WO2022231226A1 - 클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2022231226A1
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WO
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extract
chlorella protothecoides
cosmetic composition
chlorella
wrinkle improvement
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PCT/KR2022/005839
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김왕배
임동중
김건우
박진오
김보라
황지은
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대봉엘에스 주식회사
대상 주식회사
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    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof

Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition for skin whitening or wrinkle improvement comprising an extract of chlorella protothecoides and a method for preparing the same.
  • Microalgae are photosynthetic organisms that use carbon dioxide, water, and solar energy to synthesize organic matter, a major energy factor, and produce oxygen. These microalgae can fix carbon dioxide in the atmosphere and have high protein and lipid content, so they can be used as biomass for food, feed or fuel production. Specifically, the primary metabolites of microalgae, such as lipids, carbohydrates, or proteins, can be used as a source of various biofuels such as biodiesel, bioethanol or biogas and as a raw material for polyunsaturated fatty acids (PUFAs).
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • high value-added useful substances such as vitamins, carotenoids, polysaccharides, and lutein, which are secondary metabolites of microalgae, can be used as functional foods, natural pigments, medicinal substances, animal feed, aquaculture feed, and the like.
  • Chlorella protothecoides has a high value for use as a cosmetic composition because there are no limiting factors for its use due to its pale yellow color and light odor.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0023065 discloses a method for extracting soluble proteins from Chlorella protothecoides.
  • Patent Document 0001 Korean Patent Publication No. 10-2017-0023065 (2017.03.02)
  • the present inventors have researched and tried to solve the problem that the use of chlorella as a cosmetic composition is limited due to the unique fishy smell and dark color of the conventional chlorella.
  • the present invention was completed by finding that
  • an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin whitening or wrinkle improvement comprising an extract of Chlorella protothecoides, and a method for preparing the same.
  • the present invention is a first invention.
  • It provides a cosmetic composition for skin whitening or wrinkle improvement comprising an extract of Chlorella protothecoides .
  • the chlorella protothecoides ( chlorella protothecoides ) extract may include a low molecular weight peptide.
  • the low molecular weight peptide may be obtained using a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme may be a papaya-derived enzyme.
  • It provides a method for producing a Chlorella protothecoides extract comprising the step of obtaining an extract containing a low molecular weight peptide from the reaction solution.
  • the dispersion may be made by pressing at 100 to 5000 psi.
  • 10 to 150 parts by weight may be added based on 100 parts by weight of the Chlorella protothecoides.
  • the step of fractionating the extract with an ultrafiltration membrane to obtain a fraction may be further included.
  • composition containing the extract of Chlorella protothecoides of the present invention is limited in its use as a cosmetic composition due to the unique fishy smell and dark color of the conventional composition using chlorella, for skin whitening or wrinkle improvement It can be widely used as a cosmetic.
  • Example 1 is a graph showing the tyrosinase inhibitory effect test results obtained by treating the sample prepared in Example 1 under different reaction conditions.
  • 3 is a graph comparing the tyrosinase inhibitory effect of extracts prepared by treating papain and flavozyme, respectively.
  • 5 is a graph showing the inhibitory effect of melanin production in cells according to different concentrations of the samples having the best tyrosinase inhibitory effect in Experimental Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of intracellular collagen synthesis according to different concentrations of the samples having the best tyrosinase inhibitory effect in Experimental Example 1.
  • the present invention features a cosmetic composition for skin whitening or wrinkle improvement comprising an extract of Chlorella protothecoides .
  • Chlorella is a microalgae that is a single-celled green algae. Like the physiology of general plants, Chlorella assimilates carbon sources (carbon dioxide in the air), nitrogen, and other inorganic salts through photosynthesis, and is a potent green algae that quickly causes self-cell proliferation (division). to be. Chlorella is important as an organic resource because it has a high protein content and contains a lot of useful amino acids, as well as a lot of fat and other active ingredients.
  • the microalgae of the genus Chlorella used in the present invention is Chlorella protothecoides.
  • the chlorella protothecoides ( chlorella protothecoides ) extract may include a low molecular weight peptide.
  • the low molecular weight peptide may have a molecular weight of 0.1 to 10 kDa, preferably 0.1 to 5 kDa, and more preferably 0.1 to 1 kDa.
  • a molecular weight of 0.1 to 10 kDa, preferably 0.1 to 5 kDa, and more preferably 0.1 to 1 kDa.
  • the molecular weight is less than 0.1 kDa, it takes a lot of time and cost to reduce the molecular weight, and when it exceeds 1 kDa, there is a disadvantage in that the transdermal permeation efficiency is lowered.
  • the low molecular weight peptide may be obtained using a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme one or more commercially available enzymes can be used, and the commercially available enzymes include kojizyme, alkalase, esperase, nutrase, flavourzyme, etc. Any one or more selected may be used, and preferably papaya-derived enzymes may be used.
  • papaya-derived enzyme any plant proteolytic enzyme obtained from papaya may be used, and preferably papain may be used.
  • the papain is a proteolytic enzyme obtained from the latex of the fruit of a papaya tree native to South America.
  • the papain enzyme has a molecular weight of 20,000 to 30,000 (MW), an isoelectric point of pH 8.75, an optimal reaction pH is pH 6 to pH 7, is stable at pH 4.0 to pH 8.0, and degrades proteins (endopeptidase action) to peptone (peptone) can be created.
  • the papain may be prepared by purifying dendritic papain latex obtained by making a shallow wound on the skin or stem of the unripe fruit of papaya, collecting the falling liquid, and allowing it to solidify for 4 to 6 hours.
  • the papain is effectively used in the field of food, such as softening meat, removing precipitated particles generated during refrigeration of beer, and the like, and is also used as a pharmaceutical.
  • the papain has a strong hydrolysis power with respect to connective tissue collagen, elastin, actomyosin, and the like, and thus has a softening action on meat.
  • the Chlorella protothecoides extract may be included in the cosmetic composition to have a concentration of 50 to 1000 ⁇ m/ml, preferably 200 to 400 ⁇ m/ml.
  • Chlorella protothecoides extract When the Chlorella protothecoides extract is included in the cosmetic composition to have a concentration of less than 50 ⁇ m/ml, the skin moisturizing power, skin elasticity, skin regeneration and skin irritation alleviation effects of the Chlorella protothecoides extract may not be properly expressed. .
  • Chlorella protothecoides extract is included in the cosmetic composition to have a concentration exceeding 1000 ⁇ m/ml, there is a risk of inhibiting the expression effect of other components constituting the cosmetic composition, and at a concentration above a certain concentration, Chlorella protothecoides The expected effect of the koides extract may not be enhanced any more.
  • the cosmetic composition of the present invention may include components commonly used in cosmetic compositions, for example, conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, and carriers.
  • conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, and carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, It may be formulated as oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto.
  • it may be prepared in the form of a flexible lotion, a nourishing lotion, a nourishing cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray, or a powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butylglycol oil, glycerol fatty ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and microcrystals
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and microcrystals
  • cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracanth may be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • Sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative or ethoxylated glycerol fatty acid ester may be used.
  • the cosmetic composition of the present invention is a soap, surfactant-containing cleansing or surfactant-free cleansing formulation
  • the soap is liquid soap, powder soap, solid soap, and oil soap
  • the surfactant-containing cleansing formulation is a cleansing foam, cleansing water, cleansing towel, and cleansing pack
  • the surfactant-free cleansing formulation is a cleansing cream , cleansing lotion, cleansing water, and cleansing gel, but not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of dispersing chlorella protothecoides in a solvent to obtain a dispersion, adding a proteolytic enzyme to the dispersion to obtain a reaction solution, and an extract containing a low molecular weight peptide from the reaction product
  • Another feature of the method for producing an extract of Chlorella protothecoides comprising the step of obtaining.
  • the dispersion may be made by pressurizing a mixture of the Chlorella protothecoides and the solvent.
  • the pressurization induces damage or stimulation to the cell wall of Chlorella protothecoides, so that various active ingredients contained in Chlorella protothecoides can be more effectively extracted.
  • the pressurization may be performed at a pressure of 100 to 5000 psi, preferably at a pressure of 500 to 3000 psi, and more preferably at a pressure of 1000 to 2000 psi.
  • the dispersion may be obtained by adding a solvent 10 to 30 times the amount of Chlorella protothecoides added.
  • the solvent may be purified water, a lower alcohol such as ethanol, methanol, butanol, or a mixed solvent thereof, preferably purified water.
  • a reaction solution may be obtained by adding a proteolytic enzyme to the dispersion, and in this case, an additional solvent may be added to the dispersion in addition to the proteolytic enzyme and stirred.
  • the proteolytic enzyme may be added in an amount of 1 to 100 parts by weight, preferably 20 to 70 parts by weight, based on 100 parts by weight of the Chlorella protothecoides.
  • the proteolytic enzyme content is less than 1 part by weight based on 100 parts by weight of Chlorella protothecoides, there is a disadvantage that the reaction time is long due to low physiological activity, and when it exceeds 100 parts by weight, the efficiency is low and the process cost is increased cause to do
  • purified water lower alcohols such as ethanol, methanol, butanol, and mixed solvents thereof may be used, preferably purified water may be used, and 10 to 100 times the amount of Chlorella protothecoides added may be added. .
  • the amount of the additional solvent is less than 10 times the amount added to Chlorella protothecoides, it is difficult to efficiently precipitate unreacted Chlorella protothecoides, making it difficult to selectively separate unreacted Chlorella protothecoides and low molecular weight peptides.
  • the stirring may be performed at a temperature of 40 to 60 °C for 6 to 30 hours, preferably at a temperature of 45 to 55 °C for 24 to 28 hours.
  • an extract containing a low molecular weight peptide can be obtained from the reaction solution, and the supernatant obtained after centrifugation of the reaction solution can be filtered.
  • the filtration may use a filtration membrane having a pore size of 0.1 to 0.3 ⁇ m, preferably 0.15 to 0.25 ⁇ m.
  • the present invention may further include the step of fractionating the extract with an ultrafiltration membrane to obtain a fraction.
  • the ultrafiltration membrane is cellulose acetate (Cellulose Acetate), polyacrylonitrile / polyvinyl chloride copolymer (polyacrylonitrile / co-polyvinylchloride, PAN / co-PVC), polysulfone (Polysulfone), polyethersulfone (Polyethersulfone, PES), Polyvinylidene fluoride (PVDF), aliphatic polyamide, aromatic polyamide, polyimide, polyetherimide, polyetheretherketone consisting of a polymer It may be selected from a group.
  • the ultrafiltration membrane may have a molecular weight cutoff of 10 kDa or less, 5 kDa or less, 3 kDa or less, 1 kDa or less, 0.6 kDa or less, and preferably 1 kDa or less.
  • Chlorella protothecoides was mixed with purified water at 5 w/w%, and pressurized to 1500 psi to obtain a dispersion.
  • 50 parts by weight of papain and 6000 parts by weight of purified water were added to 100 parts by weight of Chlorella protothecoides and stirred to prepare a reactant.
  • the reactants were subjected to heat treatment at 40° C., 50° C., and 60° C. for each condition for 6 hours, 12 hours, 24 hours, and 28 hours, and then filtered through a filtration membrane having a pore size of 0.2 ⁇ m. Then, fractionation with a 1 kDa ultrafiltration membrane was used to prepare an extract containing a low molecular weight peptide of less than 1 kDa.
  • Tyrosinase is an enzyme that helps the production of melanin by accelerating the oxidation process of a substance called tyrosine in a living body.
  • a method of measuring the degree of inhibiting the formation of a black polymer called melanin by inhibiting the function of this enzyme by oxidizing tyrosine was applied to whiten The effect was judged.
  • the DPPH method is a test to measure antioxidant activity by reducing power using a free radical called DPPH (2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical).
  • DPPH 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical.
  • the degree of decrease is compared with the absorbance of the blank test solution, and the free radical scavenging rate is measured at a wavelength of 560 nm.
  • a standard DPPH solution having a concentration of 60 ⁇ M was prepared, and then the extract showing the highest tyrosinase inhibitory effect in Experimental Example 1 was prepared so that the dilution concentration was 100 to 0.1%, respectively. Then, the sample and the standard DPPH solution were added in the same ratio and stirred, followed by reaction at 37° C. for 30 minutes, and absorbance was measured at 560 nm, and the results are shown in FIG. 2 below.
  • the degree of inhibition of tyrosinase activity and the free radical scavenging rate of the Chlorella protothecoides low-molecular peptide-containing extract prepared by treating different proteolytic enzymes were measured.
  • Chlorella protothecoides was mixed with purified water at 5 w/w%, and pressurized to 1500 psi to obtain a dispersion.
  • 6000 parts by weight of purified water based on 100 parts by weight of Chlorella protothecoides was added, each 50 parts by weight of papain and flavozyme were treated, and two reactants treated differently with proteolytic enzymes by stirring. was prepared.
  • the two reactants were heated at a temperature of 50° C. for 24 hours and then filtered through a filtration membrane having a pore size of 0.2 ⁇ m. Thereafter, an extract containing a low molecular weight peptide of less than 1 kDa was prepared by fractionation with a 1 kDa ultrafiltration membrane.
  • B16F10 cells were dispensed at 2.0x10 4 cells/ml and cultured for 24 hours, treated with ⁇ -MSH, a melanogenesis-inducing hormone, and arbutin as a positive control and extracts by concentration were added. Then, after 72 hours incubation in the medium, cells were collected, 1N NaOH was treated at 80° C. for 1 hour to extract melanin, and the absorbance was measured at 405 nm, and the results are shown in FIG. 5 below.
  • the extract containing Chlorella protothecoides low molecular weight peptide exhibited an excellent melanin synthesis inhibitory effect in proportion to the treatment concentration.
  • NHDF human dermal fibroblasts
  • a wound healing assay is a test to confirm the wound healing activity of an evaluation sample by making a wound on a single layer of cells and observing the decrease in the interval with a time lapse microscope with the passage of time. way.
  • Human keratinocytes HaCaT Cells
  • HaCaT Cells Human keratinocytes

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Abstract

본 발명은 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 조성물은, 종래 클로렐라를 이용한 조성물의 독특한 비린내와 짙은 색으로 인해 화장료 조성물로서의 활용이 제한되는 문제가 해결되어, 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료로 널리 활용될 수 있다.

Description

클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법
본 발명은 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 출원은 2021년 4월 26일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0053917호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 기재된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
미세조류는 이산화탄소와 물, 그리고 태양에너지를 이용하여 에너지주요인자인 유기물을 합성하고 산소를 생산하는 광합성 생물이다. 이러한 미세조류는 대기 중 이산화탄소를 고정할 수 있고, 단백질 및 지질함량이 높으므로 식품, 사료 또는 연료 생산용 바이오매스로 활용될 수 있다. 구체적으로, 미세조류의 1차 대사산물인 지질, 당질 또는 단백질 등은 바이오디젤, 바이오에탄올 또는 바이오가스와 같은 다양한 바이오연료의 공급원 및 다가 불포화지방산(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)의 원료로도 사용될 수 있고, 미세조류의 2차 대사산물인 비타민, 카로테노이드, 다당류, 루테인 등의 고부가 유용 물질은 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 수산양식용 사료 등으로 이용될 수 있다.
종래의 클로렐라는 독특한 비린내와 엽록소로부터 유래한 짙은 녹색으로 인해 화장료 조성물 또는 외용제 원료로서의 활용이 제한되었다. 그러나 클로렐라 프로토테코이데스는 옅은 노란색과 옅은 취로 활용 제한 요소가 없어 화장료 조성물로서의 활용 가치가 높다고 할 수 있다. 한국공개특허공보 10-2017-0023065호는 클로렐라 프로토테코이데스로부터 가용성 단백질을 추출하는 방법을 개시하고 있다.
하지만 피부 흡수도가 높은 것으로 알려진 펩타이드 중에서도 화장료 조성물로서 활용 가능한 미백, 주름개선 및 항노화 생리활성을 가지는 클로렐라 추출물에 관한 연구개발은 미비한 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 한국공개특허공보 제 10-2017-0023065호(2017.03.02)
이에 본 발명자들은 종래 클로렐라의 독특한 비린내와 짙은 색으로 인해 화장료 조성물로서의 활용이 제한되는 문제를 해결하고자 연구, 노력한 결과, 클로렐라 프로토테코이데스를 활용하면 이러한 문제점을 해결하면서도 우수한 피부 미백 또는 주름 개선 효과가 나타나는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은,
클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물은 저분자량 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 저분자량 펩타이드는 단백질 분해 효소를 이용하여 얻어질 수 있다.
상기 단백질 분해 효소는 파파야 유래 효소일 수 있다.
한편 본 발명은,
클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides)를 용매에 분산시켜 분산액을 얻는 단계;
상기 분산액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응액을 얻는 단계; 및
상기 반응액으로부터 저분자량 펩타이드를 포함하는 추출액을 얻는 단계를 포함하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 분산은 100 ~ 5000 psi로 가압하여 이루어질 수 있다.
상기 단백질 분해 효소는,
상기 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부에 대하여 10 ~ 150 중량부가 첨가될 수 있다.
또한, 상기 추출액을 한외여과막으로 분획하여 분획액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 조성물은, 종래 클로렐라를 이용한 조성물의 독특한 비린내와 짙은 색으로 인해 화장료 조성물로서의 활용이 제한되는 문제가 해결되어, 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료로 널리 활용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 반응 조건을 달리하여 제조된 시료를 처리하여, 그에 따른 티로시나제 억제효과 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 억제효과를 가지는 시료의 농도를 달리 처리하여, 그에 따른 라디칼 소거효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 파파인과 플레보자임을 각각 처리하여 제조된 추출물의 티로시나제 억제효과를 비교한 그래프이다.
도 4는 파파인과 플레보자임을 각각 처리하여 제조된 추출물의 라디칼 소거효과를 비교한 그래프이다.
도 5은 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 억제효과를 가지는 시료의 농도를 달리 처리하여, 그에 따른 세포 내 멜라닌 생성 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 억제효과를 가지는 시료의 농도를 달리 처리하여, 그에 따른 세포 내 콜라겐 합성량을 나타낸 그래프이다.
도 7는 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 억제효과를 가지는 시료의 농도를 달리 처리하여, 그에 따른 세포 내 콜라겐 합성 정도를 확인한 사진이다.
도 8은 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 억제효과를 가지는 시료의 농도를 달리 처리하여, 그에 따른 세포 증식 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 특징으로 한다.
클로렐라는 단세포 녹조류(Green algae)에 해당하는 미세조류로서 일반식물의 생리와 같이 광합성에 의하여 탄소원(공기 중의 이산화탄소)과 질소, 기타 무기염류를 동화하여 신속히 자기세포의 증식(분열)을 일으키는 유력한 녹조류이다. 클로렐라는 단백질 함량이 많고 유용한 아미노산을 많이 함유하고 있을 뿐만 아니라, 지방, 기타 유효성분을 다량 함유하므로 유기자원으로 중요하며, 앞으로의 단백질, 지방자원으로 주목받을 수 있는 물질로 주목받고 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 클로렐라 속의 미세조류는 클로렐라 프로토테코이데스이다.
상기 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물은 저분자량 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 저분자량 펩타이드는 분자량이 0.1 ~ 10 kDa일 수 있고, 바람직하게는 분자량이 0.1 ~ 5 kDa일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 분자량이 0.1 ~ 1 kDa일 수 있다. 상기 분자량이 0.1 kDa 미만인 경우 저분자화 비용과 시간이 많이 소요되고, 1 kDa 초과인 경우 경피투과 효율이 낮아지는 단점이 있다.
상기 저분자량 펩타이드는 단백질 분해 효소를 이용하여 얻어질 수 있다.
상기 단백질 분해 효소는, 상용효소를 하나 이상 사용할 수 있으며 상용효소로는 코지자임(kojizyme), 알카라제(Alkalase), 에스퍼라제(esperase), 뉴트라제(nutrase), 플레보자임(flavourzyme) 등에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 파파야 유래 효소를 사용할 수 있다.
상기 파파야 유래 효소는 파파야에서 얻는 모든 식물성 단백질 분해 효소가 사용될 수 있고, 바람직하게는 파파인(papain)이 사용될 수 있다.
상기 파파인은 남아메리가 지역에 자생하는 파파야 나무의 과실의 유액으로부터 얻어진 단백질 가수분해효소이다. 상기 파파인 효소는 분자량이 2만 내지 3만(MW)이고, 등전점 pH 8.75이며, 최적 반응 pH는 pH 6 내지 pH 7이고, pH 4.0 내지 pH 8.0에서 안정하며, 단백질을 분해(endopeptidase 작용)하여 펩톤(peptone)을 생성할 수 있다.
상기 파파인은 파파야의 미숙 과실의 외피 혹은 수간에 얕은 상처를 내어 떨어지는 유액을 모아 4시간 내지 6시간 방치하여 응고시키는 방법으로 수득한 수지상의 파파인 라텍스(papain latex)를 정제하여 제조될 수 있다.
상기 파파인은 식품분야에서 식육의 연화, 맥주의 냉장 시에 생기는 침전입자의 제거 등에 유효하게 사용되고, 의약품으로 사용되기도 한다. 또한, 상기 파파인은 결합조직성의 콜라겐, 엘라스틴(elastin) 또는 악토미오신 등에 대하여 강한 가수분해력을 가지므로, 식육에 대한 연화작용을 갖는다.
상기 클로렐라 프로토테코이데스 추출물은, 상기 화장료 조성물에 50 ~ 1000 ㎛/ml의 농도가 되도록 포함될 수 있고, 바람직하게는 200 ~ 400 ㎛/ml의 농도가 되도록 포함될 수 있다.
화장료 조성물에 클로렐라 프로토테코이데스 추출물이 50 ㎛/ml 미만의 농도를 가지도록 포함될 경우, 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 피부 보습력, 피부 탄력, 피부 재생 및 피부 자극 완화 효능이 제대로 발현되지 않을 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 클로렐라 프로토테코이데스 추출물이 1000 ㎛/ml을 초과하는 농도를 가지도록 포함될 경우, 화장료 조성물을 조성하는 기타 성분의 발현효과를 저해할 우려가 있고, 일정 농도 이상에서는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물에서 기대할 수 있는 효과가 더는 증진되지 않을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편 본 발명은, 클로렐라 프로토테코이데스 (chlorella protothecoides)를 용매에 분산시켜 분산액을 얻는 단계, 상기 분산액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응액을 얻는 단계 및 상기 반응물로부터 저분자량 펩타이드를 포함하는 추출액을 얻는 단계를 포함하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
상기 클로렐라 프로토테코이데스를 용매에 분산시키는 경우, 상기 분산은 상기 클로렐라 프로토테코이데스와 용매의 혼합물을 가압하여 이루어질 수 있다.
상기 가압은 상기 클로렐라 프로토테코이데스의 세포벽에 손상 또는 자극을 유도하여, 클로렐라 프로토테코이데스에 포함된 각종 유효성분을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다.
상기 가압은 100 ~ 5000 psi 압력으로 진행될 수 있고, 바람직하게는 500 ~ 3000 psi 압력으로 진행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1000 ~ 2000 psi 압력으로 진행될 수 있다.
상기 가압이 100 psi 미만의 압력으로 진행될 경우, 가압효율이 떨어져 유효성분의 추출율이 크게 향상되지 않는 문제가 있고, 5000 psi 초과 압력으로 진행될 경우 온도 제어가 힘들고, 유효성분이 파괴될 수 있는 문제가 있다.
상기 분산액은 클로렐라 프로토테코이데스 첨가량의 10 ~ 30배의 용매를 가하여 얻어질 수 있다.
상기 용매는 정제수, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알콜 및 이들의 혼합용매가 사용될 수 있고, 바람직하게는 정제수가 사용될 수 있다.
다음, 상기 분산액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응액을 수득할 수 있고, 이때 상기 분산액에 단백질 분해 효소 외에 추가 용매를 더 첨가하고, 교반할 수 있다.
상기 단백질 분해 효소는 상기 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부에 대하여, 1 ~ 100 중량부가 첨가될 수 있고, 바람직하게는 20 ~ 70 중량부가 첨가될 수 있다. 단백질 분해 효소 함량이 상기 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부에 대하여, 1 중량부 미만인 경우, 생리활성이 낮아 반응 시간이 길어지는 단점이 있고, 100 중량부 초과인 경우, 효율이 낮아 공정비용이 증가하는 원인이 된다.
상기 추가 용매는 정제수, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알콜 및 이들의 혼합용매가 사용될 수 있고, 바람직하게는 정제수가 사용될 수 있으며, 상기 클로렐라 프로토테코이데스 첨가량의 10 ~ 100배가 첨가될 수 있다.
상기 추가 용매의 첨가량이 클로렐라 프로토테코이데스 첨가량의 10배 미만인 경우에는 미반응된 클로렐라 프로토테코이데스를 효율적으로 침전시키기 어려워 미반응된 클로렐라 프로토테코이데스와 저분자량 펩타이드를 선별적으로 분리하기 힘든 단점이 있으며, 100배 초과인 경우에는 반응용기의 크기가 너무 크고, 반응액 양이 너무 많아 공정비용이 과다하여 경제적이지 못한 단점이 있다.
상기 교반은 40 ~ 60 ℃의 온도에서 6 내지 30시간 동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 45 ~ 55 ℃의 온도에서 24 내지 28시간 동안 이루어질 수 있다.
다음, 상기 반응액으로부터 저분자량 펩타이드를 포함하는 추출액을 얻을 수 있고, 이때 상기 반응액을 원심분리 후 취한 상등액을 여과할 수 있다.
상기 여과는 세공 크기(pore size)가 0.1 ~ 0.3 ㎛, 바람직하게는 0.15 ~ 0.25 ㎛인 여과막을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 추출액을 한외여과막으로 분획하여 분획액을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 한외여과막은 셀룰로오스 아세테이트(Cellulose Acetate), 폴리아크릴로니트릴/폴리비닐클로라이드공중합체(polyacrylonitrile/co-polyvinylchloride, PAN/co-PVC), 폴리설폰(Polysulfone), 폴리에테르설폰(Polyethersulfone, PES), 폴리비닐리덴플루오르(Polyvinylidene fluoride, PVDF), 지방족 폴리아미드 (Aliphatic polyamide), 방향족 폴리아미드(Aromatic polyamide), 폴리이미드(Polyimide), 폴리에테르이미드(Polyetherimide), 폴리에테르에테르케톤 (Polyetheretherketone) 고분자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것이 될 수 있다.
또한, 상기 한외여과막은 한외여과시 사용된 막의 분획 분자량이 10 kDa 이하, 5 kDa 이하, 3 kDa 이하, 1 kDa 이하, 0.6 kDa 이하인 것이 사용될 수 있고, 바람직하게는 1 kDa 이하인 것이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1 : 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 제조
클로렐라 프로토테코이데스를 5 w/w%로 정제수와 혼합하고, 1500 psi로 가압하여 분산액을 얻었다. 상기 분산액에 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부 대비 파파인(papain) 50 중량부, 정제수 6000 중량부를 첨가하고 교반하여 반응물을 제조하였다. 반응물을 개별 조건별로 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃ 온도에서 6시간, 12시간, 24시간, 28시간 가열처리 후 세공 크기(pore size) 0.2 ㎛의 여과막으로 여과하였다. 그 후 1 kDa 한외여과막으로 분획하여 1 kDa 미만의 저분자량 펩타이드를 함유하는 추출물을 제조하였다.
실험예 1 : 추출물의 티로시나제 억제(tyrosinase inhibition) 효과 시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제 효소의 기능이 억제되는 정도를 확인하였다.
티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실험예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(SH Pomerantz, Biol chem, 241: 161-168, 1966)을 응용해 미백효과를 판정하였다.
고농도에서는 억제효과의 농도의존성이 확인되지 않으므로 적절한 처리 농도 설정이 필요하며, 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물을 5배 희석하여 티로시나제 억제율 평가에 사용하였다. 효소 반응 기질인 L-tyrosine을 시험관에 넣은 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각 추출물을 가하고 37 ℃에서 15 분간 반응시켰다. 그 후, mushroom tyrosinase를 첨가하고 다시 37 ℃에서 15 분간 반응하여 475 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 아래 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 상기 실험 결과 50 ℃, 24 시간 조건에서 반응하고, 1 kDa 한외여과막으로 분획한 저분자 펩타이드 추출물이 가장 우수한 티로시나제 활성저해 효과를 나타내었는바, 해당 조건에서의 저분자량 펩타이드 추출물을 가지고 하기 실험을 수행하여 추가 효능을 확인하였다.
실험예 2 : 추출물의 DPPH법을 이용한 항산화효과 측정
상기 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내는 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 항산화효과를 확인하기 위해 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거율을 측정하였다.
DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정하는 시험으로, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여, 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.
구체적으로, 먼저 60 μM 농도의 표준 DPPH 용액을 만든 후, 상기 실험예 1에서 가장 높은 티로시나제 억제효과를 나타내는 추출물을 희석농도가 각각 100 ~ 0.1%가 되도록 하여 시료를 만들었다. 그런 다음 상기 시료와 표준 DPPH 용액을 같은 비율로 첨가하여 교반한 후, 37℃에서 30분간 반응시키고 560 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 아래 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물은 농도 의존적인 항산화 효과를 나타내었다.
실험예 3 : 단백질 분해 효소에 따른 효과 비교
단백질 분해 효소에 따른 효과 비교를 위해 단백질 분해 효소를 달리 처리하여 제조된 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 티로시나제 활성 억제 정도 및 자유라디칼 소거율을 측정하였다.
클로렐라 프로토테코이데스를 5 w/w%로 정제수와 혼합하고, 1500 psi로 가압하여 분산액을 얻었다. 상기 분산액에 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부 대비 정제수 6000 중량부를 첨가하고, 파파인(papain)과 플레보자임(flavourzyme)을 각각 50 중량부씩 처리하고, 교반하여 단백질 분해 효소를 달리 처리한 두 가지 반응물을 제조하였다. 상기 두 가지 반응물을 50 ℃ 온도에서 24시간 가열처리 후 세공 크기(pore size) 0.2 ㎛의 여과막으로 여과하였다. 그 후, 1 kDa 한외여과막으로 분획하여 1 kDa 미만의 저분자량 펩타이드를 함유하는 추출물을 제조하였다. 효소 반응 기질인 L-tyrosine을 시험관에 넣은 다음, 상기 추출물을 가하고 37 ℃에서 15 분간 반응시켰다. 그 후, mushroom tyrosinase를 첨가하고 다시 37 ℃에서 15 분간 반응한 다음, 475 ㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 그리고 60 μM 농도의 표준 DPPH 용액을 만든 후, 상기 추출물과 표준 DPPH 용액을 같은 비율로 첨가하여 교반한 후, 37℃에서 30분간 반응시키고 560 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
도 3에서 보듯이, 파파인을 처리하여 저분자 펩타이드를 추출한 경우 플레보자임을 처리한 경우보다 약 3.3배 우수한 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내었고, 도 4에서 보듯이, 파파인을 처리한 추출물이 약 1.35 ~ 1.68배 우수한 항산화효과를 나타내었다.
실험예 4 : B16F10 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정
상기 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내는 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 세포 내 미백효과를 확인하기 위해 B16F10 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다.
B16F10 세포를 2.0x104 cells/ml 로 분주하여 24시간 배양한 세포주에 멜라닌 생성 유도 호르몬인 α-MSH를 처리하고, 양성대조군인 알부틴(arbutin)과 농도별 추출물을 첨가하였다. 그 후, 배지에서 72시간 배양, 세포 수집 후 1N NaOH를 80℃에서 1시간 처리하여 멜라닌을 추출하고 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 아래 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물은 처리 농도에 비례하여 우수한 멜라닌 합성저해 효과를 나타내었다.
실험예 5 : 추출물의 콜라겐 생성량을 통한 주름개선 및 항노화효과 시험
상기 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내는 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 주름개선 및 항노화효과를 확인하기 위해 세포 내 콜라겐 생성량 평가를 하였다.
콜라겐 생성 효과를 알아보기 위해, 인간진피섬유아세포(NHDF)를 2.0x104 cells/ml로 분주하여 24시간 배양한 다음, 양성대조군인 아스코르빈산(Asc.A)과 농도별 추출물을 첨가한 배지에서 48시간 배양 후, 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 양을 측정하였다. 또한, 형광 염색 염색 물질인 DAPI를 1 ㎍/㎖의 농도로 30분간 암실에서 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 아래 도 6, 7에 나타내었다.
도 6, 7에서 보듯이, 추출물 농도가 증가할수록 콜라겐 생성량이 증가하고, 형광강도가 강해지는바, 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물은 우수한 주름개선 및 항노화효과를 나타내었다.
실험예 6 : 추출물의 세포분화촉진효과 시험
상기 실험예 1에서 가장 우수한 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내는 클로렐라 프로토테코이데스 저분자 펩타이드 함유 추출물의 세포분화촉진효과를 확인하기 위해 상처치유분석을 수행하였다.
상처치유분석(wound healing assay)은 단층으로 깔린 세포에 상처를 내고, 시간의 흐름에 따라 그 간격의 감소 정도를 저속 촬영(time lapse) 현미경으로 관찰하여, 평가 시료의 상처치유활성을 확인하는 시험방법이다. 인간각질 세포주(HaCaT Cell)를 2.0 x 105 cells/ml로 분주하여 24시간 배양하고, 피펫 팁을 이용하여 물리적 손상을 가한 뒤, 시간 별 세포이동(cell migration)을 확인하였고, 그 결과를 아래 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보듯이, 추출물의 농도가 증가할수록 세포증식속도가 증가하여 우수한 세포분화촉진효과를 나타내었다.

Claims (8)

  1. 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides) 추출물은 저분자량 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 저분자량 펩타이드는 단백질 분해 효소를 이용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단백질 분해 효소는 파파야 유래 효소인 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
  5. 클로렐라 프로토테코이데스(chlorella protothecoides)를 용매에 분산시켜 분산액을 얻는 단계;
    상기 분산액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응액을 얻는 단계; 및
    상기 반응액으로부터 저분자량 펩타이드를 포함하는 추출액을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분산은 100 ~ 5000 psi로 가압하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 단백질 분해 효소는,
    상기 클로렐라 프로토테코이데스 100 중량부에 대하여, 10 ~ 150 중량부가 첨가되는 것을 특징으로 하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 추출액을 한외여과막으로 분획하여 분획액을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 프로토테코이데스 추출물의 제조방법.
PCT/KR2022/005839 2021-04-26 2022-04-25 클로렐라 프로토테코이데스 추출물을 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 WO2022231226A1 (ko)

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