WO2022014580A1 - 非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法、それに用いる試薬及び分析用キット - Google Patents

非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法、それに用いる試薬及び分析用キット Download PDF

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fatty liver
liver disease
alcoholic fatty
marker
concentration
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直樹 田中
岳史 木村
Original Assignee
国立大学法人信州大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a non-alcoholic fatty liver disease marker for detecting a non-alcoholic fatty liver disease that causes various diseases of the liver, and a method using the same.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-11806 filed on 13 July 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Non-alcoholic fatty liver disease is mainly caused by obesity, glucose tolerance disorder, or dyslipidemia of non-drinkers, and is a chronic disease that is often seen in Japan with the increase of these metabolic diseases. It has become to. In Europe, the United States and Asia, about 30% of the population has non-alcoholic fatty liver disease, and in Japan, non-alcoholic fatty liver disease has more than tripled in 30 years, and the rate of increase exceeds diabetes, and the world It is a disease for which an increase has become a problem.
  • non-alcoholic steatohepatitis which is seen in advanced cases, is a neutral fatty degeneration of the liver with histologically inflammatory necrosis, balloon-like swelling of hepatocytes, and peri-sinus. / Characterized by perivenous fibrosis, presenting with fatty liver, accompanied by inflammation, hepatocellular injury or fibrosis. Fatty liver due to non-alcoholic fatty liver has a poorer prognosis than simple fatty liver, and may progress to cirrhosis, liver cancer, and liver failure, and the incidence of cardiovascular disease and death due to liver causes is high. Due to its high rate, it has been reported that the mortality rate is high even when compared with the average mortality rate due to simple fatty liver. Therefore, early detection and treatment of non-alcoholic fatty liver disease, which increases the mortality rate as it progresses, are strongly desired.
  • a subject who is not non-alcoholic steatohepatitis has a lower alanine aminotransferase (ALT) value or aspartate aminotransferase (AST) value obtained by a blood test.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • Markers known as fibrosis markers of liver tissue such as hyaluronic acid, type 4 collagen, and M2BPGi are detected, and the overall score value of this combination is used to determine the severity of the disease. Neither specificity is sufficient.
  • imaging tests such as elastography are also performed, but the testing equipment is expensive and there is a problem that the accuracy is reduced in obese cases.
  • liver biopsy is highly invasive, and the physical burden on the subject and the burden of examination and hospitalization costs are large, and even with liver biopsy, the judgment results are biased depending on the subjectivity of the pathologist and the collection site. .. For these reasons, it is difficult to perform liver biopsy on all patients, including patients in the non-severe stage of non-alcoholic fatty liver disease, and we would like to regularly check the therapeutic effect and the course after treatment. In some cases, there are many challenges to judge by liver biopsy.
  • Patent Document 1 by the present inventors describes any of ferritin, thioredoxin, and free fatty acid derived from blood collected from a non-alcoholic steatohepatitis patient, or Cu, Zn-super derived from the liver collected from the patient.
  • a marker for determining the therapeutic effect of non-alcoholic steatohepatitis in blood or liver and a marker for determining the pathological condition or therapeutic effect of non-alcoholic steatohepatitis, which is a cytokeratin 18 fragment and is measured as a change in its content.
  • This document mainly aims to provide a marker for accurately determining the effect of treatment with a liver function improving drug in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
  • Patent Document 2 includes a step of measuring one or more factors selected from the group consisting of IL-1 receptor antagonist, sCD40, HMGB1, sPLA2groupIIA and PLA2 activity in a biological sample of a subject as a marker, and thrombospondin 1 Is further disclosed as a method for detecting or assessing the severity of nonalcoholic steatohepatitis, which comprises the step of measuring as a marker. Since this document provides useful indicators for detection / diagnosis of NASH (non-alcoholic steatohepatitis) and evaluation of severity / therapeutic effect, it is possible that NASH and NAFLD are easily affected. Subjects can be detected, and the severity of NASH and NAFLD and the therapeutic effect can be evaluated.
  • the therapeutic effect can be easily evaluated. It is possible to do so, and since it is not necessary to perform a biopsy, it is intended to provide a method that can reduce the burden on the patient and the burden on the medical staff.
  • the cytokeratin 18 fragment of Patent Document 1 shows a certain correlation with the state of non-alcoholic fatty liver disease. However, it may not correlate with liver fibrosis that can occur with the progression of non-alcoholic fatty liver disease. Therefore, more appropriate markers and methods are desired in order to comprehensively determine the degree of progression and therapeutic effect of non-alcoholic fatty liver disease.
  • Patent Documents 1 and 2 can also be used in place of the judgment by liver biopsy to determine the state of non-alcoholic fatty liver disease, morbidity risk, therapeutic effect, etc. Therefore, markers and methods with higher sensitivity and specificity are desired.
  • the present invention has been made based on the above background, and an object thereof has high sensitivity and specificity for non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, and risk of morbidity. , Or a method used for testing a non-alcoholic fatty liver disease marker, a method used for testing a non-alcoholic fatty liver disease marker, a reagent used thereof, and an analysis kit capable of accurately determining a state such as a therapeutic effect. There is something in it.
  • a non-alcoholic fatty liver disease marker used for detecting a target non-alcoholic fatty liver disease A non-alcoholic fatty liver disease marker containing thrombospondin-2 contained in a blood sample collected from the subject.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker wherein the non-alcoholic fatty liver disease marker is thrombospondin-2 protein.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker wherein the blood sample is serum.
  • Non-alcoholic fat including a step of measuring the concentration of thrombospondin-2 using thrombospondin-2 contained in a blood sample collected from a subject as a marker for non-alcoholic fatty liver disease.
  • a method for detecting sexual liver disease A method for detecting sexual liver disease.
  • the step of measuring the concentration of thrombospondin-2 is a step of measuring the protein concentration of thrombospondin-2 in the blood sample in order to detect the non-alcoholic fatty liver disease. the method of.
  • the step of measuring the protein concentration of thrombospondin-2 is a method for detecting the non-alcoholic fatty liver disease using an immunological method.
  • a method for detecting the non-alcoholic fatty liver disease using the tronspondin-2 as a marker for the degree of progression of fibrosis of liver tissue [10] Assuming that the total value N of the NAS (NAFLD activity score) of the target and the numerical value F of the stage of fibrosis of the liver tissue is the total value S, the degree of progression S is assumed. A method for detecting non-alcoholic fatty liver disease, wherein the degree of progression S increases when the concentration of thrombospondin-2 in the blood sample increases. [11] The subject is a method for detecting the non-alcoholic fatty liver disease, which is a subject who has been treated for the non-alcoholic fatty liver disease in the past.
  • An analytical reagent for detecting non-alcoholic fatty liver disease which comprises a reagent for detecting the non-alcoholic fatty liver disease marker.
  • An analytical kit for detecting non-alcoholic fatty liver disease which comprises an analytical reagent for detecting the non-alcoholic fatty liver disease.
  • the present invention has high sensitivity and specificity for non-alcoholic fatty liver disease, activity of non-alcoholic fatty liver disease, progress of fibrosis (high fibrosis / cirrhosis), and morbidity.
  • a method used for testing a non-alcoholic fatty liver disease marker and a non-alcoholic fatty liver disease marker that can accurately determine a state such as a risk or a therapeutic effect can be obtained.
  • Non-alcoholic fatty liver disease marker is a marker used for detecting a target non-alcoholic fatty liver disease.
  • the subject is a person to be examined and detected for a condition related to the non-alcoholic fatty liver disease such as the possibility of the non-alcoholic fatty liver disease, the presence or absence and the situation of the disease, and the therapeutic effect.
  • Nonalcoholic Fatty Liver Disease is a general term for non-alcoholic fatty liver diseases caused by alcohol, and is a non-alcoholic fatty liver disease (NAFL).
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Fatty liver disease may also be referred to as fatty liver disease.
  • a marker is an index for detecting information on a specific disease state of a target, and as described later, a protein, a nucleic acid encoding the marker, or other in vivo molecules (peptides, lipids, etc.).
  • the increase or decrease in its concentration in the living body is reflected in the information regarding the state of the specific disease.
  • the state of non-alcoholic fatty liver disease is non-alcoholic fat such as the presence, possibility, degree of progression, therapeutic effect, and other diseases or symptoms due to the influence of non-alcoholic fatty liver disease in the subject. Broadly refers to conditions related to sexual liver disease.
  • Used to detect non-alcoholic fatty liver disease broadly refers to obtaining information for investigating the state of the non-alcoholic fatty liver disease.
  • Detecting non-alcoholic fatty liver disease refers to, for example, acquiring and providing data related to non-alcoholic fatty liver disease. Specifically, for example, it refers to examining NAS (NAFLD activity score) indicating the state of non-alcoholic fatty liver disease.
  • NAFLD activity score indicating the state of non-alcoholic fatty liver disease.
  • it includes investigating various phenomena due to the influence of non-alcoholic fatty liver disease. More specifically, it includes degeneration, swelling or fibrosis of liver tissue. More specifically, there are hepatic triglyceride degeneration with inflammatory necrosis, balloon-like swelling (swelling) of hepatocytes, and peri-sinusoide / perivenous fibrosis.
  • the present embodiment it is preferable to use it for detecting non-alcoholic fatty liver disease, for example, to obtain information for continuously investigating the state of non-alcoholic fatty liver disease. In addition, it is more preferable to use it for examining the progress (presence or absence of improvement) after the treatment. That is, since the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment has a correlation with the target NAS and fibrosis of liver tissue, the marker of the present embodiment alone has a correlation with the non-alcoholic fatty liver. Information on the state of the disease and the presence or absence of its effects can be obtained. In addition, since it can be detected relatively easily with a blood sample, it is also suitable for multiple detections such as continuous detection.
  • the sample collected from the subject broadly refers to a sample containing a component extracted from an organism, but in this embodiment, a blood sample using blood collected from a human as a sample is used.
  • a blood sample using blood collected from a human as a sample is used.
  • collected blood, serum, plasma, or the like can be used.
  • serum is easier to obtain and store than other body fluid samples such as blood and plasma.
  • body fluid samples such as blood and plasma.
  • a sample that is cryopreserved in the form of serum is generally common internationally, so it is a useful technique.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment contains thrombospondin-2 contained in the blood sample.
  • Thrombospondin-2 (TSP2) is a protein belonging to the TSP family.
  • the TSP family plays a dynamic role in the extracellular matrix, which is associated with aggregates of extracellular molecules secreted by cells that structurally / biochemically support surrounding cells, such as fibrin, collagen, and hyaluronic acid. It is a substance that has and is known as a protein family that regulates cell migration, adhesion, proliferation, and the like.
  • the TSP family is thought to be involved in platelet aggregation, development, cell adhesion, angiogenesis, thrombus formation, cancer metastasis and wound healing.
  • Thrombospondin-2 is found in tissues such as fibroblasts and smooth muscle, and among the above-mentioned functions, it is known that it may be particularly involved in angiogenesis, cancer metastasis, wound healing and the like.
  • the present inventors have been diligently researching non-alcoholic fatty liver disease in order to find a highly sensitive marker that can be widely used for observing the susceptibility, risk, and course after treatment.
  • patients with non-alcoholic fatty liver disease it is known that there is a difference in expression in 64 genes between patients with mild fibrosis and patients with severe fibrosis (Moyan et al. Hepatology 2014, etc.). ..
  • the present inventors focused on the possibility that four of these genes, which may be secreted from the liver into blood, could be used as markers in blood samples, and used serum at the time of liver biopsy. It was measured by ELISA. As a result, it was found that the protein concentration of thrombospondin-2 was correlated with both NAS and the fibrosis stage in the blood sample. That is, it was found that it was significantly increased in severe fibrosis and cirrhosis.
  • the expression level can be used as a marker (index).
  • the protein concentration of thrombospondin-2 or the mRNA concentration of the thrombospondin-2 gene may be used as a marker.
  • the method for detecting the non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment uses the non-alcoholic fatty liver disease marker, that is, a marker containing thrombospondin-2, and determines the concentration of the thrombospondin-2. Includes the step of measuring.
  • the step of measuring the concentration of thrombospondin-2 is preferably a step of measuring the protein concentration of thrombospondin-2 in the blood sample.
  • a known means for quantifying protein can be used.
  • examples of such means include mass spectrometry, chromatography, electrophoresis, microarray, immunoassay, and the like.
  • an immunological method can be used to measure the above-mentioned concentration.
  • an enzyme enzyme immunoassay, EIA, ELISA
  • a fluorescent substance fluorescent immunoassay, FIA
  • a radioactive substance radioactive substance
  • ELISA is preferable because it is relatively inexpensive, simple, and can analyze a large number of samples.
  • anti-thrombospondin-2 antibody used for ELISA in this embodiment either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used.
  • non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment a conventionally known substance that can be used for detecting non-alcoholic fatty liver disease may be used in combination with thrombospondin-2. ..
  • substances known to have a certain correlation with NAS include CK18 (cytokeratin 18 fragment), HA (hyaluronic acid), and 4C7S (type 4 collagen 7S).
  • CK18 correlates with balloon-like swelling (swelling) of hepatocytes in NAS.
  • Substances such as HA, 4C7S, M2BPGi, and ATX are known to have a certain correlation with fibrosis.
  • the method for detecting non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment may be used in combination with the value used for detection of other non-alcoholic fatty liver disease.
  • values used for detection APRI value, i.e. (AST / ULN) ⁇ 100 / number of platelets (10 9 / L) ratio (AST: aspartate transferase, ULN: AST upper normal limit), FIB-4
  • the method for detecting non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment is to detect non-alcoholic fatty liver disease multiple times in a patient with non-alcoholic fatty liver disease and compare the results. It is possible to judge the deterioration or improvement of the condition of the disease. In addition, detection is performed on healthy subjects who do not have the pathology of non-alcoholic fatty liver disease, and the result is used as a reference value to worsen or improve the condition of non-alcoholic fatty liver disease by comparison with the reference value. Can also be judged.
  • the status of non-alcoholic fatty liver disease is the morbidity of non-alcoholic fatty liver disease, the risk of morbidity, activity, the degree of progress of fibrosis (presence or absence of severe fibrosis / cirrhosis), and non-alcoholic fatty liver disease. These include the effects of liver disease. Effects resulting from non-alcoholic fatty liver disease include liver fibrosis and cirrhosis due to the progression of fibrosis.
  • the thoronspondin-2 can be used as a marker for the degree of progression of fibrosis of liver tissue. That is, since the concentration of tronspondin-2 has a correlation coefficient with the stage of fibrosis as described later, it can be used as a guide for measuring the progress of fibrosis. Therefore, it can also be used as a guide for directly detecting and determining the progress of fibrosis. The determination of the degree of fibrosis can also be used to detect and determine severe fibrosis or cirrhosis.
  • the concentration of the marker is increased. It can be determined that the above-mentioned state of alcoholic fatty liver disease is exacerbated. Further, if the concentration of the marker is decreased when the marker is detected later, it can be determined that the condition of the non-alcoholic fatty liver disease is improved.
  • the total value of all the target NAS values (0 to 4 points for each element, etc.) is set to N.
  • the degree of progression S can be said to be the overall degree of progression or deterioration of the symptoms caused by non-alcoholic fatty liver disease and the symptoms caused by the effects thereof.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker increases in correlation with both the NAS value and fibrosis, it can be determined that the degree of progression S has increased if the concentration of the marker is increased. .. That is, from the concentration of the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment, it is possible to detect the overall degree of progression or deterioration of the symptoms caused by the non-alcoholic fatty liver disease and the symptoms caused by the effects thereof. .. This detection method can also be used to detect the degree of fibrosis (high fibrosis / cirrhosis).
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment can be applied to an analytical reagent for detecting non-alcoholic fatty liver disease or a kit containing the same.
  • the analytical reagent for detecting the non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment includes the reagent for detecting the above-mentioned non-alcoholic fatty liver disease marker.
  • a reagent an antibody for detecting a protein of a non-alcoholic fatty liver disease marker can be used. This antibody can be used to detect a protein as a marker for non-alcoholic fatty liver disease by an ELISA method or the like.
  • the reagent for analysis of the present embodiment may contain other components contained in the reagent for immunoassay.
  • the analytical reagent of the present embodiment may be provided as an analytical kit for detecting a non-alcoholic fatty liver disease having a plurality of the above configurations.
  • a kit may include, for example, an antibody for detecting a protein of the above-mentioned non-alcoholic fatty liver disease marker.
  • the kit may also include a carrier, an ELISA plate, a color-developing substrate, an antibody, or the like for use in the above-mentioned quantification operation.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment has a strong correlation with the NAS value and fibrosis. Specifically, the larger the value of NAS (fatty liver, lobular inflammation, hepatocellular balloon-like swelling, etc.) measured by histological examination of liver biopsy, the higher the concentration of the marker in serum. It gets higher. In addition, the concentration of the marker in serum also increases depending on the degree of fibrosis of liver tissue. With respect to these values, the marker of the present embodiment also has higher sensitivity than the conventionally known marker.
  • NAS fatty liver, lobular inflammation, hepatocellular balloon-like swelling, etc.
  • the marker of the present embodiment it is possible to determine with high sensitivity whether either or both of the NAS and the degree of fibrosis have increased, so that one type of marker can be used for non-alcoholic. It is possible to accurately determine whether or not the fatty liver disease and its effects have progressed comprehensively.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker of the present embodiment can obtain information on many factors related to non-alcoholic fatty liver disease by one kind of marker. Therefore, information on both NAS and fibrosis, which was conventionally performed by liver biopsy, can be obtained by examining the marker concentration in the blood sample. Blood samples are the most common clinical samples, are easily available, and blood collection is non-invasive compared to liver biopsy. Therefore, these detections can be performed with less time, physical strength, and cost burden on the patient as compared with liver biopsy. In addition, the time burden on the inspector, for example, the medical staff can be minimized.
  • the non-alcoholic fatty liver disease and the method of the present embodiment use a blood sample that can be easily collected, and use a small number of markers to obtain a comprehensive condition such as non-alcoholic fatty liver disease and fibrosis. Since information can be obtained, it is particularly effective because it is possible to reduce the time, physical strength, and cost burden when detecting the progress after treatment at regular intervals.
  • the non-alcoholic fatty liver disease marker and method of the present embodiment can be used for examination or diagnosis related to non-alcoholic fatty liver disease.
  • a diagnostic method by performing the above-mentioned detection, it is possible to diagnose the morbidity of non-alcoholic fatty liver disease, the risk of morbidity, and / or the degree of progression thereof.
  • a standard product of protein, a healthy blood sample, etc. are used as a standard product, a calibration curve, a comparison table, etc. are created, and the quantification results of the sample sample to be diagnosed are compared with the calibration curve, contrast table, etc.
  • the process used for diagnosis is also included. It should also be used to determine and diagnose liver cirrhosis that may be caused by non-alcoholic fatty liver disease, as well as morbidity, risk of morbidity, and / or the degree of its activity and progress of fibrosis. Can be done.
  • the pathological features of the 130 NAFLD patients referred to in this study are shown in Table 1.
  • the average age of the patients was 56 years, and 54 (42%) were male.
  • BMI values were in the wide range (21.4-36.8 kg / m 2 ).
  • the median TSP2 concentration in serum was 17.4 ng / mL (7.7-71.4).
  • the stages of liver fibrosis, which will be described later, were 27, 57, 15, 23, and 8 for F0, F1, F2, F3, and F4, respectively.
  • the state of fatty liver was set to the stage of S0 to S3 ( ⁇ 5%, 5-33%,> 33-66%, ⁇ 66%, respectively).
  • the state of lobular inflammation was the number of inflammatory lesions at the stage of L0 to L3 (no inflammation to ⁇ 2 inflammation / 200x range, 2-4 inflammation / 200x range,> 4 inflammation / 200x range, respectively).
  • the state of hepatocellular balloon-like swelling was set to the stage of B0 to B2 (none, several places, many).
  • the state of fibrosis is F0 to F4 (F0: none, F1: along the vas sinusoide or portal vein, F2: along the vasoide and along the portal vein, F3: with cross-linked fibrosis, F4: with cirrhosis) ..
  • Serum was collected from each fasting patient the day before liver biopsy and stored at -80 ° C until measurement.
  • TSP2 and CK18 in serum are measured by the ELISA method (TSP2, R & D Systems, Minneapolis, MN; CK18, M30 Apoptosense ELISA PEVIVA, Bromma, Sweden), HA and 4C7S proteins are measured by the latex turbidimetric method and the RIA2 antibody method, respectively. SRL) was used.
  • APRI and FIB-4 were calculated from the formula.
  • FIGS. 1A to 1D show the correlation between the number of patients classified into each stage for each element of NAS and the TSP2 concentration (ng / ml) in serum for each patient.
  • 1A shows the S0 to S3 stage and TSP2 concentration of fatty liver
  • FIG. 1B shows the L0 to L3 stage and TSP2 concentration of lobular inflammation
  • FIG. 1C shows the B0 to B2 stage of hepatocellular balloon-like swelling.
  • FIG. 1D shows the correlation between the F1 to F4 stages of fibrosis and the TSP2 concentration, respectively.
  • n 130.
  • the P values were 0.005, 0.003, ⁇ 0.001, and ⁇ 0.001 for each, and the TSP2 concentration was significantly different from the NAS value and fibrosis, respectively. From this result, the TSP2 concentration in serum correlates with both the state of non-alcoholic fatty liver disease indicated by the NAS value and the fibrosis strongly associated with the effect, and TSP2 in serum. It was shown that it could be used as a marker.
  • TSP2 has a higher correlation coefficient r than other proteins having a correlation coefficient r of 0.214 to 0.484, and has a high correlation with the total score of NAS. That is, it was shown that it could be used as a marker with higher sensitivity than conventionally known proteins for the state of non-alcoholic fatty liver disease.
  • Typical fibrosis markers such as HA and 4C7S have correlation coefficients r of 0.51 and 0.58, respectively, and can be used as markers comparable to conventionally known proteins that reflect liver fibrosis. Sex was shown. Furthermore, when the ROC curve was created with and without fibrosis, the areas under the curve were the largest at TSP2 0.73, HA 0.72, 4C7S 0.71 and TSP2. From these results, it was shown that the marker may be an excellent marker for determining the presence or absence of fibrosis.
  • FIG. 3A shows the S0 to S3 stages of fatty liver and TSP1 concentration
  • FIG. 3B shows the L0 to L3 stages of lobular inflammation and TSP1 concentration
  • FIG. 3C shows the B0 to B2 stages of hepatocellular balloon-like swelling.
  • TSP1 concentration FIG. 3D shows the correlation between the F1 to F4 stages of fibrosis and the TSP1 concentration, respectively.
  • the present invention has high sensitivity and specificity for non-alcoholic fatty liver disease, and accurately determines the state of progression, morbidity risk, therapeutic effect, etc. of non-alcoholic fatty liver disease.
  • Possible non-alcoholic fatty liver disease markers, and methods used for testing non-alcoholic fatty liver disease markers are obtained.

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Abstract

非アルコール性脂肪性肝疾患に対して高い感度及び特異性を有し、非アルコール性脂肪性肝疾患の進行度、罹患リスク、又は治療効果等の状態を的確に判断することができる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いる方法、それに用いる試薬及び分析用キットを提供する。 対象の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーであって、前記対象から採取された血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いる方法、それに用いる試薬及び分析用キットである。

Description

非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法、それに用いる試薬及び分析用キット
　本発明は、肝臓の様々な疾患の原因となる非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー及びそれを用いた方法に関するものである。
　本願は、２０２０年７月１３日に出願された特願２０２０－１１９８０６に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　非アルコール性脂肪性肝疾患は、主に非飲酒者の肥満、耐糖能障害、又は脂質代謝異常等に起因し、これらの代謝性疾病の増加に伴って、我が国でもよく見られる慢性の疾患となってきている。欧米及びアジアでは人口の約３０％が非アルコール性脂肪性肝疾患であり、わが国でも非アルコール性脂肪性肝疾患は３０年で３倍以上に増加しており、増加率は糖尿病を超え、世界的に増加が問題となっている疾患である。
　非アルコール性脂肪性肝疾患の中でも、進行した場合に見られる非アルコール性脂肪肝炎は、組織学的に炎症壊死を伴う肝臓の中性脂肪変性症、肝細胞の風船様腫大、類洞周囲／静脈周囲線維症で特徴付けられ、脂肪肝を呈し、炎症、肝細胞傷害又は線維症等を随伴する。非アルコール性脂肪肝炎による脂肪肝は、単純性脂肪肝と比較すると、予後不良であり、肝硬変、ひいては肝癌や肝不全に進行することがあり、心臓血管疾患や肝臓の所為による死亡の発生率が高いために、単純性脂肪肝による平均の死亡率と比較しても、死亡の割合が高いと報告されている。そのため、進行すると死亡率が高くなる非アルコール性脂肪性肝疾患については、早期の検出及び対処が強く望まれている。
　非アルコール性脂肪性肝疾患の指標としては、例えば、非アルコール性脂肪肝炎でない対象は、血液検査によって得られるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値が低くなる。しかしながら、ＡＬＴ値やＡＳＴ値が低くとも、非アルコール性脂肪性肝炎である症例が散見されるなど、血液検査では的確な判断ができない場合もある。
　ヒアルロン酸、４型コラーゲン、Ｍ２ＢＰＧｉ等の肝組織の線維化マーカーとして知られているマーカーを検出し、この組み合わせの総合的なスコア値によって重症化を判断することも行われているが、感度、特異度ともに充分とはいえない。
　血液検査の他、エラストグラフィー等による画像検査も行われているが、検査機器が高額であり、また肥満症例では精度が低下する問題もある。
　そのため、非アルコール性脂肪性肝疾患の判断、特に単純性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎に伴う脂肪肝との識別は、主に肝生検に基づいて行われているのが現状である。しかしながら、肝生検は侵襲性が高く、対象の体力的な負担及び検査、入院のコストの負担も大きく、さらに肝生検によっても、病理医の主観や採取部位により判断結果には偏りがある。これらの理由から、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患の重症化していない段階の患者も含めてすべてに肝生検を行うことは困難であり、治療効果及び治療後の経過を定期的に確認したい場合なども、肝生検によって判断するには課題も多い。
　これらの背景から、肝生検によらず、より侵襲性が低い手段、例えば血液などの試料の検査によって、非アルコール性脂肪性肝疾患、罹患リスク、又は治療効果等の状態の判断のために用いることのできる方法、及びそれに用いることのできるマーカーが強く望まれている。
　本発明者らによる特許文献１は、非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ，Ｚｎ－スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ－スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子－１、エンドトキシン受容体であるトール様受容体４の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定される血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカー、及び、サイトケラチン１８フラグメントであって、その含量の変化として測定される非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカーについて開示している。この文献は、主に非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者の肝機能改善薬による治療の効果を、的確に判定するマーカーを提供しようとするものである。
　特許文献２は、被験者の生体試料における、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２ｇｒｏｕｐＩＩＡおよびＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１　以上の因子をマーカーとして測定する工程を含む、また、トロンボスポンジン１をさらにマーカーとして測定する工程を含む、非アルコール性脂肪肝炎の検出又は重篤度の評価のための方法を開示している。この文献は、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）の検出・診断、重篤度・治療効果の評価に有用な指標が提供されるため、簡便に、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤに罹患している可能性のある被験者を検出することができ、また、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤの重篤度や、治療効果を評価することが可能になり、特に、ＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療を行う場合に、簡便に、その治療効果を評価することが可能になり、生検を行う必要がないため、患者の負担、及び、医療従事者の負担も軽減することができる方法を提供しようとするものである。
国際公開第２００９／０２８４５７号 国際公開第２０１１／０４６２０４号
　しかしながら、従来技術においては、非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝炎に関連するマーカーが示されているものの、非アルコール性脂肪性肝疾患の進行度、罹患リスク、又は治療効果等の状態の判断のためには、特に高い感度、特異度が求められている。
　例えば、特許文献１のサイトケラチン１８フラグメントは、非アルコール性脂肪性肝疾患の状態に対しては一定の相関性を示す。しかし、非アルコール性脂肪性肝疾患の進行に伴って起こり得る肝臓の線維化とは相関しない場合がある。このため、非アルコール性脂肪性肝疾患の進行度や治療効果を総合的に判断するには、さらに適切なマーカー及び方法が望まれている。
　特許文献１及び２に開示されているその他のマーカーについても、肝生検による判断にかえて使用することのできる、非アルコール性脂肪性肝疾患、罹患リスク、又は治療効果等の状態の判断のためには、より感度、特異度の高いマーカー及び方法が望まれている。
　本願発明は上記のような背景に基づいてなされたものであり、その目的は、非アルコール性脂肪性肝疾患に対して高い感度及び特異性を有し、非アルコール性脂肪性肝疾患、罹患リスク、又は治療効果等の状態を的確に判断することができる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの検査のために用いる方法、それに用いる試薬及び分析用キットを提供することにある。
　上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
［１］　対象の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーであって、
　前記対象から採取された血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
［２］　前記非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーがトロンボスポンジン－２蛋白質である、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
［３］　前記血液試料は血清である、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
［４］　対象から採取された血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーとして用い、前記トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［５］　前記トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程は、前記血液試料中のトロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を測定する工程である、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［６］　前記トロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を測定する工程は、免疫学的手法を用いる、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［７］　前記血液試料は血清である、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［８］　前記トロンボスポンジン－２の濃度を２回以上測定し、それぞれの結果を比較する、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［９］　前記トロンスポンジン－２を肝組織の線維化の進行度のマーカーとして用いる、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［１０］　前記対象のＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｃｏｒｅ）の合計値Ｎと、肝組織の線維化の段階の数値化Ｆの合計値を進行度Ｓとすると、
　前記血液試料中のトロンボスポンジン－２の濃度が増加した際に、前記進行度Ｓが増加したとする、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［１１］　前記対象は、過去に前記非アルコール性脂肪性肝疾患に対する治療を行った対象である、前記の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
［１２］　前記非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーを検出するための試薬を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬。
［１３］　前記非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用キット。
　本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患に対して高い感度及び特異性を有し、非アルコール性脂肪性肝疾患の活動性、線維化の進行度（高度線維化・肝硬変）、罹患リスク、又は治療効果等の状態を的確に判断することができる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、及び非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの検査のために用いる方法が得られる。
本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－２（ＴＳＰ２）濃度の相関関係を示すグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－２（ＴＳＰ２）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－２（ＴＳＰ２）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－２（ＴＳＰ２）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示すグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中の各物質の濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）濃度の相関関係を示すグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳの各要素の値と血清中のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）濃度の相関関係を示す別のグラフ図である。 本実施例におけるＮＡＳのスコア合計値と血清中のＴＳＰ１の濃度の相関関係を示すグラフ図である。
　以下、本発明に係る非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、及び非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの検査のために用いる方法について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
（非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー）
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、対象の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いるマーカーである。
　ここで対象は、非アルコール性脂肪性肝疾患の可能性、疾患の有無や状況、また治療効果など非アルコール性脂肪性肝疾患に関連する状態を検査、検出する対象となる人である。
　非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　Ｆａｔｔｙ　Ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）は、アルコールを原因としない肝臓の脂肪性疾患の総称であり、病態が進行していない非アルコール性脂肪肝（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　Ｆａｔｔｙ　Ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）と、病態が進行した非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を含む。脂肪性肝疾患は、脂肪肝疾患と表記されることもある。
　マーカーとは、対象の特定の疾患の状態に関する情報を検出するための指標であり、後述するように蛋白質、それをコードする核酸、又はそれらと他の生体内分子（ペプチド、脂質等）との結合体で、その生体中の濃度の増減が、前記特定の疾患の状態に関する情報に反映するものである。
　非アルコール性脂肪性肝疾患の状態とは、対象における疾患の存在、可能性、進行度、治療効果、及び非アルコール性脂肪性肝疾患の影響による別の疾患や症状等など、非アルコール性脂肪性肝疾患に関係する状態を広く指す。
　非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いるとは、前記非アルコール性脂肪性肝疾患の状態を調べるための情報を得ることを広く指す。
　非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するとは、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連するデータを取得する、提供することを指す。具体的には、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患の状態を示すＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｃｏｒｅ）を調べることを指す。さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患の影響による各種の現象を調べること等を含む。より具体的には、肝細胞の変性、腫大又は肝組織の線維化を含む。さらに具体的には、炎症壊死を伴う肝臓の中性脂肪変性症、肝細胞の風船様腫大（膨張）、又は類洞周囲／静脈周囲線維症などが挙げられる。
　本実施形態では、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いるとは、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患の状態を継続的に調べるための情報を得るために用いることが好ましい。また、治療を行った後の経過（改善の有無）を調べることに用いることがより好ましい。すなわち、本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、対象のＮＡＳ、肝組織の線維化に対して相関関係を有しているため、本実施形態のマーカーのみで非アルコール性脂肪性肝疾患の状態及びその影響の有無に対する情報を得ることができる。また血液試料により比較的容易に検出を行うことができるので、継続的など複数回の検出にも適している。
　対象から採取された試料としては、生物から取り出した成分を含む試料を広く指すが、本実施形態ではヒトから採取した血液を試料とした血液試料を用いる。血液試料としては採取した血液、血清又は血漿などを用いることができる。
　本実施形態では、血液試料として血清を用いることが好ましい。血清は血液や血漿等の他の体液試料よりも、検体の取得・保存が容易である。実際に血液試料としては、血清の形で凍結保持されている検体が国際的に一般的であることから、有益な技術である。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、前記血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を含む。
　トロンボスポンジン－２（ＴＳＰ２）は、ＴＳＰファミリーに属する蛋白質である。ＴＳＰファミリーは、細胞外マトリックス（周囲の細胞を構造的／生化学的に支持する細胞によって分泌される細胞外分子の集合体、例えばフィブリン、コラーゲンやヒアルロン酸に関係する）で動的な役割を持つ物質で、細胞の移動、接着、及び増殖等を調節する蛋白質ファミリーとして知られている。ＴＳＰファミリーは、血小板凝集、発生、細胞接着、血管新生、血栓形成、癌転移及び創傷治癒などに関与すると考えられている。
　トロンボスポンジン－２は、このうち線維芽細胞及び平滑筋等の組織において見られ、上記の機能のうちでも、特に血管新生、癌転移及び創傷治癒などに関与する可能性が知られている。
　本発明者らは、非アルコール性脂肪性肝疾患について、罹患可能性、リスクや治療後の経過の観察などに広く用いることのできる、かつ感度の高いマーカーを見出すため鋭意研究を進めていた。非アルコール性脂肪性肝疾患の患者のうち、軽度の線維化と重度の線維化の患者では、６４の遺伝子に発現の差が見られることが知られている（Ｍｏｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２０１４など）。本発明者らは、これらの遺伝子のうち、肝臓から血液に分泌される可能性のある４分子について、血液試料内のマーカーとして用いることのできる可能性について注目し、肝生検時の血清を用いてＥＬＩＳＡにより測定を行った。その結果、血液試料中において、トロンボスポンジン－２の蛋白質濃度がＮＡＳ及び線維化ステージの双方と相関していることを見出した。即ち、高度線維化・肝硬変で有意に上昇していることを見出した。
　非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２の濃度は、その発現量をマーカー（指標）として用いることができる。具体的には、トロンボスポンジン－２の蛋白質濃度、又は、トロンボスポンジン－２の遺伝子のｍＲＮＡ濃度をマーカーとして用いてもよい。本実施形態では、血清中のトロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を用いることが好ましい。
（非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法）
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法は、前記非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、すなわちトロンボスポンジン－２を含むマーカーを用い、前記トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程を含む。
　トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程は、前記血液試料中のトロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を測定する工程であることが好ましい。
　上述の濃度の測定には、蛋白質の定量（蛋白質量の測定）のための公知の手段を用いることができる。このような手段には、質量分析法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、マイクロアレイ法又は免疫学的手法（イムノアッセイ）等が挙げられる。例えば、本実施形態では、上述の濃度の測定には免疫学的手法を用いることができる。
　免疫学的手法を用いた濃度の測定、免疫分析としては、酵素（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光物質（蛍光イムノアッセイ、ＦＩＡ）又は放射性物質（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）などを適宜用いることができる。このうち、ＥＬＩＳＡは比較的安価、簡便かつ多数のサンプルを分析できるため望ましい。
　なお、本実施形態においてＥＬＩＳＡに用いる抗トロンボスポンジン－２抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーとしては、トロンボスポンジン－２の他に、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出に用いることのできる従来知られた物質をあわせて用いてもよい。例えば、ＮＡＳに対して一定の相関関係を有することが知られている物質としてＣＫ１８（サイトケラチン１８フラグメント）、ＨＡ（ヒアルロン酸）、４Ｃ７Ｓ（４型コラーゲン７Ｓ）などがある。ＣＫ１８は、ＮＡＳのうち肝細胞の風船様腫大（膨張）と相関する。ＨＡ、４Ｃ７Ｓ、Ｍ２ＢＰＧｉ、ＡＴＸといった物質は、線維化と一定の相関関係を有することが知られている。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法は、他の非アルコール性脂肪性肝疾患に関する検出に用いる値と併用してもよい。このような検出に用いられる値としては、ＡＰＲＩ値、すなわち（ＡＳＴ／ＵＬＮ）×１００／血小板数（１０９／Ｌ）比（ＡＳＴ：アスパラギン酸トランスフェラーゼ、ＵＬＮ：ＡＳＴ正常上限値）、ＦＩＢ－４値、すなわち（年齢×ＡＳＴ）／（血小板数×ＡＬＴ１／２）などの値がある。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法は、非アルコール性脂肪性肝疾患の患者に対して複数回検出を行い、結果を比較することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患の状態の悪化又は改善を判断することができる。
　また、非アルコール性脂肪性肝疾患の病状が見られない健常者に対して検出を行い、その結果を基準値として、基準値との比較で非アルコール性脂肪性肝疾患の状態の悪化又は改善を判断することもできる。
　非アルコール性脂肪性肝疾患の状態とは、非アルコール性脂肪性肝疾患への罹患、罹患のリスク、活動性、線維化の進行度合い（高度線維化・肝硬変の有無）、非アルコール性脂肪性肝疾患から生じる影響などである。非アルコール性脂肪性肝疾患から生じる影響としては、肝臓の線維化や、線維化の進行による肝硬変などが挙げられる。
　前記トロンスポンジン－２は、肝組織の線維化の進行度のマーカーとして用いることができる。すなわち、トロンスポンジン－２の濃度は、後述するように線維化のステージとの相関係数を持つので、線維化の進行度を測定する目安とすることができる。このため、直接に線維化の進行度を検出し判断するための目安として用いることもできる。線維化の進行度の判断は、高度線維化又は肝硬変の検出及び判断に用いることもできる。
　例えば、一定期間（例としては１、３、６又は１２か月など）を置いて２回以上の前記検出を行い、後に検出を行った方が前記マーカーの濃度が増加していれば、非アルコール性脂肪性肝疾患の前記状態が悪化していると判断することができる。また、後に検出を行った方が前記マーカーの濃度が減少していれば、非アルコール性脂肪性肝疾患の前記状態が改善していると判断することができる。
　非アルコール性脂肪性肝疾患を検出する、すなわち非アルコール性脂肪性肝疾患の状態を判断する方法としては、対象のＮＡＳの値（各要素について０～４点など）の全ての合計値をＮ、対象の肝組織の線維化や肝硬変の度合いの段階（０～４点など）を点数化したものをＦとし、その値の合計値を進行度Ｓ（Ｎ＋Ｆ＝Ｓ）とした場合、進行度Ｓは、非アルコール性脂肪性肝疾患による症状及びその影響によって起こる症状の総合的な進行度又は悪化の度合いということができる。
　前記非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、ＮＡＳの値及び線維化の両方に相関して増加するので、前記マーカーの濃度が増加していれば、進行度Ｓが増加したと判断することができる。すなわち、本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの濃度からは、非アルコール性脂肪性肝疾患による症状及びその影響によって起こる症状の総合的な進行度又は悪化の度合いを検出することができる。
　また、この検出法は線維化の進行度（高度線維化・肝硬変）の検出にも用いることができる。
（非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬及びそれを含むキット）
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬又はそれを含むキット等に応用することができる。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬は、上述の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーを検出するための試薬を含む。
　このような試薬としては、具体的には、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの蛋白質を検出するための抗体を用いることができる。この抗体はＥＬＩＳＡ法などで、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの蛋白質を検出するために用いることができる。
（その他の構成）
　本実施形態の分析用試薬は、その他免疫分析の試薬に含まれる成分を含有していてもよい。
　また、本実施形態の分析用試薬は、上記構成を複数備えた非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用キットとして提供されていてもよい。
　このようなキットとしては、例えば上述の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの蛋白質を検出するための抗体を備えていてもよい。また、このキットは、上述した定量の操作に用いるための担体、ＥＬＩＳＡプレート、発色基質又は抗体等を含んでいてもよい。
（本実施形態の効果）
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、ＮＡＳの値及び線維化に対して強い相関関係を持つ。具体的には、肝生検の組織学的検査によって測定されるＮＡＳの各値（脂肪肝、小葉炎症、肝細胞風船様腫大など）が大きくなる患者ほど、血清中の前記マーカーの濃度が高くなる。また、肝組織の線維化の度合いによっても血清中の前記マーカーの濃度が高くなる。これらの値について、本実施形態のマーカーは従来知られていたマーカーよりも高い感度も持つ。したがって、本実施形態のマーカーを用いることにより、前記ＮＡＳと線維化の度合いとのいずれか又は両方が大きくなったかを高い感度で判定することができるので、１種類のマーカーを用いて、非アルコール性脂肪性肝疾患とその影響が総合的に進行したかどうかを的確に判断することができる。
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーは、１種類のマーカーにより、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連する多くの要素についての情報を得ることができる。そのため、従来は肝生検によって行っていたＮＡＳと線維化の両方に関する情報を、血液試料中のマーカー濃度を調べることで得ることができる。
　血液試料は最も一般的な臨床試料であり、容易に採取可能で、かつ血液の採取は肝生検に比べて非侵襲的である。したがって、肝生検に比べてこれらの検出を患者への時間的、体力的、コスト的な負担を少なく行うことができる。また、検査者、例えば医療従事者に対しても時間的などの負担を最小限とすることができる。
　特に、非アルコール性脂肪性肝疾患への治療を行った後は、その治療の効果について、非アルコール性脂肪性肝疾患やその影響による線維化等の、治療後の経過を一定期間ごとに観察することが好ましい。この場合、本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患及び方法は、容易に採取できる血液試料を用い、少ない種類のマーカーにより、非アルコール性脂肪性肝疾患や線維化等の総合的な状態の情報を得ることができるため、治療後の経過について一定期間ごとに検出を行う際に時間的、体力的、コスト的な負担を少なく行うことができ特に有効である。
（本実施形態の用途）
　本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー及び方法は、非アルコール性脂肪性肝疾患に関する検査又は診断等に用いることができる。
　診断方法としては、前記検出を行うことで、非アルコール性脂肪性肝疾患への罹患、罹患のリスク、及び／又は、これらの進行度合いを診断することもできる。
　この診断方法では、蛋白質の標準品、健常血液試料などを用いて標準品として用い、検量線、対比表などを作成し、診断する対象の検体試料による定量結果を検量線や対比表などと比較して診断に用いる過程なども含まれる。
　また、非アルコール性脂肪性肝疾患が原因で起こり得る肝硬変、ひいては肝癌や肝不全といった疾患への罹患、罹患リスク、及び／又はその活動性や線維化の進行度合いの判定及び診断にも用いることができる。
　以下、実施例を示す。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
（関与した患者）
　本件の試験で参照した１３０人のＮＡＦＬＤの患者の病理学的特徴を表１に示した。患者の平均年齢は５６歳で、５４人（４２％）が男性であった。ＢＭＩ値は広い範囲（２１．４－３６．８ｋｇ／ｍ２）であった。血清中のＴＳＰ２濃度の中間値は１７．４ｎｇ／ｍＬ（７．７－７１．４）であった。後述する肝線維化のステージの段階は、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４についてそれぞれ２７、５７、１５、２３、８人であった。
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（組織学的検証）
　少なくとも１．５ｃｍ長の肝臓検体を１４ゲージ針を用いてＳ５－８区域から採取し、直ちに１０％中性ホルマリンで固定した。断片を４μｍの厚さに切断し、ヘマトキシリンとエオシンとによりアザン－マロリー法で染色した。組織学的所見は、クライナーらによる進展度診断／格付け法に準拠し、一人の病理学者（ＫＳ）による盲検法で、評定した。
　ＮＡＦＬＤの組織学的活性の値（ＮＡＦＬＤ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｃｏｒｅ；ＮＡＳ）は、ＮＡＦＬＤの病理所見を構成する要素毎に以下のように測定した。脂肪肝（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）の状態はＳ０～Ｓ３の段階（それぞれ＜５％、５－３３％、＞３３－６６％、＜６６％）とした。小葉炎症（Ｌｏｂｕｌａｒ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の状態は炎症病巣の数でＬ０～Ｌ３の段階（それぞれ炎症なし～＜２炎症／２００ｘ範囲、２－４炎症／２００ｘ範囲、＞４炎症／２００ｘ範囲）とした。肝細胞風船様腫大（Ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ　ｇｒａｄｅ）の状態はＢ０～Ｂ２の段階（それぞれなし、数か所、多数）とした。
　線維化の状態はＦ０～Ｆ４（それぞれＦ０：なし、Ｆ１：類洞沿い又は門脈沿いに有り、Ｆ２：類洞沿い及び門脈沿いに有り、Ｆ３：架橋線維化有り、Ｆ４：肝硬変有り）。
（血清中の濃度の測定）
　血清は肝生検の前日に断食を行った各患者から採取し、測定を行うまで－８０℃で保存した。
　血清中のＴＳＰ２、ＣＫ１８はＥＬＩＳＡ法（ＴＳＰ２、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；　ＣＫ１８、Ｍ３０　Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ　ＥＬＩＳＡ　ＰＥＶＩＶＡ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＨＡ、４Ｃ７Ｓ蛋白質の測定はそれぞれラテックス比濁法、ＲＩＡ２抗体法（外注、ＳＲＬ）を用いた。ＡＰＲＩ及びＦＩＢ－４は計算式から算出した。
　データの統計学的処理はＳｔａｔＦｌｅｘ　Ｖｅｒ．６．０（Ａｒｔｅｃｈ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）とＳＰＳＳ　２４．０（ＩＢＭ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）ソフトフェアを用いて行い、確率Ｐ値、相関係数ｒを求めた。
（ＮＡＳ、線維化とＴＳＰ２の相関関係）
　組織学的検証、すなわちＮＡＳの各要素ごとに各段階に分類された患者数と、患者ごとの血清中のＴＳＰ２濃度（ｎｇ／ｍｌ）の相関関係について図１Ａ～図１Ｄに示す。図１Ａには脂肪肝のＳ０～Ｓ３の段階とＴＳＰ２濃度の、図１Ｂには小葉炎症のＬ０～Ｌ３の段階とＴＳＰ２濃度の、図１Ｃには肝細胞風船様腫大のＢ０～Ｂ２の段階とＴＳＰ２濃度の、図１Ｄには線維化のＦ１～Ｆ４の段階とＴＳＰ２濃度の、それぞれ相関関係を示す。図１Ａ～図１Ｄにおいて、ｎ＝１３０である。
　それぞれについてＰ値が０．００５、０．００３、＜０．００１、＜０．００１であり、ＴＳＰ２濃度は、それぞれＮＡＳの値及び線維化に対して有意差が認められる。この結果より、血清中のＴＳＰ２濃度は、ＮＡＳの値で示される非アルコール性脂肪性肝疾患の状態、及びその影響と強く関連する線維化との両方と相関しており、血清中のＴＳＰ２をマーカーとして用いることができる可能性が示された。
（ＮＡＳのスコア合計値と各マーカーの相関関係）
　ＮＡＦＬＤの組織学的活動性の値のそれぞれの段階の合計値をＮＡＳの合計値スコア（１～７）と、各物質（蛋白質）の血清中の濃度を、それぞれ図２Ａ：ＴＳＰ２、図２Ｂ：ＣＫ１８、図２Ｃ：ＨＡ、図２Ｄ：４Ｃ７Ｓに示した。また、前記合計値スコアと図２Ｅ：ＡＰＲＩ値及び図２Ｆ：ＦＩＢ－４値について示した。図２Ａ～図２Ｆにおいて、ｎ＝１３０である。
　ＴＳＰ２の濃度はＮＡＳの合計値スコアとの相関係数がｒ＝０．５１７、Ｐ値が＜０．００１である。ＴＳＰ２は、相関係数ｒが０．２１４～０．４８４である他の蛋白質よりも高く、ＮＡＳの合計値スコアとの相関関係が高い。すなわち、非アルコール性脂肪性肝疾患の状態に対して、従来知られている蛋白質よりも高い感度のマーカーとして使用できる可能性が示された。
（線維化のステージと各マーカーの相関関係）
　ＴＳＰ２の濃度は線維化のステージとの相関係数がｒ＝０．５３、Ｐ値が＜０．００１である。ＨＡ、４Ｃ７Ｓといった代表的な線維化マーカーは、相関係数ｒがそれぞれ０．５１、０．５８であり、肝臓の線維化を反映する従来知られている蛋白質に遜色のないマーカーとして使用できる可能性が示された。さらに線維化の有無でＲＯＣ曲線を作成すると、曲線下面積はＴＳＰ２　０．７３、ＨＡ　０．７２、４Ｃ７Ｓ　０．７１　とＴＳＰ２が最も大きかった。これらの結果より、前記マーカーは線維化の有無を判定する優れたマーカーとなる可能性が示された。
（ＮＡＳ、線維化とＴＳＰ１の相関関係）
　ＴＳＰのファミリーであるトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）について、組織学的検証すなわち患者ごとのＮＡＳの段階と、血清中のＴＳＰ１濃度（ｎｇ／ｍｌ）の相関関係について図３に示す。図３Ａには脂肪肝のＳ０～Ｓ３の段階とＴＳＰ１濃度の、図３Ｂには小葉炎症のＬ０～Ｌ３の段階とＴＳＰ１濃度の、図３Ｃには肝細胞風船様腫大のＢ０～Ｂ２の段階とＴＳＰ１濃度の、図３Ｄには線維化のＦ１～Ｆ４の段階とＴＳＰ１濃度の、それぞれ相関関係を示す。
　脂肪肝の段階とＴＳＰ１濃度の関連性はｒ＝０．１５２であり、関連性は低かった。また、小葉炎症及び肝細胞風船様腫大については負の相関が認められたが、関連性は低かった。線維化の段階についてはｒ＝－０．３５９であり、負の相関が認められた。
　また、ＮＡＳの合計値スコアとＴＳＰ－１の血清中の濃度の相関関係について図４に示す。合計値スコアとして見ても、強い関連性は見られなかった。
　この結果から、ＴＳＰ１については非アルコール性脂肪性肝疾患のマーカーとしては良好な結果は得られなかった。
　本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患に対して高い感度及び特異性を有し、非アルコール性脂肪性肝疾患の進行度、罹患リスク、又は治療効果等の状態を的確に判断することができる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、及び非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーの検査のために用いる方法が得られる。

Claims (13)

  1. 　対象の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するために用いる非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーであって、
    　前記対象から採取された血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
  2. 　前記非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーがトロンボスポンジン－２蛋白質である、請求項１に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
  3. 　前記血液試料は血清である、請求項１又は２に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー。
  4. 　対象から採取された血液試料中に含まれるトロンボスポンジン－２を非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーとして用い、前記トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  5. 　前記トロンボスポンジン－２の濃度を測定する工程は、前記血液試料中のトロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を測定する工程である、請求項４に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  6. 　前記トロンボスポンジン－２の蛋白質濃度を測定する工程は、免疫学的手法を用いる、請求項５に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  7. 　前記血液試料は血清である、請求項４から６のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  8. 　前記トロンボスポンジン－２の濃度を２回以上測定し、それぞれの結果を比較する、請求項４から７のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  9. 　前記トロンスポンジン－２を肝組織の線維化の進行度のマーカーとして用いる、請求項４から８のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  10. 　前記対象のＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｃｏｒｅ）の合計値Ｎと、肝組織の線維化の段階の数値化Ｆの合計値を進行度Ｓとすると、
    　前記血液試料中のトロンボスポンジン－２の濃度が増加した際に、前記進行度Ｓが増加したとする、請求項４から９のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  11. 　前記対象は、過去に前記非アルコール性脂肪性肝疾患に対する治療を行った対象である、請求項４から１０のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法。
  12. 　請求項１又は２の非アルコール性脂肪性肝疾患マーカーを検出するための試薬を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬。
  13. 　請求項１２に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用試薬を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための分析用キット。
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