DE69731747T2

DE69731747T2 - Peptid derivate

Info

Publication number: DE69731747T2
Application number: DE69731747T
Authority: DE
Inventors: Ronald Cotton; Neil Philip EDWARDS; William Richard LUKE; Keith Oldham
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: US6541453B2; CA2252417A1; SK166798A3; EP0914333A1; NZ332347A; HRP970308B1; US20020103335A1; AU2972097A; ID17440A; US20030195158A1; JP2000512277A; HRP970308A2; WO1997046578A1; KR20000016465A; NO985680D0; AR008389A1; KR100451522B1; CN1130372C; CN1221424A; TR199802537T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neue Peptidderivate mit pharmakologisch sinnvollen Eigenschaften zur Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder medizinischen Krankheitszuständen, wie z.B. rheumatoide Arthritis und anderen von MHC-Klasse-II abhängigen, von T-Zellen vermittelten Erkrankungen. Die Erfindung umfaßt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen der neuen Peptidderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung bei der Behandlung einer oder mehrerer der obenerwähnten Erkrankungen oder medizinischen Krankheitszustände sowie bei der Produktion neuer Pharmazeutika zur Verwendung bei solchen medizinischen Behandlungen.
Die Stimulierung der menschlichen Immunantwort hängt von der Erkennung von Proteinantigenen durch T-Zellen ab. Die T-Zellen sind jedoch nicht in der Lage, auf Antigen allein zu reagieren, und werden nur dann von einem Antigen angeregt, wenn dieses in einem Komplex mit MHC (major histocompatibility complex)-Molekülen auf der Oberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle, wie z.B. einer B-Zelle, einem Macrophagen oder einer dendritischen Zelle, vorhanden ist.
MHC-Moleküle der Klasse I rufen eine T-Killer-Zellantwort hervor, die zur Zerstörung der das Antigen tragenden Zelle führt. MHC-Moleküle der Klasse II rufen eine T-Helfer-Zellantwort hervor, die die Expansion und Reifung ausgewählter B-Zellen (d.h. Erzeugung antigenspezifischer Antikörper) sowie die Aktivierung von Makrophagen steuert.
Eine entscheidende Anforderung an das Immunsystem besteht in der Fähigkeit, zwischen „eigenen" und „nicht eigenen" (d.h. fremden) Antigenen zu unterscheiden. Diese Differenzierung wird benötigt, um dem Immunsystem zu ermöglichen, auf eine Attacke durch fremde Krankheitserreger bei gleichzeitiger Bewahrung der Toleranz gegenüber Eigenproteinen zu reagieren und dadurch eine Schädigung von Normalgeweben zu vermeiden. Eine Autoimmunkrankheit entsteht dann, wenn die Eigentoleranz nicht mehr funktioniert, wodurch dem Immunsystem gestattet wird, gegen Eigengewebe, wie z.B. die Gelenke bei rheumatoider Arthritis, zu reagieren. Man nimmt an, daß die Bewahrung der Toleranz und somit die Vermeidung einer Autoimmunkrankheit in kritischer Weise von der Funktion der MHC-Moleküle abhängt.
Die Beobachtung, daß viele Autoimmunkrankheiten mit der Vererbung bestimmter MHC-Allele in Verbindung gebracht werden, läßt auf eine Schlüsselrolle für MHC-Moleküle bei der Pathogenese einer Autoimmunkrankheit schließen. So wird beispielsweise multiple Sklerose mit der Vererbung von HLA-DR2, der insulinabhängige Diabetes mellitus mit HLA-DR3 und/oder HLA-DR4 und die Hashimoto Thyroiditis mit HLA-DR5 in Verbindung gebracht. Insbesondere besteht eine besonders starke Assoziation zwischen einer Veranlagung zur Entwicklung der chronischen Gelenkentzündung rheumatoide Arthritis und der Vererbung von HLA-DR4Dw4 und/oder HLA-DR4wl4 und/oder HLA-DR1. Man nimmt an, daß die mit Autoimmunkrankheit assoziierten MHC-Moleküle an bestimmte Eigenantigene binden und diese T-Zellen präsentieren und somit eine Autoimmunantwort stimulieren. Andere Peptide, die an die Autoimmunassoziierten MHC-Moleküle binden können und/oder entweder die Bindung von Eigenantigenen verhindern oder bereits gebundene Eigenantigene verdrängen und/oder die die T-Zellaktivierung (vor allem die Aktivität pathogener T-Zellen (z.B. Th-1-Zellen)) hemmen und/oder die Aktivität schützender T-Zellen (z.B. Th-2-Zellen) oder von Peptiden, die mit MHC-Molekülen über einen alternativen Wirkmechanismus wechselwirken, um so die Stimulierung einer von den MHC-Molekülen vermittelten Autoimmunantwort zu vermeiden oder zu verändern, können eine Autoimmunantwort spezifisch unterdrücken.
Ein derartiges Mittel würde eine Therapie der Autoimmunkrankheit bieten, während eine allgemeine Unterdrückung des Immunsystems vermieden würde und somit schädigende Nebenwirkungen begrenzt wären. Diese Art von Profil hätte signifikante Vorteile gegenüber der derzeitigen Therapie für Krankheiten, wie z.B. rheumatoide Arthritis. Es ist gängige Praxis, rheumatoide Arthritis anfangs mit symptommindernden Mitteln, wie z.B. NSAIDs, zu behandeln, die keine günstige Wirkung auf den Krankheitsverlauf besitzen und oftmals mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden sind. Die Behandlung einer schwereren Erkrankung stützt sich auf die Verwendung sogenannter Mittel in zweiter Linie. Bei diesen handelt sich oftmals um allgemeine zytotoxische Verbindungen, die eine beschränkte Wirksamkeit aufweisen und schwere Toxizitätsprobleme verursachen können. Ein krankheitsveränderndes Mittel auf rationaler Grundlage ohne eine assoziierte nichtspezifische Zytotoxizität würde daher signifikante Vorteile bei der Behandlung der rheumatoiden Arthritis liefern.
Aus den internationalen Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern WO 92/02543, WO 93/05011 und WO 95/07707 sind Peptide bekannt, die an MHC-Moleküle binden und die T-Zellaktivierung hemmen. Dabei betrifft WO 95/26980 MHC-bindende Trägerpeptide, die zur Bindung von MHC (major histocompatibility complex)-Klasse-I- oder -Klasse-II-Antigenen fähig sind und mit einem oder mehreren Haptenmolekülen verknüpft sind, die an die Trägerpeptide kovalent gebunden sind und bei denen es sich um Katecholderivate handelt, die von Urushiolspezifischen T-Lymphozyten erkannt werden. Von Alexander J. et al (Immunity, 1994, Bd. 7, Seiten 751-761) werden Polyalaninpeptid-Epitope dargestellt, die ihre Kapazität zur Bindung von Maus-Klasse-II-Molekülen je nach dem Seitenkettensubstitutionsmuster der beteiligten Aminosäuren ändern. Bei der Bindung von Peptiden an MHC findet die kritische Wechselwirkung zwischen den Seitenketten einiger weniger Peptidreste statt, wobei die Taschen in der Peptidbindungsfurche des MHC lokalisiert sind.
Obwohl eine Reihe von Peptiden entdeckt wurde, die die auf HLA-DR beschränkte T-Zellaktivierung durch Bindung an HLA-DR-Moleküle hemmen, besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Verbindungen, die an solche Moleküle binden und/oder entweder die Bindung von Eigenantigenen verhindern oder bereits gebundene Eigenantigene verdrängen und/oder die T-Zellaktivierung hemmen und/oder die Aktivität schützender T-Zellen erhöhen oder die mit MHC-Molekülen über einen alternativen Wirkmechanismus wechselwirken, um so die Stimulierung einer Autoimmunantwort, durch die eine Krankheit oder ein Krankheitszustand, auf die bzw. den oben Bezug genommen wird, verursacht wird, zu verhindern oder zu verändern.
Es wurde nun gefunden, daß die Peptidderivate der vorliegenden Erfindung (wie sie unten aufgeführt sind) überraschenderweise solche pharmakologisch sinnvollen Eigenschaften besitzen und dies eine Grundlage für die vorliegende Erfindung darstellt.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Peptidderviat der Formel I (im folgenden aufgeführt) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereitgestellt,
wobei
P für einen hydrophoben Rest steht;
AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen 1, 2 oder 3 der Reste AA¹, AA⁴ und AA⁷ ausgewählt sind aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II (unten aufgeführt)
und wobei
n eine ganze Zahl 1,2,3 oder 4 darstellt;
X für -NH-CO-, -CO- (Carbonyl) oder -O.CO-(Oxycarbonyl) steht;
R¹ und R² ausgewählt sind aus (A), (B) und (C), wobei

(A) für eine Gruppe der Formel – (CH₂)_a-CO-N(R³)(R⁴) steht, in der a eine ganze Zahl 1 oder 2 bedeutet und R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Gruppe – [(CH₂)_bO]_m-R^a, in der R^a für Methyl oder Ethyl steht und m eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; b 2 oder 3 ist, wenn m 1 ist, und der Wert für b in jeder -(CH₂)_bO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn m 2, 3, 4 oder 5 ist;
(B) für eine Gruppe der Formel – (CH₂)_cO(CH₂)_d-CO-N(R⁵)(R⁶) steht, in der c eine ganze Zahl 2 oder 3 bedeutet, d eine ganze Zahl 1, 2, oder 3 bedeutet und R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Gruppe – [(CH₂)_eO]_p-R^b, in der R^b für Methyl oder Ethyl steht und p eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; e 2 oder 3 ist, wenn p 1 ist, und der Wert für e in jeder – (CH₂)_eO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn p 2, 3, 4 oder 5 ist; und
(C) für eine Gruppe der Formel -[(CH₂)_fO]_g-R⁷ steht, in der R⁷ für Methyl oder Ethyl steht und g eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; f 2 oder 3 ist, wenn g 1 ist, und der Wert für f in jeder -(CH₂)_fO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn g 2, 3, 4, oder 5 ist;

¹

²

³

⁶

⁷

⁸

¹

⁷

⁴

⁵

¹

²

³

⁴

⁵

⁸

¹

⁴

⁶

⁷

₂

¹

(1) einer Gruppe der Formel -A²-B²-, in der A² für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen und B² für (1-4C)Alkylen steht oder A² für Methylen und B² für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen steht; und
(2) einer Gruppe der Formel -A³-B³-C³-, in der A³ für Methylen, B³ für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen und C³ für (1-3C)Alkylen steht; und

¹

₂

Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Peptidderivat der Formel I (unten aufgeführt) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereitgestellt, wobei AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen einer der Reste AA¹, AA⁴ und AA⁷ ausgewählt ist aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II (unten aufgeführt), wobei n, X, R¹ und R² eine der oben angegebenen Bedeutungen aufweisen; oder AA¹, AA², AA³, AA⁶, AA⁷ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen einer der Reste AA¹ und AA⁷ ausgewählt ist aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der oben angegebenen Bedeutung und AA⁴ zusammen mit AA⁵ eine Gruppe der Formel IIIa mit der oben angegebenen Bedeutung bilden; oder AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen einer der Reste AA¹ und AA⁴ ausgewählt ist aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der oben angegebenen Bedeutung und AA⁶ zusammen mit AA⁷ eine Gruppe der Formel IIIa mit der oben angegebenen Bedeutung bilden; und P und Q einen der oben angegebenen Werte aufweisen.
Es versteht sich, daß eine Aminosäure von Q unabhängig D- oder L-Stereochemie aufweisen kann. Weiterhin versteht es sich, daß wenn Q Hydroxyl (OH) bedeutet, es sich dabei um die Hydroxylgruppe der C-terminalen Aminosäure AA⁸ handelt. Analog dazu, wo Q als NH₂, NRcRd, Piperazinyl, Piperidyl usw. definiert ist, bedeutet dies, daß die Hydroxylgruppe der C-terminalen Aminosäure AA⁸ durch eine solche Gruppe ersetzt ist. Es versteht sich ebenso, daß mit der Bezeichnung Aminosäure eine Alpha-Aminosäure gemeint ist. Ebenso versteht sich, daß die Bezeichnung L-Aminosäure auch Aminosäuren, wie z.B. Gly, 2,2-Diethyl-Gly, Azaalanin und Azaglycin, die kein chirales Kohlenstoffatom aufweisen, umfaßt. Weiter versteht sich, daß Oberbegriffe, wie zum Beispiel „Alkyl" sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige Varianten umfassen, wenn dies die Anzahl der Kohlenstoffatome gestattet. Die gleiche Regelung trifft auf andere Reste zu.
Weiter ist ersichtlich, daß, wenn R¹ und R² jeweils für Gruppen der Formel (A) stehen, die Werte für a, R³ und R⁴ in R¹ gleich oder verschieden von denen in R² sein können. Analog dazu können, wenn R¹ und R² jeweils für Gruppen der Formel (B) stehen, die Werte für c, d, R⁵ und R⁶ in R¹ gleich oder verschieden von denen in R² sein, und die Werte für f, g und R⁷ in R¹ können gleich oder verschiedenen von denen in R² sein, wenn R¹ und R² jeweils für Gruppen der Formel (C) stehen.
Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß Verbindungen mit einem chiralen Zentrum in Form eines Razemates (oder eines Gemischs aus Diastereoisomeren, wenn mehr als ein chirales Zentrum vorliegt) oder als ein optisch aktives Enantiomer oder Diastereomer existieren können. Ebenso ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß eine bestimmte, mit einem razemischen oder diastereomeren Gemisch assoziierte biologische Aktivität weitgehend oder alleinig von einem einzigen optisch aktiven Isomer herrühren kann. Daher versteht es sich, daß die Erfindung alle Formen eines Peptidderivats der Formel I betrifft, die die vorstehend erwähnten pharmazeutisch geeigneten Eigenschaften besitzen. Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, wie man ein einziges optisch aktives Isomer erhält, beispielsweise durch Trennung von einem das Isomer enthaltenden razemischen oder diastereomeren Gemisch unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie z.B. Chromatographie, oder durch chirale Synthese unter Verwendung eines geeigneten optisch aktiven Ausgangsmaterials oder einer geeigneten optisch aktiven Zwischenverbindung, wie hier beispielhaft dargestellt. Ebenso ist im Fachgebiet allgemein bekannt, wie man die pharmakologischen Eigenschaften solcher razemischen oder diastereomeren Gemische sowie der einzelnen optisch aktiven Isomere bestimmt, beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Tests. Der Fachmann ist daher leicht dazu in der Lage, die jeweiligen Isomere der Peptidderivate der Formel I mit den hier bezeichneten günstigen pharmakologischen Eigenschaften zu erhalten. Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung ebenso alle polymorphen Formen, alle Tautomere oder alle Solvate bzw. alle Gemische davon eines Peptidderivats der Formel I, das die hier bezeichneten günstigen pharmakologischen Eigenschaften besitzt, umfaßt.
Geeignete unabhängige Werte für die Aminosäurereste AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷ und AA⁸, wenn es sich bei diesen nicht um einen Rest der Aminosäure der Formel II handelt oder sie Teil einer Gruppe der Formel III, IIIa, IV, IVa, V oder Va darstellen, umfassen beispielsweise diejenigen für die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, die mittels des genetischen Codes codiert sind, insbesondere Alanin (Ala), Glutaminsäure (Glu), Glycin (Gly), Histidin (His), Isoleucin (Ile), Lysin (Lys), Asparagin (Asn), Glutamin (Gin), Arginin (Arg), Threonin (Thr), Valin (Val) und Prolin (Pro). Reste von Aminosäuren, wie z.B. Sarcosin (Sar), 3,3,3-Tri-fluoralanin, 2,2-Diethylglycin, 2,3-Diaminopropansäure (Dap), 2,4-Diaminobutansäure (Dab), 2-Aminobutansäure (Abu), Homoarginin, Homophenylalanin, trans-4-Hydroxyprolin (Hyp), Azaalanin [H₂N-N(CH₃)-COOH; Azala], Azaglycin [H₂N-NH-COOH; Azgly], 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic), Octahydroindol-2-carbonsäure (Oic), Decahydroisochinolin-3-carbonsäure (Dic) sind ebenfalls geeignet. (Mit der Bezeichnung Dic sind diejenigen Formen gemeint, bei denen die beiden Ringverknüpfungen entweder die R-Konfiguration oder die S-Konfiguration aufweisen). Reste der entsprechenden N²-methylierten Aminosäuren können ebenso verwendet werden, genauso wie Reste der entsprechenden Aminosäuren, in denen eine freie Seitenkettencarbonsäurefunktion verestert ist (z.B. als (1-6C)Alkyl- oder Benzylester) und eine freie Seitenkettenaminogruppe alkyliert (z.B. methyliert), acetyliert oder in ein Carbamat (z.B. ein Alkyl- (wie etwa Methyl- oder Ethyl-), Phenyl- oder Benzylcarbamat) umgewandelt ist. Weitere geeignete Werte umfassen beispielsweise Reste von 2-substituiertem Gylcin, worin es sich bei dem 2-Substituenten um eine Gruppe der Formel -(CH₂)_sNH2 mit s gleich 1 bis 3, oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_pN(Re)₃ ⁺X^–, wobei p gleich 2 bis 4 ist und X^– für ein Gegenion (wie etwa Acetat, Trifluoracetat, Hydroxid oder Chlorid) steht, oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_qN(Re)₂ mit q gleich 0 bis 4 oder eine Gruppe der Formel – (CH₂)_rN=C[N(Re)₂]₂, wobei r gleich 1 bis 4 ist und wobei in den letzten drei Gruppen Re jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff und (1-4C)Alkyl (wie etwa Methyl oder Ethyl), handelt.
Bei dem hydrophoben Rest P (der, wie ersichtlich ist, an die Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure AA¹ gebunden ist) handelt es sich um eine hydrophobe aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder gemischt aliphatische/aromatische oder aliphatische/heteroaromatische organische Gruppe aus 5 bis 20 Kohlenstoffatomen (sowie 1, 2 oder 3 Heteroatomen, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, bei heteroarylhaltigen Gruppen), beispielsweise eine Gruppe der Formel R-, R.CO-, R.SO₂-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- und R.CS-, in der R beispielsweise (5-10C)Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Aryl-(2-10C)alkyl, Heteroaryl-(2-10C)alkyl, Diaryl-(2-8C)alkyl, Aryl-(2-10)alkenyl, Arylcyclopropyl, (5-10C)Cycloalkyl, (5-10C)Cycloalkyl-(2-6C)alkyl, 3-Biphenyl, 4-Biphenyl, 4-Cyclohexylphenyl, 2-Naphthyloxymethyl, 3-Naphthyloxymethyl, Phenoxyphenyl und Tetrahydronaphthyl, wobei eine Aryl- oder Heteroarylgruppe der Werte R für 3 einen oder mehrere (1-4C)Alkyl-, Halogen-, Cyano- oder (1-4C)Alkoxysubstituenten tragen kann. Eine besondere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt beispielsweise Verbindungen der Formel I, in der P für R.CO- mit der oben angegebenen Bedeutung steht. Eine weitere besondere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt beispielsweise Peptidderivate der Formel I, wobei P für eine hydrophobe aliphatische, aromatische oder aliphatisch/aromatische organische Gruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen steht.
Zu besonderen Werten für R gehören beispielsweise, wenn es sich dabei um (5-10C)Alkyl handelt: Pentyl; Isopentyl, tert.-Pentyl, 2-Methylpentyl, Hexyl, Isohexyl, 5-Methylhexyl und Octyl; wenn es dabei um Aryl handelt: Phenyl, Naphthyl und Indenyl; wenn es sich um Heteroaryl handelt: 2-, 3-, 5- oder 6-Indolyl, 2-, 3-, 5- oder 6-Indolinyl, 2-, 3-, 5- oder 6-Benzo[b]-thiophenyl, Thienyl, 2-, 4- oder 5-Benzothiazolyl, 2-, 4- oder 5-Benzoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1,4-Benzodioxanyl, gebunden in 2-, 3-, 6- oder 7-Stellung, und 2-, 3-, 5- oder 6-Benzofuranyl; wenn es sich um Aryl-(2-10C)alkyl handelt: Aryl-(2-6C)alkyl (wobei der Arylanteil beispielsweise alle für Aryl oben angegebene spezifische Werte und (2-6C)Alkylanteil beispielsweise Methylen, Ethylen, Trimethylen, Tetramethylen und Pentamethylen umfaßt), wie etwa 2-Phenylethyl, 3-Phenylpropyl, 4-Phenylbutyl und 5-Phenylpentyl; wenn es sich um Heteroaryl-(2-10C)alkyl handelt: Heteroaryl-(2-6C)alkyl (wobei der Heteroarylanteil beispielsweise alle für Heteroaryl oben angegebene spezifische Werte und der (2-6C)Alkylanteil beispielsweise Methylen, Ethylen, Trimethylen, Tetramethylen und Pentamethylen umfaßt), wie etwa in 2-(2-Cyanobenzo [b] thiophen-5-yl)ethyl; wenn es sich Diaryl-(2-8C)alkyl handelt: Diaryl-(2-6C)alkyl, wie z.B. 2,2-Diphenylethyl, 3,3-Diphenylpropyl und 4,4-Diphenylbutyl; wenn es sich um Aryl-(2-10C)alkenyl handelt: Aryl-(2-6C)alkenyl, wie etwa Styryl, 3-Phenylpropen-2-yl und 4-Phenylbuten-1-yl; wenn es sich um Arylcyclopropyl handelt: Phenylcyclopropyl, 1-Naphthylcyclopropyl und 2-Naphthylcyclopropyl; wenn es sich um (5-10C)Cycloalkyl handelt: Cyclopentyl, Cyclohexyl und 1-Adamantyl; und wenn es sich um (5-10C)Cycloalkyl-(2-6C)alkyl handelt: 2-(Cyclohexyl)ethyl, 3-(Cyclohexyl)propyl und 4-(Cyclohexyl)butyl. Zu einem besonderen Wert für einen Substituenten an einer Arylgruppe von R gehören beispielsweise Metyhl, Ethyl, Chlor, Brom, Iod, Methoxy, Ethoxy und Cyano.
Bei dem hydrophoben Rest P handelt es sich auch um eine hydrophobe L-Aminosäure, wie etwa Phenylalanin (Phe), sowie um hydrierte Analoge davon, wie z.B. Cyclohexylalanin (Cha), para-Chlor-Phe, 3-(2-Thienyl)Alanin, Tyrosin (Tyr), Tyr-(O-methyl), Tryptophan (Trp), Biphenylalanin, 3-(1-Naphthyl)alanin, 3-(2-Naphthyl)alanin sowie hydrierte Analoge davon, 3-(1-Adamantyl)alanin (Ada), Glu-(O-benzyl), 3-(Benzyloxy)-Ala, 3-(Benzylsulfanyl)-Ala und 9-Fluorenyl-Gly, die jeweils am N-Terminus ggf. eine hydrophobe aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder gemischt aliphatische/aromatische oder aliphatische/heteroaromatische organische Gruppe, wie sie oben definiert oder beispielhaft dargestellt ist, tragen können. Als Alternative kann die hydrophobe Aminosäure ggf. eine weitere Sequenz aus 1 bis 3 Aminosäuren, ausgewählt aus einem der geeigneten unabhängigen Werte für AA¹ bis AA⁸ mit der oben angegebenen Bedeutung, tragen. So umfaßt beispielsweise P die jeweiligen Sequenzen Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe und Ala-Ala-Ala-Phe. Die erste Aminosäure einer solchen weiteren Sequenz aus 1 bis 3 Aminosäuren (von links nach rechts gelesen) kann eine L- oder D-Aminosäure sein und auch ggf. eine hydrophobe aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder gemischt ali phatische/aromatische oder aliphatische/heteroaromatische organische Gruppe, wie sie oben definiert oder beispielhaft dargestellt ist, tragen.
Zu weiteren besonderen Werten für P gehören beispielsweise 3-(Benzyloxycarbonyl)propionyl-Phe, 3-(Benzyloxycarbonyl)propionyl-Cha, 4-(Benzyloxycarbonyl)butyryl-Phe, 4-(Benzyloxycarbonyl)butyryl-Cha, (5-Oxo-pyrrolidin-2-yl)carbonyl-Phe-Tyr, (5-Oxo-pyrrolidin-2-yl)carbonyl-Glu-(O-benzyl)-Tyr, Acetyl-Glu-(O-benzyl)-Tyr, Diphenylmethyl.CONH.CH₂Ch₂.CO-Cha, Diphenylmethyl.CONH.CH₂CH₂.CO-Tyr, Diphenylmethyl. CONH.CH₂CH₂CH₂.CO-Cha, Diphenylmethyl. CONH.CH₂CH₂CH₂.CO-Tyr, Diphenylmethyl.NHCO.CH₂CH₂CH₂.CO-Cha, Diphenylmethyl. NHCO.CH₂CH₂CH₂.CO-Tyr, Benzyl.NHCO. CH₂CH₂.CO-Cha, Benzyl.NHCO.CH₂CH₂.CO-Tyr, N-Acetyl-4-chlor-beta-hydroxy-Phe, 4-Phenoxyphenyl.NHCO-, Benzyl.NHCO.CH₂CH₂.CO.(N-methyl -Phe), Benzyl.NHCO. CH₂CH₂.CONH.CH(CHPh₂).CO, Benzyl.NHCO.CH₂CH₂.CO-Tyr, 3,3-Diphenylpropionyl, trans-Cinnamoyl, 5-Phenylvaleryl und 3-(2-Cyanobenzo[b]thiophen-5-yl)propionyl.
Ein Wert für P von besonderem Interesse umfaßt beispielsweise Ph.(CH₂)₄.CO-(5-Phenylvaleryl (Phv)), Ph.(CH₂)₄.CS- und 3-(2-Cyanobenzo[b]thiophen-5-yl)propionyl.
Ein bevorzugter Wert für den hydrophoben Rest P umfaßt beispielsweise 3-(2-Cyanobenzo[b]thiophen-5-yl)propionyl und 5-Phenylvaleryl (Phv), vor allem den letzteren Rest.
Handelt es sich bei Rc um eine Gruppe der Formel -A¹-G¹, so umfaßt ein besonderer Wert für A¹, wenn es sich dabei um Alkylen handelt, beispielsweise Methylen, Ethylen, Propylen und Butylen; ein besonderer Wert für B², wenn es sich dabei um (1-4C)Alkylen handelt, umfaßt beispielsweise Methylen, Ethylen, Propylen; und ein besonderer Wert für C³, wenn es sich dabei um (1-3C)Alkylen handelt, umfaßt beispielsweise Methylen, Ethylen und Propylen.
Ein besonderer Wert für -A¹-G¹ umfaßt beispielsweise 3-Guanidinopropyl, 4-(2-Guanidinoethyl)phenyl, 4-(2-Morpholinoethyl.NH.CO.CH₂)phenyl und 4-(4-[2-(2-Hydroxyethoxy)ethyl]piperazin-1-yl.CO.CH₂)phenyl.
Ein besonderer Wert für Q, wenn es sich dabei um eine Sequenz von 1 bis 6 Aminosäureresten handelt, umfaßt beispielsweise eine Sequenz aus L-Aminosäureresten, unabhängig ausgewählt aus einem der geeigneten unabhängigen Werte für AA¹ bis AA⁸ mit der oben angegebenen Bedeutung (wie etwa Ala-Thr-Gly-OH), oder ihre D-Analoge, oder eine sowohl D- als auch L-Aminosäuren enthaltende Sequenz oder ein Amid davon, wie etwa ein von Ammoniak abgeleitetes Amid, ein (1-4C)Alkylamin (z.B. Methylamin) oder ein Di-(1-4C)alkylamin (wie etwa Dimethylamin).
Ein bevorzugter Wert für Q umfaßt beispielsweise 4-Carbarnoyl-1-piperidyl (den Rest von Piperidin-4-carboxamid (Pip-NH₂)), 4-Carboxy-1-piperidyl (den Rest von Piperidin-4-carbonsäure (Pip-OH)), 4-(Carbamoylmethyl)anilino (den Rest von 4-Aminophenylacetamid (Papa-NH₂)), 4-(Carboxymethyl)anilino (den Rest von 4-Aminophenylsäure (Papa-OH)) und 4-(2-Guanidinoethyl)anilino (den Rest von 2-(4-Aminophenyl)ethylguanidin (Pape-NHC(=NH)NH₂)). Als Werte für Q sind Pip-NH₂ und Papa-NH₂ besonders bevorzugt, vor allem Papa-NH₂.
Zu den besonderen neuartigen erfindungsgemäßen Peptidderivaten gehören beispielsweise Peptidverbindungen der Formel I mit der oben angegebenen Bedeutung, wobei:

(1) in der Formel II, n = 1 und X = -CO-:
(2) in der Formel II, n = 4 und X = -NHCO-;
(3) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (A) mit a = 1 stehen;
(4) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (A) stehen, wobei R³ und R⁴ für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel – [(CH₂)_bO]_m-R^a mit b = 2 stehen;
(5) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (A) stehen, wobei R³ und R⁴ für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel – [(CH₂)_bO]_m-R^a mit m = 1, 2 oder 3 stehen;
(6) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (B) mit c = 2 stehen;
(7) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (B) mit d = 2 stehen;
(8) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (B) stehen, wobei R⁵ und R⁶ für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel – [(CH₂)_cO]_p-R^e mit e = 2 stehen;
(9) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (B) stehen, wobei R⁵ und R⁶ für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel – [(CH₂)_eO]_p-R^e mit p = 1 stehen;
(10) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (C) mit f = 2 stehen; und
(11) in der Formel II, R¹ und R² für (die gleichen oder unterschiedliche) Gruppen der Formel (C) mit g = 3 stehen;

¹

²

³

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

Besondere Werte für R³, R⁴, R⁵ und R⁶ sowie R¹ und R², wenn diese aus einer Gruppe der Formel – [CCH₂)_fO]₈-R⁷ ausgewählt sind, umfassen beispielsweise -CH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ und -CH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃.
Zu weiteren besonderen neuartigen erfindungsgemäßen Peptidderivaten gehören beispielsweise die folgenden Peptidderivate der Formel I:

(i) P-AA¹-AA²-AA³-II-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q;
(ii) P-II-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q;
(iii) P-AA¹-AA²-AA³-IIIa-AA⁶-II-AA⁸-Q;
(iv) P-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-AA⁶-II-AA⁸-Q;
(v) P-AA¹-AA²-AA³-II-AA⁵-IIIa-AA⁸-Q; und
(vi) P-II-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-IIIa-AA⁸-Q;

¹

²

³

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

¹

²

³

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

Zu den Peptidderivaten von besonderem Interesse innerhalb von (i) bis (vi) gehören beispielsweise diejenigen, bei denen in der Formel II n = 1 oder 2, X = Carbonyl ist und R¹ und R² jeweils für Gruppen der Formel (C) (wobei vor allem f = 2, g = 3 und/oder R⁷ = Methyl, wie etwa -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃) oder jeweils für Gruppen der Formel (A) (wobei vor allem a = 1, b = 2, m = 1 oder 3 und/oder R⁸ = Methyl, wie etwa -CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂) oder -CH₂CON[(CH₂CH₂O)₃CH₃]₂ stehen. Von den Gruppen (i) bis (vi) sind die Peptidderivate der Gruppen (i) und (v) von besonderem Interesse. Zu den bevorzugten Peptidderivaten gehören beispielsweise Verbindungen der Gruppe (v), bei denen in der Formel II n = 1, X = Carbonyl und R¹ und R² jeweils für Gruppen der Formel (A) stehen.
Zu den bevorzugten Werten für AA¹ bis AA⁸ (wenn es sich bei AA¹, AA⁴ oder AA⁷ nicht um einen Rest der Aminosäure der Formel II und wenn es sich bei AA⁴ zusammen mit AA⁵ oder AA⁶ zusammen mit AA⁷ nicht um Gruppen der Formeln III, IIIa, IVa, V oder Va handelt) gehören beispielsweise

AA¹, ausgewählt aus Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ und 3,3,3-Trifluoralanin, insbesondere Ala, Ile, Arg, Gap, GapMe₄, vor allem Ala, Arg und Ile und ganz besonders Ala und Arg;
AA², ausgewählt aus Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-Trifluoralanin und N⁶-Diethyl-Lys, insbesondere Ala, Arg, Ile, Lys und Tic, vor allem Ala, Arg, Ile und Tic und ganz besonders Ala und Arg;
AA³, ausgewählt aus Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn und N³-Diethyl-Dap, insbesondere Ala, His, Asp und Asn, vor allem Ala und Asn und ganz besonders Ala;
AA⁴, ausgewählt aus Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His und N⁶-Diethyl-Lys, insbesondere Ala, Arg, Lys und His, vor allem Ala, Arg und His und ganz besonders Ala;
AA⁵, ausgewählt aus Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser und N³-Diethyl-Dap, insbesondere Thr, Val und Dap, vor allem Thr und Val;
AA⁶, ausgewählt aus Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His und Dap (vor allem Ala und Pro);
AA⁷ ausgewählt aus Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic und Dic (vor allem Ala und Arg); und
AA⁸, ausgewählt aus Ala, Gly, Dap, Azaalanin und Azaglycin, insbesondere Ala, Gly und Azagylcin und vor allem Ala und Gly. (Die Bezeichnung Gap bezieht sich auf den Rest -NH.CH[CH₂NH.C(=NH).NH₂].CO-, und die Bezeichnung GapMe₄ bezieht sich auf den Rest -NH.CH(CH₂N=C[N(CH₃)₂]₂).CO-.)

Zu weiteren besonderen unabhängigen Gruppen von erfindungsgemäßen Peptidderivaten gehören beispielsweise Peptidderivate der Formel I, wobei ein 1 oder 2 der Reste AA¹, AA⁴ und AA⁷ ausgewählt sind aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der oben angegebenen Bedeutung und es sich bei den übrigen Resten von AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷ und AA⁸ um Reste von L-Aminosäuren (einschließlich der geeigneten, spezifischen und bevorzugten Werte mit der oben angegebenen Bedeutung) handelt.
Enthält ein Peptidderivat der Formel I eine Gruppe der Formel III, IV, IVa oder V, so gehören zu den besonderen Werten für Ra in der Formel III und Rb in den Formeln IV und IVa sowie Rz in der Formel V, wenn es sich dabei um Alkyl, Methyl, Ethyl, Propyl und Isopropyl handelt. Unter den Peptidderivaten, die eine Gruppe der Formel III, IIIa, IV, IVa, V oder Va enthalten, sind diejenigen mit einer Gruppe der Formel IIIa bevorzugt.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt Peptidderivate der Formel I, die einen Argininrest enthalten, insbesondere Verbindungen, bei denen AA¹ oder AA² für Arginin steht (wie z.B. Verbindungen, bei denen die Teilsequenz AA¹-AA²-AA³ Ala- Arg-Ala oder Arg-Ala-Ala ist).
Zu den erfindungsgemäßen Peptidderivaten von besonderem Interesse gehören beispielsweise die spezifischen Ausführungsformen, die unten in den beigefügten Beispielen aufgeführt sind. Von diesen sind die Peptidderivate der Beispiele 3 und 6 von besonderer Bedeutung, wobei diese Verbindungen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als weitere erfindungsgemäße Merkmale bereitgestellt werden.
Beispiel 3
Beispiel 6
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt eine ggf. (beispielsweise mit Fmoc) geschützte Aminosäure der Formel II, wobei n, X, R¹ und R² jeweils einen der Werte, einschließlich der besonderen und bevorzugten Werte, mit der oben angegebenen Bedeutung aufweisen.
Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen zählen beispielsweise bei Peptidderivaten, die ausreichend basisch sind, zum Beispiel diejenigen mit einer freien Aminogruppe, Salze mit Säuren, die physiologisch unbedenkliche Anionen bilden, wie z.B. Salze mit Mineralsäuren, beispielsweise Wasserstoffhalogenide (wie Chlorwasserstoff und Bromwasserstoff), Sulfon- und Phosphonsäuren, und mit organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandel-, p-Toluolsulfon-, Methansulfon-, Trifluoressigsäure und dergleichen, und bei Peptidderivaten, die ausreichend sauer sind, beispielsweise diejenigen, die eine freie Carbonsäuregruppe aufweisen, Salze mit Basen, die physiologisch annehmbare Kationen bilden, wie z.B. Salze mit Alkalimetallen (wie Natrium und Kalium), Erdalkalimetallen (wie Magnesium und Calcium), Aluminium- und Ammoniumsalze, sowie Salze mit geeigneten organischen Basen wie Ethanolamin, Methylamin, Diethylamin, Isopropylamin, Trimethylamin und dergleichen.
Wie oben angegeben haben die Peptidderivate der Formel I bzw. deren pharmazeutisch annehmbare Salze eine nützliche pharmakologische Wirkung in Warmblütern (einschließlich des Menschen) bei einer Reihe von Autoimmunkrankheiten oder medizinischen Zuständen, bei der Behandlung von Symptomen oder als krankheitsmodifizierende Mittel oder als prophylaktische Behandlung. Zu diesen Krankheiten können beispielsweise rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Goodpasture-Syndrom, idiophatische thrombozytopenische Purpura, die juvenile Form der chronischen Polyarthritis, Zöliakie, systemischer Lupus erythematosus, Morbus Bechterew, Sjögren-Syndrom, Myasthenia gravis pseudoparalytica, Typ-1-(insulinabhängiger) Diabetes, Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Basedow, Addison-Krankheit, Skleroderm, Polymyositis, Dermatomyositis, Pemphigus vulgaris, bullöses Pemphigoid, autoimmunhämolytische Anämie, perniziöse Anämie, Glomerulonephritis, Graftabstoßungen und dergleichen, insbesondere rheumatoide Arthritis und multiple Sklerose zählen.
Die Nützlichkeit der Peptidderivate der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon läßt sich unter Anwendung einer Vielzahl von Standardtests und klinischen Studien einschließlich der in den internationalen Patentanmeldungen mit den Publikationsnummern WO 92/02543, WO 93/05011 und WO 95/07707 beschriebenen (oder Modifikationen davon) und den unten beschriebenen beurteilen. Die Peptidderivate der Formel I zeigen in einem oder mehreren dieser Tests bzw. Studien eine beträchtliche Wirkung.
Test A: in-vitro-Bindungsassay mit gereinigtem HLA-DR-Peptid. (Mit diesem Assay kann die Bindung von Peptidderivaten der Formel I an mit Krankheiten assoziierten MHC-Klasse-II-Molekülen gezeigt werden.) 30 μl Biotin-FHA_307-320 (FHA-307-320-Peptid, das am N-Terminus mit langkettigem Biotin derivatisiert ist, Biotin-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) wird in einer Konzentration von 800 nM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 30 μl gereinigtem HLA-DR4Dw4 in einer Konzentration zwischen 0,5 und 5 μg/ml in Mikrotiterplatten mit V-förmigen Vertiefungen (Nunc) 48 Stunden lang mit oder ohne Inhibitorpeptiden inkubiert. Nach der Inkubationszeit werden 100 μl des Inkubats auf Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay-(ELISA-)Platten (Nunc) übertragen, die zuvor mit einem Anti-MHC-Antikörper (L243 – American Type Culture Collection (ATCC) HB55, wie in Lampson und Levy (1980), J. Immunol. 125, 293-299, beschrieben) 1 Stunde lang bei einer Konzentration von 10 μg/ml bei Raumtemperatur beschichtet und anschließend 1 Stunde mit 1% Rinderserumalbumin (RSA) in PBS und 0,05% Tween 20 blockiert worden waren. Nach einer weiteren Stunde wird ungebundenes Peptid ausgewaschen, und bei Raumtemperatur wird 2 Stunden lang mit einer 1/4000-Verdünnung von Streptavidinperoxidase (Sigma) in PBS mit 0,01% eines geeigneten Tensids wie NP-40 (Sigma) versetzt. Nach weiterem Waschen wird auf die einzelnen Platten jeweils Tetramethylbenziden-(TMB-)Substratlösung (1 TMB-Tablette (Sigma) in 10 ml 0,1 M Citrat/Acetat-Puffer, pH 6,0, mit 36 μl Harnstoff-Wasserstoffperoxid (UHPO) (Fluka)) gegeben. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 2 M Schwefelsäure (10 μl pro Vertiefung) gestoppt, und zur Quantifizierung der Menge an gebundenem Peptid wird die Extinktion bei 450nm abgelesen. Die hemmende Wirkung der Peptide erhält man, indem man die Extinktion gegen die Konzentration aufträgt.
Das gereinigte HLA-DR4Dw4 läßt sich wie folgt erhalten:
(i) Expression von HLA-DR im Baculovirussystem
Die Expression rekombinanter Proteine von Baculovirusvektoren in Insektenzellen ist ein etabliertes Verfahren, mit dem man hohe Ausbeuten an rekombinantem Protein erhält [Luckow, VA & Summers, MD (1988) Biotechnology 6 47-551]. Damit die Expression des heterodimären HLA-DR, z.B. HLA-DR4Dw4, aus einem einfach-rekombinanten Baculovirusvektor möglich ist (im Gegensatz zu dem Verfahren, bei dem man getrennte rekombinante Viren für die α- und die β-Ketten hat und dann eine Koinfektion durchführt), wird ein doppelt-rekombinantes Baculovirus konstruiert, das sowohl die α- als auch die β-Ketten trägt.
Man kloniert eine cDNA, die für die Sequenz des α-Polypeptids kodiert, in den Transfervektor pacYM1 [Matsuura, Y; Possee, RD; Overton, HA & Bishop, DHL (1987) J. Gen. Virol., 68, 1233-1250], wodurch die Expression des Proteins vom Polyhedrinpromotor kontrolliert wird. Die Einheit wird durch homologe Rekombination in Sf21-Insektenzellen in das Baculovirusgenom insertiert, wodurch ein einfachrekombinantes Baculovirus für die α-Kette erzeugt wird. Die Vorgehensweisen für die Kultivierung und Infektion von Insektenzellen, für die homologe Rekombination und die Detektion/Isolierung von rekombinanten Viren sind alle umfassend von Summers, MDD & Smith GE (1987) [A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures; Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin Nr. 1555] beschrieben worden. Die molekulargenetischen Methoden, die bei der Konstruktion der rekombinanten Vektoren zum Einsatz kommen, sind ebenfalls leicht aus der Literatur zugänglich und am umfassendsten von Sambrook, J; Fritsch, EF & Maniatis T, (1989) [Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press] beschrieben.
Ein doppelt-rekombinantes Baculovirus erhält man, indem man eine für die β-Kette codierende cDNA in den Transfervektor pAcUW1 [Weyer, U; Knight, S & Possee, RD (1990) J. Gen. Virol., 71, 1525-1534] kloniert, wodurch die Expression vom P10-Promotor kontrolliert wird. Die Einheit wird dann in das Genom des einfachrekombinanten Baculovirus, das die α-Kette trägt, inseriert. Doppelt-rekombinante Viren werden nachgewiesen, indem man mit zufällig aus der Transfektion ausgewählten Viren infizierte Insektenzellen auf Membranen auftüpfelt und mit einem monoklonalen Antikörper, z.B. L243, der das HLA-DR-Heterodimer spezifisch erkennt, reagieren läßt. Die Bindung des Antikörpers an Sf21-Insektenzellen wird mit durchflußzytometrischen Standardverfahren, die aus der Literatur leicht zugänglich sind, nachgewiesen. Stabile, doppelt-rekombinante Baculoviren, die HLA-DR exprimieren, werden plaque-gereinigt.
(ii) Aufreinigung von HLA-DR aus Insektenzellen
Bei dem verwendeten Verfahren handelt es sich um eine Modifikation des von Gorga et al. 1987 beschriebenen Verfahrens (Gorga et al. 1987. J. Biol. Chem. 262, 16087-16094). HLA-DR-exprimierende Baculovirus/Sf21-Zellen (10 l, was ungefähr 2 × 10¹⁰ Zellen entspricht) werden in 100 ml 5 mM EDTA (Natriumsalz), 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 2% NP40, 150 nM NaCl, 1 mM Iodacetamid, 1 mM PMSF durch Homogenisieren mit 10 Hüben eines Teflon-Glas-Homogenisierers solubilisiert. Das Homogenat wird 1 Stunde lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Überstand wird abgenommen. Mit dem Überstand wird über Nacht der monoklonale Anti-HLA-DR-Antikörper LB3.1 (Gorga et al. 1986, Cell. Immunol. 103, 160-172), kovalent gekoppelt in einem Verhältnis von 50 mg L243 zu 10 ml Protein-A-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) und vorinkubiert mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% NP-40, inkubiert. Das Harz wird dann in eine Säule gefüllt und mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% NP-40 (20 Säulen Volumina) und anschließend mit 0,15 M NaCl, 50 nM Na₂HPO₄, pH 7.0, 1% Octylglucosid (20 Säulen Volumina) gewaschen. Das HLA-DR wird mit 50 mM Diethylamin, pH 11,0, 0,15 M NaCl, 1% Octylglucosid eluiert. Die Säulenfraktionen werden sofort mit 1 M Tris-HCl, pH 8,0, neutralisiert und durch Ultrazentrifugation durch eine Centricon-10-Membrane eingeengt. Der Proteingehalt wird durch einen BCA-Proteinassay (Pierce) und die Reinheit durch SDA-PAGE-Elektrophorese bestimmt.
Im allgemeinen zeigten die in Test A getesteten Peptidderivate der oben definierten Formel I bei einer Konzentration von etwa 10 μM oder wesentlich weniger eine signifikante Inhibierung.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptidderivat der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, das sich nicht an HLA-DR3 bindet, sondern HLA-DR1 und/oder HLA-DR4Dw4 und/oder HLA-DR4-Dw14 bindet. Bei HLA-DR3 handelt es sich um ein häufig vorkommendes HLA-DR-Allel, das nicht mit rheumatoider Arthritis in Zusammenhang gebracht wird. Demgemäß wird bei Patienten mit rheumatoider Arthritis, die HLA-DR3 als eines ihrer Allele tragen (dies ist bei ungefähr einem Drittel aller Patienten mit rheumatoider Arthritis der Fall), ein solches Peptidderivat der Formel I die normale Rolle von HLA-DR3 in der Wirts-Schutzfunktion nicht beeinträchtigen. Die Verwendung eines solchen Peptidderivats ist daher bei der Behandlung von Patienten mit rheumatoider Arthritis besonders vorteilhaft, da es die Immunabwehr weniger unterdrückt, als dies bei einer nichtselektiven DR-bindenden Substanz der Fall wäre.
In einer Variante von Test A kann die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Peptids, sich an eines oder mehrere HLA-DR-Moleküle zu binden, wie folgt beurteilt werden:
(i) Aufreinigung von HLA-DR-Typen aus Zellinien
Bei dem Verfahren handelte es sich um eine Modifikation des von Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 16087-16094 beschriebenen Verfahrens. Humane HLA-DR-Antigene wurden aus verschiedenen Zellinien durch Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Kurz gesagt wurden 1 × 10⁹ – 5 × 10⁹ pelletierte Zellen der entsprechenden, aus Hom 2 (die Quelle für DR1), BBF (die Quelle für DR2), AVL-B (die Quelle für DR3), JAH (die Quelle für DR4Dw4), JHAF (die Quelle für DR4Dw13) oder PE117 (die Quelle für DR4Dw14) ausgewählten Zellinie bei ungefähr 4°C in 50 ml 5 mM EDTA (Natriumsalz), 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM Iodacetamid, 1 mM PMSF, durch Homogenisierung mit 10 Hüben eines Teflon-Glas-Homogenisators solubilisiert. Das Homogenisat wurde 1 Stunde lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde abgenommen. Der monoklonale Anti-HLA-DR-Antikörper LB3.1 (Gorga et al., 1986, Cell. Immunol., 103, 160-173), kovalent an CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) gebunden, wurde mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% NP-40 vorequilibriert und über Nacht mit dem Überstand inkubiert. Das Harz wurde dann in eine Säule gefüllt und mit 0, 15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Octylglucosid (20 Säulen Volumina) gewaschen. Das HLA-DR wurde mit 50 mM Diethylamin, pH 11,0, 0,15 M NaCl, 1% Octylglucosid eluiert. Die Säulenfraktionen wurden sofort mit 0,5 M HEPES-NaOH, pH 7,4, neutralisiert. Der Proteingehalt wurde durch einen Biorad-Proteinassay und die Reinheit durch SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmt.
(ii) Bestimmung der selektiven Bindung der Peptide
200 nM Biotin-FHA_307-320 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden in Mikrotiterplatten mit V-förmigen Vertiefungen (Nunc) mit oder ohne Inhibitorpeptiden in Assaypuffer (PBS, 0,01% NP40 (Sigma)) entweder mit gereinigtem HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dw13 oder DR4Dw14 (2-20 μg/ml) inkubiert. Bei der Inhibierung von DR3 wurden 400 nM Biotin-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH mit gereinigtem DR3 (20 μg/ml) inkubiert und wie oben inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Inkubate behandelt, und die Extinktionen wurden wie in Test A beschrieben abgelesen. Die Hemmwirkung der Peptide, ausgedrückt als IC₅₀-Werte, wurde mit Microcal-Origin-Software auf einem PC berechnet.
Test B: Inhibierung der T-Zellen-Aktivierung in vitro. (Mit diesem Assay läßt sich die Fähigkeit der Peptidderivate der Formel I zur Inhibierung einer durch oder über ein MHC-Klasse-II-Molekül vermittelten T-Zellen-Immunreaktion zeigen).
Die Inhibitorpeptide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Stimulierung der murinen B52.24-T-Zellen-Hybridomalinie, die auf das durch HLA-DR4Dw4-Moleküle präsentierte FHA_307-320-Peptid (H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) anspricht, zu blockieren. B52.24 wurde durch Fusion von aus mit FHA_307-320 immunisierten HLA-DR4Dw4-transgenen Mäusen (internationale Patentanmeldung mit der Publikationsnummer WO 95/03331) entnommenen Lymphknoten-T-Zellen mit der murinen BW5147-T-Zellen-Lymphomalinie (White et al (1989) J. Immunol. 143, 1822), wie von Woods et al. (1994) J. Exp. Med. 180, 173-181 umrissen, und entsprechend der allgemeinen, in Current Protocols in Immunology, Band 2, 7.21 angegebenen Methoden für die Herstellung von T-Zellen-Hybridomen hergestellt.
Die Inhibitorpeptide wurden in Konzentrationen zwischen 100 und 0,1 μM (oder darunter) in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc) in einem Endvolumen von 100 μl mit dem antigenen Peptid FHA_307-320, entweder in verschiedenen Konzentrationen zwischen 100 und 0,1 μM oder in einer festgelegten Konzentration von 10 μM durch Verdünnen mit RPM1-1640-Kulturmedium (Gibco) gemischt. HLA-DR4Dw4-exprimierende B-Zellen, wie die JAH-EBV-transformierte Lymphoblastoidzellinie (European Culture Collection ECACC 85102909) oder aus einem HLA-DR4Dw4-homozygotischen Individuum entnommene und mit Epstein-Barr-Virus gemäß dem in Current Protocols in Immunology 7.22.1 beschriebenen Verfahren transformierte B-Zellen wurden mit Gluteraldehyd durch 30-Sekunden-langes Suspendieren in 1%igem Gluteraldehyd (Sigma) in einer Konzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml fixiert, worauf für 3 Minuten mit dem gleichen Volumen von 200 mM Lysin (Sigma) versetzt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 g gesammelt, in RPM1-1640 gewaschen und in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in die das Antigen und die Inhibitorverbindungen enthaltenden Mikrotiterplatten zugesetzt. Die Mikrotiterplatten wurden 2 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
Die Mikrotiterplatten wurden dann mit RPM1-1640 gewaschen, durch Zentrifugieren bei 300 g und zweimaliges Absaugen, woraufhin die B52.24-T-Zellen-Hybridomalinie in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro Vertiefung in Kulturmedium (RPMI-1640, 10% fötales Kälberserum (Gibco) und 2 mM Glutamin (Gibco)) zugesetzt wurde. Die Mikrotiterplatten wurden dann weitere 2 Tage lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Platten wurden dann 10 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, und aus allen Vertiefungen wurden jeweils 150 μl Überstand abgenommen, der vor dem Bioassay auf den Gehalt an IL-2 bei –20°C eingefroren wurde.
Man ließ die zu untersuchenden Überstände enthaltenden Kulturplatten bei Raumtemperatur auftauen, und 100 ml des Überstands wurden in frische Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden überführt. Mit Kulturmedium (RPMI-1640 (Gibco), 10% fötalem Kälberserum (Advanced Protein Products), 100 μg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin (Gibco), 2 mM L-Glutamin (Gibco) und 50 μM 2-Mercaptoethanol (Sigma)) wurden serielle 1:1-Verdünnungen von IL-2 durchgeführt, wodurch man eine Standardkurve von 250 Einheiten/ml der 0,04 Einheiten/ml IL-2-Endkonzentration erhielt. Eine IL-2-abhängige Zellinie wie CTLL-2-Zellen (Nature (1977) 268 154-156) oder HT-2-Zellen (J. Immunol. Methods (1987) 94-104) wurde geerntet und vor dem Resuspendieren auf 5 × 10⁴ Zellen/ml zweimal mit Kulturmedium gewaschen. In jede Vertiefung der Standardkurve und der Testproben wurden 100 μl der IL-2-abhängigen Zellsuspension gegeben. Die Kulturplatten wurden 72 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
Danach wurden in jede Vertiefung 20 μl (1 mCi) 3H-Thymidin (Amersham International) gegeben, und die Platten wurden weitere 16 Stunden lang in den Inkubator gelegt. Die Inhalte der einzelnen Platten wurden auf Glasfaser-Filtermatten gesammelt, und die Radioaktivität wurde mit einem Betaplate-Szintillationszähler gemessen.
Im allgemeinen zeigten die oben definierten Peptidderivate der Formel I, die in Test B getestet wurden, bei einer Konzentration von etwa 10 μM oder wesentlich weniger eine signifikante Inhibierung.
Test C: Peptidstimulierte DTH (Delayed Type Hypersensitivity, Hypersensibilität vom Spättyp) in Balb/c-Mäusen. (Mit dem Assay läßt sich die in-vivo-Aktivität von Peptidderivaten der Formel I in einem Tiermodell zeigen). Weibliche Balb/c-Mäuse (18-20 g) wurden, jeweils 5 pro Gruppe, in der Flanke subkutan mit 0,1 ml einer Emulsion von Ovalbumin (Sigma) (2 mg/ml in Kochsalzlösung), 1:1 (v/v) mit komplettem Freund-Adjuvans (Sigma) gemischt, immunisiert. Sieben Tage später wurde die Dicke der Fußsohlen mit einer Mikrometer-Schieblehre bestimmt, und eine hintere Fußsohle wurde dann durch subplantare Injektion von 30 μl von 1% hitzeaggregiertem Ovalbuminprotein in Kochsalzlösung gereizt. 24 Stunden nach der Reizung mit dem Antigen wurden die Fußsohlen gemessen, und die DTH-Reaktion wurde als prozentuale Zunahme der Dicke der Fußsohle der injizierten Fußsohle, verglichen mit der Kontrolle auf der anderen Seite, berechnet. Die Inhibitoren wurden durch osmotische 3-Tage-Minipumpen (Alzet), die 24 Stunden vor der Reizung mit dem Antigen implantiert wurden, in Dosen im Bereich von 10 mg/kg/Tag bis 0,1 μg/kg/Tag verabreicht. Das Ausmaß der Hemmung wurde durch Subtraktion des Wertes für die Anschwellung in den mit Inhibitor behandelten Fußsohlen von den Kontrollen, denen Vehikel verabreicht worden war, Teilen durch den Kontrollwert und Multiplizieren mit 100% berechnet.
Im allgemeinen zeigten die Peptidderivate der wie oben definierten Formel I, die im Test C getestet wurden, eine signifikante Inhibierung bei einer Dosis von etwa 1 mg/kg/Tag oder wesentlich weniger, ohne daß es zu einer offensichtlichen toxikologischen oder einer anderen ungünstigen pharmakologischen Wirkung kam.
Test D: (Mit diesem Assay läßt sich die in-vivo-Wirkung von Peptidderivaten der Formel I in einem Arthritis-Tiermodell zeigen).
Weibliche Balb/c-Mäuse (19-21 g, 5-10/Gruppe) werden am Tag 0 immunisiert und erhalten am Tag 7 eine Auffrischungsimpfung, durch subkutane Injektion von 0,1 ml einer Emulsion, die gleiche Teile von 2 mg/ml methyliertem Rinderserumalbumin (met-BSA Sigma) in Kochsalzlösung und komplettem Freund-Adjuvans (Sigma), ergänzt mit 2,5 mg/ml Mycobacterium tudercolosis (MTB, Stämme C, DT und PN, MAFF, Weybridge, Surrey, Großbritannien) enthält, wodurch man eine MTB-Endkonzentration von 3,5 mg/ml erhält. Gleichzeitig werden zusätzlich 0,1 ml 10⁹ Bordetella pertussis-Organismen (Wellcome-Pertussis-Impfstoff) in Kochsalzlösung als i.p.-Injektion verabreicht. Nach 14 Tagen werden die Tiere in einem Kniegelenk durch eine intraartikuläre 10 μl-Injektion, enthaltend 100 ug met-BSA in Kochsalzlösung, mit einer 30-G-Nadel und einer Hamilton-Spritze gereizt. In das Knie auf der gegenüberliegenden Seite, das als Kontrolle dient, wird ein ähnliches Volumen an Kochsalzlösung injiziert. Das Ausmaß der mit beiden Knien assoziierten Entzündung/Anschwellung wird 13 Tage später durch Vermessen mit einem Schieblehren-Mikrometer bestimmt. Dies wird erreicht, indem man mit einer Schere mit stumpfem Ende und Pinzette ungefähr 5 mm überhalb und unterhalb des Knies einen Einschnitt macht und damit entlang der Seite des Knies fortfährt, so daß ein Hautlappen gebildet wird, der dann vorsichtig weggeschnitten wird, wodurch das darunterliegende Gelenk freigelegt wird. Die Messung erfolgt am breitesten Teil des Knies, in der horizontalen Ebene, an einem gebeugten Lauf, dessen Position festgelegt ist. Die prozentuale Zunahme in dem mit Antigen injizierten Knie, verglichen mit der Kontrolle, wird gemäß der folgenden Formel berechnet: [Dicke des mit Antigen injizierten Knies – Dicke des mit Kochsalzlösung injizierten Knies/Dicke des mit Kochsalzlösung injizierten Knies] × 100. Die Inhibitoren werden mit osmotischen 14-Tage-Minipumpen (Alzet), die 24 Stunden vor der Reizung mit dem Antigen implantiert werden, in Dosen im Bereich von 10 mg/kg/Tag bis 0,1 ug/kg/Tag verabreicht. Die prozentuale Inhibierung der Entzündung/Schwellung wird aus den Dickemessungen berechnet, indem man den Wert für die Anschwellung in der mit Inhibitor behandelten Gruppe von dem der Vehikel behandelten Kontrollen subtrahiert, durch den Kontrollwert dividiert und mit 100 multipliziert. Die Krankheit wird weiterhin beurteilt nach 1) der histologischen Bewertung von Entzündung, Synovitis und Knorpel/Knochenerosionen, die an fixierten Knieabschnitten, die mit Hämotoxylin und Eosin angefärbt wurden, durchgeführt werden, und 2) der Bestimmung der Konzentrationen von Akute-Phase-Reaktanten im Serum, Serum-Amyloid P und/oder Haptoglobin.
In Test D können Peptidderivate der wie oben definierten Formel I bei einer Dosis von etwa 10 mg/kg/Tag oder wesentlich weniger eine signifikante Inhibierung zeigen.
Die pharmakologische Wirkung bestimmter Peptidderivate der Formel I wird dadurch veranschaulicht, daß die Verbindungen von Beispielen 3 und 6 in Test A (oder einer Variante des oben beschriebenen Tests A) bei einer Konzentration von 0,1 mikromolar oder weniger eine signifikante Bindung an HLA-DR4Dw4 zeigten und in Test C bei <0,1 mg/kg/Tag aktiv waren. Die Verbindung von Beispiel 3 zeigte ebenso signifikante Bindung an HLA-DR4Dw14, doch wurde bei den Verbindungen von Beispielen 3 und 6 keine signifikante Bindung (IC₅₀ > 100 mikromolar) an HLA-DR1, HLA-DR2 oder HLA-DR3 gefunden. Beide Verbindungen zeigten bei pH-Werten von 3 und 7, 6 eine gute Stabilität in wäßriger Lösung und, in Form einer extrahierten Polymerdepotformulierung, minimale Verluste aufgrund von Abbau beim Extrudieren und einen minimalen Abbau bei der Freisetzung aus einer solchen Depotformulierung.
Ein Peptidderivat der Formel I läßt sich durch ein beliebiges im Stand der Technik der Peptidchemie bekanntes Verfahren, das sich auf die Synthese analoger Peptide anwenden läßt, herstellen.
Ein Peptidderivat der Formel I läßt sich beispielsweise durch Verfahren analog den in „Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach" von Atherton and Sheppard (veröffentlicht von IRL Press, Oxford University Press, 1989), „Solid Phase Peptide Synthesis" von Stewart und Young (veröffentlicht von Pierce Chemical Company, Illinois, USA, 1984), „Principles of Peptide Synthesis" (veröffentlicht vom Springer Verlag, Berlin, 1984), und eine Buchreihe „Amino Acids, Peptides and Proteins" (Bänder 1-25; Band 25 veröffentlicht 1994) (veröffentlicht von der Royal Society of Chemistry, Cambridge, Großbritannien) erhalten.
Vorzugsweise wird ein Peptidderivat der Formel I durch sequentielle Festphasensynthese hergestellt. Wird diese Technik angewandt, so wird die Aminosäure, die die C-terminale Aminosäure des Peptids werden soll, an der alpha-Aminogruppe und, falls erforderlich, in der Seitenkette geschützt und an eine Festphase, beispiels weise ein Harz wie z.B. ein 2-Chlortritylchloridharz oder ein Merrifield-Harz (Chlormethylpolystyroldivinylbenzol) gekoppelt, wenn man nach dem Abspalten eine freie Carbonsäure erhalten will, oder ein Rink-Amidharz (4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz) oder Rink-Amid-MBHA-Harz (N-(4-[2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidonorleucyl)-4-methylbenzhydrylamin-Harz (alle von Calbiochem-Novabiochem erhältlich), wenn man nach dem Abspalten ein Carbonsäureamid erhalten will, woraufhin die Schutzgruppe an der alpha-Aminogruppe entfernt wird. Die Aminosäure, die an die C-terminale Aminosäure angeknüpft werden soll, wird an der alpha-Aminogruppe und, falls erforderlich, in der Seitenkette geschützt und an die C-terminale Aminosäure, die an die Festphase gebunden bleibt, gekoppelt. Das schrittweise Verfahren der Entschützung der alpha-Aminogruppe und der Kopplung an die nächste Aminosäure wird wiederholt, wodurch man ein an die Festphase gebundenes geschütztes oder ungeschütztes Polypeptid erhält. Eine geschützte Aminosäure der Formel II läßt sich beispielsweise wie in den Beispielen oder wie im nachfolgenden Schema 1 dargestellt oder analog dazu durch Verwendung eines symmetrischen oder unsymmetrischen Amins der Formel R¹R²NH erhalten. Amine der Formel R¹R²NH lassen sich mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren, beispielsweise wie in den Beispielen oder wie im nachfolgenden Schema 2 dargestellt oder analog dazu, erhalten. Die zur Durchführung der Reaktionsschritte des Schemata 1 und 2, wie z.B. Alkylierung von Alkoholen oder Aminen, Kupplung von Aminen und Carbonsäuren unter Bildung von Amiden, Bildung von Harnstoffen und Carbamaten sowie Schützen und Entschützen von Schutzgruppen, verwendeten Reagentien und Bedingungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und in Standardlehrbüchern beschrieben. Die Gruppe der Formel III oder IV wird in die Sequenz unter Verwendung einer entsprechend geschützten (3-Amino-2-oxo-pyrrolidin-1-yl)alkansäure (für eine Peptidverbindung mit III mit A = Methylen) oder eines entsprechenden, wie in J. Med. Chem., 1993, 36, 256-263 oder analog dazu beschriebenen Oxa-Analogs (für eine Peptidverbindung mit III, in der A für Sauerstoff steht) oder einer (6-Oxo-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)alkansäure (für eine Peptidverbindung mit IV) anstelle einer geschützten Aminosäure eingebaut. Die Gruppe der Formel V kann in die Sequenz unter Verwendung einer entsprechend geschützten, wie in J. Med. Chem., 1993, 36, 256-263 (oder analog dazu) oder wie in den nachfolgenden Beispielen (oder analog dazu) beschrieben erhaltenen 3-Amino-2-oxoperhydroazepin-1-alkansäure eingebaut werden. Das geschützte bzw. ungeschützte Polypeptid wird durch Standardverfahren von der Festphase abgespalten, beispielsweise unter Anwendung einer Mischung von Trifluoressigsäure, Triethylsilan und Wasser.
Es ist einzusehen, daß Seitenkettenschutzgruppen unter den zur Abspaltung des Peptids von der Festphase angewandten Bedingungen abgespalten werden können oder in einem separaten Schritt vor oder nach der Abspaltung des Peptids von der Festphase abgespalten werden können. Weiterhin ist einzusehen, daß man die für den Aufbau des Polypeptids angewandte Vorgehensweise modifizieren kann, indem man bei einem bestimmten Kopplungsschritt eine Sequenz von zwei oder mehr geeigneterweise geschützten Aminosäuren einsetzt. Bei der Synthese kann man sich manueller Methoden bedienen, oder man kann die Synthese automatisch durchführen, beispielsweise unter Anwendung eines Applied Biosystems 431A- oder 430A-Peptidsynthesizers oder eines Advanced Chemtech ACT357-Peptidsynthesizers oder eines ähnlichen automatischen Peptidsynthesizers, oder man kann sich einer Kombination beider Methoden bedienen.
Während des Zusammenbaus der Peptide werden die nicht an der Reaktion teilnehmenden funktionellen Gruppen der Aminosäure durch verschiedene funktionelle Gruppen geschützt. So kann man beispielsweise N-terminale Aminogruppen und Seitenkettenaminogruppen mit 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc-), t-Butoxycarbonyl-(Boc-), Biphenylisoprupoxycarbonyl-(Bpoc-), 2-[3,5-Dimethoxyphenyl]propyl-2-oxycarbonyl-(Ddz-), Adamantyloxycarbonyl-(Adoc-), Allyloxycarbonyl-(Aloc-), 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl-(Toc-), Benzyloxycarbonyl- und verschiedenen substituierten Benzyloxycarbonylgruppen schützen. Falls erforderlich, können diese Schutzgruppen durch Standardverfahren (z.B. Behandlung mit Säure oder Base, katalytische Hydrogenolyse und Behandlung mit Pd(0) oder Behandlung mit Zink/Essigsäure) abgespalten werden.
Für das Schützen von Guanidinogruppen in der Seitenkette von Peptiden, die einen Argininrest enthalten, eignen sich beispielsweise Nitro-, Adamantyloxycarbonyl-, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl-(Mtr-), 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl-(Pmc-) und (insbesondere) 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl-(Pbf-) Schutzgruppen.
Zu den für das Schützen einer Seitenkettenhydroxylgruppe geeigneten Schutzgruppen gehören t-Butyl, Benzyl und Trityl (Trt). Zu den für das Schützen der Seitenkettenimidazolgruppe in den Peptiden, die einen Histidinrest enthalten, geeigneten Schutzgruppen zählen Trityl-, Benzyl-, Tosyl-, Dinitrophenyl-, Adoc-, Boc- oder Fmoc-Gruppen.
Für das Schützen einer Seitenkettencarboxylgruppe geeignete Schutzgruppen schließen verschiedene Ester ein (z.B. Methyl, Ethyl, t-Butyl, Benzyl, Nitrobenzyl, Allyl und 9-Fluorenylmethyl).
Die Reaktionen zur Abspaltung der Schutzgruppen lassen sich bei Temperaturen im Bereich von 4°C bis 40°C (vorzugsweise bei oder um Raumtemperatur) und über eine Zeitspanne im Bereich von 10 Minuten bis 24 Stunden durchführen.
Geeignete Kopplungsmethoden, die bei der Kopplung der einzelnen Aminosäuren eingesetzt werden, schließen die gewöhnlich angewendeten Azid-, symmetrisches-Anhydrid-, gemischtes Anhydrid- und verschiedene aktivierte Ester- oder Carbodiimidmethoden ein. Bei den verschiedenen Carbodiimidmethoden (z.B. mit Dicyclohexyl- oder Diisopropylcarbodiimiden) können auch eine Reihe von Additiven (z.B. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und N-Hydroxysuccinimid) zugesetzt werden. Darüber hinaus lassen sich Aminosäurekopplungen auch durch Anwendung einer Reihe anderer Reagentien, z.B. 1H-Benzotriazol-1-yloxytrispyrrolidinophosphonium-hexafluorphosphat (PyBOP), (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU) und (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat (HBTU) erzielen. Die Kopplungsreaktionen können bei Temperaturen im Bereich von –20 bis 40°C und über eine Zeitspanne im Bereich von 10 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt werden. Als Medium für die Durchführung der Kopplungsreaktionen eignet sich beispielsweise N,N-Dimethylformamid (DMF). Besonders geeignete Methoden schließen die Verwendung von HBTU, HOBT und Diisopropylethylamin in DMF ein.
Diese und andere Methoden der Peptidsynthese sind in den internationalen Patentanmeldungen, auf die hier Bezug genommen wird, mit Beispielen belegt. Ein hydrophober Rest P, bei dem es sich um eine Gruppe der Formel R-, R.CO-, R.SO₂-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- und R.CS- (oder eine solche Gruppe, die als Substituent an einer terminalen Aminogruppe von P vorhanden ist, wobei P für eine hydrophobe Aminosäure oder eine hydrophobe Aminosäure, die weitere Aminosäuren trägt, steht) handelt, läßt sich beispielsweise als letzter Schritt durch Alkylierung, Azylierung oder andere Standard modifikation funktioneller Gruppen für eine terminale Aminogruppe einbauen. Sind Modifikationen am C-Terminus erforderlich (um einen bestimmten Wert für Q zu erhalten), so kann man diese nach der Synthese des Peptids unter Anwendung herkömmlicher Modifikationen funktioneller Gruppen durchführen. Alternativ dazu läßt sich ein bestimmter Wert für Q erhalten, indem man das ursprüngliche Ausgangsharz und/oder die als erste an das Harz gekoppelte geschützte Einheit (beispielsweise, indem man eine in geeigneter Weise geschützte Gruppe der Formel H-Q verwendet) entsprechend auswählt. Typische Beispiele für die Darstellung von Peptidverbindungen der Formel I sind in den folgenden Beispielen angeführt.
Die Stabilität eines Peptidderivats der vorliegenden Erfindung wird typischerweise wie folgt gemessen, wobei alles zur Herstellung von Peptidlösungen verwendete Gerät zur Minimierung mikrobieller Kontaminierung und mikrobiellen Abbaus in einem Autoklaven sterilisiert wird und alle Handhabungen von Material in einer Klasse-II-Laminarbox durchgeführt werden. Mit einer sterilen 0,22-μm-Filtereinheit und einer 20-ml-Spritze werden ungefähr 20 ml McIlvaines Citronensäure/Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 3 oder 7,6, mit 0,02% Natriumazid in eine 50-ml-Flasche filtriert. Ungefähr 1,2 mg Peptid werden exakt in ein Vial mit Verschluß ausgewogen. Mit einer sterilen Pipettenspitze wird das Peptid in dem Vial mit so viel Pufferlösung versetzt, daß man eine Peptidkonzentration von 0,1 mg/ml erhält. Das Vial wird verschlossen und zum Lösen des Peptids geschüttelt. Mit einer sterilen Pipettenspitze werden Aliquots von ungefähr 1 ml der Peptidlösung in 10 HPLC-Vials überführt, die dann verschlossen werden. 5 Vials werden bei –18 und 37°C aufbewahrt. Die Fläche des Peptidpeaks für die Lösung wird mittels HPLC unter Verwendung geeigneter Standards unmittelbar und nach 1-, 2-, 3- und 4-wöchiger Lagerung bei –18 und 37°C bestimmt, wobei bei jedem Zeitpunkt ein frisches Vial verwendet wird und jeweils zwei Probeninjektionen durchgeführt werden. Wieviel Prozent an Peptid zu den jeweiligen Zeitpunkten nach Lagerung bei 37°C noch verblieben sind, wird aus dem Verhältnis der Fläche des Peptidpeaks bei dem jeweiligen Zeitpunkt zur ursprünglichen Fläche bestimmt. Bei bevorzugten Peptidderivaten der vorliegenden Erfindung verbleiben nach Lagerung bei 37°C sowohl bei einem pH-Wert von 3 als auch bei einem pH-Wert von 7,6 mehr als 90% und vorzugsweise mehr als 95% des Peptids.
Das Peptidderivat der Formel I wird im allgemeinen für therapeutische oder prophylaktische Zwecke an Warmblüter (einschließlich des Menschen), die eine solche Behandlung benötigen, in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie dies im Stand der pharmazeutischen Technik gut bekannt ist, verabreicht.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Peptidderivat der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthält.
Die Zusammensetzung kann in einer für eine orale Anwendung geeigneten Form, beispielsweise als Tablette, Kapsel, wäßrige oder ölige Lösung, Suspension oder Emulsion, in einer für eine nasale Anwendung geeigneten Form, beispielsweise als Schnupfpulver, Nasenspray oder Nasentropfen, in einer für eine vaginale oder rektale Anwendung geeigneten Form, beispielsweise als Zäpfchen, in einer für eine Anwendung durch Inhalation geeigneten Form, beispielsweise als ein hochdisperses Pulver oder ein Flüssigaerosol, in einer für eine sublinguale oder bukkale Anwendung geeigneten Form, beispielsweise als Tablette oder Kapsel, oder in einer für eine parenterale Anwendung (einschließlich intravenöser, subkutaner, intramuskulärer und intravaskulärer Anwendung oder Anwendung als Infusion) geeigneten Form, beispielsweise als sterile wäßrige oder ölige Lösung oder Suspension, vorliegen. Die Zusammensetzung kann in einer für eine topische Verabreichung geeigneten Form wie beispielsweise als Creme, Salbe oder Gel vorliegen. Hautpflaster werden ebenfalls in Betracht gezogen. Die Formulierung im allgemeinen ist in Kapitel 25.2 von Comprehensive Medicinal Chemistry, Band 5, Herausgeber Hansch et al., Pergamon Press, 1990, beschrieben.
Im allgemeinen lassen sich die obengenannten Zusammensetzungen in herkömmlicher Weise unter Anwendung herkömmlicher Hilfsstoffe herstellen. Bei einer Zusammensetzung für die orale Verabreichung kann es jedoch zweckmäßig sein, daß die Zusammensetzung eine Beschichtung umfaßt, mit der der Polypeptid-Wirkstoff gegen die Einwirkung von Enzymen im Magen geschützt wird.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung ist eine für die orale Verabreichung geeignete Zusammensetzung in Einheitsdosisform, beispielsweise eine Tablette oder Kapsel, die von 2,5 bis 500 mg und vorzugsweise von 10 bis 100 mg Polypeptid in jeder Einheitsdosis enthält, oder eine für die parenterale Verabreichung geeignete Zusammensetzung, die von 0,5 bis 100 mg Polypeptid pro ml und vorzugsweise von 1 bis 10 mg Polypeptid pro ml Lösung enthält.
Bei einer parenteralen Zusammensetzung handelt es sich vorzugsweise um eine Lösung in isotoner Kochsalzlösung oder isotoner Dextrose, die, falls erforderlich, auf einen pH-Wert von 5 bis 9 gepuffert ist. Alternativ dazu kann es sich bei der parenteralen Zusammensetzung um eine Zusammensetzung handeln, die für eine langsame Freisetzung entwickelt wurde, wobei in diesem Fall die Menge an Polypeptid pro Einheitsdosis im allgemeinen größer ist als die, die erforderlich ist, wenn man eine herkömmliche Injektionsformulierung verwendet. Eine bevorzugte Formulierung mit langsamer Freisetzung ist eine Formulierung mit kontinuierlicher Freisetzung, beispielsweise eine Formulierung des in der europäischen Patentschrift Nr. 58481 beschriebenen Typs, oder, für Peptidderivate der Formel I, die wenigstens eine basische Gruppe enthalten, eine Formulierung, wie sie in der internationalen Patentanmeldung mit der Publikationsnummer WO 93/24150 beschrieben ist. Bestimmte Peptide der vorliegenden Erfindung weisen Löslichkeitseigenschaften auf, durch die sie für die Herstellung und Verarbeitung von parenteralen Formulierungen mit langsamer Freisetzung, insbesondere Formulierungen, die biologisch abbaubare Polyester wie Polylactide enthalten, und für die Bereitstellung von Formulierungen mit langsamer Freisetzung mit vorteilhaften Freisetzungsprofilen besonders geeignet sind. Weiterhin können Peptidderivate der vorliegenden Erfindung, die eine oder mehrere basische Gruppen, insbesondere Arginin, enthalten, auch Peptid-Polymer-Salze mit Polyestern mit Säureenden, wie Polylactiden, bilden, und solche Peptide und Peptid-Polymer-Salze bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Bestimmte dieser Salze weisen Löslichkeitseigenschaften auf, durch die sie für die Herstellung und Verarbeitung parenteraler Formulierungen mit langsamer Freisetzung wie beispielsweise den in WO 93/24150 beschriebenen und für die Bereitstellung von Formulierungen mit langsamer Freisetzung mit vorteilhaften Freisetzungsprofilen und vorteilhaften Eigenschaften in bezug auf die Lagerungsstabilität besonders geeignet sind. Eine bevorzugte parenterale Formulierung mit langsamer Freisetzung enthält von 1 bis 100 mg (z.B. 5 bis 50 mg) Polypeptid pro Einheitsdosis. Bevorzugte parenterale Formulierungen mit langsamer Freisetzung sind weiterhin Formulierungen, die für eine langsame Freisetzung über einen Zeitraum von wenigstens 5 Tagen entwickelt wurden.
Zu den bevorzugten Peptidderivaten der vorliegenden Erfindung zählen die, die, wenn sie in Form einer Depotformulierung aus extrudiertem Polymer vorliegen, minimale Verluste aufgrund eines Abbaus bei der Extrusion zeigen oder einen minimalen Abbau bei der Freisetzung aus solch einer Depotformulierung zeigen. Typische Vorschriften für die Messung des Abbaugrads eines Peptids der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:
Herstellung einer Peptid-Depotformulierung aus extrudiertem Polymer
Etwa 20 mg Peptid werden exakt ausgewogen und mit soviel Polymer (50/50% molares Poly(D,L-milchsäure/glykolsäure)-Copolymer mit einem ungefähren gewichtsmittleren Molekulargewicht von 20 kD und einer ungefähren Polydispersität von 1,7, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie in bezug auf Polystyrolstandards) versetzt, so daß man eine ungefähr 20%ige (w/w) Mischung erhält. Diese wird in anhydridfreiem Eisessig zu einer-ungefähr 10%igen (w/v) Lösung gelöst. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und das so erhaltene gefriergetrocknete Produkt wird bis zur Verwendung unter Vakuum aufbewahrt.
Ungefähr 100 mg des gefriergetrockneten Materials werden in die Trommel eines kleinen Laborextruders gefüllt, und der Stempel wird zum Konsolidieren der Probe heruntergedrückt. Der Extruder wird auf zwischen 90 und 95°C erhitzt und 10 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten, und das gefriergetrocknete Material wird dann unter Druck extrudiert, wodurch man ein zylindrisches Extrudat mit einem Durchmesser von ungefähr 1 mm erhält.
Analyse des Peptidgehalts der Peptid-Depotformulierung aus extrudiertem Polymer
Zwei peptidhaltige Depots aus extrudiertem Polymer mit einer Länge von ungefähr 5 mm werden akkurat ausgewogen und jeweils in getrennten volumetrischen 25-ml-Kolben in 1 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. Nach ungefähr 1,5 Stunden wird das Volumen jeweils mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefüllt, wodurch das Polymer ausfällt. Die Feststoffe werden mit einem 0,5-μm-Millex-PTFE-Filter abfiltriert, und die Lösungen A werden gesammelt.
Aus einer Stammlösung von 0,5 mg/ml Peptid in destilliertem Wasser und einer Stammlösung von 2,5 mg/ml Polymer in anhydridfreiem Eisessig wurden wie folgt eine Reihe von Standardlösungen hergestellt, wobei die Lösungen jeweils mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt wurden:
Die Standards werden jeweils durch einen 5-μm-Millex-PTFE-Filter filtriert, und ein Aliquot des Filtrats wird zusammen mit Aliquots der Lösungen A mittels HPLC analysiert, wobei jeweils zwei Proben injiziert werden. Der Peptidgehalt der Peptid-Depotformulierung aus extrudiertem Polymer wird aus der Peptidkonzentration in den Lösungen A, die durch Vergleich der Flächen des Peptidpeaks in den Lösungen A mit der Fläche des Peptidpeaks aus den Standardlösungen bestimmt wird, berechnet. Bevorzugte Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen einen minimalen, durch den Abbau während der Extrusion bedingten Verlust, und der Peptidgehalt der Depotformulierung aus extrudiertem Polymer liegt somit nahe dem ungefähren theoretischen Wert von 20% (w/w).
Peptidabbau bei der in-vitro-Freisetzung aus einem Depot aus extrudiertem Polymer
Eine Lösung von McIlvaines Citrat/Phosphat-Pufferlösung, pH 7,6, mit 0,02% Natriumazid wird durch einen 0,22-μ-Filter filtriert und bei 4°C aufbewahrt. Ungefähr 10 mg des peptidhaltigen Depots aus extrudiertem Polymer werden in zwei kleine Vials gegeben und mit 2 ml der Pufferlösung versetzt. Die Vials werden dann verschlossen und einen Monat lang bei 37°C in einem Wasserbad aufbewahrt. Zu geeigneten Zeitpunkten über einen Monat werden drei 0,6-ml-Aliquots des Freisetzungsmediums aus jedem Vial entnommen und entweder mittels HPLC analysiert oder vor der Analyse durch HPLC in einem HPLC-Vial bei –18°C gefroren aufbewahrt. Jedem depothaltigen Vial werden 1,8 ml Pufferlösung zugesetzt, wodurch das zum jeweiligen Zeitpunkt entnommene Freisetzungsmedium ersetzt wird.
Die durchschnittliche Menge an unversehrtem Peptid im Freisetzungsmedium zum jeweiligen Zeitpunkt wird mittels HPLC, bei der jeweils zwei Proben injiziert werden, durch Vergleich der Fläche des Peptidpeaks in den Freisetzungsmedien mit der Fläche des Peptidpeaks aus Standardpufferlösungen von Peptid mit bekannten Konzentrationen bestimmt. Die ungefähre durchschnittliche Menge an Peptidabbauprodukten in den Freisetzungsmedien zu den jeweiligen Zeitpunkten wird mittels HPLC durch Vergleich der Fläche zusätzlicher neuer Peaks in den Freisetzungsmedien mit der Fläche des Peptidpeaks aus Standardpufferlösungen von Peptid mit bekannten Konzentrationen bestimmt, wobei angenommen wird, daß sich der Extinktionskoeffizient nicht geändert hat. Das durchschnittliche kumulative in-vitro-Freisetzungsprofil von unversehrtem Peptid und Gesamtpeptid (unversehrtes Peptid und Peptidabbauprodukte) wird aus den Mengen an unversehrtem Peptid und Peptidabbauprodukten im Freisetzungsmedium zum jeweiligen Zeitpunkt bestimmt. Bevorzugte Peptidderivate der vorliegenden Erfindung zeigen bei der in-vitro-Freisetzung einen minimalen Abbau und somit Gesamtpeptidabbauprodukte von weniger als 10% und vorzugsweise weniger als 5% Gesamtpeptid nach einem Monat in-vitro-Freisetzung in McIlvaine-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,6 bei 37°C.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird einem Menschen im allgemeinen so verabreicht, daß die Tagesdosis beispielsweise für einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg 10 Mikrogramm bis 5000 mg, vorzugsweise 0,1 bis 100 mg, beträgt, die, falls erforderlich, in Teildosen verabreicht wird. Die genaue Menge an verabreichter Zusammensetzung und der Verabreichungsweg und die Verabreichungsform können von der Größe, dem Alter und dem Geschlecht der Person, die behandelt wird, und von der jeweiligen behandelten Krankheit bzw. dem jeweiligen behandelten Leiden und deren/dessen Schweregrad abhängen, gemäß Prinzipien, die im Stand der Medizin gut bekannt sind.
Für therapeutische oder prophylaktische Zwecke kann man ein Peptidderivat der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon vorteilhaft auch zusammen mit einem oder mehreren pharmakologischen Mitteln, von denen im allgemeinen Stand der Technik bekannt ist, daß sie bei der Behandlung bzw. der Linderung von Symptomen einer oder mehrerer der Krankheiten bzw. medizinischen Leiden, auf die oben Bezug genommen wurde, (bzw. es sich bei ihnen um ein krankheitsmodifizierendes Mittel handelt), von Nutzen sind verabreichen, wie z.B. ein NSAID (wie Ibuprofen oder Piroxicam), ein Analgetikum (wie Paracetamol) ein Corticosteroid, ein muskelentspannendes Mittel, einen Lipoxygenasehemmer, Methotrexat, Azathioprin, D-Penicillamin, Cyclosporin A oder eine Therapie mit monoklonalen Antikörpern (wie z.B. Anti-CD4 oder Anti-TNF). Bei Diabetes kann die Peptidverbindung zusammen mit Insulin oder anderen Therapien für Diabetes oder Diabeteskomplikationen (wie z.B. einem Aldosereduktasehemmer) verabreicht werden. Es versteht sich, daß eine solche Kombinationstherapie einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer MHC-Klasse-II-abhängigen, durch T-Zellen vermittelten Autoimmunerkrankung bzw. entzündlichen Erkrankung, beispielsweise einer oder mehrerer der oben erwähnten Krankheiten bzw. medizinischen Leiden, bereitgestellt, bei dem man einem einer solchen Behandlung bedürftigen warmblütigen Säugetier (einschließlich des Menschen) eine wirksame Menge eines Peptidderivats der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon verabreicht. Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines Peptidderivats der Formel I, oder eines Amids davon, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines neuen Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer MHC-Klasse-II-abhängigen, durch T-Zellen vermittelten Autoimmunerkrankung oder entzündlichen Erkrankung bereit.
Zusätzlich zu ihrer bereits erwähnten Verwendung in der therapeutischen Humanmedizin eignen sich die Peptidderivate der Formel I auch zur veterinären Behandlung ähnlicher Leiden, die kommerziell wertvolle Warmblüter wie z.B. Hunde, Katzen, Pferde und Rinder befallen. Bei einer solchen Behandlung wird man im allgemeinen das Peptidderivat der Formel I analog der oben für die Verabreichung an Menschen beschriebenen Menge und Weise verabreichen. Die Peptidderivate der Formel I sind weiterhin von Nutzen als pharmakologische Werkzeuge bei der Entwicklung und Standardisierung von Testsystemen für die Abschätzung der Wirkungen von MHC-Klasse-II-Molekülen in Versuchstieren wie Katzen, Hunden, Kaninchen, Affen, Ratten und Mäusen, als Beitrag zur andauernden Suche nach neuen und verbesserten therapeutischen Mitteln, oder als Diagnostika.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert, wobei, wenn nicht anders angegeben:

(i) Einengungen und Eindampfungen im Vakuum mit einem Rotationsverdampfer vorgenommen wurden;
(ii) die Arbeitsschritte bei Raumtemperatur, das heißt im Bereich von 18-26°C, durchgeführt wurden;
(iii) die angegebenen Ausbeuten lediglich als Hinweis für den Leser bestimmt sind und nicht notwendigerweise das durch eine sorgfältige Verfahrensentwicklung erzielbare Maximum darstellen;
(iv) die folgenden Abkürzungen verwendet werden (wie auch in den Schemata 1 und 2): Phv = 5-Phenylvaleryl; Boc = tert.-Butoxycarbonyl; tBu = tert.-Butyl; DMF = N,N-Dimethylformamid; HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol; Met = Methionin; Fmoc = 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl; Fmoc-Pip-OH = N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)piperidin-4-carbonsäure; Fmoc-Papa-OH = 4-[N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino]phenylessigsäure; Z bzw. CbZ = Benzyloxycarbonyl; Pmc = 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl; Pbf = 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl; Trt = Trityl; THF = Tetrahydrofuran; DMSO = Dimethylsulfoxid; HBTU = 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat; DIPEA = Diisopropylethylamin; TFA = Trifluoressigsäure; HPLC = Hochdruckflüssigchromatographie; und RP-HPLC = Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (die, falls nicht anders angegeben, an einer Vydac-C18-Säule 218TP54; 4,6 × 250 mmm, durchgeführt wurde);
(v) Flash-Chromatographie an Merck Kieselgel 60 (Art.-Nr. 9385), erhältlich von E. Merck, Darmstadt, durchgeführt wurde;
(vi) ¹H-NMR-Spektren bei 200 MHz in CDCl₃ oder d₆-Dimethylsulfoxid (d₆-DMSO) unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als internen Standard aufgenommen wurden und als chemische Verschiebung (Delta-Werte) in Parts per Million bezogen auf TMS ausgedrückt sind, wobei für die Bezeichnung der Hauptpeaks herkömmliche Abkürzungen verwendet werden: s, Singulett; m, Multiplett; t, Triplett; br, breit; d, Doublett.
(vii) die folgenden Fmoc-geschützten Aminosäuren zur Einführung eines Lys-, Thr-, Arg- bzw. His-Rests verwendet wurden: für Lys: Fmoc-Lys(Boc)-OH; für Thr: Fmoc-Thr(OtBu)-OH; für Arg: Fmoc-Arg(Pmc)-OH oder Fmoc-Arg(Pbf)-OH; und für His: Fmoc-His(Trt)-OH;
(viii) -II- in einer Formel einen Rest L-Aminosäure der Formel II, wie sie unten aufgeführt ist, bedeutet, wobei die besonderen Werte für n, X, R¹ und R² angegeben sind; und
(ix) -IIIa- in einer Formel eine Gruppe der Formel IIIa, wie sie unten aufgeführt ist, bedeutet.

BEISPIEL 1
Herstellung von Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (SEQ ID NO: 1) (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃)
1.1. Darstellung von N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴, N⁴-bis (2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)-L-asparagin

(a) 1-Brom-2-(2-Methoxyethoxy)ethan (30 g) wurde zu einer gerührten Lösung von N-Benzyldiethanolamin (10 g) in Tetradydrofuran (100 ml) unter Stickstoff gegeben. Danach wurde Natriumhydrid (5,3 g einer 60%igen Dispersion in Mineralöl) portionsweise unter Kühlen in einem Wasserbad gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch 2 Stunden gerührt, wonach weiteres Natriumhydrid (4,4 g einer 60%igen Dispersion in Mineralöl) portionsweise zugegeben wurde. Danach ließ man das Gemisch bei Umgebungstemperatur 16 Stunden lang rühren. Zur Beseitigung von überflüssigem Natriumhydrid wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig mit Wasser (50 ml) versetzt und danach zur Abtrennung des organischen Lösungsmittels eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser (100 ml) versetzt und das Gemisch mit konzentrierter Salzsäure auf etwa pH 2 angesäuert und danach mit Diethylether extrahiert (2 × 100 ml). Die Extrakte wurden verworfen. Die wäßrige Schicht wurde danach durch Zugabe von konzentrierter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von etwa 12 eingestellt und mit Diethylether extrahiert (2 × 150 ml). Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei ein auf 5% Methanol/Chloroform steigender, mit konzentrierter wäßriger Amoniaklösung gesättigter Chloroformgradient verwendet wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt eines Gummis (12 g) zur Trockne eingeengt. Danach wurde mit Methanol (100 ml) und anschließend mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (2,5 g) sowie Ammoniumformiat (7,2 g) versetzt und das Gemisch 1 Stunde bei 60°C unter Stickstoff gerührt. Danach wurde das Gemisch abgekühlt, filtriert und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei ein auf 10% Methanol/Chloroform steigender, mit konzentriertem wäßrigen Ammoniak gesättigter Chloroformgradient verwendet wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und unter Erhalt von N,N-bis(2-[2-(2-Methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)amin in Form eines Gummis (7,1 g) zur Trockne eingeengt; NMR (CDCl₃): 2,8 (m, 4H), 3, 3 (s, 6H), 3, 45 (m, 4H), 3, 6 (m, 16H).
(b) N,N-bis(2-[2-(2-Methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)amin (2,5 g) in Dimethylformamid (12 ml) wurde unter Rühren mit N-Methylmorpholin (1,6 g) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-α-benzylester (2,6 g), Hydroxybenztriazol (2,16 g) sowie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (1,68 g) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden gerührt und danach mit 2% Essigsäure in Wasser (50 ml) versetzt. Das Gemisch wurde mit Diethylether (2 × 50 ml) extrahiert und der vereinigte organische Extrakt mit Natriumdhydrogencarbonatlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Flüchtiges Material wurde durch Einengen unter Erhalt von N ²-tert.-Butyloxycarbonyl-N⁴, N⁴-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)-L-asparagin-α-benzylester in Form eines Gummis (2,8 g) abgetrennt; NMR (CDCl₃): 1,4 (s, 9H), 2,9 (m, 1H), 3,2 (m, 1H), 3,4 (s, 6H), 3,6 (m, 24H), 4, 6 (m, 1H), 5, 2 (q, 2H), 5, 8 (d, 1H), 7, 4 (s, 5H).
(c) Eine Lösung von N ²-tert.-Butyloxycarbonyl-N⁴,N⁴-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)-L-asparagin-α-benzylester (2,6 g) in Methanol (20 ml) wurde mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (0,8 g) und Cyclohexen (1,6 g) versetzt und das Gemisch 2 Stunden bei 55°C erhitzt. Danach wurde das Gemisch abgekühlt, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Aceton (20 ml) und Wasser (8 ml) versetzt, wonach konzentrierter Salzsäure (2 ml) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 55°C erhitzt, abgekühlt und der pH auf einen Wert von etwa 7 mit einem Überschuß an festem Natriumhydrogencarbonat eingestellt. Danach wurde mit 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (1,36 g) versetzt und das Gemisch 16 Stunden gerührt. Flüchtiges Material wurde durch Einengen abgetrennt und der Rückstand zwischen Wasser (25 ml) und Diethylether (50 ml) verteilt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 3 angesäuert. Das Gemisch wurde anschließend mit Methylenchlorid (50 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter Erhalt von N ²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N ⁴, N ⁴-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy)ethyl)-L-asparagin [im folgenden mit Fmoc-Asp(PE)-OH bezeichnet] (2 g) in Form eines Gummis eingeengt; NMR (CDCl₃): 2,8 (q, 1H), 3,4 (q, 1H), 3,4 (s, 6H), 3,6 (m, 24H), 4,2-4,6 (m, 4H), 6,3 (d, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (m, 2H), 7,8 (d, 2H).

1.2 Herstellung von Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂ CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃)
Das Peptid wurde durch Fmoc-Festphasensynthese, ausgehend von Fmoc-Rink-Amid-MBHA-Harz (Novabiochem, 0,50 g; 0,25 mmol), mit gemischter automatischer und manueller Synthese unter Verwendung eines Bond-Elut-Röhrchens (Varian, 15 ml, mit einem Filter am Boden ausgestattet) hergestellt.
Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-Harz wurde zunächst unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesegeräts ABI 431 erhalten, indem das Harz entschützt und nacheinander mit Fmoc-Pip-OH (353 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) und Fmoc-Val-OH (339 mg, 1 mmol) nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für einfache Acylierungen unter Beteiligung der HBTU/HOBT-Chemie, wie nachfolgend angegeben, gekuppelt und entschützt. Nach dem Entschützen wurde das Harz mit DMF (10 × 10-20 ml) gewaschen. Die Carbonsäure (1 mmol) wurde mit HBTU (1 Äquivalent), HOBT (1 Äquivalent) und DIPEA (2 Äquivalente) in DMF vor der Übertragung auf das Harz ungefähr 11 Minuten aktiviert. Die Acylierung wurde ungefähr 60 Minuten lang durchgeführt und danach das Harz mit DMF (10 × 10-20 ml) gewaschen. Auf jeder Stufe wurde das Fmoc-Entschützen mit 20%iger Lösung von Piperidin in DMF durchgeführt (zwei 10minütige Behandlungen mit jeweils 5 ml). Nach jedem Entschützen wurde das Harz gründlich mit DMF (5 × 10 ml) gewaschen.
Die übrigen Reste in der Sequenz wurden nacheinander manuell gekuppelt und entschützt. Die Kupplung wurde durchgeführt, indem eine Lösung aus der entsprechenden N-Fmoc-geschützten Aminosäure (1 mmol), DMF (1,5 ml), HOBT (165 mg, 1 mmol) und Diisopropylcarbodiimid (155 Mikroliter, 1 mmol) zum Harz gegebenen wurde. Man ließ ungefähr 30 Minuten lang kuppeln, wonach mit DMF (5 × 10 ml) gewaschen wurde und ein kleiner Teil des Harzes unter Verwendung des Kaiser-Tests (E. Kaiser, et al, (1970), Anal. Biochem. 34, 595) auf Vollständigkeit der Kupplung überprüft wurde. Das Entschützen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Auf diese Weise wurden Fmoc-Asp(PE)-OH (323 mg, 0,5 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) und 5-Phenylvaleriansäure (178 mg, 1 mmol) nacheinander an das Harz gekuppelt. Für die Phenylvaleriansäure wurde eine Doppelkupplung benötigt, um ein positives Ergebnis im Kaiser-Test zu erhalten.
Das Peptid wurde vom Harz unter Verwendung eines Gemischs aus Trifluoressigsäure (7,9 ml) und Triethylsilan (0,395 ml) abgespalten. Nach 2 Stunden wurde das Harz mit Methylenchlorid (ungefähr 150 ml) gewaschen und die erhaltene Lösung zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wurde zwischen Ether (25 ml) und Wasser (25 ml) verteilt und der Ether danach mit weiteren Portionen Wasser (2 × 25 ml) extrahiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt und gefriergetrocknet.
Das Rohprodukt wurde mit präparativer RP-HPLC (Vydac-218TP1022-Säule, 250 mm × 22 mm) gereinigt, wobei das Rohmaterial in 10 ml 20% Acetonitril/Wasser aufgetragen wurde. Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von Acetonitril-Wasser mit 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 12 ml/Minute. Die produkt-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt von Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (wobei II für einen Rest der L-Aminosäure der Formel II mit n = 1; X = Carbonyl und R¹ = R² = -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ steht) in Form eines weißen Feststoffs (83 mg) gefriergetrocknet.
Das Produkt wurde, wie nachfolgend angegeben, durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse charakterisiert.
RP-HPLC (Vydac-C18-Säule, 218TP54, 4,6 × 250 mm, eluiert mit Acetonitril und Wasser mit 0,1% TFA, unter Verwendung eines 10-50% Acetonitrilgradienten über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute), 94% Reinheit angezeigt, Retentionszeit 23,29 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES⁺) 1220.7 (MH⁺). Aminosäureanalyse (saure Hydrolyse über 24 Stunden unter Verwendung einer Lösung von 6N HCl mit 1% Phenol bei 130°C) ergab Ala 5,82, Val 0,98, Asp 1,19.
Fmoc-Pip-OH wurde mit einem zu dem in E. Atherton und R. C. Sheppard („Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, Seite 51) für N- Fmoc-L-Methionin analogen Verfahren erhalten:
Fmoc-Pip-OH: NMR (DMSO-d₆) 1,3 (m, 2H), 1,7 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,9 (t, 2H), 3, 7 (m, 1H), 4, 2 (t, 1H), 4, 4 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,7 (d, 2H), 7,9 (d, 2H); Massenspektrometrie m/e (ES⁺) 352,2 (MH⁺)
Beispiel 2
Herstellung von Phv-II-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (SEQ ID NO: 2) (Formel II: n = 1, X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem nacheinander Fmoc-Lys(Boc)-OH (468 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) Fmoc-Asp(PE)-OH (323 mg, 0,5 mmol) und 5-Phenylvaleriansäure (178 mg, 1 mmol) zu Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-Harz (erhalten mit manueller Kupplung) gekuppelt. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten und das Rohprodukt unter Verwendung ähnlicher Bedingungen wie den in Beispiel 1 beschriebenen gereinigt. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse charakterisiert, wie nachfolgend angegeben.
RP-HPLC (20-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute) Retentionszeit = 16, 4 Minuten.
Massenspektrometrie m/e (ES⁺) 1277,8 (MH⁺). Aminosäureanalyse ergab Asp 1,07, Lys 1,05, Ala 4,9, Val 0,92.
Beispiel 3
Herstellung von Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (SEQ ID NO: 3) (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
3.1 Herstellung von N²-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-N⁴, N⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]-L-asparagin

(a) N-(Benzyloxycarbonyl)iminodiessigsäure (2,7 g) in Dimethylformamid (15 ml) wurde mit N-Methylmorpholin (2 g), Hydroxybenzotriazol (4 g), bis(2-Methoxyethyl)amin (3,5 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,8 g) versetzt und das Gemisch 16 Stunden gerührt. Flüchtiges Material wurde durch Einengen abgetrennt und der Rückstand zwischen Wasser und Methylenchlorid verteilt. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines auf 10% Methanol/Chloroform steigenden Chloroformgradienten unter Erhalt von N-(Benzyloxycarbonyl)iminodi[N,N-bis(2-Methoxyethyl)] acetamid in Form eines Gummis (2,3 g) gereinigt; NMR (d₆-DMSO): 3,1-3,4 (4 Singuletts aufgrund von Rotameren, 12 H), 3,5 (m, 16H), 4,2 (s, 4H), 5,05 (s, 2H), 7,3 (m, 5H).
(b) N-(Benzyloxycarbonyl)iminodi[N,N-bis(2-methoxyethyl)]acetamid (3,5 g) in Ethanol (20 ml) wurde mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (0,2 g) und Cyclohexen (2 ml) versetzt und das Gemisch bei 55°C unter Stickstoff 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde danach abgekühlt, filtriert und eingedampft. Eine Lösung des Rückstands in Dimethylformamid (15 ml) wurde unter Rühren mit N-Methylmorpholin (1,4 g), Hydroxybenzotriazol (1,85 g), N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-α-benzylester (2,4 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (1,6 g) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden gerührt und danach zu 2% Essigsäure in Wasser (50 ml) gegeben und mit Diethylether (2 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte organische Extrakt wurde mit Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter Erhalt von N²-tert.-Butyloxycarbonyl-N ⁴,N ⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]-L-asparagin-α-benzylester (4,1 g) in Form eines Gummis eingedampft; NMR (d₆-DMSO): 1,4 (s, 9H), 2,6 (m, 2H), 3,2 (überlappende Singuletts aufgrund von Rotameren, 12 H), 3,4 (m, 16H), 4,0-4,4 (m, 5H), 5,1 (s, 2H), 6,8 (d, 1H), 7,4 (s, 5 H).
(c) Unter Verwendung einer zu der in Beispiel 1, Teil (c), analogen Vorgehensweise, jedoch mit N²-tert.-Butyloxycarbonyl-N ⁴,N ⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]-L-asparagin-α-benzylester (4 g) als Ausgangsmaterial, wurde so N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamolymethyl]-L-asparagin (nachfolgend mit FMoc-Asp(TE)-OH bezeichnet) (3 g) in Form eines Gummis erhalten; NMR (CDCl₃): 2,8 (m, 1H), 3,1 (m, 1H), 3,3 (überlappende Singuletts aufgrund von Rotameren, 12 H), 3,6 (m, 16H), 4,2-4,8 (m, 8H), 6,4 (d, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2 H), 7,8 (d, 2H).

3.2 Herstellung von Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem das Harz entschützt und nacheinander mit Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, (2S)-[(3R)-3-(N-9-Fluorenylmethyloxycarbonylamino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäure (Fmoc-IIIa-OH), Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH und 5-Phenylvaleriansäure auf den entsprechenden Kupplungsstufen gekuppelt und entschützt wurde, wobei alle Schritte manuell durchgeführt wurden. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (10-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute) Retentionszeit = 21,88 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES⁺) 1395, 8 (MH⁺). Aminosäureanalyse ergab Asp 1,04, Thr 0,93, Ala 3,12, Arg 0,92.
Fmoc-Papa-OH wurde mit einem zu dem in E. Atherton und R.C. Sheppard („Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, Seite 51) für N-Fmoc-L-Methionin analogen Verfahren erhalten: Fmoc-Papa-OH: NMR (DMSO-d₆) 3,5 (s, 2H), 4,25 (t, 1H), 4,5 (d, 2H), 7,1 (d, 2H), 7,4 (m, 6H), 7,75 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), 9,6 (s, 1H); Massenspektrometrie m/e (ES^–) 372,1 (M-H)^–(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-Fluorenylmethyloxycarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäure (Fmoc-IIIa-OH) wurde wie folgt erhalten:
(i) Synthese von Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe
Eine Lösung von Boc-(D)-Methionin (7 g, 0,028 mol) in trockenem DMF (50 ml) wurde mit N-Methylmorpholin (5,6 g), L-Alanin-methylester-hydrochlorid (3,9 g), HOBt (4,6 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (5,3 g) versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen abgetrennt und der Rückstand zwischen Methylenchlorid (100 ml) und 5%iger wäßriger Essigsäure (50 ml) verteilt. Beim Stehenlassen kristallisierte HOBt aus und wurde durch Filtration abgetrennt, wonach die organische Schicht getrennt und mit wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft wurde. Der Rückstand (8,5 g) wurde durch Flash-Chromatographie in einer Sinternutsche gereinigt, wobei mit einem Gemisch aus Methylenchlorid und Ether (0% bis 100% Ether) eluiert wurde. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt von Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe (7,2 g) in Form eines Gummis, das beim Stehenlassen auskristallisierte, eingedampft; NMR (CDCl₃) : 1,4 (d, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,95 (m, 1H), 2,1 (s, 3H), 2,1 (m, 1H), 2,6 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,3 (bs, 1H), 4,6 (m, 1H), 5,3 (m, 1H), 6,9 (bs, 1H).
(ii) Synthese von (2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert.-Butyloxycarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäuremethylester
Anmerkung: Diese Abfolge muß unter trockenen Bedingungen mit trockenen Lösungsmitteln ausgeführt werden, da ansonsten eine Epimerisierung auftritt. Methyliodid (10 ml) wurde zu Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe (8 g) in einem Gemisch von DMF (20 ml) und Methylenchlorid (20 ml) gegeben, wonach man das Gemisch 16 Stunden lang stehen ließ und danach zum Trocknen eineengte. Nach Zugabe von weiterem Methylenchlorid (2 × 50 ml) wurde zur Abtrennung von Methyliodidresten eingedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus DMF (300 ml) und Methylenchlorid (300 ml) gelöst. Das Gemisch wurde auf ~5°C abgekühlt und durch einmalige Zugabe mit Natriumhydrid (0,76 g einer 80% Dispersion in Mineralöl) versetzt und danach bei dieser Temperatur 2 Stunden lang gerührt. Gesättigtes wäßriges Ammoniumchlorid (50 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zur Trockne eingedampft und danach zwischen Wasser und Ether verteilt. Der Etherextrakt wurde mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet und eingedampft, wobei ein Gummi erhalten wurde, das durch Flash-Chromatographie auf einer Sinternutsche (25% Essigester: Hexan bis 100% Essigester) unter Erhalt von (2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert.-Butyloxycarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäuremethylester in Form eines Gummis (4,2 g), das beim Stehenlasssen auskristallisierte, gereinigt wurde: NMR (CDCl₃): 1,4 (s, 9H), 1,4 (d, 3H), 1,8 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H), 3,7 (m, 3H), 4,2 (m, 1H), 4,9 (q, 1H), 5,2 (bs, 1H).
(iii) Synthese von (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-Fluorenylmethyloxycarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäure (Fmoc-IIIa-OH)
(2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert.-Butyloxycarbonyl]amino)-2-oxo- pyrrolidin-1-yl]propionsäure-methylester (4 g) wurde in einem Gemisch aus Aceton (60 ml), Wasser (40 ml) und konzentrierter Salzsäure (24 ml) 3 Stunden am Rückfluß gekocht, wonach das Gemisch zur Trockne eingedampft wurde. Danach wurde mit Wasser versetzt und das Eindampfen wiederholt. Der Rückstand wurde in Wasser (15 ml) gelöst und ein Überschuß an festem Natriumhydrogencarbonat zugegeben. Nach Zugabe von 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (5,2 g) in Aceton (30 ml) wurde das Gemisch 16 Stunden gerührt und das Lösungsmittel danach durch Eindampfen abgetrennt und der Rückstand zwischen Wasser und Ether verteilt. Die wäßrige Schicht wurde getrennt, ihr pH-Wert auf ~3 mit Salzsäure eingestellt und die wäßrige Schicht dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft, wobei ein weißer Schaum erhalten wurde, der bei Trituration mit Ether der Erhalt von (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-Fluorenylmethyloxycarbonyl]amino)-2-oxo-pyrrolidin-1-yl]propionsäure (4,2 g) in Form eines weißen Feststoffs, Fp. 191-3°C (Zers.) auskristallisierte; NMR (CDCl₃) : 1, 4 (d, 3H), 2, 0 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H), 4,2 (t, 1H), 4,4 (m, 3H), 4,9 (m, 1H), 5,8 (bs, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,7 (d, 2H).
Beispiel 4
Herstellung von Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (SEQ ID NO: 4) (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, wobei anstelle von Fmoc-Asp(PE)-OH auf der entsprechenden Kupplungsstufe Fmoc-Asp(TE)-OH verwendet wurde. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (10-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute) Retentionszeit = 23,9 Minuten.
Massenspektrometrie m/e (ES+) 1274,7 (MH⁺).
Die Aminosäureanalyse ergab Asp 1,03, Ala 5,94, Val 0,98.
Beispiel 5
Herstellung von Phv-Arg-Ala-Ala-IIIa-Ala-II-Ala-Papa-NH₂ (SEQ ID NO: 5) (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂COCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem nacheinander Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(PE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-II-la-OH, Fmoc-Ala-OH (zweimal), Fmoc-Arg(Pbf)-OH und 5-Phenylvaleriansäure (manuell) gekuppelt und entschützt wurden, wonach die Abspaltung vom Harz sowie eine Reinigung mit präparativer RP-HPLC erfolgte. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (10-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute, Retentionszeit = 20,45 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES+) 656, 4 (M+2H⁺⁺).
Die Aminosäureanalyse ergab Arg 1,06, (Ala + IIIa) 4,85, Asp 1,09.
Beispiel 6
Herstellung von Phv-Arg-Ala-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (SEQ ID NO: 6) (Forme II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = CH₂CON[(CH₂CH₂O)₃CH₃]₂
6.1 Herstellung von N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl) carbamoylmethyl]-L-asparagin
Mit einer analogen Vorgehensweise zu der in Beispiel 3.1 für die Herstellung von FMoc-Asp(TE)-OH beschriebenen, wobei jedoch in Teil (a) anstelle von bis(2-Methoxyethyl)amin eine entsprechende Menge an bis(2-2[2-Methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)amin verwendet wird, wurde somit N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl) carbamoylmethyl]-L-asparagin (im folgenden mit FMoc-Asp(TPE)-OH bezeichnet) in Form eines Öls erhalten; NMR (CDCl₃) : 2,9 (m, 1H), 3,1 (m, 1H), 3,4 (m, 12H), 3,6 (m, 48H), 4,2-4,6 (m, 8H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (m, 2H), 7,8 (d, 2H).
Bei der Durchführung der Schritte (a) bzw. (b) wurden die folgenden Zwischenverbindungen erhalten: N-(Benzyloxycarbonyl)iminodi-[N,N-bis(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)]-acetamid; NMR (CDCl₃) : 3, 4 (m, 12H), 3,6 (m, 48H), 4,3 (s, 2H), 4,4 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,3 (s, 5H). N²-tert.-Butyloxycarbonyl-N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-[2-(2-Methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)carbamoylmethyl]-L-asparagin-α-benzylester; NMR (CDCl₃): 1,9 (s, 9H), 2,7 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 3,4 (m, 12H), 3,6 (m, 48H), 4,4 (m, 5H), 5,2 (s, 2H), 5,9 (bd, 1H), 7,4 (m, 5H).
6.2 Herstellung von Phv-Arg-Ala-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ )
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem nacheinander Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH-Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TPE)-OH, Fmoc-Ala-OH (zweimal), Fmoc-Arg(Pbf)-OH und 5-Phenylvaleriansäure (manuell) gekuppelt und entschützt wurden, wonach die Abspaltung vom Harz sowie eine Reinigung mit präparativer RP-HPLC erfolgte. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (10-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute, Retentionszeit = 23,61 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES+) 1748, 0 (MH⁺).
Die Aminosäureanalyse ergab Arg 1,01, Ala 3,18, IIIa 1,05, Asp 0,97, Thr 0,78.
Beispiel 7
Herstellung von Phv-Ala-Ala-Ala-II-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH₂ (SEQ ID NO: 7) (Formel II: n = 1; X = Carbonyl; R¹ = R² = CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem nacheinander Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH (dreimal) und 5-Phenylvaleriansäure (manuell) gekuppelt und entschützt wurden, wonach die Abspaltung vom Harz sowie eine Reinigung mit präparativer RP-HPLC erfolgte. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (20-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute, Retentionszeit = 16,07 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES+) 1395, 7 (MH⁺).
Die Aminosäureanalyse ergab Arg 1,01, Ala 3,06, Asp 1,02, Thr 0,92, Pro 0,92, Gly 1,05.
Beispiel 8
Herstellung von Phv-II-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (SEQ ID NO: 8) (Formel II: n = 2; X = Carbonyl; R¹ = R² = CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
8.1 Herstellung von N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]-L-glutamin
Mit einer analogen Vorgehensweise zu der in Beispiel 3.1 für die Herstellung von FMoc-Asp(TE)-OH beschriebenen, wobei jedoch in Teil (b) anstelle von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-α-benzylester eine entsprechende Menge an N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-α-benzylester verwendet wurde, wurde somit N²-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N⁴, N⁴-bis (N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]-L-glutamin (im folgenden mit FMoc-Glu(TE)-OH bezeichnet) in Form eines Öls erhalten; NMR (CDCl₃): 2,0-2,4 (m, 4H), 3,3 (m, 12H), 3,5 (m, 16H), 4,2-4,6 (m, 8H), 7,4 (m, 4H), 7, 6 (m, 2H), 7, 8 (d, 2H).
Bei der Durchführung von Schritt (b) wurde die folgende Zwischenverbindung erhalten:
N²-tert.-Butyloxycarbonyl-N ⁴,N ⁴-bis[N,N-bis(2-methoxyethyl)carbamoylmethyl]L-glutamin-α-benzylester, in Form eines Gummis;
NMR (CDCl₃) : 1,4 (s, 9H), 2,0 (m, 1H), 2,2 (m, 1H), 2,4 (m, 2H), 3,3 (s, 12H), 3,5 (m, 16H), 4,1-4,5 (m, 5H), 5,2 (s, 2H), 7,3 (s, 5H).
8.2 Herstellung von Phv-II-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH₂ (Formel II: n = 2; X = Carbonyl; R¹ = R² = CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)
Die Synthese wurde mit einer ähnlichen Methodik wie der für Beispiel 1.2 beschriebenen durchgeführt, indem nacheinander Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(TE)-OH und 5-Phenylvaleriansäure (manuell) gekuppelt und entschützt wurden, wonach die Abspaltung vom Harz sowie eine Reinigung mit präparativer RP-HPLC erfolgte. Das Produkt wurde durch HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse, wie nachfolgend angegeben, charakterisiert.
RP-HPLC (10-50% Acetonitrilgradient über 30 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/Minute, Retentionszeit = 22,23 Minuten.
Massenspektrometrie, m/e (ES+) 1472,2 (MH⁺).
Die Aminosäureanalyse ergab Arg 0,95, Ala 2,17, His 0,98, Glu 0,99, Val 0,92, IIIa 0,96.
Beispiel 9
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können Warmblütern wie dem Menschen zur therapeutischen oder prophylaktischen Anwendung in Form von herkömmlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, wobei folgendes ein typisches Beispiel dafür ist:
Injektionslösung
0,01 bis 100 mg Wirkstoff wird in bis 2 ml eines wäßrigen Injektionsvehikels gelöst, so daß man eine Wirkstoffkonzentration zwischen 0,01 und 100 mg/ml erhält. Das wäßrige Injektionsvehikel wird mit einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer (beispielsweise Phosphat oder Acetat) auf einen pH-Wert zwischen 5 und 8 gepuffert und enthält ein pharmazeutisch annehmbares Mittel zum Einstellen der Tonizität (beispielsweise Natriumchlorid oder Dextrose), das zugesetzt wird, um Isotonizität zu erzielen. Das Vehikel kann ggf. auch noch andere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe wie etwa Lösungsvermittler (beispielsweise DMSO, Ethanol, Propylengylkol oder Polyethylenglykol), Konservierungsstoffe und Antioxidationsmittel enthalten. Bei dem Wirkstoff kann es sich typischerweise um eines der oben beschriebenen Beispiele handeln, wobei er zweckmäßiger Weise als pharmazeutisch annehmbares Salz vorliegen kann.
Anmerkungen:
(1) Für Peptide mit einer Gruppe der Formel IV läßt sich (S)-2-[1-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-6-oxo-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl]propionsäure (Fmoc-IV-OH) wie folgt erhalten:
(i) Synthese von (RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl) prolin
N-Benzylcarbonylprolin-methylester (13 g) in THF (20 ml) wurde zu Lithium-Diisopropylamid (27,5 ml, 2 M in Hexan/THF) in THF (100 ml) bei –78°C unter Stickstoff zugetropft. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, und anschließend wurde Allyliodid (5,5 ml) zugetropft und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt und dann zum Aufwärmen auf Umgebungstemperatur stehengelassen. Danach wurde das Gemisch zu wäßrigem Ammoniumchlorid (200 ml) gegeben und mit Ether (2 × 200 ml) extrahiert. Die Etherschicht wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines auf 20% Ethylester: Hexan steigenden Hexangradienten gereinigt. Die zur Trockne eingedampften entsprechenden Fraktionen ergaben (RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl)prolin-methylester (9 g) in Form eines Öls.
8,5 g dieses Materials wurden in Methanol (40 ml) gelöst, wonach Natriumhydroxid (4,5 g) in Wasser (20 ml) zugegeben und das Gemisch am Rückfluß 60 Minuten erhitzt wurde. Der pH-Wert des Gemischs wurde dann mit konzentrierter Salzsäure auf 7 eingestellt und das Methanol durch Eindampfen abgetrennt. Der pH-Wert des Gemischs wurde auf 3 eingestellt und das Gemisch mit Ether (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden unter Erhalt (RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl)prolin in Form eines Gummis eingedampft; NMR (d₆-DMSO (373K)): 1,9 (m, 2H), 2,1 (m, 2H), 2,6 (q, 1H), 2,9 (q, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 5,0 (m, 4H), 5,75 (m, 1H) 7,3 (m, 5H).
(ii) Synthese von [(RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl)]prolyl-(S)-alanin-methylester
(RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl)prolin (6,5 g) in DMF (30 ml) wurde mit HOBt (7,7 g), N-Methylmorpholin (6,6 g), L-Alananin-methylester-hydrochlorid (4,5 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid (5,7 g) versetzt und das Gemisch nach 18stündigem Rühren eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Ether und Wasser verteilt, zur Abtrennung von HOBt filtriert und die organische Schicht abgetrennt. Die organische Schicht wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines steigenden Gradienten von 20% Essigester in Hexan bis 50% Essigester in Hexan gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurde vereinigt und unter Erhalt von [(RS)-2-Allyl-N-(benzyloxycarbonyl)]prolyl-(S)-alanin-methylester (7 g) zur Trockne eingedampft;
NMR (d₆-DMSO (373K)): einige Peaks verdoppelt aufgrund des Gemischs aus Diastereoisomeren, 1,25 und 1,3 (2d, 3H), 1,75 (m, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,65 (m, 1H), 2,9 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,65 (2s, 3H), 3,7 (m, 1H) 4,3 (2q, 1H), 5,0 (m, 4H), 5,7 (m, 1H), 7,3 (m, 5H), 7,4 und 7, 5 (bs, 1H).
(iii) Synthese von (S)-2-(1-Benzyloxycarbonyl-6-oxa-1,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionsäure-methylester (CbZ-IV-OMe)
[(RS)-2-Allyl-N-(Benzyloxycarbonyl)]prolyl-(S)-alaninmethylester (1,45 g) in einem Gemisch aus Methanol (30 ml) und Wasser (20 ml) wurde mit Osmiumtetroxid (1,5 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung) versetzt. Das Gemisch wurde unter Argon 10 Minuten gerührt, wonach Natriumperiodat (2,45 g) portionsweise zugegeben wurde. Das Gemisch wurde 2 Stunden gerührt und danach mit Wasser (100 ml) versetzt, und dieses Gemisch wurde mit Essigester (2 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet und unter Erhalt von 1,4 g eines Gummis eingedampft. Das Gummi wurde in Metyhlenchlorid (30 ml) gelöst, und danach wurden Triethylsilan (0,65 g) und anschließend Trifluoressigsäure (4 g) zugetropft. Das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt, eingedampft und der Rückstand zwischen wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Ether verteilt.
Der Etherextrakt wurde abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines steigenden Gradienten von 25% Essigester in Hexan bis 100% Essigester gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt von (S)-2-(1-Benzyloxycarbonyl-6-oxo-l,7-di-azaspiro[4,4)non-7-yl)propionsäure-methylester (0,8 g) zur Trockne eingedampft; NMR (d₆-DMSO (373K)): einige Peaks verdoppelt aufgrund des Gemischs aus Diastereoisomeren, 1,25 und 1,35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H), 3,1-3,5 (m, 4H), 3,6 und 3,65 (2 s, 3H), 4,5 und 4,65 (2q, 1H), 5,05 (m, 2H), 7,25 (m, 5H).
(iv) Synthese von (S)-2-(6-oxo-1,7-Diazaspiro-[4,4]non-7-yl)propionsäure (H-IV-OH)
(S)-2-(1-Benzyloxycarbonyl-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionsäure-methylester (3,3 g) in einem Gemisch aus Methanol (40 ml) und Wasser (40 ml) wurde mit Kaliumcarbonat (2,5 g) versetzt und das Gemisch 10 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Der pH wurde mit konzentrierter Salzsäure auf einen Wert von ~5 eingestellt und das Gemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (40 ml) gelöst und der pH mit konzentrierter Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Das Gemisch wurde danach mit Methylenchlorid (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter Erhalt eines Schaums (2,8 g) eingedampft. Der Schaum wurde in Methanol (20 ml) gelöst und Cycylohexen (0,7 g) sowie anschließend 10% Pd/C (0,5 g) zugegeben. Das Gemisch wurde am Rückfluß 2 Stunden erhitzt, abgekühlt, filtriert, und das Filtrat wurde unter Erhalt von (S)-2-(6-oxo-1,7-Diazaspiro[4,4]non-7-yl)propionsäure in Form eines Schaums (1,9 g) eingedampft; NMR (d₆-DMSO): einige Peaks verdoppelt aufgrund des Gemischs aus Diastereoisomeren, 1,25 und 1,3 (2s, 3H), 1,8 (m, 4H), 2,0 (m, 2H), 3,0 (m, 2H), 3,3 (m, 2H), 4,5 (m, 1H).
(v) Synthese von (S)-2-[1-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl]propionsäure (Fmoc-IV-OH)
(S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl]propionsäure (0,42 g) in Wasser (2 ml) wurde mit einem Überschuß an festem Natriumhydrogencarbonat versetzt, und anschließend wurde 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (0,7 g) in Aceton (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt. Danach wurde das Gemisch in Wasser (10 ml) gegeben, mit Ether (10 ml) extrahiert, wonach die wäßrige Schicht abgetrennt wurde (die Etherextrakte wurden verworfen). Der pH der wäßrigen Schicht wurde mit konzentrierter Salzsäure auf einen Wert ~3 eingestellt, wonach die wäßrige Schicht mit Methylenchlorid (2 × 10 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten Extrakte wurden abgetrennt, getrocknet (MgSO₄) und unter Erhalt von (S)-2-[1-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl]propionsäure (0,62 g) in Form eines weißen Schaums eingedampft; NMR (d₆-DMSO (373K)): einige Peaks verdoppelt aufgrund des Gemischs aus Diastereoisomeren, 1,3 (2d, 3H), 1,6-2,0 (m, 6H), 3,05 (m, 1H), 3,2-3,45 (m, 3H), 4,2-4,4 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7, 35 (m, 4H), 7, 8 (m, 4H).
(2) Für Verbindungen mit einer Gruppe der Formel Va läßt sich (3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-1-Essigsäure (Fmoc-Va-OH) wie folgt erhalten:

(i) (3S)-3-Amino-ε-caprolactam (25 g) und Triethylamin (19,7 g) wurden in THF (200 ml) gelöst und auf 5°C abgekühlt. Danach wurde Chlorameisensäure-Benzylester (33 g) in THF (50 ml) über 30 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und danach in Wasser (500 ml) gegossen. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigester (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ether (40 ml) trituriert und unter Erhalt von 20 g (S)-3-Benzyloxycarbonylamino-ε-caprolactam in Form eines weißen Feststoffs filtriert; NMR (d₆-DMSO): 1,1-2 (m, 6H), 2,9-3,2 (m, 2H), 4,1-4,25 (m, 1H), 5,0 (s, 2H), 7,25-7,4 (m, 5H), 7,75 (t, 1H).
(ii) Ein Gemisch von Natriumhydrid (2 g) in DMF (100 ml) wurde unter einem Argonstrom auf 0°C abgekühlt. (3S)-3-Benzyloxycarbonylamino-ε-caprolactam (10 g) wurde im Verlauf von 20 Minuten portionsweise mit einer solchen Geschwindigkeit zugesetzt, daß die Reaktionstemperatur unter 5°C blieb. Es wurde weitere 40 Minuten lang bei 0°C gerührt und dann über 10 Minuten tropfenweise mit Bromessigsäure-tert.-butylester (8,2 g) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 0°C und weitere 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (600 ml) gegossen und mit Essigester (6 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch MPLC an Kieselgel unter Verwendung von 20% Essigester/Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt, wodurch man (3S)-3-Benzyloxycarbonylamino-2-oxoperhydroazepin-1-essig-säure-tert.-butylester (15 g) als klares Öl erhielt; NMR (d₆-DMSO): 1,4 (s, 9H), 1,5-1,9 (m, 6H), 3,5-3,65 (m, 1H), 3,9-4,15 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,0 (s, 2H), 7,1 (d, 1H), 7,35 (m, 5H); Massenspektroskopie, m/e (ES+) 377 (MH⁺).
(iii) (3S)-3-Benzyloxycarbonylamino-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure-tert.-butylester (15 g) wurde in Ethanol (150 ml) gelöst und mit Argon gespült. 10% Palladium-auf-Aktivkohle (1,5 g) wurde zugegeben, wonach der Kolben evakuiert und mit Wasserstoff aus einem Ballon gefüllt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Argon gespült und über Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, wodurch man (3S)-3-Amino-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure-tert.-butylester (7,7 g) als zähflüssiges Öl erhielt; NMR (CDCl₃): 1,45 (s, 9H), 1,55-2,05 (m, 6H), 3,2-3,3 (d, 1H), 3,55-3,75 (zwei überlappende Dubletts, 2H) 3,95-4,25 (q, 2H); Massenspektroskopie, m/e (ES+) 243,2 (MH⁺).
(iv) Eine Lösung von (3S)-3-Amino-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure-tert.-butylester (7 g) in THF (50 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumcarbonat (3 9) in Wasser (30 ml) gegeben. Danach wurde eine Lösung von N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimid (9,7 g) in THF (100 ml) unter Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde dann weitere 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Zugabe von Wasser (200 ml) wurde das Reaktionsgemisch mit Essigester (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch MPLC an Kieselgel, wobei zunächst Methylenchlorid als Elutionsmittel verwendet wurde und schrittweise auf 15% Essigester/Methylenchlorid gesteigert wurde, gereinigt, wodurch man (3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure-tert.-butylester (10,9 g) als klares Öl erhielt; NMR (d₆-DMSO) : 1,45 (s, 9H), 1,5-2,15 (m, 6H), 3,1-3,25 (m, 1H), 3,6-3,75 (m, 1H), 4,0-4,5 (m, 5H), 6,25 (d, 1H), 7,25-7,45 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,75 (d, 2H); Massenspektroskopie, m/e (ES+) 465,2 (MH⁺).
(v) (3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure-tert.-butylester (10,5 g) wurde in Metyhlenchlorid (30 ml) gelöst und mit Trifluoressigsäure (20 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde Metyhlenchlorid (100 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch MPLC an Kieselgel unter Verwendung von 25% Essigester/Methylenchlorid und anschließend von Essigester als Elutionsmittel gereinigt, wodurch man ein Öl erhielt. Durch Trituration mit Isohexan erhielt man einen weißen Schaum, der filtriert und bei 60°C im Vakuum getrocknet wurde, wodurch man (3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-2-oxoperhydroazepin-1-essigsäure (5,5 g) erhielt; NMR (d₆-DMSO): 1,4-1,95 (m, 1H), 3,15-3,4 (m, 1H), 3,55-3,7 (m, 1H), 3,9-4,2 (m, 2H), 4,25-4,45 (m, 2H), 7,15 (d, 1H), 7,25-7,45 (m, 4H), 7,75 (m, 2H), 7,85 (d, 2H); Massenspektrometrie, m/e (ES-) 407,1 (M-H)^–.

Chemische Formeln

P-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q I

Schema 1
Schema 2
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptidderivat der Formel I, P-AA¹-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei P für einen hydrophoben Rest, ausgewählt aus einer hydrophoben aliphatischen, aromatischen, heteroaromatischen oder gemischten aliphatisch/aromatisch oder aliphatisch/heteroaromatischen Gruppe aus 5 bis 20 Kohlenstoffatomen und 1, 2 oder 3 Heteroatomen, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff für Heteroaryl enthaltende Gruppen, oder P für eine hydrophobe L-Aminosäure steht, die gegebenenfalls am N-Terminus eine hydrophobe aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder gemischt aliphatisch/aromatische oder aliphatisch/heteroaromatische organische Gruppe mit der oben angegebenen Bedeutung trägt oder die hydrophobe Aminosäure eine weitere Sequenz aus 1-3 Aminosäuren, ausgewählt aus einer beliebigen AA¹-AA⁸ mit der unten angegebenen Bedeutung, trägt und es sich bei der ersten Aminosäure einer solchen weiteren Sequenz um eine L- oder D-Aminosäure handelt, die ebenso gegebenenfalls eine hydrophobe aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder gemischt aliphatisch/aromatische oder aliphatisch/heteroaromatische organische Gruppe mit der oben angegebenen Bedeutung trägt; AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷, und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen 1, 2 oder 3 der Reste AA¹, AA⁴ und AA⁷ ausgewählt sind aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II
wobei n eine ganze Zahl 1,2,3 oder 4 darstellt; X für -NH-CO-, -CO- oder -O.CO- steht; R¹ und R² ausgewählt sind aus (A), (B) und (C), wobei (A) für eine Gruppe der Formel -(CH₂)_a-CO-N(R³)(R⁴) steht, in der a eine ganze Zahl 1 oder 2 bedeutet und R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Gruppe -[(CH₂)_bO]_m-R^a, in der R^a für Methyl oder Ethyl steht und m eine ganz zahl 1, 2, 3, 4, oder 5 bedeutet; b 2 oder 3 ist, wenn m 1 ist, und der Wert für b in jeder -(CH₂)_bO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn m 2, 3, 4 oder 5 ist; (B) für eine Gruppe der Formel -(CH₂)_cO(CH₂)_d-CO-N(R⁵) (R⁶) steht, in der c eine ganze Zahl 2 oder 3 bedeutet, d eine ganze Zahl 1, 2, oder 3 bedeutet und R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Gruppe -[(CH₂)_eO]_p-R^b, in der R^b für Methyl oder Ethyl steht und p eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; e 2 oder 3 ist, wenn p 1 ist, und der Wert für e in jeder -(CH₂)_eO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn p 2, 3, 4 oder 5 ist; und (C) für eine Gruppe der Formel -[(CH₂)_fO]_g-R⁷ steht, in der R⁷ für Methyl oder Ethyl steht und g eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; f 2 oder 3 ist, wenn g 1 ist, und der Wert für f in jeder -(CH₂)_fO-Einheit unabhängig aus 2 und 3 ausgewählt wird, wenn g 2, 3, 4, oder 5 ist; oder AA¹, AA², AA³, AA⁶, AA⁷, und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen ein oder beide Reste AA¹ und AA⁷ ausgewählt sind aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der oben angegebenen Bedeutung und AA⁴ zusammen mit AA⁵ eine Gruppe der Formel III, IIIa, IV, IVa, V oder Va;
bilden, wobei Ra, Rb und Rz unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und (1-4C)Alkyl und A für Sauerstoff oder Methylen steht; oder AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵ and AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, bei denen ein oder beide Reste AA¹ und AA⁴ ausgewählt sind aus einem Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der oben angegebenen Bedeutung und AA⁶ zusammen mit AA⁷ eine Gruppe der Formel III, IIIa, IV, IVa, V oder Va mit der oben angegebenen Bedeutung bilden; und Q für OH, NH₂, NRcRd steht, wobei Rc ausgewählt ist aus (1-4C)Alkyl, 2-Carbamoylcyclopentyl, 2-Pyridylmethyl, 4-Carbamoylcyclohexyl, 4-Carbamoylcyclohexylmethyl, 3-Carbamoylphenyl, 4-Carbamoylphenyl, 4-(Carbamoylmethyl)phenyl, 4-(Carboxymethyl)phenyl, 2-Morpholinoethyl und einer Gruppe der Formel -A¹-G¹, in der A¹ für (3-7C)Alkylen steht oder A¹ ausgewählt ist aus (3) einer Gruppe der Formel -A²-B²-, in der A² für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen und B² für (1-4C)Alkylen steht oder A² für Methylen und B² für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen steht; und (4) einer Gruppe der Formel -A³-B³-C³-, in der A³ für Methylen, B³ für p-Phenylen oder 1,4-Cyclohexylen und C³ für (1-3C)Alkylen steht; und G¹ für eine Gruppe der Formel -N=C[N(Rp)₂]₂ steht, in der Rp jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl und Propyl; und Rd für Wasserstoff oder (1-4C)Alkyl steht; oder Q für 1-Piperazinyl, 4-Methyl-1-piperazinyl, 4-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethyl)-1-piperazinyl, 4-Amidino-1-piperazinyl, 1-Piperidyl oder 4-substituiertes-1-piperidyl steht, wobei der 4-Substituent ausgewählt ist aus Carboxy, Carbamoyl, N-(2-Aminoethyl)carbamoyl und N-(4-Aminobutyl)carbamoyl; oder Q für eine Sequenz aus 1 bis 6 Aminosäureresten oder ein Amid davon steht.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, bei dem es sich um ein Peptidderivat der Formel P-AA¹-AA²-AA³-II-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q handelt, wobei AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷, und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, P und Q eine der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweisen und II für einen Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, bei dem es sich um ein Peptidderivat der Formel P-AA¹-AA²-AA³-IIIa-AA⁵-II-AA⁸-Q handelt, wobei AA¹,AA², AA³, AA⁵ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, P und Q eine der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweisen und II für einen Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht und IIIa für eine Gruppe der Formel IIIa mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, bei dem es sich um ein Peptidderivat der Formel P-AA¹-AA²-AA³-II-AA⁵-IIIa-AA⁸-Q handelt, wobei AA¹, AA², AA³, AA⁵ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, P und Q eine der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweisen und II für einen Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht und IIIa für eine Gruppe der Formel IIIa mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1, bei dem es sich um ein Peptidderivat der Formel P-II-AA²-AA³-AA⁴-AA⁵-IIIa-AA⁸-Q handelt, wobei AA², AA³, AA⁴, AA⁵ und AA⁸ für L-Aminosäurereste stehen, P und Q eine der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweisen und II für einen Rest der L-Aminosäure der Formel II mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht und IIIa für eine Gruppe der Formel IIIa mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung steht.
Peptidderivat oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem P für eine aliphatische, aromatische oder gemischt aliphatisch/aromatische organische Gruppe aus 5 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine heteroaromatische oder gemischt aliphatisch/heteroaromatische organische Gruppe aus 5 bis 20 Kohlenstoffatomen und 1, 2 oder 3 Heteroatomen, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, steht.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei im Rest der L-Aminosäure der Formel II, n = 1 oder 2, X = Carbonyl ist und R¹ und R² jeweils für identische Gruppen der Formel (A) oder jeweils für identische Gruppen der Formel (C) mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung stehen.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 7, wobei R¹ und R² jeweils für -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ oder jeweils für -CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂ oder jeweils für -CH₂CON[(CH₂CH₂O)₃CH₃]₂ stehen.
Peptidderivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei AA¹ bis AA⁸, wenn vorhanden, ausgewählt sind aus Resten der folgenden Aminosäuren: AA¹ ausgewählt aus Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ und 3,3,3-Trifluoralanin; AA² ausgewählt aus Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-Trifluoralanin und N⁶-Diethyl-Lys; AA³ ausgewählt aus Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn und N³-Diethyl-Dap; AA⁴ ausgewählt aus Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His und N⁶-Diethyl-Lys; AA⁵ ausgewählt aus Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser und N³-Diethyl-Dap; AA⁶ ausgewählt aus Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His und Dap; AA⁷ ausgewählt aus Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic und Dic; und AA⁸ ausgewählt aus Ala, Gly, Dap, Azaalanin und Azaglycin.
Peptidderivat und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Q ausgewählt ist aus 4-Carbamoyl-1-piperidyl und 4-(Carbamoylmethyl)anilin.
Peptidderivat und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der hydrophoben Gruppe P um 5-Phenylvaleryl handelt.
Peptidderivat nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch annehmbares Salz, bei dem es sich um die Verbindung
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, in dem Phv eine 5-Phenylvalerylgruppe darstellt, handelt.
Peptidderivat nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, bei dem es sich um die Verbindung
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, in dem Phv eine 5-Phenylvalerylgruppe darstellt, handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptidderivat der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägerstoff umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon nach Anspruch 1, bei dem nacheinander in der entsprechenden Reihenfolge in geeigneter Weise geschützte Aminosäuren oder Sequenzen aus zwei oder mehreren in geeigneter Weise geschützten Aminosäuren, eine in geeigneter Weise geschützte Gruppe der Formel H-II-OH, H-III-OH, H-IIIa-OH, H-IV-OH, H-IVa-OH, H-V-OH oder H-Va-OH sowie gegebenenfalls als eine in geeigneter Weise geschützte Gruppe der Formel H-Q kuppelt, und anschließend gegebenenfalls eine funktionelle Gruppenmodifikation der N-Terminalaminogruppe zur Einführung einer hydrophoben Gruppe P durchführt und eventuell verbliebene Schutzgruppen und festen Träger entfernt.
Peptidderivat der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung einer von MHC-Klasse-II abhängigen, T-Zellen-vermittelten Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankung.
Verbindung oder dessen Salz nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis oder zystischer Fibrose.
Verwendung eines Peptidderivats der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Behandlung einer von MHC-Klasse-II abhängigen, T-Zellen-vermittelten Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankung.
Geschützte oder ungeschützte Aminosäure der Formel II oder ein Salz davon, wobei n, X, R¹ oder R² jeweils eine der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen aufweisen.