WO2021261891A1 - 박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능 증진 방법 및 조성 - Google Patents

박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능 증진 방법 및 조성 Download PDF

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고경윤
이재욱
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Definitions

  • the present invention relates to a method and composition for enhancing the cancer treatment efficacy of bacterial extracellular vesicles, and more particularly, to cancer treatment of bacterial extracellular vesicles using various immune checkpoint inhibitors single or in combination of two or more types. It relates to methods and compositions for enhancing efficacy.
  • Cancer is the leading cause of death, but if detected early in the disease, in some cases it is curable. However, it is still difficult to treat cancer if it has progressed to some extent, especially if it is accompanied by metastasis. Due to the immunosuppressive environment present in most cancers, it has been known and recognized in recent years that cancers are not regulated by the immune system. As a result, various methods have been developed to stimulate the immune system to control cancer. Cancer immunotherapy is a strategy to treat cancer by using the body's immune function, and since the late 19th century, William B. Coley observed cancer reduction by administering a mixture of bacteria known as Coley's toxin, which has long been of interest and expectation.
  • Immune checkpoint inhibitors include monoclonal antibodies against cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4), programmed cell death protein 1 (PD1) and programmed death-ligand 1 (PDL1).
  • CTL4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
  • PD1 programmed cell death protein 1
  • PDL1 programmed death-ligand 1
  • Cytotoxic T lymphocytes are one of the representative specific immune responses, such as killing antigen-bearing cells, including cancer cells.
  • antigen recognition and co-stimulatory signals are required. This is achieved by simultaneous binding of CD80 and CD40 expressed in antigen presenting cells to CD28 and CD40L, which are ligands on the surface of T lymphocytes.
  • activated T lymphocytes can be inactivated through activation of a co-inhibitory signal after a certain period of time, thereby preventing tissue damage caused by excessive immune stimulation.
  • a co-inhibitory signal There are various simultaneous suppression signals.
  • CTLA4 of T lymphocytes inactivates naive or memory T lymphocytes by binding to CD80 and CD86, ligands of antigen-bearing cells, 2) PD1 of T lymphocytes, a ligand of antigen-bearing cells, It inhibits T lymphocyte function in peripheral tissues through binding to PDL1 and PDL2.
  • the immune function of our body regulates the overall T lymphocyte function through the control of these co-stimulatory and co-inhibitory signals at the same time as antigen recognition, which is called immune checkpoint.
  • the immune function of our body detects tumor-specific neo-antigens expressed in cancer cells and eliminates cancer cells.
  • Cancer cells change the tumor microenvironment in order to avoid such an immune attack and activate the suppressive immune checkpoint to suppress the immune function, or through T lymphocyte immune tolerance or immuno-editing, etc. Avoid attack by tumor-specific killer T lymphocytes.
  • activating tumor-specific cytotoxic T lymphocytes suppressed using monoclonal antibody immune checkpoint inhibitors against CTLA4, PD1, or ligand PDL1 has therapeutic effects on various cancers, such as malignant melanoma, kidney cancer, or non-small cell lung cancer. .
  • checkpoint inhibitors respond to treatment only in some cancers, and in some patients with those cancers, suggesting that different types of immunosuppressive mechanisms are at work in many cancers.
  • immune checkpoint inhibitors have different therapeutic effects depending on the patient despite their surprising cancer treatment effect, so the specificity of the tumor microenvironment (CTLA4, PD1, PDL1 or PDL2 expression level and number of T lymphocytes, etc.) Research on Korean medicine and various combination therapy are being actively studied. According to recent research results, the cancer treatment effect of immune checkpoint inhibitors differs depending on the distribution of intestinal bacteria in the patient, and in animal tests, it has been found that certain intestinal bacteria can significantly increase the cancer treatment effect of immune checkpoint inhibitors. However, the mechanism by which specific intestinal bacteria and substances derived from intestinal bacteria enhance the cancer treatment effect of immune checkpoint inhibitors have not been elucidated.
  • Bacterial extracellular vesicles secreted by the Gram-negative bacteria are also known as outer membrane vesicles.
  • Bacterial extracellular vesicles are 20-200 nm in size and contain substances with various biological activities such as proteins, lipids, genetic materials (DNA, RNA), and peptidoglycan
  • gram Extracellular vesicles secreted from negative and gram-positive bacteria also have virulence factors such as lipopolysaccharide (LPS) and lipoteichoic acid (LTA), respectively.
  • Bacterial extracellular vesicles function as information carriers, such as the transfer of proteins or genetic materials between allogeneic species, and cell signal transduction, and contribute to the elimination of competing organisms or enhancement of the survival of bacteria. is known to regulate
  • various bacterial extracellular vesicles have direct therapeutic efficacy against various diseases including cancer, and can be used as drug carriers to treat these diseases, and can be used to prevent or treat various diseases such as meningitis. It is being used or developed clinically as a vaccine delivery system for
  • Bacterial extracellular vesicles also contain a variety of substances that can stimulate the immune system. Bacterial extracellular vesicles are safer than bacteria themselves because they are non-living organisms from which the bacteria themselves have been eliminated. It has been reported that when bacterial extracellular vesicles are injected intravenously into cancer-bearing mice, the bacterial extracellular ER induces a long-term anti-cancer immune response that effectively removes cancerous tissues without significant side effects (Nature Communications. 8:626, 2017).
  • the bacterial extracellular endoplasmic reticulum specifically accumulates in cancer tissues with enhanced permeability and retention (EPR) effects due to its nano-size characteristics, and the mechanism of secretion of IFN- ⁇ , an anticancer cytokine, from natural killer cells and T lymphocytes is estimated to induce an anticancer immune response (Nature Communications. 8:626, 2017).
  • EPR permeability and retention
  • the present invention provides a method for enhancing the cancer treatment efficacy of the bacterial extracellular ER by administering the bacterial extracellular ER in combination with an immune checkpoint inhibitor, and the bacterial extracellular ER and the immune checkpoint inhibitor It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an active ingredient.
  • compositions for preventing or treating cancer comprising a bacterial extracellular vesicle and an immune checkpoint inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer which is essentially composed of a bacterial extracellular vesicle and an immune checkpoint inhibitor.
  • Gram-negative bacteria are composed of an outer membrane and an inner membrane (cytoplasmic membrane)
  • Gram-positive bacteria are composed of one cell membrane (cytoplasmic membrane).
  • the bacterial extracellular ER is a membrane-type ER (native extracellular vesicle) that bacteria (including transformed bacteria) naturally secrete out of the cell (native extracellular vesicle) and an artificially made membrane-type ER (artificial vesicle).
  • Extracellular vesicles artificial extracellular vesicles).
  • Natural extracellular vesicles are called extracellular vesicles, outer membrane vesicles, shedding vesicles, microvesicles, microparticles, exosomes, etc., All of these may be understood to be included in the extracellular vesicles in the present invention.
  • Artificial extracellular vesicles can be used to extrude bacteria (including transformed bacteria) in a variety of ways, including extrusion, sonication, cell lysis, pH change, temperature change, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation, and antibiotics or surfactants.
  • Membrane-type ERs artificially made by a method selected from the group consisting of chemical treatment or a combination thereof, all of which can be understood to be included in the extracellular ER in the present invention, and the method for making artificial extracellular ER is limited thereto it's not going to be
  • artificial extracellular vesicles include outer membrane-derived vesicles (OMDV), inner membrane-derived vesicles (IMDV), and inner/outer membrane-derived extracellular vesicles (IMDV).
  • inner-outer membrane-derived vesicle -inner-outer membrane-derived vesicle coexists or has an inner membrane within the outer membrane, conversely, a form with an outer membrane inside the inner membrane
  • CMDV cell membrane-derived vesicles
  • the type of the bacteria is not limited. Specifically, the bacteria may be gram-negative bacteria or gram-positive bacteria.
  • Gram-negative bacteria examples include Escherichia genus, Helicobcater genus, Hemophilus genus, Neisseria genus, Cyanobacterium genus, Klebsiella genus , acetonitrile bakteo (Acetobacter), A ahsine Sat bakteo (Acinetobacter) genus, Enterobacter bakteo (Enterobacter) genus, Chlamydia (Chlamydia) genus Vibrio (Vibrio) genus Pseudomonas (Pseudomonas) in Salmonella (Salmonella), A thioether bakteo ( Thiobacter), A borelri Ah (Borrelia) genus Burkholderia (Burkholderia) genus Serratia (Serratia), A Trail Four nematic (Treponema), A rike Nella (Rikenella) in Ali Stevenage Fez (
  • Gram positive bacteria Bacillus (Bacillus), A No-carboxylic Dia (Nocardia) genus, Clostridium (Clostridium) in, propionyl sludge tumefaciens (Propionibacterium), An evil Martino My process (Actinomyces) genus Enterococcus ( Enterococcus) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Listeria (Listeria) genus Lactobacillus (Lactobacillus) in the guard four mozzarella (Gardnerella) genus Mycobacterium (Mycobacterium) genus Mycoplasma (Mycoplasma), A Staphylococcus (Staphylococcus) genus Streptomyces (Streptomyces), a micro Rhodococcus (Micrococcus), a Streptococcus (Streptococcus) genus Bifidobacterium (Bifidobacterium (Bif
  • the bacterium may be a transformed bacterium.
  • the transformed bacterium includes a bacterium transformed so that the toxicity of the extracellular endoplasmic reticulum is weakened, for example, a bacterium in which an endotoxin-producing gene is deleted or modified.
  • a bacterium transformed to have a deletion in the msbB gene ( ⁇ msbB ) more preferably a gram-negative bacterium transformed to have a deletion in the msbB gene, most preferably Escherichia coli transformed to have a deletion in the msbB gene may be, but is not limited thereto.
  • the bacteria also include bacteria transformed to secrete extracellular vesicles well.
  • the bacteria include bacteria transformed to be targeted to a specific cell or tissue, and examples thereof include bacteria transformed to target cancer blood vessels, cancer tissues, or cancer cells.
  • the bacteria used in the present invention include bacteria transformed to fusion with the cell membrane of target cells, bacteria transformed to express a substance for disease treatment and/or diagnosis, and inhibition of the specific substance and a specific substance Including, but not limited to, bacteria and the like transformed so that the expression occurs at the same time.
  • Transformation of bacterial cells may include, but is not limited to, a method of increasing or changing the expression of a substance such as a protein by giving a stimulus to the cell, or a method of increasing or inhibiting the expression of a protein through gene introduction.
  • a method for increasing the expression of a specific protein may use plasmid DNA, RNA or phage, heat shock, calcium phosphate precipitation, lipofectamine transfection Transfection), electroporation (electroporation), microinjection (microinjection), as well as methods such as all commonly known methods can be used.
  • a specific gene may be removed from the cell, and any method known in general may be used as well as a method using antisense RNA or the like.
  • the bacteria may be characterized in that the bacteria are cultured in a chemically defined medium.
  • the "chemical composition medium” refers to a synthetic medium prepared only with substances with clear composition and chemical properties, as opposed to a "natural medium” using naturally-derived materials whose composition is unclear, such as serum and tissue extract. .
  • the bacteria may be preferably cultured in a chemically formulated medium.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium, DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640), but is not limited thereto.
  • the bacteria are immune checkpoint proteins, cell adhesion molecules, various antibodies including immune checkpoint inhibitors, IL-12 or interferon gamma, etc., proteins that enhance therapeutic efficacy (cytokine, It may be characterized in that it is transformed to express one or more selected from the group consisting of chemokine, growth factor), target inducing (targeting) protein, cell membrane fusion material, or a fusion protein thereof, but is not limited thereto .
  • a fusion protein of various proteins such as outer membrane protein or inner membrane protein (e.g., a fusion protein of PrsA, an inner membrane protein and human epidermal growth factor (EGF), a target inducing protein)
  • outer membrane protein or inner membrane protein e.g., a fusion protein of PrsA, an inner membrane protein and human epidermal growth factor (EGF), a target inducing protein
  • EGF human epidermal growth factor
  • the bacterium may be a bacterium transformed to display a human immune checkpoint protein (PD1, PDL1, etc.) or an antibody therefor to inhibit the efficacy of the immune checkpoint inhibitor on the surface of the extracellular vesicle, more preferably may be a gram-negative bacterium transformed to express a human immune checkpoint protein (PD1, PDL1, etc.) or an antibody therefor, and most preferably a human immune checkpoint protein (PD1, PDL1, etc.) or an antibody therefor. It may be a converted E. coli, but is not limited thereto.
  • ⁇ msbB Escherichia coli with weakened lipopolysaccharide toxicity is transformed with a pHCE-prsA-EGF vector expressing a fusion protein of human EGF and bacterial inner membrane protein PrsA, and ⁇ msbB -prsA-EGF E. coli was prepared, and the extracellular vesicles were isolated therefrom.
  • the pharmaceutical composition may further include a drug for inhibiting toxicity caused by bacterial extracellular vesicles, immune checkpoint inhibitors, and combinations thereof.
  • the drug includes drugs that inhibit toxicity caused by endotoxin, and examples thereof include polymyxin B, dexamethasone, anti-inflammatory agents including aspirin, anticoagulants, COX (cyclooxygenase) inhibitors, etc. and is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a drug that increases anticancer efficacy.
  • the drug is an anticancer agent, a STING (stimulator of interferon genes) agonist, a TGF beta inhibitor, a drug that inhibits Th17 (T helper 17 cell) immune response, a drug that inhibits the production or activity of interleukin (IL)-6, a blood vessel Drugs that inhibit the production or activity of endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor, VEGF), and drugs that inhibit STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) signal transduction, and the like, but are not limited thereto.
  • examples of drugs that inhibit the Th17 immune response include aspirin, and examples of drugs that inhibit VEGF production or activity include drugs that inhibit signal transduction by VEGF receptors.
  • the membrane of the bacterial extracellular endoplasmic reticulum may be characterized in that it further comprises a component other than the cell membrane of the bacteria.
  • a component other than the cell membrane it may include a target inducing material, a cell membrane fusion material (fusogen), cyclodextrin, polyethyleneglycol, and the like.
  • a cell membrane fusion material frusogen
  • cyclodextrin cyclodextrin
  • polyethyleneglycol polyethyleneglycol
  • components other than the cell membrane may be added by various methods, including chemical modification of the cell membrane.
  • the membrane component of the bacterial extracellular vesicle is modified by a chemical method using a thiol group (-SH) or an amine group (-NH 2 ), or by chemically binding polyethylene glycol to the bacterial extracellular vesicle.
  • the membrane component of the extracellular ER may be chemically modified.
  • the bacterial extracellular vesicles according to the present invention may further include chemically modifying the membrane component during production.
  • the bacterial extracellular vesicles according to the present invention can be isolated from bacterial cultures according to various methods known in the art.
  • the technology for separating the extracellular vesicles from the bacterial culture is not particularly limited, for example, ultracentrifugation, density gradient ultracentrifugation, ultrafiltration, size exclusion chromatography. size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, immunoaffinity capture, microfluidics-based isolation, aqueous two phase system, or precipitation
  • a method such as a recipe may be used.
  • the "immune checkpoint” refers to proteins involved in inducing stimulation or suppression signals of immune responses on the surface of immune cells, and cancer cells properly stimulate immune responses and thus suppression of cancer cells through these immune checkpoints. It evades the immune system's surveillance network by manipulating it to prevent it from happening.
  • the immune checkpoint protein is PD1 (programmed cell death-1), PDL1 (programmed cell death-ligand 1), PDL2 (programmed cell death-ligand 2), CD27 (cluster of differentiation 27), CD28 (cluster of differentiation 28) ), CD70 (cluster of differentiation 70), CD80 (cluster of differentiation 80), CD86 (cluster of differentiation 86), TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), CD137 (cluster of differentiation 137), CD276 (cluster of differentiation) differentiation 276), KIRs (killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), TNFRSF4 (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4), GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL (glucocorticoid) -induced TNFR-related protein ligand), 4-1BBL (4-IBB ligand), CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte
  • immune checkpoint inhibitor is an antagonist that targets the immune checkpoint protein, and exhibits an anticancer effect by an immune response by enhancing a protein that stimulates an immune response or blocking a protein that suppresses an immune response.
  • the immune checkpoint inhibitor may be a protein or peptide such as a soluble fusion protein.
  • such protein is PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL, 4-1BBL, CTLA4, A2aR, VTCN1, BTLA , a receptor/ligand binding domain (eg, an extracellular domain) of IDO, TIM3, VISTA, or KLRA.
  • the receptor/ligand binding domain may be fused to an immunoglobulin Fc domain.
  • fusion proteins can be prepared by standard recombinant DNA techniques (see, eg, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). In addition, many expression vectors already encoding fusion moieties are commercially available.
  • the immune checkpoint inhibitor is an immune checkpoint protein (eg, PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL , 4-1BBL, CTLA4, A2aR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, or KLRA).
  • immune checkpoint protein eg, PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL , 4-1BBL, CTLA4, A2aR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, or KLRA.
  • antibody may refer to both an intact antibody and an antigen-binding fragment thereof.
  • Such antibodies include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), single-chain antibodies and antigen-binding antibody fragments.
  • An antigen-binding fragment of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to bind an antigen. Examples of binding fragments include Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, disulfide linked Fv, Fd, diabodies, single chain antibody, camelid antibody, isolated CDR-H3, and other antibody fragments that retain at least a portion of the variable region of an intact antibody.
  • Such antibody fragments may be obtained using conventional recombinant and/or enzymatic techniques and screened for antigen-binding in the same manner as intact antibodies.
  • the immune checkpoint inhibitor is an immune checkpoint protein (eg, PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL, 4-1BBL, CTLA4, A2AR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, or KLRA).
  • Inhibitory nucleic acid molecules can be prepared by chemical synthesis, in vitro transcription, or cleavage of long dsRNAs by Rnase III or Dicer.
  • Inhibitory nucleic acid molecules can be delivered to cells in vitro or in vivo , eg, into a mammalian tumor or hypoxic tissue. Typical delivery means known in the art may be used.
  • interfering RNA can be delivered systemically using methods and compositions described, for example, in PCT Application Serial No. PCT/US2009/036223, each of which is incorporated by reference in its entirety.
  • the inhibitory nucleic acid is delivered locally.
  • delivery to the tumor can be, for example, in Takahashi et al., Journal of Controlled Release 116:90-95 (2006, each of which is incorporated by reference in its entirety).
  • Kim et al. Journal of Controlled Release 129:107-116 (2008).
  • the immune checkpoint inhibitor is Durvalumab, Atezolizumab, Avelumab, Tremelimumab, Ipilimumab, Pembrolizumab ( Pembrolizumab), nivolumab, pidilizumab, BMS986016, semiprimab and lirilumab may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • Immune checkpoint inhibitors have fewer side effects such as vomiting and hair loss than general cytotoxic anticancer drugs, and have a large therapeutic effect. In addition to the advantages of using an immune response system with excellent memory, the therapeutic effect can last for a long time after drug administration is stopped. There is nothing known about the enhancement of the anticancer effect according to the combination with the extracellular vesicles, and therefore, the synergic effect of the cancer treatment effect according to the combination of the immune checkpoint inhibitor and the bacterial extracellular vesicles can be a technical feature of the present invention.
  • the bacterial extracellular ER and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously, sequentially or separately.
  • “simultaneous” means that two agents are administered simultaneously
  • “sequentially” means that one agent is administered within 5 minutes, within 10 minutes, or within several hours after the other agent, provided that the first The circulating half-lives of the administered agents are provided such that they are both present in a therapeutically effective amount at the same time.
  • simultaneous, sequential or separate administration methods are not limited to once, and these administration methods may be administered repeatedly or in combination.
  • the bacterial extracellular vesicles and the immune checkpoint inhibitor may be included in the same composition together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and/or diluent.
  • the bacterial extracellular vesicles and the immune checkpoint inhibitor may be provided in separate pharmaceutical forms or under kit-of-parts.
  • the cancer is gastric cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, bone cancer, non-small cell cancer Bone cancer, blood cancer, skin cancer, head or neck cancer, uterine cancer, rectal cancer, perianal cancer, colon cancer, fallopian tube cancer, endometrial cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma , thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, salivary gland cancer, sarcoma cancer, pseudomyx
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain only bacterial extracellular vesicles and an immune checkpoint inhibitor, or may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain excipients or diluents.
  • the carrier includes all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • composition of the present invention may be administered to mammals including humans by any method.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal administration can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as a formulation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient as a single dose, or may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg, most preferably 0.1 ⁇ g to 500 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route and number of treatments, as well as the patient's age, weight, health status, sex, severity of disease, diet and excretion rate, etc., the effective dosage for the patient is determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the "target cell” refers to a bacterial extracellular ER, an extracellular vesicle with a modified surface, or a cell involved in binding to an immune checkpoint inhibitor or inducing a physiological stimulus or inhibitory signal, and includes cancer cells, immune cells (T Lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, NKT cells, macrophages, dendritic cells, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, bone marrow-derived suppressor cells, etc.), endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts, etc. including, but not limited to.
  • immune cells T Lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, NKT cells, macrophages, dendritic cells, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, bone marrow-derived suppressor cells, etc.
  • endothelial cells epithelial cells, fibroblasts, etc. including, but not limited to
  • the present invention provides the use of a bacterial extracellular vesicle and an immune checkpoint inhibitor for the manufacture of a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides a cancer treatment method comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising the bacterial extracellular vesicle and an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits the effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or inhibiting or reducing cancer progression when administered to an individual, and the 'individual' refers to an animal, preferably a mammal, In particular, it may be an animal including a human, and may be an animal-derived cell, tissue, organ, or the like. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention refers generically to ameliorating cancer or symptoms caused by cancer, which may include curing, substantially preventing, or ameliorating the condition of cancer, as long as it results from the cancer. including, but not limited to, alleviating, curing, or preventing various symptoms or most of the symptoms.
  • the term “comprising” is used in the same sense as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically Additional components or method steps that have not been excluded are not excluded.
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients not specifically described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect the basic properties thereof in addition to the substances or steps described.
  • composition of the present invention comprising the bacterial extracellular vesicle and various immune checkpoint inhibitors in single or a combination of two or more as an active ingredient exhibits a synergistic effect in cancer treatment compared to a single dosage formulation of each agent, and It exhibits an action of alleviating side effects caused by high-dose administration, and as a result, provides a method for enhancing cancer treatment efficacy, which can be very usefully utilized in the development of cancer therapeutics.
  • FIG. 1 is a view showing the experimental schedule of co-administration of anti-PD1 antibody and natural extracellular vesicles ( EGF EV M9+) to mice transplanted with colorectal cancer cells (CT26).
  • EGF EV M9+ natural extracellular vesicles
  • Figure 2 including Figures 2a and 2b shows the animal's survival rate, tumor volume, and body weight change during the period of co-administration of anti-PD1 antibody and natural extracellular vesicle ( EGF EV M9+) to mice transplanted with colorectal cancer cells (CT26). and a result of measuring the change in body temperature.
  • EGF EV M9+ extracellular vesicle
  • CT26 colorectal cancer cells
  • Figure 3 including Figures 3a to 3g is a tumor microenvironment after administration of natural or artificial extracellular vesicles (EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB ) to a mouse transplanted with bladder cancer cells (MB49). It is the result of confirming the expression change of the immune checkpoint proteins PDL1, CTLA4, and CD80 by flow cytometry analysis of the existing cells.
  • EV VP-LB natural or artificial extracellular vesicles
  • CMDV VP-LB or OMDV VP-LB a tumor microenvironment after administration of natural or artificial extracellular vesicles (EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB ) to a mouse transplanted with bladder cancer cells (MB49). It is the result of confirming the expression change of the immune checkpoint proteins PDL1, CTLA4, and CD80 by flow cytometry analysis of the existing cells.
  • Figure 4 including Figures 4a to 4g is a tumor microenvironment after administration of natural or artificial extracellular vesicles (EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB ) to mice transplanted with colorectal cancer cells (CT26). It is the result of confirming the expression change of the immune checkpoint proteins PDL1, CTLA4, and CD80 by flow cytometry analysis of the cells present in the
  • Figure 6 including Figures 6a to 6f is treated with natural or artificial extracellular vesicles (EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB ) in spleen cells extracted from mice transplanted with mouse colorectal cancer cells (CT26). This is the result of confirming the expression change of the immune checkpoint proteins, PDL1 and TIGIT, through flow cytometry.
  • EV VP-LB natural or artificial extracellular vesicles
  • CMDV VP-LB or OMDV VP-LB mouse colorectal cancer cells
  • Example 1 Effect of in vivo co-administration of bacterial extracellular vesicles (EV) and immune checkpoint inhibitors
  • a medium (M9+) was prepared in which vitamins and trace elements were added to the M9 chemical composition medium. This was incubated with the human EGF-bacterial lining of pHCE prsA-EGF vector transformed ⁇ msbB prsA-EGF into the E. coli expressing the fusion proteins of the PrsA protein to the Escherichia coli msbB weakening ⁇ lipopolysaccharide used.
  • the culture medium was centrifuged twice at 4°C at 6,000 x g for 20 minutes to remove bacteria, and the supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m membrane filter once, using a membrane capable of removing proteins with a molecular weight of 100 kDa or less. Concentrated 50-fold. After passing the concentrate through a 0.22 ⁇ m filter once, the filtrate was ultra-high-speed centrifuged at 150,000 x g at 4°C for 3 hours.
  • the precipitate was suspended in 2.5 mL of 50% iodixanol, placed in a 5 mL ultra-high speed centrifuge tube, and 1.5 mL of 40% iodixanol and 1.25 mL of 10% iodixanol were sequentially placed thereon. Then, ultracentrifugation was performed at 200,000 x g at 4°C for 2 hours to obtain pure bacterial extracellular vesicles in a layer between 10% iodixanol and 40% iodixanol.
  • EGF EV M9+ The finally isolated bacterial extracellular ER was called EGF EV M9+ as a natural extracellular ER.
  • mice 1x10 6 mice per mouse were injected under the skin of mice (BALB/c, male, 5 weeks old), and mouse colorectal cancer cells (CT26) were injected. brought up After 5 days of administration of the mouse colon cancer cells, the mice were divided into 4 experimental groups of 5 mice each (see Table 2). For each group, the isolated and purified bacterial extracellular vesicles and the immune checkpoint inhibitor were administered alone or in combination.
  • the mouse PD1 (Cat# BE0273) product was purchased and used. First, 5 days after cell administration, PBS or immune checkpoint inhibitor (Ab) was injected into each group.
  • PBS or EGF EV M9+ (EV) was injected into each group. After 9 days of cell administration, PBS or Ab was again injected into each group, and then PBS or EV was injected again for each group 18 days after cell administration. Finally, 20 days after cell administration, PBS or Ab was injected for each group ( FIG. 1 ).
  • mice in each experimental group were continuously observed every day from 6 days after colon cancer cell injection to 24 days after injection.
  • Group # PBS or Ab PBS or EV One PBS PBS 2 PBS EV (0.2 ⁇ g) 3 Ab (50 ⁇ g) PBS 4 Ab (50 ⁇ g) EV (0.2 ⁇ g)
  • the final size of colon cancer tissue was significantly reduced in the PBS-EV (0.2 ⁇ g) and Ab (50 ⁇ g)-EV (0.2 ⁇ g) experimental groups, and finally in the Ab (50 ⁇ g)-PBS experimental group All mice died so comparison was not possible. Also, compared with the PBS-EV (0.2 ⁇ g) experimental group, the final size of the colon cancer tissue was significantly reduced in the Ab (50 ⁇ g)-EV (0.2 ⁇ g) experimental group ( FIG. 2B ).
  • the native extracellular endoplasmic reticulum used in the experiment was prepared according to Example 4 of KR10-2021-0080108 filed in Korea on June 21, 2021, derived from E. coli BL21 (DE3) ⁇ msbB, and finally isolated native The extracellular vesicles were referred to as EV VP-LB .
  • CMDV cell membrane-derived vesicles
  • OMDV outer membrane-derived vesicles
  • CMDV and OMDV E. coli BL21 (DE3) ⁇ msbB -AmCyan was cultured using vegetable peptone-based lysogeny broth (VP-LB). After centrifugation of the culture medium (6,000 x g for 15 minutes), the supernatant was removed to obtain a bacterial cell precipitate and suspended in vehicle-2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% sucrose).
  • the suspension was passed through a microfluidic device (5 times at 10,000 psi) to disrupt the bacterial cells, and a supernatant containing the crushed cell fragments was obtained through centrifugation (6,000 x g, 20 min) and tangential flow filtration (Tangential flow filtration: >500 kDa filter) and concentrated 3 times.
  • the concentrate was divided in half, and half was used to separate CMDV and half OMDV.
  • CMDV CMDV
  • benzonase final concentration 50 units/mL
  • MgCl 2 final concentration 2 mM
  • vehicle-2 was added as much as 4 times the volume of the concentrate, and it was concentrated 5 times by passing through a tangential flow filter (>500 kDa).
  • CMDV was separated through density gradient ultra-high speed centrifugation (sample 6.5 mL, 0.8 M sucrose 3.0 mL, 2.5 M sucrose 3.0 mL, 200,000 x g, 2 hours).
  • sarkosyl (final concentration of 1%) was treated with the previously prepared concentrate at room temperature for 30 minutes. Then, vehicle-2 was added as much as 4 times the volume of the concentrate, and it was concentrated 5 times by passing through a tangential flow filter (>500 kDa). Then, the concentrate was treated with benzonase (final concentration 50 units/mL) together with MgCl 2 (final concentration 2 mM) at 37 o C for 30 minutes. Thereafter, vehicle-2 as much as 4 times the volume of the concentrate was added and passed through a tangential flow filter (>100 kDa) to concentrate 25 times. Then, OMDV was separated through density gradient ultra-high speed centrifugation (sample 6.5 mL, 0.8 M sucrose 3.0 mL, 2.5 M sucrose 3.0 mL 200,000 x g, 2 hours).
  • CMDV VP-LB The finally isolated CMDV and OMDV were designated as CMDV VP-LB and OMDV VP-LB , respectively.
  • the isolated bacterial extracellular vesicles were characterized by referring to the literature (Biomaterials . 113:68-79, 2017).
  • the size distribution was measured by dynamic light scattering analysis using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments).
  • protein concentration and total protein amount were measured using Bradford assay, and particle concentration and total number of particles were measured by nanoparticle tracking analysis using LM10-HS (Malvern Instruments).
  • Example 3 Analysis of changes in the tumor microenvironment (TME) according to the administration of the bacterial extracellular vesicles
  • mice Mouse bladder cancer cells (MB49: injected into C57BL/6) colon cancer cells (CT26: injected into BALB/c) under the skin of mice (C57BL/6, male, 7 weeks old and BALB/c, female, 7 weeks old) After injecting 1x10 6 per animal, they were raised for 7 days. Mice were divided into 5 mice in each group, and EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB was intratumorally administered to the cancer tissue as shown in Table 2 below. After 24 hours of EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB administration, cancer tissues were extracted from each group, and changes in the tumor microenvironment were analyzed by flow cytometry or real-time RT-PCR.
  • Vehicle -1 10 mM L-histidine (pH 7.4), 107 mM NaCl, 2% sucroseVehicle-2: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% sucrose
  • Cell preparation for flow cytometry was performed using the method described in the literature (Methods Mol Biol . 1458:95-110, 2016), and the antibody was anti-PDL1 and anti-CTLA4 manufactured by BD Biosciences, and the analysis equipment was BD Biosciences.
  • the LSR Fortessa (5 Laser) model was used.
  • RNA preparation for real-time RT-PCR analysis was prepared using the method described in the literature (Invitrogen, TRIzol TM Reagent User guide), and the prepared RNA was prepared as cDNA using the GoScirpt TM Reverse Transcriptase Kit (Promega). GAPDH was used as an internal control, real-time PCR was performed in StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems), and the primers required for real-time PCR were purchased from Bioneer.
  • FIGS. 3A to 3G and 4A to 4G Cells present in the tumor microenvironment were analyzed by flow cytometry to confirm changes in the expression of immune checkpoint proteins PDL1, CTLA4, and CD80 ( FIGS. 3A to 3G and 4A to 4G ).
  • Example 4 Analysis of the effect of bacterial extracellular vesicles on spleen cells
  • the spleen is a secondary lymphoid organ, and various immune cells exist and affect the systemic immune response. Therefore, it is expected to provide important clues in cancer treatment to see the change when spleen cells extracted from cancer-bearing mice are treated with bacterial extracellular vesicles.
  • mice colorectal cancer cells (CT26) per mouse under the skin of a mouse (BALB/c, female, 7 weeks old)
  • CT26 mouse colorectal cancer cells
  • the isolated spleen single cells were treated with EV VP-LB , CMDV VP-LB or OMDV VP-LB at 1 ⁇ g/mL for 24 hours, and flow cytometry was performed.
  • Cell preparation for flow cytometry was performed using the method described in the literature (Methods Mol Biol . 1458:95-110, 2016), and the antibody was anti-PDL1 and anti-TIGIT manufactured by BD Biosciences, and the analysis equipment was BD Biosciences.
  • the LSR Fortessa (5 Laser) model was used.
  • composition of the present invention comprising bacterial extracellular vesicles and various immune checkpoint inhibitors in single or a combination of two or more as an active ingredient shows a synergistic effect in cancer treatment compared to a single dosage formulation of each agent, and It exhibits an action of alleviating the side effects caused by high-dose administration, and as a result, provides a method for enhancing the efficacy of cancer treatment, which can be very usefully utilized in the development of cancer therapeutics, and thus has very high industrial applicability.

Abstract

본 발명은 박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능 증진 방법 및 조성에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일 또는 2종 이상이 조합된 다양한 면역관문 억제제를 사용하여 박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능을 증진하는 방법 및 조성에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 상기 각 제제의 단일 투여 제제와 비교해 암 치료에 있어서 상승효과(synergic effect)를 나타내며, 단일 투여 제제의 고용량 투여로 인한 부작용을 경감시키는 작용을 나타내어 암 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능 증진 방법 및 조성
본 출원은 2020년 6월 22일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0076053호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 박테리아 세포밖 소포체(bacteria extracellular vesicle)의 암 치료 효능 증진 방법 및 조성에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일 또는 2종 이상이 조합된 다양한 면역관문 억제제를 사용하여 박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능을 증진하는 방법 및 조성에 관한 것이다.
암은 주요 사망 원인이지만, 질병 발생 초기에 발견된다면 몇몇 경우에서 치료가 가능하다. 그러나 어느 정도 진행되고, 특히 전이를 수반하는 경우에는 암을 여전히 치료하기 쉽지 않다. 대부분의 암에서 존재하는 면역 억제 환경 때문에 암들이 면역 체계(immune system)에 의해 조절되지 않는다는 것이 최근 몇 년 사이 알려지고 인지되어왔다. 그 결과 암을 조절하는 면역 체계를 촉진하는 다양한 방법이 개발되었다. 암면역치료(cancer immunotherapy)는 신체의 면역기능을 이용하여 암을 치료하는 전략으로, 19세기 후반 William B. Coley가 Coley's toxin으로 알려진 박테리아 혼합물 투여에 의한 암 감소를 관찰한 이후 오랫동안 많은 관심과 기대를 받았지만, 1980-1990년대를 거치면서 시도된 다양한 암면역치료법들의 실망적인 결과들로 인하여 일관되고 재현 가능한 암면역치료방법이 절실히 필요하였다. 하지만 최근 몇년간 개발된 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)에 대한 단클론항체들이 다양한 암종에 대해 놀라운 치료 효과를 보임으로써 암면역치료 방법이 현실화되고 있다. 하나 이상의 면역관문을 차단함으로써, 면역관문 억제제들은 면역 체계에 대한 장벽들 중 하나를 제거하고 종양들의 면역 억제 환경을 저해한다. 면역관문 억제제로는 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4(CTLA4), programmed cell death protein 1(PD1) 및 programmed death-ligand 1(PDL1)에 대한 단일 클론 항체(monoclonal antibodies)가 있다.
항원특이 T림프구(T lymphocyte)의 면역반응은 매우 복잡하고 정교하게 조절되며, 세포독성 T림프구(cytotoxic T lymphocyte)가 암세포를 포함한 항원을 가지고 있는 세포를 살해하는 등 대표적인 특이적 면역반응의 하나이다. 항원특이 T림프구가 활성화하기 위해서는 항원 인지와 동시자극(co-stimulatory) 신호가 필요한데 항원제시세포(antigen presenting cell)에서 발현하는 CD80, CD40 등이 T림프구 세포 표면의 리간드에 해당하는 CD28, CD40L 등과 동시에 결합함으로써 이루어진다.
그러나 활성화된 T림프구는 일정시간 후 동시억제(co-inhibitory) 신호의 활성화를 통해 비활성화됨으로써 과도한 면역자극으로 인한 조직 손상 등을 예방할 수 있다. 다양한 동시억제 신호가 있으며 대표적으로 1) T림프구의 CTLA4는 항원보유세포의 리간드인 CD80과 CD86과 결합을 통하여 naive 또는 memory T림프구를 비활성화 시키고, 2) T림프구의 PD1은 항원보유세포의 리간드인 PDL1과 PDL2와 결합을 통하여 말초조직에서 T림프구 기능을 억제한다. 우리 몸의 면역기능은 항원인지와 동시에 이러한 동시자극 신호 및 동시억제신호의 조절을 통하여 전체적인 T림프구 기능을 조절하는데 이를 면역관문이라고 한다.
우리 몸의 면역기능은 암세포에서 발현되는 종양특이항원(tumor-specific neo-antigen)을 감지해 암세포를 제거한다. 암세포는 반대로 이러한 면역공격을 회피하기 위하여 종양미세환경(tumor microenvironment)을 변화시켜 억제 면역관문을 활성화시켜 면역기능을 억제하거나 T림프구 면역관용(immune tolerance) 또는 면역편집(immuno-editing) 등을 통하여 종양특이 킬러 T림프구의 공격을 회피한다. 최근 CTLA4나 PD1 또는 리간드 PDL1에 대한 단클론항체 면역관문 억제제들을 이용하여 억제된 종양특이 세포독성 T림프구를 활성화시켜 악성 흑색종, 신장암이나 비소세포폐암 등 다양한 암에 대한 치료 효과가 있음이 규명되었다. 그러나 면역관문 억제제는 일부 암에서만, 그리고 그러한 암을 가진 환자 중에서도 일부에서만 치료에 차도를 보이는데, 이는 여러 암에서 다른 종류의 면역 억제 기작이 작용함을 시사한다.
상기한 면역관문 억제제들은 놀라운 암 치료 효과에도 불구하고 환자에 따라 치료 효과가 차이가 있어, 환자에 따른 종양미세환경의 특이성(CTLA4, PD1, PDL1 또는 PDL2의 발현 정도 및 T림프구의 수 등)에 대한 연구와 다양한 병용치료(combination therapy) 등이 활발히 연구되고 있다. 최근의 연구결과에 의하면, 환자의 장내 세균 분포에 따라 면역관문 억제제의 암 치료 효과가 상이하며 동물시험에서 특정 장내 세균들이 면역관문 억제제들의 암 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음이 규명되었다. 하지만 특정 장내 세균들이 어떤 기전으로 그리고 어떤 장내 세균 유래 물질들이 면역관문 억제제들의 암 치료 효과를 증진시키는지에 대해서는 규명되지 않았다.
한편 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아(Gram-negative and Gram-positive bacteria)를 포함한 모든 세포는 세포밖 소포체를 자연적으로 분비하는 것으로 알려져 있다. 상기 그람 음성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 외막 소포체(outer membrane vesicle)로도 알려져 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 크기가 20-200 nm이고, 단백질(proteins), 지질(lipids), 유전 물질(DNA, RNA) 및 펩티도글리칸(peptidoglycan) 등 다양한 생물학적 활성을 가진 물질들을 가지고 있으며, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 각각 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA)와 같은 독성 인자(virulence factor)도 가지고 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 동종 간의 단백질 혹은 유전 물질의 전달, 세포 신호 전달과 같은 정보 전달체로서의 기능과 경쟁적 생물체의 제거 혹은 박테리아의 생존 증진에 기여하며, 숙주에 독소 등을 전달함으로써 박테리아 감염 질환의 병인 현상을 조절한다고 알려져 있다.
최근의 연구 결과에 의하면, 다양한 박테리아 세포밖 소포체가 암을 비롯한 여러 질병에 대한 직접적인 치료 효능이 있을 뿐만 아니라, 이들 질병을 치료하기 위한 약물 전달체로 사용 가능하며, 뇌수막염 등 다양한 질병을 예방하거나 치료하기 위한 백신 전달체로 임상에 사용되거나 개발되고 있다.
또한 박테리아 세포밖 소포체는 면역 체계를 촉진할 수 있는 다양한 물질들을 가지고 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 박테리아 자체가 제거된 비생명체이기 때문에 박테리아 자체보다 안전하다. 박테리아 세포밖 소포체를 암을 가진 마우스의 정맥을 통해 주입할 경우, 박테리아 세포밖 소포체는 뚜렷한 부작용 없이 암 조직을 효과적으로 제거하는 장기 항암 면역 반응을 유도하는 것으로 보고되어 있다(Nature Communications. 8:626, 2017). 더 나아가, 박테리아 세포밖 소포체는 나노 크기라는 특성 때문에 enhanced permeability and retention(EPR) effects로 암 조직에 특이적으로 누적되고, 자연살해세포와 T림프구로부터 항암 사이토카인인 IFN-γ가 분비되도록 하는 기작으로 항암 면역 반응을 유도하는 것으로 추정되고 있다 (Nature Communications. 8:626, 2017).
하지만 박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제를 포함한 다른 기작의 항암제와 병용치료하면 암 치료 효능을 증진시키는지에 대해서는 규명되지 않았다.
본 발명자는 암 성장을 효과적으로 저해하면서도 부작용을 나타내지 않는 암 치료 효능 증진 방법 및 암 치료용 병용제제를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 박테리아 세포밖 소포체를 면역관문 억제제와 병용 투여함으로써 이와 같은 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박테리아 세포밖 소포체를 면역관문 억제제와 병용 투여함으로써 박테리아 세포밖 소포체의 암 치료 효능을 증진하는 방법을 제공하고 박테리아 세포밖 소포체 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 박테리아 세포밖 소포체 및 면역관문 억제제로 이루어진 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 박테리아 세포밖 소포체 및 면역관문 억제제로 필수적으로 이루어진 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
통상적으로, 그람 음성 박테리아는 외막(outer membrane)과 내막(inner membrane 또는 cytoplasmic membrane) 두개의 막으로 구성되어 있고 그람 양성 박테리아는 1개의 세포막(cytoplasmic membrane)으로 구성되어 있다. 본 발명에서 박테리아 세포밖 소포체는 박테리아(형질전환된 박테리아 포함)가 자연적으로 세포밖으로 분비하는 막(membrane) 유형의 소포체(자연 세포밖 소포체: native extracellular vesicle)와 인공적으로 만들어진 막 유형의 소포체(인공 세포밖 소포체: artificial extracellular vesicle)를 통칭하는 것이다. 자연 세포밖 소포체는 세포밖 소포체(extracellular vesicle), 외막 소포체(outer membrane vesicle), 쉐딩 소포체(shedding vesicle), 마이크로베시클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 엑소좀(exosome) 등으로 불리며, 이들은 모두 본 발명에서 상기 세포밖 소포체에 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
인공 세포밖 소포체는 박테리아(형질전환된 박테리아 포함)를 압출, 초음파 분해, 세포 용해, pH 변화, 온도 변화, 균질화, 냉동-해동, 전기 천공, 기계적 분해, 및 항생제 또는 계면활성제(detergent) 등 다양한 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법이나 이들의 조합으로 인공적으로 만들어진 막 유형의 소포체로, 이들은 모두 본 발명에서 상기 세포밖 소포체에 포함되는 것으로 이해될 수 있으며 인공 세포밖 소포체를 만드는 방법은 이에 한정되는 것이 아니다. 또한 그람 음성 박테리아의 경우 인공 세포밖 소포체는 외막 유래 세포밖 소포체(outer membrane-derived vesicle: OMDV), 내막 유래 세포밖 소포체(inner membrane-derived vesicle: IMDV), 그리고 내막/외막 유래 세포밖 소포체(inner-outer membrane-derived vesicle -외막과 내막 성분이 동시에 존재하거나, 외막 안에 내막이 있는 형태, 반대로 내막 안에 외막이 있는 형태 등), 및 외막 유래 베지클, 내막 유래 베지클 및 내막/외막 유래 베지클을 모두 포함하는 세포막 유래 세포밖 소포체(cell membrane-derived vesicle: CMDV)를 모두 포괄하는 개념으로 크기가 20 nm 내지 1,000 nm 인 것을 의미하며, 이들은 모두 본 발명에서 상기 인공 세포밖 소포체에 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리아의 종류는 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
상기 그람 음성 박테리아의 예는 이스체리치아(Escherichia) 속, 헬리코박터(Helicobcater) 속, 헤모필루스(Hemophilus) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 시아노박테리움(Cyanobacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 클라미디아(Chlamydia) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 티오박터(Thiobacter) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 리케넬라(Rikenella) 속, 알리스티페스(Alistipes) 속, 마리닐라빌리아(Marinilabilia) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속, 모르가넬라(Morganella) 속, 큐프리아비더스(Cupriavidus) 속, 예르시니아(Yersinia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 레지오넬라(Legionella) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 및 모락셀라(Moraxella) 속 박테리아 등을 포함할 수 있다. 상기 그람 양성 박테리아의 예는 바실러스(Bacillus) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 클로스트리듐(Clostridium) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 가드네렐라(Gardnerella) 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속, 마이코플라스마(Mycoplasma) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 마이크로코커스(Micrococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 아나에로스티페스(Anaerostipes) 속, 코프로코커스(Coprococcus) 속, 아토포비움(Atopobium) 속, 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 및 박테로이데스(Bacteroides) 속 박테리아 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 박테리아는 형질전환된 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 형질전환된 박테리아는 상기 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 내독소(endotoxin) 생성 유전자가 결손되거나 변형된 박테리아를 들 수 있다. 바람직하게는, msbB 유전자가 결손되도록(ΔmsbB) 형질전환된 박테리아, 보다 바람직하게는 msbB 유전자가 결손되도록 형질전환된 그람 음성 박테리아, 가장 바람직하게는 msbB 유전자가 결손되도록 형질전환된 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 박테리아는 세포밖 소포체를 잘 분비하도록 형질전환된 박테리아를 포함한다.
또한 상기 박테리아는 특이 세포나 조직으로 타겟팅되도록 형질전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 암 혈관, 암 조직 또는 암 세포로 타겟팅되도록 형질전환된 박테리아를 들 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에서 사용되는 박테리아는 표적세포의 세포막과 융합(fusion)하도록 형질전환된 박테리아, 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 발현되도록 형질전환된 박테리아, 및 상기 특정 물질의 억제와 특정 물질의 발현이 동시에 일어나도록 형질전환된 박테리아 등을 포함하나, 이에 제한되지 아니한다.
박테리아 세포의 형질전환은 세포에 자극을 주어 단백질 등 물질 발현을 증가 또는 변화시키는 방법, 유전자 도입을 통한 단백질 발현 증가 또는 발현 억제시키는 방법 등이 가능하나 이제 제한되지 아니한다.
특정 단백질의 발현을 증가시키는 방법은 플라스미드(plasmid) DNA, RNA또는 파지(phage)를 이용할 수 있으며, 열충격법(heat shock), 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 리포펙타민 형질주입법(lipofectamine transfection), 전기 천공법(electroporation), 미량주사법(microinjection) 등의 방법뿐만 아니라 일반적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 특정 단백질의 발현을 억제시키기 위해서, 특정 유전자를 세포에서 제거할 수도 있고 안티센스(antisense) RNA등을 이용하는 방법뿐만 아니라 일반적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지(chemically defined medium)에서 배양된 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 "화학 조성 배지"는 혈청, 조직 추출물 등 조성이 불분명한 자연 유래 소재를 사용한 "자연 배지"와 대비되는 것으로서, 조성물의 구성과 화학적 성상이 분명한 물질만으로 제조한 합성 배지를 의미한다. 균일한 효과를 나타내는 세포밖 소포체를 생산하기 위해서 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에서 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 박테리아는 면역관문 단백질, 세포 접합 분자(cell adhesion molecule), 면역관문 억제제를 포함한 다양한 항체(antibody), IL-12 또는 interferon gamma 등 치료 효능을 증진시키는 단백질(cytokine, chemokine, growth factor), 표적 유도(targeting) 단백질, 세포막 융합(fusion) 물질 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 외막 단백질 또는 내막 단백질 등 다양한 단백질의 융합단백질(예. 내막단백질인 PrsA와 표적 유도 단백질인 인간 EGF(epidermal growth factor)의 융합단백질)을 이용하면 상기한 물질들을 세포밖 소포체의 표면에 효과적으로 display할 수 있다.
바람직하게는, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 표면에 면역관문 억제제의 효능을 저해하기 위해 인간 면역관문 단백질(PD1, PDL1 등) 또는 이에 대한 항체가 display되도록 형질전환된 박테리아일 수 있으며, 더 바람직하게는 인간 면역관문 단백질(PD1, PDL1 등) 또는 이에 대한 항체를 발현하도록 형질전환된 그람 음성 박테리아일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 면역관문 단백질(PD1, PDL1 등) 또는 이에 대한 항체를 발현하도록 형질전환된 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균을, 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질전환시켜 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 제작하고, 이로부터 세포밖 소포체를 분리하였다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 박테리아 세포밖 소포체, 면역관문 억제제 및 이들의 조합에 의한 독성을 억제시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약물은 내독소에 의한 독성을 억제하는 약물을 포함하며, 그 예로 폴리믹신(polymyxin) B를 들 수 있으며 덱사메타손(dexamethasone), 아스피린(aspirin)을 포함한 항염증제, 항응고제, COX(cyclooxygenase) 저해제 등 일수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 항암효능을 증가시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약물은 항암제, STING(stimulator of interferon genes)　agonist, TGF 베타 저해제, Th17(T helper 17 세포) 면역반응을 억제하는 약물, 인터루킨(interleukin, IL)-6의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달을 억제하는 약물 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. Th17 면역반응을 억제하는 약물의 예로는 아스피린을 들 수 있으며, VEGF의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물의 예로는 VEGF 수용체에 의한 신호전달을 억제하는 약물을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막이 상기 박테리아의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 세포막 이외의 성분으로서 표적 유도 물질, 세포막 융합 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킴으로써 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 박테리아 세포밖 소포체는 제조 시 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 박테리아 세포밖 소포체는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 따라 박테리아 배양물로부터 분리될 수 있다. 박테리아 배양물로부터 세포밖 소포체를 분리하는 기술은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 초고속원심분리법(ultracentrifugation), 밀도 구배 초고속원심분리법(density gradient ultracentrifugation), 한외여과법(ultrafiltration), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 수성 2 상 시스템(aqueous two phase system), 또는 침전법(precipitation) 등의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역관문"은 면역세포 표면에서 면역 반응의 자극 또는 억제 신호를 유발하는데 관여하는 단백질을 총칭하며, 암세포는 이러한 면역관문을 통해 면역반응의 자극 및 이에 따른 암세포의 억제가 제대로 진행되지 않도록 조작하여 면역체계의 감시망을 회피하게 된다. 바람직하게 상기 면역관문 단백질은 PD1(programmed cell death-1), PDL1(programmed cell death-ligand 1), PDL2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), TNFRSF4(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand), 4-1BBL(4-IBB ligand), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated antign-4), A2aR(adenosine A2A receptor), VTCN1(V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1), BTLA(B- and T-lymphocyte attenuator), IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), TIM3(T-cell immunoglobulin domain and mucin-domain containing-3), VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation), 및 KLRA(killer cell lectin-like receptor subfamily A)를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 PDL1, TIGIT, CD80 또는 CTLA4일 수 있다.
본 발명에서 "면역관문 억제제"는 상기 면역관문 단백질을 표적으로 하는 길항제로서, 면역반응을 자극시키는 단백질을 증진시키거나 면역반응을 억제하는 단백질을 차단하여 면역반응에 의한 항암 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 면역관문 억제제는 가용성 융합 단백질과 같은 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 일 양태에서, 이러한 단백질은 PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL, 4-1BBL, CTLA4, A2aR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, 또는 KLRA의 수용체/리간드 결합 도메인(예컨대, 세포 외 도메인)을 포함한다. 일 양태에서, 수용체/리간드 결합 도메인은 면역글로불린 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992 참조). 게다가, 이미 융합 부분(fusion moiety)를 코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 면역관문 억제제는 면역관문 단백질(예컨대, PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL, 4-1BBL, CTLA4, A2aR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, 또는 KLRA)에 결합하고 억제하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명에서 "항체"는 온전한 항체 및 이의 항원 결합 단편 둘 다를 지칭할 수 있다. 상기 항체는 예컨대, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중 특이성 항체(예컨대, 이중 특이성 항체), 단쇄(single-chain) 항체 및 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 디설파이드 결합된 Fv, Fd, 디아바디(diabodies), 단쇄 항체, 낙타 항체(camelid antibody), 분리된 CDR-H3, 및 온전한 항체의 가변 영역의 적어도 일부를 보유하는 다른 항체 단편을 포함한다. 이러한 항체 단편은 종래의 재조합 및/또는 효소 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 온전한 항체와 동일한 방식으로 항원-결합에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 면역관문 억제제는 면역관문 단백질(예컨대 PD1, PDL1, PDL2, CD27, CD28, CD70, CD80, CD86, TIGIT, CD137, CD276, KIRs, LAG3, TNFRSF4, GITR, GITRL, 4-1BBL, CTLA4, A2AR, VTCN1, BTLA, IDO, TIM3, VISTA, 또는 KLRA)를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는, 억제 핵산(예컨대, siRNA 분자, shRNA 분자, 안티센스 RNA)일 수 있다. 억제 핵산 분자는 화학적 합성, 시험관 내(in vitro) 전사, 또는 Rnase III 또는 다이서(Dicer)에 의한 긴 dsRNA의 절단에 의해 제조될 수 있다. 억제 핵산 분자는 시험관 내(in vitro)에서 세포로 또는 생체 내(in vivo)에서, 예컨대, 포유동물의 종양 또는 저산소 조직으로 전달될 수 있다. 당 업계에 공지된 전형적인 전달 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 간섭 RNA는, 예컨대, 각각이 그 전체가 참고로 인용되는 PCT 출원 제PCT/US2009/036223호 등에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 전신으로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서 억제 핵산은 국소적으로 전달된다. 예를 들어, 본원에 기재된 억제 핵산이 암을 치료하기 위해 사용될 때, 종양으로의 전달은 예컨대, 각각이 그 전체가 참고로 인용되는 Takahashi et al., Journal of Controlled Release 116:90-95 (2006) 및 Kim et al., Journal of Controlled Release 129:107-116 (2008)에 기재된 바와 같은 종양 내 주사에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 면역관문 억제제는 더발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 트리멜리무맙(Tremelimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 피딜리주맙(Pidilizumab), BMS986016, 세미프리맙(Cemiplimab) 및 릴리루맙(lirilumab)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
면역관문 억제제는 일반적인 세포 독성 항암제보다 구토나 탈모와 같은 부작용이 적고, 치료 효과가 크다는 장점 이외에도 기억능이 우수한 면역반응 체계를 이용하기 때문에 약물 투여를 중단한 후에도 치료효과가 오랫동안 지속될 수 있으나, 박테리아 세포밖 소포체와의 병용에 따른 항암 효과 증진에 대해서는 알려진 바가 없으며, 따라서 면역관문 억제제와 박테리아 세포밖 소포체의 병용에 따른 암 치료 효과의 상승작용(synergic effect)이 본 발명의 기술적 특징이 될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제는 동시에, 순차적으로 또는 별도로 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 "동시에"는 2개의 제제가 동시에 투여되는 것을 의미하고, "순차적으로"는 하나의 제제가 다른 제제 후 5분 이내, 10분 이내 또는 수시간 내에 투여되도록 하고, 단, 제1 투여된 제제의 순환 반감기는 이들이 둘 다 동시에 치료학적 유효량으로 존재하도록 제공된다. 또한, 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여되는 방법은 1회에 한정되는 것은 아니며, 이들 투여 방법이 반복적으로, 또는 혼합되어 투여될 수도 있다.
일 양태에서, 박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 동일한 조성물 내에 포함될 수 있다.
또 다른 일 양태에서, 박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제는 별도의 약제학적 형태 또는 부품 키트 (kit-of-parts) 하에 제공될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 위암, 폐암, 비소세포성 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 대장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 골암, 비소세포성 골암, 혈액암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 직장암, 항문 부근암, 결장암, 나팔관암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 침샘암, 육종암, 가성점액종, 간모세포종, 고환암, 교모세포종, 구순암, 난소생식세포종양, 기저세포암, 다발성골수종, 담낭암, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 복막암, 설암, 소세포암, 소아림프종, 신경모세포종, 십이지장암, 요관암, 성상세포종, 수막종, 신우암, 외음부암, 흉선암, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 박테리아 세포밖 소포체 및 면역관문 억제제만을 포함하거나, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 μg 내지 10,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 μg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "표적세포"는 박테리아 세포밖 소포체, 표면이 변형된 세포밖 소포체 또는 면역관문 억제제가 결합하거나 생리적 자극 또는 억제 신호를 유발하는데 관여하는 세포를 총칭하며, 암 세포, 면역 세포(T림프구, B림프구, NK세포, NKT세포, 대식세포, 수지상세포, 단핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만세포(mast cell), 골수유래억제세포 등), 내피세포, 상피세포, 섬유아세포 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 암 치료제를 제조하기 위한 박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 암의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 암 진행의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 암 또는 암으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 암을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 암으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “을 포함하는(comprising)”이란 “함유하는(including)” 또는 “특징으로 하는(characterized by)”과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 “로 이루어지는(consisting of)”이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 “필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)”이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
박테리아 세포밖 소포체 및 단일 또는 2종 이상이 조합된 다양한 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 각 제제의 단일 투여 제제와 비교해 암 치료에 있어서 상승효과를 나타내며, 단일 투여 제제의 고용량 투여로 인한 부작용을 경감시키는 작용을 나타내어, 결과적으로 암 치료 효능을 증진하는 방법을 제공하여 암 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 대장암 세포(CT26)를 이식한 마우스에 anti-PD1 항체와 자연 세포밖 소포체(EGFEVM9+)를 병용투여하는 실험 일정을 나타낸 도면이다.
도 2a 및 2b를 포함하는 도 2는 대장암 세포(CT26)를 이식한 마우스에 anti-PD1 항체와 자연 세포밖 소포체(EGFEVM9+)를 병용투여하는 기간 동안 동물의 생존율, 종양 부피, 체중변화 및 체온변화를 측정한 결과이다.
도 3a 내지 3g를 포함하는 도 3은 방광암 세포(MB49)를 이식한 마우스에 자연 또는 인공 세포밖 소포체(EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB)를 투여한 후 종양미세환경에 존재하는 세포들을 유세포 분석하여 면역관문 단백질인 PDL1, CTLA4, 및CD80의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4g를 포함하는 도4는 대장암 세포(CT26)를 이식한 마우스에 자연 또는 인공 세포밖 소포체(EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB)를 투여한 후 종양미세환경에 존재하는 세포들을 유세포 분석하여 면역관문 단백질인 PDL1, CTLA4, 및CD80의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 방광암 세포(MB49)를 이식한 마우스에 자연 또는 인공 세포밖 소포체(EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB)를 투여한 후 종양미세환경에 존재하는 세포들을 qRT-PCR로 분석하여 면역관문 단백질인 IDO1의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6a 내지 6f를 포함하는 도 6은 마우스 대장암 세포(CT26)을 이식한 마우스에서 추출한 비장 세포에 자연 또는 인공 세포밖 소포체(EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB)를 처리한 뒤 유세포 분석을 통해 면역관문 단백질인 PDL1과 TIGIT의 발현 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리아 세포밖 소포체(EV)와 면역관문 억제제의 in vivo 병용투여 효과
실험방법
자연 세포밖 소포체 제조
하기 표 1에 나타난 바와 같이 M9 화학 조성 배지에 비타민과 미량 원소를 첨가한 배지(M9+)을 제조하였다. 이를 이용하여 지질 다당류가 약화된 ΔmsbB 대장균에 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질전환된 ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 배양하였다.
Component Concentration
Salts and glucose
Na2HPO4·2H2O 42.3 mM
KH2PO4 22.0 mM
NH4Cl 9.4 mM
NaCl 8.6 mM
MgSO4·7H2O 1.0 mM
CaCl2·2H2O 0.3 mM
Glucose 0.4%
Vitamins
Thiamine 3.0 μM
Biotin 4.1 μM
Trace elements
EDTA 0.2 mM
FeCl3 30.7 μM
ZnCl2 6.2 μM
CuCl2·2H2O 0.8 μM
CoCl2·6H2O 0.4 μM
H3BO3 1.6 μM
MnCl2 ·4H2O 81.0 nM
배양액을 4℃에서 6,000 x g로 20분간 두 번 원심분리하여 박테리아를 제거하고, 상층액을 0.45 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 멤브레인을 이용하여 50배 농축하였다. 농축액을 0.22 μm 필터에 1회 통과시킨 후, 여과액을 4℃에서 150,000 x g로 3시간 동안 초고속 원심 분리하였다. 침전물을 50% iodixanol 2.5 mL에 현탁한 후, 5 mL 용량의 초고속 원심 분리 튜브에 넣은 후, 그 위에 40% iodixanol 1.5 mL, 10% iodixanol 1.25 mL을 차례로 담았다. 이후, 4℃에서 200,000 x g로 2시간 동안 초고속원심분리하여, 10% iodixanol과 40% iodixanol 사이의 층에서 순수한 박테리아 세포밖 소포체를 얻었다.
최종적으로 분리한 박테리아 세포밖 소포체는 자연 세포밖 소포체로 EGFEVM9+라 하였다.
박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제 병용 실험
박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제의 병용에 따른 항암 활성을 평가하기 위해, 마우스(BALB/c, 수컷, 5주령)의 피부 밑에 마우스 대장암 세포(CT26)를 마우스 한 마리당 1x106 개를 주사하고 키웠다. 마우스 대장암 세포 투여 5일 후, 마우스를 5마리씩 총 4개의 실험군으로 나누었다(표 2 참조). 각 그룹별로 상기 분리 정제한 박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제를 단독 또는 병용 투여하였는데, 실험에 사용된 면역관문 억제제는 anti-PD1 항체로 Bio X Cell(Lebanon, NH, USA) 회사의 InVivoMAb anti-mouse PD1(Cat# BE0273) 제품을 구입하여 사용하였다. 우선 세포 투여 5일 후에는 각 그룹별로 PBS 또는 면역관문 억제제(Ab)를 주입하였다.
세포 투여 6일 후 각 그룹별로 PBS 또는 EGFEVM9+(EV)를 주입하였다. 세포 투여 9일 후 다시 각 그룹별로 PBS 또는 Ab을 주입한 다음, 세포 투여 18일 후 다시 각 그룹별로 PBS 또는 EV를 주입하였다. 마지막으로 세포 투여 20일 후 각 그룹별로 PBS 또는 Ab을 주입하였다(도 1).
다음으로 각 실험군 별로 대장암 세포 주입 6일 후부터 24일 후까지 매일 마우스의 생존 여부를 확인하고, 대장암 조직의 크기를 측정하였다. 대장암 조직의 부피(V)는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 V = l x s2/2의 공식으로 계산하였다.
또한 각 실험군 마우스의 체중과 체온 변화를 대장암 세포 주입 6일 후부터 24일 후까지 매일 지속적으로 관찰하였다.
Group # PBS or Ab PBS or EV
1 PBS PBS
2 PBS EV (0.2 μg)
3 Ab (50 μg) PBS
4 Ab (50 μg) EV (0.2 μg)
실험결과
실험결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, PBS-PBS 대조군 및 PBS-EV(0.2 μg), Ab(50 μg)-EV(0.2 μg) 실험군에서 사망하는 마우스는 발생하지 않았고, Ab(50 μg)-PBS 실험군에서 Day 22에 모든 마우스가 사망하였다(도 2A).
PBS-PBS 대조군에 비해서 PBS-EV(0.2 μg) 및 Ab(50 μg)-EV(0.2 μg) 실험군에서 대장암 조직의 최종 크기는 유의미하게 감소하였고, Ab(50 μg)-PBS 실험군에서는 최종적으로 모든 마우스가 사망해서 비교할 수 없었다. 또한 PBS-EV(0.2 μg) 실험군과 비교해서도 Ab(50 μg)-EV(0.2 μg) 실험군에서 대장암 조직의 최종 크기가 유의미하게 감소하였다(도 2B).
이와 같이, EV와 Ab의 단독 투여군과 비교했을 때 Ab-EV 병용 투여군에서 암 세포의 성장이 현저하게 감소하여 상승효과가 나타났음을 확인하였으며, 특히 Ab 단독 투여군에서는 Day 22일에 마우스가 모두 사망하였으나, Ab-EV 병용 투여군에서는 실험이 종료되는 시점까지 사망하는 동물이 나타나지 않는 것으로 보아 두 제제의 병용에 따른 독성 감소 효과까지 나타나는 것으로 판단해 볼 수 있었다.
모든 실험 기간 동안 대조군 및 모든 실험군에서 체중 및 체온에는 큰 변화가 없었다(도 2C, 도 2D).
실시예 2: 박테리아 세포밖 소포체의 제조 및 특성 분석
상기 실시예 1에서 확인한 시너지 효과 (박테리아 세포밖 소포체와 면역관문 억제제 조합의 시너지 효과)의 과학적 근거를 찾기 위한 실험을 수행하기 위해 추가 실험 수행하였다. 추가 실험에 사용된 박테리아 세포밖 소포체는 아래 방법으로 제조했다.
자연 세포밖 소포체의 제조
실험에 사용된 자연 세포밖 소포체는 E. coli BL21 (DE3) ΔmsbB 유래로 2021년 6월 21일자로 한국에 출원된 KR10-2021-0080108호의 실시예 4에 따라 제조되었고, 최종적으로 분리한 자연 세포밖 소포체를 EVVP-LB라 하였다.
인공 세포밖 소포체의 제조
실험에 사용된 인공 세포밖 소포체에는 세포막 유래 인공 세포밖 소포체(cell membrane-derived vesicles, CMDV)와 외막 유래 세포밖 소포체(outer membrane-derived vesicles, OMDV)가 있었다. CMDV와 OMDV를 분리하기 위해 vegetable peptone-based lysogeny broth(VP-LB)를 이용하여 E. coli BL21 (DE3) ΔmsbB-AmCyan을 배양하였다. 배양액을 원심분리(6,000 x g 15분)한 뒤 상층액을 제거하여 박테리아 세포 침전물을 얻어 vehicle-2(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% sucrose)에 현탁하였다. 현탁액을 microfluidic device(10,000 psi로 5번)를 통과시켜 박테리아 세포를 분쇄하고, 원심분리(6,000 x g, 20분)를 통해 분쇄된 세포 조각을 포함하는 상층액을 얻고 접선유동필터(Tangential flow filtration: >500 kDa filter)를 이용하여 3배 농축하였다. 농축액을 반으로 나누어 반은 CMDV, 반은 OMDV를 분리하는데 활용하였다.
CMDV 제조를 위해, 앞서 준비한 농축액에 benzonase(최종 농도 50 units/mL)를 MgCl2(최종 농도 2 mM)와 함께 37oC에서 30분간 처리하였다. 이후 농축액 부피의 4배 만큼의 vehicle-2를 추가하고 접선유동필터(>500 kDa)를 통과시켜 5배 농축하였다. 이어 밀도구배 초고속원심분리(시료 6.5 mL, 0.8 M sucrose 3.0 mL, 2.5 M sucrose 3.0 mL로 200,000 x g, 2시간)를 통하여, CMDV를 분리하였다.
OMDV 제조를 위해서는, 앞서 준비한 농축액에 sarkosyl(최종 농도 1%)을 상온에서 30분간 처리하였다. 이후 농축액 부피의 4배 만큼의 vehicle-2를 추가하고 접선유동필터(>500 kDa)를 통과시켜 5배 농축하였다. 그 다음 농축액에 benzonase(최종 농도 50 units/mL)를 MgCl2(최종 농도 2 mM)와 함께 37oC에서 30분간 처리하였다. 이후 농축액 부피의 4배 만큼의 vehicle-2를 추가하고 접선유동필터(>100 kDa)를 통과시켜 25배 농축하였다. 이어 밀도구배 초고속원심분리(시료 6.5 mL, 0.8 M sucrose 3.0 mL, 2.5 M sucrose 3.0 mL로 200,000 x g, 2시간)를 통하여, OMDV를 분리하였다.
최종적으로 분리한 CMDV와 OMDV를 각각 CMDVVP-LB, OMDVVP-LB라 하였다.
박테리아 세포밖 소포체의 특성 분석
분리한 박테리아 세포밖 소포체는 문헌(Biomaterials. 113:68-79, 2017)을 참조하여 특성을 분석하였다. 우선 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 이용한 동적광산란분석(dynamic light scattering)으로 측정하였다. 또한 단백질 농도 및 총 단백질량은 Bradford assay를 이용하여 측정하였으며, 입자 농도 및 총 입자수는 LM10-HS(Malvern Instruments)를 이용한 나노입자추적분석(nanoparticle tracking analysis)으로 측정하였다.
박테리아 세포밖 소포체의 특성 분석 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
Size (nm) Concentration Total amount
Protein (mg/mL) Particle (x1012/mL) Protein (mg) Particle (x1012)
CMDVVP-LB 156.8 ± 61.2 5.3 28.7 5.3 28.7
OMDVVP-LB 127.6 ± 42.8 2.3 24.6 2.5 27.3
실시예 3: 박테리아 세포밖 소포체 투여에 따른 종양미세환경(tumor microenvironment, TME) 변화 분석
실험방법
마우스(C57BL/6, 수컷, 7주령 및 BALB/c, 암컷, 7주령)의 피부 밑에 마우스 방광암 세포(MB49: C57BL/6에 주입) 대장암 세포(CT26: BALB/c에 주입)를 마우스 한 마리당 1x106개를 주사한 뒤 7일간 키웠다. 마우스를 각 그룹당 5마리씩 나누어 아래 표2와 같이 EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB를 암 조직에 직접(intratumoral) 투여하였다. EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB 투여 24시간 뒤 각 그룹에서 암 조직을 적출하여 종양미세환경의 변화를 유세포 분석(flow cytometry) 또는 Real-time RT-PCR로 분석하였다.
Group # Sample
1 Vehicle-1 (for EVVP-LB)
2 EVVP-LB 5 μg
3 Vehicle-2 (for CMDVVP-LB and OMDVVP-LB)
4 CMDVVP-LB 10 μg
5 OMDVVP-LB 10 μg
Vehicle -1: 10 mM L-histidine (pH 7.4), 107 mM NaCl, 2% sucroseVehicle-2: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% sucrose
(1) 종양미세환경에 대한 유세포 분석
유세포 분석을 위한 세포 준비는 문헌(Methods Mol Biol. 1458:95-110, 2016)에 기재된 방법을 사용하였고, 항체는 BD Biosciences 사의 anti-PDL1, anti-CTLA4를 사용하였으며, 분석기기는 BD Biosciences의 LSR Fortessa (5 Laser) 모델을 이용하였다.
(2) 종양미세환경에 대한 Real-time RT-PCR 분석
Real-time RT-PCR분석을 위한 RNA 준비는 문헌(Invitrogen, TRIzolTM Reagent User guide)에 기재된 방법을 사용하였고, 준비한 RNA는 GoScirptTM Reverse Transcriptase Kit(Promega)를 이용하여 cDNA로 준비하였다. Internal control로 GAPDH를 사용하였으며, StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 real-time PCR을 수행하였고, Real-time PCR에 필요한 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다.
실험결과
(1) 종양미세환경에 대한 유세포 분석 결과
종양미세환경에 존재하는 세포들에 대해 유세포 분석을 하여 면역관문 단백질인 PDL1, CTLA4, 및CD80의 발현 변화를 확인하였다(도 3a 내지 3g 및 도 4a 내지 4g)
우선 마우스 방광암 세포(MB49)를 주입했던 마우스에 세포밖 소포체를 투여한 경우를 분석하였다. 대조군에 비하여 EVVP-LB 투여군에서는 PDL1의 발현이 45.0% 늘어났으며(27.7% → 72.7%), CTLA4의 발현은 43.3% 늘어났고(4.5% → 47.8%), CD80의 발현은 14.0% 늘어났다(48.6% → 62.6%) (도 3a 내지 3c). CMDVVP-LB 투여군에서는 경우 PDL1의 발현이 46.8% 늘어났으며(41.5% → 88.3%), TLA4의 발현이 71.9% 늘어났다(24.0% → 95.9%) (도 3d, 3e). 한편 OMDVVP-LB 투여군에서는 PDL1의 발현이 29.1% 늘어났으며(41.5% → 70.6%), TLA4의 발현이 65.3% 늘어났다(24.0% → 89.3%) (도 3f, 3g).
또한 마우스 대장암 세포(CT26)를 주입했던 마우스에 세포밖 소포체를 투여한 경우를 분석하였다. 대조군에 비하여 EVVP-LB 투여군에서는 PDL1의 발현이 65.9% 늘어났으며(27.9% → 93.8%), CTLA의 발현은 61.5% 늘어났고(19.6% → 81.1%), D80의 발현은 16.4% (71.5% → 87.9%) 늘어났다 (도 4a 내지 4c). CMDVVP-LB 투여군에서는 PDL1의 발현이 30.9% 늘어났으며(11.5% → 42.4%), CTLA4의 발현이 38.8% 늘어났다(26.8% → 65.6%) (도 4d, 4e). 한편 OMDVVP-LB 투여군에서는 PDL1의 발현이 17.2% 늘어났으며(11.5% → 28.7%), CTLA4의 발현이 33.9% 늘어났다(26.8% → 60.7%) (도 4g, 4g).
박테리아 세포밖 소포체를 투여할 때 마우스 종양미세환경에서 면역관문 단백질인 PDL1, CTLA4, CD80을 발현하는 세포의 비율이 높아지고 있음을 확인하였다.
위 결과는 실시예 1의 박테리아 세포밖 소포체와 PDL1의 병용으로 인한 시너지 효과를 과학적으로 설명하는 것으로 이해된다. 나아가, 박테리아 세포밖 소포체의 항암 효과는 PDL1 억제제 이외에도 CD80, CTLA4를 억제할 수 있는 물질과의 병용 투여 시 증가할 것으로 예상할 수 있다.
(2) 종양미세환경에 대한 Real-time RT-PCR 분석 결과
Real-time RT-PCR 하여 면역관문 단백질인 IDO1의 발현 변화를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이 EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB를 투여할 때 마우스 종양미세환경에서 면역관문 단백질인 IDO1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 박테리아 세포밖 소포체의 항암효과는 IDO 억제 물질과 병용 투여 시 증가할 것으로 예상할 수 있다.
실시예 4: 박테리아 세포밖 소포체가 비장 세포에 미치는 영향 분석
비장(spleen)은 2차 림프 기관으로서 다양한 면역세포들이 존재하며 전신 면역 반응에 영향을 주고, 암이 존재하는 경우 암 조직과 서로 영향을 주고받는 것으로 추정되고 있다. 따라서 암을 갖는 마우스로부터 추출한 비장 세포에 박테리아 세포밖 소포체를 처리하였을 때의 변화를 보는 것은 암 치료에 있어서 중요한 단서를 제공할 것으로 기대된다.
실험방법
마우스(BALB/c, 암컷, 7주령)의 피부 밑에 마우스 대장암 세포(CT26)를 마우스 한 마리당 1x106개를 주사한 뒤 14일 후 비장을 적출하였고, 적출한 비장으로부터 단일 세포를 분리하였다. 분리한 비장 단일 세포에 EVVP-LB, CMDVVP-LB 또는 OMDVVP-LB를 1 μg/mL로 24시간 처리하고, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다. 유세포 분석을 위한 세포 준비는 문헌(Methods Mol Biol. 1458:95-110, 2016)에 기재된 방법을 사용하였고, 항체는 BD Biosciences 사의 anti-PDL1, anti-TIGIT을 사용하였으며, 분석기기는 BD Biosciences의 LSR Fortessa (5 Laser) 모델을 이용하였다.
실험결과
마우스 대장암 세포(CT26)을 투여한 마우스에서 추출한 비장 세포에 박테리아 세포밖 소포체를 처리한 뒤 유세포 분석을 하여 면역관문 단백질인 PDL1과 TIGIT의 발현 변화를 확인하였다(도 6a 내지 6f).
도 6a 내지 6f에서 보듯이, 비장 세포에 EVVP-LB를 처리한 경우 PDL1의 발현이 26.9% 늘어났고(6.0% → 32.9%), IGIT의 발현이 10.0% 늘어났다(15.0% → 25.0%)(도 6a, 6b). CMDVVP-LB를 처리한 경우 PDL1의 발현이 26.2% 늘어났고(7.0% → 33.2%), IGIT의 발현이 14.3% 늘어났다(17.3% → 33.2%), 도 6c, 6d). 한편 OMDVVP-LB를 처리한 경우 PDL1의 발현이 30.2% 늘어났고(7.0% → 37.2%), IGIT의 발현이 10.7% 늘어났다(17.3% → 28.0%)(도 6e, 6f).
암을 갖는 마우스에서 추출한 비장 세포에 박테리아 세포밖 소포체를 처리하고 PDL1과 TIGIT의 발현을 관찰한 결과 PDL1과 TIGIT의 발현이 모두 현저히 증가하였다. 따라서 박테리아 세포밖 소포체를 PDL1과 TIGIT 억제 물질과 병용 투여하면 항암 효과가 증가할 것을 합리적으로 예상할 수 있다.
박테리아 세포밖 소포체 및 단일 또는 2종 이상이 조합된 다양한 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 각 제제의 단일 투여 제제와 비교해 암 치료에 있어서 상승효과를 나타내며, 단일 투여 제제의 고용량 투여로 인한 부작용을 경감시키는 작용을 나타내어, 결과적으로 암 치료 효능을 증진하는 방법을 제공하여 암 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (27)

  1. 박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 그람 음성 박테리아는 이스체리치아(Escherichia) 속, 헬리코박터(Helicobcater) 속, 헤모필루스(Hemophilus) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 시아노박테리움(Cyanobacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 클라미디아(Chlamydia) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 티오박터(Thiobacter) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속, 세라티아(Serratia) 속 및 트레포네마(Treponema) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 바실러스(Bacillus) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 클로스트리듐(Clostridium) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 가드네렐라(Gardnerella) 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속, 마이코플라스마(Mycoplasma) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 마이크로코커스(Micrococcus) 속 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 내독소 생성 유전자가 결손되거나 변형된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 물질, 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현되도록 형질 전환된 박테리아인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포막 융합 물질이 인간 EGF(human epidermal growth factor)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막이 상기 박테리아의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 박테리아의 세포막 이외의 성분이 표적 유도 물질, 세포막 융합 물질, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기 또는 아민기를 이용한 화학적 변형되거나, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킨 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포밖 소포체는 초고속원심분리, 밀도 구배 초고속원심분리, 한외여과법, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 면역친화성 분리법, 미세유체기술 분리법, 수성 2상 시스템 및 폴리머 기반 침전법으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 분리된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 PD1(programmed cell death-1) 길항제, PDL1(programmed cell death-ligand 1) 길항제, PDL2(programmed cell death-ligand 2) 길항제, CD27(cluster of differentiation 27) 길항제, CD28(cluster of differentiation 28) 길항제, CD70(cluster of differentiation 70) 길항제, CD80(cluster of differentiation 80) 길항제, CD86(cluster of differentiation 86) 길항제, TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains) 길항제, CD137(cluster of differentiation 137) 길항제, CD276(cluster of differentiation 276) 길항제, KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors) 길항제, LAG3(lymphocyte-activation gene 3) 길항제, TNFRSF4(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4) 길항제, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein) 길항제, GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand) 길항제, 4-1BBL(4-IBB ligand) 길항제, CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated antign-4) 길항제, A2aR(adenosine A2A receptor) 길항제, VTCN1(V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1) 길항제, BTLA(B- and T-lymphocyte attenuator) 길항제, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase) 길항제, TIM3(T-cell immunoglobulin domain and mucin-domain containing-3) 길항제, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation) 길항제, 및 KLRA(killer cell lectin-like receptor subfamily A) 길항제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 단백질, 펩타이드, 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 억제 핵산인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 억제 핵산은 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 더발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 트리멜리무맙(Tremelimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 피딜리주맙(Pidilizumab), BMS986016, 세미프리맙(Cemiplimab) 및 릴리루맙(lirilumab)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포밖 소포체와 면역 관문 억제제는 동시에, 순차적으로 또는 별도로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 비소세포성 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 대장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 골암, 비소세포성 골암, 혈액암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 직장암, 항문 부근암, 결장암, 나팔관암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 침샘암, 육종암, 가성점액종, 간모세포종, 고환암, 교모세포종, 구순암, 난소생식세포종양, 기저세포암, 다발성골수종, 담낭암, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 복막암, 설암, 소세포암, 소아림프종, 신경모세포종, 십이지장암, 요관암, 성상세포종, 수막종, 신우암, 외음부암, 흉선암, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 경구적인 방법 또는 비경구적인 방법으로 투여하는 것인 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 비경구적인 방법은 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 및 직장 내 투여로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 암 치료제를 제조하기 위한 박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)의 용도.
  27. 박테리아 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
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