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, which comprises an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a polynucleotide that encodes a polypeptide having a kinase activity and comprising a BTB / POZ domain of KCTD1
  • C FGFR2-T
  • the substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by any of the above three gene fusions may be ⁇ Examples of the method for identifying a patient or a subject at risk of cancer>, preferably a substance that inhibits FGFR2 kinase activity, more preferably 3- [2,4-dimethyl-5-[[ (Z) -2,3-dihydro-2-oxo-1H-indole-3-ylidene] methyl] -1H-pyrrol-3-yl] propanoic acid (eg, SU6668 (generic name; orantinib)), N- ⁇ 5- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) ethyl] -1H-pyrazol-3-yl ⁇ -4-[(3R, 5S -3,5-dimethylpiperazin-1-yl] benzamide (eg,
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and / or other additives that are usually used for their formulation.
  • the method for administering the cancer therapeutic agent of the present invention is appropriately selected according to the type of the inhibitor, the type of cancer, etc.
  • oral, intravenous, intraperitoneal, transdermal, intramuscular, intratracheal (Aerosol), rectal, intravaginal and other dosage forms can be employed.
  • the dose of the cancer therapeutic agent of the present invention is determined depending on the activity and type of the active ingredient, the mode of administration (eg, oral or parenteral), the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, It can be appropriately determined in consideration of weight, age and the like.
  • the therapeutic method and cancer therapeutic agent of the present invention are useful for enabling the treatment of patients having a specific cancer responsible mutation that has not been known so far and has been clarified by the present invention.
  • the present invention provides a screening method for a cancer therapeutic agent (hereinafter also referred to as the screening method of the present invention) that has a therapeutic effect on a cancer patient having any of the three types of gene fusions.
  • the screening method of the present invention the expression and / or expression of any one of the three fusion polypeptides (ie, FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide, and FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide).
  • a substance that suppresses the activity can be obtained as a cancer therapeutic agent.
  • the test substance to be used in the screening method of the present invention may be any compound or composition, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), low molecular compounds, compound libraries, Examples include random peptide libraries, natural components (eg, components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc.), foods, and the like.
  • a nucleic acid eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide
  • carbohydrate eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides
  • lipids
  • the screening method of the present invention may be in any form as long as it can be evaluated whether the test substance suppresses the expression and / or activity of any of the three fusion polypeptides.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps: (1) A step of bringing a test substance into contact with a cell expressing a fusion polypeptide of any one of (a) to (c) below: (A) a FGFR2-TXLNA fusion polypeptide, comprising a FGFR2 Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA and having kinase activity; (B) an FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide comprising an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a BTB / POZ domain of KCTD1 and having kinase activity; and (c) FGFR2- A
  • a test substance is contacted with a cell expressing any one of the three fusion polypeptides.
  • a solvent not containing a test substance for example, DMSO
  • the contact can be performed in a culture medium.
  • the medium is appropriately selected depending on the type of cells used, for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • the culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells to be used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is about 30 to about 40 ° C., and the culture time is about 12 to about 72 hours.
  • Examples of cells expressing any one of the three fusion polypeptides include, for example, cells derived from cancer tissues that endogenously express the fusion polypeptide, cell lines derived from the cells, Examples include, but are not limited to, genetically engineered cell lines. Whether or not a cell expresses any one of the three fusion polypeptides can also be confirmed using the detection method of the present invention.
  • the cells are usually mammalian cells, preferably human cells.
  • step (2) it is determined whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed.
  • the expression of the fusion polypeptide can be measured by determining the mRNA level or protein level in the cell using a known analysis method such as Northern blotting, quantitative PCR, immunoblotting, ELISA, etc. .
  • the activity of the fusion polypeptide can also be measured by a known analysis method (for example, kinase activity measurement).
  • the obtained measured value is compared with the measured value in a control cell not contacted with the test substance. The comparison of measured values is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. If the measured value in the cell contacted with the test substance is significantly lower than that of the control, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • the proliferation of the cells can be used as an indicator for determination in this step.
  • the proliferation of the cells in contact with the test substance is measured.
  • the cell proliferation can be measured by a method known per se such as cell count, 3 H thymidine incorporation, BRDU method and the like.
  • the growth of the cells in contact with the test substance is compared with the growth of control cells not in contact with the test substance.
  • the comparison of the proliferation level is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the growth of the control cells not contacted with the test substance may be a value measured in advance or a value measured simultaneously with respect to the measurement of the growth of the cells contacted with the test substance.
  • a value measured simultaneously from the viewpoint of reproducibility is preferable. As a result of the comparison, when the growth of the cell contacted with the test substance is suppressed, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • step (3) the test substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide in step (2) is selected as a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides the following isolated fusion polypeptides (hereinafter also referred to as fusion polypeptides of the present invention) or fragments thereof: (1) an isolated FGFR2-TXLNA fusion polypeptide comprising an Ig-like domain of FGFR2, a transmembrane region, and a kinase domain, and a coiled-coil domain of TXLNA and having kinase activity; (2) an isolated FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide comprising an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain of FGFR2, and a BTB / POZ domain of KCTD1, and having kinase activity, and (3) IgR2 Ig An isolated FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide comprising a domain-like domain, a transmembrane region, and a kin
  • an “isolated” substance refers to another substance (preferably a biological agent) (eg, a nucleic acid) in the environment in which the substance exists in nature (eg, within the organism's cells).
  • a nucleic acid containing a non-nucleic acid factor and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid in the case of a protein, such as a protein containing a non-protein factor and an amino acid sequence other than the target protein). It means what was done.
  • isolated preferably refers to 75% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 96% or more, 97% or more.
  • isolated polynucleotides and polypeptides include polynucleotides and polypeptides purified by standard purification methods, as well as chemically synthesized polynucleotides and polypeptides.
  • “Fragment” refers to a fragment of the fusion polypeptide of the present invention, comprising a continuous partial sequence including sequences upstream and downstream of the fusion point.
  • the sequence upstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the N-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the sequence downstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the C-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the length of the fragment is not particularly limited, but is usually 8 amino acid residues or more (for example, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 100 amino acid residues or more).
  • the fusion polypeptide of the present invention can be, for example, the following isolated fusion polypeptide.
  • (1) Regarding FGFR2-TXLNA fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity; or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by number 4 and having kinase activity; and (3) FGFR2-BICC1type 2 fusion polypeptide, (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity; or (iii) a
  • the present invention provides an isolated polynucleotide encoding the above-mentioned fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof (hereinafter also referred to as the polynucleotide of the present invention).
  • the polynucleotide of the present invention may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA. It may be double-stranded or single-stranded.
  • a typical example of cDNA encoding the FGFR2-TXLNA fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a typical example of a cDNA encoding the FGFR2-KCTD1 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a typical example of cDNA encoding the FGFR2-BICC1 type 2 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by a method known per se. For example, using a known hybridization technique from a cDNA library or genomic library prepared from a cancer tissue or the like holding FGFR2-TXLNA fusion polynucleotide, FGFR2-KCTD1 fusion polynucleotide, or FGFR2-BICC1 type 2 fusion polynucleotide And can be extracted. Moreover, it can also prepare by amplifying using mRNA, cDNA, or genomic DNA prepared from the said cancer tissue etc. using a well-known gene amplification technique (PCR) as a template.
  • PCR gene amplification technique
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can also be produced by a method known per se. For example, by inserting the polynucleotide prepared as described above into an appropriate expression vector, introducing the vector into a cell-free protein synthesis system (for example, reticulocyte extract, wheat germ extract), and incubation, Further, the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • a cell-free protein synthesis system for example, reticulocyte extract, wheat germ extract
  • the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can be used as a marker in the detection method of the present invention, and can also be used for production of an antibody against the fusion polypeptide of the present invention.
  • RNA sequencing As a sample for RNA sequencing, RT-PCR and Sanger sequencing, total RNA was prepared from tumor tissue excised from biliary tract cancer patients (190 cases) by a conventional method. This study was carried out with the approval of the ethical review board of the organization involved in this study.
  • RNA sequencing library was prepared using an Agilent SureSelct strand specific kit according to the manufacturer's standard protocol. This library was subjected to 100 bp paired-end reads with a next generation sequencer, Hiseq2000 or GAIIx. By referring the obtained paired-end reads to a RefSeq (NCBI Reference Sequence) database, candidate fusion genes were detected.
  • CDNA was synthesized from the total RNA by the reverse transcriptase method.
  • the obtained cDNA was subjected to PCR amplification.
  • the base sequence of the obtained PCR product was directly determined using the BigDye terminator kit and ABI 3130xl DNA sequencer (Applied Biosystems). The primers used in this study are shown in Table 1.
  • CDNAs encoding polypeptides having a FLAG epitope tag added to the carboxy terminus of wild-type or mutant FGFR2 fusion polypeptides were prepared and cloned into pMXs retroviral vectors.
  • the mouse fibroblast cell line NIH-3T3 cells were infected with these retroviruses to obtain a stable expression cell line expressing a wild type or mutant type FGFR2 fusion gene.
  • Example 1 This example describes the identification of novel fusion transcripts in biliary tract cancer tissues.
  • RNA sequencing Whole transcriptome sequencing of tumor tissue removed from patients with biliary tract cancer (RNA sequencing, Meyerson, M. et al., Nat Rev Genet, 2010, 11, 685-696).
  • RNA sequencing was analyzed, and reverse transcription (RT) -PCR product Sanger sequencing was performed. As a result, as shown in Table 2 and FIG. 1, three novel fusion gene products were identified.
  • FGFR2-TXLNA is generated by chromosomal translocation t (1; 10), and the reading frame between the FGFR2-TXLNA gene on chromosome 10q26.1 and the TXLNA gene on chromosome 1p35.1 does not shift. It is a directly linked fusion gene.
  • FGFR2-KCTD1 the FGFR2 gene present on chromosome 10q26.1 and the KCTD1 gene present on chromosome 18q11.2, which are generated by chromosomal translocation t (10; 18), were directly linked without causing a shift in the reading frame. It is a fusion gene.
  • FGFR2-BICC1 type 2 the FGFR2 gene present on chromosome 10q26.1 and the BICC1 gene present on chromosome 10q21.1, which were generated by chromosome inversion inv (10), were directly linked without causing a shift in the reading frame. It is a fusion gene.
  • the FGFR2-BICC1 type 2 gene fusion found in this example was caused by in-frame fusion of exons 1-19 of the FGFR2 gene and exons 18-21 of the BICC1 gene.
  • the known FGFR2-BICC1 gene fusion (FGFR2-BICC1 type 1) is caused by in-frame fusion of exons 1-19 of the FGFR2 gene and exons 3-21 of the BICC1 gene. That is, FGFR2-BICC1 type 2 is a novel gene fusion that is completely different from FGFR2-BICC1 type 1.
  • Example 2 This example shows the analysis of the function of the polypeptide encoded by the fusion gene found in Example 1 and the effectiveness of the FGFR kinase inhibitor against cancer cells expressing the polypeptide. .
  • FGFR2-TXLNA cDNA, FGFR2-KCTD1 cDNA, or FGFR2-BICC1 type 2 cDNA obtained from a cancer tissue derived from a biliary tract cancer patient
  • the cDNA encoding was ligated with the translation reading frame aligned and cloned into the pMXs retroviral vector.
  • a vector encoding a kinase activity mutant (KD mutant FGFR2 fusion polypeptide: Y568F / Y569F) in which a site-specific mutation was introduced into this vector and two amino acids in the FGFR2 kinase domain were substituted was also produced.
  • FGFR2-BICC1 type 1 As a control, for FGFR2-BICC1 type 1 as well, a vector encoding a wild-type or mutant fusion polypeptide was prepared in the same manner as described above. The vector was infected with NIH-3T3 cells to prepare a cell line that stably expresses the FGFR2-BICC1 type 1 fusion polypeptide.
  • a cell line that stably expresses the wild type FGFR2 fusion polypeptide was synthesized with a soft agar medium (concentration of agar in the medium: 4 mg / mL, the same applies hereinafter), and the ability of these cell lines to form an anchorage-independent colony was evaluated.
  • FGFR kinase inhibitor against transformation by FGFR2 fusion polypeptide was similarly evaluated by evaluating the ability to form an anchorage-independent colony. The effect of was investigated.
  • NIH3T3 cells expressing wild-type or KD-mutated FGFR2 fusion genes were placed in two 6-week-old immunodeficient mice (BALB / c-nu / nu, Claire Japan, Tokyo, Japan). A total of 4 sites) were implanted subcutaneously. Ten days after transplantation, the presence or absence of tumor formation was observed. NIH3T3 cells expressing the Kras oncogene G12V mutation were used as a positive control.
  • the fusion polypeptide of the present invention has transformation ability and that the transformation ability requires FGFR2 kinase activity. Furthermore, it was shown that an FGFR kinase inhibitor is effective for suppressing anchorage-independent colony formation in cells expressing the fusion polypeptide of the present invention.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide produced by detecting a gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer and the gene fusion results in a therapeutic effect. It is possible to identify a cancer patient or a subject who is at risk for cancer, and to perform treatment (personalized medicine) suitable for such a cancer patient.

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Abstract

[課題]　胆道がんなどのがんにおいて、分子治療の標的となり、また薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供すること、当該変異に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなど。 [解決手段]　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料におけるFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、もしくはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドのいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法。

Description

胆道がんにおける新規治療標的融合遺伝子
　本発明は、がんの責任変異である遺伝子融合の検出方法、該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法などに関する。
　胆道がんは、肝臓内（肝内胆道がん）および肝臓外（肝外胆道がん）の胆管上皮細胞から発生する非常に浸潤性の高いがんである。東アジアを中心に発生頻度が高いが、近年欧米を含めて全世界的に発生頻度が増加している。発症早期の臨床症状に乏しいことから多くの症例では進行期で発見されることが多く、その予後は不良である。手術切除が唯一の完全治癒治療であるが、再発率が高く、５年生存率は手術可能症例の１５～２５％である。手術不能例あるいは再発症例に対して、既存の化学療法で明らかな著効を示すものは知られていないが、最近、塩酸ゲムシタビン単独あるいは塩酸ゲムシタビンとプラチナ製剤との併用が他の化学療法と比較してやや有効な成績を示すという報告がある。従って、胆道がんに対し、分子標的治療を含む新たな有効な治療法が強く求められており、これまでに標的分子の候補としてＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴといったものが報告されている。
　胆道がんにおける責任変異（ドライバー変異）としては、ＫＲＡＳ及びＢＲＡＦ遺伝子変異が報告されており、また最近チロシンキナーゼの融合遺伝子として脳腫瘍で同定されたＧＯＰＣ－ＲＯＳ１が胆道がんでも報告された。これらの異常が見られない症例におけるドライバー変異は未同定のままである。
　ＦＧＦＲ（Fibroblast growth factor receptor：繊維芽細胞増殖因子受容体）ファミリーはＦＧＦ（Fibroblast growth factor：繊維芽細胞増殖因子）の受容体として機能する膜貫通型チロシンキナーゼ分子の総称である。ＦＧＦＲファミリーに属する分子は、ヒトではＦＧＦＲ１～４の４種類が知られている。細胞外領域に３つのＩｇ－ｌｉｋｅ（イムノグロブロン様）領域、１カ所の膜貫通領域、細胞内領域にチロシンキナーゼ領域を有する。ＦＧＦＲファミリーは、胃がん、乳がん、子宮がん、膀胱がんを含む多くのがんの発生や進展に寄与していることが知られており、がんにおいて様々な種類のゲノム異常による活性化を起こしていることが報告されている（非特許文献１）。
　例えば、ＦＧＦＲ１に関しては、乳がんや卵巣がんにおいて遺伝子増幅が、メラノーマにおいて遺伝子変異が、白血病や乳がんにおいて遺伝子転座が生じることが知られている。また、ＦＧＦＲ２に関しては、胃がんや乳がんにおいて遺伝子増幅が、子宮がんや胃がんにおいて遺伝子変異が生じることが知られている。また、ＦＧＦＲ３に関しては、膀胱がんや唾液腺がんにおいて遺伝子増幅が、膀胱がん、子宮がん、ミエローマ、及び前立腺がんにおいて遺伝子変異が生じることが知られている。
　ＦＧＦＲが関与する融合遺伝子に関しては、これまで多くは血液腫瘍で同定されている。血液腫瘍ではＦＧＦＲ１ＯＰ２－ＦＧＦＲ１（非特許文献２）、ＺＮＦ１９８－ＦＧＦＲ１（非特許文献３）といったものが報告されている。最近、固形腫瘍での発見も報告されており、乳がんにおいてERLIN2-FGFR1、FGFR2-AFF3、FGFR2-CASP7、およびFGFR2-CCDC6、肺がんにおいてBAG4-FGFR1およびFGFR2-KIAA1967、脳腫瘍や膀胱がんにおいてFGFR3-TACC3が報告されている（非特許文献４）。胆道がんにおけるＦＧＦＲシグナルの異常に関しては、そのリガンドであるＦＧＦの発現が文献的に報告されている（非特許文献５）。
　最近になって、本発明者らの研究グループによる胆道がんの解析において、FGFR2遺伝子のエクソン1～19にBICC1遺伝子のエクソン3～21がインフレームで融合したFGFR2-BICC1遺伝子融合（以下、FGFR2-BICC1 type 1ともいう）とFGFR2遺伝子のエクソン1～19にAHCYL1遺伝子のエクソン5～21がインフレームで融合したFGFR2-AHCYL1遺伝子融合が検出されている（特許文献１）。当該遺伝子融合は、FGFR2タンパク質の活性化をもたらし、細胞をがん化させること、およびFGFRキナーゼ阻害剤によってがん化を抑制できることが実証されている。現在更に他の研究グループから、FGFR2-TACC3、FGFR2-MGEA5、およびFGFR2-KIAA1598遺伝子融合が報告されている（非特許文献６および７）。
　ＦＧＦＲを標的とした低分子阻害化合物としては、現在、ＡＺＤ４５４７、ＴＫＩ２５８、Ｅ３８１０、Ｅ７０９０、ＢＩＢＦ１１２０、Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ、ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４といったものについて臨床開発が進められている。またＦＧＦＲを標的とした抗体治療薬の開発も現在進行中である（非特許文献１）。
国際公開第2014/007369号
Ahmad I.ら, Biochim Biophys Acta., 2012, 1823, 850-860 Popovici C.ら, Blood, 1999, 93, 1381-1389 Xiao S.ら, Nature Genet., 1998, 18, 84-87 Wu YM.ら, Cancer Discovery, 2013, 3, 636-647 Ogasawara S.ら, Hepatol Res., 2001, 20, 97-113 Borad MJ.ら, Plos Genetics, 2014, 10, e1004135 Ross JS.ら, The Oncologist, 2014, 19, 235-242
　胆道がんなどのがんにおける変異の同定はいまだ十分になされているとはいえず、分子治療の標的となり、また薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異のさらなる同定が望まれているのが現状である。例えば、特定の2つの遺伝子から生じる融合遺伝子には、融合点の異なる複数のバリアントが存在する可能性があり、そのような個々のバリアントが同定されることにより、個別化医療における患者の層別化の精度をより一層高めることが可能となる。
　したがって本発明は、胆道がんなどのがんにおいて、分子治療の標的となり、また薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供すること、当該変異に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、高速DNAシークエンス解析技術を用いて、胆道がんにおいてFGFR2-TXLNA融合遺伝子、FGFR2-KCTD1融合遺伝子、およびFGFR2-BICC1融合遺伝子の新しいバリアント（FGFR2-BICC1 type 2）を新規キナーゼ融合遺伝子として見出した。また、そのようにして見出されたFGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type2融合遺伝子を安定的に発現する細胞株について解析を行い、これらの融合遺伝子にコードされる融合ポリペプチドが、FGFR2キナーゼ活性依存的にMAPKシグナル伝達経路を活性化すること、またFGFR2キナーゼ活性依存的な形質転換能（がん化能）を有すること、を見出した。すなわち、これらの融合遺伝子が、がんの責任変異（ドライバー変異）であることを見出した。
　本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、胆道がんなどのがんにおいて、当該遺伝子融合に基づき、当該遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［２］融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（c）のいずれかである、［１］に記載の方法：
（a）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（b）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
（c）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［３］融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（c）のいずれかである、［１］または［２］に記載の方法：
（a）（i）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（c）（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［４］がんが胆道がんである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
［６］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
（A）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［７］FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-TXLNA融合ポリペプチドまたはその断片。
［８］FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-KCTD1融合ポリペプチドまたはその断片。
［９］FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドまたはその断片。
［１０］［７］～［９］のいずれかに記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
［１１］FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合陽性がんの治療剤。
［１２］下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分として含む、［１１］に記載の治療剤：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［１３］がんが胆道がんである、［１１］または［１２］に記載の治療剤。
［１４］前記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の治療剤。
［１５］FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質が、３－［２，４－ジメチル－５－［［（Ｚ）－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン］メチル］－１Ｈ－ピロール－３－イル］プロパン酸、Ｎ－｛５－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチル］－１Ｈ－ピラゾール－３－イル｝－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ジメチルピぺラジン－１－イル］ベンズアミド、１－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－アジド－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン、ＦＧＦＲ２－IIIｂ特異的抗体、３－（２，６－ジクロロ－３，５－ジメトキシフェニル）－１－［６－［［４－（４－エチルピぺラジン－１－イル）フェニル］アミノ］ピリミジン－４－イル］－１－メチルウレア、（Ｓ）－（Ｒ）－１－（（４－（（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）オキシ）－５－メチルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）オキシ）プロパン－２－イル　２－アミノプロピオン酸、Ｎ－［２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－ウレアである、［１４］に記載の治療剤。
［１６］がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　本発明によれば、本願発明によりはじめて明らかとなった特定のがんの未知の責任変異を検出することが可能となり、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらには当該がん患者を治療することが可能となる。
図１は、FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1及びFGFR2-BICC1 type2融合タンパク質のドメイン構造の一例を示す概略図である。Ig：Ig様ドメイン；TM：膜貫通領域；CC：コイルドコイルドメイン；BT：BTB/POZドメイン；KH：KHドメイン；SAM：SAMドメイン。下向き矢印は融合点を示す。 図２は、マウス線維芽細胞株NIH3T3にFGFR2融合遺伝子の野性型またはキナーゼ活性変異体（KD）を発現させ、MAPKの活性化を解析した結果を示す。アステリスクはリン酸化されたFGFR2融合タンパク質を示す。 図３は、FGFR2融合遺伝子を発現したNIH3T3細胞の足場非依存性増殖、およびそのFGFR阻害薬（BGJ398またはPD173074）による抑制を示す。バー：100μm。 図４は、本発明の融合ポリペプチドのin vivo造腫瘍能を調べた結果を示す。矢頭は腫瘍形成を示す。各パネルの左下の値は、野生型FGFR2融合遺伝子を発現させた細胞を移植した場合は4箇所全てにおいて腫瘍が形成されたこと（4/4）およびKD変異型のFGFR2融合遺伝子の場合は4箇所全てにおいて腫瘍が形成されなかったこと（0/4）を示す。
　後述の実施例において示す通り、本発明者らは、がん組織において、がんの責任変異（ドライバー変異）として3種の新規遺伝子融合、すなわちFGFR2-TXLNA遺伝子融合、FGFR2-KCTD1遺伝子融合、及び新規な融合型のFGFR2-BICC1遺伝子融合を見出した。本発明はかかる知見に基づき、当該遺伝子融合の検出方法、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者の同定方法、がんの治療方法およびがん治療剤、がん治療剤のスクリーニング方法等を提供する。
　本発明において「がんの責任変異」とは、ドライバー変異と互換的に使用される用語であるが、がん組織に存在する変異であって、細胞に対するがん化能を有する変異をいう。典型的には、ある変異が見出されたがん組織において、既知のがん遺伝子変異がいずれも存在しない場合（すなわち、当該変異が前記既知のがん遺伝子変異と相互排他的に存在する場合）、当該変異はがんの責任変異であるということができる。
＜具体的ながんの責任変異＞
　以下、各遺伝子融合について説明する。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合
　本遺伝子融合は、FGFR2タンパク質とTXLNAタンパク質の融合タンパク質（以下、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては10q26.1および1p35.1の領域内に切断点を有する転座（t(1;10)）により生じる変異である。
　FGFR2タンパク質は、ヒトにおいては10q26.1に存在する遺伝子にコードされるタンパク質である。本発明において、「FGFR2タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、例えば、NCBIアクセッション番号NP_000132.3（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム1）、NP_075259.4（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム2）、NP_001138385.1（10-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム3）、NP_001138386.1（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム4）、NP_001138387.1（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム5）、NP_001138388.1（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム6）、NP_001138389.1（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム7）、NP_001138390.1（25-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム8）、およびNP_001138391.1（10-May-2014）で特定されるタンパク質（アイソフォーム9）が挙げられる。これらFGFR2タンパク質のアイソフォームは、膜外ドメインの構造において互いに少し異なる構造を有している。本発明における「FGFR2タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（アイソフォーム２）である。FGFR2タンパク質は、Ig様ドメイン、膜貫通領域、およびキナーゼドメインを有することを特徴としている（図１）。配列番号8で表されるアミノ酸配列であれば、Ig様ドメインは53～347位のアミノ酸配列に該当し、膜貫通領域は376～398位のアミノ酸配列に該当し、キナーゼドメインは482～758位のアミノ酸配列に該当する。
　TXLNAタンパク質は、ヒトにおいては1p35.1に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号10で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_787048.1）からなるタンパク質である。TXLNAタンパク質は、コイルドコイルドメインを有することを特徴としており（図１）、これは配列番号10で表されるアミノ酸配列の186～491位のアミノ酸配列に該当する。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドは、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドには、FGFR2タンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、FGFR2タンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドには、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、TXLNAタンパク質のコイルドコイルドメインの全部が含まれてもよいし、一部が含まれてもよい。
　本発明において、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドとも称する）は、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号2で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号2で表されるアミノ酸配列中、融合点は、653位のグルタミン酸と654位のグルタミン酸の間に位置する。
　上記(ii)において、「1若しくは複数のアミノ酸」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のアミノ酸を意味する。
　上記(iii)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくBLASTXまたはBLASTPと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
　また本発明におけるFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号1で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号1で表される塩基配列中、融合点は、1959位のGTPと1960位のGTPの間に位置する。
　上記(ii)において、「ストリンジェントな条件下」とは、特に記載した場合を除き、中程度または高程度にストリンジェントな条件をいう。
　中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40～50℃での、約50％ホルムアミド、2～6×SSC（または、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；および約40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件および／または洗浄条件を含んでいてもよい。
　高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度が含まれる。典型的には、約65℃、0.2～6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65～68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
　いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄および洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、および1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
　上記(iii)において、「1若しくは複数のヌクレオチド」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のヌクレオチドを意味する。
　上記(iv)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。塩基配列の同一性は、前記アルゴリズムBLASTに基づくBLASTNと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。
（2）FGFR2-KCTD1遺伝子融合
　本遺伝子融合は、FGFR2タンパク質とKCTD1タンパク質の融合タンパク質（以下、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては18q11.2および10q26.1の領域内に切断点を有する転座（t(10;18)）により生じる変異である。
　FGFR2タンパク質は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
　KCTD1タンパク質は、ヒトにおいては18q11.2に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号12で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001136202.1）からなるタンパク質である。KCTD1タンパク質は、BTB/POZドメインを有することを特徴としており（図１）、これは配列番号12で表されるアミノ酸配列の638～740位のアミノ酸配列に該当する。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドは、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドには、FGFR2タンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、FGFR2タンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドには、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、KCTD1タンパク質のBTB/POZドメインの全部が含まれてもよいし、一部が含まれてもよい。
　本発明において、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドとも称する）は、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号4で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号4で表されるアミノ酸配列中、融合点は、679位のグルタミン酸と680位のアスパラギン酸の間に位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号3で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号3で表される塩基配列中、融合点は、2037位のGTPと2038位のGTPの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
（3）FGFR2-BICC1 type2遺伝子融合
　本遺伝子融合は、FGFR2タンパク質とBICC1タンパク質の融合タンパク質（以下、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては10q21.1および10q26.1の領域内に切断点を有する逆位（inv(10)）により生じる変異である。
　FGFR2タンパク質は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
　BICC1タンパク質は、ヒトにおいては10q21.1に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号14で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001073981.1）からなるタンパク質である。BICC1タンパク質は、RNA結合領域であるKHドメインおよびタンパク質相互作用に関与するSAM（ステライル（sterile）αモチーフ）ドメインを有することを特徴としている（図１）。配列番号14で表されるアミノ酸配列であれば、KHドメインは131～204位と283～353位のアミノ酸配列に該当し、SAMドメインは871～936位のアミノ酸配列に該当する。BICC1タンパク質は、Wnt経路を負に制御することが知られており、また、このタンパク質の機能異常により、腎多発嚢胞と膵臓発生異常とを来すことが報告されている（Kraus MR.ら、Hum Mutat., 2012, 33, 86-90）。
　FGFR2-BICC1 type2融合ポリペプチドは、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。FGFR2タンパク質とBICC1タンパク質の融合タンパク質としては、FGFR2遺伝子のエクソン1～19とBICC1遺伝子のエクソン3～21とがインフレームで融合することにより生じた融合ポリペプチドが知られているが（国際公開第2014/007369号）、当該融合ポリペプチドはBICC1のKHドメインを含んでいるため本発明におけるFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドには含まれない。なお本明細書中、本発明におけるFGFR2-BICC1遺伝子融合をFGFR2-BICC1 type 2、国際公開第2014/007369号に開示されたFGFR2-BICC1遺伝子融合をFGFR2-BICC1 type 1という。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドには、FGFR2タンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、FGFR2タンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドには、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、BICC1タンパク質のSAMドメインの全部が含まれてもよいし、一部がふくまれてもよい。
　本発明において、FGFR2-BICC1 type2融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドとも称する）は、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。FGFR2-BICC1 type2融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるFGFR2-BICC1 type2融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号6で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号6で表されるアミノ酸配列中、融合点は、653位のグルタミン酸と654位のグリシンの間に位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号5で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号5で表される塩基配列中、融合点は、1959位のGTPと1960位のGTPの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）FGFR2-TXLNA遺伝子融合」に記載した通りである。
＜がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法＞
　本発明は、前記3種の遺伝子融合の検出方法（以下、本発明の検出方法とも称する）を提供する。本発明の検出方法は、がんを有する被験者由来の単離された試料における前記いずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、被験者は、哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、ヒトが好ましい。
　がんを有する被験者は、がんに罹患している被験者のみならず、がんに罹患している疑いのある被験者、又は将来がんになるリスクを有する被験者であってもよい。本発明の検出方法を適用する対象となる「がん」としては、前記3種の遺伝子融合のうちいずれかが検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは胆道がんである。
　被験者由来の「単離された試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムDNA抽出物、mRNA抽出物、mRNA抽出物から調製されたcDNA調製物やcRNA調製物等）やタンパク質抽出物も含む。ゲノムDNA、mRNA、cDNA又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　また「単離された試料」は、前記がんが存在するか又は存在すると疑われる臓器由来であることが好ましく、例えば、小腸、脾臓、腎臓、肝臓、胆道、胃、肺、副腎、心臓、脳、膵臓、大動脈等に由来するものが挙げられるが、より好ましくは胆道由来である。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドの検出は、自体公知の手法を用いて行なうことができる。
　ゲノムDNAからの転写産物（mRNAまたはmRNAから調製したcDNA）を対象とする場合、例えば、RT-PCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、cDNAマイクロアレイ解析等を利用してmRNA又はcDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　またゲノムDNAを対象とする場合、例えば、in situハイブリダイゼーション（ISH）、ゲノムPCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析等を利用してゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　これらの手法はそれぞれ単独で利用することができるが、組み合わせて利用してもよい。例えば、前記3種の遺伝子融合は、融合ポリペプチドを発現することによりがん化に寄与すると考えられることから、ゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出する場合（例えばin situハイブリダイゼーション等による）には、転写産物またはタンパク質が生成することをさらに確認すること（例えばRT-PCR、免疫染色法等による）も好ましい。
　ハイブリダイゼーション技術（例えば、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット法、マイクロアレイ解析、in situハイブリダイゼーション（ISH）など）により融合ポリヌクレオチドを検出する場合には、前記融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識する」とは、ストリンジェントな条件で、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を含めて当該融合ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドから、当該融合ポリヌクレオチドを識別して認識することをいう。
　本発明の検出方法においては、治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いため、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、in situハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
　in situハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドとして少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（融合ポリヌクレオチド）を検出することができる。
（ａ）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子（FGFR2遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側融合パートナー遺伝子（TXLNA、KCTD1またはBICC1遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　本発明にかかる5’側融合パートナー遺伝子であるFGFR2遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000010.11で特定されるゲノムの配列のうち121478330～121598458番目のＤＮＡ配列（相補鎖）からなる遺伝子である。
　本発明にかかる3’側融合パートナー遺伝子であるTXLNA遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000001.11で特定されるゲノムの配列のうち32179695～32198285番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　本発明にかかる3’側融合パートナー遺伝子であるKCTD1遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000018.10で特定されるゲノムの配列のうち26454910～26657401番目のＤＮＡ配列（相補鎖）からなる遺伝子である。
　本発明にかかる3’側融合パートナー遺伝子であるBICC1遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000010.11で特定されるゲノムの配列のうち58513016～58831435番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変化しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
　本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子（FGFR2遺伝子）の塩基配列および／または3’側融合パートナー遺伝子（TXLNA、KCTD1またはBICC1遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである：
（ａ１）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ；
（ａ２）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）との組み合わせ；
（ａ３）　3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、FGFR2タンパク質のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がTXLNA遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、TXLNAのコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がKCTD1遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の上流領域の塩基配列にはKCTD1のBTB/POZドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がBICC1遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、BICC1のSAMドメインの全部または一部のコード領域が含まれるが、KHドメインのコード領域は含まれない。
　前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の(a1-1)～(a1-3)のポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる：
(a1-1)FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、TXLNAのコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-2)FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、KCTD1のBTB/POZドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、ならびに
(a1-3)FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、BICC1のSAMドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
　本発明の検出方法において検出される融合遺伝子について、融合点の異なる既知のバリアントが存在する場合には、「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブ」には、当該融合遺伝子と当該バリアントとを識別するためのプローブがさらに含まれてもよい。そのようなプローブとしては、当該融合遺伝子と当該バリアントのいずれか一方にのみ含まれる領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。例えば、FGFR2-BICC1 type 2遺伝子のバリアントとしてFGFR2-BICC1 type 1遺伝子が知られているが、これらを識別するためには、BICC1のエクソン3～17の領域（例えばKHドメインのコード領域）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを使用することができる。
　本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、5’側融合パートナー遺伝子（FGFR2遺伝子）と3’側融合パートナー遺伝子（TXLNA、KCTD1またはBICC1遺伝子）との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：1、3、または5に記載の塩基配列中の融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外に放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、33Ｐ、32Ｐ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）等）、によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と5’側融合パートナー遺伝子２とを用いる場合、または3’融合パートナー遺伝子プローブ２と3’融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてin situハイブリダイゼーションを行った場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルと5’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルとの分離、3’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルと3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
　前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記in situハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、5’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと3’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いて融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。基板としては、オリゴまたはポリヌクレオチドを固相化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーなどを挙げることができる。
　本発明の検出方法においては、PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出することも好ましい。
　PCRにおいては、前記生体試料から調製したDNA（ゲノムDNA、cDNA）やRNAを鋳型として融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できる」とは、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を増幅することなく、当該融合ポリヌクレオチドのみを増幅できることをいい、当該融合ポリヌクレオチドの全部が増幅されてもよいし、融合点を含む当該融合ポリヌクレオチドの一部が増幅されてもよい。
　PCR等で利用する「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマー（フォワードプライマー）とアンチセンスプライマー（リバースプライマー）とからなり、センスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側の塩基配列から設計し、アンチセンスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から3’末端側の塩基配列から設計する。またこれらのプライマーは、PCR法による検出の精度や感度の観点から、通常PCR産物が5 kb以下になるよう設計される。プライマーの設計は、公知の手法により適宜行なうことができ、例えば、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems）を利用することができる。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常15塩基以上（好ましくは16、17、18、19または20塩基以上、より好ましくは21塩基以上）であり、100塩基以下（好ましくは90、80、70、60、50または40塩基以下、より好ましくは30塩基以下）である。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号15で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号16で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号15で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号17で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、そしてFGFR2-BICC1 type2融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号15で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号18で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセットが挙げられる（後述の表１を参照のこと）。
　PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、PCR産物を対象としてダイレクトシークエンシングを行い、融合点を含む塩基配列を決定することで、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。シークエンシングは公知の手法により行うことができ、シークエンサー（例えば、ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）などを）を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
　またPCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、TaqManプローブ法をにより、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。TaqManプローブ法において使用するプローブとしては、例えば前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。プローブは、レポーター色素（例えば、FAM、FITC、VIC等）とクエンチャー（例えば、TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGBなど）で標識される。
　上記プライマー及びプローブは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。またその一部又は全部において、PNA（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、LNA（登録商標、locked nucleic acid、Bridged Nucleic Acid、架橋化核酸）、ENA（登録商標、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、GNA（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、TNA（Threose nucleic acid、トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。また上記プライマー及びプローブは、二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
　また上記プライマーおよびプローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含んでいてもよく、標的配列の相補配列に対して通常80％以上、好ましくは90、91、92、93、94％以上、より好ましくは95、96、97、98、99％以上の同一性を有し、最も好ましくは100％の同一性を有する。
　上記プライマー及びプローブは、例えば、本明細書に記載された塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　本発明の検出方法においては、全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング）またはゲノムシークエンシングにより融合ポリヌクレオチドを検出してもよい。これらの手法は、例えば、次世代シークエンサー（例えば、ゲノムアナライザーIIx（Illumina社）、ハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社）ゲノムシークエンサー FLX System（Roche社）など）を使用して製造者の説明書に従って行なうことができる。RNAシークエンシングは、例えば、市販のキット（例えば、mRNA-Seqサンプル調製キット（Illumina社）など）を用いて製造者の説明書に従ってトータルRNAからcDNAライブラリーを調製し、これを次世代シークエンサーを使用するシークエンシングに供することにより行なうことができる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（すなわち、融合ポリヌクレオチド）を対象とする場合、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、RIA法、ELISA法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析などを利用して当該翻訳産物を検出することができる。これらの方法においては、融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体が用いられる。ここで「融合ポリペプチドを特異的に認識する」とは、当該融合ポリペプチドの融合点からN末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質を含めて当該融合ポリペプチド以外のタンパク質を認識することなく、当該融合ポリペプチドのみを認識することをいう。本発明の検出方法において使用される「融合ポリペプチドを特異的に認識する」抗体は、1つの抗体であってもよいし、2つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、N末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質には結合しない抗体を意味する。
　また「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせも挙げられる。これら2つの抗体を用いてサンドイッチELISA、免疫染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などを行なうことにより、融合ポリペプチドを検出することができる。
　さらに、本発明の検出方法において検出される融合遺伝子について、融合点の異なる既知のバリアントが存在する場合には、「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」には、当該融合遺伝子と当該バリアントとを識別するための抗体がさらに含まれてもよい。そのような抗体としては、当該融合遺伝子によってコードされるポリペプチドと当該バリアントによってコードされるペプチドのいずれか一方にのみ含まれる領域に結合する抗体が挙げられる。例えば、FGFR2-BICC1 type 2遺伝子のバリアントとしてFGFR2-BICC1 type 1遺伝子が知られているが、これらを識別するためには、BICC1のエクソン3～17の領域にコードされる領域（例えばKHドメイン）に結合する抗体を使用することができる。
　本発明において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前記抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばFab、Fab’、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体などが挙げられる。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEなどのいずれのアイソタイプを有する抗体であってもよいが、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチド、前記融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチド、または前記融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。市販の抗体を利用してもよい。また標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインGまたはプロテインA等を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キット＞
　以上のように、がんの責任変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、がんの責任変異である遺伝子融合の検出用キット（以下、本発明のキットとも称する）を提供する：
（A）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
　本発明のキットには、ポリヌクレオチドや抗体に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチド、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチド、あるいはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、PCR用試薬、in situハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（DAPI等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインG、プロテインA）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を適宜組み合わせて含めることができる。本発明のキットには、使用説明書を含めることもできる。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の検出方法を容易に実施することが可能である。
　本発明の検出方法及び検出用キットは、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の検出を可能にするものであり、後述のように当該遺伝子融合の陽性例を同定し個別化医療を適用する上で極めて有用である。
＜がんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法＞
　前記3種の遺伝子融合は、がんの責任変異であり、それぞれFGFR2キナーゼの恒常活性化により、細胞のがん化に寄与していると考えられる。そのため、このような遺伝子融合が検出されるがん患者においては、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質による治療が有効である蓋然性が高い。
　したがって、本発明は、がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法（以下、本発明の同定方法とも称する）を提供する。
　本発明の同定方法は、下記の工程を含む：
（1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
　本発明の同定方法において、「がんの患者またはがんのリスクを有する被験者」は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している疑いのある哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の同定方法を適用する対象となる「がん」としては、前記3種の遺伝子融合のうちいずれかが検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは胆道がんである。
　本発明の同定方法において、「治療効果」とは、がん治療の効果であって、患者に対する有益な効果であれば特に限定されず、例えば、腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果、延命効果などが挙げられる。
　本発明の同定方法において、FGFR2-TXLNA遺伝子融合に関してがん治療の有効性を評価する対象となる「がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質」（以下、本発明の同定方法における対象物質とも称する）としては、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型FGFR2タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、３－［２，４－ジメチル－５－［［（Ｚ）－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン］メチル］－１Ｈ－ピロール－３－イル］プロパン酸（例えば、ＳＵ６６６８（一般名称；オランチニブ（ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）））、Ｎ－｛５－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチル］－１Ｈ－ピラゾール－３－イル｝－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ジメチルピぺラジン－１－イル］ベンズアミド（例えば、ＡＺＤ４５４７）、１－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－アジド－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン（例えば、ＤＳ４１５２（一般名称；テコガランナトリウム（ｔｅｃｏｇａｌａｎ　ｓｏｄｉｕｍ））、ＦＧＦＲ２－IIIｂ特異的抗体（例えば、ＡＶ３６９ｂ）、３－（２，６－ジクロロ－３，５－ジメトキシフェニル）－１－［６－［［４－（４－エチルピぺラジン－１－イル）フェニル］アミノ］ピリミジン－４－イル］－１－メチルウレア（例えば、ＢＧＪ３９８）、（Ｓ）－（Ｒ）－１－（（４－（（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）オキシ）－５－メチルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）オキシ）プロパン－２－イル　２－アミノプロピオン酸（例えば、ＢＭＳ－５８２６６４（一般名称；ブリバニブアラニナート（ｂｒｉｖａｎｉｂ　ａｌａｎｉｎａｔｅ））、Ｎ－［２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－ウレア（例えば、ＰＤ１７３０７４）が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドおよび／またはFGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　FGFR2-KCTD1遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型FGFR2タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質として上述したものが挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドおよび／またはFGFR2-KCTD1融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　FGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型FGFR2タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質として上述したものが挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドおよび／またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　本発明の同定方法における工程(1)は、前記本発明の検出方法に含まれる工程と同様に実施することができる。
　本発明の同定方法における工程(2)では、工程(1)でがんを有する被験者（すなわちがんの患者またはがんのリスクを有する被験者）由来の単離された試料において融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定され、一方、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されなかった場合には、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらす可能性が低いと判定される。
　本発明の同定方法によれば、がんの患者またはがんのリスクを有する被験者の中からがんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の陽性例を検出し、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であり、本発明はそのような対象に適した治療を行うことが可能になる点で有用である。
＜がんの治療方法およびがん治療剤＞
　上記の通り、本発明の同定方法により、前記3種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがん患者が同定される。そのため、がん患者のうち、当該融合遺伝子を保持する患者に選択的に当該物質を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんの治療方法であって、被験者に、当該物質を投与する工程を含む方法（以下、本発明の治療方法とも称する）を提供する。
　本発明の治療方法において、被験者は、典型的にはFGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合陽性がん患者である。がんは、特に限定されないが、胆道がんであることが望ましい。ここで、FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合陽性がんとは、本発明の検出方法によってそれぞれの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されるがんを意味する。
　また本発明は、FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合陽性がんの治療剤（以下、本発明のがん治療剤とも称する）を提供する。前記3種の遺伝子融合陽性がんに対しては、これまで当該遺伝子融合を標的とする治療は行われていなかった。またこれらの遺伝子融合の存在については、いずれの先行技術文献等を考慮しても全く予想できないものであった。したがって、本発明のがん治療剤は、前記3種の遺伝子融合陽性がんに対して有効な新規の治療手段を提供するものである。
　本発明のがん治療剤において、がんは、特に限定されないが、胆道がんであることが望ましい。
　本発明のがん治療剤は、典型的には下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分として含む：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　上記（a）～（c）中の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　本発明の治療方法およびがん治療剤において、前記3種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質としては、上記＜がんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法＞において記載した物質が挙げられ、好ましくはFGFR2キナーゼ活性を阻害する物質であり、より好ましくは３－［２，４－ジメチル－５－［［（Ｚ）－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン］メチル］－１Ｈ－ピロール－３－イル］プロパン酸（例えば、ＳＵ６６６８（一般名称；オランチニブ（ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）））、Ｎ－｛５－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチル］－１Ｈ－ピラゾール－３－イル｝－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ジメチルピぺラジン－１－イル］ベンズアミド（例えば、ＡＺＤ４５４７）、１－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－アジド－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン（例えば、ＤＳ４１５２（一般名称；テコガランナトリウム（ｔｅｃｏｇａｌａｎ　ｓｏｄｉｕｍ））、ＦＧＦＲ２－IIIｂ特異的抗体（例えば、ＡＶ３６９ｂ）、３－（２，６－ジクロロ－３，５－ジメトキシフェニル）－１－［６－［［４－（４－エチルピぺラジン－１－イル）フェニル］アミノ］ピリミジン－４－イル］－１－メチルウレア（例えば、ＢＧＪ３９８）、（Ｓ）－（Ｒ）－１－（（４－（（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）オキシ）－５－メチルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）オキシ）プロパン－２－イル　２－アミノプロピオン酸（例えば、ＢＭＳ－５８２６６４（一般名称；ブリバニブアラニナート（ｂｒｉｖａｎｉｂ　ａｌａｎｉｎａｔｅ））、Ｎ－［２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－ウレア（例えば、ＰＤ１７３０７４）である。
　本発明のがん治療剤は、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、および／またはその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
　本発明のがん治療剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
　本発明のがん治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。
　本発明の治療方法およびがん治療剤は、従来知られておらず本願発明により明らかとなった特定のがんの責任変異を有する患者の治療を可能にするため有用である。
＜がん治療剤のスクリーニング方法＞
　本発明は、前記3種の遺伝子融合のいずれかを有するがん患者に対して治療効果をもたらすがん治療剤のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法とも称する）を提供する。本発明のスクリーニング方法により、前記3種の融合ポリペプチド（すなわち、FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、およびFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチド）のうちいずれかの発現および／または活性を抑制する物質を、がん治療剤として得ることができる。
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、低分子化合物、化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品等が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、被験物質が前記3種の融合ポリペプチドのうちいずれかの発現および／または活性を抑制するか否かを評価可能である限り、いかなる形態であってもよい。典型的には、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む：
（1）下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程：
（a）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（b）FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに
（c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　上記（a）～（c）中の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　工程（1）では、前記3種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現している細胞と被験物質を接触させる。対照として、被験物質を含まない溶媒（例えば、DMSOなど）を用いることができる。当該接触は、培地中で行うことができる。培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6～約8であり、培養温度は約30～約40℃であり、培養時間は約12～約72時間である。
　前記3種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現している細胞としては、例えば、内在的に当該融合ポリペプチドを発現しているがん組織由来の細胞、当該細胞から誘導された細胞株、遺伝子工学的に作製された細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。ある細胞が前記3種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現しているか否かは、上記本発明の検出方法を利用して確認することもできる。また細胞は、通常哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒトの細胞である。
　工程（2）では、前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かが決定される。融合ポリペプチドの発現は、細胞におけるmRNAレベルまたはタンパク質レベルを公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット法、定量的PCR法、イムノブロット法、ELISA法等を用いて決定することにより測定することができる。また融合ポリペプチドの活性も、公知の分析方法（例えば、キナーゼ活性測定など）により測定することができる。得られた測定値を被験物質と接触させない対照細胞における測定値と比較する。測定値の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被験物質と接触させた細胞における測定値が対照と比較して有意に低い場合、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　あるいは、これらの融合ポリペプチドを発現している細胞は、増殖が亢進していることから、当該細胞の増殖を本工程における決定のための指標とすることができる。この場合、まず、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を測定する。細胞増殖の測定は、セルカウント、3Hチミジンの取り込み、BRDU法等の自体公知の方法により行うことができる。次に、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を、被験物質と接触させない対照細胞の増殖と比較する。増殖レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質と接触させない対照細胞の増殖は、被験物質と接触させた細胞の増殖の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。比較の結果、被験物質と接触させた当該細胞の増殖が抑制された場合に、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　工程（3）では、工程（2）において融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された被験物質をがん治療剤として選択する。
　以上のように、本発明のスクリーニング方法によれば、従来知られていなかったがんの責任変異を有する患者の治療に適用可能ながん治療剤を取得することが可能となる。
＜単離された融合ポリペプチドまたはその断片、およびそれらをコードするポリヌクレオチド＞
　本発明は、以下の単離された融合ポリペプチド（以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する）またはその断片を提供する：
（1）FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、
（2）FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、ならびに
（3）FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチド。
　本明細書中、「単離された」物質とは、ある物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。本明細書において「単離された」とは、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、よりさらに好ましくは９５重量％以上、そして最も好ましくは９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、又は１００％の純度を有することを意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、また化学的に合成したポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含まれる。
　上記（1）～（3）中のその他の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　「断片」とは、本発明の融合ポリペプチドの断片であって、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなるものをいう。当該部分配列に含まれる融合点の上流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのN末端までを含みうる。当該部分配列に含まれる融合点の下流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのC末端までを含みうる。断片の長さは、特に限定されないが、通常8アミノ酸残基以上（例えば、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100アミノ酸残基以上）である。
　また本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る。
（1）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（2）FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号4で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
（3）FGFR2-BICC1type 2融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号6で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　上記(i)～(iii)中の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　さらに本発明は、上記本発明の融合ポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとも称する）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
　FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを保持するがん組織等から調製したcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記がん組織等から調製したmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（PCR）を用いて増幅することにより調製することもできる。さらに、各融合ポリヌクレオチドの5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子のcDNAを材料とし、PCR、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片も、自体公知の方法により作製することができる。例えば、上記のようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片は、本発明の検出方法等におけるマーカーとして使用することができ、また本発明の融合ポリペプチドに対する抗体の作製等にも使用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜サンプル＞
　RNAシークエンシング、RT-PCRおよびサンガーシークエンシング用サンプルとして、胆道がん患者（190症例）から摘出した腫瘍組織から定法により全RNAを調製した。なお、この研究は、本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
　＜RNAシークエンシング＞
　RNAシークエンシングライブラリーは製造者の標準プロトコールに従い、アジレント社SureSelct strand specific kitを用いて作製した。このライブラリーについて、次世代シークエンサー、Hiseq2000またはGAIIxで、100 bpのペアエンドリードを行なった。得られたペアエンドリードをRefSeq（NCBI Reference Sequence）データベースに参照することにより、融合遺伝子候補を検出した。
　＜RT-PCR、サンガーシークエンシング＞
　全RNAから、逆転写酵素法によりcDNAを合成した。得られたcDNAをPCR増幅に供した。得られたPCR産物の塩基配列は、BigDyeターミネーターキットとABI 3130xl DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製）とを用いて直接決定した。なお、本研究で用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜ウェスタンブロット解析＞
　野性型または変異型のFGFR2融合ポリペプチドのカルボキシ末端にFLAGエピトープタグが付加されたポリペプチドをコードするcDNAを調製し、pMXsレトロウイルスベクターにそれぞれをクローニングした。これらのレトロウイルスをマウス繊維芽細胞株NIH-3T3細胞に感染させて野性型もしくは変異型のFGFR2融合遺伝子を発現する安定発現細胞株を得た。G418（700μg/ml)存在下で培養した細胞から、protease阻害剤(Sigma, P8340)とphosphatase阻害剤(Nacalai tesque, #7574-61)を添加した細胞溶解液(Sigma, CelLytic-M)を用いてタンパク質を抽出し、以下の抗体を使用して定法によりウェスタンブロット解析を行った：抗FLAG抗体（Takara Bio, #635691）；抗p-FGFR（Y653/Y654)抗体（CST, #3476）；抗p-MAPK (T202/Y204)抗体（CST, #9106）；抗MAPK抗体（CST, #4695）；および抗β-アクチン抗体（Sigma, A5441）。
　（実施例１）
　本実施例は、胆道がん組織における新規融合転写産物の同定について記載する。
　治療標的となりうる新規融合転写産物を同定するため、胆道がん患者から摘出した腫瘍組織の全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング、Meyerson, M. et al., Nat Rev Genet, 2010, 11, 685-696）を行った。
　RNAシークエンシングで得られたペアエンドリードを解析し、逆転写（RT）-PCR産物のサンガーシークエンシングを行った。その結果、表２及び図１に示すように、3つの新規融合遺伝子産物が同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　FGFR2-TXLNAは、染色体転座t(1;10)により生じた、染色体10q26.1に存在するFGFR2-TXLNA遺伝子と染色体1p35.1に存在するTXLNA遺伝子とが、読み枠にずれを生じることなく直接結合した融合遺伝子である。
　FGFR2-KCTD1は、染色体転座t(10;18)により生じた、染色体10q26.1に存在するFGFR2遺伝子と染色体18q11.2に存在するKCTD1遺伝子が、読み枠にずれを生じることなく直接結合した融合遺伝子である。
　FGFR2-BICC1 type 2は、染色体逆位inv(10)により生じた、染色体10q26.1に存在するFGFR2遺伝子と染色体10q21.1に存在するBICC1遺伝子が、読み枠にずれを生じることなく直接結合した融合遺伝子である。本実施例において見出されたFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合は、FGFR2遺伝子のエクソン1～19とBICC1遺伝子のエクソン18～21とがインフレームで融合することにより生じたものである。一方、既知のFGFR2-BICC1遺伝子融合（FGFR2-BICC1 type 1）は、FGFR2遺伝子のエクソン1～19とBICC1遺伝子のエクソン3～21とがインフレームで融合することにより生じたものである。すなわち、FGFR2-BICC1 type 2は、FGFR2-BICC1 type 1とは融合点が全く異なる新規の遺伝子融合である。
（実施例２）
　本実施例は、実施例１で見出された融合遺伝子にコードされるポリペプチドの機能、および当該ポリペプチドを発現しているがん細胞に対するFGFRキナーゼ阻害剤の有効性について解析した結果を示す。
　まず、胆道がん患者由来のがん組織より得たFGFR2融合遺伝子のcDNA（FGFR2-TXLNAのcDNA、FGFR2-KCTD1のcDNA、またはFGFR2-BICC1 type 2のcDNA）の5'側に、FLAGエピトープタグをコードするcDNAを翻訳の読み枠を合わせて連結し、pMXsレトロウイルスベクターにクローニングした。
　また、このベクターに部位特異的な変異を導入し、FGFR2キナーゼドメイン内の2アミノ酸を置換したキナーゼ活性変異体（KD変異型FGFR2融合ポリペプチド：Y568F/Y569F）をコードするベクターも作製した。
　次に、このように調製して得られたレトロウイルスベクターを、マウス正常繊維芽細胞株NIH-3T3細胞に各々感染させ、野性型または変異型のFGFR2融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を得た。
　対照として、FGFR2-BICC1 type 1についても、前記と同様に野生型または変異型の融合ポリペプチドをコードするベクターを作製した。当該ベクターをＮＩＨ－３Ｔ３細胞に感染させ、FGFR2-BICC1 type 1融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を調製した。
　FGFRシグナルはMAPK経路を活性化することが知られていることから、これらの細胞株についてリン酸化MAPKまたは非リン酸化MAPKに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析を行い、FGFR2を介したシグナル伝達の活性化を解析した。
　結果を図２に示す。野生型FGFR2融合ポリペプチドの発現によってMAPKのリン酸化が引き起こされることが確認された一方で、キナーゼ活性変異体を発現させた細胞株では、MAPKのリン酸化レベルが顕著に低下した。したがって、本発明の融合ポリペプチドが、FGFR2キナーゼ活性依存的にMAPK経路を活性化することが示された。
　また本発明の融合ポリペプチドの形質転換能（がん化能）を調べるために、野性型のFGFR2融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株をソフトアガー培地（培地中のアガーの濃度：4 mg/mL、以下同じ）に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価した。
　結果を図３（薬無し）に示す。野生型のFGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2の発現によって、NIH3T3細胞の足場非依存性増殖が誘導されることが明らかになった。
　さらに、低分子FGFRキナーゼ阻害剤（BGJ398またはPD173074）を添加したソフトアガー培地を使用して同様に足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、FGFR2融合ポリペプチドによる形質転換に対するFGFRキナーゼ阻害剤の効果を調べた。
　結果を図３に示す。FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、およびFGFR2-BICC1 type 2のFGFR2融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は、FGFRキナーゼ阻害剤によって著しく阻害された。
　さらに、本発明の融合ポリペプチドのin vivo造腫瘍能を調べた。
　野生型またはKD変異型FGFR2融合遺伝子を発現するNIH3T3細胞1x106個を6週齢の免疫不全マウス（BALB/c-nu/nu、日本クレア株式会社、東京、日本）2匹にそれぞれ2箇所（合計4箇所）、皮下移植した。移植から10日後、腫瘍形成の有無を観察した。Krasがん遺伝子G12V変異を発現するNIH３T３細胞を陽性コントロールとして用いた。
　結果を図４に示す。野性型FGFR2融合遺伝子を発現させた細胞では腫瘍形成が観察されたが、KD変異型を用いた場合は移植から30日後の観察においても腫瘍形成は全く認められなかった。
　以上の結果から、本発明の融合ポリペプチドが形質転換能を有していること、および当該形質転換能にはFGFR2キナーゼ活性が必要であることが示された。さらに、本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞の足場非依存性コロニー形成を抑制するためにはFGFRキナーゼ阻害剤が有効であることが示された。
　本発明によれば、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合を検出すること、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらにはそのようながんの患者に適した治療（個別化医療）を行うことが可能となる。
配列番号1：FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド
配列番号2：FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド
配列番号3：FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド
配列番号4：FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド
配列番号5：FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチド
配列番号6：FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチド
配列番号7：FGFR2 cDNA
配列番号8：FGFR2ポリペプチド
配列番号9：TXLNA cDNA
配列番号10：TXLNAポリペプチド
配列番号11：KCTD1 cDNA
配列番号12：KCTD1ポリペプチド
配列番号13：BICC1 cDNA
配列番号14：BICC1ポリペプチド
配列番号15：FGFR2センスプライマー
配列番号16：TXLNAアンチセンスプライマー
配列番号17：KCTD1アンチセンスプライマー
配列番号18：BICC1アンチセンスプライマー

Claims (16)

  1. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
    （a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
    （c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 　融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（c）のいずれかである、請求項１に記載の方法：
    （a）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
    （b）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；および
    （c）下記のポリペプチドをコードするFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
  3. 　融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（c）のいずれかである、請求項１または２に記載の方法：
    （a）（i）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （b）（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （c）（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　がんが胆道がんである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
    （a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
    （c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
    （2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
  6. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
    （A）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
    （B）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチド、FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
    （C）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチド、FGFR2-KCTD1融合ポリペプチド、またはFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
  7. 　FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-TXLNA融合ポリペプチドまたはその断片。
  8. 　FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-KCTD1融合ポリペプチドまたはその断片。
  9. 　FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有する、単離されたFGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドまたはその断片。
  10. 　請求項７～９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　FGFR2-TXLNA、FGFR2-KCTD1、またはFGFR2-BICC1 type 2遺伝子融合陽性がんの治療剤。
  12. 　下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分として含む、請求項１１に記載の治療剤：
    （a）FGFR2-TXLNA融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （b）FGFR2-KCTD1融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
    （c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリヌクレオチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  13. 　がんが胆道がんである、請求項１１または１２に記載の治療剤。
  14. 　前記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療剤。
  15. 　FGFR2キナーゼ活性を阻害する物質が、３－［２，４－ジメチル－５－［［（Ｚ）－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン］メチル］－１Ｈ－ピロール－３－イル］プロパン酸、Ｎ－｛５－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチル］－１Ｈ－ピラゾール－３－イル｝－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ジメチルピぺラジン－１－イル］ベンズアミド、１－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－アジド－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン、ＦＧＦＲ２－IIIｂ特異的抗体、３－（２，６－ジクロロ－３，５－ジメトキシフェニル）－１－［６－［［４－（４－エチルピぺラジン－１－イル）フェニル］アミノ］ピリミジン－４－イル］－１－メチルウレア、（Ｓ）－（Ｒ）－１－（（４－（（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）オキシ）－５－メチルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）オキシ）プロパン－２－イル　２－アミノプロピオン酸、Ｎ－［２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－ウレアである、請求項１４に記載の治療剤。
  16. 　がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）下記（a）～（c）のいずれかの融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程：
    （a）FGFR2-TXLNA融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにTXLNAのコイルドコイルドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、
    （b）FGFR2-KCTD1融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにKCTD1のBTB/POZドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに
    （c）FGFR2-BICC1 type 2融合ポリペプチドであって、FGFR2のIg様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼドメイン、ならびにBICC1のSAMドメインを含むが、BICC1のKHドメインを含まず、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
    （2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
    （3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
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