JP6645427B2 - 分子標的薬を含有する標識剤 - Google Patents
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Description
前記2価の連結基の一端が前記窒素原子を含む芳香環の炭素原子に結合していることを特徴とする標識剤を提供する。
また、本発明はもう一つの側面において、前記標識剤を使用することを特徴とするバイオアッセイを提供する。
本発明はさらなる側面において、前記標識剤を使用することを特徴とする組織染色法を提供する。
本発明における標識剤は、分子標的薬としての含窒素芳香環含有化合物と、標識体とが、2価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、前記2価の連結基の一端が含窒素芳香環の炭素原子に結合しているものである。
本発明に用いられる分子標的薬は、当該技術分野において用いられる含窒素芳香環含有化合物の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。なお、本発明における含窒素芳香環含有化合物は一般的に、分子標的薬のうち、抗体医薬ではなく低分子医薬に属する化合物を指す。また、本発明における分子標的薬は、標的分子に対して結合するないし相互作用する能力を多少なりとも有している、ないし有している可能性があればよく、実用化されている分子標的薬のみならず、実用化できる分子標的薬を選抜するための候補化合物、たとえば実用化されている分子標的薬の誘導体をも包含している。
公知の分子標的薬のうち、含窒素芳香環含有化合物としては、たとえばアキシチニブ(下記式参照)が挙げられる。また、本発明では、分子標的薬としてアキシチニブの誘導体を用いることもできる。アキシチニブ誘導体には、アキシチニブに対して官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなど、母体構造を大幅に変えない程度の(特に2価の連結基の一端が窒素原子を含む芳香環(ピリジン環)の炭素原子に結合することを妨げないように)改変がなされた化合物であって、アキシチニブと同程度またはそれよりも優れた分子標的薬としての作用を有する様々な化合物が包含される。
本発明に用いられる標識体は、当該技術分野において用いられる各種の標識体の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。代表的な標識体としては、放射線同位体、特定の基質と反応して発色する酵素、蛍光体などが挙げられるが、シグナルとして蛍光強度または輝点数を測定することができるため定量性に優れ、標的分子に対する分子標的薬の結合性を正確に評価することのできる蛍光体が好ましい。
無機半導体ナノ粒子としては、II−VI族化合物、III−V族化合物、またはIV族元素を含有するもの、たとえば、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geなどが挙げられる。また、これらの無機半導体ナノ粒子をコアとし、その外側にシェルが形成されたもの、たとえば、CdSe/ZnS、CdS/ZnS、InP/ZnS、InGaP/ZnS、Si/SiO2、Si/ZnS、Ge/GeO2、Ge/ZnSなどのコア/シェル型無機半導体ナノ粒子を用いることもできる。
有機蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、Cy(登録商標、GEヘルスケア社製)系色素分子、DY系色素分子(登録商標、DYOMICS社製)、HiLyte(登録商標、アナスペック社製)系色素分子、DyLight(登録商標、サーモサイエンティフィック社製)系色素分子、ATTO(登録商標、ATTO−TEC社製)系色素分子、MFP(登録商標、Mobitec社製)系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造(骨格)または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
蛍光物質の集積体の代表例として、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質がその中に内包されているおよび/またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である「蛍光物質集積ナノ粒子」が挙げられる。この場合、母体(たとえば樹脂)と蛍光物質(たとえば有機蛍光色素)は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
標識体は、2価の連結基と結合することのできる反応性の部位を自ずと備えているか、そうでなければそのような部位を標識体の作製後に導入しておく必要がある。
本発明に用いられる、分子標的薬と標識体とを連結するための2価の連結基は、当該技術分野において用いられる各種の2価の連結基の中から選択することができ、本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。
本発明のバイオアッセイは、本発明の標識剤を使用して行われるものであり、その実施形態は特に限定されるものではない。たとえば、培養細胞に本発明の標識剤を添加し、そこで発現している標的分子に標識剤を結合させて、その標識体が発するシグナルを定量的に取得するというバイオアッセイが挙げられる。異なる分子標的薬の候補(たとえばアキシチニブ誘導体)を用いた標識剤同士のデータを比較することで標的分子への結合力を評価し、分子標的薬の改良に役立てるといった利用が可能である。あるいは、血液(血清)等の検体に本発明の標識剤を添加し、分子標的薬が対象とする特定の分子またはそれを発現している細胞と結合させて、それらの分子または細胞について定性的または定量的な分析を行うという利用も可能である。
本発明の組織染色法は、本発明の標識剤を使用して行われるものであり、その実施形態は特に限定されるものではないが、たとえば以下のような工程を含む:
(1)パラフィンに包埋された組織切片を染色に適した状態にする工程(前処理工程);
(2)標的分子を標識剤で染色する工程(染色工程);
(3)染色された組織切片を観察に適した状態にする工程(後処理工程);
(4)任意工程として、明視野において細胞等の形態を観察できるよう染色する工程(形態観察用染色工程);
(5)染色された組織切片から標識体が発するシグナルを取得する工程(シグナル取得工程)。
これらの工程は、具体的には、たとえば次のような手順で行われる。
組織切片は通常、ホルマリンで固定された後、パラフィンに包埋された状態で保存されていることが多い。そのような組織切片を染色する場合、染色を可能にするため、組織切片の脱パラフィン・親水化処理のための前処理工程が行われる。この前処理工程には必要に応じて、タンパク質を分子標的薬との反応に適した状態にするための賦活化処理を含んでいてもよい。
染色工程は、標的分子に標識剤を結合させる染色処理のための工程である。染色処理は、たとえば、前処理工程を終えた組織切片を、標識剤を含む溶液(染色液)に浸漬するようにして行えばよい。染色液に組織切片を浸漬する際の温度、時間、その他の条件は、従来の染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
染色工程を終えた組織切片は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。固定化・脱水処理は、組織切片を固定処理液(ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤)に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた組織切片を透徹液(キシレン等)に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織切片を封入液に浸漬すればよい。これらの処理を行う上での条件、たとえば組織切片を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。後処理工程を終えた組織切片にカバーガラスを載せれば、形態観察やシグナル取得に適した形態の標本となる。
本発明の標識剤を用いた組織染色法には、必要に応じて、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察用染色工程を含めることができる。形態観察用染色工程は、常法に従って行うことができる。組織切片の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色されるエオジンを用いた染色および/または細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色されるヘマトキシリンを用いた染色が標準的に行われており、これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)としてよく知られている。形態観察染色工程を含める場合は、前述した染色工程の後に行うようにしてもよいし、その前に行うようにしてもよい。
観察・撮影工程は、上述したような染色工程(および必要に応じて行われる形態観察用染色工程)を経た組織切片から、標識体が発するシグナルを取得する工程である。たとえば、本発明における標識体として好ましい蛍光体を用いた場合、その蛍光体に対応した励起光を照射しながら、染色された組織切片を所望の倍率の蛍光顕微鏡で観察し、その蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラを用いて、蛍光強度または輝点数を取得することのできる染色像を撮影すればよい。特に、蛍光体として好ましい蛍光物質集積ナノ粒子を用いた場合、標的分子に結合した分子標的薬を標識する蛍光物質集積ナノ粒子を輝点として観測しやすく、蛍光強度を測定するのみならず、輝点数を計測することができる。
(合成工程Z−1)アキシチニブ(1)のピリジン環の炭素原子に2価連結基を結合させたアキシチニブ誘導体(1b)を下記のルートで合成した。得られた誘導体は位置異性体の混合物であり、この混合物を次の合成工程に用いた。なお、合成工程Z−1のルートはJ. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (35), pp 12994−12997に記載された手法に基づいている。
(合成工程Y−1)アキシチニブのアミド基(カルバモイル基)の窒素原子に2価連結基を結合させたアキシチニブ誘導体(6)を、特許文献3(特表2012−533579号公報)の段落[0181]〜[0189]に記載されたソラフェニブ誘導体に関する手法を参考にして合成した。特許文献3の記載では、ピリジン環に2−ヒドロキシエチルカルボキサミド基が導入されたソラフェニブ誘導体を利用して所望の物質(ε−ポリリシン)を結合させているが、今回はベンゼン環に2−ヒドロキシエチルカルボキサミド基が導入されたアキシチニブ誘導体を利用した。
腎細胞がん組織切片のスポットがアレイ上に配列したスライド(USBiomax, Inc., T071)について、脱パラフィンおよび親水化処理を行った後、標識剤Zを組織上に添加した。2時間放置後、未反応の標識剤を洗浄により除去し、そのスライドの蛍光像を共焦点型蛍光顕微鏡を用いて撮影し、蛍光強度を計測した。
標識剤Zの代わりに標識剤Yを用いた他は実施例1と同様の操作を行い、蛍光強度を計測した。
実施例1および比較例1の結果を下記表に示す。本発明の結合様式に基づく標識剤(標識剤Z)を用いて染色した場合、従来の結合様式に基づく標識剤(標識剤Y)を用いた場合よりも、染色された腎細胞がん組織切片の蛍光強度が強いことが分かる。この結果から、従来の標識剤に用いられているアキシチニブは蛍光体として連結されたQdotによって標的分子(VEGFR等)に対する結合が妨害されやすいのに対し、本発明の標識剤に用いられているアキシチニブは蛍光体として連結されたQdotの妨害を受けにくく、標的分子(VEGFR等)に対して強く結合することができるものと推定される。
Claims (11)
- 窒素原子を含む芳香環を有する化合物である分子標的薬と、標識体とが、2価の連結基を介して結合している構造を有する標識剤であって、
前記窒素原子を含む芳香環の少なくとも一つがピリジン環であり、
前記2価の連結基の一端が前記ピリジン環の炭素原子に結合していることを特徴とする標識剤。 - 前記標識体が量子ドットである、請求項1に記載の標識剤。
- 前記標識体が蛍光物質集積ナノ粒子である、請求項1に記載の標識剤。
- 前記蛍光物質集積ナノ粒子がローダミン系色素集積メラミン樹脂ナノ粒子である、請求項3に記載の標識剤。
- 前記分子標的薬がアキシチニブである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の標識剤。
- 前記標識体の粒径が10〜500nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の標識剤。
- 前記標識体の粒径が50〜200nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の標識剤。
- 前記標識体の粒径の変動係数が20%以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の標識剤。
- 前記標識体の粒径の変動係数が5〜15%である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の標識剤。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の標識剤を使用することを特徴とするバイオアッセイ。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の標識剤を使用することを特徴とする組織染色法。
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