WO2022176219A1 - 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法 - Google Patents

抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022176219A1
WO2022176219A1 PCT/JP2021/008404 JP2021008404W WO2022176219A1 WO 2022176219 A1 WO2022176219 A1 WO 2022176219A1 JP 2021008404 W JP2021008404 W JP 2021008404W WO 2022176219 A1 WO2022176219 A1 WO 2022176219A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
igg
fucosylated
inflammatory
fucose
acetylglucosamine
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/008404
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄輔 三村
由香 三村
Original Assignee
雄輔 三村
由香 三村
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2021024790A external-priority patent/JP2022132706A/ja
Application filed by 雄輔 三村, 由香 三村 filed Critical 雄輔 三村
Priority to IL305222A priority Critical patent/IL305222A/en
Priority to CA3211392A priority patent/CA3211392A1/en
Priority to JP2021527064A priority patent/JP7230199B2/ja
Priority to KR1020237031773A priority patent/KR20230156355A/ko
Priority to EP21926648.3A priority patent/EP4295863A1/en
Priority to AU2021427938A priority patent/AU2021427938A1/en
Priority to BR112023016723A priority patent/BR112023016723A2/pt
Priority to CN202180093960.5A priority patent/CN117083082A/zh
Publication of WO2022176219A1 publication Critical patent/WO2022176219A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to an anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation and a method for producing the same.
  • IVIG is one of the few treatment options for autoimmune diseases such as Kawasaki disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, and Guillain-Barré syndrome. IVIG is manufactured by fractionating, purifying, and concentrating IgG from the plasma of thousands of healthy individuals. It has been reported that the therapeutic effect resides in the IgG-Fc portion (Non-Patent Documents 1 and 2) and requires the Asn297-linked sugar chain of IgG-Fc (Non-Patent Document 2). Not clear. The sugar chains of IgG-Fc are essential for the expression of IgG effector functions such as Fc ⁇ receptor and complement activation. etc. are greatly impaired (Non-Patent Document 3).
  • IgG-Fc sugar chains exhibit a high degree of heterogeneity, with fucose, galactose, sialic acid, etc. bound to a core structure consisting of heptads (Fig. 1). Monosaccharides bound to these non-reducing ends have been reported to be associated with various biological activities (Non-Patent Document 4).
  • the present invention was made in view of such problems, and aims to provide a new therapeutic agent for inflammatory diseases such as autoimmune diseases.
  • the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation of the present invention is characterized in that the IgG antibodies to be included consist of human serum IgG antibodies in which the sugar chain shown below is linked to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion. Characterized by where G is galactose, N is N-acetylglucosamine and M is mannose.
  • the method for producing an anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation uses endoglycosidase S (Endo S) on a human serum IgG antibody to extract a sugar bound to the asparagine 297 (Asn297) residue of the Fc portion.
  • Endo S endoglycosidase S
  • the fucose-removing step of removing fucose bound to N-acetylglucosamine and glycosynthase were used to convert oxazoline sugar chains (GG-Ox) prepared from galactosyl glycopeptides into human serum IgG antibodies.
  • new therapeutic agents for inflammatory diseases such as autoimmune diseases can be obtained.
  • FIG. 2 is a diagram explaining the heterogeneity of IgG-Fc sugar chains.
  • S2F fucosylated serum IgG
  • S2F non-fucosylated serum IgG
  • S2F fucose is present in the sugar chain of the Fc portion of the antibody
  • S2F non-fucosylated serum IgG
  • FIG. 2 shows a process of forming an oxazoline sugar chain (SG-Ox) from a sugar chain released from a sialylglycopeptide by Endo S.
  • FIG. 4 is a diagram showing that fucose is removed from IgG(S2) of the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation according to this example by high performance liquid chromatography.
  • FIG. 2 shows that normal serum IgG (95% fucosylated IgG) suppresses ADCC in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 4 shows that non-fucosylated serum IgG (S2) has a marked antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) inhibitory effect compared to fucosylated serum IgG (S2F).
  • FIG. 2 is a photographic diagram showing the results of SDS electrophoresis of fucosylated serum IgG (S2F), non-fucosylated serum IgG (S2), and galactosyl non-fucosylated serum IgG (G2).
  • S2F fucosylated serum IgG
  • S2F non-fucosylated serum IgG
  • G2 galactosyl non-fucosylated serum IgG
  • FIG. 4 shows the process of forming oxazoline sugar chains (GG-Ox) from sugar chains released from galactosyl glycopeptides by Endo S.
  • FIG. 4 is a diagram showing that fucose is removed from IgG(S2) and IgG(G2) of the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation according to this example by high performance liquid chromatography.
  • FIG. 2 shows that normal serum IgG (95% fucosylated IgG) suppresses ADCC in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 4 shows that non-fucosylated serum IgG (G2) has a marked antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) inhibitory effect compared to fucosylated serum IgG (S2F) and non-fucosylated serum IgG (S2).
  • FIG. 4 shows the anti-inflammatory effect of non-galactosyl fucosylated IgG (G2) on collagen antibody-induced arthritic mice.
  • the IgG antibody to be included consists of a human serum IgG antibody in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion. characterized by where S is sialic acid, G is galactose, N is N-acetylglucosamine and M is mannose.
  • the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation according to this embodiment contains human serum IgG antibodies in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion. characterized by becoming where G is galactose, N is N-acetylglucosamine and M is mannose.
  • Immunoglobulins include, but are not limited to, antibodies and antibody fragments (scFv, Fab, Fc, F(ab')2) and other genetically engineered portions of antibodies.
  • Immunoglobulins, or antibodies are a group of glycoproteins present in the serum and tissue fluids of all mammals. IgG (Immunoglobulin G) accounts for about 75-85% of the immunoglobulins in normal human serum.
  • Sugar chains also play an important role in maintaining the three-dimensional structure of IgG as a whole, and there are 16 types of these sugar chains as neutralized sugar chains.
  • the sugar chain structure of IgG is composed of a highly heterogeneous mixture of sugar chains, but the relative proportions of the 16 types are almost constant in healthy subjects. It is known that sugar chains in myeloma and rheumatoid arthritis patients exhibit a very specific relative ratio.
  • ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • NK cells natural killer cells
  • ADCC activity is considered to be one of the most important factors in the efficacy of antibody drugs.
  • N-glycoside-linked sugar chains are bound to the Fc region of one molecule of IgG antibody.
  • the N-glycoside-linked sugar chain of this antibody is a complex-type two-chain sugar chain with a mannosyl-chitobiose core structure as the basic structure. Diversity exists in the presence or absence of fucose at the terminal end.
  • the non-fucosylated IgG having sialic acid at the terminal can be denoted as IgG (S2) (it can also be simply referred to as non-fucosylated IgG), and the non-fucosylated IgG having galactose at the terminal IgG can be designated as IgG(G2) (it can also be referred to as non-galactosyl fucosylated IgG).
  • IgG(S2) has a structure in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) in the Fc portion.
  • S sialic acid
  • G galactose
  • N N-acetylglucosamine
  • M mannose
  • IgG has a structure in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) in the Fc portion.
  • G galactose
  • N N-acetylglucosamine
  • M mannose
  • the IgG antibody to be included is composed of a human serum IgG antibody in which a predetermined sugar chain is bound to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion means that the predetermined sugar chain is bound to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion.
  • the present human serum IgG antibody is 95% to 100% contained in the IgG antibody contained in the immunoglobulin preparation, preferably 98% to 100% contained, most preferably 100% contained.
  • an anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation (where S is sialic acid, G is galactose, N is N-acetylglucosamine, and M is mannose.) is immunized by a human serum IgG antibody in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) in the Fc portion. It should be 95% to 100%, preferably 98% to 100%, most preferably 100%, in the IgG antibody included in the globulin preparation.
  • an anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation (where G is Galactose, N is N-acetylglucosamine, and M is mannose.) is a human serum IgG antibody in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) of the Fc portion is included in immunoglobulin preparations. 95% to 100% coverage, preferably 98% to 100% coverage, most preferably 100% coverage in the IgG antibody used.
  • IgG fucosylated IgG
  • S2F fucosylated IgG
  • S2F has a structure in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) in the Fc portion.
  • S sialic acid
  • G galactose
  • N N-acetylglucosamine
  • M mannose
  • F fucose
  • the immunoglobulin preparation of the present invention is a liquid preparation, it is used as it is or after being diluted with an appropriate solvent (e.g., distilled water for injection, physiological saline, glucose solution, etc.). After freeze-drying the immunoglobulin solution, it is dissolved in an appropriate solvent (eg, distilled water for injection, etc.) before use.
  • an appropriate solvent e.g., distilled water for injection, physiological saline, glucose solution, etc.
  • the administration route of the immunoglobulin preparation of the present invention is usually injection, and intravenous administration is particularly preferred.
  • the dosage of the immunoglobulin preparation of the present invention is typically 50 to 1000 mg/day of immunoglobulin per 1 kg of body weight by intravenous administration for one to several days, depending on symptoms, sex, body weight, etc. The dosage may be increased or decreased.
  • the immunoglobulin solution according to the present invention contains pharmacologically acceptable additives (e.g., carriers, excipients, diluents, etc.), stabilizers, or Pharmaceutically necessary ingredients may be contained.
  • Stabilizers include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as saccharose and maltose, sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, neutral salts such as sodium chloride, amino acids such as glycine, polyethylene glycol, polyoxyethylene-polyoxy Nonionic surfactants such as propylene copolymer (Pluronic (registered trademark)) and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween) are exemplified, and are preferably added in an amount of about 1 to 10 w/v%.
  • Pluronic registered trademark
  • Tween polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester
  • Immunoglobulin preparation of the present invention is administered are not particularly limited, but examples include Kawasaki disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, Guillain-Barre syndrome, multiple sclerosis, and rheumatoid arthritis.
  • Antibody drugs in which fucose is removed from the sugar chain of the Fc region of monoclonal IgG antibodies have been developed for the purpose of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) (eg Mogamulizumab (trade name PoteligeoTM)).
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Conventional non-fucosylated antibodies are antigen-specific monoclonal antibodies produced from mammalian host cells in which carbohydrate-related genes have been engineered, and are indicated for malignant tumors.
  • the immunoglobulin according to the present invention is obtained by enzymatically removing fucose from serum-derived non-specific IgG antibodies and then transferring uniform sugar chains by chemical enzymatic reaction, and is applicable to autoimmune diseases. That is, the immunoglobulin preparation according to the present invention is used for the purpose of inhibiting unwanted immune responses caused by autoantibodies.
  • the sugar chain bound to the asparagine 297 (Asn297) residue of the Fc portion of the human serum IgG antibody is cleaved with a chitobiose core, and the Asn297 residue is A sugar chain removal step of removing other than N-acetylglucosamine bound to N-acetylglucosamine and fucose bound to the N-acetylglucosamine, a fucose removal step of removing fucose bound to the N-acetylglucosamine, a glycosynthase (Endo N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine 297 (Asn297) residue of the Fc portion of the human serum IgG antibody using N-acetylglucosamine (SG-Ox) prepared from egg yolk-derived sialylglycopeptides using S D233Q
  • human serum IgG antibody is bound to the asparagine 297 (Asn297) residue of the Fc portion using endoglycosidase S (Endo S).
  • the enzyme that cleaves the sugar chain bound to the asparagine 297 (Asn297) residue of the Fc portion with the chitobiose core is endoglycosidase S (Endo S).
  • ⁇ -L-fucosidase The enzyme that removes fucose bound to N-acetylglucosamine is ⁇ -L-fucosidase (AlfC).
  • ⁇ -L-fucosidase includes 1,2- ⁇ -L-fucosidase, 1,3- ⁇ -L-fucosidase, or 1,6- ⁇ -L-fucosidase, where 1,6- ⁇ -L-fucosidase is preferably used.
  • Oxazolylated sugar chains (SG-Ox or GG-Ox) are prepared by dehydration condensation of the reducing end of sialylglycan.
  • the enzyme that transfers SG-Ox or GG-Ox to deglycosylated IgG is glycosynthase (Endo S D233Q).
  • Deglycosylation of Serum IgG Endo S was used as an endoglycosidase that cleaves the Fc-linked sugar chain of IgG. It was hydrolyzed between two N-acetylglucosamines in the chitobiose core of the sugar chain, leaving the disaccharide of N-acetylglucosamine and fucose and deglycosylated.
  • Deglycosylated IgG was purified on Protein G-Sepharose 4 (GE).
  • sialylglycan oxazoline (SG-Ox)
  • the sugar chain of the sialylglycopeptide (10 mg, Tokyo Kasei) shown below was cleaved with Endo S in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), 2-Chloro-1,3-dimethylimidazolinium Chloride (Tokyo Kasei Co., Ltd.) and triethylamine were added, left at 0°C for 1 hour, and SG-Ox was prepared by dehydration condensation reaction of the reducing end.
  • Figure 4 shows the production process of oxazoline sugar chains (SG-Ox) from sialyl sugar chains released by Endo S.
  • SG-Ox oxazoline sugar chains
  • IgG(S2) and its fucosylated IgG, IgG(S2F), were confirmed to have a purity of 95% or more by SDS-PAGE (Fig. 3).
  • the transglycosylation reaction of SG-Ox to GlcNAc-IgG is shown below.
  • IgG(S2) and IgG(S2F) in which the sugar chain was replaced were digested with N-glycosidase F to remove the sugar chain. After liberation, they were fluorescently labeled with 2-aminobenzamide and analyzed by High performance liquid chromatography (HPLC).
  • IgG(S2F) is a fucosylated IgG according to a comparative example, specifically human serum IgG in which the sugar chain shown below is bound to asparagine 297 (Asn297) in the Fc portion.
  • the sugar chains of the control IgG mostly contain fucose, whereas the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation IgG(S2) according to the present example has fucose removed. rice field.
  • ADCC Suppressive (Anti-Inflammatory) Effect by Non-Fucosylated Serum IgG The anti-inflammatory action of the anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation according to this example was confirmed by the following method.
  • the strength of the ADCC activity of anti-hapten IgG is indicated by the anti-hapten IgG concentration (EC50) that can induce 50% of the maximum level of target cell death (Cytotoxicity, Fig. 6, Y axis). It can be interpreted that the lower the EC50, the higher the ADCC activity of the specific antibody. Serum IgG was added to the ADCC measurement system at concentrations of 0.01, 0.1, 1, and 8 mg/ml, and the EC50 of anti-hapten IgG was compared. shift), indicating that ADCC was suppressed (Fig. 6).
  • GG-Ox was prepared by dehydration condensation reaction of the reducing end.
  • GG-Ox was purified on a cellulose column (Sigma-Aldrich).
  • galactosyl glycopeptide is obtained by desialylation of sialyl glycopeptide using sialidase, but desialylation is possible without using an enzyme. It is also possible to obtain galactosyl glycopeptides by chemical reaction.
  • Fig. 9 shows the production process of GG-Ox from sugar chains released by Endo S.
  • the structure of GG-Ox is shown below.
  • ADCC inhibitory (anti-inflammatory) effect of non-galactosyl-fucosylated immunoglobulin 2b-1 In vitro ADCC inhibitory (anti-inflammatory) effect Serum IgG from which fucose has been removed has an anti-inflammatory effect and has galactose at its terminal. It was discovered by the following method that the action is enhanced by the fact. As a preliminary experiment, the effect of the presence of normal serum IgG (IVIG, 95% fucosylation, FIG. 10A) on ADCC was investigated using the ADCC Reporter bioassay kit (Promega). Target cells (Raji cells) were sensitized with CD20 antibody (rituximab) (0.001-3 ⁇ g/ml, Figure 11).
  • the strength of ADCC activity is indicated by the antibody concentration (EC50, Fig. 11 X-axis) capable of inducing 50% of the maximal level of target cell death (Cytotoxicity, Fig. 11 Y-axis). It can be interpreted that the smaller the EC50 value, the stronger the ADCC activity.
  • Serum IgG (IVIG) was added to the ADCC measurement system at concentrations of 0, 0.1, 1, and 10 mg/ml, and the EC50 values were compared. It was shown that the higher the value, the higher the EC50 value and the suppression of ADCC (Fig. 11).
  • IVIG serum IgG
  • the high-dose IVIG administration group is a positive control, the dose used for treating human inflammatory diseases.
  • Phosphate buffer (PBS, 0.33 ml) was used as a negative control.
  • PBS Phosphate buffer
  • the degree of arthritis was evaluated on a 5-point scale (0: no change, 1: swelling of the toes, 2: swelling of the toes and soles, 3: swelling of the entire foot, 4: severe swelling), expressed as the total number of limb scores.
  • the G2-treated group and the high-dose IVIG-treated group had similarly low arthritis scores (Figure 13).
  • the S2, S2F, and low-dose IVIG administration groups had high arthritis scores similar to the PBS administration group.
  • blood was collected by cardiac puncture under isoflurane anesthesia, and acute-phase proteins such as inflammatory cytokine Interleukin-6 (IL-6) and C-reactive protein (CRP) were measured.
  • the serum IL-6 concentration was the highest in the PBS group at 10.9 pg/ml, and the normal group and G2 administration group had low values of 1.3 pg/ml and 0.7 pg/ml, respectively (Fig. 14A).
  • the S2, S2F, and IVIG-administered groups were 2-3 times higher than the healthy group. Serum CRP levels were also low in the G2-administered group as in the healthy group (Fig. 14B). From the above, it was confirmed that G2 exhibits a remarkable anti-inflammatory effect even in vivo.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

自己免疫疾患等の炎症性疾患に対する新しい治療薬を提供する。包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなる。

Description

抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法
　本発明は、抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法に関する。
　IVIGは川崎病、特発性血小板減少性紫斑病、ギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患に対する数少ない治療選択肢の一つである。IVIGはIgGを数千の健常人の血漿から分画し、精製、濃縮されて製造される。治療効果はIgG-Fc 部分にあり(非特許文献１、２)、IgG-FcのAsn297結合糖鎖が必要であると報告されているが(非特許文献２)、抗炎症作用の機序は明らかではない。IgG-Fcの糖鎖は、Fcγ受容体や補体活性化などIgGのエフェクター機能の発現に必須であり、糖鎖の除去により抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)や補体依存性細胞傷害作用等が大きく損なわれる(非特許文献３)。IgG-Fc糖鎖は、7糖からなるコア構造にフコース、ガラクトース、シアル酸等が結合し、高度な不均一性を示す(図1)。これらの非還元末端に結合する単糖は、様々な生物活性との関連が報告されている(非特許文献４)。
　フコース除去はADCCを100倍程度増強することが示され(非特許文献５，６)、既に非フコシル化モノクローナル抗体(Mogamulizumab, Obinutuzumab)は成人T 細胞白血病やCD20陽性濾胞性リンパ腫に対して臨床応用されている。自己免疫疾患に抗炎症効果を示すIVIGの有効成分の同定やその作用機序の解明は、今後も需要が増大するIVIGに代わる新規抗体医薬の開発のためにも必要である。
Debre, M., et al., Infusion of Fc gamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet, 1993. 342(8877): p. 945-9. Schwab, I. and F. Nimmerjahn, Intravenous immunoglobulin therapy: how does IgG modulate the immune system? Nat Rev Immunol, 2013. 13(3): p. 176-89. Mimura, Y., et al., Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein Cell, 2018. 9(1): p. 47-62. Zhang, P., et al., Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs. Drug Discov Today, 2016. 21(5): p. 740-65. Shinkawa, T., et al., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem, 2003. 278(5): p.3466-73. Shields, R.L., et al., Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. J Biol Chem, 2002. 277(30): p. 26733-40.
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、自己免疫疾患等の炎症性疾患に対する新しい治療薬を提供することを目的とする。
　本発明にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤は、包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなることを特徴とする。ここでGはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法は、ヒト血清IgG抗体にエンドグリコシダーゼ S (Endo S)を用いて、Fc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合している糖鎖をキトビオースコアで切断し、Asn297残基に結合しているN-アセチルグルコサミン及び該N-アセチルグルコサミンに結合したフコース以外を除去する糖鎖除去工程と、α-L-フコシダーゼ (AlfC)を用いて前記N-アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去するフコース除去工程と、グリコシンターゼ (Endo S D233Q)を用いて、ガラクトシルグリコペプチドから調製したオキサゾリン化糖鎖(GG-Ox)を、ヒト血清IgG抗体のFc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合しているN-アセチルグルコサミンに転移する転移工程と、を有することを特徴とする。
　本発明によれば、自己免疫疾患等の炎症性疾患に対する新しい治療薬が得られる。
IgG-Fc糖鎖の不均一性を説明する図である。 抗体のFc部分の糖鎖にフコースが存在するフコシル化血清IgG(S2F)と、抗体のFc部分の糖鎖にフコースが存在しない非フコシル化血清IgG(S2)とにおいて、NK細胞の殺作用の相違を説明する図である。 抗体のFc部分の糖鎖にフコースが存在するフコシル化血清IgG(S2F)と、抗体のFc部分の糖鎖にフコースが存在しない非フコシル化血清IgG(S2)とにおいて、SDS-PAGEによる写真図である。 シアリルグリコペプチドからEndo Sで遊離した糖鎖から、オキサゾリン化糖鎖(SG-Ox)が生成する工程を示す図である。 高速液体クロマトグラフィにより、本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤のIgG(S2)ではフコースが除去されていることが示されている図である。 通常の血清IgG(95％フコシル化IgG)が、濃度依存的にADCCを抑制することを示す図である。 非フコシル化血清IgG(S2)がフコシル化血清IgG(S2F)に比べ、著明な抗体依存性細胞傷害(ADCC)抑制作用を示す図である。 フコシル化血清IgG(S2F)、非フコシル化血清IgG(S2)、及び、ガラクトシル非フコシル化血清IgG(G2)のそれぞれのSDS電気泳動結果を示す写真図である。 ガラクトシルグリコペプチドからEndo Sで遊離した糖鎖から、オキサゾリン化糖鎖(GG-Ox)が生成する工程を示す図である。 高速液体クロマトグラフィにより、本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤のIgG(S2)及びIgG(G2)ではフコースが除去されていることが示されている図である。 通常の血清IgG(95％フコシル化IgG)が、濃度依存的にADCCを抑制することを示す図である。 非フコシル化血清IgG(G2)がフコシル化血清IgG(S2F)及び非フコシル化血清IgG(S2)に比べ、著明な抗体依存性細胞傷害(ADCC)抑制作用を示す図である。 コラーゲン抗体誘発関節炎マウスに対するガラクトシル非フコシル化IgG(G2)の抗炎症効果を示す図である。 IgGを投与されたコラーゲン抗体誘発関節炎マウスにおける急性期タンパク IL-6 (A)及びC反応性タンパク (CRP) (B)を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤は、包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなることを特徴とする。ここでSはシアル酸、Gはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　また、本実施形態にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤は、包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなることを特徴とする。ここでGはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　免疫グロブリンは、抗体および抗体フラグメント(scFv、Fab、Fc、F(ab’)2)ならびに抗体の他の遺伝子工学的に処理した部分を含むが、これらに限定されない。免疫グロブリンすなわち抗体は、すべての哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖タンパク質の一群である。IgG(Immunoglobulin G)は、正常ヒト血清中の免疫グロブリンの約75～85%を占める。糖鎖はIgG全体の立体構造を保つ上でも重要な働きをもっており、その糖鎖は中性化糖鎖として16種類存在している。IgGの糖鎖構造は、非常に不均一な糖鎖の混合物により構成されているが、健常人ではその16種類の相対比率は、ほぼ一定である。なお骨髄腫患者やリューマチ患者の糖鎖は、非常に特異な相対比率を示すことが知られている。
　抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)は、標的細胞に結合した抗体がナチュラルキラー細胞(NK細胞)やマクロファージなどのエフェクター細胞上のFc受容体と結合することで、抗体依存的に誘導される標的細胞傷害活性である。抗体医薬の薬効発現に、ADCC活性は最も重要なものの１つと考えられている。
　1分子のIgG型抗体のFc領域に２つのN-グリコシド結合糖鎖が結合している。この抗体のN-グリコシド結合糖鎖は、マンノシル-キトビオースコア (Mannosyl-chitobiose Core)構造を基本構造とする複合型2本鎖糖鎖であり、非還元末端側ではガラクトース及びシアル酸の有無について、還元末端ではフコースの有無について多様性が存在している。
　抗体Fc領域に結合するN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンからフコース残基を除去すると、Fcγ受容体IIIaに対する親和性が上がる。本明細書において、シアル酸を末端に有する非フコシル化IgGをIgG(S2)と表記することができ(単に非フコシル化IgGと称することも可能である。)、ガラクトースを末端に有する非フコシル化IgGをIgG(G2)と表記することができる(ガラクトシル非フコシル化IgGと称することも可能である。)。
　IgG(S2)は、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合している構造を有する。ここでSはシアル酸、Gはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　IgG(G2)は、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合している構造を有する。ここでGはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　なお、包含されるIgG抗体が、所定糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなるとは、所定糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体が免疫グロブリン製剤中に包含されるIgG抗体中に95％～100％包含される、好ましくは98％～100％包含される、最も好ましくは100%包含されることである。
　そのため、包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなる、抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤(ここでSはシアル酸、Gはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。)とは、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体が免疫グロブリン製剤中に包含されるIgG抗体中に95％～100％包含される、好ましくは98％～100％包含される、最も好ましくは100%包含されることである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　また、包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなる、抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤(ここでGはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。)とは、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体が免疫グロブリン製剤中に包含されるIgG抗体中に95％～100％包含される、好ましくは98％～100％包含される、最も好ましくは100%包含されることである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　一方でフコシル化IgGをIgG(S2F)と表記することができ、IgG(S2F)は、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合している構造を有する。ここでSはシアル酸、Gはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノース、Fはフコースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　図2に示されるように、フコシル化IgGは、自己抗体-抗原複合体とNK細胞上のFcγ受容体IIIaとの相互作用を阻害できないが、一方で、非フコシル化IgG(図2のBで示される非フコシル化血清IgGは、IgG(S2)又はIgG(G2)である。)は、NK細胞上のFcγ受容体IIIaに強く結合してNK細胞の殺作用を阻害し、その結果として炎症が抑制されると考えられる。
　本発明の免疫グロブリン製剤は、液状製剤の場合は、そのままで、あるいは適当な溶媒(例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液等)で希釈して使用され、乾燥製剤の場合は、上記免疫グロブリン溶液を凍結乾燥をした後、使用時に適当な溶媒(例えば、注射用蒸留水等)に溶解して使用される。
　本発明の免疫グロブリン製剤の投与経路は、通常注射であり、特に静脈内投与が好ましい。本発明の免疫グロブリン製剤の投与量は、体重１ｋｇ当たり免疫グロブリンとして50～1000mg／日を、１～数日間連日静脈内投与することが標準的であるが、症状、性別、体重等に応じて投与量を増減すればよい。
　本発明にかかる免疫グロブリン溶液は、本発明の目的に反しない範囲で、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤(例えば、担体、賦形剤、希釈剤等)、安定化剤または製薬上必要な成分を含有してもよい。
　安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体(プルロニック(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(トゥイーン)等の非イオン系界面活性剤等が例示され、1～10w/v%程度添加されていることが好ましい。
　本発明にかかる免疫グロブリン製剤の投与対象となる疾患は、特に限定されるものではないが、例えば、川崎病、特発性血小板減少性紫斑病、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性後天性凝固第VIII因子欠乏症、スティフ・パーソン症候群、多病巣性神経障害、ベーチェット病、潰瘍性大腸炎、クローン病、Reiter関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、Sjogren症候群、抗糸球体基底膜腎炎、原発性硬化性胆管炎、原発性抗リン脂質抗体症候群、中毒性表皮壊死症、移植片対宿主病、敗血症 などが挙げられる。
　なおモノクローナルIgG抗体のFc部位の糖鎖からフコースを除去した抗体医薬が抗体依存性細胞傷害(ADCC)を増強する目的で開発されてきた(例Mogamulizumab(商品名 PoteligeoTM))。従来の非フコシル化抗体は、糖鎖関連遺伝子を操作した哺乳類宿主細胞から産生された抗原特異的なモノクローナル抗体であり、適応対象は悪性腫瘍である。一方、本願発明にかかる免疫グロブリンは血清由来の非特異IgG抗体のフコースを酵素的に除去した後に均一な糖鎖を化学酵素反応により転移したものであり、適応対象は自己免疫疾患である。即ち、本願発明にかかる免疫グロブリン製剤は自己抗体による望ましくない免疫応答を阻害する目的で使用される。
　本実施形態にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法は、ヒト血清IgG抗体のFc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合している糖鎖をキトビオースコアで切断し、Asn297残基に結合しているN-アセチルグルコサミン及び該N-アセチルグルコサミンに結合したフコース以外を除去する糖鎖除去工程と、前記N-アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去するフコース除去工程と、グリコシンターゼ (Endo S D233Q)を用いて、卵黄由来シアリルグリコペプチドから調製したオキサゾリン化糖鎖(SG-Ox)を、ヒト血清IgG抗体のFc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合しているN-アセチルグルコサミンに転移させる転移工程と、を有する。
　本実施形態にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法は、ヒト血清IgG抗体にエンドグリコシダーゼ S (Endo S)を用いて、Fc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合している糖鎖をキトビオースコアで切断し、Asn297残基に結合しているN-アセチルグルコサミン及び該N-アセチルグルコサミンに結合したフコース以外を除去する糖鎖除去工程と、α-L-フコシダーゼ (AlfC)を用いて前記N-アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去するフコース除去工程と、グリコシンターゼ (Endo S D233Q)を用いて、卵黄由来ガラクトシルグリコペプチドから調製したオキサゾリン化糖鎖(GG-Ox)を、ヒト血清IgG抗体のFc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合しているN-アセチルグルコサミンに転移する転移工程と、を有することを特徴とする抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法。
　Fc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合している糖鎖をキトビオースコアで切断する酵素は、エンドグリコシダーゼ S (Endo S)である。
　N-アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去する酵素は、α-L-フコシダーゼ (AlfC)である。α-L-フコシダーゼには、1,2-α-L-フコシダーゼ、1,3-α-L-フコシダーゼ、又は、1,6-α-L-フコシダーゼがあるが、ここでは1,6-α-L-フコシダーゼを用いることが好ましい。
　オキサゾリン化糖鎖(SG-Ox又はGG-Ox)はシアリルグリカンの還元末端を脱水縮合して調製される。
　SG-Ox又はGG-Oxを糖鎖除去したIgGへ転移する酵素は、グリコシンターゼ (Endo S D233Q)である。
　1.抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造
　1a-1.血清由来IgGの精製
　健常人血液から調製した血清20 mlを0.01M リン酸緩衝液(pH 7.0)で透析後、同じ緩衝液で平衡化したDiethylaminoethyl (DEAE)-cellulose 陰イオン交換カラム(DE52, Whatman Biosystems, Chalfont, St Giles, UK)(1 x 30 cm)に添加し、素通りした分画に含まれるIgGを採取した。血清IgGの糖鎖構造は、後述の通りHigh performance liquid chromatographyで分析し(図5-A)、95 %以上がフコシル化であることを確認した。
　1a-2.血清IgGの脱グリコシル化
　IgGのFc結合糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、Endo Sを用いた。糖鎖のキトビオースコアの２つのN-アセチルグルコサミン間を加水分解し、N-アセチルグルコサミンとフコースの二糖を残し、脱グリコシル化した。脱グリコシル化IgG は、Protein G-Sepharose 4(GE)で精製した。
　1a-3.血清IgGの脱フコシル化
　フコースの除去にα-L-フコシダーゼ(AlfC)を用いた。本酵素の発現ベクターのDNA配列は以前報告され(配列番号1)、BL21(DE3)大腸菌で文献に準じて発現させる。Endo Sで脱グリコシル化したIgG にAlfC を50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中で37℃一晩反応させ、フコースを除去した。
　1a-4.シアリルグリカンオキサゾリン(SG-Ox)の生成
　下記に示すシアリルグリコペプチド(10 mg, 東京化成)を50 mM リン酸緩衝液(pH 6.0)中にてEndo Sで糖鎖を切断し、2-Chloro-1,3-dimethylimidazolinium Chloride(東京化成)とtriethylamineを加え、0℃で１時間放置し、還元末端の脱水縮合反応によりSG-Ox を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　図4はEndo Sで遊離したシアリル糖鎖からのオキサゾリン化糖鎖(SG-Ox)の生成工程を示す。下記にSG-Oxの構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　1a-5.非フコシル化IgGの作製
　グリコシンターゼEndo S D233Qの発現ベクターのDNA配列は文献に報告され(配列番号2)、BL21(DE3)大腸菌で発現させる。糖鎖転移反応はSG-Oxを用いて、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、30℃で3時間インキュベートして行った。これにより本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤を製造した。この本実施例にかかる非フコシル化IgGをIgG(S2)と表記することができる。IgG(S2)およびそのフコシル化したIgGであるIgG(S2F)はともに純度がSDS-PAGEで95％以上であることを確認した(図3)。下記にSG-OxのGlcNAc-IgGへの糖鎖転移反応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤において、糖鎖の改変を確認するために、糖鎖をすげ替えたIgG(S2)及びIgG(S2F)をN-グリコシダーゼF 消化し糖鎖を遊離した後、2-aminobenzamide で蛍光標識し、High performance liquid chromatography (HPLC)で分析した。なおIgG(S2F)は比較例にかかるフコシル化IgGであり具体的には下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgGである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　図5に示されるように、対照IgGの糖鎖はほぼフコースを有するが、本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤のIgG(S2)ではフコースが除去されていることが確認できた。
　1b.非フコシル化血清IgGによるADCC 抑制(抗炎症)効果
　本実施例にかかる抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の抗炎症作用を以下の手法にて確認した。
　予備実験として、通常の血清IgG(95％フコシル化IgGであり、図5のAに示される対照IgGである)が、ADCCに及ぼす影響をADCC Reporter bioassay kit(プロメガ社)により調べた。標的細胞をハプテン(4-hydroxy-3-iodo-5-nitrophenacetyl)で標識し、抗ハプテンモノクローナルIgG 抗体で感作した(0.001～3 μg/ml)(図6)。
　抗ハプテンIgG のADCC活性の強弱は、標的細胞死(Cytotoxicity、図6, Y軸)を最大レベルの50％を誘導できる抗ハプテンIgG 濃度(EC50)で示される。EC50が低いほど、特異抗体のADCC活性は高いと解釈できる。血清IgG を0.01, 0.1, 1, 8 mg/ml の濃度でADCC測定系に加えて、抗ハプテンIgGのEC50を比較したところ、加えた血清IgG の濃度が高いほどEC50が上昇(X 軸右側へシフト)し、ADCCが抑制されることが示された(図6)。
　一方、糖鎖改変した血清IgGである非フコシル化IgG(S2)とフコシル化IgG(S2F)の間で、ADCC抑制作用に差があるか調べるために、それらの存在下で抗CD20 IgG のADCC 活性を比較した(図7)。S2及びS2F濃度は0.1 mg/ml とした。S2Fでは対照と同じEC50(0.2μg/ml)となり、抑制作用を示さなかった(図7)。一方、S2存在下では、EC50 は15倍以上高濃度の>3μg/mlとなった(図7)。つまり、S2はS2Fの15倍以上のADCC 抑制作用を発揮したといえる。従って、非フコシル化IVIG を用いれば、通常のIVIGよりも少量の投与量で抗炎症効果が期待でき、更に通常のIVIGが有効でない症例に対しても抗炎症効果を発揮する可能性がある。
　2.抗炎症性ガラクトシル非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造
　2a-1.血清由来IgGの精製
　健常人血液から調製した血清20 mlを0.01M リン酸緩衝液(pH 7.0)で透析後、同じ緩衝液で平衡化したDiethylaminoethyl (DEAE)-cellulose 陰イオン交換カラム(DE52, Whatman Biosystems, Chalfont, St Giles, UK)(1 x 30 cm)に添加し、素通りした分画に含まれるIgGを採取した。純度はSDS-PAGEで95％以上であることを確認した(図8、レーン1)。
　2a-2.血清IgGの糖鎖切断
　IgGのFc結合糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、Endo Sを用いた。Endo S の発現ベクターのDNA 配列は以前報告され、BL21(DE3)大腸菌で発現させた。臭化シアン活性化Sepharose 4B ビーズに固定化したEndo Sを用いて、糖鎖のキトビオースコアの２つのN-アセチルグルコサミン間を加水分解し、N-アセチルグルコサミンとフコースの二糖を残し、脱グリコシル化した。脱グリコシル化IgG は、Protein G-Sepharose 4(GE)で精製した。
　2a-3.血清IgGの脱フコシル化
　フコースの除去にα-L-フコシダーゼ(AlfC)を用いた。本酵素の発現ベクターのDNA配列は以前報告され(配列番号1)、BL21(DE3)大腸菌で文献に準じて発現させる。Endo Sで脱グリコシル化したIgG にAlfC を50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中で37℃一晩反応させ、フコースを除去した。
　2a-4.ガラクトシルグリカンオキサゾリン(GG-Ox)の生成
　シアリルグリコペプチド(10mg, 東京化成)を50mM リン酸緩衝液 (pH 6.0) 中にてシアリダーゼ (Roche) およびSepharose固定化Endo Sと一晩37℃で反応させる。下記に示すガラクトシルグリコペプチドが中間体となり、その糖鎖が切断され、ガラクトシルグリカンが生成する。更に2-Chloro-1,3-dimethylimidazolinium Chloride(東京化成)とtriethylamineを加え、0℃で１時間放置し、還元末端の脱水縮合反応によりGG-Ox を調製した。GG-Ox はセルロースカラム(Sigma-Aldrich)で精製した。なお上述では、シアリルグリコペプチドにシアリダーゼを用いる脱シアル化によりガラクトシルグリコペプチドを得ているが、脱シアル化は酵素を用いることなく可能であり、例えばシアリルグリコペプチドをpH1-2で熱処理する脱シアル化によりガラクトシルグリコペプチドを得ることも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　図9はEndo Sで遊離した糖鎖からのGG-Oxの生成工程を示す。下記にGG-Oxの構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　2a-5.ガラクトシル非フコシル化IgGの作製
　グリコシンターゼEndo S D233Qの発現ベクターのDNA配列は文献に報告され、BL21(DE3)大腸菌で発現させる。糖鎖転移反応では、GG-Oxを用いて、Endo S D233Qと50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、30℃で4時間インキュベートして行った。これにより本実施例にかかる抗炎症性ガラクトシル非フコシル化免疫グロブリン製剤を製造した。この本実施例にかかるガラクトシル非フコシル化IgGをIgG(G2)と表記することができる。糖鎖の改変を確認するために、糖鎖をすげ替えたIgG(S2、S2F、G2)をN-グリコシダーゼF消化し糖鎖を遊離した後、2-aminobenzamideで蛍光標識し、High performance liquid chromatography (HPLC)で分析した(図10)。下記にGG-OxのGlcNAc-IgGへの糖鎖転移反応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　2b. ガラクトシル非フコシル化免疫グロブリンのADCC抑制(抗炎症)効果
　2b-1. in vitroでのADCC抑制(抗炎症)効果
　フコースを除去した血清IgG が抗炎症作用を持ち、更にガラクトースを末端に持つ事で、その作用が増強される事を以下の方法で発見した。予備実験として、通常の血清IgG(IVIG、95％フコシル化、図10A)の存在がADCCに及ぼす影響をADCC Reporter bioassay kit(プロメガ社)により調べた。標的細胞(Raji 細胞)をCD20抗体(rituximab)で感作した(0.001～3 μg/ml, 図11)。ADCC活性の強弱は、標的細胞死(Cytotoxicity、図11 Y 軸)を最大レベルの50％誘導できる抗体濃度(EC50、図11 X 軸)で示される。EC50 値が小さいほど、ADCC 活性は強いと解釈できる。血清IgG(IVIG)を0，0.1, 1, 10 mg/ml の濃度でADCC 測定系に加えて、EC50 値を比較したところ、それぞれ、0.026, 0.032, 0.6, >2μg/mlであり、IVIG 濃度が高いほどEC50 値が上昇し、ADCC が抑制されることが示された(図11)。
　次に、糖鎖改変した非フコシル化IgG(S2)、ガラクトシル非フコシル化IgG(G2)、非ガラクトシル非フコシル化IgG(G0)とフコシル化IgG(S2F)を0.1 mg/ml 濃度の存在下で、ADCC を測定した(図12)。EC50 値は、PBS(陰性対照)、S2F、G0、S2、G2 存在下で、それぞれ0.023、0.028、0.08、0.12、0.3 μg/ml であり、G2 存在下で最も強い阻害作用を示した(図12)。これは相対的ADCC 活性が、100%、82%、29%、19%、7.6%に相当する。つまり、G2 はS2F やS2 と比べ、それぞれ11 倍、2.5 倍のADCC 抑制作用を発揮したといえる。従って、ガラクトシル非フコシル化IVIG を用いれば、通常のIVIG よりも少量の投与量で抗炎症効果が期待できる。またFcγ受容体IIIaには2つアロタイプがあり、バリン158（Val158）を含むFcγ受容体IIIaの方が、フェニルアラニン158（Phe158）を含むものよりもIgGに高親和性で、ADCC活性も高い。本結果はFcγ受容体IIIa-Val158 を発現するエフェクター細胞で観察されたが、Fcγ受容体IIIa-Phe158に対しても同様に強いADCC阻害作用が見られた。従って、どちらのアロタイプの患者に対してもG2は有効であり、通常のIVIGでは効果がない患者にも強い抗炎症作用を発揮すると期待できる。
　2b-2. in vivoでのADCC抑制(抗炎症)効果
　ADCC抑制作用を持つ非フコシル化IgG(S2, G2)が(図12)、生体内でも抗炎症作用を発揮するか調べるために、コラーゲン抗体誘発関節炎Collagen antibody-induced arthritis (CAIA) モデルマウスを用いた。Day 0にコラーゲン抗体カクテル(Chondrex, Inc.　 Cat.# 53010)をDBA/1Jマウス(雌、8週令、日本エスエルシー)に静脈内投与し(1.5 mg/匹)、Day 3にリポ多糖(LPS、12.5 μg/匹)を腹腔内投与し関節炎を誘発した。治療目的で、IgG(S2, S2F, G2、図8、10)をLPS投与1時間前に静脈内投与した(0.1 g/kg体重、n = 3/群)。血清IgG(IVIG)は低用量(0.1 g/kg体重)と高用量(1 g/kg体重)投与群の2用量とした。高用量IVIG投与群は陽性対照で、ヒトの炎症性疾患治療で用いる量である。陰性対照としてリン酸緩衝液(PBS、0.33 ml)を用いた。Day 3，4，6、8に関節炎の程度を5段階評価し(0：変化なし、1：足指の腫脹、2：足指および足裏の腫脹、3：足全体の腫脹、4：重度の腫脹)、四肢のスコア合計数で表した。Day 8で、G2投与群と高用量IVIG投与群は同程度に関節炎スコアが低かった(図13)。一方、S2、S2F、低用量IVIG投与群はPBS投与群と同様に関節炎スコアが高かった。Day 8にイソフルラン麻酔下で心穿刺により採血し、急性期タンパクである炎症性サイトカインInterleukin-6 (IL-6)やC反応性タンパク (CRP)を測定した。血清IL-6濃度はPBS群が10.9 pg/mlと最も高く、健常(Normal)群とG2投与群は、それぞれ1.3 pg/mlと0.7 pg/mlと低値であった(図14A)。一方、S2、S2F、IVIG投与群は健常群の2～3倍高値であった。血清CRP値もG2投与群が健常群と同様に低値であった(図14B)。以上より、G2は生体内でも著明な抗炎症作用を発揮する事が確認できた。
　自己免疫疾患の治療に利用できる。
　配列番号１、２：酵素

Claims (5)

  1. 　包含されるIgG抗体が、下記で示される糖鎖がFc部分のアスパラギン297(Asn297)に結合しているヒト血清IgG抗体からなることを特徴とする、抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤(ここでGはガラクトース、NはN-アセチルグルコサミン、Mはマンノースである。)。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用される請求項１記載の抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤。
  3. 　前記自己免疫疾患は、川崎病、特発性血小板減少性紫斑病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性後天性凝固第VIII因子欠乏症、多発性硬化症、重症筋無力症、スティフ・パーソン症候群、多病巣性神経障害、ANCA関連血管炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、ベーチェット病、潰瘍性大腸炎、クローン病、Reiter関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、Sjogren症候群、抗糸球体基底膜腎炎、原発性硬化性胆管炎、原発性抗リン脂質抗体症候群、中毒性表皮壊死症、移植片対宿主病、又は、敗血症の何れかである請求項２記載の抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤。
  4. 　ヒト血清IgG抗体にエンドグリコシダーゼ S (Endo S)を用いて、Fc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合している糖鎖をキトビオースコアで切断し、Asn297残基に結合しているN-アセチルグルコサミン及び該N-アセチルグルコサミンに結合したフコース以外を除去する糖鎖除去工程と、
    　α-L-フコシダーゼ(AlfC)を用いて前記N-アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去するフコース除去工程と、
    　グリコシンターゼ (Endo S D233Q)を用いて、ガラクトシルグリコペプチドから調製したオキサゾリン化糖鎖(GG-Ox)を、ヒト血清IgG抗体のFc部分のアスパラギン297(Asn297)残基に結合しているN-アセチルグルコサミンに転移する転移工程と、を有することを特徴とする抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法。
  5. 　前記フコース除去工程において、α-L-フコシダーゼは1,6-α-L-フコシダーゼであることを特徴とする請求項４に記載の抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤の製造方法。
PCT/JP2021/008404 2021-02-19 2021-03-04 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法 WO2022176219A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL305222A IL305222A (en) 2021-02-19 2021-03-04 An anti-inflammatory non-fucosylated immunoglobulin preparation and a method for its production
CA3211392A CA3211392A1 (en) 2021-02-19 2021-03-04 Anti-inflammatory afucosylated immunoglobulin preparation and method of producing such
JP2021527064A JP7230199B2 (ja) 2021-02-19 2021-03-04 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法
KR1020237031773A KR20230156355A (ko) 2021-02-19 2021-03-04 항-염증성 비푸코실화 면역글로불린 제제 및 이의 생산 방법
EP21926648.3A EP4295863A1 (en) 2021-02-19 2021-03-04 Anti-inflammatory, non-fucosylated immunoglobulin preparation and production method therefor
AU2021427938A AU2021427938A1 (en) 2021-02-19 2021-03-04 Anti-inflammatory, non-fucosylated immunoglobulin preparation and production method therefor
BR112023016723A BR112023016723A2 (pt) 2021-02-19 2021-03-04 Preparação de imunoglobulina afucosilada anti-inflamatória, e, método de produção de uma preparação de imunoglobulina afucosilada anti-inflamatória
CN202180093960.5A CN117083082A (zh) 2021-02-19 2021-03-04 抗炎性无岩藻糖基化免疫球蛋白制剂及其产生方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-024790 2021-02-19
JP2021024790A JP2022132706A (ja) 2019-09-04 2021-02-19 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022176219A1 true WO2022176219A1 (ja) 2022-08-25

Family

ID=82931271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/008404 WO2022176219A1 (ja) 2021-02-19 2021-03-04 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4295863A1 (ja)
JP (1) JP7230199B2 (ja)
KR (1) KR20230156355A (ja)
CN (1) CN117083082A (ja)
AU (1) AU2021427938A1 (ja)
BR (1) BR112023016723A2 (ja)
CA (1) CA3211392A1 (ja)
IL (1) IL305222A (ja)
WO (1) WO2022176219A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021042195A (ja) * 2019-09-04 2021-03-18 独立行政法人国立病院機構 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021042195A (ja) * 2019-09-04 2021-03-18 独立行政法人国立病院機構 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORZA BEATA, SZIGETI MARTON, SZEKRENYES AKOS, HAJBA LASZLO, GUTTMAN ANDRAS: "Glycosimilarity assessment of biotherapeutics 1: Quantitative comparison of the N -glycosylation of the innovator and a biosimilar version of etanercept", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, ELSEVIER B.V., AMSTERDAM, NL, vol. 153, 1 May 2018 (2018-05-01), AMSTERDAM, NL , pages 182 - 185, XP055964467, ISSN: 0731-7085, DOI: 10.1016/j.jpba.2018.02.021 *
DEBRE, M. ET AL.: "Infusion of Fc gamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura", LANCET, vol. 342, no. 8877, 1993, pages 945 - 9, XP055311761, DOI: 10.1016/0140-6736(93)92000-J
FALCK D. ET AL.: "Glycoforms of Immunoglobulin G Based Biopharmaceuticals Are Differentially Cleaved by Trypsin Due to the Glycoform Influence on Higher- Order Structure", J. PROTEOME RES ., vol. 14, 2015, pages 4019 - 4028, XP055568109, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5b00573 *
GIDDENS JOHN P., LOMINO JOSEPH V., DILILLO DAVID J., RAVETCH JEFFREY V., WANG LAI-XI: "Site-selective chemoenzymatic glycoengineering of Fab and Fc glycans of a therapeutic antibody", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 115, no. 47, 20 November 2018 (2018-11-20), pages 12023 - 12027, XP055964465, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1812833115 *
MIMURA, Y. ET AL.: "Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy", PROTEIN CELL, vol. 9, no. 1, 2018, pages 47 - 62, XP055670386, DOI: 10.1007/s13238-017-0433-3
REUSCH D. ET AL.: "Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes", GLYCOBIOLOGY, vol. 25, no. 12, 2015, pages 1325 - 1334, XP055425665, DOI: 10.1093/glycob/cwv065 *
SCHWAB, I. F. NIMMERJAHN: "Itravenous immunoglubulin therapy: how does IgC modulate the immune system?", NAT REV IMMUNOL, vol. 13, no. 3, 2013, pages 176 - 89
SHIELDS, R.L. ET AL.: "Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity", J BIOL CHEM, vol. 277, no. 30, 2002, pages 26733 - 40, XP002689094, DOI: 10.1074/jbc.M202069200
SHINKAWA, T. ET AL.: "The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity", J BIOL CHEM, vol. 278, no. 5, 2003, pages 3466 - 73, XP002965857, DOI: 10.1074/jbc.M210665200
ZHANG, P. ET AL.: "Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs", DRUG DISCOV TODAY, vol. 21, no. 5, 2016, pages 740 - 65, XP029543922, DOI: 10.1016/j.drudis.2016.01.006

Also Published As

Publication number Publication date
IL305222A (en) 2023-10-01
CN117083082A (zh) 2023-11-17
JPWO2022176219A1 (ja) 2022-08-25
BR112023016723A2 (pt) 2024-02-06
KR20230156355A (ko) 2023-11-14
EP4295863A1 (en) 2023-12-27
CA3211392A1 (en) 2022-08-25
JP7230199B2 (ja) 2023-02-28
AU2021427938A1 (en) 2023-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7374275B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体の皮下製剤及びその使用
JP5969102B2 (ja) 治療用イヌ免疫グロブリンおよびそれを用いる方法
JP5990701B2 (ja) 治療用イヌ免疫グロブリンおよびそれを用いる方法
US20240132608A1 (en) Combination therapy using an anti-fucosyl-gm1 antibody and an anti-cd137 antibody
JP2011506476A (ja) 抗炎症性が促進しかつ細胞毒性が低減したポリペプチドおよび関連する方法
IL103560A (en) Metal chelate formulation of antibodies
US20210353752A1 (en) Treatment with highly silylated igg compositions
JP2022132706A (ja) 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法
WO2022176219A1 (ja) 抗炎症性非フコシル化免疫グロブリン製剤及びその製造方法
JP2010512306A (ja) 抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法
CN115698082A (zh) 抗聚糖抗体及其用途
WO2021119234A1 (en) Glycosylated antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
Wang et al. Structural and functional characterization of glycosylation in an immunoglobulin G1 to Cryptococcus neoformans glucuronoxylomannan
CN107106672B (zh) 用于预防和治疗免疫介导性疾病的针对胞壁酰肽的单克隆抗体
WO2013172379A1 (ja) 新規抗体及びその用途
TWI838196B (zh) 抗cd38抗體之皮下調配物及其用途
EA042589B1 (ru) Составы антител к cd38 для подкожного введения и их применение
JP2005509595A (ja) 示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）活性を有する結合作用因子

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021527064

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21926648

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 305222

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180093960.5

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3211392

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021427938

Country of ref document: AU

Ref document number: MX/A/2023/009637

Country of ref document: MX

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023016723

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021427938

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210304

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237031773

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020237031773

Country of ref document: KR

Ref document number: 202392339

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021926648

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11202306159P

Country of ref document: SG

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021926648

Country of ref document: EP

Effective date: 20230919

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112023016723

Country of ref document: BR

Free format text: COM BASE NA PORTARIA 48 DE 20/06/2022, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA POIS O CONTEUDO APRESENTADO NA PETICAO NO 870220025975 DE 25/03/2022 NAO ESTA NO FORMATO ST.25.

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 523450324

Country of ref document: SA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023016723

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20230818