WO2021219918A1 - Dispositivo concentrador de cultivos de microorganismos por ósmosis directa y funcionamiento en continuo - Google Patents

Dispositivo concentrador de cultivos de microorganismos por ósmosis directa y funcionamiento en continuo Download PDF

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WO2021219918A1
WO2021219918A1 PCT/ES2021/070295 ES2021070295W WO2021219918A1 WO 2021219918 A1 WO2021219918 A1 WO 2021219918A1 ES 2021070295 W ES2021070295 W ES 2021070295W WO 2021219918 A1 WO2021219918 A1 WO 2021219918A1
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WO
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fluid
tube
membrane
culture
osmotic
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Application number
PCT/ES2021/070295
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tania Mazzuca Sobczuk
María José IBÁÑEZ GONZÁLEZ
Emilio Molina Grima
Jesús SÁNCHEZ ALCAIDE
Original Assignee
Universidad De Almería
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Filing date
Publication date
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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/002—Forward osmosis or direct osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention falls within the field of biotechnology and, specifically, in the field of technologies for the concentration of microorganisms grown in liquid media, such as microalgae cultures.
  • Centrifugation is efficient, fast and extremely useful when you want to recover high value-added metabolites, free of chemical contaminants, but it is energy expensive. For example, in the case where biomass is used to generate energy from it, centrifugation should be avoided so that the net energy production is favorable.
  • Flocculation for its part, is efficient in energy terms, but the added flocculating agents cannot always be recovered, or they are toxic, sometimes excluding their use in the field of the cosmetic or food industry [1, 2, 3]. large doses of some flocculants are required, worsening both the economic balance and the amount of waste generated with respect to the amount of bioproduct obtained, even more so in those cases in which the presence of these additives in the supernatant, after flocculation, prevents the reuse of the medium, as it is toxic to the microorganism itself.
  • the Spectra / Por® Flot-A-Lyzer® is a device that consists of a piece of semi-permeable membrane, attached at its ends to rings that force it to float vertically when it is filled with the solution to be dialysed, and introduced into a suitable container. containing the osmotic fluid.
  • the device is easily refillable, but it is necessary to operate it in batches, being able to process batches of up to 10 ml for each device that is used. This is a drawback when it is desired to concentrate cultures from a bioreactor that operates continuously, due to two factors: one, the volume of the device is small, and two, it is operated in batches, breaking the dynamics of the production chain.
  • the micro Spectra / Por® Flot-A-Lyzer® is a device that differs from the previous one fundamentally in terms of the form of physical stabilization of the membrane tube, which in this case is supported by a body that allows it to be supported vertically in any flat work surface, to facilitate its use. However, it only allows you to work with volumes even smaller than the Flot-A-Lyzer® (up to 500 pL) and, again, only in batches. For its part, the Spectra / Por® Tube-A-Lyzer® device circulates the osmotic solution, but has the disadvantage that it continues to operate in batches in terms of loading the solution to be dialyzed.
  • DiaEasy TM Dialyzer Tubes devices from BioVision.
  • the Spectra / Por® Hollow Fiber Dialysis Modules® device allows the continuous introduction of both culture and osmotic fluid.
  • the mode of operation proposed by said device is based on introducing the solution to be dialyzed by pumping. In this way, the time it takes for it to circulate and exit through the opposite end of the device marks the time the culture has to transfer the water to the osmotic solution, depending on the speed at which the solution is pumped.
  • the present invention is intended to solve said need, by means of a novel device and procedure for the concentration of microorganism cultures by direct osmosis and continuous operation, where the effective distance of circulation of said cultures during the osmotic filtering stage is adjustable, so that both the adaptability of the device to different applications is improved, as well as its efficiency in energy terms, which also results in efficiency with respect to the costs of its use.
  • the present invention aims to provide a technology that allows the osmotic dehydration of microalgae cultures to be carried out in a way that is adaptable to different needs of use, of a simple and inexpensive way.
  • this technology is not limited to its application in microalgae cultures, but can also be extended to other microorganism cultures.
  • the invention refers to a system and a process according to the claims incorporated herein, which provides at least six advantages for the application of osmotic separation of cultures, compared to previously existing techniques:
  • the concentrator device of the invention preferably comprises:
  • a housing adapted to house an osmotic fluid; - at least one tube for the circulation of a fluid that houses a culture of microorganisms, where the wall of said tube is formed by a semi-permeable membrane and where the tube is arranged, at least partially, inside the housing, where the The membrane of the tube separates the space through which the fluid circulates with the microorganism culture from the space where the osmotic fluid is housed.
  • said membrane is a flexible type membrane and, more preferably, a flexible dialysis membrane.
  • the device additionally comprises:
  • the position of the connectors inside the housing, and / or the length of the tube are adjustable in the device, so that the variation of said position and / or said length provides a variation in the length of circulation of the fluid with the culture of microorganisms along said tube.
  • the tube formed by the membrane is longitudinally arranged inside the casing between respective supports, to which it is fixed by means of the connector elements.
  • the casing has a cylindrical shape and the supports are disc-shaped.
  • the geometric relationship between the internal radius (R) of the outer shell, its length (L) and the relationship between the specific volume per unit length of the membrane (v e ), the number of membrane sections (N), and the diameter of the membrane (0 me m)) is:
  • the device comprises a plurality of rods of adjustable length arranged between the supports, which allow the distance to be adjusted between said supports. More preferably, the rods are located equidistant from the center of the supports and, even more preferably, the fastening of each rod to both supports is carried out by means of threaded elements.
  • the tube is made up of a plurality of sections connected through one or more connectors. More preferably, the connectors of the sections of the tube are shaped like a "U”, an “L”, causing the fluid that houses the culture to be guided to circulate in different directions through the interior of the tube.
  • the housing comprises a cover.
  • the housing comprises at least one auxiliary overflow for osmotic fluid.
  • the inlet port of the device is connected to the outlet of a micro-organism culture bioreactor.
  • the osmotic fluid housed in the housing comprises solutions of glycerol, sea water, hypersaline water or another liquid with greater osmotic force than the culture fluid circulating through the tube;
  • the semi-permeable membrane is a dialysis membrane.
  • Another object of the invention relates to a method for concentrating a culture of microorganisms from a bioreactor, by direct osmosis and continuous operation, using a device according to any of the preceding claims.
  • Said procedure advantageously comprises carrying out the following steps:
  • the inlet orifice of the device is connected to the outlet of the bioreactor
  • an osmotic fluid is introduced inside the casing, in the space defined between it and the tube;
  • a fluid that houses the culture of microorganisms from the bioreactor is circulated through the tube of the device, so that its concentration increases as part of said fluid that houses the culture is filtered by osmosis, from the inside of the tube to its outside through the membrane, mixing with the osmotic fluid;
  • the concentrated fluid that houses the culture is collected in a container connected to the overflow of the device;
  • the application time of the osmosis concentration method is regulated by modifying the length and / or number of membrane tubes and / or the height of the osmotic fluid housed in the housing.
  • the housing and / or the membrane are sterilized prior to the circulation of the fluid that houses the culture inside the tube;
  • the osmotic fluid is sterile.
  • the osmotic fluid is renewed, during or after one or more circulations of the fluid that houses the culture, to maintain high the rate of material transfer between the culture and the osmotic fluid.
  • the device is arranged at a level below the outlet of the bioreactor; and / or a pump is used to drive the fluid that houses the microorganism culture to the inlet of the device.
  • osmotic fluid refers to the substance that is used in order to promote the transfer of water or culture medium out of the membrane contained in the device object of the present invention.
  • said fluid may comprise glycerol solutions, but it is not limited solely to the use of this substance.
  • culture refers to the presence of one or more cell types in the same bioreactor.
  • the terms “broth”, “harvested” or “culture” interchangeably also refer to the contents extracted from the bioreactor at a certain time, which contains the cells and the culture medium.
  • the cell types can be microorganisms, such as microalgae or they can be microalgae cells cultured with a different cell type, or they can be bacteria, yeast, fungi, etc.
  • the set of cells is called “biomass”.
  • the culture media can be those that enhance the growth and / or propagation of at least one of the cells, or a subset of these.
  • Culture media commonly contain components such as a fixed nitrogen source, trace elements, optionally a buffer for pH maintenance, and phosphate.
  • Other components may include a fixed carbon source such as acetate or glucose and salts, such as sodium chloride, particularly for seawater microalgae.
  • trace elements include zinc, boron, cobalt, copper, manganese, and molybdenum in the form of salt, acid, or other appropriate for the culture.
  • the medium may contain dissolved metabolites excreted by the cells it contains.
  • Culture media can have a complex formulation that is not fully defined in its chemical composition, for example, those containing meat extract, yeast extract, etc.
  • the fixed carbon source comprises sucrose and glucose, fructose, acetate or glycerol, among others.
  • Some species of microalgae can be cultivated using a fixed carbon source such as glucose or acetate in the absence of light. Such a culture is known as a heterotrophic or heterotrophic culture.
  • dehydration and variants thereof, such as “dehydrate”, as used herein, refers to the elimination of water contained in the culture medium, either pure or accompanied by other substances dissolved in it. .
  • concentration refers to the technological device designed so that the biomass concentration can be increased inside it thanks to the elimination of water contained in the culture medium.
  • concentration broth refers to the resulting suspension after having resided the necessary time within the membrane of the concentrator.
  • overflow refers herein to the orifice to which a nozzle, conduit or other type of outlet of the bioreactor or concentrator is connected, arranged so that, when the fluid in question reaches the level of said orifice, it flows spontaneously through this.
  • broth overflow in the concentrator, refers to the overflow through which the broth containing the already concentrated biomass leaves the concentrator.
  • the expression "bundle of membrane tubes” refers to a modality of distributing the membrane tubes within the casing, which consists of arranging several vertical membrane tube sections within the casing by connecting an end of the tube with the initial end. of the following by means of a piece designed in the shape of a “U”, an “L” or similar.
  • osmotic fluid overflow in the concentrator refers to the overflow through which the osmotic fluid used to promote the removal of water from the culture broth leaves the concentrator.
  • harvest inlet of the concentrator refers to the aperture and / or attached devices by which the broth containing the microalgae is introduced into the concentrator during operation.
  • osmotic fluid inlet refers to the aperture and / or attached devices by which the osmotic fluid is introduced into the concentrator, before or during the concentrating operation.
  • batch operation refers to the way of carrying out the process in which the culture is introduced and a given time is waited, after which the concentrated culture is removed. During this processing time, no new crop enters the process.
  • continuous operation refers to the way of carrying out the process in which the introduction of the culture occurs continuously, while the process is carried out, as well as the harvest. of the concentrate.
  • useful length refers to the length of the device that is useful for the effective development of the process.
  • useful length of the membrane tube refers to the length of membrane that is immersed in the osmotic fluid and that contains the culture.
  • all residence time refers to the time during which the culture would remain within the useful membrane length if no culture medium were removed through the semipermeable membrane.
  • Osmosis is defined as the spontaneous movement of a solvent through a semi-permeable membrane.
  • a semipermeable membrane is a membrane that allows solvent to pass through, but is not fully permeable to solutes. The movement of the solvent occurs without the need to apply any external force, but occurs when on both sides of the semipermeable membrane there are different values for the chemical potential of said solvent.
  • the activity of the solvent is closely linked to the concentration of the solvent in the solution, so that modifications in the concentration of the solvent on both sides of the membrane, or modifications in temperature, can cause differences in chemical potential, which force the solvent in question to move from one side of the semi-permeable membrane to the other.
  • the solvent passes through the membrane, moving from the zone of higher chemical potential to the zone of lower chemical potential until the potentials on both sides of the membrane are equal.
  • the solution where the chemical potential of the solvent is lower is called an osmotic solution.
  • the solvent that passes through the membrane is water, we speak of osmotic dehydration.
  • Figure 1 shows an external view of the device for concentrating the broth containing the biomass, by a direct osmosis process in operation, according to a preferred embodiment of the invention.
  • a membrane tube (1) can be seen inside a cylindrical casing (2).
  • the culture enters through the lower inlet hole (4) and exits through the outlet or overflow hole (3, 3 ') of the broth in the concentrator, configured with a piece (16) in the shape of an elbow.
  • the membrane remains extended, thanks to the action of threaded rods (11).
  • An auxiliary inlet port (4 ') of the osmotic fluid in a lower cover (14') is maintained with a closed valve, to prevent the leakage of the osmotic fluid, which exits once it reaches an upper orifice (15, 15 ') of osmotic fluid outlet.
  • a top cap (14) of the concentrator keeps the osmotic fluid free of impurities in the environment.
  • Figure 2 shows a view of the elements of the internal structure of the broth concentrating device. You can see the outlet or overflow (3) of the broth in the concentrator, some supports in the form of upper (5) and lower (6) circular discs, through which the threaded rods (11) pass to maintain the membrane of the tube (1) stretched and whose height is regulated through two threads per rod (12, 12 '13, 13') that are placed on the upper and lower faces of each disc (5, 6). It can also be seen how the ends of the tube (1) formed by the membrane are fixed by means of polyamide elements, as well as a plurality of connector elements (7, 8, 9, 10).
  • a main object of the present invention is a concentrator device, which allows to carry out a continuous process of osmotic dehydration of the harvest from the overflow of a bioreactor.
  • a semi-permeable membrane is used that allows the passage of water and some salts through it, but not of microorganisms.
  • Said membrane can be any semi-permeable membrane of a flexible type, or a commercial membrane adapted to the effect, such as, for example, the dialysis membrane of Spectrum Labs (MWCO: 20KDa, Standard Regenerated Cellulose (RC), 0.79 ml / cm and 10 mm in diameter, Spectrum Labs, USA), but without limitation to other equivalent membranes.
  • the device of the invention adopts a preferably cylindrical configuration with vertical orientation, with upstream liquid flow, in the opposite direction to gravity (although, preferably, with circulation favored by is).
  • the membrane occupies a central place inside the device, housing the circulating liquid to be filtered.
  • the harvest from the bioreactor circulates until it reaches the inner zone of the semi-permeable membrane, arranged in the form of a tube (1), and contained within a casing (2) ( Figure 1) preferably cylindrical, which contains the osmotic fluid in the device.
  • a casing (2) preferably cylindrical, which contains the osmotic fluid in the device.
  • the membrane is preferably kept extended, maintaining its tubular shape within the casing (2) of the concentrator, connecting at both ends of said tube (1) to respective supports (5, 6), which preferably adopt the shape of upper and lower discs. bottom and which can be made of a plastic material, such as for example PVC.
  • the connection between the tube (1) that forms the membrane and the supports (5, 6) is preferably made by corresponding internal connectors (7, 8), for example, through polyamide elements to which the membrane, either directly or using adapters with a conical or cylindrical shape.
  • the distance between the upper (5) and lower (6) supports is fixed by means of a plurality of rods (11) of adjustable length (for example, through threaded means). More preferably, said rods (11) are located equidistant from the center of the upper (5) or lower (6) supports (in Figure 1 two embodiments based on four and three rods (11) are shown, respectively).
  • the fastening of each rod (11) to both supports (5, 6) is carried out, preferably, by means of upper (12, 12 ') and lower (13, 13') threads, respectively.
  • the culture enters the concentrator through the lower external connector (10) and, after passing through the lower internal connector (8), begins to circulate through the tube (1) upstream, reaching the interior surface of the membrane (which makes up said tube (1)), where the osmosis process towards the outside of the same begins.
  • the membrane is bathed, on its external side, by the osmotic fluid which is in turn contained within the casing (2).
  • the device can comprise a single section of membrane tube (1) or, alternatively, it can comprise a plurality of tubes (1) connected by means of membrane end connector elements (for example, in the form of "U", of "L”, etc.) causing the liquid to be guided to continue circulating in different directions, but always running through the interior of the tube sections (1) defined by the membrane.
  • membrane end connector elements for example, in the form of "U”, of "L”, etc.
  • the osmotic fluid can be introduced to the concentrating device by opening (for example, unscrewing) an upper cap (14) of the housing (2) of the device and, in turn, keeping the lower inlet port (4) of the device closed. osmotic fluid, or be pumped directly from the outlet port (3).
  • the mixture of osmotic fluid plus the liquid transferred by the culture to the osmotic fluid can leave the concentrator through an auxiliary overflow (15) for osmotic fluid, once it reaches the level required for it.
  • the overflow (3) for the concentrate has an elbow-shaped piece (16) connected to change the direction of the concentrate, as can be seen in Figure 1.
  • the auxiliary overflow (15) for the fluid Osmotic is preferably located below the overflow (3) of the concentrate (for example, approximately 3-5 cm) because said elbow-shaped piece is not useful for dehydration and therefore does not need to be bathed by the fluid osmotic.
  • closures eg, rubber plugs, not shown in the figures
  • the difference in chemical potential existing on both sides of the membrane forces the passage of water towards the osmotic solution housed in the housing (2), consequently increasing the concentration of the microalgae culture inside the tube (1).
  • the osmotic solution contained between the casing (2) and the membrane increases its volume, due to the supply of liquid that it receives from the culture broth contained in the membrane.
  • the level of osmotic fluid therefore, rises until it reaches the auxiliary overflow (15) of the osmotic fluid in the concentrator, through which it exits and is collected in another container, and can be reused until the driving force given by is exhausted.
  • the differences in chemical potentials between the microorganism culture to be concentrated and the osmotic fluid can also be directly withdrawn from the process, once used.
  • An important advantage of this technology is that it is not necessary to spend conventional energy for the culture medium to flow from the inlet port (4) to the outlet overflow (3) of the concentrator, since the concentrator can be placed in a level below the outlet of the bioreactor to which it is coupled, so that circulation by gravity is favored. Although circulation does not require propulsion by using any external energy source, it is possible, in different preferred embodiments of the invention, to regulate the residence time of the culture within the membrane in various ways, namely:
  • the membrane is connected to the polyamide tubes and said polyamide tubes are fitted into the internal connectors (7, 8) that pass through the supports (5, 6).
  • the position of the upper support (5) is regulated until the membrane is fully extended, but without excessive tension.
  • the complete interior assembly consisting of: tubular section (1) of membrane, clamping rods (11), supports (5, 6) and connectors (7, 8, 9, 10) is introduced inside the casing (2 ), making the internal connector (8) or for the inlet of the broth coincide with the inlet hole (4).
  • the thread of said connector (8) is sealed, for example, by means of a gasket and Teflon system, and the interior (7, 8) and exterior (9, 10) connectors are attached to their corresponding supports (5, 6), preferably by threading.
  • the ethanol is removed from the system and the inlet port (3) of the culture is connected to the outlet of the bioreactor and the outlet (4) of the concentrated broth from the concentrator to a collection container (sterile, if you want to work in asepsis).
  • the casing (2) is filled with the osmotic fluid (sterile, if required by the application) up to the level of the osmotic fluid overflow (15), with all the other auxiliary outlets (15 ') plugged with their respective closures. , and the outlet of the overflow (15) is connected to a container for collecting the excess osmotic fluid.
  • the device should preferably be placed below the outlet level of the bioreactor, ensuring that the broth overflow (3) in the concentrator is also below the level of the bioreactor overflow.
  • agitation can be provided to one or both sides of the semipermeable membrane, by introducing air through a corresponding orifice.
  • the flow or circulation of the culture or of the osmotic solution can be arranged, operating semi-continuously. And, finally, the flow or circulation of the culture and the osmotic solution can be arranged operating continuously.
  • a concentrator with a 14 cm long membrane tubular section (1) is used to concentrate the harvest from a 2-liter bioreactor, in which the microalgae culture is carried out, operating continuously for 24 hours, at a dilution rate of 0.144 d 1 .
  • the medium is added to the bioreactor by means of a peristaltic pump, which operates at flow rates set by the user, in this case 0.2 ml / min, so that each time a medium is added to the bioreactor, a volume is dislodged. equivalent of culture for its overflow.
  • An 18 cm strip is cut from a dialysis membrane tube (1) (MWCO: 20KDa, Standard Regenerated Cellulose (RC), 0.79 ml / cm and 10 mm in diameter, Spectrum Labs, USA).
  • the tube (1) is immersed for 30 minutes in a container containing deionized water to remove the preservative, according to the manufacturer's instructions.
  • the mouth of the lower connector (10) is inserted through the hole (4) of the lower casing cap (2), a gasket with a little Teflon is placed and it is attached, by threading, to the lower external connector (10) of the casing (2), thus being united the casing (2) and the concentric internal assembly.
  • the inlet mouth (4) of the culture is connected to the culture overflow of the bioreactor, and the overflow (3) of the concentrator to a graduated cylinder, which makes it possible to measure the volume of concentrate collected at each moment.
  • Said test tube is placed at a horizontal distance of 0.3 m above the concentrated culture outlet (3) and at a vertical distance of 0.15 m below the bioreactor outlet overflow.
  • the osmotic fluid collection line is connected to the auxiliary overflow orifice (15), directing it to a graduated cylinder that allows the volume of the dislodged liquid to be measured.
  • the free volume between the tube (1) and the casing (1) is filled with crude glycerol, according to the following composition: 80.5% (w / w) glycerol (GPR Rectapur®, 98% purity), 10.1% (w / w) distilled water, 5.2% (w / w) sodium chloride (Sigma Aldrich, AGS Grade, 99% purity), 0.4% (w / w) potassium chloride (Sigma Aldrich, AGS Grade, 99% of purity), 2% (w / w) of methanol (Sigma Aldrich, 99.8% of purity) and 2% (w / w) of oleic acid, by the upper part of the concentrator.
  • the glycerol descends through the walls of the casing (2), through the gap between the upper support (5) and the casing (2), dislodging the air.
  • the upper cover (14) of the casing (2) is placed.
  • the concentration factor (F) and the concentration percentage (% C) are calculated according to: v

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Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo concentrador que comprende una carcasa (2) para alojar un fluido osmótico y al menos un tubo (1) semipermeable para la circulación de un fluido que aloja un cultivo de microorganismos. Ventajosamente, el dispositivo comprende, adicionalmente: al menos un orificio de entrada (4) conectado a uno de los tubos (1), a través de uno o más elementos conectores (8, 10); y, al menos, un rebosadero de salida (3, 3') conectado a uno de los tubos (1), a través de uno o más elementos conectores (7, 9). Asimismo, la posición de los conectores (7, 8, 9, 10) en el interior de la carcasa (2) o la longitud del tubo (2) son regulables, de forma que la variación de dicha posición o de dicha longitud proporciona una variación en la longitud útil de circulación del fluido con el cultivo de microorganismos a lo largo de dicho tubo (2).

Description

DESCRIPCIÓN
DISPOSITIVO CONCENTRADOR DE CULTIVOS DE MICROORGANISMOS POR OSMOSIS DIRECTA Y FUNCIONAMIENTO EN CONTINUO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra en el campo de la biotecnología y, específicamente, en el ámbito de las tecnologías para la concentración de microorganismos cultivados en medios líquidos, como son por ejemplo los cultivos de microalgas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Entre las técnicas actualmente empleadas para la concentración de microorganismos figuran la centrifugación, la floculación y sus variantes (electrofloculación, biofloculación, autofloculación, etc.). La aplicación de dichas técnicas depende, por lo general, del tipo de microorganismo (morfología, sustancias que excreta al medio, etc.) y de la aplicación concreta para la cual se requiera la biomasa.
La centrifugación es eficiente, rápida y sumamente útil cuando se desea recuperar metabolitos de alto valor agregado, exentos de contaminantes químicos, pero es costosa energéticamente. Por ejemplo, en el caso de que la biomasa se utilice para generar energía a partir de ella, la centrifugación debe evitarse para que la producción neta de energía sea favorable.
La floculación, por su parte, es eficaz en términos energéticos, pero no siempre pueden recuperarse los agentes floculantes añadidos, o resultan tóxicos, excluyendo en ocasiones su uso en el campo de la industria cosmética o alimentaria [1 , 2, 3] Además, se requieren grandes dosis de algunos floculantes, empeorando tanto el balance económico como la cantidad de residuos generados con respecto a la cantidad de bioproducto obtenido, más aún en aquellos casos en los que la presencia de estos aditivos en el sobrenadante, después de la floculación, impide la reutilización del medio, por resultar tóxico para el propio microorganismo.
La autofloculación, por su parte, evita el problema de la adición de sustancias químicas que posteriormente haya que separar, pero suele ser más lenta que la floculación con adición de agentes floculantes [4] La eliminación parcial del agua contenida en cultivos de microalgas mediante osmosis, a través de una membrana semipermeable utilizando como fluido osmótico disoluciones de glicerol [5], es un proceso que permite concentrar cultivos de microalgas de una forma muy eficiente en términos energéticos y que evita el contacto directo de los microorganismos con sustancias externas. Dada la novedad de la aplicación del proceso, aún no se cuenta con tecnología apropiada para su utilización específica a la salida de biorreactores que funcionen en continuo.
Con relación a los dispositivos comerciales del estado de la técnica, la empresa Spectrum Labs comercializa diversos dispositivos “listos para usar” que permiten la realización de procesos de diálisis sobre disoluciones. Si, en lugar de introducirse disoluciones para dializar en dichos dispositivos, se introducen cultivos de microorganismos, podría realizarse el proceso de deshidratación de los cultivos. No obstante, dado que la concepción de este tipo de unidades de diálisis ha sido desarrollada con fines distintos al de la concentración de cultivos, se presentan algunos inconvenientes operativos y de proceso que se analizan a continuación.
El Spectra/Por® Flot-A-Lyzer® es un dispositivo que consiste en un trozo de membrana semipermeable, sujeta en sus extremos a anillos que le obligan a flotar verticalmente cuando es rellenada con la disolución a dializar, e introducida en un recipiente adecuado que contenga al fluido osmótico. El dispositivo es fácilmente rellenable, pero es necesario operarlo por lotes, pudiéndose procesar lotes de hasta 10 mi por cada dispositivo que se utilice. Ello resulta un inconveniente cuando se desea concentrar cultivos procedentes de un biorreactor que opera en continuo, debido a dos factores: uno, el volumen del dispositivo es pequeño, y dos, se opera por lotes rompiéndose la dinámica de la cadena de producción.
El micro Spectra/Por® Flot-A-Lyzer® es un dispositivo que difiere del anterior fundamentalmente en cuanto a la forma de estabilización física del tubo de membrana, que en este caso es soportado por un cuerpo que le permite estar apoyado verticalmente en cualquier superficie plana de trabajo, para facilitar su modo de utilización. Sin embargo, sólo permite trabajar con volúmenes aún más pequeños que el Flot-A-Lyzer® (hasta 500 pL) y, de nuevo, sólo por lotes. Por su parte, el dispositivo Spectra/Por® Tube-A-Lyzer® hace circular la disolución osmótica, pero presenta el inconveniente de que se sigue operando por lotes en cuanto a la carga de la disolución a dializar. En la misma línea se encuentran los dispositivos DiaEasy™ Dialyzer Tubes de la empresa BioVision. El dispositivo Spectra/Por® Hollow Fiber Dialysis Modules® permite introducir, de modo continuo, tanto el cultivo como el fluido osmótico. El modo de operación que propone dicho dispositivo se basa en introducir la disolución a dializar por bombeo. De este modo, el tiempo que tarda la misma en circular y salir por el extremo opuesto del dispositivo marca el tiempo del que dispone el cultivo para transferir el agua hacia la disolución osmótica, según la velocidad a la cual se bombee la disolución. Si bien el citado dispositivo podría, hipotéticamente, acoplarse a la salida del cosechado de un biorreactor, acoplándose de modo que el cosechado circule por gravedad y no exista consumo de energía de fuentes externas, ello presentaría el inconveniente de no poder adaptar el tiempo de permanencia del cultivo en la membrana.
Las limitaciones de las técnicas anteriores generan, en el presente campo técnico, una necesidad de desarrollar nuevos dispositivos y procedimientos de concentración osmótica de cultivos de microorganismos, que permitan modificar los tiempos de residencia en el dispositivo concentrador, sin necesidad de bombeo externo.
La presente invención está destinada a resolver dicha necesidad, mediante un novedoso dispositivo y procedimiento de concentración de cultivos de microorganismos por osmosis directa y funcionamiento en continuo, donde la distancia efectiva de circulación de dichos cultivos durante la etapa de filtrado osmótico es regulable, de forma que se mejora tanto la adaptabilidad del dispositivo a diferentes aplicaciones, así como su eficiencia en términos energéticos, lo que redunda también en eficiencia respecto a los costes de su utilización.
Referencias del estado de la técnica citadas:
[1] Granados M.R., Acién F.G., Gómez C., Fernández-Sevilla J.M., Molina Grima E., “Evaluation of flocculants for the recovery of freshwater microalgae”. Bioresour. Technol. 118:102-10 (2012).
[2] Anthony R.J., Ellis J.T., Sathish A., Rahman A., Miller C.D., Sims R.C., “Effect of coagulant/flocculants on bioproducts from microalgae”. Bioresour. Technol. 149:65-70 (2013).
[3] Sim T., Goh A., Becker E.W., “Comparison of centrifugation, dissolved air flotation and drum filtration techniques for harvesting sewage-grown algae”. Biomass 16 :51-62 (1988). [4] González-Fernández C., Ballesteros M., “Microalgae autoflocculation: An alternative to high-energy consuming harvesting methods”. J. Appl. Phycol. 25 : 991-9 (2013).
[5] Solicitud de patente española ES 2545829 A1.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
A la luz de los problemas y limitaciones del estado de la técnica expuestos en la sección anterior, la presente invención tiene por objeto proporcionar una tecnología que permite llevar a cabo la deshidratación osmótica de cultivos de microalgas de forma adaptable a diferentes necesidades de uso, de un modo sencillo y económico. No obstante, dicha tecnología no se limita a su aplicación en cultivos de microalgas, sino que se puede extender además a otros cultivos de microorganismos.
Más concretamente, la invención se refiere a un sistema y a un procedimiento según las reivindicaciones incorporadas en el presente documento, que aporta al menos seis ventajas para la aplicación de la separación osmótica de los cultivos, en comparación con las técnicas previamente existentes:
- Puede ser colocado a continuación de la salida del cosechado de biorreactores de cultivo de microorganismos que operan en continuo.
- Permite regular fácilmente el tiempo de residencia del cosechado dentro del concentrador, modificando la longitud útil de la membrana semipermeable que se introduce en el dispositivo (modificando así la concentración final del cosechado).
- No precisa hacer uso de ninguna fuente de energía externa para la circulación del cultivo a deshidratar, ya que el dispositivo puede ser colocado debajo del nivel del rebosadero de biorreactores que funcionen en continuo, favoreciéndose así la circulación por gravedad (por diferencia de alturas).
- Permite acoplar varios dispositivos que trabajen en serie o en paralelo, para atender a mayores tiempos de residencia o caudales de cosechado, respectivamente.
- Permite utilizar uno o varios tramos tubulares de membrana para que el cultivo pueda circular, aumentando así el tiempo de residencia del cultivo dentro del deshidratador.
- Permite utilizar membranas semipermeables de tipo flexible gracias a que el conjunto de varillas roscadas que conforman el sistema mantiene a dichas membranas en la posición adecuada para realizar eficazmente el proceso de deshidratación osmótica.
El dispositivo concentrador de la invención comprende, preferentemente:
- una carcasa adaptada para alojar un fluido osmótico; - al menos un tubo para la circulación de un fluido que aloja un cultivo de microorganismos, donde la pared de dicho tubo está formada por una membrana semipermeable y donde el tubo está dispuesto, al menos parcialmente, en el interior de la carcasa, donde la membrana del tubo separa el espacio por el que circula el fluido con el cultivo de microorganismos del espacio donde se aloja el fluido osmótico. Preferentemente, dicha membrana es una membrana de tipo flexible y, más preferentemente, una membrana flexible de diálisis.
Ventajosamente, el dispositivo comprende, adicionalmente:
- al menos un orificio de entrada dispuesto en la carcasa, conectado interiormente a al menos uno de los tubos, a través de uno o más elementos conectores; y
- al menos un rebosadero de salida dispuesto en la carcasa, conectado interiormente a al menos uno de los tubos, a través de uno o más elementos conectores, de forma que, cuando dichos orificios de entrada y de salida se encuentran abiertos, permiten la circulación del fluido que aloja el cultivo de microorganismos a través del tubo.
Asimismo, la posición de los conectores en el interior de la carcasa, y/o la longitud del tubo son regulables en el dispositivo, de forma que la variación de dicha posición y/o de dicha longitud proporciona una variación en la longitud de circulación del fluido con el cultivo de microorganismos a lo largo de dicho tubo.
En una realización preferente de la invención, el tubo formado por la membrana está longitudinalmente dispuesto dentro de la carcasa entre sendos soportes, a los que se fija por medio de los elementos conectores.
En otra realización preferente de la invención, la carcasa posee una forma cilindrica y los soportes poseen forma de discos.
En otra realización preferente de la invención, la relación geométrica entre el radio interno (R) de la carcasa externa, su longitud (L) y la relación entre el volumen específico por unidad de longitud de la membrana (ve), el número de tramos de membrana (N), y el diámetro de la membrana (0mem)) es:
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En otra realización preferente de la invención, el dispositivo comprende una pluralidad de varillas de longitud regulable dispuestas entre los soportes, que permiten regular la distancia entre dichos soportes. Más preferentemente, las varillas se ubican equidistantes al centro de los soportes y, aún más preferentemente, la sujeción de cada varilla a ambos soportes se realiza mediante elementos roscados.
En otra realización preferente de la invención, el tubo está conformado por una pluralidad de tramos conectados a través de uno o más conectores. Más preferentemente, los conectores de los tramos del tubo poseen forma de “U”, de “L”, haciendo que el fluido que aloja el cultivo sea conducido para circular en diferentes sentidos por el interior del tubo.
En otra realización preferente de la invención, la carcasa comprende una tapa.
En otra realización preferente de la invención, la carcasa comprende al menos un rebosadero auxiliar para fluido osmótico.
En otra realización preferente de la invención, el orificio de entrada del dispositivo está conectado a la salida de un biorreactor de cultivo de microorganismos.
En otra realización preferente de la invención;
- el fluido osmótico alojado en la carcasa comprende disoluciones de glicerol, agua de mar, agua hipersalina u otro líquido con mayor fuerza osmótica que el fluido de cultivo que circula por el tubo; y/o
- la membrana semipermeable es una membrana de diálisis.
Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para concentrar un cultivo de microorganismos procedente de un biorreactor, por osmosis directa y funcionamiento en continuo, que emplea un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. Dicho procedimiento comprende, ventajosamente, la realización de las siguientes etapas:
- se conecta el orificio de entrada del dispositivo a la salida del biorreactor;
- se introduce un fluido osmótico en el interior de la carcasa, en el espacio definido entre ésta y el tubo;
- se hace circular un fluido que aloja el cultivo de microorganismos procedente del biorreactor a través del tubo del dispositivo, de forma que su concentración aumente al filtrarse por osmosis parte de dicho fluido que aloja el cultivo, desde el interior del tubo hasta su exterior a través de la membrana, mezclándose con el fluido osmótico;
- se recoge el fluido concentrado que aloja el cultivo en un recipiente conectado al rebosadero del dispositivo;
- se recoge el fluido osmótico mezclado con las sustancias que se han filtrado a través de la membrana que conforma el tubo. En una realización preferente de dicho procedimiento, el tiempo de aplicación del procedimiento de concentración por osmosis se regula modificando la longitud y/o número de tubos de membrana y/o la altura del fluido osmótico alojado en la carcasa.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención:
- la carcasa y/o la membrana se esterilizan previamente a la circulación del fluido que aloja el cultivo por el interior del tubo; y/o
- el fluido osmótico es estéril.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, se renueva el fluido osmótico, durante o tras una o más circulaciones del fluido que aloja el cultivo, para mantener alta la tasa de transferencia de materia entre el cultivo y el fluido osmótico.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, se dispone el dispositivo a un nivel por debajo de la salida del biorreactor; y/o se utiliza una bomba para impulsar el fluido que aloja el cultivo de microorganismos hasta la entrada del dispositivo.
Asimismo, se presentan a continuación las definiciones de los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria, según el significado entendido comúnmente por una persona experta en la técnica.
El término “fluido osmótico” se refiere a la sustancia que se utiliza con objeto de favorecer la transferencia del agua o medio de cultivo hacia afuera de la membrana contenida en el dispositivo objeto de la presente invención. A modo de ejemplo, dicho fluido puede comprender disoluciones de glicerol, pero no se limita únicamente al uso de esta sustancia.
El término “cultivo” y variantes de éste, tales como “cultivar”, se refieren a la presencia de una o más tipos de células en el mismo biorreactor. Según la presente memoria, los términos “caldo”, “cosechado” o “cultivo” indistintamente, se refieren también al contenido extraído del biorreactor en un momento determinado, que contiene las células y el medio de cultivo. Los tipos de células pueden ser microorganismos, tales como microalgas o pueden ser células de microalgas cultivadas con un tipo de célula diferente, o pueden ser bacterias, levaduras, hongos, etc. Al conjunto de células se le denomina “biomasa”. Los medios de cultivo pueden ser aquellos que refuerzan el crecimiento y/o propagación de al menos una de las células, o un subconjunto de estas. Los medios de cultivo contienen comúnmente componentes tales como una fuente de nitrógeno fija, elementos en trazas, opcionalmente una solución reguladora para el mantenimiento del pH, y fosfato. Otros componentes pueden incluir una fuente de carbono fija tal como acetato o glucosa y sales, tales como cloruro de sodio, particularmente para microalgas de agua de mar. Los ejemplos de elementos en trazas incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en forma de sal, ácido u otra apropiada para el cultivo. Además, el medio puede contener disueltos metabolitos excretados por las células que contiene. Los medios de cultivo pueden tener una formulación compleja que no está totalmente definida en su composición química, por ejemplo, los que contienen extracto de carne, extracto de levadura, etc. La fuente de carbono fija comprende sacarosa y glucosa, fructosa, acetato o glicerol, entre otros. Algunas especies de microalgas pueden ser cultivadas al utilizar una fuente de carbono fija tal como glucosa o acetato en ausencia de luz. Tal cultivo es conocido como cultivo heterotrófico o heterótrofo.
El término “deshidratación” y variantes de éste, tales como “deshidratar”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la eliminación de agua contenida en el medio de cultivo, ya sea pura o acompañada de otras sustancias disueltas en ella.
El término “concentrador” se refiere al artefacto tecnológico diseñado para que en su interior pueda aumentar la concentración de biomasa gracias a la eliminación de agua contenida en el caldo de cultivo. El término “caldo concentrado”, “cultivo concentrado” o simplemente “concentrado” se refiere a la suspensión resultante luego de haber residido el tiempo necesario dentro de la membrana del concentrador.
El término “rebosadero” se refiere en la presente memoria al orificio al cual se conecta una boquilla, conducción u otro tipo de salida del biorreactor o del concentrador, dispuesto de modo que, cuando el fluido en cuestión alcance el nivel de dicho orificio, fluya espontáneamente a través de este.
La expresión “rebosadero del caldo”, en el concentrador, se refiere al rebosadero por el cual abandona del concentrador el caldo que contiene la biomasa ya concentrada.
La expresión “haz de tubos de membrana” se refiere a una modalidad de distribuir los tubos de membrana dentro de la carcasa, que consiste en disponer varios tramos de tubo de membrana verticales dentro de la carcasa conectando un extremo final de tubo con el extremo inicial del siguiente mediante una pieza diseñada en forma de “U”, de “L” o similar.
El término “rebosadero del fluido osmótico”, en el concentrador, se refiere al rebosadero por el cual el fluido osmótico utilizado para favorecer la eliminación del agua del caldo de cultivo abandona el concentrador. El término “entrada del cosechado” del concentrador se refiere a la abertura y/o dispositivos acoplados mediante los cuales el caldo que contiene las microalgas es introducido en el concentrador durante la operación.
El término “entrada del fluido osmótico” se refiere a la abertura y/o a los dispositivos acoplados mediante los cuales el fluido osmótico es introducido al concentrador, antes o durante la operación de concentración.
La expresión “operación por lotes”, “concentración por lotes” o “batch” se refiere al modo de realización del proceso en el cual se introduce el cultivo y se espera un tiempo dado, tras el cual se saca el cultivo concentrado. Durante ese tiempo de procesado, no ingresa nuevo cultivo al proceso.
La expresión “operación en continuo”, “concentración en continuo” o “concentración continua” se refiere al modo de realización del proceso en el cual la introducción del cultivo se produce continuamente, a la vez que se realiza el proceso, así como la recolección del concentrado.
La expresión “longitud útil” se refiere a la longitud del dispositivo que resulta de utilidad para el desarrollo efectivo del proceso. Así la “longitud útil del tubo de membrana” se refiere a la longitud de membrana que se encuentra inmersa en el fluido osmótico y que contiene al cultivo.
La expresión “tiempo de residencia global” se refiere al tiempo durante el cual el cultivo permanecería dentro de la longitud de membrana útil si no se eliminara medio de cultivo a través de la membrana semipermeable.
Se define como osmosis al movimiento espontáneo de un solvente a través de una membrana semipermeable. Una membrana semipermeable es una membrana que permite el paso del solvente, pero no es totalmente permeable a los solutos. El movimiento del solvente se produce sin necesidad de aplicar ninguna fuerza externa, sino que ocurre cuando a ambos lados de la membrana semipermeable existen distintos valores para el potencial químico de dicho solvente. El potencial químico del solvente (JJA, expresado en J-mol-1) dependerá de su potencial químico en estado puro (JJA *, expresado en J-mol-1), la temperatura a la que se encuentre (T, expresada en K) y la actividad del solvente (a¿), según la ecuación: mA = A * + 8.314 · T · ln ( aA ) .
La actividad del solvente está íntimamente ligada con la concentración del solvente en la disolución, de modo que modificaciones en la concentración del solvente a ambos lados de la membrana, o modificaciones de temperatura, pueden ocasionar diferencias de potencial químico, que obliguen al solvente en cuestión a moverse desde un lado hacia el otro de la membrana semipermeable. El solvente atraviesa la membrana pasando de la zona de mayor potencial químico a la zona de menor potencial químico hasta que los potenciales a ambos lados de la membrana resultan iguales. La disolución donde el potencial químico del solvente es menor se denomina disolución osmótica. Cuando el solvente que traspasa la membrana es agua, hablamos de deshidratación osmótica. Aunque una membrana ideal para la deshidratación osmótica sólo permite el paso del agua, las membranas reales no son totalmente impermeables a todos los solutos, de modo que la deshidratación osmótica podría implicar también el movimiento de algunas de las sales y otras sustancias presentes en el medio acuoso hacia la disolución osmótica y viceversa.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras que acompañan al presente documento ilustran la tecnología de la invención en algunas de sus modalidades de uso preferente, pero sin limitación a otras realizaciones.
La Figura 1 muestra una vista exterior del dispositivo para concentrar el caldo que contiene a la biomasa, por un proceso de osmosis directa en funcionamiento, según una realización preferente de la invención. Se puede observar un tubo (1) de membrana dentro de una carcasa (2) cilindrica. El cultivo ingresa a través del orificio inferior de entrada (4) y sale a través del orificio de salida o rebosadero (3, 3’) del caldo en el concentrador, configurado con una pieza (16) en forma de codo. La membrana se mantiene extendida, gracias a la acción de unas varillas roscadas (11). Un orificio de entrada (4’) auxiliar del fluido osmótico en una tapa inferior (14’) se mantiene con una válvula cerrada, para impedir la fuga del fluido osmótico, que sale una vez alcanzado un orificio superior (15, 15’) de salida del fluido osmótico. Una tapa superior (14) del concentrador mantiene al fluido osmótico libre de impurezas del ambiente.
La Figura 2 muestra una vista de los elementos de la estructura interna del dispositivo concentrador del caldo. Pueden observarse el orificio de salida o rebosadero (3) del caldo en el concentrador, unos soportes a modo de discos circulares superior (5) e inferior (6), a través de los cuales pasan las varillas roscadas (11) para mantener la membrana del tubo (1) estirada y cuya altura se regula a través de dos roscas por varilla (12, 12’ 13, 13’) que se colocan sobre las caras superior e inferior de cada disco (5, 6). Puede observarse también cómo se fijan los extremos del tubo (1) formado por la membrana, mediante elementos de poliamida, así como una pluralidad de elementos conectores (7, 8, 9, 10).
Referencias numéricas:
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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se expone, a continuación, una descripción detallada de la invención referida a una realización preferente de la misma, basada en las Figuras 1-2 del presente documento. Dicha descripción se aporta con fines ilustrativos, pero no limitativos, de la invención reivindicada.
Como se ha descrito en los apartados precedentes, un objeto principal de la presente invención es un dispositivo concentrador, que permite llevar a cabo un proceso en continuo de deshidratación osmótica del cosechado procedente del rebosadero de un biorreactor. Para ello, se utiliza una membrana semipermeable que permite el paso del agua y de algunas sales a través de ella, pero no de los microorganismos. Dicha membrana puede ser cualquier membrana semipermeable de tipo flexible, o una membrana comercial adaptada al efecto, como es, por ejemplo, la membrana de diálisis de Spectrum Labs (MWCO: 20KDa, Standard Regenerated Cellulose (RC), 0.79 ml/cm y 10 mm de diámetro, Spectrum Labs, USA), pero sin limitación a otras membranas equivalentes.
Como se observa en las realizaciones mostradas en las Figuras 1-2, el dispositivo de la invención adopta una configuración preferentemente cilindrica con orientación vertical, con flujo de líquido aguas arriba, en dirección opuesta a la gravedad (aunque, preferentemente, con circulación favorecida por ésta). En dicha configuración, la membrana ocupa un lugar central en el interior del dispositivo, alojando el líquido circulante que se desea filtrar.
Para hacer que el líquido, preferentemente agua, fluya espontáneamente en dirección radial a través de la membrana, el cosechado proveniente del biorreactor circula hasta alcanzar la zona interior de la membrana semipermeable, dispuesta en forma de tubo (1), y contenida dentro de una carcasa (2) (Figura 1) preferentemente cilindrica, que contiene el fluido osmótico en el dispositivo. A medida que dicho tubo (1) conformado por la membrana recibe cosechado, el caldo es empujado hacia arriba, en dirección axial, hasta que alcanza un orificio (3) de salida o rebosadero del caldo, dispuesto en el dispositivo. Durante el periodo de circulación por el interior del tubo (1) formado por la membrana, el agua contenida en el caldo es expulsada hacia afuera de la membrana (dada su naturaleza semipermeable), en dirección radial a través de la misma, alcanzando la disolución osmótica alojada en el interior de la carcasa (2). De este modo, el caldo que sale por el rebosadero (3) de salida posee una concentración de biomasa mayor que a la entrada (4) del dispositivo concentrador (que coincide con la salida del biorreactor). Asimismo, la membrana se mantiene preferentemente extendida, manteniendo su forma tubular dentro de la carcasa (2) del concentrador, conectándose por ambos extremos de dicho tubo (1) a sendos soportes (5, 6), que adoptan preferentemente forma de discos superior e inferior y que pueden estar fabricados de un material plástico, tal como por ejemplo PVC. La conexión entre el tubo (1) que forma la membrana y los soportes (5, 6) se realiza, preferentemente, mediante conectores interiores (7, 8) correspondientes, por ejemplo, a través de elementos de poliamida a los cuales se fija la membrana, bien de forma directa o haciendo uso de adaptadores con forma cónica o cilindrica.
Por la parte exterior del soporte superior (5) (Figura 2), se dispone un conector (9) de salida del caldo de cultivo concentrado y, por la parte exterior del soporte inferior (6), se dispone un conector (10) de entrada de cultivo concentrado al dispositivo. En una realización preferente de la invención, la distancia entre los soportes superior (5) e inferior (6) se fija mediante una pluralidad de varillas (11) de longitud regulable (por ejemplo, a través de medios roscados). Más preferentemente, dichas varillas (11) se ubican equidistantes al centro de los soportes superior (5) o inferior (6) (en la Figura 1 se muestran dos realizaciones basadas en cuatro y en tres varillas (11), respectivamente). La sujeción de cada varilla (11) a ambos soportes (5, 6) se realiza, preferentemente, mediante roscas superiores (12, 12’) e inferiores (13, 13’), respectivamente.
Como se ha descrito previamente, el cultivo ingresa al concentrador a través del conector inferior externo (10) y, luego de atravesar el conector inferior interno (8), comienza a circular por el tubo (1) aguas arriba, alcanzando la superficie interior de la membrana (que conforma dicho tubo (1)), donde se inicia el proceso de osmosis hacia el exterior de la misma. Así, la membrana se encuentra bañada, por su lado externo, por el fluido osmótico que se encuentra a su vez contenido dentro de la carcasa (2). En diferentes realizaciones preferentes de la invención, el dispositivo puede comprender un único tramo de tubo (1) de membrana o, alternativamente, puede comprender una pluralidad de tubos (1) conectados, mediante elementos conectores de extremos de membrana (por ejemplo, en forma de “U”, de “L”, etc.) haciendo que el líquido sea conducido para continuar circulando en diferentes sentidos, pero siempre discurriendo por el interior de los tramos de tubo (1) definidos por la membrana. Una vez atravesados los tramos de tubo (1) de membrana, con sus respectivas conexiones, dispuestos en el concentrador, el cultivo abandona el dispositivo a través del orificio de salida o rebosadero (3) del caldo dispuesto en el concentrador.
En diferentes realizaciones, el fluido osmótico puede introducirse al dispositivo concentrador abriendo (por ejemplo, desenroscando) una tapa superior (14) de la carcasa (2) del dispositivo y, a su vez, manteniendo cerrado el orificio de entrada (4) inferior del fluido osmótico, o bombearse directamente desde el orificio de salida (3). La mezcla de fluido osmótico más el líquido transferido por el cultivo al fluido osmótico, puede abandonar el concentrador a través de un rebosadero auxiliar (15) para fluido osmótico, una vez que éste alcanza el nivel requerido para ello. En una realización preferente, el rebosadero (3) del concentrado lleva conectada una pieza (16) en forma de codo para cambiar la dirección del concentrado, como se aprecia en la Figura 1. En dicha realización, el rebosadero auxiliar (15) del fluido osmótico se encuentra preferentemente ubicado por debajo del rebosadero (3) del concentrado (por ejemplo, aproximadamente a 3-5 cm) debido a que dicha pieza en forma de codo no resulta útil para la deshidratación y por tanto no necesita ser bañada por el fluido osmótico. Asimismo, en otras realizaciones, pueden existir otros orificios de rebosadero (3’, 15’), tanto principales como auxiliares, dispuestos a distintas alturas en la carcasa (2), para que no sea necesario rellenar totalmente dicha carcasa (2) con fluido osmótico cuando no se requiera. En estas realizaciones, es posible utilizar cierres (por ejemplo, tapones de goma, no representados en las figuras) para tapar las salidas que no se utilizan.
La diferencia de potencial químico existente a ambos lados de la membrana fuerza el paso del agua hacia la disolución osmótica alojada en la carcasa (2), aumentando en consecuencia la concentración del cultivo de microalgas en el interior del tubo (1). Por su parte, la disolución osmótica contenida entre la carcasa (2) y la membrana va incrementado su volumen, debido al aporte de líquido que recibe desde el caldo de cultivo contenido en la membrana. El nivel de fluido osmótico, por tanto, va subiendo hasta alcanzar el rebosadero auxiliar (15) del fluido osmótico en el concentrador, a través del cual sale y es recogido en otro recipiente, pudiendo ser reutilizado hasta que se agote la fuerza impulsora dada por las diferencias de potenciales químicos entre el cultivo de microorganismos a concentrar y el fluido osmótico. El fluido osmótico también puede ser directamente retirado del proceso, una vez utilizado.
Una ventaja importante de esta tecnología radica en que no es necesario gastar energía convencional para que el caldo de cultivo fluya desde el orificio de entrada (4) hasta el rebosadero de salida (3) del concentrador, dado que el concentrador puede ser colocado en un nivel por debajo de la salida del biorreactor al cual va acoplado, de modo que se favorece la circulación por gravedad. A pesar de que la circulación no requiere propulsión mediante el uso de ninguna fuente de energía externa es posible, en diferentes realizaciones preferentes de la invención, regular el tiempo de residencia del cultivo dentro de la membrana de diversas formas a saber:
- regulando la altura del tubo o tubos (1) de diálisis que se utilizan (ajustando también la altura de las varillas que los soportan (11)) y utilizando un orificio de salida auxiliar (3) para el caldo concentrado;
- variando la longitud útil de la membrana, cambiando la ubicación del orificio de salida (15) del fluido osmótico (cuanto más abajo esté, menor longitud de membrana estará mojada por el fluido osmótico);
- por combinación de las dos opciones anteriores;
- variando el número de tramos tubulares (1) de membrana por los cuales circula el fluido (puede circular sólo por uno y dirigirse la salida del tramo de membrana a la salida de cultivo del concentrador, o dirigirse a un nuevo tramo de membrana). Dado que la osmosis constituye un proceso espontáneo, el proceso por sí mismo tampoco consume energía externa. En reactores aireados, puede dirigirse la salida de gases del reactor, junto con el cultivo, hacia el concentrador osmótico, y favorecer así el mezclado del caldo dentro de la membrana. El consumo de energía procedente de otras fuentes es nulo, siendo este hecho especialmente relevante cuando se pretende utilizar la biomasa para producir energía, ya que el coste energético de la eliminación del agua por métodos convencionales (como por ejemplo la centrifugación y/o la liofilización del cultivo) es elevado. Además, es posible incrementar la concentración debida puramente al fenómeno de deshidratación osmótica con la sedimentación natural que se produce dentro de la membrana, al verse reducida la velocidad de circulación del cultivo de microorganismos debido al flujo radial de agua que abandona la membrana.
Se describe a continuación el procedimiento de preparación y utilización del dispositivo de la presente invención, según una realización preferente de dicho dispositivo.
Para la preparación de una membrana de longitud determinada, se corta el trozo de membrana y se la acondiciona, poniéndola en remojo aproximadamente 30 minutos en agua desionizada, siguiendo las instrucciones del fabricante. Asimismo, se regula la altura de las varillas (11) internas, para adecuarlas a la longitud del tubo (1) de membrana elegida.
A continuación, se conecta la membrana a los tubos de poliamida y se encajan dichos tubos de poliamida en los conectores internos (7, 8) que atraviesan los soportes (5, 6). De este modo, se va regulando la posición del soporte superior (5) hasta que la membrana quede totalmente extendida, pero sin tensión excesiva. Adicionalmente, se introduce el conjunto interior completo que consiste en: tramo tubular (1) de membrana, varillas de sujeción (11), soportes (5, 6) y conectores (7, 8, 9, 10) dentro de la carcasa (2), haciendo coincidir el conector interno (8) o para la entrada del caldo con el orificio de entrada (4). Se sella la rosca de dicho conector (8), por ejemplo, mediante un sistema de junta y teflón, y se unen los conectores interiores (7, 8) y exteriores (9, 10) a sus correspondientes soportes (5, 6), preferentemente por roscado. Si se desea trabajar en condiciones de asepsia, se hace circular etanol por el camino del cultivo durante aproximadamente 20 minutos. A continuación, se elimina el etanol del sistema y se conecta el orificio de entrada (3) del cultivo a la salida del biorreactor y la salida (4) del caldo concentrado proveniente del concentrador a un recipiente de recogida (estéril, si se desea trabajar en asepsia). Posteriormente, se llena la carcasa (2) con el fluido osmótico (estéril, si así lo requiere la aplicación) hasta el nivel del rebosadero (15) del fluido osmótico, con todas las otras salidas auxiliares (15’) taponadas con sus respectivos cierres, y se conecta la salida del rebosadero (15) a un recipiente de recogida del fluido osmótico excedente.
En ese punto, se da comienzo a la entrada del caldo. El dispositivo debe colocarse, preferentemente, por debajo del nivel de salida del biorreactor, procurando que el rebosadero (3) del caldo en el concentrador quede, asimismo, por debajo del nivel del rebosadero del biorreactor.
Como alternativa, se puede proporcionar agitación a uno o ambos lados de la membrana semipermeable, mediante la introducción de aire a través de un orificio correspondiente. Asimismo, se puede disponer el flujo o circulación del cultivo o de la disolución osmótica, operando en semicontinuo. Y, por último, se puede disponer el flujo o circulación del cultivo y de la disolución osmótica operando en continuo.
La presente invención se ilustra, adicionalmente, mediante el siguiente ejemplo, cuyo alcance no debe ser interpretado de forma limitativa.
Ejemplo de realización preferente:
Se utiliza un concentrador con un tramo tubular (1) de membrana de 14 cm de largo, para concentrar el cosechado de un biorreactor de 2 litros de capacidad, en el cual se realiza el cultivo de microalgas, operando en continuo durante 24 horas, a una velocidad de dilución de 0.144 d 1. La adición del medio al biorreactor se realiza mediante una bomba peristáltica, que funciona a caudales establecidos por el usuario, en este de caso de 0.2 ml/min, de modo que cada vez que se produce una adición de medio al biorreactor se desaloja un volumen equivalente de cultivo por su rebosadero. Se corta una tira de 18 cm de un tubo (1) de membrana de diálisis (MWCO: 20KDa, Standard Regenerated Cellulose (RC), 0.79 ml/cm y 10 mm de diámetro, Spectrum Labs, USA). El tubo (1) se sumerge durante 30 minutos en un recipiente que contiene agua desionizada para eliminar el conservante, según indicaciones del fabricante.
Se toma el conjunto de elementos internos (1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11) del concentrador y se ajusta la distancia entre los soportes inferior (6) y superior (5) a 20 cm, roscando los juegos de tuercas superiores e inferiores (12, 12’, 13, 13’) de las varillas (11) que soportan a cada disco. Se abre uno de los extremos del tubo (1) de membrana y se introduce sobre la pieza de sujeción (8). Se sujeta el extremo libre de la membrana a la pieza de sujeción (7) del lado opuesto de la pieza interior del concentrador. A continuación, se introduce el conjunto montado previamente en el interior de la carcasa (2). Se introduce la conducción de salida del concentrado del dispositivo concentrador por el rebosadero (3) del concentrado. Se inserta la boca del conector (10) inferior a través del orificio (4) del casquete inferior de la carcasa (2), se coloca una junta con un poco de teflón y se une, mediante roscado, al conector inferior externo (10) de la carcasa (2), quedando así unidas la carcasa (2) y el conjunto interno concéntrico. Se conecta la boca de entrada (4) del cultivo al rebosadero de cultivo del biorreactor, y el rebosadero (3) del concentrador a una probeta graduada, que permite medir el volumen de concentrado recogido en cada momento. Dicha probeta se coloca a una distancia horizontal de 0,3 m sobre la salida (3) de cultivo concentrado y a una distancia vertical de 0,15 m por debajo del rebosadero de salida del biorreactor. Se conecta la conducción de recogida del fluido osmótico en el orificio de rebosadero auxiliar (15), dirigiéndola a una probeta graduada que permite medir el volumen del líquido desalojado. Se rellena el volumen libre entre el tubo (1) y la carcasa (1) con glicerol crudo, según la siguiente composición: 80.5% (w/w) de glicerol (GPR Rectapur®, 98% de pureza), 10.1% (w/w) de agua destilada, 5.2% (w/w) de cloruro de sodio (Sigma Aldrich, AGS Grade, 99% de pureza), 0.4% (w/w) cloruro de potasio (Sigma Aldrich, AGS Grade, 99% de pureza), 2% (w/w) de metanol (Sigma Aldrich, 99.8% de pureza) y 2% (w/w) de ácido oleico, por la parte superior del concentrador. El glicerol desciende por las paredes de la carcasa (2), a través de la holgura existente entre el soporte superior (5) y la carcasa (2), desalojando el aire. Cuando se alcanza el nivel del rebosadero (15) del fluido osmótico, se coloca la tapa superior (14) de la carcasa (2). Una vez configurado el concentrador para su funcionamiento, se inicia el experimento, midiendo a intervalos los volúmenes de cultivo concentrado recogido (VCUitivo) y de fluido osmótico desalojado (Vdesaiojado). Con estas medidas, se calcula el volumen total tratado en ese intervalo de 24 h y el tiempo de residencia global del cultivo en el concentrador (tr), según:
Figure imgf000019_0001
siendo 11 mi el volumen útil de la membrana para este experimento.
Se calculan el factor de concentración (F) y el porcentaje de concentración (%C) según: v
F =
V cultivo
% C = (F — 1) * 100. Se realiza el promedio de estas cantidades, para el intervalo de tiempo muestreado durante la operación en continuo, obteniéndose así los valores medios de V, Q, tr, F y %C para cada experimento. Para realizar los promedios se descartan los datos correspondientes a los intervalos de tiempo iniciales, en los cuales el tubo (1) de membrana no estaba visiblemente completo en todo su volumen. El fluido osmótico es reemplazado cada vez que se ha desplazado aproximadamente un tercio de su volumen, para evitar cambios abruptos en la fuerza osmótica. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de los valores medios para la velocidad de dilución (D) aplicada al biorreactor en continuo:
Figure imgf000020_0001
Tabla 1. Resultados obtenidos según el ejemplo de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Dispositivo concentrador de cultivos de microorganismos por osmosis directa y funcionamiento en continuo, que comprende:
- una carcasa (2) adaptada para alojar un fluido osmótico;
- al menos un tubo (1) para la circulación de un fluido que aloja un cultivo de microorganismos, donde la pared de dicho tubo (1) está formada por una membrana semipermeable y donde el tubo (1) está dispuesto, al menos parcialmente, en el interior de la carcasa (2); donde la membrana del tubo (1) separa el espacio por el que circula el fluido con el cultivo de microorganismos del espacio donde se aloja el fluido osmótico; caracterizado por que el dispositivo comprende, adicionalmente:
- al menos un orificio de entrada (4) dispuesto en la carcasa (2), conectado interiormente a al menos uno de los tubos (1), a través de uno o más elementos conectores (8, 10);
- al menos un rebosadero de salida (3, 3’) dispuesto en la carcasa (2), conectado interiormente a al menos uno de los tubos (1), a través de uno o más elementos conectores (7, 9); de forma que cuando dichos orificios de entrada (4) y de salida (3, 3’) se encuentran abiertos, permiten la circulación del fluido que aloja el cultivo de microorganismos a través del tubo (1); y por que tanto la posición de los conectores (7, 8, 9, 10) en el interior de la carcasa (2) o la longitud del tubo (2) es regulable, de forma que la variación de dicha posición o de dicha longitud proporciona una variación en la longitud útil de circulación del fluido con el cultivo de microorganismos a lo largo de dicho tubo (2).
2.- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde el tubo (1) formado por la membrana está longitudinalmente dispuesto dentro de la carcasa (2) entre sendos soportes (5, 6), a los que se fija por medio de los elementos conectores (7, 8, 9, 10).
3.- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde la carcasa (2) posee una forma cilindrica y los soportes (5, 6) poseen forma de discos.
4 Dispositivo según la reivindicación anterior, donde la relación geométrica entre el radio interno (R) de la carcasa externa (2), su longitud (L) y la relación entre el volumen específico por unidad de longitud de la membrana (ve), el número de tramos de membrana (N), y el diámetro de la membrana (0mem)) es: 49.
Figure imgf000022_0001
5.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que comprende una pluralidad de varillas (11) de longitud regulable dispuestas entre los soportes (5, 6), que permiten regular la distancia entre dichos soportes (5, 6).
6.- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde:
- las varillas (11) se ubican equidistantes al centro de cada uno de los soportes (5, 6); y/o
- la sujeción de cada varilla (11) a ambos soportes (5, 6) se realiza mediante elementos roscados (12, 12’, 13, 13’).
7.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tubo (1) está conformado por una pluralidad de tramos conectados a través de uno o más elementos conectores.
8.- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde los conectores de los tramos del tubo (1) poseen forma de “U”, de “L”, haciendo que el fluido que aloja el cultivo sea conducido para circular en diferentes sentidos por el interior del tubo (1).
9.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la carcasa
(2):
- comprende al menos una tapa (14, 14’);
- comprende al menos un orificio de entrada (4’) para fluido osmótico; y/o
- comprende al menos un rebosadero auxiliar (15, 15’) para fluido osmótico.
10.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el orificio de entrada (3) está conectado a la salida de un biorreactor de cultivo de microorganismos.
11.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
- el fluido osmótico alojado en la carcasa (2) comprende glicerol, agua de mar, agua hipersalina u otro líquido con mayor fuerza osmótica que el fluido de cultivo que circula por el tubo (1); y/o
- la membrana semipermeable es una membrana de diálisis.
12.- Procedimiento para concentrar un cultivo de microorganismos procedente de un biorreactor, por osmosis directa y funcionamiento en continuo, que emplea un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende la realización de las siguientes etapas:
- se conecta el orificio de entrada (4) del dispositivo a la salida del biorreactor;
- se introduce un fluido osmótico en el interior de la carcasa (2), en el espacio definido entre ésta y el tubo (1);
- se hace circular un fluido que aloja el cultivo de microorganismos procedente del biorreactor a través del tubo (1) del dispositivo, de forma que su concentración aumente al filtrarse por osmosis parte de dicho fluido que aloja el cultivo, desde el interior del tubo (1) hasta su exterior a través de la membrana, mezclándose con el fluido osmótico;
- se recoge el fluido concentrado que aloja el cultivo en un recipiente conectado al rebosadero (3) del dispositivo;
- se recoge el fluido osmótico mezclado con las sustancias que se han filtrado a través de la membrana que conforma el tubo (1).
13.- Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el tiempo de aplicación del procedimiento de concentración por osmosis se regula modificando la longitud y/o número de tubos (1) de membrana y/o la altura del fluido osmótico alojado en la carcasa (2).
14.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde:
- la carcasa (2) y/o la membrana se esterilizan previamente a la circulación del fluido que aloja el cultivo por el interior del tubo (1); y/o
- el fluido osmótico es estéril.
15.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde:
- se renueva el fluido osmótico, durante o tras una o más circulaciones del fluido que aloja el cultivo, para mantener alta la tasa de transferencia de materia entre el cultivo y el fluido osmótico; y/o
- se dispone el dispositivo a un nivel por debajo de la salida del biorreactor; y/o se utiliza una bomba para impulsar el fluido que aloja el cultivo de microorganismos hasta la entrada (4) del dispositivo.
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