WO2022154186A1 - 신규한 피토엔 탈포화효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 - Google Patents
신규한 피토엔 탈포화효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022154186A1 WO2022154186A1 PCT/KR2021/005033 KR2021005033W WO2022154186A1 WO 2022154186 A1 WO2022154186 A1 WO 2022154186A1 KR 2021005033 W KR2021005033 W KR 2021005033W WO 2022154186 A1 WO2022154186 A1 WO 2022154186A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- polypeptide
- present application
- sequence
- strain
- polynucleotide
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 112
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 112
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 112
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 99
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 99
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 99
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 abstract description 55
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 55
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 54
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 65
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 49
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 2
- 241001605246 Corynebacterium crudilactis Species 0.000 description 2
- 241000446654 Corynebacterium deserti Species 0.000 description 2
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 241000291063 Corynebacterium halotolerans Species 0.000 description 2
- 241000024402 Corynebacterium imitans Species 0.000 description 2
- 241000128247 Corynebacterium pollutisoli Species 0.000 description 2
- 241000334675 Corynebacterium singulare Species 0.000 description 2
- 241000158523 Corynebacterium striatum Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- HOZBSSWDEKVXNO-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-azanylbutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O HOZBSSWDEKVXNO-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 15,15'-cis-Phytoene Natural products C(=C\C=C/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C YVLPJIGOMTXXLP-UUKUAVTLSA-N 0.000 description 1
- YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 15-cis-phytoene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CC=CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YVLPJIGOMTXXLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100533902 Arabidopsis thaliana SPL13A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100533904 Arabidopsis thaliana SPL13B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100455080 Bacillus subtilis (strain 168) lmrB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000960580 Corynebacterium testudinoris Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100070556 Oryza sativa subsp. japonica HSFA4D gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043227 Oryza sativa subsp. japonica SPL13 gene Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101150099282 SPL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100061456 Streptomyces griseus crtB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 101150011633 crtI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940086388 thiamine hydrochloride 5 mg Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 101150062776 yccA gene Proteins 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
- C12Y103/99031—Phytoene desaturase (lycopene-forming) (1.3.99.31)
Definitions
- the present application relates to a novel phytoene desaturase (Phytoene desaturase) variant, a Corynebacterium stationis strain comprising the variant, and IMP (5'-inosine monophosphate) production method using the strain will be.
- phytoene desaturase Plant desaturase
- Corynebacterium stationis strain comprising the variant
- IMP 5'-inosine monophosphate
- IMP 5'-inosine monophosphate
- various studies are being conducted for the development of high-efficiency production microorganisms and fermentation process technology.
- a target substance-specific approach such as increasing the expression of a gene encoding an enzyme involved in IMP biosynthesis or removing a gene unnecessary for biosynthesis is mainly used (EP 3722430 A1, US 2020-0347346) A1).
- the present inventors are a novel phytoene desaturase (Phytoene desaturase) variant to increase IMP production, Corynebacterium stationis including the variant ( Corynebacterium stationis ) strain and IMP (5'-inosine monophosphate) using the strain ) developed a production method and completed the present application.
- phytoene desaturase Plant desaturase
- Corynebacterium stationis including the variant ( Corynebacterium stationis ) strain and IMP (5'-inosine monophosphate) using the strain
- IMP 5'-inosine monophosphate
- aspartic acid which is an amino acid corresponding to the 425th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is substituted with asparagine, consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, phytoenthal It is to provide a saturating enzyme (Phytoene desaturase) variant.
- Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the variant of the present application.
- Another object of the present application is to include a variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant, and having IMP (5'-inosine monophosphate) producing ability, Corynebacterium stationis ( Corynebacterium stationis ) strain is to provide
- Another object of the present application is to include the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant, and having an IMP-producing ability, including the step of culturing a Corynebacterium stasis strain in a medium, IMP to provide a production method.
- FIG. 1 is a schematic diagram of a pDCM2 plasmid.
- aspartic acid which is an amino acid corresponding to the 425th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is substituted with asparagine, consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, phytoenthal Saturated enzyme variants are provided.
- the variant of the present application may have, include, or consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or consist essentially of the amino acid sequence.
- the amino acid corresponding to position 425 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is asparagine, and at least 70% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 75 %, 425%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, or an amino acid sequence having at least 99.9% homology or identity.
- variants having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted or added are also included within the scope of the present application. is self-evident
- sequence additions or deletions naturally occurring mutations, silent mutations or conservation within the N-terminus, C-terminus and/or within the amino acid sequence that do not alter the function of the variants of the present application It is a case of having an enemy substitution.
- conservative substitution means substituting an amino acid for another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
- variant means that one or more amino acids are conservatively substituted and/or modified so that they differ from the amino acid sequence before the mutation of the variant, but have functions or properties. refers to a polypeptide that is maintained. Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the polypeptide before the mutation. In addition, some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
- variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
- variant may be used interchangeably with terms such as mutant, modified, mutant polypeptide, mutated protein, mutant and mutant (in English, modified, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, etc.) and, as long as it is a term used in a mutated sense, it is not limited thereto.
- the variant may be a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in which aspartic acid, which is an amino acid corresponding to position 425 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is substituted with asparagine.
- variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
- a signal (or leader) sequence involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of the mutant, either co-translationally or post-translationally.
- the variants may also be conjugated with other sequences or linkers for identification, purification, or synthesis.
- the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
- the terms homology and identity can often be used interchangeably.
- Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is apparent that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons taking codon degeneracy into account in the polynucleotide.
- a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
- Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
- the variant of the present application may have phytoene desaturase activity.
- the mutant of the present application may have an activity to increase IMP (5'-inosine monophosphate) production ability compared to the wild-type polypeptide having phytoene desaturase activity.
- phytoene desaturase refers to a colorless 15-cis-phytoene in a biochemical pathway called a poly-trans pathway to a bright red color. It is a polypeptide that converts to lycopene.
- the phytoene desaturase of the present application may be used in combination with phytoene desaturase or CrtI.
- the sequence of the phytoene desaturase can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a phytoene desaturase activity encoded by crtI , but is not limited thereto.
- corresponding to refers to an amino acid residue at a listed position in a polypeptide, or to an amino acid residue that is similar, identical or homologous to a listed residue in a polypeptide. Identifying an amino acid at a corresponding position may be determining a specific amino acid in a sequence that refers to a specific sequence.
- corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.
- any amino acid sequence is aligned with SEQ ID NO: 3, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 3 .
- a sequence alignment algorithm such as that described in this application can identify the position of an amino acid, or a position at which modifications, such as substitutions, insertions, or deletions, occur compared to a query sequence (also referred to as a "reference sequence").
- Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc., but is not limited thereto, and a sequence alignment program known in the art, a pairwise sequence comparison algorithm, etc. may be appropriately used.
- Another aspect of the present application is to provide a polynucleotide encoding the variant of the present application.
- polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. polynucleotide fragments.
- the polynucleotide encoding the variant of the present application may include a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
- the polynucleotide of the present application may have or include the sequence of SEQ ID NO: 2.
- the polynucleotide of the present application may consist of, or consist essentially of, the sequence of SEQ ID NO: 2.
- the polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variants of the present application. Deformation can be made.
- the polynucleotide of the present application has 70% or more, 75% or more, 425% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% homology or identity to the sequence of SEQ ID NO: 2 or more, 98% or more, and less than 100% of the base sequence, or homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 is 70% or more, 75% or more, 425% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the nucleotide sequence may consist of or consist essentially of, but is not limited thereto.
- the codon encoding the amino acid corresponding to the 425th position of SEQ ID NO: 1 may be one of the codons encoding asparagine.
- polynucleotide of the present application may be included without limitation as long as it can hybridize under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application.
- stringent condition means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
- polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 425% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize, or a washing condition of conventional Southern hybridization at 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS at a salt concentration and temperature equivalent to one wash, specifically two to three times conditions can be enumerated.
- Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
- complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
- adenine is complementary to thymine
- cytosine is complementary to guanine.
- the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
- a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using the hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
- the Tm value may be 60° C., 63° C. or 65° C., but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
- the appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
- Another aspect of the present application is to provide a vector comprising the polynucleotide of the present application.
- the vector may be an expression vector for expressing the polynucleotide in a host cell, but is not limited thereto.
- the vector of the present application may include a DNA preparation comprising the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host.
- the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
- the vector After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
- the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
- Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
- pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors may be used.
- pBluescript II-based pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based and the like
- pDZ pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like
- pC1BAC vectors and the like can be used.
- a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
- the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
- It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
- the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. Markers to be given can be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
- the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
- the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as they can be expressed in the host cell.
- the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a target polypeptide.
- the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
- the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
- the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
- the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
- the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
- operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the target variant of the present application and the polynucleotide sequence are functionally linked.
- Another aspect of the present application includes a variant of the present application or a polynucleotide of the present application, Corynebacterium stationis ( Corynebacterium stationis ) It is to provide a strain.
- the strain of the present application may include a vector comprising the mutant polypeptide of the present application, a polynucleotide encoding the polypeptide, or the polynucleotide of the present application.
- strain or microorganism
- strain includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially.
- a specific mechanism is weakened or enhanced as a microorganism, and may be a microorganism including genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product.
- the strain of the present application includes a strain comprising any one or more of a mutant of the present application, a polynucleotide of the present application, and a vector including the polynucleotide of the present application; a strain modified to express a variant of the present application or a polynucleotide of the present application; a variant of the present application, or a strain expressing the polynucleotide of the present application (eg, a recombinant strain); Or it may be a strain having the mutant activity of the present application (eg, a recombinant strain), but is not limited thereto.
- the strain of the present application may be a strain having IMP-producing ability.
- the strain of the present application is a microorganism having naturally phytoene desaturase or IMP-producing ability, or a mutant of the present application or a polynucleotide encoding the same in a microorganism having no phytoene desaturase or IMP-producing ability (or the polynucleotide
- a vector comprising a) may be a microorganism to which the introduced and/or IMP-producing ability is imparted, but is not limited thereto.
- the strain of the present application is transformed with a vector containing the polynucleotide of the present application or a polynucleotide encoding the variant of the present application, and expresses the variant of the present application as a cell or microorganism
- the strain of the application may include all microorganisms capable of producing IMP, including the mutant of the present application.
- the strain of the present application is a recombinant strain in which the phytoene desaturase variant is expressed by introducing the polynucleotide encoding the variant of the present application into a natural wild-type microorganism or a microorganism producing IMP, and the IMP production capacity is increased.
- the recombinant strain with increased IMP-producing ability is a natural wild-type microorganism or a phytoene desaturase unmodified microorganism (ie, a microorganism or a mutant (SEQ ID NO: 1) protein expressing wild-type phytoene desaturase (SEQ ID NO: 3)) It may be a microorganism having an increased IMP-producing ability compared to a microorganism that does not express), but is not limited thereto.
- the strain with increased IMP-producing ability of the present application may be a microorganism having increased IMP-producing ability compared to Corynebacterium stasis comprising the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding the same, but is not limited thereto does not
- the target strain to compare whether the increase in the IMP production capacity, phytoene desaturase unmodified microorganism may be a CJI2332 strain (KCCM12277P, KR 10-1950141 B1), but is not limited thereto.
- the recombinant strain with increased production capacity is about 1% or more, specifically about 2% or more, about 4% or more, about 6% or more, about 8% compared to the IMP production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation. or more, about 10% or more, about 12% or more, about 14% or more, about 16% or more, about 18% or more, or about 20% or more (the upper limit is not particularly limited, for example, about 200% or less, about 150% or less , about 100% or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, or about 25% or less) As long as it has, it is not limited thereto.
- the recombinant strain with increased production capacity has an IMP production capacity of about 1.01 times or more, about 1.02 times or more, about 1.03 times or more, about 1.05 times or more, about 1.06 times or more, compared to the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
- the term "unmodified microorganism” does not exclude a strain containing a mutation that can occur naturally in a microorganism, it is a wild-type strain or a natural-type strain itself, or a genetic variation caused by natural or artificial factors. It may mean the strain before being changed.
- the unmodified microorganism may refer to a strain before or in which the phytoene desaturase variant described herein is not introduced or introduced.
- the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with "strain before modification", “microbe before modification”, “unmodified strain”, “unmodified strain”, “unmodified microorganism” or "reference microorganism”.
- the microorganism of the present application is Corynebacterium stationis ( Corynebacterium stationis ), Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium crudilactis ), Cory Nebacterium deserti ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium efficiens ( Corynebacterium efficiens ), Corynebacterium callunae ( Corynebacterium callunae ), Corynebacterium singulare ( Corynebacterium singulare ), Corynebacterium halo Tolerans ( Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum ( Corynebacterium striatum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Corynebacterium pollutisoli ( Coryne
- the term "weakening" of a polypeptide is a concept that includes both reduced or no activity compared to intrinsic activity.
- the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, attenuation, and the like.
- the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide possessed by the original microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, etc.
- the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression amount) in the cell is lower than that of the native strain due to (translation) inhibition, etc., when the expression of the polynucleotide is not made at all, and/or when the expression of the polynucleotide is Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
- the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification”. "Inactivation, deficiency, reduction, downregulation, reduction, attenuation” of the activity of the polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity of the specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation is lowered.
- Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by application of various methods well known in the art (eg, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
- the attenuation of the polypeptide activity of the present application is
- an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
- an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of said gene encoding the polypeptide
- deletion of a part or all of the gene encoding the polypeptide may be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
- the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
- the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon having a lower expression rate of the polypeptide compared to the intrinsic start codon It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
- the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) above deletes, inserts, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide so as to weaken the activity of the polypeptide.
- a combination thereof may result in a mutation in sequence, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
- the expression of a gene may be inhibited or attenuated, but is not limited thereto.
- antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
- antisense RNA an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide
- Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
- RTE reverse transcription engineering
- the term “enhancement” of a polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
- the reinforcement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
- activation, enhancement, up-regulation, overexpression, and increase may include all of those exhibiting an activity that was not originally possessed, or exhibiting an improved activity compared to an intrinsic activity or an activity prior to modification.
- intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors.
- the enrichment can be achieved by introducing an exogenous polypeptide, or by enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of the endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from the increase in the level of activity, expression level, or the amount of product excreted from the polypeptide.
- the enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as it can enhance the activity of the target polypeptide compared to the microorganism before modification. Specifically, it may be one using genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (eg, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell). Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
- modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide that has been modified to enhance the activity of the polypeptide;
- the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introduction into the host cell of a vector to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked, which can replicate and function independently of the host it may be Alternatively, the polynucleotide encoding the polypeptide may be achieved by introducing one copy or two or more copies into a chromosome in a host cell.
- the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
- the vector is the same as described above.
- Replacing the gene expression control region (or expression control sequence) on the chromosome encoding the polypeptide with a sequence with strong activity is, for example, deletion, insertion, non-conservative or Conservative substitution or a combination thereof may result in a mutation in the sequence, or replacement with a sequence having a stronger activity.
- the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation.
- the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
- Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
- the modification of the nucleotide sequence encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another start codon having a higher expression rate of the polypeptide compared to the intrinsic start codon. It may be a substitution, but is not limited thereto.
- the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide;
- a combination thereof may result in sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
- the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
- the vector used may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
- the selection marker is the same as described above.
- the introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be the introduction of the foreign polynucleotide encoding the polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
- the foreign polynucleotide is not limited in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
- the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art, and the introduced polynucleotide is expressed in a host cell to generate a polypeptide and increase its activity.
- Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon-optimized so that the transcription or translation of the endogenous polynucleotide is increased in the host cell, or the transcription and translation of the foreign polynucleotide is optimized in the host cell. It may be that its codons are optimized so that the
- Selecting an exposed site by analyzing the tertiary structure of the polypeptide and modifying or chemically modifying it is, for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored to determine the degree of sequence similarity. Accordingly, it may be to determine a template protein candidate, check the structure based on this, and select an exposed site to be modified or chemically modified and modified or modified.
- Such enhancement of polypeptide activity is to increase the activity or concentration of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or increase the amount of product produced from the polypeptide.
- the present invention is not limited thereto.
- Modification of some or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion in the microorganism or genome correction using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by light and/or chemical treatments such as, but not limited to, ultraviolet and radiation.
- the method of modifying part or all of the gene may include a method by DNA recombination technology.
- nucleotide sequence or a vector containing a nucleotide sequence homologous to a target gene into the microorganism to cause homologous recombination, deletion of a part or all of a gene may be made.
- the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
- Another aspect of the present application provides a method for producing IMP, comprising the step of culturing a Corynebacterium stationionis strain comprising a mutant of the present application or a polynucleotide of the present application in a medium.
- the method for producing IMP of the present application may include culturing a Corynebacterium stationionis strain comprising the mutant of the present application or the polynucleotide of the present application or the vector of the present application in a medium.
- the term "cultivation” means growing the Corynebacterium stasis strain of the present application under moderately controlled environmental conditions.
- the culture process of the present application may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
- the culture may be a batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
- the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing the Corynebacterium stasis strain of the present application are mixed as a main component, and nutrients including water essential for survival and growth and growth factors.
- the medium and other culture conditions used for culturing the Corynebacterium stasis strain of the present application may be used without any particular limitation as long as it is a medium used for culturing conventional microorganisms, but the Corynebacterium of the present application Rium stasis strains can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compound, amino acid and/or vitamin, and the like.
- the culture medium for the Corynebacterium sp. strain can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
- the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, and the like; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
- natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
- nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
- inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
- Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
- organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
- the phosphorus may include potassium first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
- potassium first potassium phosphate potassium phosphate
- second potassium phosphate or a sodium-containing salt corresponding thereto.
- sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
- the pH of the medium may be adjusted.
- an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
- oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or without injection of gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions, which are limited thereto it is not
- the culture temperature may be maintained at 20 to 45° C., specifically, 25 to 40° C., and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
- the IMP produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or may remain in the cell.
- IMP production method of the present application preparing the Corynebacterium stasis strain of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (regardless of the order, in any order) , for example, prior to the culturing step, may further include.
- the method for producing IMP of the present application may further include recovering IMP from the culture medium (the culture medium) or the Corynebacterium stasis strain.
- the recovering step may be further included after the culturing step.
- the recovery may be to collect the desired IMP using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
- a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
- centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitating agent (salting out method) extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity
- Various chromatography such as island chromatography, HPLC, or a combination thereof may be used, and a desired IMP may be recovered from a medium or a microorganism using a suitable method known in the art.
- the IMP production method of the present application may additionally include a purification step.
- the purification may be performed using a suitable method known in the art.
- the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously, regardless of the order, or performed simultaneously or integrated into one step. may be, but is not limited thereto.
- variants, polynucleotides, vectors, strains, and the like are as described in the other aspects above.
- Another aspect of the present application provides a variant of the present application, a polynucleotide encoding the variant, a vector including the polynucleotide or a Corynebacterium stasis strain comprising the polynucleotide of the present application; the culture medium; Or to provide a composition for producing IMP comprising a combination of two or more of them.
- composition of the present application may further include any suitable excipients commonly used in compositions for the production of amino acids, and such excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents, etc.
- excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents, etc.
- the present invention is not limited thereto.
- composition of the present application variants, polynucleotides, vectors, strains, media and IMPs are the same as those described in the other aspects above.
- a plasmid (pDCM2, FIG. 1, SEQ ID NO: 5) was designed for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome, and the plasmid was synthesized using the Gene-synthesis service of Bionics.
- a plasmid was designed to include a restriction enzyme that is easy to use for cloning by referring to the generally known sacB system related paper [Gene, 145 (1994) 69-73].
- the thus synthesized pDCM2 plasmid has the following characteristics.
- Wild-type Corynebacterium stationis ( Corynebacterium stationis ) Using gDNA (genomic DNA) of ATCC6872 as a template, primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 6 and 7 and primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 8 and 9. PCR is performed, respectively. did. Using the mixture of the two fragments obtained above as a template, overlapping PCR was performed again using the primer pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 to obtain a fragment. After denaturation at 94°C for 5 minutes, PCR was repeated 30 times at 94°C for 30 seconds, at 55°C for 30 seconds, and at 72°C for 1 minute and 30 seconds, and then at 72°C for 5 minutes.
- the pDCM2 vector was treated with smal and the PCR product obtained above was fusion cloned. Fusion cloning was performed using the In-Fusion® HD cloning kit (Clontech). The resulting plasmid was named pDCM2-crtI (D425N).
- Example 3 Evaluation of IMP-producing ability of microorganisms expressing phytoene desaturase variants
- the vector prepared in Example 2 was transformed into Corynebacterium stasis CJI2332 strain (KCCM12277P, KR 10-1950141 B1).
- the strain into which the mutant was introduced was selected using SEQ ID NOs: 10 and 11.
- the selected strain was named CJI2332_crtI_D425N.
- IMP production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and control parent strain prepared in Example 3-1.
- each strain was inoculated in a test tube with a diameter of 18 mm containing 2 ml of the seed medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours to be used as a seed culture medium.
- 2 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250ml corner-baffle flask containing 29ml of production medium (24ml of main medium + 5ml of separate sterile medium) and cultured at 30°C for 72 hours at 170rpm.
- the production capacity of IMP was measured by HPLC. IMP concentration and concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 1 below.
- the CJI2332_crtI_D425N was named CN01-2649, and it was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty, on November 30, 2020, and was given an accession number KCCM12844P.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 출원은 신규한 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase) 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주 및 상기 균주를 이용한 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 신규한 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase) 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주 및 상기 균주를 이용한 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산 방법에 관한 것이다.
IMP(5'-inosine monophosphate) 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, IMP 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(EP 3722430 A1, US 2020-0347346 A1).
다만, IMP 의 수요 증가에 따라 효과적인 IMP의 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 IMP 생산을 증대시키는 신규한 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase) 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주 및 상기 균주를 이용한 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열의 425번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산(Aspartic acid)이 아스파라긴(Asparagine)으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진, 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, IMP(5'-inosine monophosphate) 생산능을 가진, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, IMP 생산능을 가진, 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, IMP 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase)의 변이체를 포함하는, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주를 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산이 가능하다.
도 1은 pDCM2 플라스미드의 모식도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 3의 아미노산 서열의 425번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산(Aspartic acid)이 아스파라긴(Asparagine)으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진, 피토엔 탈포화효소 변이체를 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 425번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴이고, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 425%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 425번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase) 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 피토엔 탈포화효소 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase)"는 폴리 트랜스(poly-trans) 경로라고 불리는 생화학적 경로에서 무색의 15-시스-피토엔(15-cis-phytoene)을 밝은 적색의 리코펜(lycopene)으로 전환시키는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 피토엔 탈포화효소는 피토엔 디세츄라제 또는 CrtI와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 피토엔 탈포화효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 crtI에 의해 코딩되는 피토엔 탈포화효소 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 3과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 425% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 425% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 425번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 아스파라긴을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 425% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 균주는 IMP 생산능을 가진 균주일 수 있다.
본 출원의 균주는 자연적으로 피토엔 탈포화효소 또는 IMP 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 피토엔 탈포화효소 또는 IMP 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 IMP 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 IMP를 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 IMP를 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 피토엔 탈포화효소 변이체가 발현되어, IMP 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 IMP 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 피토엔 탈포화효소 비변형 미생물 (즉, 야생형 피토엔 탈포화효소(서열번호 3)를 발현하는 미생물 또는 변이형(서열번호 1) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 IMP 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 본 출원의 IMP 생산능이 증가된 균주는 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스와 비교하여 IMP 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 IMP 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 피토엔 탈포화효소 비변형 미생물은 CJI2332 균주(KCCM12277P, KR 10-1950141 B1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 IMP 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 2% 이상, 약 4% 이상, 약 6% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 12% 이상, 약 14% 이상, 약 16% 이상, 약 18% 이상 또는 약 20% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, IMP 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.03배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.06배 이상, 약 1.07배 이상, 약 1.08배 이상, 약 1.09배 이상, 약 1.10배 이상, 약 1.11배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 약 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상, 약 1.19배 이상 또는 약 1.20배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 피토엔 탈포화효소 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 IMP 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, IMP 생산방법을 제공한다.
본 출원의 IMP 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 IMP는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 IMP 생산 방법은, 본 출원의 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 IMP 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 코리네박테리움 스테이셔니스 균주로부터 IMP를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 IMP를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 IMP를 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 IMP 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 IMP 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스 균주; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 IMP 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 IMP 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: 플라스미드의 제작
코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드(pDCM2, 도 1, 서열번호 5)를 디자인하였고, 바이오닉스(주)의 유전자 합성(Gene-synthesis) 서비스를 이용하여 플라스미드를 합성하였다. 일반적으로 알려진 sacB 시스템 관련 논문[Gene, 145 (1994) 69-73]을 참고로 하여 클로닝에 활용하기 용이한 제한효소(restriction enzyme)를 포함하도록 플라스미드를 설계하였다. 이렇게 합성된 pDCM2 플라스미드는 다음과 같은 특성을 갖는다.
1) 대장균에서만 작용하는 복제 기점(replication origin)을 가지고 있어 대장균 내에서는 자가 복제(self-replication)가 가능하나 코리네박테리움에서는 자가 복제가 불가능한 특성을 갖는다.
2) 선별 마커로 카나마이신 내성 유전자를 갖는다.
3) 2차 양성 선별(positive-selection) 마커로 레반 수크라제(Levan sucrase) 유전자(sacB)를 갖는다.
4) 최종 제작된 균주에는 pDCM2 플라스미드로부터 유래한 어떠한 유전자 정보도 남지 않는다.
실시예 2: 미생물내 피토엔 탈포화효소(Phytoene desaturase)
변이체 발현을 위한 벡터 제작
피토엔 탈포화효소 아미노산 서열(서열번호 3)의 425번째 위치 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 변이체(D425N; 서열번호 1)가 IMP(5'-inosine monophosphate) 생산에 미치는 영향을 확인하고자 이의 발현 균주 제작을 위한 벡터를 하기와 같이 제작하였다.
야생형 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) ATCC6872의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 6 및 7의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 8 및 9의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 상기에서 얻어진 두 단편의 혼합물을 주형으로 서열번호 6 및 서열번호 9의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 다시 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 벡터는 smaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-crtI(D425N)라 명명하였다.
실시예 3: 피토엔 탈포화효소 변이체를 발현하는 미생물의 IMP 생산능 평가
3-1. 피토엔 탈포화효소
변이체 발현 균주 제작
상기 실시예 2에서 제작한 벡터를 코리네박테리움 스테이셔니스 CJI2332 균주(KCCM12277P, KR 10-1950141 B1)에 형질전환 하였다.
상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 10과 11을 이용하여 변이체가 도입된 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 CJI2332_crtI_D425N로 명명하였다.
3-2. 피토엔 탈포화효소 변이체 발현 균주의 IMP 생산능 비교
상기 실시예 3-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 IMP 생산능을 분석하였다.
먼저, 종배지 2ml을 함유하는 지름 18mm 시험관에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 24시간 동안, 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 생산배지 29ml(본배지 24ml + 별도 살균 배지 5ml)를 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 2 ml의 종 배양액을 접종하여 30℃에서 72 시간 동안, 170rpm으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC로 IMP의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 IMP 농도 및 농도 증가율은 하기 표 1과 같다.
<종배지 (pH 7.5)>
포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 - 본배지 (pH 7.5)>
효모추출액 0.2%, 글루타민산 나트륨 0.1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 베타알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 포도당 2.55%, 과당 1.45% (증류수 1리터 기준)
<생산배지 - 별도 살균 배지 (pH 7.5)>
인산(85%) 2.3%, 수산화칼륨(45%) 2.55% (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 1에 나타내었다.
균 주 | IMP 농도 (g/L) | IMP 농도 증가율(%) |
CJI2332 | 1.74 | - |
CJI2332_crtI_D425N | 2.1 | 20.7 |
표 1과 같이, CJI2332_crtI_D425N 균주는 대조군에 비해 20.7% 증가된 IMP 생산능을 나타내었다.
상기 CJI2332_crtI_D425N은 CN01-2649로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 11월 30일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12844P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (5)
- 서열번호 3의 425번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 피토엔 탈포화효소 변이체.
- 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 스테이셔니스 균주.
- 제3항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스와 비교하여 IMP 생산능이 증가된, 균주.
- 제1항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 스테이셔니스 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, IMP 생산 방법.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210006170A KR102254632B1 (ko) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | 신규한 피토엔 탈포화효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
KR10-2021-0006170 | 2021-01-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2022154186A1 true WO2022154186A1 (ko) | 2022-07-21 |
Family
ID=76157486
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/KR2021/005033 WO2022154186A1 (ko) | 2021-01-15 | 2021-04-21 | 신규한 피토엔 탈포화효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102254632B1 (ko) |
WO (1) | WO2022154186A1 (ko) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101916611B1 (ko) * | 2017-12-15 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
KR101950141B1 (ko) * | 2018-08-01 | 2019-02-19 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 아데닐로석시네이트 신세타아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 생산방법 |
KR101956510B1 (ko) * | 2018-07-27 | 2019-03-08 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 5'-이노신산 디하이드로게나아제 및 이를 이용한 5'-이노신산 제조방법 |
JP2019165635A (ja) * | 2016-08-10 | 2019-10-03 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸の製造法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101916635B1 (ko) * | 2018-06-19 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
-
2021
- 2021-01-15 KR KR1020210006170A patent/KR102254632B1/ko active IP Right Grant
- 2021-04-21 WO PCT/KR2021/005033 patent/WO2022154186A1/ko active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019165635A (ja) * | 2016-08-10 | 2019-10-03 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸の製造法 |
KR101916611B1 (ko) * | 2017-12-15 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
KR101956510B1 (ko) * | 2018-07-27 | 2019-03-08 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 5'-이노신산 디하이드로게나아제 및 이를 이용한 5'-이노신산 제조방법 |
KR101950141B1 (ko) * | 2018-08-01 | 2019-02-19 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 아데닐로석시네이트 신세타아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 생산방법 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
DATABASE PROTEIN 13 December 2021 (2021-12-13), ANONYMOUS : "phytoene desaturase family protein [Corynebacterium stationis]", XP055950964, retrieved from NCBI Database accession no. WP_066795961 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102254632B1 (ko) | 2021-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2022163934A1 (ko) | 신규한 d-알라닌-d-알라닌 리가아제 a 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
WO2022231369A1 (ko) | 신규한 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022225322A1 (ko) | 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 알파 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022163933A1 (ko) | 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
WO2022163917A1 (ko) | 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
WO2022154181A1 (ko) | 신규한 1,4-알파-글루칸-분지 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154177A1 (ko) | 신규한 3d-(3,5/4)-트리하이드록시사이클로헥세인-1,2-다이온 아실하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154178A1 (ko) | 신규한 혐기성 코프로포르피리노겐 iii 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154190A1 (ko) | 신규한 포스포노아세테이트 하이드롤라제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022154191A1 (ko) | 신규한 2,5-다이케토-d-글루콘산 리덕타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022231371A1 (ko) | 신규한 5-(카르복시아미노)이미다졸리보뉴클레오티드합성효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022231370A1 (ko) | 신규한 2중기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포밀트랜스퍼라아제/imp 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022163920A1 (ko) | 신규한 시스테인 설피네이트 디설피나제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
WO2022163922A1 (ko) | 신규한 아스파라긴 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
WO2022163935A1 (ko) | 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
WO2022163923A1 (ko) | 신규한 atp 포스포리보실트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
WO2022225321A1 (ko) | 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 감마 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022225320A1 (ko) | 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022225319A1 (ko) | 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
WO2022231067A1 (ko) | 신규한 이중기능성 pyr 오페론 전사조절자/우라실 포스포리보실 전달 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154186A1 (ko) | 신규한 피토엔 탈포화효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154182A1 (ko) | 신규한 포름이미도일글루타마아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154185A1 (ko) | 신규한 펩타이드 메티오닌 설폭사이드 환원효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154179A1 (ko) | 신규한 d-알라닌--d-알라닌 리가아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
WO2022154180A1 (ko) | 신규한 포름아미도피리미딘-dna 글리코실라제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21919812 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 21919812 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |