WO2021215952A1 - Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus - Google Patents

Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus Download PDF

Info

Publication number
WO2021215952A1
WO2021215952A1 PCT/RU2020/000198 RU2020000198W WO2021215952A1 WO 2021215952 A1 WO2021215952 A1 WO 2021215952A1 RU 2020000198 W RU2020000198 W RU 2020000198W WO 2021215952 A1 WO2021215952 A1 WO 2021215952A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
levivirus
family
bacteriophages
rna
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/000198
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Игорь Геннадьевич СИВОВ
Игорь Сергеевич ФИРСОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Индженик"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Индженик" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Индженик"
Priority to PCT/RU2020/000198 priority Critical patent/WO2021215952A1/ru
Priority to EP20932307.0A priority patent/EP4141110A1/en
Publication of WO2021215952A1 publication Critical patent/WO2021215952A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10244—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the group of inventions relates to medicine and biology and concerns a technologically simple method of creating particles of bacteriophages of the Levivirus family (M82-like), devoid of LPS toxicity, and a method of their biomineralization, which provides prerequisites for the study of their application for targeted delivery to malignant tumor cells (including number of endothelial cells of the pathological circulatory network), enriched with integrin a in P3, which makes it possible to drastically reduce their overall toxicity.
  • VLP Phage-like particles
  • VLPs Virus-like particles
  • VLPs are multimeric nanostructures assembled from native viral structural proteins, but devoid of any genetic material.
  • VLPs are composed of high-density displays of viral surface proteins and as such are highly adaptive tools for a variety of applications (eg, antibody development, delivery system, membrane protein expression).
  • VLPs can also provide tissue-specific targeting as they are derived from their own virus.
  • the particle surface is susceptible to a chemical conjugation reaction, which makes it possible to create a tissue-specific ligand on its surface. In this case, the VLP particle becomes, in the words of the developers, a display demonstrating its ability to find cellular targets.
  • bacteriophages Zeltins A.
  • VLP particles of Lentivirus were described, which are obtained by sequential operations: cloning cDNA of genomic RNA sequences of these bacteriophages, expressing them in bacterial cells of E. coli, and then excreting particles using detoxification techniques.
  • Penicillins are a large family of compounds, the common structural basis of which is the b-lactam ring, the b-lactam ring is a target for nucleophilic attack of free amino groups of proteins, leading to ring opening and covalent amide binding of the penicilloyl group.
  • the penicilloyl configuration in which the hapten-determinant is covalently bound to the e-amino groups of the lysine residues of proteins, accounts for more than 90% of the products of the conjugation reaction with proteins.
  • conjugation products can be formed by the degradation of penicillin in solution to penicillinic or penicilloic acid, which form disulfide bonds with sulfhydryl groups of cysteine, producing penicillin and penicillamine-protein conjugates, respectively [Weltzien H.U., E. Padovan. Molecular Features of Penicillin Allergy // Journal of investigative dermatology 1998, v. 110 (3), pp. 203-206].
  • VLP of the Lentivirus family phages with metal preparations (a pharmaceutical preparation having a center of activity containing a metal atom) provides genomic RNA or its fragments [Liu L., Pu X., Yin G., Chen X., Yin J., Wu Y. Biomimetic Mineralization of Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Mediated by Bi-Functional Copolypeptides / ZMolecules 2019; v. 24 (X ° 7), pp. 1-16], as well as "internal" ligands introduced into the VLP capsid structure of Lentivirus particles after receiving the latter.
  • metal preparations a pharmaceutical preparation having a center of activity containing a metal atom
  • the technical result of the claimed group of inventions consists in the development of a technologically simple method for creating particles of bacteriophages of the Levivirus family (M82-like), devoid of LPS toxicity, and a method for their biomineralization, which provides prerequisites for the study of their use for targeted delivery to malignant tumor cells (including endothelial cells of the pathological circulatory network), enriched with integrin a n b 3 , which makes it possible to drastically reduce their overall toxicity.
  • the technical result is achieved due to the method for obtaining particles of bacteriophages of the Levivirus family, which includes the following steps:
  • T7 phasmid nucleic acid sequence of T7 phasmid, encoding proteins of DNA and RNA polymerase of T7 phage and devoid of morphogenesis genes
  • the strictly polar mutation is mapped behind the AZ promoter, which leads to a significant decrease in the transcription frequency of the phage genome ( ⁇ 10 2 ).
  • the ratio of phage particles to particles capable of causing pseudolysogeny was 1: 1 (Hft-lysates).
  • T7 phage as a model of pseudolysogeny is based on its property of infecting a wide range of host bacteria ⁇ Escherichia coli, Salmonella enterica Typhimurium, Shigella flexnery, Bordetella parapertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Erwinia carotovorum, Yersinia, Francisella enterceella) , some of which contain LPS antigen that is not toxic to humans.
  • chemotherapy drugs are encapsulated, for example, in virions of phages of the genus Lentivirus [US Patent 5677124, 6159728, US Patent Application 20100167981; Carlee E. Ashley et al. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles // ACS Nano. 2011; 5 (7): 5729-5745].
  • capsids In full-fledged virions of phages of the genus Lentivirus, capsids contain cone-shaped pores: the inlet diameter is 5-7 nm and the inner diameter is 1.5-2 nm [Michel T. Dedeo, Daniel T. Finley, Matthew B. Francis. Chapter 8 - Viral Capsids as Self-Assembling Templates for New Materials // page 366. In book “Molecular Assembly in Natural and Engineered Systems” (Edited by S. Howorka) 2011, v. 103, pp. 1-401]. The success of mineralization depends on the preservation of the crystallization property [Aljabali AA, Sachin N. Shah, Richard Evans-Gowing, George P. Lomonossoff, David J. Evans.
  • cisplatin cis-dichlorodiammineplatinum
  • ammonium hexachloroplatinate IV
  • ruthenium nitrosonitroamine, aurothiosulfate, iron polymaltose hydroxide, silver, copper or zinc nitrates, as well as trinitrate gallium, vanadium salts and thallium salts of various valences were introduced into the VLPs of the phages of the Lentivirus family.
  • empty virions were obtained by temporary thermal destruction and assembly in the presence of trimethylamine N-oxide (TMAO), similarly to [US Patent Application 20040152181; WO 1995031476; RF patent 2599462].
  • TMAO trimethylamine N-oxide
  • the particles of the Lentivirus genus phages may contain an "external" ligand, which ensures its interaction with a receptor present on the target cell and is capable of forming a "display" due to the non-enzymatic reaction of the interaction of the 6-peptidylopenicillic acid radical with surface lysine or cysteine amino acid radicals [NF Adkinson, Jr; L. M. Mendelson; S. Ressler; J. C. Keogh. Penicillin minor determinants // Ann Allergy Asthma Immunol. 2018; v. 121; pp. 537-544].
  • an immunological reaction can be avoided, as disclosed in the description of the application [WO 2020030954].
  • the toxicity of metal preparations containing a platinum atom in the structure is associated with neurotoxicity, which is caused by the formation of adducts with DNA [O. Kanat, Hulya Ertas, Burcu Caner. Platinum-induced neurotoxicity: A review of possible mechanisms // World J Clin Oncol 2017; v. 8 (4), pp. 329-335].
  • the minimum therapeutic doses are in within values of 10-100 ⁇ g / m 2 [US Patent Application 20180078551].
  • the toxicity of metal preparations having a gold atom in the structure is described, where its tolerance is indicated in the range of 1-500 mg / kg [US Patent Application 20180303954].
  • Compounds of gold (III) according to the invention [US Patent Application 20150182489] have antitumor activity.
  • Other metal preparations having antitumor potential with an acceptable level of toxicity are mentioned in US Patent 10098952.
  • VLPs were obtained using the pseudolysogeny system of bacteriophage T7 [Bolshakova T.N., Dobrynina O.Yu. Karataev G.I., Sivov I.G. Pseudolysogeny in the T7 phage and its use (within the framework of the Scientific-practical conference with international participation "Bacteriophages: theoretical and practical aspects of application in medicine, veterinary medicine and food industry") // Moscow, 2016, Russia];
  • the metal drug binding agent was prepared similarly to [US Patent Application 20140377289].
  • HHQG general structure
  • the term “introduction” and variations of this term, including “introduction”, include contacting.
  • a suitable “effective amount” can be determined by one of ordinary skill in the art using only routine experimentation.
  • Figure 1 shows the structure of cointegrates T7 :: pMS3,6VRep (or isolates fr; M12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 - SEQ ID NO 1) or T7 :: pGA2,6VRep (or isolates KU1; T72; DL10; DL20-SEQ ID NO 2).
  • Figure 2 shows the preparation and analysis of particles of phages of the genus Livirus (typical results are shown).
  • Figure 3 shows the definition of the structure of the obtained VLPs.
  • Figure 4 shows the change in the size of the obtained VLPs after filling them with AgNC> 3 (concentration 25 mm).
  • Figure 5 shows the ACM (atomic force microscopy) of the MS2 bacteriophage and the resulting phages of the genus Levivirus treated with anti-poly-lysin IgGl antibodies.
  • Figure 6 shows the modification of particles of phages of the genus Levivirus with peptide (HHQG) 4 (SEQ ID NO 8), which causes a particle size change with a poly-lysin insert.
  • Figure 7 shows non-enzymatic conjugation of peptidyl-barA to the B protein of Levivirus particles.
  • Figure 8 shows isotope analysis of stable isotope detection.
  • Figure 9 shows the results of determining the accuracy of delivery by flow fluorimetry from a mixture of cells enriched with and lacking anb3 integrin (RS3 and HEK293 lines).
  • Figure 1 shows the structure of cointegrates T7 :: pMS3,6VRep (or isolates fr; M12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 - SEQ ID NO 1) or T7 :: pGA2,6VRep (or isolates KU1; T72; DL10; DL20-SEQ ID NO 2).
  • the integration site is located in the 0.5 kb fragment of BsaBI-BstBI and after the AZ promoter, which hinders any transcription towards ORF RNA polymerase of phage T7.
  • the insert is flanked by straight full length IS 481 and tetranucleotide CTAG copies. Sequences at “seams” are displayed in dotted rectangles. Sequences were obtained by analyzing PCR products obtained from primers with the structure shown in the figure.
  • PCR primers were added at a final concentration of 1.5 mM.
  • Top line - PCR products (slow ⁇ 4V, fast ⁇ 0 ⁇ 5V); middle line - markers with a fragment size of 10, 9, 7, 5, 3, 1 (B); bottom line markers with fragment sizes 1000, 900, 800, 700, 600, 500 and 400 (b).
  • the DNA sequence was carried out according to method 373 Automatic Automatic Sequencer Guidance (Applied Biosystems, USA) using a Dye Doing Terminator ABI sequencing kit with Taq polymerase FS (Perkin Elmer, USA).
  • Experimental data files (EMBL format) were compared with sequences (ac. N ° J02518) of the base GenBank.
  • Figure 2 shows the preparation and analysis of particles of phages of the genus Livirus (typical results are shown).
  • MS2 phage particles filled with silver salts; dark particles up to 30 nm, transmission microscopy) or filled with silver salts; particles up to 25 nm, transmission microscopy).
  • FIG. 3 shows the definition of the structure of the obtained VLPs.
  • Figure 4 shows the change in the size of the obtained VLPs after filling them with AgNC> 3 (concentration 25 mm).
  • Figure 5 shows the ACM (atomic force microscopy) of the MS2 bacteriophage (upper pair of figures) and the resulting phages of the genus Levivirus treated with anti-poly-lysin IgGl antibodies (lower pair of figures).
  • Figure 6 shows the modification of particles of phages of the genus Levivirus with a peptide (HHQG) (SEQ ID NO 8), which causes a particle size change with a poly-lysin insert.
  • HHQG peptide
  • Figure 7 shows non-enzymatic conjugation of peptidyl-barA to the B protein of Levivirus particles.
  • the proposed method for obtaining particles of phages of the genus Levivirus is implemented on the basis of the existing prior art by the following sequence of actions.
  • ACM - atomic force microscopy
  • SPR surface plasmon resonance
  • TPA trypsin
  • MS mass spectroscopy
  • MADI-TOF mass spectroscopy
  • Example 1 Obtaining particles of phage MS2 and modified VLPs of the genus Levivirus.
  • Plasmids were transferred into Pseudomonas putida cells using Hft transduction with bacteriophage T7 (Bolshakova T.N., Dobrynina O.N., Karataev G.I., Sivov I.G. Pseudolysogeny in T7 phage and its use // Bacteriophages: theoretical and practical aspects of application in medicine, veterinary medicine and food industry Third International Scientific Conference, Moscow, 2016).
  • the control of the infectivity of the particles was carried out according to the method (Knyazhev V.A., Sergienko V.I., Sivov I.G.
  • the resulting electrophoretically pure particles were stored at + 4 ° C.
  • Figure 1 shows the structure of the cointegrates
  • Table 1 shows the efficiency of structure transfer between members of the family Enterobacteriaceae.
  • T7 :: pMS3,6VRep or T7 :: pGA2,6VRep transduction of Gram-negative bacteria
  • Example 2 Obtaining particles of phages of the genus Levivirus with fully hydrolyzed
  • the bacteriophage particles are treated with diethylamine (DEA 1.5%, causes complete hydrolysis of genomic RNA within 2 days of incubation at 37 ° C).
  • the decrease in the molecular weight of genomic RNA was monitored by electrophoresis (in 2% agarose gel).
  • the resulting particles were concentrated by centrifugation in a CsCl density gradient (as is known to specialists), and the purity of the preparations was also monitored by transmission electron microscopy according to the method (US Patent 10446366).
  • the particles were stored at + 4 ° C under conditions known to those skilled in the art.
  • Example 3 Obtaining VLPs of particles with (HHQG) 4 .
  • the conjugation of the peptide with the capsid B-protein of VLPs of the genus Levivirus was carried out using the homobifunctional reagent dimethyladipimidate (DMAI, Sigma, USA) in a molar ratio of phage protein: peptide: DMAI 1: 20: 80 according to the method [US Patents 6080383; 6468503; 10576144 and DE Patent 000069731747] in 40% dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • VLPs were separated from excess reagents by precipitation with a 25% polyethylene glycol 6000 solution (Dia-M, Russia) with 1M NaCl. The precipitated VLPs were suspended in deionized water.
  • the desired shRNA structure (for binding with the maximum number of cations; no less than 200) was calculated using the https: // biosettia program. com / supoort / shma-designer / and synthesized according to the method of [Chris B. Moore, E. H. Guthrie, M. Tze-Han Huang, D. J. Taxman. Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown // Methods Mol Biol. 2010; 629: 141-158].
  • the introduction of shRNA in complex with salts was carried out with TMAO [RF Patent 2599462] and taking into account the calculations obtained earlier [Farafonov V.S., Nerukh D.
  • Residues of salts and metal preparations were removed from the samples by gel filtration using Sephadex G-50.
  • the drugs were added to Sephadex columns. The separation was repeated twice.
  • the final concentrations of the salts encapsulated in nanoparticles were estimated using a flame photometer (PFP-7 / C, Jenway, England). The results were compared with the concentration curve of the compounds in the wavelength range of 280-800 nm.
  • the loaded particle size was measured using a particle size analyzer (IG-1000 Plus, Shimadzu, Japan).
  • Example 5 Atomic force microscopy of particles of phages of the genus Levivirus.
  • Chips were made using mica (Structure Probe, Inc., West Chester, PA, USA), which was sialyzed in 3-aminopropyltriethoxysilane vapor (APTES) as known in the art.
  • the surface of the silicized mica substrates was activated with 0.12 mM DTSSP in 10 mM PBSD (pH 7.4) for 10 min, washed with 1 ml of 50% absolute ethanol for 10 min at 10 ° C and then dried in a stream of nitrogen immediately used for immobilization. Incubation solutions ( ⁇ 1 ⁇ L) were carefully dropped onto the surface of the activated substrate, incubated for half an hour at room temperature (25 ° C) in a humid chamber.
  • ACM scanning was performed using a titanium atomic force microscope (NT-MDT, Zelenograd, Moscow, Russia).
  • NT-MDT has a resonance frequency of 47-150 kHz, the radius of curvature of the cantilever tip is 10 nm).
  • the ACM data were assessed according to two criteria: the first is "quality", which was based on the apparent increase in the height of the complexes compared to the height of the chip irregularities.
  • the stated constant force (0.21 N / m) was checked with an accuracy of 20% by measuring the deflection of the cantilever when pressed against a quartz fiber of known stiffness.
  • the scanning head was calibrated in the x, y and z directions using polystyrene latex supports as known in the art. There is some uncontrolled run-to-run variation that can be associated with scanners and this introduces sizing bias of up to ⁇ 2.5%.
  • the experiments were carried out in a liquid cell using air, deionized water. Image height and width were measured using software available on the NanoScope Im workstation. At least 40 molecules were measured at 5 points along their contours for each material cited herein. The results were analyzed with the KaleidaGraph software.
  • Example 6 Isotope Analysis for the Detection of a Stable Isotope (see FIGS. 8A and 8B).
  • Example 7 The toxicity (mg / kg) of preparations and metal salts was determined for mice (DCL; according to ISO / IEC 17025: 2017 [General requirements for the competence of testing and calibration laboratories] and GOST ISO / IEC 17025-2009), as well as same for crops cells (d ggi ). The toxicity of drugs and metal salts for mice is given in the Table
  • Example 8 Targeted delivery of particles of phages of the genus Levivirus.
  • the delivery accuracy was qualitatively determined by flow fluorimetry from a mixture of cells enriched with integrin a in P3 and lacking it (RS3 and
  • HEK293 HEK293
  • mixtures of cells with and without integrin were prepared in various ratios (1:10; 1: 20 and 1: 40) in a titer of 10 7 / ml.
  • VLPs of the genus Levivirus with filling were added to the cells, and after 3 hours a fluorescent dye 4 ', 6-diamid-2-phenylindole (DAPI) was added to stain the dead cells.
  • DAPI 6-diamid-2-phenylindole

Abstract

Настоящая группа изобретений относится к медицине и биологии и касается технологически простого метода создания частиц бактериофагов семейства Levivirus (MS2-подобных), лишенных LPS-токсичности, и способа их биоминерализации, что дает предпосылки к исследованию их применения для адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли (в том числе клеткам эндотелия патологической кровеносной сети), обогащенными интегрином v3, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЦ БАКТЕРИОФАГОВ СЕМЕЙСТВА LEVIVIRUS
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Группа изобретений относится к медицине и биологии и касается технологически простого метода создания частиц бактериофагов семейства Levivirus (М82-подобных), лишённых LPS-токсичности, и способа их биоминерализации, что дает предпосылки к исследованию их применения для адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли (в том числе клеткам эндотелия патологической кровеносной сети), обогащёнными интегрином ауРз, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фагоподобные частицы (VLP) получают с иммунологическими целями [US Patent Application 201700008778; US Patent Application 20190315807], а так же с целью клинического применения в качестве систем адресной доставки лекарств [US Patent 8324149]. Руководствуясь указанными задачами, разработаны способы получения VLP в больших количествах, которые базируются на генно-инженерных методах [US Patent 5534257; WO9306921; US Patent Application 20190307819] при этом используются различные клеточные культуры (бактерии, микроскопические грибы, клетки насекомых или животных, а также линии клеток человека).
Вирусоподобные частицы (VLP) - мультимерные наноструктуры, собранные из нативных вирусных структурных белков, но лишенные какого-либо генетического материала. VLPs состоят из высокоплотных дисплеев вирусных поверхностных белков и как таковые являются высокоадаптивным инструментом для различных применений (например, разработка антител, система доставки, экспрессия мембранного белка). VLPs также могут обеспечить тканеспецифический таргетинг, поскольку они происходят от собственного вируса. С другой стороны, поверхность частиц восприимчива к реакции химической конъюгации, которая позволяет создать на её поверхности тканеспецифический лиганд. В этом случае VLP частица становиться, по выражению разработчиков, дисплеем, экспонирующим свою способность находить клеточные «мишени». В ранних работах с бактериофагами [Zeltins A. Construction and characterization of virus-like particles: a review//Mol Biotechnol. 2013; v.53(N°l), pp.92-107], были описаны генно-инженерные методы создания VLP частиц Lentivirus, которые получены путем последовательных операций: клонирования кДНК геномных РНК последовательностей этих бактериофагов, экспрессии их в бактериальных клетках E.coli, а затем выделения частиц с применением методов детоксикации.
Дальнейшее развитие метода получения VLP частиц Lentivirus было направлено на применение различных систем экспрессии генетических структур [Blazeck J., Alper H.S. Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level//Biotechnol J. 2013; v.8(-N°l),pp.46-58], в которые были внесены новые генно- инженерные «новинки» в виде клонирования тандемов гена оболочки, содержащие, с целью получения желательного иммунологического ответа, дополнительные кодирующие ДНК фрагменты [Zhai L., J. Peabody, Y.-Y. S. Pang, J. Schiller, B. Chackerian, E. Tumban. A Novel Candidate MS2 Phage VLP Vaccine Displaying a tandem HPV L2 Peptide offers Similar Protection in Mice to Gardasil-9// Antiviral Res. 2017 Nov; 147: 116-123].
Несколько патентов, касающихся раскрытых указанных выше способов получения VLP частиц Lentivirus, в числе которых US Patents 4722840; 5534257; 7494656; 8324149, а также US Patent Applications 20130224828; 20140302593; 20160090403; 20160208221, и содержание которых систематизированы в публикациях [Р. Pumpens et al. The True Story and Advantages of RNA Phage Capsids as Nanotools//Intervirology 2016;v.59(2), pp.74-110; Rohovie M.J., Nagasawa M., Swartzl J.R. Virus-like particles: Next-generation nanoparticles for targeted therapeutic delivery// Bioengineering & Translational Medicine 2017; v.2(l), pp. 43-57], имеют общим недостатком значительный перечень методов получения, требующих высокой квалификации работников и энергозатрат. Кроме того, использование в качестве клеток-хозяина бактерий с токсичным для человека и животных LPS-антигеном вызывает необходимость применения дорогостоящих сорбентов на этапе выделения.
Химическая модификация поверхности VLP частиц Lentivirus, необходимая для придания «мишенности» и получения из них дисплеев, разработана как метод конъюгации и как метод получения капсидных белков с дополнительными пептидными последовательностями, н аналогично методу фагового дисплея [Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface//Science 1985; v.228(JV°4705), pp.1315-1317 ], упомянутого выше. Введение в структуру каписидного В-белка проводили с учётом данных [van Meerten D., R. C. L. Olsthoorn, J. van Duin, R. M. D. Verhaert. Peptide display on live MS2 phage: restrictions at the RNA genome level//Journal of General Virology 2001, v.82(N°7), pp.l 797-1805].
Из всего разнообразия химических, генетических и физико-химических методов привлекает внимание простая реакция конъюгации пенициллинов с белками. Пенициллины представляют собой большое семейство соединений, общей структурной основой которых является b-лактамное кольцо, b-лактамное кольцо является мишенью для нуклеофильной атаки свободных аминогрупп белков, приводящей к открытию кольца и ковалентному амидному связыванию пенициллоильной группы. Пенициллоильная конфигурация, в которой гаптен-детерминант ковалентно связан с e-аминогруппами лизиновых остатков белков, составляет более 90% продуктов реакции конъюгации с белками. Другие продукты конъюгации могут образовываться путем деградации пенициллина в растворе до пеницилленовой или пенициллоиновой кислоты, которые образуют дисульфидные связи с сульфгидрильными группами цистеина, продуцирующими соответственно пенициллен - и пеницилламин-белковые конъюгаты [Weltzien H.U., Е. Padovan. Molecular Features of Penicillin Allergy//Journal of investigative dermatology 1998, v.110(3), pp. 203-206].
Единственным дополнением к получению указанных конъюгатов является предварительный синтез пептидных производных 6-амино пенициллиновой кислоты, получение которых раскрыто в патентах [US Patents 3957764; 4229348; 4810777; DE 69731747].
Заполнение полученных VLP фагов семейства Lentivirus металлопрепаратами (фармацевтический препарат, имеющий центр активности, содержащий атом металла) обеспечивает геномная РНК или её фрагменты [Liu L., Pu X., Yin G., Chen X., Yin J., Wu Y. Biomimetic Mineralization of Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Mediated by Bi-Functional Copolypeptides/ZMolecules 2019; v.24(X°7), pp. 1-16], а также «внутренние»-лиганды, вводимые в структуру капсида VLP частиц Lentivirus, после получения последних. В настоящее время в медицине применяют 89 металлопрепаратов [Barry N.P., Sadler P.J. Exploration of the medical periodic table: towards new targets//Chem Commun (Camb). 2013, v.49 (·N°45), pp.5106-5131], которые, зачатую имеют низкий «терапевтический индекс» (Therapeutic ratio) или «терапевтическое окно» (соотношение двух доз лекарства, где первая - вызывает побочные эффекты при заболевании, а вторая - тяжесть введения, не связанная с целевым показанием). Например, отношение токсической дозы в 50 % случаев, TDso к дозе, при которой лекарство проявляет желаемый фармакологический эффект, действенная доза в 50 % случаев, ED50). Очевидно, что адресная доставка «расширяет терапевтическое окно» за счёт создания высокой локальной концентрации лекарственного препарата. Ранее, была установлена принципиальная возможность применения упомянутой технологии, применимо к фагу MS2, наполненному солями одновалентного таллия [Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(N°2), pp. 1214-1217]. Уровень токсичности препаратов, приготовленных на основе солей одновалентного таллия в этом случае, был снижен в 10000 раз.
РАСКРЫТИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
Технический результат заявленной группы изобретений заключается в разработке технологически простого метода создания частиц бактериофагов семейства Levivirus (М82-подобных), лишённых LPS-токсичности, и способа их биоминерализации, что дает предпосылки к исследованию их применения для адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли (в том числе клеткам эндотелия патологической кровеносной сети), обогащёнными интегрином anb3, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность.
Техничский результат достигается за счет способа получения частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающего этапы:
(a) получения линии псевдолизогенных клеток-хозяина, размножающихся при температуре < 23 °С, лишённых токсического липо полисахарида и содержащих:
- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фазмиду Т7 с фрагментом геномов бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки ДНК- и РНК-полимеразы фага Т7 и лишённой генов морфогенеза;
(B) инициирования гиперэкспрессии генов, кодирующих белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus при повышении температуры > 28°С;
(c) получения частиц бактериофагов семейства Levivirus с одновременным разрушением клеток-хозяина, при этом указанные частицы бактериофагов имеют морфологическое сходство с природными частицами фага. Кроме того, техничский результат, а именно существенно снизить общую токсичность нагруженных металлопрепаратами частиц, достигается за счет способа биоминерализации частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающего этапы:
(а) полного удаления РНК из частиц бактериофагов семейства Levivirus;
(б) получения комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов;
(в) «загрузки» комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов, в «разрыхлённые» триметиламин N-оксидом частицы бактериофагов семейства Levivirus, лишённых РНК;
(г) неферментативного присоединения лиганда к биоминерализованным частицам, пригодного для создания системы адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли, в том числе клеткам, обогащённым интегрином ауРз;
(д) определение специфичности доставки и чувствительности на модели смеси линии клеток РСЗ, одна из которых обогащёна интегрином ауРз.
Далее заявленная группа изобретений будет описана более подробно только в качестве иллюстрации нижеследующих примеров. Предполагается, что примеры служат для иллюстрации группы изобретений и не должны рассматриваться как ограничивающие универсальность раскрытия описания в данном источнике [US Patent Application 20180250331].
В производстве фагов рода Lentivirus, поражающего «мужские» штаммы бактерий, основной трудностью является сохранение чувствительности, которую клетки бактерий, в присутствии бактериофага, быстро теряют [Spengler G, Molnar A, Schelz Z, Amaral L, Sharpies D, Molnar J. The mechanism of plasmid curing in bacteria//Curr Drug Targets. 2006; v.7(.N°7); pp.823-41; Getino M., D.J. Sanabria-Rios, R. Femandez-Lopez, J. Campos- Gomez, J.M. Sanchez-Lopez, A. Fernandez, N.M. Carballeira, F. de la Cruz. Synthetic Fatty Acids Prevent Plasmid-Mediated Horizontal Gene Transfer//mBio. 2015; v.6(N°5), pp. e01032- 15]. На генетическом уровне это явление выражается в элиминации «мужских» плазмид из популяции, а на уровне биотехнологическом — к нестабильному «урожаю» фага. Этим объясняется разница в продажной стоимости лечебных фагов (около 10 руб/мл) и одного из фагов рода Lentivirus - MS2 (14000 руб/мл). Следует указать, что количество инфекционных частиц в первом случае превышает аналогичный показатель в случае MS2 в 1000 раз. Снижение стоимости препаратов фагов рода Lentivirus авторы группы изобретений видят в применении явления псевдолизогении [Большакова Т.Н., Добрынина О.Ю. Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование (в рамках Научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности»)//Москва, 2016, Россия]. Геном дефектных фагов Т7, способных вызвать псевдолизогению, содержит строго-полярную мутацию. Строго-полярная мутация картирована за промотором АЗ, что приводит к значительному снижению частоты транскрипции генома фага (< 102). При заражении бактерий псевдолизогенных клонов фагом-помощников Т7 в потомстве фагов получали соотношение частиц фага и частиц, способных вызвать псевдолизогению, равно 1:1 (Hft-лизаты). Выбор фага Т7 в качестве модели псевдолизогении основан на его свойстве вызывать заражение широкого круга бактерий-хозяев {Escherichia coli, Salmonella enterica Typhimurium, Shigella flexnery, Bordetella parapertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Erwinia carotovorum, Yersinia enterocolitica, Francisella spp, Brucella abortus), ряд из которых содержит не токсичный для человека LPS-антиген.
Для повышения эффективности и снижения общей токсичности, химиопрепараты инкапсулируют, например, в вирионы фагов рода Lentivirus [US Patent 5677124, 6159728, US Patent Application 20100167981; Carlee E. Ashley et al. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles// ACS Nano. 2011; 5(7): 5729-5745].
В полноценных вирионах фагов рода Lentivirus капсиды содержат конусовидные поры: входной диаметр 5-7 нм и внутренний - 1,5 - 2 нм [Michel Т. Dedeo, Daniel Т. Finley, Matthew В. Francis. Chapter 8 - Viral Capsids as Self-Assembling Templates for New Materials//page 366. In book “Molecular Assembly in Natural and Engineered Systems” (Edited by S. Howorka) 2011, v. 103, pp. 1-401]. Успех минерализации зависит от сохранения свойства кристаллизации [Aljabali A. A., Sachin N. Shah, Richard Evans-Gowing, George P. Lomonossoff, David J. Evans. Chemically-coupled- peptide -promoted virus nanoparticle templated mineralization// Integr. Biol., 2011, 3, 119-125], когда вирионы очищают от геномной ssPHK либо полностью, либо частично [Hooker J. М., Е. W. Kovacs, М. В. Francis. Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2//J. AM. CHEM. SOC. 2004, v. 9(M°12), pp. 3718-3719]. В случае получения частиц с укороченным РНК геномом, способным к разнообразной упаковке [Sun L.-Z., D. Zhang, S.-J. Chen. Theory and Modeling of RNA Structure and Interactions with Metal Ions and Small Molecules//Annu Rev Biophys. 2017; v.46 (N° 1), pp. 227-246], можно, на основании соответствующих расчётов, предсказать увеличение числа дуплексных петель, связывающих катионы тяжёлых металлов [Bonilla S., С. Limouse, N. Bisaria, М. Gebala, Н. Mabuchi, D. Herschlag. Single- Molecule Fluorescence Reveals Commonalities and Distinctions among Natural and in Vitro- Selected RNA Tertiary Motifs in a Multistep Folding Pathway// J. Am. Chem. Soc. 2017, v.139 (Jfe 51), pp.18576-18589].
В случае полного гидролиза геномной ssPHK и получения VLPs, генетически изменённую внутреннюю поверхность вириона подвергают химической модификации, позволяющей присоединять молекулы металлопрепаратов [US Patent 8187607; US Patent Application 20110286971].
Представителем фагов рода Lentivirus - бактериофагом MS2, нагруженным солями тяжёлых металлов, имеет основание для безопасного применения в медицинской практике, что показано практическим применением iRGD-MS2 дисплея [US Patent Application 20140106982; Ashley С. Е. , Eric С. Carnes, Genevieve К. Phillips, Paul N. Durfee, Mekensey D. Buley, Christopher A. Lino, David P. Padilla, Brandy Phillips, Mark B. Carter, Cheryl. L. Willman, C. Jeffrey Brinker, Jerri do Carmo Caldeira, Bryce Chackerian, Walker Wharton, David S. Peabody. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles// ACS Nano. 2011 Jul 26; 5(7): 5729-5745; Diaz D. , Andrew Care, Anwar Sunna. Bioengineering Strategies for Protein-Based Nanoparticles//Genes (Basel). 2018; v.9 (Jf°7), pp. 370-400], в том числе и в случае наполнения частиц нитратом одновалентного таллия [Патент РФ 2599462, Колесанова Е. Ф., Мельникова М. В., Большакова Т. Н., Рыбалкина Е. Ю., Сивов И.Г. Бактериофаг MS2 - средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей //Acta Naturae. 2019. V. 11. N° 2 (41). Стр. 98 -101; Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(N°2), pp. 1214-1217]. Концентрация Tl+1 в дозе упомянутого в патенте РФ препарата меньше в 5 раз меньше DLM для солей указанного иона. На примере адресной доставки одновалентного иона таллия уже показана возможность снижения токсичности до уровней по значениям ниже тех, что является допустимыми [TOXICOLOGICAL REVIEW OF THALLIUM AND COMPOUNDS // U.S. Environmental Protection Agency, 2009].
В настоящей группе изобретений цисплатин (цис-дихлородиамминплатин) (II) или гексахлороплатинат (IV) аммония; рутения нитрозонитроамин, ауротиосульфат, гидроксид полимальтозата железа, нитраты серебра, меди или цинка, а так же тринитрат галлия, соли ванадия и соли таллия различной валентности были введены в состав VLPs фагов семейства Lentivirus.
В одном аспекте настоящей группы изобретений по аналогии с раскрытым способом в [US Patent Applications 20090092538; 20180103645; 20170071211] наполнение проводили:
- в случае с цисплатином методами, раскрытыми [US Patent 7594884; US Patent Application 20190350871] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
- в случае с гексахлороплатинат (IV) аммония методами раскрытыми [US Patent 7569606; ЕР 2958553] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
- в случае с рутения нитрозонитроамином, ауротиосульфатом, гидроксид полимальтозата железом, нитратами серебра, меди или цинка, тринитратом галлия, солями ванадия таллия методом раскрытым [US Patent 7594884; US Patent Application 20190350871] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
Ещё в одном аспекте группы изобретений «пустые» вирионы получали временным температурным разрушением и сборкой в присутствии триметиламина N-оксида (ТМАО), аналогично [US Patent Application 20040152181; WO 1995031476; Патент РФ 2599462].
В соответствии с ещё одним аспектом группы изобретений, частицы фагов рода Lentivirus могут содержать «наружный» лиганд, обеспечивающий его взаимодействие с рецептором, присутствующим на клетке-мишени и способный формировать «дисплей», за счёт неферментативной реакции взаимодействия радикала 6-пептидилопенициллиновой кислоты с поверхностными радикалами аминокислот лизина или цистеина [N.F. Adkinson, Jr; L. М. Mendelson; С. Ressler; J. C. Keogh. Penicillin minor determinants//Ann Allergy Asthma Immunol. 2018; v.121; рр.537-544]. При введении такого препарата фагового дисплея, полученного в реакциях с лизилом или цистеилом, можно избежать иммунологической реакции, так как раскрыто в описании к заявке [WO 2020030954].
Токсичность металлопрепаратов, имеющих в структуре атом платины, связан с нейротоксичностью, которая вызвана образованием аддуктов с ДНК [О. Kanat, Hulya Ertas, Burcu Caner. Platinum-induced neurotoxicity: A review of possible mechanisms// World J Clin Oncol 2017; v.8(4), pp. 329-335]. В соответствии с возможными побочными эффектами препаратов платины, минимальные терапевтические дозы находятся в пределах значений 10-100 мкг/м2 [US Patent Application 20180078551]. Токсичность металлопрепаратов, имеющих в структуре атом золота описана, где указана его переносимость в пределах значений 1-500 мг/кг [US Patent Application 20180303954]. Соединения золота (III) по изобретению [US Patent Application 20150182489] обладают противоопухолевой активностью. Другие металлопрепараты, имеющие противоопухолевый потенциал с приемлемым уровнем токсичности, упомянуты в US Patent 10098952.
Ранее был предложен способ адресной доставки к клеткам солидных опухолей солей [Патент РФ 2599462; метод получения таких частиц - минерализация] одновалентного таллия - иона, имеющий высочайший токсический потенциал [Toxicological review of thallium and compounds//U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. September 2009]. Кроме того, предложены способы диагностики на основе адресной доставки к клеткам солидных опухолей 99mTc [US Patent Application 20150125533] или пероральной доставки терапевтических и выявляемых агентов к больной ткани [US Patent Application 20180000949], а также к сосудистой сети опухоли [US Patent Application 20190022170].
Однако, вопрос адресной доставки металлопрепаратов и снижения их токсического воздействия на организм реципиента, остаётся не решённым [Topcul М, Cetin I. Endpoint of cancer treatment: targeted therapies// Asian Рас J Cancer Prev. 2014; V.15(11); pp. 4395-403; Maeda H, Khatami M. Analyses of repeated failures in cancer therapy for solid tumors: poor tumor-selective drug delivery, low therapeutic efficacy and unsustainable costs//Clin Transl Med. 2018; v.7(l); pp.l 1 - 30].
Таким образом, из уровня техники известны способы минерализации при получении наночастиц с медицинскими целями у апоферритина [US Patent 9,925,592], а также у вируса табачной мозаики (ВТМ) [US Patent Application 20180256758].
Ранее, было установлена принципиальная возможность применения упомянутой технологии, применимо к фагу MS2, наполненному солями одновалентного таллия [Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(N°2), pp. 1214-1217]. В описанном случае, уровень токсичности препаратов, приготовленных на основе солей одновалентного таллия, был снижен более чем в 10000 раз, что позволяет с оптимизмом ожидать подобного результата и с Cr(VI), для которого DCL=50-150 мг/кг. Эксперты Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют максимально допустимую концентрацию 50 мкг на литр хрома (VI) в питьевой воде. Металлопрепараты вводили в состав VLP, «пустых» вирионов и других методов «нагрузки» препаратами, как варианты известных способов минерализации [US Patent Application 20140377289].
В одном аспекте группы изобретений VLPs получали с помощью системы псевдолизогении бактериофага Т7 [Большакова Т.Н., Добрынина О.Ю. Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование (в рамках Научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности»)//Москва, 2016, Россия];
В другом аспекте группы изобретений «пустые» вирионы с необходимыми точечными заменами аминокислот каписидного белка у фагов рода Levivirus, получали прямым гидролизом геномной ssRNA из «нормальных» вирионов, аналогично [ЕР 1736538];
В одном варианте, связывающий металлолекарство агент получали аналогично [US Patent Application 20140377289]. В соответствии с этим аспектом настоящей группы изобретений предлагаются пептиды общей структуры (HHQG)„, которые встраивали в последовательности, кодирующие поверхность В -белка, которая обращена во внутреннюю часть капсида.
В контексте данной группы изобретений термин «введение» и варианты этого термина, включая «введение», включают в себя контактирование. Для любого конкретного случая подходящее «эффективное количество» может быть определено специалистом в данной области с использованием только рутинных экспериментов.
Вышеуказанные и другие задачи, особенности, преимущества, а также техническая значимость данной группы изобретений будут более понятны из нижеследующего подробного описания со ссылками на сопровождающие фигуры.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фигуре 1 представлена структура коинтегратов T7::pMS3,6VRep (или изолятов fr; М12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 - SEQ ID NO 1) или T7::pGA2,6VRep (или изолятов KU1; Т72; DL10; DL20- SEQ ID NO 2).
На фигуре 2 представлено получение и показан анализ частиц фагов рода Livirus (приведены типичные результаты).
На фигуре 3 представлено определение структуры полученных VLPs. На фигуре 4 показано изменение размеров полученных VLPs после наполнения их AgNC>3 (концентрация 25 мМ).
На фигуре 5 представлена ACM (атомносиловая микроскопия) MS2 бактериофага и полученных фагов рода Levivirus, обработанных анти-poly-lysin IgGl антителами.
На фигуре 6 представлена модификация частиц фагов рода Levivirus пептидом (HHQG)4 (SEQ ID NO 8), которое вызывает изменение размера частиц с вставкой poly- lysin.
На фигуре 7 представлена неферментативная конъюгация пептидил-бАРА с В белком частиц Levivirus.
На фигуре 8 представлен изотопный анализ обнаружения стабильного изотопа.
На фигуре 9 представлены результаты определения точности доставки методом проточной флуориметрии со смеси клеток, обогащённых интегрином anb3 и лишённых такового (линии РСЗ и НЕК293).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
На фигуре 1 представлена структура коинтегратов T7::pMS3,6VRep (или изолятов fr; М12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 - SEQ ID NO 1) или T7::pGA2,6VRep (или изолятов KU1; Т72; DL10; DL20- SEQ ID NO 2).
1 А. Сайт интеграции расположен во 0,5kb фрагменте BsaBI-BstBI и после промотора АЗ, что затрудняет любую транскрипцию в направлении ORF РНК-полимеразы фага Т7. Вставка фланкирована прямыми полноразмерным IS 481 и тетрануклеотидом CTAG копиями. Последовательности в местах «стыков» отображаются в прямоугольниках, показанных пунктиром. Секвенсы получены путем анализа продуктов ПЦР полученных с праймеров с приведённой на фигуре структурой.
1 В. ПЦР-амплификация экспериментальных данных. Направление электрического поля справа налево. ПЦР амплификационная смесь с использованием праймерных олигонуклео-тидов (* FT7 - TAAGCGCACCACGGCACATAAGG (SEQ ID NO 3);
* RiS48i - GCGGCGCAGCTCCACGATA (SEQ ID NO 4);
* LIS 8I - GCACCGCTTTACCCGACCTTA (SEQ ID NO 5);
* RT? - TGCTCCTTCCACTGCTTCATCTG) (SEQ ID NO 6).
Праймеры для проведения ПЦР добавляли в конечной концентрации 1,5 мМ. Верхняя линия-продукты ПЦР (медленные ~ 4В, быстрые ~ 0<5В); средняя линия- маркеры с размером фрагмента 10, 9, 7, 5, 3, 1 (В); нижняя линия-маркеры с размером фрагмента 1000, 900, 800, 700, 600, 500 и 400 (Ь). Последовательность ДНК проводили по методике 373 Automatic Automatic Sequencer Guidance (Applied Biosystems, США) c использованием набора для секвенирования Dye Doing Terminator ABI c Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, США). Файлы экспериментальных данных (формат EMBL) сравнили с последовательностями (асе. N° J02518) базового GenBank.
На фигуре 2 представлено получение и показан анализ частиц фагов рода Livirus (приведены типичные результаты).
2А. Градиентное центрифугирование наночастиц фагов рода Levivirus: стрелками с обозначениями указаны скопления частиц с известной для специалистов плавучей плотностью. VLP (скопления расположенные выше, так как более лёгкие), а фаговые частицы (скопления расположенные ниже, так как более тяжёлые).
2В. Микроскопические фотографии частиц фага MS2 (с наполнением солями серебра; темные частицы размером до 30 нм, просвечивающая микроскопия) или наполнением солями серебра; частицы размером до 25 нм, просвечивающая микроскопия).
2С. Результат гидролиза геномной РНК в бактериофагах с изменёнными последовательнос-тями основного белка оболочки. Нижняя дорожка - время гидролиза 20 минут, Самая верхняя - 4 часа. «Nothem дот блот-гибридизацию» (Yadetie F., А.К. Sandvik, Н. Bergum, К. Norsett, A. Laegreid. Miniaturized fluorescent RNA dot blot method for rapid quantitation of gene expression// BMC Biotechnology 2004, v.4(J4°12), pp. 472-480) c 3- OH меченным олигонуклеотидом со структурой ACATGAGGATTACCCATGT (SEQ ID NO 7) использовали для выявления положения фрагментов фаговых геномных РНК.
2D. Гиперэкспрессия генов клонированных генов бактериофагов семейства Levivirus.
ПААГ-элктрофорез лизатов прогретых клеток (слева направо, через каждые 5 часов от начала прогрева). Нижняя полоса - капсидный белок MS2.
2Е. Результат определения ЛПС (LAL тест) в псевдолизогенных клетках. Лизат клеток Limulus amebocytis вызвает образование геля в присутствии ЛПС (> 1пг/мл). Рукодство по проведению теста утверждено FDA USA (Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers, JUNE 2012).
На фигуре 3 представлено определение структуры полученных VLPs.
ЗА. Методом SPR (поверхностный плазмой). Поверхность стеклянного чипа обработанного анти-poly-lysin IgGl антителами кролика (небольшое неспецифическое связывание с контрольными частицами фагов - OD 0,0020 и связывание высокоспецифичное с анти-poly-lysin IgGl - OD = 0,230).
ЗВ. Методом HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления). Рассчётная молекулярная масса В -белка фагов рода Levivirus (контроль - 13866.58 ) и полученных VLPs (опыт - 14457.38).
На фигуре 4 показано изменение размеров полученных VLPs после наполнения их AgNC>3 (концентрация 25 мМ).
На фигуре 5 представлена ACM (атомносиловая микроскопия) MS2 бактериофага (верхняя пара фигур) и полученных фагов рода Levivirus, обработанных анти-poly-lysin IgGl антителами (нижняя пара фигур).
На фигуре 6 представлена модификация частиц фагов рода Levivirus пептидом (HHQG) (SEQ ID NO 8), которое вызывает изменение размера частиц с вставкой poly- lysin.
На фигуре 7 представлена неферментативная конъюгация пептидил-бАРА с В белком частиц Levivirus.
Предлагаемый способ получения частиц фагов рода Levivirus реализуют на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.
Первоначально производят подготовительные процедуры для получения высоких титров и последующее очищение образцов фага MS2 или VLPs фагов рода Levivirus, а также осуществляют синтез необходимых лигандов в виде органических соединений, используемых для модификации внутренней поверхности полости капсидов. Для наполнения, указанными выше соединениями, их используют в виде растворов, подобно описанным, например, в патентах и патентных заявках (US Patent Applications 20190255088; 20190255087; 20190201547; 20190167584; 20190240186; 20190170742;
20180071399; 20190117561; 20190091165; 20190015526; 20190015320; 20180353613;
20180344849; 20180243440; 20180243229; 20180133343; 20180028683; 20180021265;
20180021259; 20170239369; 20150157571) и которые, в соответствии с настоящей группой изобретений, рассматриваются в качестве ядра модифицированных VLPs фагов рода Levivirus.
Контроль указанных операций осуществляют с помощью методов:
- выделения геномных РНК;
- расчёта праймеров для проведения ОТ-ПЦР (обратная транскрипция, сопряжённая с ПЦР); - обратной транскрипции и клонирование кДНК;
- электрофорез ДНК в агарозе;
- просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ);
- атомно-силовой микроскопии (ACM);
- поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (V.N. Konopsky et al. Photonic Crystal Biosensor Based on Optical Surface Waves // Sensors 2013, 13(20), pp. 25662578);
- флуоресцентной спектроскопии проб содержащих различные металлопрепараты, для определения эффективности упаковки и интенсивности вымывания (манипуляции проводились с учетом письма Главного государственного санитарного врача РФ от 2004.01.06 510/92-04-32);
- изотопный анализ для облегчения обнаружения иона, как при оценке эффективности упаковки, так и для оценки интенсивности вымывания;
- пламенной атомной фотометрии (ПАФ);
- ферментативного картирования с трипсином (ТФК);
- высоко-эффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ);
- время пролётной масс-спектроскопии (МС) и масс-спектроскопии MADI-TOF.
Группа изобретений поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение частиц фага MS2 и модифицированных VLPs рода Levivirus.
Плазмиды переносили в клетки Pseudomonas putida, при помощи Hft трансдукции бактериофагом Т7 (Большакова Т.Н., Добрынина О.Н., Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Третья международная научная конференция, Москва, 2016). Контроль инфекционности частиц проводили по методу (Княжев В.А., Сергиенко В.И., Сивов И.Г. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002, N° 3, стр. 56 -63). Полученный электрофоретически чистые частицы хранили при +4оС.
На фигуре 1 показана структура коинтегратов, а в Таблице 1 показана эффективность переноса структуры между представителями семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 1
T7::pMS3,6VRep или T7::pGA2,6VRep трансдукция Грам -отрицательных бактерий
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Пример 2. Получение частиц фагов рода Levivirus с полностью гидролизованной
РНК.
Частицы бактериофага обрабатывают диэтиламином (ДЭА 1,5%, вызывает в течение 2-х суток инкубации при 37°С полный гидролиз геномной РНК). Контроль снижения молекулярной массы геномной РНК проводили электрофоретически (в 2% агарозном геле). Полученные частицы концентрировали центрифугированием в градиенте плотности CsCl (как известно специалистам), а так же проводили контроль чистоты препаратов просвечивающей электронной микроскопией по методу (US Patent 10446366). Хранили частицы при +4°С в условиях, известных специалистам. Пример 3. Получение VLPs частиц с (HHQG)4.
ЗА. Проводили согласно ранее описанному методу [Hooker J.M., E.W. Kovacs, М.В. Francis. Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2. Supporting Information//!. AM. CHEM. SOC. 2004, v.126 (12), pp. 3718-3719] с модификацией Tyr85 Cys в последовательности В-белка (SEQ ID NO 9). 3B. Пептиды получали методом автоматического твердофазного синтеза исходя из
9-флуо-ренил(метоксикарбонил)-аминокислот («ChemPep», США) (синтезатор 433А, Applied Biosystems, метод FastMoc). Формирование S-S-мостика проводили путем окисления h [10]. Пептид очищали ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка С18 Triart, 21x250 мм, 10.0 мкм, «YMC», Швейцария, рабочая станция Agilent 1100, «Agilent», США) в градиенте концентрации CH3CN («BioSolve», Израиль) в воде в присутствии 0,1% уксусной кислоты. По данным аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка С18 Triart, 2.1x50 мм, 2.0 мкм («YMC»), рабочая станция Agilent 1200) с УФ- и масс- спектрометрической детекцией чистота препарата пептида не ниже 95%. ЗС. Неферментативная реакция присоединения iRGD-6APA (SEQ ID NO 10)
Конъюгацию пептида с капсидным В-белком VLPs рода Levivirus, проводили с использованием гомобифункционального реагента диметиладипимидата (ДМАИ, «Sigma», США) в молярном соотношении белок фага: пептид: ДМАИ 1 :20:80 по методу [US Patents 6080383; 6468503; 10576144 и DE Patent 000069731747] в 40% диметилсульфоксиде (ДМСО). VLPs отделяли от избытка реагентов осаждением 25%-ным раствором полиэтиленгликоля 6000 («Диа-М», Россия) с 1М NaCl. Осажденные VLPs суспендировали в деионизованной воде.
Пример 4. Биоминерализация частиц.
На предварительном этапе желательную структуру shRNA (для связывания с максимальным количеством катионов; не менее 200) расчитывали с помощью программы https://biosettia. com/supoort/shma-designer/ и синтезировали по методу [Chris В. Moore, Е. Н. Guthrie, М. Tze-Han Huang, D. J. Taxman. Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown//Methods Mol Biol. 2010 ; 629: 141-158]. Введение shRNA в комплексе с солями проводили с ТМАО [Патент РФ 2599462] и с учётом расчётов, полученных ранее [Farafonov V.S., Nerukh D. MS2 bacteriophage capsid studied using all-atom molecular dynamics//Interface Focus. 2019 Jun 6;9(3): pp. 81 - 85]. «Разрыхлённые» частицы переносили из pH = 4,5 в буфер карбоната натрия (0,5М, рН= 10,0). Соли и металлопрепараты переносили в раствор в концентрации не менее 1/50 штоковых растворов (<1 мг/мл) в соотношении 100 мкг белка. Далее инкубировали в течение 30 мин, с мягким перемешиванием на магнитной мешалке. Затем смесь диализовали в предварительно охлажденной стеклянной пробирке на льду, оставляли на 10 мин на льду, а затем 5 мин на комнатной температуре. Остатки солей и металлопрепаратов удаляли из образцов путем гель-фильтрации с использованием Сефадекса G-50. Препараты добавляли в колонки с сефадексом. Разделение повторяли дважды. Конечные концентрации инкапсулированных в наночастицы солей оценивали с помощью пламенного фотометра (PFP-7/C, Jenway, Англия). Результаты сравнивали с кривой концентраций соединений в диапазоне длин волн 280-800 нм. Размер нагруженных частиц измеряли с помощью анализатора размера частиц (IG-1000 Plus, Shimadzu, Япония).
Анализ проводили согласно прописям руководства по аналитическому методу пламенной фотометрии [Flame Atomic Absorption Spectrometry. Analytical Methods / /Fourteenth edition, 2017 Agilent Technologies Australia (M) Pty, Ltd.]. Контроль связывания катионов металлов с В-белком проводили с помощью программы «Metal Detector n.2.0». Контрольные измерения концентрации веществ давали линейную зависимость с г > 0,98. Полученные результаты сведены в таблицу известную специалистам [Analytical Methods for Atomic Absorption Spectroscopy. Manual Perkin Elmer. 1996].
Пример 5. Атомно-силовая микроскопия частиц фагов рода Levivirus.
Проводили по схеме, описанной ранее [Kuznetsov Y.G., Sheng-Chieh Chang, А. McPherson. Investigation of bacteriophage T4 by atomic force microscopy//Bacteriophage. 2011 May-Jun; 1(3): 165-173; A. Ramanaviciene, V. Snitka, R. Mieliauskiene, R. Kazlauskas, A. Ramanavicius. AFM study of complement system assembly initiated by antigen -antibody complex//Central European Journal of Chemistry 2006, v.4(l), pp 194-206]. Результаты суммированы на фигурах 5А и 5В.
5а. Подготовка чипа.
Для изготовления чипов использовали слюду (Structure Probe, Inc., West Chester, PA, USA), которую сиализировали в парах 3-аминопропилтриетоксисилана (APTES), как известно специалистам. Поверхность силизированных слюдяных субстратов активировали 0,12 мМ раствором DTSSP в 10 мМ PBSD (pH 7,4) в течение 10 мин, промывали 1 мл 50% абсолютого этанола в течение 10 мин при 10°С и затем сушили в токе азота немедленно использовали для иммобилизации. Инкубационные растворы (~ 1 мкл) осторожно капали на поверхность активированного субстрата, инкубировали полчаса при комнатной температуре (25°С) во влажной камере.
5в. ACM сканирование проводилось с использованием титанового атомно-силового микроскопа (НТ-МДТ, Зеленоград, Москва, Россия). НТ-МДТ имеет резонансную частоту 47-150 кГц, радиус кривизны острия кантилевера 10 нм). Данные ACM оценивали по двум критериям: первый «качественный», который основывался на очевидном увеличении высоты комплексов по сравнению с высотой неровностей чипа. Использовали треугольные датчики с широкими ножками 13 pm и общей длиной lOOpm. Заявленную постоянную силы (0,21Н/м) проверяли с точностью до 20% путем измерения прогиба кантилевера при прижатии к кварцевому волокну известной жесткости. Сканирующая головка была откалибрована в направлениях х,у и z с использованием полистирол-латексных подставок, как известно специалистам. Существует некоторое неконтролируемое изменение от запуска к запуску, которое может быть связано со сканерами, и это вводит систематическую ошибку в размерах до ±2,5%. Эксперименты проводились в жидкостной ячейке, с использованием воздуха, деионизованной воды. Высота и ширина изображения измеряли с помощью программного обеспечения, доступного на рабочей станции NanoScope Im. По меньшей мере, 40 молекул были измерены в 5 точках вдоль их контуров для каждого приведенного здесь материала. Результаты анализировали программой KaleidaGraph. Измерения силы производили с помощью дисплея силы на ACM (График зависимости напряжения, приложенного к контролю высоты образца, связанного с положением образца, Zs, через известную калибровку высоты, от сигнала отклонения, связанного с силой через отклонение наконечника, ZT и постоянной пружины кантилевера, кН). Адгезия может значительно варьироваться, поскольку она зависит от неконтролируемой геометрии наконечника и от загрязнения. Приводим усреднённые значения и диапазон, который отражает типичные условия эксперимента (см. фигуры 5А и 5В). В Таблице 2 приведены результаты измерения с помощью ACM.
Таблица 2
Figure imgf000019_0001
Пример 6. Изотопный анализ обнаружения стабильного изотопа (см. фигуру 8А и 8В).
Изотопный анализ обнаружения иона проводили согласно (Good Practice Guide for isotope ratio mass spectrometry 2011, first edition; а также Park S.K., Venable J.D., Tao Xu, John R. Yates III. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry- based proteomics//Nat Methods. 2008; v.5(N°4), pp. 319-322 и Ilbeigi V., Y. Valadbeigi, M. Tabrizchi. Ion Mobility Spectrometry of Heavy Metals//Anal. Chem. 2016, v.88 (N°14), pp. 7324-7328).
Пример 7. Токсичность (мг/кг) препаратов и солей металлов определяли для мышей (DCL; согласно ISO/IEC 17025:2017 [General requirements for the competence of testing and calibration laboratories] и ГОСТ ИСО/МЭК 17025- 2009), а так же для культур клеток (d ggi). Токсичность препаратов и солей металлов для мышей приведена в Таблице
3.
Таблица 3
Figure imgf000020_0001
Пример 8. Адресная доставка частиц фагов рода Levivirus. Точность доставки качественно определяли методом проточной флуориметрии со смеси клеток, обогащённых интегрином ауРз и лишённых такового (линии РСЗ и
НЕК293). С этой целью готовили смеси клеток с интегрином и без него в различных соотношениях (1:10; 1 :20 и 1 :40) в титре 107/мл. К клеткам добавляли VLPs рода Levivirus с наполнением, а через 3 часа флуоресцентный краситель 4’,6-диамиидно-2-фенилиндол (DAPI) для окрашивания мёртвых клеток. Полученные результаты суммированы на фигуре 9 и в Таблице 4. Расчётные коэффициенты корреляции летальным эффектом частиц VLPs рода Levivirus с наполнением так же приведены в Таблице 4.
Таблица 4
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающий этапы:
(a) получения линии псевдолизогенных клеток-хозяина, размножающихся при температуре < 23 °С, лишённых токсического липополисахарида и содержащих:
- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фазмиду Т7 с фрагментом геномов бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки ДНК- и РНК-полимеразы фага Т7 и лишённой генов морфогенеза;
(B) инициирования гиперэкспрессии генов, кодирующих белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus при повышении температуры > 28°С;
(c) получения частиц бактериофагов семейства Levivirus с одновременным разрушением клеток-хозяина, при этом указанные частицы бактериофагов имеют морфологическое сходство с природными частицами фага.
2. Частица бактериофага семейства Levivirus, полученная способом по п.1, лишённая LPS-токсичности.
3. Способ биоминерализации частиц бактериофагов семейства Levivirus по п.2, полученных способом по п.1 , предназначенный существенно снизить общую токсичность нагруженных металлопрепаратами частиц, включающий этапы:
(а) полного удаления РНК из частиц бактериофагов семейства Levivirus;
(б) получения комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов;
(в) «загрузки» комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов, в «разрыхлённые» триметиламин N-оксидом частицы бактериофагов семейства Levivirus, лишённых РНК;
(г) неферментативного присоединения лиганда к биоминерализованным частицам, пригодного для создания системы адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли, в том числе клеткам, обогащённым интегрином ауРз;
(д) определение специфичности доставки и чувствительности на модели смеси линии клеток РСЗ, одна из которых обогащёна интегрином ауРз-
PCT/RU2020/000198 2020-04-24 2020-04-24 Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus WO2021215952A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2020/000198 WO2021215952A1 (ru) 2020-04-24 2020-04-24 Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus
EP20932307.0A EP4141110A1 (en) 2020-04-24 2020-04-24 Method for producing particles of bacteriophages of the genus levivirus

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2020/000198 WO2021215952A1 (ru) 2020-04-24 2020-04-24 Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021215952A1 true WO2021215952A1 (ru) 2021-10-28

Family

ID=78269708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/000198 WO2021215952A1 (ru) 2020-04-24 2020-04-24 Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP4141110A1 (ru)
WO (1) WO2021215952A1 (ru)

Citations (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2599462A (en) 1950-08-31 1952-06-03 Kowarsch Arthur Wall attached closure remover with releasable retainer
US3957764A (en) 1969-11-11 1976-05-18 Lovens Kemiske Fabrik Produktionsaktieselskab 6-aminopenicillanic acid derivatives
US4229348A (en) 1978-05-26 1980-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Penicillanic acid derivatives
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US4810777A (en) 1987-03-04 1989-03-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antimicrobial compounds
WO1993006921A1 (en) 1991-10-04 1993-04-15 Gs Biochem Ab Particles, method of preparing said particles and uses thereof
WO1995031476A1 (en) 1994-05-17 1995-11-23 The University Of Queensland Recombinant papilloma virus l1
US5534257A (en) 1991-01-24 1996-07-09 British Technology Group Limited Antigen-presenting capsid with fusion MS2-coat protein
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US6080383A (en) 1997-01-13 2000-06-27 Rose; Samuel Method and composition for the treatment of cancer by the enzymatic conversion of soluble radioactive toxic agents into radioactive toxic precipitates in the cancer
US6159728A (en) 1992-06-26 2000-12-12 Btg International Limited RNA bacteriophage-based delivery system
US20040152181A1 (en) 1997-09-05 2004-08-05 Mccarthy Michael P. In vitro method for disassmbly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (VLPs). Homogeneous VLP and cavsomere compositions produced by said methods: use thereof as vehicle for improved purification, and delivery of active agents
DE69731747T2 (de) 1996-06-07 2006-02-02 Astrazeneca Ab Peptid derivate
EP1736538A1 (en) 2005-06-21 2006-12-27 Cytos Biotechnology AG Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs)
US7494656B2 (en) 2002-07-17 2009-02-24 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays
US20090092538A1 (en) 2007-10-08 2009-04-09 Amit Khanolkar Methods for forming stabilized metal salt particles
US7569606B2 (en) 2006-01-26 2009-08-04 Bionumerik Pharmaceuticals, Inc. Platinum complexes with mononitrile-containing ligands
US7594884B2 (en) 2005-12-27 2009-09-29 Goss International Montataire Sa Folding device
US20100167981A1 (en) 2008-11-18 2010-07-01 Bundy Bradley C Encapsidation of Heterologous Entities into Virus-Like Particles
US20110286971A1 (en) 2005-03-08 2011-11-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted drug-carrying bacteriophages
US8187607B2 (en) 2002-07-18 2012-05-29 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates and uses thereof
US20130224828A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Qapsule Technologies, Inc. RNA-Directed Packaging of Enzymes Within Protein Particles
US20140106982A1 (en) 2009-12-31 2014-04-17 David S. Peabody Plasmids and methods for peptide display and affinity-selection on virus-like particles of rna bacteriophages
US20140302593A1 (en) 2011-12-21 2014-10-09 Apse, Llc Process for purifying vlps
US20140377289A1 (en) 2011-05-12 2014-12-25 MetalloPharm, LLC Metallodrugs Having Improved Pharmacological Properties, and Methods of Manufacture and Use Thereof
US20150125533A1 (en) 2011-07-25 2015-05-07 American University In Cairo Single-domain antibodies and graphene coated magnetic metal nanoparticles conjugate and methods for using the same
US20150157571A1 (en) 2011-09-08 2015-06-11 Western University Of Health Sciences Targeted liposomes in cancer therapy
US20150182489A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 King Abdulaziz City For Science And Technology Gold (iii) compounds and use for treating cancer
RU2568872C1 (ru) * 2014-10-15 2015-11-20 Игорь Геннадьевич Сивов Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с
EP2958553A2 (en) 2013-02-19 2015-12-30 National Health Research Institutes Caged platinum nanoclusters for anticancer chemotherapeutics
US20160090403A1 (en) 2012-02-16 2016-03-31 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle composition
US20160208221A1 (en) 2013-09-12 2016-07-21 Apse, Llc Compositions and methods using capsids resistant to hydrolases
RU2599462C1 (ru) * 2015-09-22 2016-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНОЛОГИЯ" (ООО "БИОТЕХНОЛОГИЯ") Способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей
US20170008778A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 King Abdulaziz University Freezing desalination module
US20170239369A1 (en) 2013-05-02 2017-08-24 Jinis Co., Ltd. Targeting-enhanced anticancer nanoparticles and preparation methods of same
US20180000949A1 (en) 2012-03-09 2018-01-04 Vascular Biosciences Orally Active, Cell-Penetrating Homing Peptide and Methods of Using Same
US20180021259A1 (en) 2015-02-10 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dye-stabilized nanoparticles and methods of their manufacture and therapeutic use
US20180021265A1 (en) 2015-02-18 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for nanoparticle-based drug delivery and imaging
US20180028683A1 (en) 2015-02-20 2018-02-01 Trustees Of Boston University Theranostic compositions and uses thereof
US20180071399A1 (en) 2016-09-02 2018-03-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Use of Single Dendritic Wedge Cell Penetrating Peptides to Facilitate Cellular Delivery of Nanoparticles and Nanoparticles Carrying Cargos
US20180078551A1 (en) 2010-11-12 2018-03-22 Pharma Mar, S.A. Combination therapy with an antitumor alkaloid
US9925592B2 (en) 2010-09-24 2018-03-27 Nanyang Technological University Method for fabricating a gold nanoparticle
US20180133343A1 (en) 2016-11-15 2018-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle conjugates and uses thereof
US20180243229A1 (en) 2007-11-05 2018-08-30 The Trustees Of Princeton University Composite flash-precipitated nanoparticles
US20180243440A1 (en) 2016-10-04 2018-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for drug delivery
US20180256758A1 (en) 2014-08-05 2018-09-13 Case Wester Reserve University Coated plant virus imaging agents
US10098952B2 (en) 2013-01-25 2018-10-16 Nanobiotix Inorganic nanoparticles compositions in combination with ionizing radiations for treating cancer
US20180303954A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Gachon University Of Industry-Academic Cooperation Foundation Stem cell-nano drug delivery system complex, use thereof and method for preparing the same
US20180344849A1 (en) 2015-11-20 2018-12-06 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Phase change nanodroplet conjugates for targeted delivery
US20180353613A1 (en) 2015-05-05 2018-12-13 B.G. Negev Technologies And Applications Ltd Anionic nanoparticles for use in the delivery of anionic small molecule drugs
US20190015320A1 (en) 2016-01-15 2019-01-17 Universidad De Chile Pharmaceutical form for oral administration of a highly controlled and stable dose of nanoparticles or biomacromolecule suspensions
US20190015526A1 (en) 2016-03-11 2019-01-17 Marilyn Mackiewicz Hybrid membrane-coated nanoparticle composites and methods of making and using the same
US20190022170A1 (en) 2014-08-06 2019-01-24 David Mann Compositions Containing a Pharmacophore with Selectivity to Diseased Tissue and Methods of Making Same
US20190091165A1 (en) 2017-04-21 2019-03-28 Bio-Synectics Inc. Method for preparing nanoparticle of active ingredient using lipid as lubricant in milling process
US20190117561A1 (en) 2016-03-07 2019-04-25 Research Business Foundation Sungkyunkwan University Self-assembled nanoparticle releasing soluble microneedle structure and preparation method therefor
US20190167584A1 (en) 2017-12-05 2019-06-06 International Business Machines Corporation Block copolymers and self-assembling nanoparticles formed therefrom
US20190170742A1 (en) 2009-05-19 2019-06-06 University Of Miami Compositions, kits and methods for in vitro antigen presentation, assessing vaccine efficacy, and assessing immunotoxicity of biologics and drugs
US20190201547A1 (en) 2018-01-02 2019-07-04 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Nanoparticle-Based Method for Real-time Actuated Release and Monitoring of Cargos to Cells
US20190240186A1 (en) 2016-10-25 2019-08-08 Council Of Scientific & Industrial Research Gold nanoparticle based formulation for use in cancer therapy
US20190255087A1 (en) 2016-01-22 2019-08-22 The Penn State Research Foundation Encapsulation and high loading efficiency of phosphorylated drug and imaging agents in nanoparticles
US20190255088A1 (en) 2018-02-17 2019-08-22 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Biocompatible organo-inorganic nanocomposites
US20190307819A1 (en) 2010-03-31 2019-10-10 Stabilitech Biopharma Ltd Stabilisation of viral particles
US10446366B1 (en) 2018-02-13 2019-10-15 Fei Company Imaging technique in scanning transmission charged particle microscopy
US20190315807A1 (en) 2016-07-27 2019-10-17 Fundación Privada De Institut De Recerca De La Sida-Caixa Virus-like particles with high-density coating for inducing the expression of antibodies
US20190350871A1 (en) 2016-11-03 2019-11-21 Case Western Reserve University Melt processed viral nanoparticle constructs
WO2020030954A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Integrative Medicine Clinic, Sia Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer
US10576144B2 (en) 2013-06-28 2020-03-03 Auckland Uniservices Limited Amino acid and peptide conjugates and conjugation process

Patent Citations (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2599462A (en) 1950-08-31 1952-06-03 Kowarsch Arthur Wall attached closure remover with releasable retainer
US3957764A (en) 1969-11-11 1976-05-18 Lovens Kemiske Fabrik Produktionsaktieselskab 6-aminopenicillanic acid derivatives
US4229348A (en) 1978-05-26 1980-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Penicillanic acid derivatives
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US4810777A (en) 1987-03-04 1989-03-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antimicrobial compounds
US5534257A (en) 1991-01-24 1996-07-09 British Technology Group Limited Antigen-presenting capsid with fusion MS2-coat protein
WO1993006921A1 (en) 1991-10-04 1993-04-15 Gs Biochem Ab Particles, method of preparing said particles and uses thereof
US6159728A (en) 1992-06-26 2000-12-12 Btg International Limited RNA bacteriophage-based delivery system
WO1995031476A1 (en) 1994-05-17 1995-11-23 The University Of Queensland Recombinant papilloma virus l1
DE69731747T2 (de) 1996-06-07 2006-02-02 Astrazeneca Ab Peptid derivate
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US6468503B2 (en) 1997-01-13 2002-10-22 Oncologic, Inc. Method and composition for the treatment of cancer by the enzymatic conversion of soluble radioactive toxic precipitates in the cancer
US6080383A (en) 1997-01-13 2000-06-27 Rose; Samuel Method and composition for the treatment of cancer by the enzymatic conversion of soluble radioactive toxic agents into radioactive toxic precipitates in the cancer
US20040152181A1 (en) 1997-09-05 2004-08-05 Mccarthy Michael P. In vitro method for disassmbly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (VLPs). Homogeneous VLP and cavsomere compositions produced by said methods: use thereof as vehicle for improved purification, and delivery of active agents
US7494656B2 (en) 2002-07-17 2009-02-24 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays
US8187607B2 (en) 2002-07-18 2012-05-29 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates and uses thereof
US20110286971A1 (en) 2005-03-08 2011-11-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted drug-carrying bacteriophages
EP1736538A1 (en) 2005-06-21 2006-12-27 Cytos Biotechnology AG Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs)
US7594884B2 (en) 2005-12-27 2009-09-29 Goss International Montataire Sa Folding device
US7569606B2 (en) 2006-01-26 2009-08-04 Bionumerik Pharmaceuticals, Inc. Platinum complexes with mononitrile-containing ligands
US20180103645A1 (en) 2007-10-08 2018-04-19 Johnson & Johnson Vision Care, Inc. Methods for forming stabilized metal salt particles
US20090092538A1 (en) 2007-10-08 2009-04-09 Amit Khanolkar Methods for forming stabilized metal salt particles
US20170071211A1 (en) 2007-10-08 2017-03-16 Johnson & Johnson Vision Care, Inc. Methods for forming stabilized metal salt particles
US20180243229A1 (en) 2007-11-05 2018-08-30 The Trustees Of Princeton University Composite flash-precipitated nanoparticles
US20100167981A1 (en) 2008-11-18 2010-07-01 Bundy Bradley C Encapsidation of Heterologous Entities into Virus-Like Particles
US8324149B2 (en) 2008-11-18 2012-12-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Encapsidation of heterologous entities into virus-like particles
US20190170742A1 (en) 2009-05-19 2019-06-06 University Of Miami Compositions, kits and methods for in vitro antigen presentation, assessing vaccine efficacy, and assessing immunotoxicity of biologics and drugs
US20140106982A1 (en) 2009-12-31 2014-04-17 David S. Peabody Plasmids and methods for peptide display and affinity-selection on virus-like particles of rna bacteriophages
US20190307819A1 (en) 2010-03-31 2019-10-10 Stabilitech Biopharma Ltd Stabilisation of viral particles
US9925592B2 (en) 2010-09-24 2018-03-27 Nanyang Technological University Method for fabricating a gold nanoparticle
US20130224828A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Qapsule Technologies, Inc. RNA-Directed Packaging of Enzymes Within Protein Particles
US20180078551A1 (en) 2010-11-12 2018-03-22 Pharma Mar, S.A. Combination therapy with an antitumor alkaloid
US20140377289A1 (en) 2011-05-12 2014-12-25 MetalloPharm, LLC Metallodrugs Having Improved Pharmacological Properties, and Methods of Manufacture and Use Thereof
US20150125533A1 (en) 2011-07-25 2015-05-07 American University In Cairo Single-domain antibodies and graphene coated magnetic metal nanoparticles conjugate and methods for using the same
US20150157571A1 (en) 2011-09-08 2015-06-11 Western University Of Health Sciences Targeted liposomes in cancer therapy
US20140302593A1 (en) 2011-12-21 2014-10-09 Apse, Llc Process for purifying vlps
US20160090403A1 (en) 2012-02-16 2016-03-31 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle composition
US20180000949A1 (en) 2012-03-09 2018-01-04 Vascular Biosciences Orally Active, Cell-Penetrating Homing Peptide and Methods of Using Same
US10098952B2 (en) 2013-01-25 2018-10-16 Nanobiotix Inorganic nanoparticles compositions in combination with ionizing radiations for treating cancer
EP2958553A2 (en) 2013-02-19 2015-12-30 National Health Research Institutes Caged platinum nanoclusters for anticancer chemotherapeutics
US20170239369A1 (en) 2013-05-02 2017-08-24 Jinis Co., Ltd. Targeting-enhanced anticancer nanoparticles and preparation methods of same
US10576144B2 (en) 2013-06-28 2020-03-03 Auckland Uniservices Limited Amino acid and peptide conjugates and conjugation process
US20160208221A1 (en) 2013-09-12 2016-07-21 Apse, Llc Compositions and methods using capsids resistant to hydrolases
US20150182489A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 King Abdulaziz City For Science And Technology Gold (iii) compounds and use for treating cancer
US20180256758A1 (en) 2014-08-05 2018-09-13 Case Wester Reserve University Coated plant virus imaging agents
US20190022170A1 (en) 2014-08-06 2019-01-24 David Mann Compositions Containing a Pharmacophore with Selectivity to Diseased Tissue and Methods of Making Same
RU2568872C1 (ru) * 2014-10-15 2015-11-20 Игорь Геннадьевич Сивов Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с
US20180021259A1 (en) 2015-02-10 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dye-stabilized nanoparticles and methods of their manufacture and therapeutic use
US20180021265A1 (en) 2015-02-18 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for nanoparticle-based drug delivery and imaging
US20180028683A1 (en) 2015-02-20 2018-02-01 Trustees Of Boston University Theranostic compositions and uses thereof
US20180353613A1 (en) 2015-05-05 2018-12-13 B.G. Negev Technologies And Applications Ltd Anionic nanoparticles for use in the delivery of anionic small molecule drugs
US20170008778A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 King Abdulaziz University Freezing desalination module
RU2599462C1 (ru) * 2015-09-22 2016-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНОЛОГИЯ" (ООО "БИОТЕХНОЛОГИЯ") Способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей
US20180250331A1 (en) 2015-09-22 2018-09-06 Obshestvo S Ogranichennoi Otvetstvennost'yu "Biotehnologiya" Method for Poly Signal Activation of Apoptosis of Malignant Solid Tumour Cells
US20180344849A1 (en) 2015-11-20 2018-12-06 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Phase change nanodroplet conjugates for targeted delivery
US20190015320A1 (en) 2016-01-15 2019-01-17 Universidad De Chile Pharmaceutical form for oral administration of a highly controlled and stable dose of nanoparticles or biomacromolecule suspensions
US20190255087A1 (en) 2016-01-22 2019-08-22 The Penn State Research Foundation Encapsulation and high loading efficiency of phosphorylated drug and imaging agents in nanoparticles
US20190117561A1 (en) 2016-03-07 2019-04-25 Research Business Foundation Sungkyunkwan University Self-assembled nanoparticle releasing soluble microneedle structure and preparation method therefor
US20190015526A1 (en) 2016-03-11 2019-01-17 Marilyn Mackiewicz Hybrid membrane-coated nanoparticle composites and methods of making and using the same
US20190315807A1 (en) 2016-07-27 2019-10-17 Fundación Privada De Institut De Recerca De La Sida-Caixa Virus-like particles with high-density coating for inducing the expression of antibodies
US20180071399A1 (en) 2016-09-02 2018-03-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Use of Single Dendritic Wedge Cell Penetrating Peptides to Facilitate Cellular Delivery of Nanoparticles and Nanoparticles Carrying Cargos
US20180243440A1 (en) 2016-10-04 2018-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for drug delivery
US20190240186A1 (en) 2016-10-25 2019-08-08 Council Of Scientific & Industrial Research Gold nanoparticle based formulation for use in cancer therapy
US20190350871A1 (en) 2016-11-03 2019-11-21 Case Western Reserve University Melt processed viral nanoparticle constructs
US20180133343A1 (en) 2016-11-15 2018-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle conjugates and uses thereof
US20180303954A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Gachon University Of Industry-Academic Cooperation Foundation Stem cell-nano drug delivery system complex, use thereof and method for preparing the same
US20190091165A1 (en) 2017-04-21 2019-03-28 Bio-Synectics Inc. Method for preparing nanoparticle of active ingredient using lipid as lubricant in milling process
US20190167584A1 (en) 2017-12-05 2019-06-06 International Business Machines Corporation Block copolymers and self-assembling nanoparticles formed therefrom
US20190201547A1 (en) 2018-01-02 2019-07-04 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Nanoparticle-Based Method for Real-time Actuated Release and Monitoring of Cargos to Cells
US10446366B1 (en) 2018-02-13 2019-10-15 Fei Company Imaging technique in scanning transmission charged particle microscopy
US20190255088A1 (en) 2018-02-17 2019-08-22 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Biocompatible organo-inorganic nanocomposites
WO2020030954A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Integrative Medicine Clinic, Sia Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer

Non-Patent Citations (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Analytical Methods", 2017, AGILENT TECHNOLOGIES AUSTRALIA (M) PTY, LTD, article "Flame Atomic Absorption Spectrometry"
"Good Practice Guide for isotope ratio mass spectrometry", 2011
"Toxicological review of thallium and compounds", September 2009, U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY
"TOXICOLOGICAL REVIEW OF THALLIUM AND COMPOUNDS", U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 2009
A. RAMANAVICIENEV. SNITKAR. MIELIAUSKIENER. KAZLAUSKASA. RAMANAVICIUS: "AFM study of complement system assembly initiated by antigen-antibody complex", CENTRAL EUROPEAN JOURNAL OF CHEMISTRY, vol. 4, no. 1, 2006, pages 194 - 206
ALJABALI A. A.SACHIN N. SHAHRICHARD EVANS-GOWINGGEORGE P. LOMONOSSOFFDAVID J. EVANS: "Chemically-coupled-peptide -promoted virus nanoparticle templated mineralization", INTEGR. BIOL., vol. 3, 2011, pages 119 - 125
ASHLEY C. E.ERIC C. CARNESGENEVIEVE K. PHILLIPSPAUL N. DURFEEMEKENSEY D. BULEYCHRISTOPHER A. LINODAVID P. PADILLABRANDY PHILLIPSMA: "Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles", ACS NANO, vol. 5, no. 7, 26 July 2011 (2011-07-26), pages 5729 - 5745, XP002765929, DOI: 10.1021/nn201397z
BARRY N.P.SADLER P.J.: "Exploration of the medical periodic table: towards new targets", CHEM COMMUN (CAMB, vol. 49, no. 45, 2013, pages 5106 - 5131
BLAZECK J.ALPER H.S.: "Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level", BIOTECHNOL J, vol. 8, no. 1, 2013, pages 46 - 58, XP055206622, DOI: 10.1002/biot.201200120
BOLSHAKOVA T.N.DOBRYNINA O.N.KARATAEV G.I.SIVOV I.G.: "Pseudolysogeny in T7 phage and its use", BACTERIOPHAGES: THEORETICAL AND PRACTICAL ASPECTS OF APPLICATION IN MEDICINE, VETERINARY MEDICINE AND FOOD INDUSTRY. THE THIRD INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE, MOSCOW, 2016
BOLSHAKOVA T.N.DOBRYNINA O.YU.KARATAEV G.I.SIVOV I.G.: "Bacteriophages: Theoretical and Practical Aspects of Application in Medicine, Veterinary Medicine and Food Industry", PSEUDOLYSOGENY IN T7 PHAGE AND ITS USE (WITHIN THE FRAMEWORK OF THE SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE WITH THE INTERNATIONAL PARTICIPATION, 2016
BONILLA S.C. LIMOUSEN. BISARIAM. GEBALAH. MABUCHID. HERSCHLAG: "Single-Molecule Fluorescence Reveals Commonalities and Distinctions among Natural and in Vitro-Selected RNA Tertiary Motifs in a Multistep Folding Pathway", J. AM. CHEM. SOC., vol. 139, no. 51, 2017, pages 18576 - 18589
CARLEE E. ASHLEY ET AL.: "Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles", ACS NANO, vol. 5, no. 7, 2011, pages 5729 - 5745, XP002765929, DOI: 10.1021/nn201397z
CHRIS B. MOOREE. H. GUTHRIEM. TZE-HAN HUANGD. J. TAXMAN: "Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown", METHODS MOL BIOL, vol. 629, 2010, pages 141 - 158
DIAZ D.ANDREW CAREANWAR SUNNA: "Bioengineering Strategies for Protein-Based Nanoparticles", GENES (BASEL, vol. 9, no. 7, 2018, pages 370 - 400, XP055791167, DOI: 10.3390/genes9070370
FARAFONOV V.S.NERUKH D.: "MS2 bacteriophage capsid studied using all-atom molecular dynamics", INTERFACE FOCUS, vol. 9, no. 3, 6 June 2019 (2019-06-06), pages 81 - 85
FIRSOV I.S.SIVOV I.G.: "Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report", J CLIN CASE REP, vol. 9, no. 2, 2019, pages 1214 - 1217
GETINO M.D.J. SANABRIA-RIOSR. FERNANDEZ-LOPEZJ. CAMPOS-GOMEZJ.M. SANCHEZ-LOPEZA. FERNANDEZN.M. CARBALLEIRAF. DE LA CRUZ: "Synthetic Fatty Acids Prevent Plasmid-Mediated Horizontal Gene Transfer", MBIO, vol. 6, no. 5, 2015, pages e01032 - 15
GUIDANCE FOR INDUSTRY: PYROGEN AND ENDOTOXINS TESTING: QUESTIONS AND ANSWERS, June 2012 (2012-06-01)
HOOKER J. M.E. W. KOVACSM. B. FRANCIS: "Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2", J. AM. CHEM. SOC., vol. 9, no. 12, 2004, pages 3718 - 3719, XP002461219, DOI: 10.1021/ja031790q
HOOKER J.M.E.W. KOVACSM.B. FRANCIS: "Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2//J. Supporting Information", J. AM. CHEM. SOC., vol. 126, no. 12, 2004, pages 3718 - 3719
ILBEIGI V.Y. VALADBEIGIM. TABRIZCHI: "Ion Mobility Spectrometry of Heavy Metals", ANAL. CHEM., vol. 88, no. 14, 2016, pages 7324 - 7328
KNYAZHEV V.A.SERGIENKO V.ISIVOV I.G.: "RNA transduction by non-infectious virions of MS2 phage", MOLECULAR GENETICS, MICROBIOLOGY AND VIROLOGY, no. 3, 2002, pages 56 - 63
KOLESANOVA E. F.MELNIKOVA M.V.BOLSHAKOVA T. N.RYBALKINA E. YU.SIVOV I.G.: "Bacteriophage MS2 is a delivery vehicle for targeted chemotherapy of solid tumors", ACTA NATURAE, vol. 11, no. 2, 2019, pages 98 - 101
KUZNETSOV Y.G.SHENG-CHIEH CHANGA. MCPHERSON: "Investigation of bacteriophage T4 by atomic force microscopy", BACTERIOPHAGE, vol. 1, no. 3, May 2011 (2011-05-01), pages 165 - 173
LIU L.PU X.YIN G.CHEN X.YIN J.WU Y.: "Biomimetic Mineralization of Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Mediated by Bi-Functional Copolypeptides", MOLECULES, vol. 24, no. 7, 2019, pages 1 - 16
MAEDA HKHATAMI M: "Analyses of repeated failures in cancer therapy for solid tumors: poor tumor-selective drug delivery, low therapeutic efficacy and unsustainable costs", CLIN TRANSL MED, vol. 7, no. 1, 2018, pages 11 - 30, XP021254524, DOI: 10.1186/s40169-018-0185-6
MICHEL T. DEDEODANIEL T. FINLEYMATTHEW B. FRANCIS: "Molecular Assembly in Natural and Engineered Systems", vol. 103, 2011, article "Viral Capsids as Self-Assembling Templates for New Materials", pages: 1 - 401
N.F. ADKINSON, JRL. M. MENDELSONC. RESSLERJ. C. KEOGH: "Penicillin minor determinants", ANN ALLERGY ASTHMA IMMUNOL, vol. 121, 2018, pages 537 - 544, XP085524529, DOI: 10.1016/j.anai.2018.09.459
O. KANATHULYA ERTASBURCU CANER: "Platinum-induced neurotoxicity: A review of possible mechanisms", WORLD J CLIN ONCOL, vol. 8, no. 4, 2017, pages 329 - 335
P. PUMPENS ET AL.: "The True Story and Advantages of RNA Phage Capsids as Nanotools", INTERVIROLOGY, vol. 59, no. 2, 2016, pages 74 - 110, XP055883746, DOI: 10.1159/000449503
PARK S.K.VENABLE J.D.TAO XUJOHN R. YATES III: "A quantitative analysis software tool for mass spectrometry- based proteomics", NAT METHODS, vol. 5, no. 4, 2008, pages 319 - 322
PEABODY J. ET AL.: "Characterization of a spray-dried candidate HPV L2-VLP vaccine stored for multiple years at room temperature", PAPILLOMAVIRUS RESEARCH, vol. 3, 2017, pages 116 - 120, XP055757573, DOI: 10.1016/j.pvr.2017.03.004 *
ROHOVIE M.J.NAGASAWA M.SWARTZL J.R.: "Virus-like particles: Next-generation nanoparticles for targeted therapeutic delivery", BIOENGINEERING & TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 2, no. 1, 2017, pages 43 - 57, XP055952266, DOI: 10.1002/btm2.10049
SMITH G.P.: "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", SCIENCE, vol. 228, no. 4705, 1985, pages 1315 - 1317, XP002464311, DOI: 10.1126/science.4001944
SPENGLER GMOLNAR ASCHELZ ZAMARAL LSHARPLES DMOLNAR J.: "The mechanism of plasmid curing in bacteria", CURR DRUG TARGETS, vol. 7, no. 7, 2006, pages 823 - 41, XP009087182, DOI: 10.2174/138945006777709601
SUN L.-Z.D. ZHANGS.-J. CHEN: "Theory and Modeling of RNA Structure and Interactions with Metal Ions and Small Molecules", ANNU REV BIOPHYS, vol. 46, no. 1, 2017, pages 227 - 246
TOPCUL MCETIN I: "Endpoint of cancer treatment: targeted therapies", ASIAN PAC J CANCER PREV, vol. 15, no. 11, 2014, pages 4395 - 403
V.N. KONOPSKY ET AL.: "Photonic Crystal Biosensor Based on Optical Surface Waves", SENSORS, vol. 13, no. 20, 2013, pages 25662578
VAN MEERTEN D.R. C. L. OLSTHOORNJ. VAN DUINR. M. D. VERHAERT: "Peptide display on live MS2 phage: restrictions at the RNA genome level", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 82, no. 7, 2001, pages 1797 - 1805
WELTZIEN H.U.E. PADOVAN: "Molecular Features of Penicillin Allergy", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 110, no. 3, 1998, pages 203 - 206
YADETIE F.A.K. SANDVIKH. BERGUMK. NORSETTA. LAEGREID: "Miniaturized fluorescent RNA dot blot method for rapid quantification of gene expression", BMC BIOTECHNOLOGY, vol. 4, no. 12, 2004, pages 472 - 480
ZELTINS A: "Construction and characterization of virus-like particles: a review", MOL BIOTECHNOL, vol. 53, no. 1, 2013, pages 92 - 107, XP055551932, DOI: 10.1007/s12033-012-9598-4
ZHAI L.J. PEABODYY.-Y. S. PANGJ. SCHILLERB. CHACKERIANE. TUMBAN: "A Novel Candidate MS2 Phage VLP Vaccine Displaying a tandem HPV L2 Peptide offers Similar Protection in Mice to Gardasil-9", ANTIVIRAL RES, vol. 147, November 2017 (2017-11-01), pages 116 - 123, XP085255770, DOI: 10.1016/j.antiviral.2017.09.012

Also Published As

Publication number Publication date
EP4141110A1 (en) 2023-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jiang et al. Intracellular trafficking of HBV particles
Kim et al. Disease-associated mutations and alternative splicing alter the enzymatic and motile activity of nonmuscle myosins II-B and II-C
Noble et al. A de novo virus-like topology for synthetic virions
TWI297040B (en) Recombinant baculovirus and virus-like particle
Rabe et al. Nuclear entry of hepatitis B virus capsids involves disintegration to protein dimers followed by nuclear reassociation to capsids
Tamburro et al. Multifunctional core–shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers
Kann et al. Intracellular transport of hepatitis B virus
US20050037390A1 (en) Methods and compositions for modulating erythropoietin expression
CA2263784A1 (en) Dual-tagged proteins and their uses
Whitley et al. Encapsulating Cas9 into extracellular vesicles by protein myristoylation
Dixon et al. The E1 helicase of human papillomavirus type 11 binds to the origin of replication with low sequence specificity
Bin Mohamed Suffian et al. Yield optimisation of Hepatitis B virus core particles in E. coli expression system for drug delivery applications
Spearman et al. Human immunodeficiency virus type 1 capsid formation in reticulocyte lysates
CN109528653A (zh) 具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途
Wang et al. Three-step channel conformational changes common to DNA packaging motors of bacterial viruses T3, T4, SPP1, and Phi29
CN111214663A (zh) Tmed2在作为埃博拉病毒病治疗靶点中的应用
JP2010510812A (ja) 細胞イメージング法に基づく、ｈｂｖカプシドタンパク質と表面タンパク質との間の相互作用を用いたｈｂｖ増殖抑制物質のスクリーニング方法
CN112941237A (zh) 一种用于特异性检测甲型h7n9禽流感病毒的crispr核酸检测试剂盒
Mukherjee et al. High cooperativity of the SV40 major capsid protein VP1 in virus assembly
EP3225255B1 (en) Carbosilane dendrimer and aggregatable carrier obtained using said dendrimer for drug delivery system
US10772973B2 (en) Targeted shell for use in drug delivery system utilizing carbosilane dendrimer
TW201732040A (zh) 結合於分子標靶醫藥之ｄｎａ適體及使用其之分子標靶醫藥之檢測方法
CN104758918A (zh) 用交叉β结构靶向诱导蛋白质聚集
EP4141110A1 (en) Method for producing particles of bacteriophages of the genus levivirus
WO2015135432A1 (zh) 靶向脂质体的制备及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20932307

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020932307

Country of ref document: EP

Effective date: 20221124

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE