WO2022075113A1 - 動脈病変を検出し、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を検出する、体液抗体バイオマーカー - Google Patents
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Definitions
- the present invention is an invention relating to a disease data acquisition means or a detection means, and more specifically, data acquisition regarding arterial lesions by measuring a body fluid antibody against the KIAA0513 protein or a peptide having a partial sequence thereof as a biomarker.
- the present invention relates to means or detection means, as well as data acquisition means or detection means relating to cerebrocardiovascular disorders, diabetes, chronic kidney disease, solid cancer, and the like.
- Non-Patent Document 1 antibody markers for acute cerebral infarction (AIS), Hsp60 (Non-Patent Document 1), RPA2 (Non-Patent Document 2), SOSTDC1 (Non-Patent Document 3), PDCD11 (Non-Patent Document 4), MMP1, CBX1 and CBX5 (Non-Patent Document 5); ATP2B4 (Non-Patent Document 6), BMP-1 (Non-Patent Documents 2 and 6), DHPS (Non-Patent Document 7), SH3BP5 (Non-Patent Document 7) as markers for atherosclerosis.
- US Pat. Glutamic acid decarboxylase (Non-Patent Document 13), Adiponectin (Non-Patent Document 14), GADD34 (Non-Patent Document 15) and the like.
- anti-p53 antibody As an antibody biomarker for cancer, anti-p53 antibody has been put into practical use as a marker useful for diagnosis, monitoring, and prognosis prediction of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and head and neck cancer (Non-Patent Documents 16 and 17). ..
- the group of the present inventors was screened by the recombinant cDNA expression cloning (SEREX) method, and used as an ESCC antibody marker in Trop2 / TACSTD2 (Non-Patent Document 18), SLC2A.
- Non-Patent Document 20 Myomegalin
- Non-Patent Document 21 macolin 1
- ECSA Non-Patent Document 23
- cyclin L2 CCNL2
- FIR / PUF60 Non-Patent Document 25
- SH3GL1 Non-Patent Document 26
- Anti-Philamine C Non-Patent Document 27
- An anti-deoxyhypusine synthase antibody as a marker of atherosclerosis-related cerebral infarction, myocardial infarction, diabetes mellitus, and chronic kidney Http://smjournals.com/atherosclerosis/in-press.php#x Hiwasa T, Tomiyoshi G, Nakamura R, et al. Serum SH3BP5-specific antibody level is a biomarker of atherosclerosis. Immunome Res. 2017; 13: 132. Doi: 10.4172 / 17457580.1000132 Zhang XM, Wang H, Mine S, et al. Association of serum anti-prolyl carboxylpeptidase antibody marker with atherosclerotic diseases accompanied by hypertension.
- diabetes which is a risk factor for cancer, heart disease, cerebrovascular disease, renal failure, and these organic diseases, is a disease whose onset and progression can be suppressed by health management such as early diagnosis. be. Therefore, if disease markers can be used for appropriate treatment, treatment, lifestyle guidance, etc., they can greatly contribute to the promotion of human health.
- the new coronavirus (COVID-19) is prevalent worldwide, and as factors that make the new coronavirus more serious, "diabetes, heart disease, cerebrovascular disease, cancer, kidney disease, etc.” Presence or absence of underlying disease "is mentioned. It can be said that the presence or absence of these underlying diseases as well as the new coronavirus is a general factor in the aggravation of infectious diseases. Therefore, there is an urgent need to provide a biomarker that can easily determine "presence or absence of an underlying disease,” which is an element of the aggravation of such infectious diseases.
- Non-Patent Document 32 Since the organs and organs in the body influence each other more or less (Non-Patent Document 32), if "arterial lesions” such as arteriosclerosis and angiogenesis can be detected, cerebrocardiovascular disorders , Diabetes, kidney disease, solid cancer, etc. can be detected, and it is considered that it will lead to early detection of these diseases. These diseases are serious life-threatening diseases, and their significance is great if their signs can be detected and detected early with a single biomarker.
- the present inventors have found that the presence of arterial lesions can be detected by measuring the increase in antibody levels against the KIAA0513 protein in body fluids, and this can be obtained as data of signs or presence of diseases associated with arterial lesions. .. Furthermore, it has been found that by measuring the increase in the body fluid antibody level, it can be obtained as latent or overt data of cerebrocardiovascular disorders, diabetes, chronic kidney disease, or solid cancer. Furthermore, it has been found that the latent or overt data of the above-mentioned cerebrocardiovascular disorders, diabetes, chronic kidney disease, or solid cancer can be used as data of arterial lesions associated with these diseases.
- the presence of arterial lesions is detected by using the increase in antibody level against KIAA0513 protein in body fluid as an index, and this can be used as the data of signs or presence of diseases associated with arterial lesions, or the above-mentioned cerebrocardiovascular disorders, diabetes, and chronic disease. It has been found that it is possible to determine the presence or absence of an underlying disease that is a factor in the aggravation of an infectious disease as latent or actual data of kidney disease or solid cancer.
- a data acquisition method (hereinafter, also referred to as “data acquisition method 1 of the present invention”) is provided.
- the protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 constituting the KIAA0513 protein, or a part thereof, or 10% or less of the amino acid sequence (rounded down to the nearest whole number) of amino acid residues is deleted.
- a data acquisition method hereinafter, also referred to as “data acquisition method 2 of the present invention” to be acquired as latent or actual data of cancer.
- the disease onset data obtained by the data acquisition method 2 of the present invention can be acquired as data of arterial lesions associated with these diseases.
- Isoform c (301 amino acids, NP_001284695.1: SEQ ID NO: 1)
- isoform b (301 amino acids, NP_00127375.1)
- isoform a (411 amino acids, NP_05547.1: SEQ ID NO: 2).
- the total length of 301 amino acids of KIAA0513 isoforms c and b is exactly the same as the first 301 amino acids of KIAA0513 isoform a.
- the KIAA0513 isoforms c and b have different base sequences of the mRNA precursors encoded by each, but have the same amino acid sequence as the KIAA0513 protein, which expresses spliced mature mRNA as a template. Therefore, in the present specification, when the term "KIAA0513 protein" is used without particular mention, it means the KIAA0513 protein isoforms b and / or c (SEQ ID NO: 1), and the case of isoform a is specified separately.
- KIAA0513 isoforms c and a showed higher antibody levels in the sera of AIS and CVD patients compared to HD (FIGS. 7a, b), and the reactivity of KIAA0513 isoform c was KIAA0513 isoform. Although it was higher than the reactivity of Form a, the two were relatively closely correlated (Fig. 7c).
- the major epitope site of the body fluid antibody against the KIAA0513 protein is located at the first 301 amino acids of the KIAA0513 isoform c, and b.
- "part of the KIAA0513 protein" used to detect body fluid antibodies against the KIAA0513 protein using an antigen-antibody reaction is a region of the above overlapping amino acid sequence of the KIAA0513 isoforms c, b, and a. It turns out that it is preferable to include it.
- the antibody level in the body fluid sample separated from the living body against the protein or a part thereof in which the amino acid residue of (truncated) is deleted, substituted, or added is measured, and the increase in the antibody level is used as an index to measure the antibody level in the artery.
- Cerebral cardiovascular disorders are measured by measuring the antibody level in the body fluid sample separated from the living body for the protein whose residue is deleted, substituted, or added, or a part thereof, and using the increase in the antibody level as an index. , A method for diagnosing or detecting diabetes, chronic kidney disease, or solid cancer. "
- the present invention provides a data acquisition kit (hereinafter, also referred to as the kit of the present invention) for performing the data acquisition method 1 or 2 of the present invention.
- the above-mentioned "protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 constituting the KIAA0513 protein, or a part thereof, or 10% or less of the amino acid sequence” Elevation of the antibody level by measuring the antibody level in the body fluid sample separated from the living body against the protein in which the number of amino acid residues (rounded down to the nearest whole number) is deleted, substituted, or added, or a part thereof.
- a method for detecting an arterial lesion using Measure the antibody level in the body fluid sample separated from the living body against the protein or a part thereof in which the amino acid residue (hereinafter truncated) is deleted, substituted, or added, and using the increase in the antibody level as an index.
- the present invention firstly, it becomes possible to acquire data on the presence of arterial lesions. Through these measures, it is possible to contribute to health promotion and prevention / treatment of diseases by grasping the signs and existence of diseases associated with arterial lesions and providing a way to take measures such as lifestyle guidance and medication based on the data. It is possible. Second, it makes it possible to obtain latent or overt data of cerebrocardiovascular disorders, diabetes, chronic kidney disease, or solid tumors. This makes it possible to contribute to the prevention and treatment of diseases by predicting the onset of the above-mentioned serious diseases and early detection, and providing a way to take measures such as lifestyle guidance and medication based on the data. be.
- the present invention provides basic data for determining the presence or absence of an underlying disease that is a factor in the aggravation of infectious diseases.
- the results of quantifying KIAA0513 serum antibody levels in healthy subjects (HD), patients with acute cerebral infarction (AIS) and patients with transient ischemic attack (TIA) by the AlphaLISA method are shown.
- the results when the KIAA0513 protein antigen is used are shown in a distribution map in a.
- the vertical axis of these distribution maps is the alpha count indicating the antibody level, and the bars of each distribution map indicate the average value and the average value ⁇ SD value.
- the results of ROC analysis are shown in b and c.
- the numerical values in the ROC diagram are AUC value, cutoff value, sensitivity, specificity, and 95% confidence interval.
- the results of measuring the KIAA0513 serum antibody level in HD and diabetic (DM) patients by the AlphaLISA method are shown.
- the results when the DIDO1 protein antigen is used are shown in a.
- the result of ROC analysis is shown in b.
- the explanation of the distribution map and the ROC diagram is as shown in FIG.
- the results of measuring the KIAA0513 serum antibody level in patients with HD, cardiovascular disorder (CVD) and sleep apnea syndrome (OSAS) by the AlphaLISA method are shown.
- the distribution map is shown in a, and the results of ROC analysis are shown in b and c.
- the explanation of the distribution map and the ROC analysis map is as shown in FIG.
- the results of measuring the KIAA0513 serum antibody level in patients with HD and chronic kidney disease (CKD) by the AlphaLISA method are shown.
- the results when the KIAA0513 protein antigen is used are shown.
- the distribution map is shown in a, and the results of ROC analysis are shown in b, c, and d.
- the explanation of the distribution map and the ROC analysis map is as shown in FIG.
- the results of measuring the KIAA0513 serum antibody level in HD and cancer patients by the AlphaLISA method are shown.
- the serum antibody levels of HD, esophageal cancer (EC), gastric cancer (GC), colon cancer (CC), lung cancer (LC), and breast cancer (MC) when using the KIAA0513 protein antigen are shown.
- the distribution map is shown in a, and the result of ROC analysis is shown in bf.
- the explanation of the distribution map and the ROC analysis map is as shown in FIG.
- (1) Data acquisition method of the present invention (a) Acquisition data
- the acquired data in the data acquisition method 1 of the present invention is "existence data of arterial lesions".
- Arterial lesions are abnormalities in the structure or constituents of the arteries and have forms such as occlusion, dilation, and fistula formation.
- Arteriosclerosis (atherosclerosis, arteriosclerosis, medial sclerosis), chronic inflammation and abnormal angiogenesis in solid cancer appear as the arterial lesion progresses.
- arteriosclerosis is often caused by the progression of diabetes and obesity
- arteriosclerosis, especially atherosclerosis is caused by cerebrocardiovascular disorders, chronic kidney disease, aortic aneurysm, retinopathy, foot necrosis, etc.
- the "arterial lesion data" obtained by the data acquisition method 1 of the present invention can be used as data on the possibility of development or progression of diabetes, arteriosclerosis, solid cancer, etc., and further, cerebral cardiovascular system. It can be used as latent or actual data of serious circulatory diseases such as disorders, chronic kidney diseases, aortic aneurysms, retinopathy, and foot rupture.
- the acquired data in the data acquisition method 2 of the present invention is "latent or actual data of diabetes, cerebrocardiovascular disorder, chronic kidney disease, or solid cancer".
- cerebrocardiovascular disorders include cerebral infarction, stroke, myocardial infarction, angina, and the like.
- solid cancer include esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, etc., and an increase in body fluid antibody level against KIAA0513 protein is latent or actual data for esophageal cancer, colon cancer, gastric cancer, or lung cancer. The probability is high, especially for esophageal cancer.
- the data acquisition method 2 of the present invention often overlaps with the data acquisition method 1.
- the onset of the above-mentioned disease can be predicted with high accuracy.
- serious circulatory diseases such as cerebral infarction and myocardial infarction, and solid cancer, once onset, are life-threatening and suffer from severe sequelae even if they do not lead to death. Therefore, it is best to predict the onset of these, and the anti-KIAA0513 body fluid antibody marker can be used as a biomarker for obtaining data for such onset prediction.
- the presence or absence of an underlying disease that is a factor of the aggravation of the epidemic is determined based on the data obtained by the data acquisition method 1 or 2 of the present invention.
- the treatment of infectious disease sufferers can be performed more appropriately. If the obtained data suggests, for example, the presence of an arterial lesion, it is possible to give preferential hospitalization measures to the subject suffering from the above-mentioned infectious disease to prepare for aggravation. If no such suggestion is found, it is possible to treat the patient as waiting at home, efficiently distribute the hospital medical staff, beds, etc., and take measures according to the risk of aggravation of each of the above-mentioned affected subjects. It is possible and can reduce the risk of medical care personnel due to infectious disease epidemics and the risk of medical collapse due to lack of beds.
- infectious diseases are various viral diseases, bacterial diseases, etc., and are not particularly limited as long as the presence or absence of an underlying disease is a factor of aggravation. It is desirable that the risk of aggravation be estimated by mass screening, and it is particularly suitable as a target to which the present invention in a simple form such as an immunochromatography is applied.
- infectious diseases include infectious diseases caused by beta coronaviruses such as new coronavirus (COVID-19), SARS, MARS, etc .; infectious diseases caused by influenza virus; infectious diseases caused by RS virus, adenovirus, rhinovirus, etc. Infectious diseases, but are not limited to these.
- Body fluid sample separated from the living body The body fluid of the "body fluid sample separated from the living body” used as the target of data acquisition in the data acquisition method of the present invention is blood, lymph, etc., and the “sample” is , The body fluid itself in a state separated from the body, or a processed product.
- a blood sample is preferable.
- the blood sample include samples such as whole blood, serum, and plasma, but a serum sample or a plasma sample is preferable, and a serum sample is particularly preferable.
- the blood sample may be subjected to anticoagulation treatment such as heparin treatment.
- the KIAA0513 protein of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is the basis for capturing body fluid antibodies in the data acquisition method of the present invention.
- the whole KIAA0513 protein can be used as a body fluid antibody capture antigen, or a part of the KIAA0513 protein can be used.
- an amino acid sequence (peptide) having a short chain length it is possible to select an amino acid sequence (peptide) having a short chain length, and in that case, the number of amino acid sequences is preferably about 7-30. More preferably, it is about 10 to 20 pieces.
- 10% or less of the amino acid residues (rounded down to the nearest whole number) of all or part of these amino acid sequences may be modified (deleted, substituted, or added).
- a body fluid antibody of interest KIAA0513 protein or a body fluid antibody against a peptide having a partial sequence thereof
- a body fluid antibody capture antigen candidate in which an amino acid residue is modified is described herein, for example.
- the body fluid antibody is captured by the same method as the method of the above embodiment, it is necessary to be able to obtain the data of the target arterial lesion or disease from the captured antibody level.
- the KIAA0513 antigen having a predetermined amino acid sequence can be secured according to a conventional method. Specifically, for example, based on the base sequence of the KIAA0513 gene shown in SEQ ID NO: 1 or 2, a nucleic acid amplification primer for amplifying double-stranded DNA having all or part of these base sequences is designed. , A gene amplification product by the PCR method or the like using the amplification primer was obtained as all or part of the KIAA0513 gene, and was incorporated into a prokaryotic cell expression vector such as pGEX-4T using the gene amplification product.
- the expression of all or part of the predetermined KIAA0513 gene is induced, and the expressed KIAA0513 protein is expressed. All or part of it can be purified by affinity chromatography or the like using, for example, glutathione-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences).
- GST glutthione S-transfase
- AlphaLISA Amplitude Homogeneous Assay-Linked ImmunoSorbento Assay
- the antibody level against the KIAA0513 antigen in a body fluid sample separated from a living body such as a blood sample is quantified, and the quantified value is based on a standard value (cutoff value). If it is also large, the enhancement of KIAA0513 antigen in the body fluid sample donor is confirmed, and the presence data of the arterial lesion of the test sample provider, or cerebrocardiovascular disorder, diabetes, chronic kidney disease, or It can be latent or overt data of solid tumors.
- a control sample group consisting of persons (healthy persons) who do not have any abnormalities such as diabetes, circulatory system disease, and cancer in the medical examination is set, and the sample is set.
- a body fluid sample separated from a living body is brought into contact with a immobilized product of the KIAA0513 antigen, and the antibody against the KIAA0513 antigen in the body fluid sample separated from the living body is used with the body fluid antibody capturing antigen. This can be done by detecting the binding based on the antigen-antibody reaction as a signal.
- Quantitative measurement can be performed.
- Any of the quantitative measurement means exemplified here is an established quantitative measurement means when the quantitative target substance is an antibody in a body fluid sample separated from a living body.
- a body fluid and a buffer solution mixed with a colloidal gold-bound anti-human IgG antibody are added to a cellulose membrane coated with the KIAA0513 antigen and slowly moved, and if an antibody against the KIAA0513 antigen is present in the body fluid. Since a line is formed at the applied position, it can be visually confirmed. Lateral flow test is particularly suitable for mass screening because it is easy to simplify as compared with other quantitative measurement means. That is, by applying the data acquisition method of the present invention to the immunochromatography method, it is possible to acquire desired disease-related data in a short time (about 10 minutes) even in a small-scale facility such as a clinic or a health center. It will be possible to do.
- the GST-fused KIAA0513 antigen when used as the body fluid antibody capture antigen, the glutathione-binding donor beads are used, and the body fluid antibody capture antigen, the blood sample, and the acceptor beads to which the anti-human IgG antibody is bound are mixed.
- the desired body fluid antibody can be quantified by incubating at room temperature for several hours to several days, irradiating the formed antigen-antibody complex with 680 nm light, and detecting the generated 520-620 nm light. can.
- the indirect fluorescent antibody method a body fluid sample separated from a living body is brought into contact with a protein array on which the KIAA0513 antigen is immobilized, and the formed KIAA0513 antigen-anti-KIAA0513 body fluid antibody complex is further fluorescently labeled. The next antibody can be contacted to quantify the body fluid antibody against the KIAA0513 protein.
- the labeling of the secondary antibody used in the indirect fluorescent antibody method is used as an enzyme label for quantification. The labeling of the secondary antibody can be selected in various ways.
- the KIAA0513 antigen is electrophoresed on an SDS-polyacrylamide gel, then transferred from the gel to a carrier such as a nitrocellulose membrane, and a body fluid sample separated from the living body is brought into contact with the resulting KIAA0513 antigen-anti-KIAA0513.
- Quantitative measurement can be performed by detecting the body fluid antibody complex using a secondary antibody.
- the KIAA0513 antigen-anti-KIAA0513 body fluid antibody complex formed by contacting the body fluid sample separated from the living body with the KIAA0513 antigen is subjected to turbidity (turbidimetry method) and scattered light intensity.
- Quantification can be performed by detecting the change in (Turbidimetry).
- the anti-KIAA0513 antibodies in the body fluid in which the aggregates of the latex particles are bound to the latex particles by contacting the latex particles to which the KIAA0513 antigen is bound with the body fluid sample separated from the living body. It can be quantified by forming it by the interaction of and detecting it.
- the KIAA0513 antigen-bound magnetic particles and the body fluid sample separated from the living body are brought into contact with each other to form a KIAA0513 antigen-anti-KIAA0513 antibody complex on the magnetic particles to collect magnetism and remove unreacted substances. Then, quantitative measurement can be performed by detecting the complex by subjecting it to an appropriate fluorescence treatment or the like.
- kit of the present invention for example, a set of GST-fusion KIAA0513 antigen, glutathione-binding donor beads, and anti-human IgG-binding acceptor beads, and an AlphaLISA method are used as quantitative measurement means. Can be mentioned as the composition of.
- a plate on which the above-mentioned KIAA0513 antigen is immobilized, a secondary antibody labeled with respect to the anti-KIAA0513 antibody, and a reagent for manifesting the label of the secondary antibody are used for quantitative measurement using the ELISA method.
- a plate on which the above-mentioned KIAA0513 antigen is immobilized, a secondary antibody labeled with respect to the anti-KIAA0513 antibody, and a reagent for manifesting the label of the secondary antibody are used for quantitative measurement using the ELISA method.
- the latex particles to which the above-mentioned KIAA0513 antigen is bound can be mentioned as a kit configuration for performing the latex agglutination turbidimetry method.
- the magnetic particles to which the above KIAA0513 antigen is bound, the secondary antibody labeled against the anti-KIAA0513 antibody, and the reagent for manifesting the label of the secondary antibody are used as a kit configuration for performing the CLEIA method. Can be mentioned.
- kits for performing other quantitative measurement means are also included in the scope of the kit of the present invention. Further, it is possible to further reduce the composition of the above-mentioned elements exemplified here to increase the degree of outsourcing or self-procurement of the test, and conversely, a diluent, a tube for a reagent, or the like can be used. It is also possible to increase the configuration and set the immediate use of the kit of the present invention. It is also possible to add other factors according to the specific inspection.
- Antigen protein used in this example (1) Identification of antigen protein
- a human protein microarray ProtoArray (registered trademark): manufactured by Thermo Fisher Scientific) is used, and the KIAA0513 protein is used as an antigen recognized by serum antibodies of patients with atherosclerosis. was identified.
- the plasmid vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare Life Sciences), in which the human KIAA0513 isoform a and the cDNA encoding the isoform c are separately provided with the Glutathione S-transphase (GST) gene site upstream of the cloning site. , Pittsburg, PA) at the EcoRI / SalI site, pGEX-4T-1-KIAA0513 (isoform a) and pGEX-4T-1-KIAA0513 (isoform c), which are recombinant plasmids for gene expression.
- GST Glutathione S-transphase
- the GST-KIAA0513 protein isoforms a and c in the protein extract were purified by glutathione-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences) column chromatography, respectively, and the buffer solution was replaced with PBS, which was replaced with the above-mentioned "KIAA0513 protein". ". As a control, GST was similarly purified.
- the AlphaLISA method (Amplified Luminescence Protocol Homogeneous Assay) was specifically performed using a 384-well microtiter plate (white opaque OptiPlate TM , Perkin Elmer, Waltham). Each well is diluted 100-fold with AlphaLISA-specific buffer (25 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% casein, 0.5% Triton X-100, 1 mg / mL protein-500, 0.05% Protein-300). 2.5 ⁇ L of the serum and GST or KIAA0513 protein (KIAA0513 isoform a and isoform c, respectively) (10 ⁇ g / mL) as an antigen were diluted with AlphaLISA buffer and mixed.
- AlphaLISA-specific buffer 25 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% casein, 0.5% Triton X-100, 1 mg / mL protein-500, 0.05% Protein-300.
- 2.5 ⁇ L of the serum and GST or KIAA0513 protein (10 ⁇ g / m
- Example 1 Examination in patients with transient ischemic attack (TIA) and patients with acute cerebral infarction (AIS) using the AlphaLISA method AIS is for motor function and sensory function due to stagnation of cerebral blood flow. A condition in which a large amount of damage suddenly occurs.
- Transient ischemic attack (TIA) is a disease in which brain nerve cells are damaged due to the same cause as cerebral infarction, but recover within 24 hours, often within a few minutes. Each serum sample was collected within 2 weeks after onset.
- s-KIAA0513-Abs serum KIAA0513 antibody
- AIS KIAA0513 isoform c
- SEQ ID NO: 1 The levels of serum antibody (s-KIAA0513-Abs: serum KIAA0513 antibody) against AIS and KIAA0513 isoform c (SEQ ID NO: 1) of TIA patients were examined. Healthy person (HD) sera, AIS, and TIA patient sera were obtained from Chiba Prefectural Sawara Hospital. AlphaLISA results showed that s-KIAA0513-Ab levels were significantly higher in TIA and AIS patients than in HD (FIG. 1).
- TIA which is the precursor stage of AIS
- TIA was also positively associated with the amount of serum KIAA0513 antibody. This result indicates that s-KIAA0513-Ab is effective in predicting the onset of AIS.
- Example 2 Examination in diabetic (DM) patients using the AlphaLISA method Next, the level of s-KIAA0513-Abs in DM patients was examined.
- Serum samples of HD and DM patients were obtained from Chiba University Hospital.
- the level of s-KIAA0513-Abs was significantly higher in the DM patient sample than in the HD sample (Fig. 2a).
- ROC analysis was performed to evaluate the ability of these antibody markers to indicate the presence of DM.
- the AUC value of s-KIAA0513-Abs was 0.7361, and the sensitivity and specificity values were 50.55% and 87, respectively. It was .65% (Fig. 2b).
- Example 3 Examination in patients with cardiovascular disorders (CVD) and sleep apnea syndrome (OSAS) using the AlphaLISA method Next, the levels of s-KIAA0513-Abs in CVD and OSAS patients were examined.
- CVD cardiovascular disorders
- OSAS sleep apnea syndrome
- CVD included acute myocardial infarction and unstable angina obtained from Chiba University Hospital. Since OSAS is associated with atherosclerosis and is associated with a high risk of acute cerebral infarction (AIS) and CVD, sera from OSAS patients obtained from Chiba University Hospital were also examined.
- AIS acute cerebral infarction
- the level of s-KIAA0513-Abs compared to HD was higher in both CVD and OSAS patients (FIG. 3a).
- the positive rate of s-KIAA0513-Abs in HD is 5.3%
- the positive rate of s-KIAA0513-Abs in CVD patients is 10.3%
- the positive rate of s-KIAA0513-Abs in OSAS patients is 11.6%. It was (Table 3).
- the AUC of s-KIAA0513-Abs for CVD was 0.6492 (95% CI: 0.5821-0.7163) (FIG. 3b), and the AUC of s-KIAA0513-Abs for OSAS was 0. It was revealed to be .6463 (95% CI: 0.5616-0.7309) (Fig. 3e).
- Example 4 Examination in patients with chronic kidney disease (CKD) using the AlphaLISA method Next, the level of s-KIAA0513-Abs in CKD patients closely associated with atherosclerosis was examined.
- CKD was divided into three groups as follows.
- type 1 diabetic nephropathy type 2, nephrosclerosis; type 3, glomerular nephropathy;
- Serum samples of CKD patients were obtained from the Kumamoto cohort, and serum samples of HD were obtained from Chiba University.
- Serum levels of s-KIAA0513-Abs were significantly higher than HD in all three groups of CKD (FIG. 4a). That is, the s-KIAA0513-Ab positive rates in HD, type 1 CKD patients, type 2 CKD patients, and type 3 CKD patients were 6.1%, 29.0%, 37.5%, and 20.3%, respectively. Yes (Table 4), the highest positive rate was observed in serum samples of patients with type 2 CKD.
- ROC analysis revealed that the AUC of s-KIAA0513-Abs was 0.7434 (95% CI: 0.6783-0.8085) for type 1 CKD (FIG. 4b) and 0.8080 for type 2 CKD (FIG. 4b). It was revealed that 95% CI: 0.7264-0.8897) (Fig. 4c) and 0.6906 (95% CI: 0.6177-0.7635) for type 3 CKD (Fig. 4d). ..
- Example 5 Examination in cancer patients using the AlphaLISA method Since atherosclerosis is often associated with cancer, esophageal cancer (EC), gastric cancer (GC), and colon cancer (CC) obtained from Toho University Hospital ), Lung cancer (LC), and breast cancer (MC) were examined for levels of s-KIAA0513-Abs in serum samples.
- EC esophageal cancer
- GC gastric cancer
- CC colon cancer
- LC Lung cancer
- MC breast cancer
- the levels of s-KIAA0513-Abs were significantly higher in the serum samples of all cancer patients than those of HD patients, and the highest mean of s-KIAA0513-Ab levels was observed in esophageal cancer (FIG. 5a). , Table 5).
- the AUC value of esophageal cancer was as high as 0.8300 (Fig. 5b-f).
- Example 6 Comparison of serum antibody levels when KIAA0513 isoform c and isoform a are used as antigens Healthy subjects (HD) against KIAA0513 isoform c (SEQ ID NO: 1) and KIAA0513 isoform a (SEQ ID NO: 2). ), The serum of patients with acute cerebral infarction (AIS), and the serum of patients with cardiovascular disorder (CVD) were examined by the AlphaLISA method.
- AIS acute cerebral infarction
- CVD cardiovascular disorder
- KIAA0513 isoforms c and a also showed higher antibody levels in the sera of AIS and CVD patients compared to HD (FIGS. 7a, b).
- the reactivity of KIAA0513 isoform c with respect to the serum antibody was higher than that of KIAA0513 isoform a, but the two were relatively closely correlated (FIG. 7c).
- Example 7 Correlation analysis between serum antibody level and subject data (1) Mann-Whitney U analysis Correlation analysis between s-KIAA0513-Ab level and subject data was performed on 139 HD specimens, 225 AIS patients, 44 TIA patients, and none. 665 samples from Chiba Prefectural Sawara Hospital, including 17 patients with symptomatic ischemic stroke, 122 patients with deep and subcortical leukomalacia (DSWMH), 59 patients with chronic cerebral infarction (CIS), and 41 control samples. Made using.
- s-KIAA0513-Ab levels and subject parameters including general information such as age, height, weight, BMI, maximum intima media thickening (max-IMT) ), Lifestyle factors such as smoking period (years) and alcohol intake frequency (times / week), and correlation with continuous variables of blood test data were investigated.
- a significant correlation of s-KIAA013-Abs was found between age, max-IMT, ALP, potassium, C-reactive protein (CRP), body sugar (BS), and smoking duration (Table 7). There was an inverse relationship between antibody levels and height and weight. Correlation with max-IMT indicates that s-KIAA0513-Ab levels are associated with stenosis and atherosclerosis.
- angiogenesis is indispensable for the development of solid cancer such as EC, it is considered that the abnormal formation of blood vessels in solid cancer promotes the expression of KIAA0513 protein as well as arteriosclerosis.
- DM and arteriosclerosis are known as risk factors for cancer.
- body fluid antibody markers have higher detection sensitivity for disease-related data than body fluid antigen markers.
- the KIAA0513 antigen has particularly high antigenicity, so that this anti-KIAA0513 body fluid antibody marker is extremely sensitive.
- it can be detected as latent or overt disease data for cancer, cerebral infarction, myocardial infarction, diabetes, chronic kidney disease, etc., which have fatal results for humans, as well as abnormalities in arteriosclerosis and solid cancer. It has been found that it is even possible to detect data indicating the presence of arterial lesions such as diabetic angiogenesis.
- the present invention it is possible to comprehensively detect the presence or absence of an underlying disease, which is an element that aggravates an infectious disease, by a single biomarker.
- an underlying disease which is an element that aggravates an infectious disease
- COVID-19 new coronavirus
- influenza virus it is possible to efficiently perform medical personnel, hospital beds, etc. It is possible to provide a proper distribution and more appropriate treatment.
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Abstract
本発明は、動脈病変、さらには、早期診断等の健康管理により発生や進行を抑えることができる、糖尿病、心疾患、脳血管障害、がん、腎臓病等に関する、包括的なバイオマーカーを提供することを課題とし、本発明者らは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、動脈病変の存在データ、或いは、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得することにより、上記の課題を解決することができることを見出した。
Description
本発明は疾患のデータ取得手段ないし検出手段に関する発明であり、より具体的にはＫＩＡＡ０５１３蛋白質、又はこれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体をバイオマーカーとして測定することによる、動脈病変に関するデータ取得手段ないし検出手段、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、固形癌等に関するデータ取得手段ないし検出手段に関する発明である。
近年はさまざまな疾患バイオマーカーが発見され、簡便な血液検査等により病状把握、発病予測、予後予測、予防／治療標的の同定などの目的で開発が進められている。バイオマーカーも古くは酵素マーカー、抗原マーカー、そして近年ではＤＮＡ／ＲＮＡマーカーが報告されている。一方、体液抗体マーカーはまだ報告例は少なく、実用化された例も少ない。脳心臓血管障害においても抗体マーカーが同定されている。たとえば、急性脳梗塞（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ；ＡＩＳ）の抗体マーカーとしてＨｓｐ６０（非特許文献１）、ＲＰＡ２（非特許文献２）、ＳＯＳＴＤＣ１（非特許文献３）、ＰＤＣＤ１１（非特許文献４）、ＭＭＰ１、ＣＢＸ１、及びＣＢＸ５（非特許文献５）；アテローム性動脈硬化症のマーカーとしてＡＴＰ２Ｂ４（非特許文献６）、ＢＭＰ－１（非特許文献２、６）、ＤＨＰＳ（非特許文献７）、ＳＨ３ＢＰ５（非特許文献８）、ｐｒｏｌｙｌｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ（非特許文献９）；急性冠症候群のｎａｒｄｉｌｙｓｉｎ（ＮＲＤ１）（非特許文献１０）；糖尿病（ＤＭ）のマーカーとしてＴＵＢＢ２Ｃ（非特許文献１１）、インスリン（非特許文献１２）、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（非特許文献１３）、アディポネクチン（非特許文献１４）、ＧＡＤＤ３４（非特許文献１５）等がある。
また、がんの抗体バイオマーカーとしては、抗ｐ５３抗体が食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）や頭頸部癌の診断、モニタリング、予後予測に役立つマーカーとして実用化されている（非特許文献１６、１７）。本発明者らのグループは組換えｃＤＮＡ発現クローニング（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ； ＳＥＲＥＸ）法によりスクリーニングし、ＥＳＣＣの抗体マーカーとしてＴｒｏｐ２／ＴＡＣＳＴＤ２（非特許文献１８）、ＳＬＣ２Ａ１（非特許文献１９）、ＴＲＩＭ２１（非特許文献２０）、ｍｙｏｍｅｇａｌｉｎ（非特許文献２１）、ｍａｋｏｒｉｎ １（非特許文献２２）、ＥＣＳＡ（非特許文献２３）、及びｃｙｃｌｉｎ Ｌ２（ＣＣＮＬ２）（非特許文献２４）；大腸癌に対するＦＩＲ ／ ＰＵＦ６０（非特許文献２５）；及びグリオーマに対するＳＨ３ＧＬ１（非特許文献２６）及び抗フィラミンＣ（非特許文献２７）を発見し報告した。
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がん、心疾患、脳血管疾患、腎不全は日本人の死因のそれぞれ第１位、第２位、第４位、第８位を占める（厚生労働省２０１８年人口動態統計）。その他の第３位、第５位、第６位、第７位、第９位、第１０位はそれぞれ老衰、肺炎、不慮の事故、誤嚥性肺炎、認知症、自殺である。また、ＷＨＯによると、２０１９年の世界における死因の第１位は虚血性心疾患、第２位は脳卒中、第５位が気管・気管支・肺癌、第８位が糖尿病、第９位が腎臓病である。上記死因の中で、がん、心疾患、脳血管疾患、腎不全、さらにこれらの器質的な疾患のリスクファクターとなる糖尿病は早期診断等の健康管理により発症や進行を抑えることができる病気である。従って、疾患マーカーを用いて、それらに対する適切な処置、治療、生活指導等を行うことができれば、ヒトの健康増進に大いに貢献できる。
さらに２０２０年現在、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）が世界的に流行しており、新型コロナウイルスが重篤化する要素として、「糖尿病、心疾患、脳血管疾患、がん、腎臓病等の基礎疾患の有無」が挙げられている。新型コロナウイルスのみならず、これらの基礎疾患の有無は、感染症の重篤化の一般的な要素であるともいえる。従って、かかる感染症の重篤化の要素である「基礎疾患の有無」を手軽に判定するバイオマーカーの提供が急務となっている。
このことを踏まえて背景技術についてさらに検討すると、上記のアテローム性動脈硬化症のマーカーであるＡＴＰ２Ｂ４、ＢＭＰ－１、ＤＨＰＳの体液抗体は、食道癌の患者血清においても上昇していた（非特許文献６、７）。このことはアテローム性動脈硬化等の動脈硬化が代表例として挙げられる「動脈の病変」が、発がんを促進することを示している。実際に、「動脈の病変」の例として挙げられる「血管新生」は、固形癌の進展に必須であり（非特許文献２８）、動脈硬化を誘導する糖尿病や肥満は、大腸癌や食道癌のリスクファクターとなっている（非特許文献２９、３０、３１）。そして、体内の臓器や器官は多かれ少なかれ相互に影響を与えている（非特許文献３２）のであるから、動脈硬化や血管新生等の「動脈の病変」を検出することができれば、脳心臓血管障害、糖尿病、腎臓病、固形癌等の徴候を捉えることが可能になり、さらにこれらの疾病の早期発見にも繋がるものと考えられる。これらの疾患は生命に関わる重大疾患であり、単一のバイオマーカーで、その徴候の検出や早期発見が可能となれば、その意義は大きい。
また、感染症の重篤化の要素となる「基礎疾患の有無」を、単一のバイオマーカーで簡易に判定する手段を提供する意義も非常に大きい。
本発明者らは、体液中のＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する抗体レベルの上昇を測定することにより、動脈病変の存在を検出し、これを、動脈病変を伴う疾患の兆候若しくは存在のデータとして取得できることを見出した。さらに、上記体液抗体レベルの上昇を測定することにより、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得できることを見出した。さらに、上記脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データは、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとすることもできることを見出した。さらに、体液中のＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変の存在を検出し、これを、動脈病変を伴う疾患の徴候若しくは存在のデータ、或いは、上記脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして、感染症の重篤化の要素となる基礎疾患の有無の判断が可能であることを見出した。
すなわち本発明は、第１に、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１又は２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、動脈病変の存在データとして取得する、データ取得方法（以下、「本発明のデータ取得方法１」ともいう）を提供する。
第２に、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１又は２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得する、データ取得方法（以下、「本発明のデータ取得方法２」ともいう）を提供する。
本発明のデータ取得方法２で得られる疾病の発症データは、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとして取得することが可能である。
本明細書において、「本発明のデータ取得方法」と記載されている場合は、特に断らない限り、本発明のデータ取得方法１と２を総称するものである。
ＫＩＡＡ０５１３蛋白質には３つのスプライシングバリアントが知られている。アイソフォームｃ（３０１アミノ酸、ＮＰ＿００１２８４６９５．１：配列番号１）、アイソフォームｂ（３０１アミノ酸、ＮＰ＿００１２７３４９５．１）、及びアイソフォームａ（４１１アミノ酸、ＮＰ＿０５５５４７．１：配列番号２）である。
ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ及びｂの全長３０１アミノ酸は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの最初の３０１アミノ酸と完全に同じである。ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ及びｂは、各々がコードされるｍＲＮＡ前駆体の塩基配列は異なるが、スプライシングを受けた成熟ｍＲＮＡを鋳型として発現するＫＩＡＡ０５１３蛋白質、としてのアミノ酸配列は同一である。従って、本明細書では、特に断らずに「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」と記載する場合は、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質アイソフォームｂ及び／又はｃ（配列番号１）を意味し、アイソフォームａの場合は別途明記する。
本発明者らはまた、ＧＳＴ－ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａを精製し、健常者（ＨＤ）血清、急性脳梗塞（ＡＩＳ）の患者血清、及び心血管障害（ＣＶＤ）の患者血清におけるＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体を調べた（実施例６）。
その結果、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａは、ＨＤと比較して、ＡＩＳ患者及びＣＶＤ患者の血清において、より高い抗体レベルを示し（図７ａ、ｂ）、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの反応性は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの反応性より高かったが、相対的には両者は密接に相関していた（図７ｃ）。
これは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体の主要なエピトープ部位は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びｂの最初の３０１アミノ酸に位置していることを意味している。このことは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体を、抗原抗体反応を用いて検出するために用いる、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の一部」は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、ｂ、及びａの上記の重複アミノ酸配列の領域を含めることが好適であることがわかる。
本発明のデータ取得方法の別の表現として、例えば、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変を検出する方法。」、及び、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を、診断或いは検出する方法。」等が挙げられる。
さらに、本発明は、本発明のデータ取得方法１又は２を行うための、データ取得用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。
本発明のデータ取得用キットの別の表現として、例えば、上記の「『ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変を検出する方法、』、及び、『ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を、診断或いは検出する方法、』等を行うためのキット。」が挙げられる。
本発明により、第１に、動脈病変の存在のデータを取得することが可能となる。これらにより、動脈病変を伴う疾患の兆候、存在を把握し、当該データに基づいた生活指導、投薬等の措置を行う途を提供することにより、健康増進や疾病の予防・治療に貢献することが可能である。第２に、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データを取得することが可能になる。これにより、上記重篤疾患の発症予測、及び早期検出を行い、当該データに基づいた生活指導、投薬等の措置を行う途を提供することにより、疾病の予防・治療に貢献することが可能である。
さらに本発明により、感染症の重篤化の要素となる基礎疾患の有無を判断する基礎データが提供される。
（１）本発明のデータ取得方法
（ａ）取得データ
本発明のデータ取得方法１における取得データは、「動脈病変の存在データ」である。動脈病変は、動脈の構造又は構成因子の異常であり、閉塞、拡張、瘻形成等の形態がある。動脈硬化（アテローム動脈硬化、細動脈硬化、中膜硬化）、慢性炎症や固形癌における異常な血管新生等が、動脈病変の進行に伴って顕れる。また、動脈硬化は多くの場合、糖尿病や肥満の進行により引き起こされることが知られており、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等は、動脈硬化、特に、アテローム動脈硬化の進行に伴い引き起こされることが知られている。糖尿病や肥満は、固形癌（大腸癌、食道癌等）のリスクファクターでもある。従って、本発明のデータ取得方法１により得られる「動脈病変のデータ」は、糖尿病、動脈硬化、固形癌等の発生や進行の可能性のデータとして用いることが可能であり、さらに、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等の重篤な循環系疾患の潜在又は顕在のデータとして用いることができる。
（ａ）取得データ
本発明のデータ取得方法１における取得データは、「動脈病変の存在データ」である。動脈病変は、動脈の構造又は構成因子の異常であり、閉塞、拡張、瘻形成等の形態がある。動脈硬化（アテローム動脈硬化、細動脈硬化、中膜硬化）、慢性炎症や固形癌における異常な血管新生等が、動脈病変の進行に伴って顕れる。また、動脈硬化は多くの場合、糖尿病や肥満の進行により引き起こされることが知られており、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等は、動脈硬化、特に、アテローム動脈硬化の進行に伴い引き起こされることが知られている。糖尿病や肥満は、固形癌（大腸癌、食道癌等）のリスクファクターでもある。従って、本発明のデータ取得方法１により得られる「動脈病変のデータ」は、糖尿病、動脈硬化、固形癌等の発生や進行の可能性のデータとして用いることが可能であり、さらに、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等の重篤な循環系疾患の潜在又は顕在のデータとして用いることができる。
本発明のデータ取得方法２における取得データは、「糖尿病、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在のデータ」である。脳心臓血管障害としては、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、狭心症等が挙げられる。また、固形癌としては、食道癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌等が挙げられ、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体レベルの上昇は、食道癌、大腸癌、胃癌、又は肺癌についての潜在若しくは顕在データとしての確度が高く、特に食道癌についての確度が高い。本発明のデータ取得方法２は、データ取得方法１と重なり合う場合が多い。
例えば、被験者に対して定期的に本発明のデータ取得方法１又は２を行い、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」に対する体液抗体レベルをモニタリングすることにより、上記した疾患の発症の予測を確度良く行うことができる。特に、脳梗塞や心筋梗塞等の循環系の重篤な疾患や、固形癌は一度発症すると生命の危険を伴い、たとえ死に至らなくとも重い後遺症に悩まされる。従って、これらの発症を予測することが最善であり、抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体マーカーはそのような発症予測のデータ取得を行うためのバイオマーカーとして用いることができる。
さらに、特定の感染症の流行が認められる際に、その重症化の要素となる基礎疾患の有無を、本発明のデータ取得方法１又は２により得られたデータを基に判断することにより、当該感染症罹患者の扱いをより適切に行うことができる。得られたデータが、例えば動脈病変の存在を示唆する場合には、上記感染症に罹患した被験者の優先的な入院措置を行い、重症化に備えることが可能である。そのような示唆が認められない場合には自宅待機扱いとして、病院の医療担当者やベッド等の効率的な分配を行い、上記の罹患した被験者各々の重症化リスクに応じた処置を行うことが可能であり、感染症流行による医療担当者やベッド不足による医療崩壊リスクを減じることができる。
上記の感染症は、各種ウイルス疾患、細菌疾患等であって、基礎疾患の有無が重症化の要素となるものであれば特に限定されないが、特に、流行規模が大きい、気道系の感染症は、集団検診により重症化リスクが見積もられるのが望ましく、特に、イムノクロマト等の簡便な形態とした本発明を適用する対象として好適である。上記の感染症としては、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳ、ＭＡＲＳ等のベータコロナウイルスによる感染症；インフルエンザウイルスによる感染症；ＲＳウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス等による感染症等の気道系の感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（ｂ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
（ｃ）体液抗体捕捉抗原（ＫＩＡＡ０５１３抗原）
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎である。当該ＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７－３０個程度が好適であり、さらに好適には１０－２０個程度である。
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎である。当該ＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７－３０個程度が好適であり、さらに好適には１０－２０個程度である。
また、これらのアミノ酸配列の全部又は一部のうち、１０％以下の個数のアミノ酸残基（小数点以下は切り捨て）が、改変（欠失、置換、又は、追加）されていてもよい。ただし、目的の体液抗体（ＫＩＡＡ０５１３蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体）の捕捉が可能であること、すなわち、アミノ酸残基を改変した体液抗体捕捉抗原候補が、例えば、本明細書の実施例の手法と同様の手法で体液抗体の捕捉を行った場合に、その捕捉抗体レベルから、目的とする動脈病変や疾患のデータを取得可能であることが必要である。
「欠失」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、対象となるアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。Ｎ末端とＣ末端における新たな１個以上のアミノ酸残基の付加も、この「付加」の概念に含まれる。これらの「付加」されたアミノ酸残基の個数が「アミノ酸付加の個数」として数えられる。以下、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部」を「ＫＩＡＡ０５１３抗原」ともいう。
所定のアミノ酸配列のＫＩＡＡ０５１３抗原は、常法に従って確保することが可能である。具体的には、例えば、配列番号１又は２に示すＫＩＡＡ０５１３遺伝子の塩基配列に基づいて、これらの塩基配列の全部若しくは一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物を、ＫＩＡＡ０５１３遺伝子の全部若しくは一部として得て、これを用いてｐＧＥＸ－４Ｔ等の原核細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択し、さらにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の薬物を添加することにより所定のＫＩＡＡ０５１３遺伝子の全部若しくは一部の発現を誘導し、発現されたＫＩＡＡ０５１３蛋白質の全部若しくは一部を、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
また、これらのＫＩＡＡ０５１３抗原として用いられる蛋白質又はペプチドには、必要に応じて適宜修飾構造を付加することができる。例えば、後述するように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法において用いられる、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）－融合化蛋白質又はペプチドや、ビオチン融合化蛋白質又はペプチドとすること等も可能である。
（ｄ）データ取得の実際
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＫＩＡＡ０５１３抗原、に対する抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＫＩＡＡ０５１３抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈病変の存在データ、或いは、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとすることが可能である。
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＫＩＡＡ０５１３抗原、に対する抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＫＩＡＡ０５１３抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈病変の存在データ、或いは、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとすることが可能である。
被験試料におけるＫＩＡＡ０５１３抗原に対する体液抗体レベルの標準値は、例えば、健康診断において糖尿病、循環系疾患、癌等の異常が認められない者（健常者）からなる対照の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料におけるＫＩＡＡ０５１３抗原に対する上記体液抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
上記体液抗体レベルの測定は、例えば、ＫＩＡＡ０５１３抗原の固定化物に、生体から分離された体液サンプルを接触させ、当該生体から分離された体液サンプル内のＫＩＡＡ０５１３抗原に対する抗体の当該体液抗体捕捉抗原との抗原抗体反応に基づく結合をシグナルとして検出することにより、行うことができる。具体的には、イムノクロマト法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量測定を行うことができる。ここに例示したいずれの定量測定手段も、定量標的物質を生体から分離された体液サンプル中の抗体とした場合の、確立した定量測定手段である。
例えば、イムノクロマト法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を塗布したセルロース膜に、体液、及び、金コロイド結合抗ヒトＩｇＧ抗体を混合した緩衝液を加えてゆっくりと移動させ、体液中にＫＩＡＡ０５１３抗原に対する抗体が存在すれば、塗布した位置にラインが形成されるので、目視で確認できる。イムノクロマト法は、他の定量測定手段と比べて簡便化することが容易であるため、特に集団検診に適している。すなわち、本発明のデータ取得方法をイムノクロマト法に適用することで、診療所（クリニック）等の小規模施設や、保健所等においても、短時間（１０分程度）で所望の疾病関連データの取得を行うことが可能となる。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法では、ＧＳＴ－融合ＫＩＡＡ０５１３抗原を体液抗体捕捉抗原とする場合は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズを用い、体液抗体捕捉抗原、血液サンプル、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させたアクセプタービーズを混合し、数時間から数日、室温でインキュベートし、形成された抗原抗体複合体に６８０ｎｍの光を照射し、発生した５２０－６２０ｎｍの光を検出することにより、所望の体液抗体の定量を行うことができる。間接蛍光抗体法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を固定化したプロテインアレイに生体から分離された体液サンプルを接触させて、形成されたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、生体から分離された体液サンプルを接触させて、生じたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体を、二次抗体を用いて検出することにより定量測定を行うことができる。比濁法や比朧法では、生体から分離された体液サンプルとＫＩＡＡ０５１３抗原を接触させることにより形成されたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体を、濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させたラテックス粒子と生体から分離された体液サンプルとを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体をラテックス粒子に結合した、体液中の抗ＫＩＡＡ０５１３抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原の結合磁性粒子と生体から分離された体液サンプルを接触させて、磁性粒子上にＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量測定を行うことができる。
（２）本発明のキットについて
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ－融合ＫＩＡＡ０５１３抗原、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ－融合ＫＩＡＡ０５１３抗原、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を固定化したプレート、抗ＫＩＡＡ０５１３抗体に対する、標識がなされた二次抗体、当該二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＥＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための、本発明のキットの構成として挙げることができる。
また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。
また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させた磁性粒子と、抗ＫＩＡＡ０５１３抗体に対する標識がなされた二次抗体、当該二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。
ここに挙げたこれらのキットの構成はあくまでも例示であり、他の定量測定手段を行うためのキットも本発明キットの範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、本発明のキットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査に応じた他の要素を加味することも可能である。
以下、本発明の実施例を開示する。
［製造例と解析手法］
＜本実施例において用いた抗原蛋白質＞
（１）抗原蛋白質の同定
本実施例においては、ヒト蛋白質マイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。
＜本実施例において用いた抗原蛋白質＞
（１）抗原蛋白質の同定
本実施例においては、ヒト蛋白質マイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。
「ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ」（配列番号２）の、Ｎ末端がＧＳＴ修飾された４１１アミノ酸全長領域、又はＮ末端から３０１アミノ酸領域部分を用いた。後者の「Ｎ末端から３０１アミノ酸領域部分」はＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）である。
（２）抗原蛋白質の調製（ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の発現と精製）
ヒトＫＩＡＡ０５１３蛋白質は下記の要領で調製した。
ヒトＫＩＡＡ０５１３蛋白質は下記の要領で調製した。
ヒトＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ、及びアイソフォームｃをコードするｃＤＮＡを、それぞれ別々にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＫＩＡＡ０５１３（アイソフォームａ）と、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＫＩＡＡ０５１３（アイソフォームｃ）をそれぞれ作製し、これらを大腸菌ＢＬ－２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、それぞれのＫＩＡＡ０５１３ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ－ＫＩＡＡ０５１３蛋白質アイソフォームａとｃは、それぞれ、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
＜ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析＞
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）は、具体的には、３８４穴マイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行った。各ウェルに、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１％ ｃａｓｅｉｎ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１ｍｇ／ｍＬ ｄｅｘｔｒａｎ－５００，０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００）で１００倍希釈した血清を２．５μＬ、及び、抗原となるＧＳＴ、又はＫＩＡＡ０５１３蛋白質（ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａとアイソフォームｃそれぞれ）（１０μｇ／ｍＬ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。６－８時間室温でインキュベートした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）、及び、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－、又はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）をＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。１－１４日間、室温で放置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生じた光子の数を測定して、「Ａｌｐｈａ Ｃｏｕｎｔ」とした。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の場合はコントロールのＧＳＴを、上記ビオチン化ペプチドの場合は緩衝液コントロールの値を差し引いて、ＫＩＡＡ０５１３抗原に特異的な抗体レベルを算出した。
［実施例１］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ＡＩＳ）患者における検討
ＡＩＳとは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
ＡＩＳとは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
ＡＩＳ、及びＴＩＡ患者のＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）に対する血清抗体（ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓ：血清ＫＩＡＡ０５１３抗体）のレベルを調べた。健常者（ＨＤ）の血清、ＡＩＳ、及びＴＩＡの患者の血清は、千葉県立佐原病院から入手した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの結果は、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂのレベルがＨＤよりも、ＴＩＡ及びＡＩＳの患者で有意に高かった（図１）。
ＨＤ値の平均プラス２×標準偏差（ＳＤ）のカットオフ値を使用すると、ＨＤ、ＡＩＳ患者、ＴＩＡ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性率は、それぞれ０．０％、７．６％、１５．６％であった（表１）。
ＲＯＣ分析により、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＡＩＳ（図１ｂ）に対して０．６４３９ ［９５％信頼区間（ＣＩ）＝０．５８７３－０．７００４］、及び、ＴＩＡの場合は、０．６６０４（９５％ＣＩ＝０．５６３３－０．７５７５）（図１ｃ）。
従って、ＡＩＳの前駆段階であるＴＩＡも同様に、血清ＫＩＡＡ０５１３抗体量と正に連関していた。この結果はｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂがＡＩＳの発症予測に有効であることを示している。
［実施例２］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた糖尿病（ＤＭ）患者における検討
次に、ＤＭ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
次に、ＤＭ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
ＨＤ及びＤＭ患者の血清サンプルは、千葉大学医学部附属病院から入手した。
ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルは、ＨＤのサンプルよりもＤＭの患者のサンプルで有意に高かった（図２ａ）。
ＨＤサンプルの値の平均プラス２×ＳＤをカットオフ値とすると、ＨＤ及びＤＭ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂの陽性率は、それぞれ２．５％及び２６．５％であった（表２）。
ＲＯＣ分析を行って、これらの抗体マーカーがＤＭの存在を示す能力を評価したところ、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣ値は０．７３６１で、感度と特異度の値はそれぞれ５０．５５％と８７．６５％であった（図２ｂ）。
［実施例３］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた心血管障害（ＣＶＤ）及び睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）患者における検討
次に、ＣＶＤ及びＯＳＡＳ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
次に、ＣＶＤ及びＯＳＡＳ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
ＣＶＤには、千葉大学医学部附属病院から入手した急性心筋梗塞と不安定狭心症が含まれていた。ＯＳＡＳはアテローム性動脈硬化症に関連し、急性期脳梗塞（ＡＩＳ）及びＣＶＤの高いリスクで関連しているため、千葉大学医学部附属病院から入手したＯＳＡＳ患者の血清も調べた。
その結果、ＨＤと比較したｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルは、ＣＶＤ及びＯＳＡＳ患者の双方において高かった（図３ａ）。ＨＤにおけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は５．３％、ＣＶＤ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は１０．３％、及びＯＳＡＳ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は１１．６％であった（表３）。
ＲＯＣ分析により、ＣＶＤに対するｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣは、０．６４９２（９５％ＣＩ：０．５８２１－０．７１６３）（図３ｂ）、及び、ＯＳＡＳに対するｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣは、０．６４６３（９５％ＣＩ：０．５６１６－０．７３０９）（図３ｅ）であることが明らかになった。
ＣＶＤのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂのＰ値が低いこと（０．０００１未満）と比較すると、ＯＳＡＳのＰ値は０．００１３であった。これは、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂマーカーとＯＳＡＳの関連がＣＶＤと比べて低いことを示唆している（表３）。すなわち、ＯＳＡＳは、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂマーカーに直接対応しているのではなく、ＯＳＡＳから併発するＣＶＤ等を介して間接的に対応していると推定された。
［実施例４］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における検討
次に、アテローム性動脈硬化に密接に関連しているＣＫＤ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
次に、アテローム性動脈硬化に密接に関連しているＣＫＤ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
ＣＫＤは次のように３つのグループに分けた。
すなわち、１型、糖尿病性腎症；２型、腎硬化症；３型、糸球体腎症；と分類した。
ＣＫＤ患者の血清サンプルは熊本コホートから、ＨＤの血清サンプルは千葉大学から取得した。
ＣＫＤの上記３つのグループすべてにおいて、ＨＤよりもｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの血清レベルが有意に高かった（図４ａ）。すなわち、ＨＤ、１型ＣＫＤ患者、２型ＣＫＤ患者、３型ＣＫＤ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性率は、それぞれ６．１％、２９．０％、３７．５％、及び２０．３％であり（表４）、最も高い陽性率は２型ＣＫＤの患者の血清サンプルにおいて観察された。
ＲＯＣ分析により、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣが、１型ＣＫＤ（図４ｂ）では０．７４３４（９５％ＣＩ：０．６７８３-０．８０８５）、２型ＣＫＤ（図４ｂ）では０．８０８０（９５％ＣＩ：０．７２６４-０．８８９７）（図４ｃ）、及び３型ＣＫＤでは０．６９０６（９５％ＣＩ：０．６１７７-０．７６３５）であることが明らかになった（図４ｄ）。
［実施例５］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた癌患者における検討
アテローム性動脈硬化症はしばしば癌に関連しているため、東邦大学病院から入手した食道癌（ＥＣ）、胃癌（ＧＣ）、結腸癌（ＣＣ）、肺癌（ＬＣ）、及び乳癌（ＭＣ）の患者からの血清サンプルにおけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
アテローム性動脈硬化症はしばしば癌に関連しているため、東邦大学病院から入手した食道癌（ＥＣ）、胃癌（ＧＣ）、結腸癌（ＣＣ）、肺癌（ＬＣ）、及び乳癌（ＭＣ）の患者からの血清サンプルにおけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。
その結果、ＨＤの患者に比べ、すべての癌患者の血清サンプルにおいて、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルが有意に高く、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルの最高平均値は食道癌で観察された（図５ａ、表５）。ＲＯＣ分析においても、食道癌のＡＵＣ値は０．８３００と高かった（図５ｂ－ｆ）。
次に、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルが手術後の食道癌（ＥＣ）及び胃癌（ＧＣ）患者の生存に関連しているかどうかを調べた。ＲＯＣ分析によって得られたカットオフ値を使用して、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルを陽性と陰性に分けた（図５ｂ、ｃ）。その結果、食道癌のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性群と陰性群の間で全生存に有意差はなかったが（Ｐ＝０．３５０９）、抗体陽性群は手術後期（４０－６０週間）で予後不良の傾向を示した（図６ａ）。一方、胃癌のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性群と陰性群の間では生存率に明らかな違いは見られなかった（図６ｂ）。
［実施例６］ ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びアイソフォームａを抗原としたときの血清抗体レベルの比較
ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）、及びＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ（配列番号２）に対する健常者（ＨＤ）の血清、急性脳梗塞（ＡＩＳ）の患者血清、及び心血管障害（ＣＶＤ）の患者血清における抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により調べた。
ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）、及びＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ（配列番号２）に対する健常者（ＨＤ）の血清、急性脳梗塞（ＡＩＳ）の患者血清、及び心血管障害（ＣＶＤ）の患者血清における抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により調べた。
その結果、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａは同様に、ＨＤと比較して、ＡＩＳ及びＣＶＤ患者の血清でより高い抗体レベルを示した（図７ａ、ｂ）。そして、血清抗体に対するＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの反応性は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの反応性より高かったが、相対的には両者は密接に相関していた（図７ｃ）。
これは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体の主要なエピトープ部位は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの３０１アミノ酸に位置していることを意味している。
［実施例７］血清抗体レベルと被験者データの相関解析
（１）Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと被験者データの相関解析は、ＨＤ１３９検体、ＡＩＳ患者２２５人、ＴＩＡ患者４４人、無症候性虚血性脳卒中患者の１７検体、深部及び皮質下白質軟化症（ＤＳＷＭＨ）患者の１２２検体、慢性期脳梗塞（ＣＩＳ）患者５９検体、対照検体４１人を含む千葉県立佐原病院の６６５検体を使用して行われた。
（１）Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと被験者データの相関解析は、ＨＤ１３９検体、ＡＩＳ患者２２５人、ＴＩＡ患者４４人、無症候性虚血性脳卒中患者の１７検体、深部及び皮質下白質軟化症（ＤＳＷＭＨ）患者の１２２検体、慢性期脳梗塞（ＣＩＳ）患者５９検体、対照検体４１人を含む千葉県立佐原病院の６６５検体を使用して行われた。
この分析では、マンホイットニーＵ検定を使用して、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルを、男性／女性間、ＤＭ、高血圧（ＨＴ）、ＣＶＤ、脂質異常症、及び肥満［肥満指数（ＢＭＩ）２５未満で「普通又は痩せ」、２５以上で「肥満」］の有無；喫煙及びアルコール摂取習慣の有無の間で比較した。その結果、有意差は、ＨＴの有無でのみ観察された（表６）。
（２）Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析
Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析を用いて、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと、年齢、身長、体重、ＢＭＩなどの一般的な情報を含む被験者パラメーター、最大内膜中膜肥厚（ｍａｘ－ＩＭＴ）を含む動脈狭窄の程度、喫煙期間（年）やアルコール摂取頻度（回／週）などのライフスタイル要因、血液検査データの連続変数との相関関係を調べた。ｓ－ＫＩＡＡ０１３－Ａｂｓの有意な相関は、年齢、ｍａｘ－ＩＭＴ、ＡＬＰ、カリウム、Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）、体糖（ＢＳ）、及び喫煙期間との間に認められた（表７）。抗体レベルと、身長及び体重との間には逆関係が見られた。ｍａｘ－ＩＭＴとの相関は、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルが狭窄及びアテローム性動脈硬化に関連していることを示している。
Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析を用いて、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと、年齢、身長、体重、ＢＭＩなどの一般的な情報を含む被験者パラメーター、最大内膜中膜肥厚（ｍａｘ－ＩＭＴ）を含む動脈狭窄の程度、喫煙期間（年）やアルコール摂取頻度（回／週）などのライフスタイル要因、血液検査データの連続変数との相関関係を調べた。ｓ－ＫＩＡＡ０１３－Ａｂｓの有意な相関は、年齢、ｍａｘ－ＩＭＴ、ＡＬＰ、カリウム、Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）、体糖（ＢＳ）、及び喫煙期間との間に認められた（表７）。抗体レベルと、身長及び体重との間には逆関係が見られた。ｍａｘ－ＩＭＴとの相関は、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルが狭窄及びアテローム性動脈硬化に関連していることを示している。
同様の結果は、他のコホートを使用しても確認された。ＣＫＤコホート（３００例）のＳｐｅａｒｍａｎ相関解析は、プラークスコア、ｍａｘ－ＩＭＴ、及びＣＡＶＩ（右）との有意な相関を示した。これらはすべてアテローム性動脈硬化症の指標である（表８）。ＣＲＰはＣＫＤコホートのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓとも関連しており、炎症の関与を示している。一方、ＣＫＤコホートでは、年齢、身長、体重、ＢＭＩ、カリウムはｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓと有意な相関を示さなかった。ＡＩＳは年齢と密接に関連しており、かつ、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓはＡＩＳとの正の相関が認められるので、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓと加齢は、間接的に関連している可能性がある。
［実施例のまとめ］
ヒト蛋白質マイクロアレイを用いた一次スクリーニングによって、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。その後、組換えＧＳＴタグ付きＫＩＡＡ０５１３蛋白質を精製した。この精製蛋白質を抗原として使用して、血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡで調べた。その結果、ＡＩＳ、ＴＩＡ、ＤＭ、ＣＶＤ、ＯＳＡ、ＣＫＤ、ＥＣ、ＧＣ、ＣＣ、ＬＣ、及びＭＣの患者で、ＨＤよりも有意に高いレベルのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓを示した（図１－５、表１－５）。これらの疾患の中で、特に高いＡＵＣ値は、ＤＭ、タイプ２ ＣＫＤ、及びＥＣで観察された（図２、４、５）。さらに相関分析により、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルがｍａｘ－ＩＭＴ、プラークスコア、及びＣＡＶＩとよく正相関していることがわかった。これらはすべて、アテローム性動脈硬化症関連病変の指標である（表７、８）。一方、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルはＢＳとは弱く相関したが（Ｐ＝０．０２２９）（表７）、典型的なＤＭマーカーであるＨｂＡ１ｃとは相関が認められなかった（表７）。従って、ＤＭ患者はＨＤと比較して高いＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルを示したが、この抗体マーカーは、主にＤＭにおける血糖値の上昇を反映しているのではなく、ＤＭによって誘導される動脈硬化病変に対応していると考えられる。また、血管新生はＥＣをはじめとする固形癌の進展に必要不可欠であるので、固形癌における血管の異常形成が、動脈硬化と同じくＫＩＡＡ０５１３蛋白質の発現を促進していると考えられる。実際に、ＤＭや動脈硬化症は癌のリスクファクターとして知られている。
ヒト蛋白質マイクロアレイを用いた一次スクリーニングによって、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。その後、組換えＧＳＴタグ付きＫＩＡＡ０５１３蛋白質を精製した。この精製蛋白質を抗原として使用して、血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡで調べた。その結果、ＡＩＳ、ＴＩＡ、ＤＭ、ＣＶＤ、ＯＳＡ、ＣＫＤ、ＥＣ、ＧＣ、ＣＣ、ＬＣ、及びＭＣの患者で、ＨＤよりも有意に高いレベルのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓを示した（図１－５、表１－５）。これらの疾患の中で、特に高いＡＵＣ値は、ＤＭ、タイプ２ ＣＫＤ、及びＥＣで観察された（図２、４、５）。さらに相関分析により、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルがｍａｘ－ＩＭＴ、プラークスコア、及びＣＡＶＩとよく正相関していることがわかった。これらはすべて、アテローム性動脈硬化症関連病変の指標である（表７、８）。一方、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルはＢＳとは弱く相関したが（Ｐ＝０．０２２９）（表７）、典型的なＤＭマーカーであるＨｂＡ１ｃとは相関が認められなかった（表７）。従って、ＤＭ患者はＨＤと比較して高いＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルを示したが、この抗体マーカーは、主にＤＭにおける血糖値の上昇を反映しているのではなく、ＤＭによって誘導される動脈硬化病変に対応していると考えられる。また、血管新生はＥＣをはじめとする固形癌の進展に必要不可欠であるので、固形癌における血管の異常形成が、動脈硬化と同じくＫＩＡＡ０５１３蛋白質の発現を促進していると考えられる。実際に、ＤＭや動脈硬化症は癌のリスクファクターとして知られている。
現状では、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の機能についてはほとんどわかっていないが、シナプス伝達やアポトーシス誘導に関わる蛋白質と結合すると報告されていることから、少なくともこれらのシグナル伝達に関与していると推定されている。
一般に体液抗体マーカーは、体液抗原マーカーよりも、疾患に関連するデータの検出感度が高い。その中でもＫＩＡＡ０５１３抗原は、特に高い抗原性を持っていることから、この抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体マーカーは超高感度である。しかもヒトに対して致命的な結果をもたらす、癌、脳梗塞、心筋梗塞、糖尿病、慢性腎臓病等についての潜在又は顕在の疾病データとして検出できることは勿論のこと、動脈硬化や、固形癌における異常な血管新生等の動脈病変の存在を示すデータを検出することまでもが可能であることが分かった。
癌、脳梗塞、心筋梗塞、糖尿病、慢性腎臓病等、命に関わる重篤な疾患であっても、簡便なマーカーは少なく、しかもそれぞれの疾患について個別のマーカーを用いるしかなかった。本発明のデータ取得方法による疾病データの取得を超高感度で行うことが可能であり、かつ、これらの重篤な疾患に関するデータを包括的に検出できると共に、動脈硬化や、固形癌における異常な血管新生等の動脈病変の存在を示すデータを検出することで、疾病の予防の指標とすることも可能であり、集団検診等に最適である。
また上記のように、本発明においては単一のバイオマーカーにより、感染症を重症化させる要素である基礎疾患の有無を包括的に検出することが可能である。例えば、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）やインフルエンザウイルスによる気道系の感染症の流行に合わせて、本発明のデータ取得方法を集団検診において行うことで、医療担当者や病院のベッド等の効率的な分配と、より適切な治療を施すことが可能となる。
Claims (8)
- ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、動脈病変の存在データとして取得する、データ取得方法。
- ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得する、データ取得方法。
- 脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データを、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとして取得する、請求項２に記載のデータ取得方法。
- 配列番号１のアミノ酸配列の蛋白質の一部、におけるアミノ酸残基の個数は、１０－３０１個である、請求項１－３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 生体から分離された体液サンプルは、血液サンプルであることを特徴とする、請求項１－４のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 血液サンプルは、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項５に記載のデータ取得方法。
- 抗体レベル測定法は、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、又は、ＣＬＥＩＡ法であることを特徴とする、請求項１－６のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 請求項１－７のいずれか１項に記載のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット。
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|---|---|---|---|
| US18/248,099 US20240118288A1 (en) | 2020-10-08 | 2021-09-27 | Humoral antibody biomarker for detecting artery lesions, and detecting cerebrovascular and cardiovascular disorder, diabetes, chronic nephropathy, or solid cancer |
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| JP2014513957A (ja) * | 2011-04-28 | 2014-06-19 | ハリー・オストラー | 前立腺癌における転移のゲノム・シグネチャー |
| JP2015516155A (ja) * | 2012-04-27 | 2015-06-11 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 乳がん予後判定、プロゲステロン受容体サブタイプの予測および遺伝子発現に基づく抗プロゲスチン処置に対する応答の予測 |
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