WO2021182558A1

WO2021182558A1 - Method and kit for conducting immunoassay of target substance in sample

Info

Publication number: WO2021182558A1
Application number: PCT/JP2021/009722
Authority: WO
Inventors: 亨本多; 伊藤　雅浩; 一久中島
Original assignee: 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2021-03-11
Publication date: 2021-09-16
Also published as: JPWO2021182558A1

Abstract

As a technology for accurately measuring the concentration of substances such as peptide hormones and haptens contained in a sample, provided is an immunoassay method that is for a substance in a sample and that is based on detection of a multi-complex including the target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex-recognition type antibody that specifically recognizes a complex between the target substance and the first antibody. The method includes a step for bringing the first antibody in contact with the complex-recognition type antibody in the presence of a protein denaturing agent.

Description

試料中の対象物質を免疫測定するための方法及びキットMethods and kits for immunoassaying the target substance in the sample

　本発明は、試料中の対象物質を免疫測定するための方法及びキット等に関する。より詳しくは、対象物質を特異的に認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを用いた免疫測定方法において、測定のプロセスにタンパク質変性剤が適用される方法等に関する。 The present invention relates to a method and a kit for immunoassaying a target substance in a sample. More specifically, in an immunoassay method using a first antibody that specifically recognizes a target substance and a complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of the target substance and the first antibody, the measurement process. The present invention relates to a method in which a protein denaturant is applied to.

　生体試料等に含まれるペプチドホルモンやハプテン等の濃度の測定が種々の疾患の診断のために実施されている。例えば、ハプテンの１つであり、原発性アルドステロン症、バーター症候群、リドル症候群、水酸化酵素欠損症、及び選択的低アルドステロン症等の鑑別診断に用いられるアルドステロン濃度の測定には、ＬＣ－ＭＳ法及び免疫測定法等が用いられている。免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）がある（特許文献１参照）。 Measurement of the concentration of peptide hormones, haptens, etc. contained in biological samples, etc. is carried out for the diagnosis of various diseases. For example, the LC-MS method is used to measure the aldosterone concentration, which is one of the haptens and is used for the differential diagnosis of primary aldosteronism, Bartter syndrome, Liddle's syndrome, hydroxylase deficiency, and selective hypoaldosteronism. And immunoassays and the like are used. Examples of the immunoassay method include a radioimmunoassay method (RIA method) and an enzyme-linked immunosorbent assay method (EIA method) (see Patent Document 1).

　本発明に関連して、特許文献２には、ハプテンに結合する抗ハプテン抗体と、ハプテン－抗ハプテン抗体複合体に結合する抗イムノコンプレックス抗体とを用いたハプテンの免疫測定方法が開示されている。抗イムノコンプレックス抗体は、遊離の（免疫複合体を形成していない）抗ハプテン抗体との反応性もわずかながら有している場合があり、抗イムノコンプレックス抗体が遊離の抗ハプテン抗体へ結合すると測定ノイズの原因となることがあった（特許文献２、段落０００５参照）。特許文献２に記載される技術は、「ハプテンと抗ハプテン抗体を反応させ、生成したハプテン－抗ハプテン抗体複合体と抗イムノコンプレックス抗体を反応させる際に、ハプテン類似物質を共存させること」（請求項１参照）により、抗イムノコンプレックス抗体と遊離の抗ハプテン抗体との結合に起因する測定ノイズを低減できるとされている。 In connection with the present invention, Patent Document 2 discloses a method for measuring immunity of a hapten using an anti-hapten antibody that binds to a hapten and an anti-immunocomplex antibody that binds to a hapten-anti-hapten antibody complex. .. Anti-immunocomplex antibodies may also have slight reactivity with free (non-immune complex) anti-hapten antibodies, measured as anti-immunocomplex antibodies binding to free anti-hapten antibodies. It may cause noise (see Patent Document 2, paragraph 0005). The technique described in Patent Document 2 is "to allow a hapten-like substance to coexist when reacting a hapten with an anti-hapten antibody and reacting the produced hapten-anti-hapten antibody complex with an anti-immunocomplex antibody" (claim). (See Item 1), it is said that the measurement noise caused by the binding between the anti-immunocomplex antibody and the free anti-hapten antibody can be reduced.

特開平２－５７９７６号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-57976 特開２０１５－０２５７８７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-025787

　本発明は、試料に含まれるペプチドホルモンやハプテン等の物質の濃度を正確に測定するための技術を提供することを主な目的とする。 A main object of the present invention is to provide a technique for accurately measuring the concentration of a substance such as a peptide hormone or a hapten contained in a sample.

　上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］－［４８］を提供する。
［１］　対象物質と、対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含んでなる多重複合体の検出に基づく、試料中の物質の免疫測定方法であって、
第１抗体と複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触する工程（変性剤処理工程）を含む、
方法。
［２］前記変性剤処理工程が、対象物質の存在下及び／又は非存在下で行われる、［１］の方法。
［３］　前記タンパク質変性剤が、カオトロピック変性剤、界面活性剤及び還元剤からなる群から選択されるいずれか１以上である、［１］又は［２］の方法。
［４］　前記カオトロピック変性剤が、尿素、チオ尿素、グアニジン又はその塩、及びヨウ化物からなる群から選択されるいずれか１以上である、［３］の方法。
［５］　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートからなる群から選択されるいずれか１以上のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、［３］の方法。
［６］　前記還元剤が、グルタチオン及び／又はシステインである、［３］の方法。
［７］　前記タンパク質変性剤が、尿素及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである、［１］－［５］のいずれかの方法。
［８］　前記対象物質が、ペプチドホルモン又はハプテンである、［１］－［７］のいずれかの方法。
［９］　前記ペプチドホルモンが、心房性ナトリウム利尿ペプチ（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチ（ＢＮＰ）及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）からなる群から選択されるいずれか１以上である、［８］の方法。
［１０］　前記ハプテンが、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン及びビタミンからなる群から選択されるいずれか１以上である、［８］の方法。
［１１］　前記対象物質が、アルドステロン又は甲状腺ホルモンである、［８］の方法。
［１２］　前記試料が、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、糞便及び膵液からなる群から選択されるいずれか１以上の生体試料である、［１］－［１１］のいずれかの方法。 In order to solve the above problems, the present invention provides the following [1]-[48].
[1] Based on the detection of a multiplex complex comprising a target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex recognition type antibody that specifically recognizes the complex of the target substance and the first antibody. , A method for measuring immunity of substances in a sample,
A step of contacting the first antibody and the complex recognition type antibody in the presence of a protein denaturing agent (denaturing agent treatment step) is included.
Method.
[2] The method of [1], wherein the denaturant treatment step is performed in the presence and / or absence of the target substance.
[3] The method of [1] or [2], wherein the protein denaturant is at least one selected from the group consisting of a chaotropic denaturant, a surfactant and a reducing agent.
[4] The method of [3], wherein the chaotropic denaturant is at least one selected from the group consisting of urea, thiourea, guanidine or a salt thereof, and iodide.
[5] The surfactants are polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, and poly. The method of [3], wherein any one or more of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters selected from the group consisting of oxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate and polyoxyethylene sorbitan tetraoleate.
[6] The method of [3], wherein the reducing agent is glutathione and / or cysteine.
[7] The method according to any one of [1] to [5], wherein the protein denaturing agent is urea and / or polyoxyethylene sorbitan monolaurate.
[8] The method according to any one of [1]-[7], wherein the target substance is a peptide hormone or a hapten.
[9] The peptide hormone is at least one selected from the group consisting of atrial natriuretic pepti (ANP), cerebral natriuretic pepti (BNP) and C-type natriuretic peptide (CNP), [8]. the method of.
[10] The method of [8], wherein the hapten is at least one selected from the group consisting of steroid hormones, thyroid hormones, catecholamines and vitamins.
[11] The method of [8], wherein the target substance is aldosterone or thyroid hormone.
[12] The sample is any one or more biological samples selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, spinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, feces and pancreatic juice [1]. -A method according to any one of [11].

［１３］　前記変性剤処理工程が、対象物質の存在下で行われる、［１］－［１２］のいずれかの方法。
［１４］　（Ａ１）試料中の対象物質と第１抗体とを接触させて複合体を形成させる工程と、
（Ａ２）複合体と複合体認識型抗体とを接触させて多重複合体を形成させる工程と（ここで、工程（Ａ１）及び工程（Ａ２）は同時に行われても別時に行われてもよい）、
（Ａ３）多重複合体を検出する工程と、を含み、
前記工程（Ａ１）及び／又は工程（Ａ２）がタンパク質変性剤の存在下で行われる（変性剤処理工程）、［１３］の方法。
［１５］　前記工程（Ａ１）と前記工程（Ａ２）との間、及び／又は、前記工程（Ａ２）との前記工程（Ａ３）との間に洗浄工程を含まない、［１４］の方法。
［１６］　前記複合体と前記複合体認識型抗体とが反応される溶液における尿素の濃度が０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下である、［１４］又は［１５］の方法。
［１７］　前記複合体と前記複合体認識型抗体とが反応される溶液におけるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度が０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下である、［１４］又は［１５］の方法。
［１８］　多重複合体の検出シグナル強度と、既知量の対象物質を用いて予め作成された対象物質量と検出シグナル強度との相関を規定する検量線と、に基づいて対象物質量を決定する工程をさらに含む、［１４］－［１７］のいずれかの方法。
［１９］　前記第１抗体及び前記複合体認識型抗体の少なくともいずれか一方が、不溶性担体に固定化される、［１４］－［１８］のいずれかの方法。
［２０］　サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法、ラテックス凝集法又はイムノクロマト法である、［１４］－［１９］のいずれかの方法。 [13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the modifier treatment step is performed in the presence of the target substance.
[14] (A1) A step of contacting the target substance in the sample with the first antibody to form a complex, and
(A2) The step of contacting the complex with the complex-recognizing antibody to form a multiplex complex (here, steps (A1) and (A2)) may be performed simultaneously or at different times. ),
(A3) Including a step of detecting a multiple complex.
The method of [13], wherein the step (A1) and / or step (A2) is performed in the presence of a protein denaturant (denaturant treatment step).
[15] The method of [14], which does not include a cleaning step between the step (A1) and the step (A2) and / or between the step (A2) and the step (A3).
[16] The concentration of urea in the solution in which the complex and the complex recognition antibody are reacted is 0.1 M or more and 8 M or less, preferably 0.5 M or more and 6 M or less, and more preferably 2 M or more and 4 M or less. The method of [14] or [15].
[17] The concentration of polyoxyethylene sorbitan monolaurate in the solution in which the complex and the complex recognition antibody are reacted is 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less. The method of [14] or [15], which is more preferably 0.0025% or more and 2.5% or less, and particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.
[18] The amount of the target substance is determined based on the detection signal intensity of the multiple complex and the calibration curve that defines the correlation between the amount of the target substance and the detection signal intensity prepared in advance using a known amount of the target substance. The method of any of [14]-[17], further comprising a step.
[19] The method according to any one of [14]-[18], wherein at least one of the first antibody and the complex recognition type antibody is immobilized on an insoluble carrier.
[20] The method according to any one of [14]-[19], which is a sandwich ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method, a latex agglutination method, or an immunochromatography method.

［２１］　前記変性剤処理工程が、対象物質の非存在下で行われる、［１］－［１２］のいずれかの方法。
［２２］　（Ｂ１ａ）第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に溶解し抗体溶液を調製する工程（変性剤処理工程）と、
（Ｂ１ｂ）抗体溶液の溶媒を、タンパク質変性剤を含まない溶媒に置換する工程と、
（Ｂ２）溶媒置換後の抗体溶液と試料とを混合し、試料中の対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させて多重複合体を形成させる工程と、
（Ｂ３）多重複合体を検出する工程と、
を含む、［２１］の方法。
［２３］　前記抗体溶液における尿素の濃度が０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下である、［２２］の方法。
［２４］　前記抗体溶液におけるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度が０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下である、［２２］の方法。
［２５］　多重複合体の検出シグナル強度と、既知量の対象物質を用いて予め作成された対象物質量と検出シグナル強度との相関を規定する検量線と、に基づいて対象物質量を決定する工程をさらに含む、［２２］－［２４］のいずれかの方法。
［２６］　前記第１抗体及び前記複合体認識型抗体の少なくともいずれか一方が、不溶性担体に固定化される、［２２］－［２５］のいずれかの方法。
［２７］　サンドイッチＥＬＩＳＡ法又はラテックス凝集法である、［２２］－［２６］のいずれかの方法。 [21] The method according to any one of [1] to [12], wherein the modifier treatment step is performed in the absence of the target substance.
[22] (B1a) A step of dissolving the first antibody and the complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturant to prepare an antibody solution (denaturant treatment step).
(B1b) A step of replacing the solvent of the antibody solution with a solvent containing no protein denaturant, and
(B2) A step of mixing the antibody solution after solvent replacement and the sample, and contacting the target substance in the sample with the first antibody and the complex recognition type antibody to form a multiple complex.
(B3) Step of detecting multiple complexes and
The method of [21] including.
[23] The method of [22], wherein the concentration of urea in the antibody solution is 0.1 M or more and 8 M or less, preferably 0.5 M or more and 6 M or less, and more preferably 2 M or more and 4 M or less.
[24] The concentration of polyoxyethylene sorbitan monolaurate in the antibody solution is 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less, and more preferably 0.0025% or more and 2.5% or less. The method of [22], which is particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.
[25] The amount of the target substance is determined based on the detection signal intensity of the multiple complex and the calibration curve that defines the correlation between the amount of the target substance and the detection signal intensity prepared in advance using a known amount of the target substance. The method of any of [22]-[24], further comprising a step.
[26] The method of any of [22]-[25], wherein at least one of the first antibody and the complex recognition type antibody is immobilized on an insoluble carrier.
[27] The method of any of [22]-[26], which is a sandwich ELISA method or a latex agglutination method.

［２８］　対象物質と、対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含んでなる多重複合体の検出に基づく、試料中の物質の免疫測定において、第１抗体と複合体認識型抗体との結合を抑制する方法であって、
第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持する工程を含む、方法。
［２９］　前記タンパク質変性剤が、カオトロピック変性剤、界面活性剤及び還元剤からなる群から選択されるいずれか１以上である、［２８］の方法。
［３０］　前記カオトロピック変性剤が、尿素、チオ尿素、グアニジン又はその塩、及びヨウ化物からなる群から選択されるいずれか１以上である、［２９］の方法。
［３１］　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートからなる群から選択されるいずれか１以上のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、［２９］の方法。
［３２］　前記還元剤が、グルタチオン及び／又はシステインである、［２９］の方法。
［３３］　前記タンパク質変性剤が、尿素及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである、［２８］－［３１］のいずれかの方法。
［３４］　前記溶媒における尿素の濃度が０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下である、［３３］の方法。
［３５］　前記溶媒におけるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度が０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下である、［３３］の方法。 [28] Based on the detection of a multiplex complex comprising a target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex recognition type antibody that specifically recognizes the complex of the target substance and the first antibody. , A method of suppressing the binding between the first antibody and the complex recognition type antibody in the immunoassay of the substance in the sample.
A method comprising holding a first antibody and a complex recognition antibody in a solvent containing a protein denaturant.
[29] The method of [28], wherein the protein denaturant is at least one selected from the group consisting of chaotropic denaturants, surfactants and reducing agents.
[30] The method of [29], wherein the chaotropic denaturant is any one or more selected from the group consisting of urea, thiourea, guanidine or a salt thereof, and iodide.
[31] The surfactant is polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, poly. The method of [29], wherein any one or more of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters selected from the group consisting of oxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate and polyoxyethylene sorbitan tetraoleate.
[32] The method of [29], wherein the reducing agent is glutathione and / or cysteine.
[33] The method of any of [28]-[31], wherein the protein denaturant is urea and / or polyoxyethylene sorbitan monolaurate.
[34] The method of [33], wherein the concentration of urea in the solvent is 0.1 M or more and 8 M or less, preferably 0.5 M or more and 6 M or less, and more preferably 2 M or more and 4 M or less.
[35] The concentration of polyoxyethylene sorbitan monolaurate in the solvent is 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less, more preferably 0.0025% or more and 2.5% or less. The method of [33], which is particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.

［３６］　対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含む、試料中の物質の免疫測定用キットであって、
（１）タンパク質変性剤を含む、又は、
（２）前記第１抗体溶液、前記複合体認識型抗体溶液、前記第１抗体及び／又は前記複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒、並びに前記対象物質を含む試料を希釈するための溶媒からなる群から選択されるいずれか１以上の液体を含んでなり、かつ該いずれか１以上の液体がタンパク質変性剤を含有する、
キット。
［３７］　前記タンパク質変性剤が、カオトロピック変性剤、界面活性剤及び還元剤からなる群から選択されるいずれか１以上である、［３６］のキット。
［３８］　前記カオトロピック変性剤が、尿素、チオ尿素、グアニジン又はその塩、及びヨウ化物からなる群から選択されるいずれか１以上である、［３７］のキット。
［３９］　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートからなる群から選択されるいずれか１以上のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、［３７］のキット。
［４０］　前記還元剤が、グルタチオン及び／又はシステインである、［３７］のキット。
［４１］　前記タンパク質変性剤が、尿素及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである、［３６］－［３９］のいずれかのキット。
［４２］　前記第１抗体と前記複合体認識型抗体とが接触される溶液において尿素が濃度０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下に調製される、［４１］のキット。
［４３］　前記第１抗体と前記複合体認識型抗体とが接触される溶液においてポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが濃度０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下に調製される、［４１］のキット。
［４４］　前記対象物質が、ペプチドホルモン又はハプテンである、［３６］－［４３］のいずれかのキット。
［４５］　前記ペプチドホルモンが、心房性ナトリウム利尿ペプチ（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチ（ＢＮＰ）及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）からなる群から選択されるいずれか１以上である、［４４］のキット。
［４６］　前記ハプテンが、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン及びビタミンからなる群から選択されるいずれか１以上である、［４４］のキット。
［４７］　前記対象物質が、アルドステロン又は甲状腺ホルモンである、［４４］のキット。
［４８］　前記試料が、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、糞便及び膵液からなる群から選択されるいずれか１以上の生体試料である、［３６］－［４７］のいずれかのキット。 [36] An immunoassay kit for a substance in a sample, which comprises a first antibody that recognizes a target substance and a complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of the target substance and the first antibody. ,
(1) Contains a protein denaturant or
(2) For diluting a sample containing the first antibody solution, the complex recognition type antibody solution, the first antibody and / or a solvent for redissolving the complex recognition type antibody, and the target substance. It comprises any one or more liquids selected from the group consisting of solvents, and the one or more liquids contain a protein modifier.
kit.
[37] The kit of [36], wherein the protein denaturant is at least one selected from the group consisting of chaotropic denaturants, surfactants and reducing agents.
[38] The kit of [37], wherein the chaotropic denaturant is at least one selected from the group consisting of urea, thiourea, guanidine or a salt thereof, and iodide.
[39] The surfactant is polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, poly. The kit of [37], which is any one or more polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters selected from the group consisting of oxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate and polyoxyethylene sorbitan tetraoleate.
[40] The kit of [37], wherein the reducing agent is glutathione and / or cysteine.
[41] The kit of any of [36]-[39], wherein the protein denaturant is urea and / or polyoxyethylene sorbitan monolaurate.
[42] Urea is prepared to have a concentration of 0.1 M or more and 8 M or less, preferably 0.5 M or more and 6 M or less, and more preferably 2 M or more and 4 M or less in the solution in which the first antibody and the complex recognition type antibody are contacted. [41] kit.
[43] In the solution in which the first antibody and the complex recognition type antibody are contacted, the concentration of polyoxyethylene sorbitan monolaurate is 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less. The kit of [41], which is more preferably prepared to be 0.0025% or more and 2.5% or less, and particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.
[44] The kit according to any one of [36]-[43], wherein the target substance is a peptide hormone or a hapten.
[45] The peptide hormone is at least one selected from the group consisting of atrial natriuretic pepti (ANP), cerebral natriuretic pepti (BNP) and C-type natriuretic peptide (CNP), [44]. Kit.
[46] The kit of [44], wherein the hapten is at least one selected from the group consisting of steroid hormones, thyroid hormones, catecholamines and vitamins.
[47] The kit of [44], wherein the target substance is aldosterone or thyroid hormone.
[48] The sample is any one or more biological samples selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, spinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, feces and pancreatic juice [36]. -A kit of any of [47].

　本発明において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片又は抗体修飾物であってよい。抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であってよく、または他の種由来抗体であってもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。なお、「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われる。 In the present invention, the term "antibody" is used in the broadest sense and is a monoclonal antibody, polyclonal antibody, dimer, multimer, multispecific antibody (eg, double) as long as it exhibits the desired biological activity. It may be a specific antibody), an antibody fragment or an antibody modified product. The antibody may be a mouse antibody, a rabbit antibody, a human antibody, a humanized antibody or a chimeric antibody, or may be an antibody derived from another species. Antibodies can be in any class of immunoglobulin molecules (eg, IgG, IgE, IgM, IgD and IgA), in any subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2). The terms "antibody" and "immunoglobulin" are used in a broad sense with compatibility.

　「抗体断片」とは、抗体の一部であって、抗体の可変ドメインを含むか、少なくとも抗原結合領域を含むものを言う。抗体断片には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）₂、Ｆａｂ₃、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、及びこれらの抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれ得る。「Ｆｖ断片」は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。 An "antibody fragment" is a portion of an antibody that comprises a variable domain of an antibody, or at least an antigen-binding region. Antibody fragments include, for example, Fab, Fab', F (ab') ₂ , Fv fragment, linear antibody, single chain antibody (scFv), sc (Fv) ₂ , Fab ₃ , domain antibody (dAb), diabody. , Triabodies, tetrabodies, minibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments thereof. An "Fv fragment" is the smallest antibody fragment that contains a complete antigen recognition region and antigen binding region.

　「抗体修飾物」とは、抗体又は抗体断片に化学的な修飾を施すことによって得られるものであり、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子を結合した抗体が挙げられる。抗体に結合される分子は限定されない。 The "antibody modified product" is obtained by chemically modifying an antibody or antibody fragment, and examples thereof include antibodies to which various molecules such as polyethylene glycol (PEG) are bound. The molecule that binds to the antibody is not limited.

　「対象物質と対象物質を認識する第１抗体との複合体を特異的に認識する」とは、対象物質と第１抗体の複合体に対して、遊離の対象物質に対するよりも高い親和性で結合することを意味し、好ましくは、対象物質と第１抗体の複合体にのみに結合し、遊離の対象物質には結合しないことを意味する。遊離の対象物質、又は対象物質と第１抗体の複合体に対する親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法又は表面プラズモン共鳴の原理を用いる方法等によって測定することができる。対象物質と第１抗体との複合体に特異的に結合する抗体は、対象物質と第１抗体の複合体に対する親和性が、遊離の対象物質に対する親和性の１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍であり、好ましくは２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍であり、場合によって２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１００００倍あるいはそれ以上である。 "Specifically recognizing the complex of the target substance and the first antibody that recognizes the target substance" means that the complex of the target substance and the first antibody has a higher affinity than that of the free target substance. It means that it binds, preferably it binds only to the complex of the target substance and the first antibody, and does not bind to the free target substance. The affinity of the free target substance or the complex of the target substance and the first antibody can be measured by, for example, the ELISA method or a method using the principle of surface plasmon resonance. Antibodies that specifically bind to the complex of the target substance and the first antibody have an affinity for the complex of the target substance and the first antibody 10 times, 20 times, and 30 times the affinity for the free target substance. 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, preferably 200 times, 300 times, 400 times, 500 times, 600 times, 700 times, 800 times, 900 times, 1000 times. It is double, and in some cases, 2000 times, 3000 times, 4000 times, 5000 times, 6000 times, 7000 times, 8000 times, 9000 times, 10000 times or more.

　「複合体認識型抗体」とは、いわゆる抗メタタイプ抗体と同義であり、抗原と抗体との複合体を特異的に認識する抗体を意味する。本発明において、複合体認識型抗体は、対象物質と対象物質を認識する第１抗体との複合体に結合する抗体を意味し、対象物質と第１抗体との複合体のいずれの部位に結合する抗体であってよい。
　複合体認識型抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、全長の抗体のみならず、抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、前述の抗体断片等が挙げられる。 The “complex recognition type antibody” is synonymous with a so-called anti-metatype antibody, and means an antibody that specifically recognizes a complex of an antigen and an antibody. In the present invention, the complex recognition type antibody means an antibody that binds to a complex of a target substance and a first antibody that recognizes the target substance, and binds to any site of the complex of the target substance and the first antibody. It may be an antibody to be used.
As the complex recognition type antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but a monoclonal antibody is preferable. Moreover, not only the full-length antibody but also the antibody fragment can be used. Examples of the antibody fragment include the above-mentioned antibody fragment and the like.

　本発明により、試料に含まれるペプチドホルモンやハプテン等の対象物質の濃度を正確に測定するための技術が提供される。 The present invention provides a technique for accurately measuring the concentration of a target substance such as a peptide hormone or a hapten contained in a sample.

　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, a suitable mode for carrying out the present invention will be described. It should be noted that the embodiments described below show an example of typical embodiments of the present invention, and the scope of the present invention is not narrowly interpreted by this.

１．タンパク質変性剤による第１抗体と複合体認識型抗体との結合の抑制
　本発明に係る方法は、対象物質と、対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体（以下、単に「複合体」とも称する）を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含んでなる多重複合体の検出に基づいて試料中の物質を免疫測定する方法であって、第１抗体と複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触する工程（以下「変性剤処理工程」と称する）を含む。変性剤処理工程において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。 1. 1. Suppression of binding between the first antibody and the complex recognition type antibody by a protein denaturant The method according to the present invention comprises a target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex of the target substance and the first antibody ( Hereinafter, a method for immunometrically measuring a substance in a sample based on the detection of a multiplex complex including a complex recognition type antibody that specifically recognizes (hereinafter, also simply referred to as “complex”), the first antibody. Includes a step of contacting the complex-recognizing antibody with the complex-recognizing antibody in the presence of a protein denaturing agent (hereinafter referred to as "modifying agent treatment step"). In the denaturant treatment step, by retaining the first antibody and the complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturing agent, non-specific binding between the first antibody and the complex recognition type antibody is suppressed. Can be done.

　本発明に係る免疫測定方法は、一般に抗体による免疫反応を利用した測定方法であれば特に制限はなく、例えば、ＥＬＩＳＡ法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス凝集法、及びイムノクロマト法等が挙げられる。
　本発明に係る免疫測定方法は、用手法に限らず、自動分析装置による実施に適用され得る。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせなどについては、特に制限はなく、適用する自動分析装置の環境や機種に合わせて、あるいは他の要因を考慮に入れて適当な試薬類等の組み合わせを選択して用いればよい。さらに、本発明に係る免疫測定方法は、Ｍｉｃｒｏ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ：μ－ＴＡＳ、μ総合分析システム）への応用も可能である。 The immunoassay method according to the present invention is generally not particularly limited as long as it is a measurement method using an immune reaction with an antibody. For example, ELISA method, radioimmunoassay method (RIA), fluorescence immunoassay method (FIA), latex agglutination. Examples thereof include a method and an immunochromatography method.
The immunoassay method according to the present invention is not limited to the method used, and can be applied to the practice by an automatic analyzer. There are no particular restrictions on the combination of reagents, etc. when measuring using the method or automatic analyzer, depending on the environment and model of the automatic analyzer to be applied, or taking other factors into consideration. A combination of appropriate reagents and the like may be selected and used. Furthermore, the immunoassay method according to the present invention can also be applied to Micro-TAS (Micro-Total Analysis Systems: μ-TAS, μ comprehensive analysis system).

　第１抗体及び複合体認識型抗体は、それぞれ対象物質及び複合体に特異的に結合する抗体であればよく、それらの構造は特に限定されない。第１抗体及び複合体認識型抗体には、市販の抗体を用いることができる。また、第１抗体及び複合体認識型抗体は、それぞれ対象物質又は複合体を免疫した動物（例えばマウス）の脾臓Ｂ細胞とミエローマ細胞（例えばＰ３－Ｕ１細胞）とを融合してハイブリドーマのライブラリを作成し、ライブラリから目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択されたハイブリドーマから産生される抗体を精製することより得ることもできる。 The first antibody and the complex recognition type antibody may be antibodies that specifically bind to the target substance and the complex, respectively, and their structures are not particularly limited. Commercially available antibodies can be used as the first antibody and the complex recognition type antibody. In addition, the first antibody and the complex recognition type antibody fuse spleen B cells and myeloma cells (for example, P3-U1 cells) of an animal (for example, mouse) immunized with the target substance or complex, respectively, to form a hybridoma library. It can also be obtained by preparing, selecting a hybridoma producing the desired antibody from the library, and purifying the antibody produced from the selected hybridoma.

　変性剤処理工程において、第１抗体と複合体認識型抗体とは、対象物質の存在下（後述する第一実施形態参照）で接触されるものであってよく、対象物質の非存在下（後述する第二実施形態参照）で接触されるものであってもよい。また、第１抗体と複合体認識型抗体とは、対象物質の非存在下で接触された後、さらに、対象物質の存在下で接触されるものであってもよい。 In the denaturant treatment step, the first antibody and the complex recognition type antibody may be in contact with each other in the presence of the target substance (see the first embodiment described later), and may be in contact with each other in the absence of the target substance (described later). It may be contacted in the second embodiment). Further, the first antibody and the complex recognition type antibody may be contacted in the absence of the target substance and then further in the presence of the target substance.

　変性剤処理工程に用いられるタンパク質変性剤は、カオトロピック変性剤、界面活性剤及び還元剤からなる群から選択されるいずれか１以上とできる。
　カオトロピック変性剤としては、尿素、チオ尿素、グアニジン又はその塩、及びヨウ化物からなる群から選択されるいずれか１以上が用いられ得る。
　界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエートからなる群から選択されるいずれか１以上のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが用いられ得る。
　前記還元剤としては、グルタチオン及び／又はシステインが用いられ得る。
　これらのタンパク質変性剤うち、尿素及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが好ましく用いられ得る。 The protein denaturant used in the denaturant treatment step can be any one or more selected from the group consisting of chaotropic denaturants, surfactants and reducing agents.
As the chaotropic modifier, any one or more selected from the group consisting of urea, thiourea, guanidine or a salt thereof, and iodide can be used.
Surfactants include polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, and polyoxyethylene sorbitan. Any one or more polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters selected from the group consisting of monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate and polyoxyethylene sorbitan tetraoleate can be used.
As the reducing agent, glutathione and / or cysteine can be used.
Of these protein denaturants, urea and / or polyoxyethylene sorbitan monolaurate can be preferably used.

　第１抗体と複合体認識型抗体とタンパク質変性剤とを含む溶液におけるタンパク質変性剤の濃度は、例えば０．０００５％（ｗ/ｖ）以上４８％（ｗ/ｖ）以下、好ましくは０．００１％（ｗ/ｖ）以上３６％（ｗ/ｖ）以下、より好ましくは０．００２５％（ｗ/ｖ）以上２４％（ｗ/ｖ）以下とされる。
　特に尿素が用いられる場合、当該溶液中のタンパク質変性剤の濃度は、例えば０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍが挙げられ、例えば０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下とできる。
　特にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが用いられる場合、当該溶液中のタンパク質変性剤の濃度は、例えば、０．０００５％、０．００１％、０．００２５％、０．００５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％が挙げられ、例えば０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下とできる。 The concentration of the protein denaturant in the solution containing the first antibody, the complex recognition type antibody and the protein denaturant is, for example, 0.0005% (w / v) or more and 48% (w / v) or less, preferably 0.001. % (W / v) or more and 36% (w / v) or less, more preferably 0.0025% (w / v) or more and 24% (w / v) or less.
Especially when urea is used, the concentration of the protein denaturant in the solution is, for example, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M. , 0.9M, 1M, 2M, 3M, 4M, 5M, 6M, 7M, 8M, for example, 0.1M or more and 8M or less, preferably 0.5M or more and 6M or less, more preferably 2M or more and 4M or less. ..
Especially when polyoxyethylene sorbitan monolaurate is used, the concentration of the protein modifier in the solution is, for example, 0.0005%, 0.001%, 0.0025%, 0.005%, 0.01%. , 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, Examples thereof include 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% and 10%, for example, 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less. It can be more preferably 0.0025% or more and 2.5% or less, and particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.

　対象物質は、特に限定されないが、ペプチドホルモン又はハプテンであってよい。
　ペプチドホルモンは、心房性ナトリウム利尿ペプチ（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチ（ＢＮＰ）及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）からなる群から選択されるいずれか１以上であってよい。
　ハプテンは、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン及びビタミンからなる群から選択されるいずれか１以上であってよい。
　ステロイドホルモンとしては、鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド及び性ホルモン等が挙がられる。鉱質コルチコイドとしては、アルドステロン及びフルドロコルチゾン等が挙げられる。糖質コルチコイドとしては、コルチゾール、コルチコステロン及びコルチゾン等が挙げられる。性ホルモンとしては、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、エストラジオール、エストリオール、エストロン及びプロゲステロン等が挙げられる。
　甲状腺ホルモンとしては、トリヨードサイロニン（Ｔ３）及びサイロキシン（Ｔ４）等が挙げられる。
　カテコールアミンとしては、レボドパ、ドーパミン、ノルアドレナリン及びアドレナリン等が挙げられる。
　ビタミンとしては、ビタミンＤ、ビタミンＤ代謝物（２５－ヒドロキシビタミンＤ）、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ及びビタミンＫ等が挙げられる。
　対象物質は、特にアルドステロン又は甲状腺ホルモンとできる。 The target substance is not particularly limited, but may be a peptide hormone or a hapten.
The peptide hormone may be any one or more selected from the group consisting of atrial natriuretic pepti (ANP), cerebral natriuretic pepti (BNP) and type C natriuretic peptide (CNP).
The hapten may be any one or more selected from the group consisting of steroid hormones, thyroid hormones, catecholamines and vitamins.
Examples of steroid hormones include mineralocorticoids, glucocorticoids and sex hormones. Examples of mineralocorticoids include aldosterone and fludrocortisone. Examples of the glucocorticoid include cortisol, corticosterone and cortisone. Examples of sex hormones include testosterone, dehydroepiandrosterone, estradiol, estriol, estrone, progesterone and the like.
Examples of thyroid hormones include triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4).
Examples of catecholamines include levodopa, dopamine, noradrenaline and adrenaline.
Examples of vitamins include vitamin D, vitamin D metabolites (25-hydroxyvitamin D), vitamin B12, vitamin E and vitamin K.
The target substance can be aldosterone or thyroid hormone in particular.

　試料は、対象物質を含有する可能性があるものであれば特に限定されないが、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、糞便及び膵液からなる群から選択されるいずれか１以上の生体試料であってよい。試料は、好ましくは全血、血漿、血清又は尿である。
　「試料中の対象物質」とは、試料中に存在する対象物質を意味する。対象物質は、抗体との結合が可能な形態であれば特に制限はなく、例えば、当該物質単体による遊離形態であってもよく、他の物質（例えばタンパク質等）との複合形態であってもよい。 The sample is not particularly limited as long as it may contain the target substance, but is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, spinal fluid, saliva, sheep water, urine, sweat, feces and pancreatic fluid. It may be any one or more biological samples. The sample is preferably whole blood, plasma, serum or urine.
The “target substance in the sample” means the target substance present in the sample. The target substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody, and may be, for example, a free form of the substance alone or a complex form with another substance (for example, protein). good.

２．免疫測定方法の第一実施形態（変性剤処理工程が対象物質の存在下で行われる形態）２－１．実施形態１－１
　本実施形態に係る方法は以下の工程を含む。
（Ａ１－１）　試料中の対象物質と第１抗体とを接触させて複合体を形成させる工程。
（Ａ２－１）　複合体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて多重複合体を形成させる工程。
（Ａ３－１）　多重複合体を検出する工程。
　以下、各工程について順に説明する。 2. First Embodiment of Immunoassay Method (Form in which the denaturant treatment step is performed in the presence of the target substance) 2-1. Embodiment 1-1
The method according to this embodiment includes the following steps.
(A1-1) A step of contacting a target substance in a sample with a first antibody to form a complex.
(A2-1) A step of contacting a complex and a complex-recognizing antibody in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex.
(A3-1) A step of detecting a multiple complex.
Hereinafter, each step will be described in order.

２－１－１．工程（Ａ１－１）
　工程（Ａ１－１）は、試料中の対象物質と第１抗体とを接触させて、対象物質と第１抗体との複合体を形成させ得る方法であれば特に制限はない。
　工程（Ａ１－１）は、水性溶媒中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させることにより行ってもよいが、水性溶媒中で行うことが好ましい。 2-1-1. Process (A1-1)
The step (A1-1) is not particularly limited as long as it is a method capable of contacting the target substance in the sample with the first antibody to form a complex of the target substance and the first antibody.
The step (A1-1) may be carried out in an aqueous solvent or by developing in an insoluble membrane, but is preferably carried out in an aqueous solvent.

　ここで、「対象物質と第１抗体とを接触させ」とは、対象物質と第１抗体とを１つの反応容器内で共存させて、これらが互いに接触可能となっている状態を意味する。 Here, "contacting the target substance with the first antibody" means a state in which the target substance and the first antibody coexist in one reaction vessel so that they can come into contact with each other.

　水性溶媒としては、本発明の免疫測定方法を可能とする水性溶媒であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　水性溶媒には、塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキシル（Ｐｒｏｘｅｌ）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社製）等が挙げられる。 The aqueous solvent is not particularly limited as long as it is an aqueous solvent that enables the immunoassay method of the present invention, and examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
The aqueous solvent may contain salts, metal ions, sugars, preservatives, proteins, surfactants, protein stabilizers and the like. Examples of salts include lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, ammonium chloride, lithium bromide, sodium bromide, potassium bromide, calcium bromide, magnesium bromide, ammonium bromide and the like. .. Examples of the metal ion include magnesium ion, manganese ion, zinc ion and the like. Examples of saccharides include mannitol and sorbitol.
Examples of preservatives include sodium azide, antibiotics (streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.), bioace, Proclin 300, Proxel GXL, and the like. Examples of the protein include bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA) and the like. Examples of the surfactant include nonionic surfactants and the like. Examples of the protein stabilizer include a peroxidase stabilizing buffer (Peroxidase Stabilizing Buffer, manufactured by DakoCytomation) and the like.

　複合体を形成させる反応の温度は、本発明の免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。
　当該反応の時間は、本発明の免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。
　反応溶液中の第１抗体の濃度は、本発明の免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。 The temperature of the reaction for forming the complex is not particularly limited as long as it is a temperature that enables the immunoassay method of the present invention, and is usually 1 ° C., 2 ° C., 3 ° C., 4 ° C., 5 ° C., 6 ° C., 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃, 10 ℃, 11 ℃, 12 ℃, 13 ℃, 14 ℃, 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃ , 41 ° C., 42 ° C., 43 ° C., 44 ° C., 45 ° C., 46 ° C., 47 ° C., 48 ° C., 49 ° C., 50 ° C. and the like.
The reaction time is not particularly limited as long as it enables the immunoassay method of the present invention, and is 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes. Minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 minutes, 8 minutes, 9 minutes, 10 minutes, 11 minutes, 12 minutes, 13 minutes, 14 minutes, 15 minutes, 16 minutes, 17 minutes, 18 minutes, 19 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 70 minutes, 80 minutes, 90 minutes, 100 minutes, 110 minutes, 120 minutes, 130 minutes, 140 minutes, 150 minutes, 160 minutes, 170 minutes, 180 minutes, 190 minutes , 200 minutes, 210 minutes, 220 minutes, 230 minutes, 240 minutes and the like.
The concentration of the first antibody in the reaction solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the immunoassay method of the present invention, and is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0. 9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100 μg / mL, etc., 0.1 to 20 μg The / mL range is preferred.

　第１抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。
　不溶性担体には、例えば、スライドグラス、ＥＬＩＳＡプレート（マイクロタイタープレート）、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、フィルター、フィルム及びメンブレン等が挙げられる。不溶性担体の材料には、ガラス、ガラスファイバー、シリコン、セラミック、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート又はポリウレタン等が用いられ得る。
　抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、本技術分野において周知であり、例えば、化学的結合法（共有結合により固定化する方法）あるいは物理的に吸着させる方法など方法を適用できる。アビジン－ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用して抗体を不溶性担体に固定化することも可能である。この場合、抗体にビオチンを結合したビオチン化抗体を、ストレプトアビジンをコーティングしたストレプトアビジンプレートに固定化すればよい。また、リンカーを介して、抗体を不溶性担体に固定化させてもよい。
　リンカーとしては、不溶性担体表面の官能基と、抗体が有する官能基とを共有結合できる分子であって、例えば、抗体が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを有する分子であって、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が好ましく用いられる。抗体が有する官能基及び不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えばアリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。 The first antibody is preferably immobilized on an insoluble carrier.
Examples of the insoluble carrier include slide glass, ELISA plate (microtiter plate), beads, latex particles, magnetic particles, filters, films, membranes and the like. As the material of the insoluble carrier, glass, glass fiber, silicon, ceramic, cellulose, nitrocellulose, nylon, polycarbonate, polyethylene, polypurpyrene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polyurethane and the like can be used.
Methods for immobilizing an antibody on an insoluble carrier are well known in the art, and for example, a method such as a chemical bond method (a method for immobilizing by covalent bond) or a method for physically adsorbing an antibody can be applied. It is also possible to immobilize the antibody on an insoluble carrier using a very strong binding reaction such as the avidin-biotin reaction. In this case, the biotinylated antibody in which biotin is bound to the antibody may be immobilized on a streptavidin plate coated with streptavidin. Alternatively, the antibody may be immobilized on an insoluble carrier via a linker.
The linker is a molecule capable of covalently binding the functional group on the surface of the insoluble carrier and the functional group of the antibody, for example, a first reactive active group capable of reacting with the functional group of the antibody, and an insoluble carrier. A molecule having a second reactive active group capable of reacting with a functional group on the surface and having a different first reactive active group and a second reactive active group is preferably used. Examples of the functional group contained in the antibody and the functional group retained on the surface of the insoluble carrier include a carboxyl group, an amino group, a glycidyl group, a sulfhydryl group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, an N-hydroxysuccinyl group and a maleimide group. And so on. Examples of the reactive group in the linker include allyl azide, carbodiimide, hydrazide, aldehyde, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, N-hydroxysuccinimide ester, pentafluorophenyl (PFP) ester, solarene, pyridyl disulfide, vinyl sulfone and the like. The basis of.

　工程（Ａ１－１）と工程（Ａ２－１）との間に洗浄工程が含まれてもよい。ただし、後述するように、洗浄工程は省略してもよい。
　例えば第１抗体が不溶性担体に固定化されている場合においては、洗浄により、不溶性担体表面から試料中の夾雑物や未反応の抗体を除去し、当該担体表面上に形成された複合体のみを分離できる。
　洗浄液には、例えばＰＢＳ溶液や界面活性剤を含有するＰＢＳ溶液等が従来汎用されている。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。 A cleaning step may be included between the steps (A1-1) and the step (A2-1). However, as will be described later, the cleaning step may be omitted.
For example, when the first antibody is immobilized on an insoluble carrier, impurities and unreacted antibodies in the sample are removed from the surface of the insoluble carrier by washing, and only the complex formed on the surface of the carrier is removed. Can be separated.
As the cleaning solution, for example, a PBS solution, a PBS solution containing a surfactant, and the like have been widely used. Examples of the surfactant include nonionic surfactants such as Tween 20 and the like.

２－１－２．工程（Ａ２－１）
　工程（Ａ２－１）は、変性剤処理工程に相当する。工程（Ａ２－１）は、複合体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させ得る方法であれば特に制限はない。工程（Ａ２－１）は、水性溶媒中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させることにより行ってもよいが、水性溶媒中で行うことが好ましい。 2-1-2. Process (A2-1)
The step (A2-1) corresponds to a denaturant treatment step. In step (A2-1), the complex and the complex-recognizing antibody can be brought into contact with each other in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex of the target substance, the first antibody, and the complex-recognizing antibody. There is no particular limitation as long as it is a method. The step (A2-1) may be carried out in an aqueous solvent or by developing in an insoluble membrane, but it is preferably carried out in an aqueous solvent.

　ここで、「複合体と複合体認識型抗体とを接触させ」とは、複合体と複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、これらが互いに接触可能となっている状態を意味する。 Here, "contacting the complex with the complex recognition type antibody" means that the complex and the complex recognition type antibody coexist in one reaction vessel so that they can come into contact with each other. Means.

　多重複合体を形成させる反応の温度は、本発明の免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。
　当該反応の時間は、本発明の免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。
　反応溶液中の複合体認識型抗体の濃度は、本発明の免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。 The temperature of the reaction for forming the multiple complex is not particularly limited as long as it is a temperature that enables the immunoassay method of the present invention, and is usually 1 ° C., 2 ° C., 3 ° C., 4 ° C., 5 ° C., 6 ° C. 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃, 10 ℃, 11 ℃, 12 ℃, 13 ℃, 14 ℃, 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃ , 24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C, 29 ° C, 30 ° C, 31 ° C, 32 ° C, 33 ° C, 34 ° C, 35 ° C, 36 ° C, 37 ° C, 38 ° C, 39 ° C, 40. ℃, 41 ℃, 42 ℃, 43 ℃, 44 ℃, 45 ℃, 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃ and the like.
The reaction time is not particularly limited as long as it enables the immunoassay method of the present invention, and is 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes. Minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 minutes, 8 minutes, 9 minutes, 10 minutes, 11 minutes, 12 minutes, 13 minutes, 14 minutes, 15 minutes, 16 minutes, 17 minutes, 18 minutes, 19 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 70 minutes, 80 minutes, 90 minutes, 100 minutes, 110 minutes, 120 minutes, 130 minutes, 140 minutes, 150 minutes, 160 minutes, 170 minutes, 180 minutes, 190 minutes , 200 minutes, 210 minutes, 220 minutes, 230 minutes, 240 minutes and the like.
The concentration of the complex recognition type antibody in the reaction solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the immunoassay method of the present invention, and is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0. 05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg / mL, etc., 0.1 The range of ~ 20 μg / mL is preferable.

　タンパク質変性剤は、反応溶液中へ直接添加されてよい。あるいは、タンパク質変性剤は複合体認識型抗体溶液に添加されていてもよく、この場合、タンパク質変性剤を含む複合体認識型抗体溶液を反応溶液に添加すればよい。
　複合体と複合体認識型抗体とが反応される溶液におけるタンパク質変性剤の濃度は、上述したとおりである。 The protein denaturant may be added directly into the reaction solution. Alternatively, the protein denaturant may be added to the complex recognition antibody solution, in which case the complex recognition antibody solution containing the protein denaturant may be added to the reaction solution.
The concentration of the protein denaturant in the solution in which the complex and the complex recognition antibody are reacted is as described above.

　本工程において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。 In this step, by holding the first antibody and the complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturing agent, non-specific binding between the first antibody and the complex recognition type antibody can be suppressed. ..

　工程（Ａ２－１）と工程（Ａ３－１）との間に洗浄工程が含まれてもよい。ただし、後述するように、洗浄工程は省略してもよい。
　例えば第１抗体が不溶性担体に固定化されている場合においては、洗浄により、不溶性担体表面から試料中の夾雑物や未反応の抗体を除去し、当該担体表面上に形成された多重複合体のみを分離できる。 A cleaning step may be included between the steps (A2-1) and the step (A3-1). However, as will be described later, the cleaning step may be omitted.
For example, when the first antibody is immobilized on an insoluble carrier, impurities and unreacted antibodies in the sample are removed from the surface of the insoluble carrier by washing, and only the multiplex complex formed on the surface of the carrier is used. Can be separated.

２－１－３．工程（Ａ３－１）
　工程（Ａ３－１）は、例えば標識物質を用いて多重複合体を検出することにより行うことができる。標識物質は、第１抗体及び複合体認識型抗体のいずれか一方に結合されていればよいが、第１抗体を不溶性担体に固定化する場合には、複合体認識型抗体に標識物質が結合されていることが好ましい。 2-1-3. Process (A3-1)
The step (A3-1) can be carried out, for example, by detecting the multiplex complex using a labeling substance. The labeling substance may be bound to either the first antibody or the complex recognition type antibody, but when the first antibody is immobilized on an insoluble carrier, the labeling substance binds to the complex recognition type antibody. It is preferable that it is.

　標識物質としては、通常の免疫測定方法において用いられる、酵素類、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、補酵素又は補酵素と特異的に結合するもの（ビオチン、アビジン）、タグ、紫外部～赤外部に吸収を有する物質、発色性微粒子、蛍光性微粒子、金属性微粒子、磁性物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質などが挙げられる。
　酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
　放射性同位元素としては、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、³²Ｐ、¹²⁵Ｐ及び¹³¹Ｉ等が挙げられる。
　蛍光性物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン　イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ－イソチオシアナート）等が挙げられる。
　発光性物質としては、例えばアクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。
　標識物質を抗体に結合させるための方法は、免疫測定の技術分野において公知である。
例えば、１個若しくは数個のアミノ酸を介して、又は、１個又は数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識物質を結合させることができる。また、標識物質を抗体に結合させるキットも各種市販されている。 Labeling substances include enzymes, radioactive isotopes, fluorescent substances, luminescent substances, DNA, RNA, coenzymes, or substances that specifically bind to coenzymes (biotin, avidin) used in ordinary immunoassay methods. , Tags, substances that absorb in the ultraviolet to infrared regions, color-developing fine particles, fluorescent fine particles, metallic fine particles, magnetic substances, substances having properties as spin labeling agents, and the like.
Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, galactosidase, glucuronidase, luciferase and the like.
Radioisotopes include, for example, ³ H, ¹⁴ C, ³⁵ S, ³² P, ¹²⁵ P and ¹³¹ I.
Examples of the fluorescent substance include FITC (fluorescein isothiocyanate) and RITC (rhodamine B-isothiocyanate).
Examples of the luminescent substance include aclidinium and its derivatives, ruthenium complex compounds, loffin and the like.
Methods for binding a labeling substance to an antibody are known in the art of immunoassay.
For example, the labeling substance can be attached to the antibody via one or several amino acids, or via a linker with one or several amino acids. In addition, various kits for binding the labeling substance to the antibody are commercially available.

　多重複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質から生じる信号を検出することにより、多重複合体を検出することができる。
　標識物質から生じる信号の測定方法は、用いる標識物質により適宜選択すればよい。
　標識物質が発色物質、すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いて吸光度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
　標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いて蛍光強度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
　標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて、発光強度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
　標識物質が放射性同位元素である場合、放射活性をシンチレーションカウンター、γ－ウェルカウンター等により、放射活性を測定することにより、標識物質を測定することができる。
　標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定することにより、標識物質を測定することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識物質を測定することができる。 The multiplex complex can be detected by detecting the signal generated from the labeling substance of the first antibody and / or the complex recognition type antibody forming the multiplex complex.
The method for measuring the signal generated from the labeling substance may be appropriately selected depending on the labeling substance to be used.
When the labeling substance is a coloring substance, that is, a substance that absorbs light of a certain wavelength, the labeling substance can be measured by measuring the absorbance using a spectrophotometer, a multi-well plate reader, or the like.
When the labeling substance is a fluorescent substance, the labeling substance can be measured by measuring the fluorescence intensity using a fluorometer, a fluorescent multi-well plate reader, or the like.
When the labeling substance is a luminescent substance, the labeling substance can be measured by measuring the luminescence intensity using a luminescent photometer, a luminescent multi-well plate reader, or the like.
When the labeling substance is a radioisotope, the labeling substance can be measured by measuring the radioactivity with a scintillation counter, a γ-well counter, or the like.
When the labeling substance is an enzyme, the labeling substance can be measured by measuring the enzyme activity. For example, the labeling substance can be measured by reacting the substrate of the enzyme with the enzyme and measuring the produced substance.

　標識物質から生じる信号に基づいて多重複合体を検出する際、複合体認識型抗体が第１抗体に結合した非特異的複合体が生じていると、非特異的複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質からも信号が生じる。非特異的複合体の標識物質からの信号は、多重複合体の標識物質から生じる信号に対するノイズとなり、Ｓ／Ｎ比を低下させる要因となる。 When detecting a multiplex complex based on a signal generated from a labeling substance, if a non-specific complex in which the complex recognition antibody is bound to the first antibody is generated, the first antibody that forms the non-specific complex is generated. A signal is also generated from the labeling substance of the complex recognition antibody and / or the complex recognition type antibody. The signal from the labeling substance of the non-specific complex becomes noise with respect to the signal generated from the labeling substance of the multiple complex, and becomes a factor of lowering the S / N ratio.

　本実施形態では、変性剤処理工程（工程（Ａ２－１）が相当）において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。
　したがって、非特異的複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質からのノイズの検出を抑制して、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
　このため、特に工程（Ａ１－１）と工程（Ａ２－１）との間、及び／又は、工程（Ａ２－１）と前記工程（Ａ３－１）との間の洗浄工程を省略した場合にも、高いＳ／Ｎ比を実現し得る。 In the present embodiment, in the denaturant treatment step (corresponding to step (A2-1)), the first antibody and the complex recognition type antibody are combined with the first antibody by holding them in a solvent containing a protein denaturant. Non-specific binding with body-recognizing antibody can be suppressed.
Therefore, it is possible to suppress the detection of noise from the labeling substance of the first antibody and / or the complex recognition type antibody forming the non-specific complex, and improve the S / N ratio.
Therefore, especially when the cleaning step between the step (A1-1) and the step (A2-1) and / or between the step (A2-1) and the step (A3-1) is omitted. Also, a high S / N ratio can be achieved.

　さらに、工程（Ａ３－１）は以下の工程を含むことにより、試料中の対象物質の濃度を決定できる。
　既知濃度の対象物質を用いて多重複合体の検出までを行い、対象物質濃度と測定値との関係を表す検量線を作成すること（以下、「検量線作成工程」という）；及び
　検量線作成工程で作成された検量線と、試料の測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 Further, the step (A3-1) includes the following steps, so that the concentration of the target substance in the sample can be determined.
Performing up to the detection of multiple complexes using a target substance with a known concentration, and creating a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value (hereinafter referred to as the "calibration curve creation step"); and creating a calibration curve. Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve created in the process and the measured value of the sample.

［測定方法１：サンドイッチＥＬＩＳＡ１］
　本実施形態は、例えば以下の工程を含むサンドイッチＥＬＩＳＡとして好適に実施され得る。
〔Ａ１－１〕　試料中の対象物質と第１抗体と接触させて複合体を形成させること；
〔Ａ２－１〕　複合体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて多重複合体を形成させること；
〔Ａ３－１〕　多重複合体を測定すること；
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－１〕－工程〔Ａ３－１〕を行い、対象物質濃度と多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び〔５〕　検量線作成工程で作成された検量線と、工程〔Ａ３－１〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 1: Sandwich ELISA1]
This embodiment can be suitably implemented as a sandwich ELISA including, for example, the following steps.
[A1-1] Contacting the target substance in the sample with the first antibody to form a complex;
[A2-1] Contacting a complex with a complex-recognizing antibody in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex;
[A3-1] Measuring multiple complexes;
[4] Using a target substance having a known concentration as a sample, perform step [A1-1] -step [A3-1] to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of the multiple complex. That; and [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve created in the calibration curve preparation step and the measured value obtained by the measurement in step [A3-1].

［測定方法２：ラテックス凝集法１］
　また、本実施形態は、例えば以下の工程を含むラテックス凝集法としても好適に実施され得る。
〔Ａ１－１〕　試料中の対象物質と、不溶性担体粒子が結合した第１抗体と、を水性溶媒中で接触させ、対象物質と、不溶性担体粒子が結合した第１抗体と、の複合体を形成させること；
〔Ａ２－１〕　工程〔Ａ１－１〕後の溶液に、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体を添加し、複合体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体とを、タンパク質変性剤の存在下で接触させ、凝集を生成させること；
〔Ａ３－１〕　凝集を測定すること；
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－１〕－〔Ａ３－１〕を行い、対象物質濃度と凝集の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕　工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔Ａ３－１〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 2: Latex agglutination method 1]
Further, this embodiment can also be preferably implemented as a latex agglutination method including, for example, the following steps.
[A1-1] The target substance in the sample and the first antibody to which the insoluble carrier particles are bound are brought into contact with each other in an aqueous solvent to form a complex of the target substance and the first antibody to which the insoluble carrier particles are bound. To form;
[A2-1] A complex recognition antibody to which insoluble carrier particles are bound is added to the solution after the step [A1-1], and the complex and the complex recognition antibody to which the insoluble carrier particles are bound are combined with a protein. Contacting in the presence of a modifier to generate agglomerates;
[A3-1] Measuring aggregation;
[4] Using a target substance of a known concentration as a sample, perform steps [A1-1]-[A3-1] to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of aggregation; [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve prepared in step [4] and the measured value obtained by the measurement in step [A3-1].

　ラテックス凝集法に用いる不溶性担体粒子としては、特に限定されないが、例えばラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられ、ラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の素材としては、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等が挙げられる。
　不溶性担体粒子の粒径は、特に限定されないが、平均粒径で、例えば３０～８００ｎｍであり、１００～５００ｎｍが好ましく、１５０～４５０ｎｍがより好ましい。
　第１抗体が結合する不溶性担体粒子と、複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子とは同じであっても異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。 The insoluble carrier particles used in the latex agglutination method are not particularly limited, and examples thereof include latex particles and magnetic particles, and latex particles are preferable. Examples of the material of the latex particles include polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene and the like.
The particle size of the insoluble carrier particles is not particularly limited, but the average particle size is, for example, 30 to 800 nm, preferably 100 to 500 nm, and more preferably 150 to 450 nm.
The insoluble carrier particles to which the first antibody binds and the insoluble carrier particles to which the complex recognition type antibody binds may be the same or different, but are preferably the same.

　不溶性担体粒子の反応溶液中の濃度は、本発明の免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．００００５、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量％等が挙げられる。 The concentration of the insoluble carrier particles in the reaction solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the immunoassay method of the present invention, and is 0.00005, 0.0001, 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007, 0.0008, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0. 008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% by weight, etc. Can be mentioned.

　凝集の測定は、例えば吸光度を測定する方法、及び散乱光を測定する方法等によって行い得る。 Aggregation can be measured by, for example, a method of measuring absorbance, a method of measuring scattered light, or the like.

２－２．実施形態１－２
　本実施形態に係る方法は以下の工程を含む。
（Ａ１－２）　試料中の対象物質と第１抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて複合体を形成させる工程。
（Ａ２－２）　複合体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて多重複合体を形成させる工程。
（Ａ３－２）　多重複合体を検出する工程。
　以下、各工程について順に説明する。各工程において実施形態１－１と同様であってよい事項は説明を省略する。 2-2. Embodiment 1-2
The method according to this embodiment includes the following steps.
(A1-2) A step of contacting a target substance in a sample with a first antibody in the presence of a protein denaturing agent to form a complex.
(A2-2) A step of contacting a complex and a complex-recognizing antibody in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex.
(A3-2) A step of detecting a multiple complex.
Hereinafter, each step will be described in order. Items that may be the same as those in the first embodiment in each step will not be described.

２－２－１．工程（Ａ１－２）
　工程（Ａ１－２）は、試料中の対象物質と第１抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて、対象物質と第１抗体との複合体を形成させ得る方法であれば特に制限はない。
　工程（Ａ１－２）は、タンパク質変性剤の存在下で行われる点を除いて、上述の工程（Ａ１－１）と同様に行うことができる。 2-2-1. Process (A1-2)
The step (A1-2) is particularly limited as long as it is a method capable of contacting the target substance and the first antibody in the sample in the presence of a protein denaturant to form a complex of the target substance and the first antibody. There is no.
The step (A1-2) can be carried out in the same manner as the above-mentioned step (A1-1) except that the step (A1-2) is carried out in the presence of a protein denaturing agent.

　タンパク質変性剤は、反応溶液中へ直接添加されてよい。あるいは、タンパク質変性剤は第１抗体溶液及び／又は試料を希釈するための溶媒に添加されていてもよく、タンパク質変性剤を含む第１抗体溶液及び／又は試料溶液を反応溶液に添加してもよい。
　対象物質と第１抗体とが反応される溶液におけるタンパク質変性剤の濃度は、上述した、複合体と複合体認識型抗体とが反応される溶液におけるタンパク質変性剤の濃度と同じであってよい。 The protein denaturant may be added directly into the reaction solution. Alternatively, the protein denaturant may be added to the first antibody solution and / or the solvent for diluting the sample, or the first antibody solution and / or the sample solution containing the protein denaturant may be added to the reaction solution. good.
The concentration of the protein denaturant in the solution in which the target substance and the first antibody are reacted may be the same as the concentration of the protein denaturant in the solution in which the complex and the complex recognition type antibody are reacted as described above.

　工程（Ａ１－２）と工程（Ａ２－２）との間に洗浄工程が含まれてもよい。ただし、後述するように、洗浄工程は省略してもよい。 A cleaning step may be included between the steps (A1-2) and the step (A2-2). However, as will be described later, the cleaning step may be omitted.

２－２－２．工程（Ａ２－２）
　工程（Ａ２－２）は、変性剤処理工程に相当する。工程（Ａ２－２）は、工程（Ａ２－１）と同様に行うことができる。 2-2-2. Process (A2-2)
The step (A2-2) corresponds to a denaturant treatment step. The step (A2-2) can be performed in the same manner as the step (A2-1).

　工程（Ａ１－２）と工程（Ａ２－２）との間に洗浄を行う場合には、タンパク質変性剤は、反応溶液中へ新たに添加される。工程（Ａ１－２）と工程（Ａ２－２）との間に洗浄を行わない場合には、タンパク質変性剤は、工程（Ａ１－２）において反応溶液に添加されたものであってよく、また本工程において新たに反応溶液中へ添加されたものであってもよい。 When washing is performed between the steps (A1-2) and the step (A2-2), the protein denaturant is newly added to the reaction solution. If no wash is performed between step (A1-2) and step (A2-2), the protein denaturant may have been added to the reaction solution in step (A1-2). It may be newly added to the reaction solution in this step.

　工程（Ａ２－２）と工程（Ａ３－２）との間に洗浄工程が含まれてもよい。ただし、後述するように、洗浄工程は省略してもよい。 A cleaning step may be included between the steps (A2-2) and the steps (A3-2). However, as will be described later, the cleaning step may be omitted.

２－２－３．工程（Ａ３－２）
　工程（Ａ３－２）は、工程（Ａ３－１）と同様に行うことができる。 2-2-3. Process (A3-2)
The step (A3-2) can be performed in the same manner as the step (A3-1).

　本実施形態においても、変性剤処理工程（工程（Ａ２－２）が相当）において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。
　したがって、非特異的複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質からのノイズの検出を抑制して、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
　このため、特に工程（Ａ１－２）と工程（Ａ２－２）との間、及び／又は、工程（Ａ２－２）と前記工程（Ａ３－２）との間の洗浄工程を省略した場合にも、高いＳ／Ｎ比を実現し得る。 Also in the present embodiment, in the denaturant treatment step (corresponding to step (A2-2)), the first antibody and the complex recognition type antibody are retained in a solvent containing a protein denaturant to obtain the first antibody. Non-specific binding with complex recognition type antibody can be suppressed.
Therefore, it is possible to suppress the detection of noise from the labeling substance of the first antibody and / or the complex recognition type antibody forming the non-specific complex, and improve the S / N ratio.
Therefore, especially when the cleaning step between the step (A1-2) and the step (A2-2) and / or between the step (A2-2) and the step (A3-2) is omitted. Also, a high S / N ratio can be achieved.

［測定方法３：イムノクロマト法１］
　本実施形態は、例えば以下の工程を含むイムノクロマト法として好適に実施され得る。
〔１〕　テストストリップの試料供給部に、試料を供給すること；
〔Ａ１－２〕　試料中の対象物質を、標識化抗体保持部に保持された第１抗体と、タンパク質変性剤の存在下で接触させ、対象物質と第１抗体との複合体を形成させること；
〔Ａ２－２〕　検出部において、複合体に複合体認識型抗体をタンパク質変性剤の存在下で接触させ、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；〔Ａ３－２〕　多重複合体を測定すること。 [Measurement method 3: Lateral flow test 1]
This embodiment can be suitably implemented as an immunochromatographic method including, for example, the following steps.
[1] Supplying a sample to the sample supply section of the test strip;
[A1-2] The target substance in the sample is brought into contact with the first antibody held in the labeled antibody holding portion in the presence of a protein denaturing agent to form a complex of the target substance and the first antibody. ;
[A2-2] In the detection unit, the complex is brought into contact with the complex in the presence of a protein denaturant to form a multiple complex of the target substance, the first antibody, and the complex recognition antibody; [A3-2] To measure a multiplex complex.

　さらに、以下の工程を含むことにより、試料中の対象物質の濃度を決定できる。
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－２〕－〔Ａ３－２〕を行い、対象物質濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び〔５〕　工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔Ａ３－２〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 Furthermore, the concentration of the target substance in the sample can be determined by including the following steps.
[4] Using a target substance having a known concentration as a sample, the steps [A1-2]-[A3-2] are performed to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of the multiplex complex. And [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve prepared in step [4] and the measured value obtained by the measurement in step [A3-2].

　テストストリップは、試料供給部を備え、これを最上流として液体の試料が展開する方向に従って順に標識化抗体保持部、展開部、検出部及び吸収部をさらに備える。 The test strip is provided with a sample supply unit, and with this as the uppermost stream, a labeled antibody holding unit, a developing unit, a detecting unit, and an absorbing unit are further provided in order according to the direction in which the liquid sample develops.

　試料供給部とは、液体の試料が供給される場所であり、当該試料を吸収し、液体と対象物質とが通り抜けることができる物質及び形態であればよい。
　試料供給部を構成する素材は、液体の試料が吸収され、液体の試料が展開されていくような性質を有する素材であれば特に制限はなく、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ガラスファイバー、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。 The sample supply unit is a place where a liquid sample is supplied, and may be any substance and form that can absorb the sample and allow the liquid and the target substance to pass through.
The material constituting the sample supply unit is not particularly limited as long as it has the property of absorbing the liquid sample and developing the liquid sample. For example, cellulose, nitrocellulose, glass fiber, polyester, etc. Examples thereof include polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon and cotton cloth.

　標識化抗体保持部とは、標識物質が結合した第１抗体が溶出可能に保持された場所であり、試料供給部の下流に位置する。
　標識化抗体保持部を構成する素材は、標識物質が結合した第１抗体が溶出可能に保持される素材であれば特に制限はなく、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート又はポリウレタン、綿布等が挙げられる。
　標識物質としては、前記工程（３Ａ－１）記載の標識物質が挙げられる。第１抗体へ標識物質を結合する方法は、前記工程（３Ａ－１）記載の結合方法が挙げられる。 The labeled antibody holding section is a place where the first antibody to which the labeling substance is bound is held so that it can be eluted, and is located downstream of the sample supply section.
The material constituting the labeled antibody holding portion is not particularly limited as long as it is a material that retains the first antibody to which the labeling substance is bound so that it can be eluted. For example, cellulose, nitrocellulose, nylon, glass fiber, polycarbonate, polyethylene. , Polypurpyrene, polystyrene, polyethylene terephthalate or polyurethane, cotton cloth and the like.
Examples of the labeling substance include the labeling substance described in the above step (3A-1). Examples of the method for binding the labeling substance to the first antibody include the binding method described in the above step (3A-1).

　展開部とは、対象物質を含む試料が毛細管現象によって展開される場所である。検出部には、複合体認識型抗体が固定化されている。
　展開部及び検出部は、多孔質体からなるメンブレンからなる。メンブレンの素材は、毛細管現象により液体の試料を吸収し移動させることができる素材であれば特に制限はなく、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート又はポリウレタン等が挙げられる。 The unfolding part is a place where the sample containing the target substance is unfolded by the capillary phenomenon. A complex recognition type antibody is immobilized on the detection unit.
The developing part and the detecting part are made of a membrane made of a porous body. The material of the membrane is not particularly limited as long as it can absorb and move a liquid sample by capillarity. For example, cellulose, nitrocellulose, nylon, glass fiber, polycarbonate, polyethylene, polypurpyrene, polystyrene, polyethylene terephthalate. Alternatively, polyurethane and the like can be mentioned.

　吸収部とは、液体の試料を吸収する場所である。液体の試料を吸収する能力を有する吸収部を備えることで、試料が毛細管現象によって試料供給部から検出部まで展開され易くなる。
　吸収部の素材は、試料を吸収する能力を有する素材であれば特に制限はなく、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ガラスファイバー、綿布、吸水性ポリマーを包含した複合材等が挙げられる。 The absorption unit is a place where a liquid sample is absorbed. By providing an absorption unit having an ability to absorb a liquid sample, the sample can be easily expanded from the sample supply unit to the detection unit by the capillary phenomenon.
The material of the absorbing portion is not particularly limited as long as it has an ability to absorb a sample, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, glass fiber, cotton cloth, and a composite material containing a water-absorbing polymer.

　タンパク質変性剤は、試料供給部、標識化抗体保持部及び展開部の少なくとも１つの部位に含まれることで、展開部において対象物質と第１抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触させられる。さらに続いて、検出部において、複合体と、検出部に固定化された複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触し、多重複合体が形成される。 The protein denaturant is contained in at least one site of the sample supply part, the labeled antibody holding part and the developing part, so that the target substance and the first antibody are brought into contact with each other in the presence of the protein denaturing part in the developing part. Subsequently, in the detection unit, the complex and the complex recognition type antibody immobilized on the detection unit come into contact with each other in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex.

　また、タンパク質変性剤は試料を希釈するための溶媒に添加されていてよく、当該溶媒で希釈した試料を試料供給部に供給することで、展開部において対象物質と第１抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触させられる。さらに続いて、検出部において、複合体と、検出部に固定化された複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触し、多重複合体が形成される。 Further, the protein denaturant may be added to a solvent for diluting the sample, and by supplying the sample diluted with the solvent to the sample supply section, the target substance and the first antibody become the protein denaturant in the developing section. Are contacted in the presence of. Subsequently, in the detection unit, the complex and the complex recognition type antibody immobilized on the detection unit come into contact with each other in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex.

２－３．実施形態１－３
（Ａ１－３）　試料中の対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて多重複合体を形成させる工程。
（Ａ３－３）　多重複合体を検出する工程。
　以下、各工程について順に説明する。各工程において実施形態１－１と同様であってよい事項は説明を省略する。 2-3. Embodiment 1-3
(A1-3) A step of contacting a target substance in a sample, a first antibody, and a complex recognition type antibody in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex.
(A3-3) A step of detecting a multiple complex.
Hereinafter, each step will be described in order. Items that may be the same as those in the first embodiment in each step will not be described.

２－３－１．工程（Ａ１－３）
　工程（Ａ１－３）は、変性剤処理工程に相当する。工程（Ａ１－３）は、試料中の対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体をタンパク質変性剤の存在下で接触させて、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体の多重複合体を形成させ得る方法であれば特に制限はない。
　工程（Ａ１－３）は、水性溶媒中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させることにより行ってもよいが、水性溶媒中で行うことが好ましい。 2-3-1. Process (A1-3)
The step (A1-3) corresponds to the denaturant treatment step. In step (A1-3), the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody in the sample are brought into contact with each other in the presence of a protein modifier, and the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody are duplicated. There is no particular limitation as long as it is a method capable of forming a coalescence.
The step (A1-3) may be carried out in an aqueous solvent or by developing in an insoluble membrane, but it is preferably carried out in an aqueous solvent.

　ここで、「対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させ」とは、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、これらが互いに接触可能となっている状態を意味する。この場合において、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とはどのような順番で添加して接触させてもよい。 Here, "contacting the target substance with the first antibody and the complex recognition type antibody" means that the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody coexist in one reaction vessel, and these are used. It means a state in which they can come into contact with each other. In this case, the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody may be added in any order and brought into contact with each other.

　多重複合体を形成させる反応の温度は、本発明の免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。
　当該反応の時間は、本発明の免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。
　反応溶液中の第１抗体及び複合体認識型抗体の濃度は、本発明の免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。 The temperature of the reaction for forming the multiple complex is not particularly limited as long as it is a temperature that enables the immunoassay method of the present invention, and is usually 1 ° C., 2 ° C., 3 ° C., 4 ° C., 5 ° C., 6 ° C. 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃, 10 ℃, 11 ℃, 12 ℃, 13 ℃, 14 ℃, 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃ , 24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C, 29 ° C, 30 ° C, 31 ° C, 32 ° C, 33 ° C, 34 ° C, 35 ° C, 36 ° C, 37 ° C, 38 ° C, 39 ° C, 40. ℃, 41 ℃, 42 ℃, 43 ℃, 44 ℃, 45 ℃, 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃ and the like.
The reaction time is not particularly limited as long as it enables the immunoassay method of the present invention, and is 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes. Minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 minutes, 8 minutes, 9 minutes, 10 minutes, 11 minutes, 12 minutes, 13 minutes, 14 minutes, 15 minutes, 16 minutes, 17 minutes, 18 minutes, 19 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 70 minutes, 80 minutes, 90 minutes, 100 minutes, 110 minutes, 120 minutes, 130 minutes, 140 minutes, 150 minutes, 160 minutes, 170 minutes, 180 minutes, 190 minutes , 200 minutes, 210 minutes, 220 minutes, 230 minutes, 240 minutes and the like.
The concentrations of the first antibody and the complex recognition type antibody in the reaction solution are not particularly limited as long as they are concentrations that enable the immunoassay method of the present invention, and are 0.01, 0.02, 0.03, 0. 04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg / mL, etc. , 0.1 to 20 μg / mL is preferred.

　第１抗体又は複合体認識型抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。 The first antibody or complex recognition type antibody is preferably immobilized on an insoluble carrier.

　タンパク質変性剤は、反応溶液中へ直接添加されてよい。あるいは、タンパク質変性剤は第１抗体溶液、複合体認識型抗体溶液及び／又は試料を希釈するための溶媒に添加されていてもよく、この場合、タンパク質変性剤を含む第１抗体溶液、複合体認識型抗体溶液及び／又は試料溶液を反応溶液に添加すればよい。
　対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とが反応される溶液におけるタンパク質変性剤の濃度は、上述した、複合体と複合体認識型抗体とが反応される溶液におけるタンパク質変性剤の濃度と同じであってよい。 The protein denaturant may be added directly into the reaction solution. Alternatively, the protein denaturant may be added to the first antibody solution, the complex recognition antibody solution and / or the solvent for diluting the sample, in which case the first antibody solution, the complex containing the protein denaturant. The recognition antibody solution and / or the sample solution may be added to the reaction solution.
The concentration of the protein denaturant in the solution in which the target substance, the first antibody and the complex recognition antibody are reacted is the same as the concentration of the protein denaturant in the solution in which the complex and the complex recognition antibody are reacted as described above. It can be the same.

　工程（Ａ１－３）と工程（Ａ３－３）との間に洗浄工程が含まれてもよい。ただし、後述するように、洗浄工程は省略してもよい。 A cleaning step may be included between the steps (A1-3) and the steps (A3-3). However, as will be described later, the cleaning step may be omitted.

２－３－２．工程（Ａ３－３）
　工程（Ａ３－３）は、工程（Ａ３－１）と同様に行うことができる。 2-3-2. Process (A3-3)
The step (A3-3) can be performed in the same manner as the step (A3-1).

　本実施形態においても、変性剤処理工程（工程（Ａ１－３）が相当）において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。
　したがって、非特異的複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質からのノイズの検出を抑制して、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
　このため、特に工程（Ａ１－３）と工程（Ａ３－３）との間の洗浄工程を省略した場合にも、高いＳ／Ｎ比を実現し得る。 Also in the present embodiment, in the denaturant treatment step (corresponding to step (A1-3)), the first antibody and the complex recognition type antibody are retained in a solvent containing a protein denaturant to obtain the first antibody. Non-specific binding with complex recognition type antibody can be suppressed.
Therefore, it is possible to suppress the detection of noise from the labeling substance of the first antibody and / or the complex recognition type antibody forming the non-specific complex, and improve the S / N ratio.
Therefore, a high S / N ratio can be realized even when the cleaning step between the steps (A1-3) and the step (A3-3) is omitted.

［測定方法４：サンドイッチＥＬＩＳＡ２］
　本実施形態は、例えば以下の工程を含むサンドイッチＥＬＩＳＡとして好適に実施され得る。
〔Ａ１－３〕　試料中の対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤の存在下で接触させて多重複合体を形成させること；
〔Ａ３－３〕　多重複合体を測定すること。
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－３〕，工程〔Ａ３－３〕を行い、対象物質濃度と多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び〔５〕　検量線作成工程で作成された検量線と、工程〔Ａ３－３〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 4: Sandwich ELISA2]
This embodiment can be suitably implemented as a sandwich ELISA including, for example, the following steps.
[A1-3] The target substance in the sample, the first antibody, and the complex recognition type antibody are brought into contact with each other in the presence of a protein denaturing agent to form a multiple complex;
[A3-3] To measure the multiplex complex.
[4] Using a target substance with a known concentration as a sample, perform steps [A1-3] and [A3-3] to create a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of the multiple complex. That; and [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve created in the calibration curve preparation step and the measured value obtained by the measurement in step [A3-3].

［測定方法５：ラテックス凝集法２］
　また、本実施形態は、例えば以下の工程を含むラテックス凝集法としても好適に実施され得る。
〔Ａ１－３〕　水性溶媒中で、試料中の対象物質と、不溶性担体粒子が結合した第１抗体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体、とをタンパク質変性剤の存在下で接触させ、凝集を形成させること；
〔Ａ３－３〕　凝集を測定すること；
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－３〕，〔Ａ３－３〕を行い、対象物質濃度と凝集の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕　工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔Ａ３－３〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 5: Latex agglutination method 2]
Further, this embodiment can also be preferably implemented as a latex agglutination method including, for example, the following steps.
[A1-3] In an aqueous solvent, the target substance in the sample, the first antibody to which the insoluble carrier particles are bound, and the complex recognition type antibody to which the insoluble carrier particles are bound are contacted in the presence of a protein modifier. To form agglomerates;
[A3-3] Measuring aggregation;
[4] Perform steps [A1-3] and [A3-3] using a target substance having a known concentration as a sample to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of aggregation; [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve prepared in step [4] and the measured value obtained by the measurement in step [A3-3].

［測定方法６：イムノクロマト法２］
　本実施形態は、例えば以下の工程を含むイムノクロマト法として好適に実施され得る。
〔１〕　テストストリップの試料供給部に、試料を供給すること；
〔Ａ１－３〕　試料中の対象物質と、標識化抗体保持部に保持された複合体認識型抗体と、検出部に固定化された第１抗体と、を検出部においてタンパク質変性剤の存在下で接触させ、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；
〔Ａ３－３〕　多重複合体を測定すること。 [Measurement method 6: Lateral flow test 2]
This embodiment can be suitably implemented as an immunochromatographic method including, for example, the following steps.
[1] Supplying a sample to the sample supply section of the test strip;
[A1-3] The target substance in the sample, the complex recognition type antibody held in the labeled antibody holding part, and the first antibody immobilized in the detection part are present in the detection part in the presence of a protein modifier. To form a multiplex complex of the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody.
[A3-3] To measure the multiplex complex.

　さらに、以下の工程を含むことにより、試料中の対象物質の濃度を決定できる。
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ａ１－３〕，〔Ａ３－３〕を行い、対象物質濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び〔５〕　工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔Ａ３－３〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 Furthermore, the concentration of the target substance in the sample can be determined by including the following steps.
[4] Using a target substance having a known concentration as a sample, the steps [A1-3] and [A3-3] are performed to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of the multiplex complex. And [5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve prepared in step [4] and the measured value obtained by the measurement in step [A3-3].

　テストストリップの構成は、標識化抗体保持部に標識物質が結合した複合体認識型抗体を溶出可能に保持させ、検出部に第１抗体を固定化する点を除き、前述のイムノクロマト法１で用いるテストストリップと同様である。 The structure of the test strip is used in the above-mentioned immunochromatography method 1 except that the labeled antibody holding portion retains the complex recognition type antibody to which the labeling substance is bound so that it can be eluted and the first antibody is immobilized on the detecting portion. Similar to the test strip.

　タンパク質変性剤は、試料供給部、標識化抗体保持部、展開部又は検出部の少なくとも１つの部位に含まれることで、検出部において、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触し、多重複合体が形成される。 The protein denaturant is contained in at least one site of the sample supply section, the labeled antibody holding section, the developing section or the detection section, and in the detection section, the target substance, the first antibody and the complex recognition type antibody are proteins. Contact in the presence of a denaturant to form a multiplex complex.

　また、タンパク質変性剤は試料を希釈するための溶媒に添加されていてよく、当該溶媒で希釈した試料を試料供給部に供給することで、検出部において、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触し、多重複合体が形成される。 In addition, the protein denaturant may be added to a solvent for diluting the sample, and by supplying the sample diluted with the solvent to the sample supply unit, the detection unit recognizes the target substance, the first antibody, and the complex. The type antibody comes into contact with the protein denaturant in the presence of a protein denaturant to form a multiplex complex.

３．免疫測定方法の第二実施形態（変性剤処理工程が対象物質の非存在下で行われる形態）
３－１．実施形態２－１
　本実施形態に係る方法は以下の工程を含む。
（Ｂ１ａ）　第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に溶解し抗体溶液を調製する工程。
（Ｂ１ｂ）　抗体溶液の溶媒を、タンパク質変性剤を含まない溶媒に置換する工程。
（Ｂ２）　溶媒置換後の抗体溶液と試料とを混合し、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させて多重複合体を形成させる工程。
（Ｂ３）　多重複合体を検出する工程。 3. 3. The second embodiment of the immunoassay method (a form in which the denaturant treatment step is performed in the absence of the target substance)
3-1. Embodiment 2-1
The method according to this embodiment includes the following steps.
(B1a) A step of dissolving a first antibody and a complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturing agent to prepare an antibody solution.
(B1b) A step of replacing the solvent of the antibody solution with a solvent containing no protein denaturant.
(B2) A step of mixing the antibody solution after solvent replacement and the sample, and contacting the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody to form a multiple complex.
(B3) A step of detecting a multiple complex.

３－１－１．工程（Ｂ１ａ）
　工程（Ｂ１ａ）は、変性剤処理工程に相当する。工程（Ｂ１ａ）では、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に溶解させることで互いに接触させる。
ここで、「複合体と複合体認識型抗体とを接触させ」とは、複合体と複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、これらが互いに接触可能となっている状態を意味する。第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。 3-1-1. Process (B1a)
The step (B1a) corresponds to a denaturant treatment step. In step (B1a), the first antibody and the complex recognition type antibody are brought into contact with each other by dissolving them in a solvent containing a protein denaturing agent.
Here, "contacting the complex with the complex recognition type antibody" means that the complex and the complex recognition type antibody coexist in one reaction vessel so that they can come into contact with each other. Means. By holding the first antibody and the complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturing agent, non-specific binding between the first antibody and the complex recognition type antibody can be suppressed.

　タンパク質変性剤は、溶媒中へ直接添加されてよい。あるいは、タンパク質変性剤は第１抗体溶液及び／又は複合体認識型抗体溶液に添加されていてもよく、この場合、タンパク質変性剤を含む第１抗体溶液及び／又は複合体認識型抗体溶液を溶媒に添加すればよい。
　第１抗体と複合体認識型抗体とタンパク質変性剤とを含む溶液におけるタンパク質変性剤の濃度は、上述したとおりである。 The protein denaturant may be added directly into the solvent. Alternatively, the protein denaturant may be added to the first antibody solution and / or the complex recognition antibody solution, in which case the first antibody solution and / or the complex recognition antibody solution containing the protein denaturant is used as a solvent. It may be added to.
The concentration of the protein denaturant in the solution containing the first antibody, the complex recognition type antibody and the protein denaturant is as described above.

３－１－２．工程（Ｂ１ｂ）
　工程（Ｂ１ｂ）における溶媒の置換は、例えば以下のいずれかの方法により行うことができる。
（１）第１抗体及び複合体認識型抗体と、タンパク質変性剤との間の分子量の差を利用し、透析やゲル濾過クロマトグラフィーにより溶媒を置換する。
（２）第１抗体及び複合体認識型抗体と、タンパク質変性剤との間の電気的性質の差を利用し、イオン交換クロマトグラフィーにより溶媒を置換する。
（３）第１抗体及び複合体認識型抗体と、タンパク質変性剤との間の疎水性の差を利用し、疎水クロマトグラフィーにより溶媒を置換する。
（４）第１抗体及び複合体認識型抗体を不溶性担体に固定化し、Ｂ／Ｆ分離行うことにより溶媒を置換する。
（５）イムノクロマト法において、第１抗体及び複合体認識型抗体と、タンパク質変性剤との間の展開速度の差を利用して溶媒を置換する。 3-1-2. Process (B1b)
The solvent substitution in the step (B1b) can be performed by, for example, any of the following methods.
(1) Utilizing the difference in molecular weight between the first antibody and the complex recognition type antibody and the protein denaturing agent, the solvent is replaced by dialysis or gel filtration chromatography.
(2) The solvent is replaced by ion exchange chromatography by utilizing the difference in electrical properties between the first antibody and the complex recognition type antibody and the protein denaturing agent.
(3) Utilizing the difference in hydrophobicity between the first antibody and the complex recognition type antibody and the protein denaturing agent, the solvent is replaced by hydrophobic chromatography.
(4) The first antibody and the complex recognition type antibody are immobilized on an insoluble carrier, and the solvent is replaced by performing B / F separation.
(5) In the immunochromatography method, the solvent is replaced by utilizing the difference in the developing rate between the first antibody and the complex recognition type antibody and the protein denaturing agent.

３－１－３．工程（Ｂ２）
　工程（Ｂ２）は、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させて、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体の多重複合体を形成させ得る方法であれば特に制限はない。
ここで、「対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させ」とは、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、これらが互いに接触可能となっている状態を意味する。 3-1-3. Process (B2)
The step (B2) is particularly limited as long as it is a method capable of contacting the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody to form a multiple complex of the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody. There is no.
Here, "contacting the target substance with the first antibody and the complex recognition type antibody" means that the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody coexist in one reaction vessel, and these are used. It means a state in which they can come into contact with each other.

　工程（Ｂ２）と工程（Ｂ３）との間に洗浄工程が含まれてもよい。 A cleaning step may be included between the steps (B2) and the step (B3).

３－１－４．工程（Ｂ３）
　工程（Ｂ３）は、工程（Ａ３－１）と同様に行うことができる。 3-1-4. Process (B3)
The step (B3) can be performed in the same manner as the step (A3-1).

　標識物質から生じる信号に基づいて多重複合体を検出する際、複合体認識型抗体が第１抗体に結合した非特異的複合体が生じていると、非特異的複合体を形成する第１抗体及び／又は複合体認識型抗体の標識物質からも信号が生じる。非特異的複合体の標識物質からの信号は、多重複合体の標識物質から生じる信号に対するノイズとなり、Ｓ／Ｎ比を低下させる要因となる。例えば第１抗体と複合体認識型抗体とが混合された抗体溶液を長期間保存後に測定に用いるような場合には、保存期間中に非特異的複合体が形成されてノイズを生じさせる可能性がある。 When detecting a multiplex complex based on a signal generated from a labeling substance, if a non-specific complex in which the complex recognition antibody is bound to the first antibody is generated, the first antibody that forms the non-specific complex is generated. A signal is also generated from the labeling substance of the complex recognition antibody and / or the complex recognition type antibody. The signal from the labeling substance of the non-specific complex becomes noise with respect to the signal generated from the labeling substance of the multiple complex, and becomes a factor of lowering the S / N ratio. For example, when an antibody solution in which a first antibody and a complex recognition type antibody are mixed is used for measurement after long-term storage, a non-specific complex may be formed during the storage period to generate noise. There is.

　本実施形態では、変性剤処理工程（工程（Ｂ１ａ）が相当）において、第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持することによって、第１抗体と複合体認識型抗体との非特異的な結合を抑制することができる。
　したがって、例えば第１抗体と複合体認識型抗体とが混合された抗体溶液を長期間保存後に測定に用いるような場合にも、非特異的複合体の標識物質からのノイズの検出を抑制して、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。 In the present embodiment, in the denaturant treatment step (corresponding to step (B1a)), the first antibody and the complex recognition type antibody are retained in a solvent containing a protein denaturant to recognize the first antibody and the complex. Non-specific binding to type antibody can be suppressed.
Therefore, for example, even when an antibody solution in which the first antibody and the complex recognition type antibody are mixed is used for measurement after long-term storage, the detection of noise from the labeling substance of the non-specific complex is suppressed. , The S / N ratio can be improved.

［測定方法７：サンドイッチＥＬＩＳＡ３］
　本実施形態は、例えば以下の工程を含むサンドイッチＥＬＩＳＡとして好適に実施され得る。
〔Ｂ１ａ〕　第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に溶解し抗体溶液を調製すること；
〔Ｂ１ｂ〕　抗体溶液の溶媒を、タンパク質変性剤を含まない溶媒に置換すること；
〔Ｂ２〕　溶媒置換後の抗体溶液と試料とを混合し、対象物質と第１抗体と複合体認識型抗体とを接触させて多重複合体を形成させること；
〔Ｂ３〕　多重複合体を測定すること。
〔４〕試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ｂ１ａ〕－工程〔Ｂ２〕を行い、対象物質濃度と多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕検量線作成工程で作成された検量線と、工程〔Ｂ３〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 7: Sandwich ELISA3]
This embodiment can be suitably implemented as a sandwich ELISA including, for example, the following steps.
[B1a] To prepare an antibody solution by dissolving the first antibody and the complex recognition type antibody in a solvent containing a protein denaturant;
[B1b] Replacing the solvent of the antibody solution with a solvent containing no protein denaturant;
[B2] The antibody solution after solvent replacement and the sample are mixed, and the target substance, the first antibody, and the complex recognition type antibody are brought into contact with each other to form a multiple complex;
[B3] To measure the multiplex complex.
[4] Using a target substance of a known concentration as a sample, perform step [B1a] -step [B2] to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of the multiple complex; and [ 5] Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve created in the calibration curve preparation step and the measured value obtained by the measurement in step [B3].

［測定方法８：ラテックス凝集法３］
　また、本実施形態は、例えば以下の工程を含むラテックス凝集法としても好適に実施され得る。
〔Ｂ１ａ〕　不溶性担体粒子が結合した第１抗体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に溶解し、抗体溶液を調製すること；
〔Ｂ１ｂ〕　抗体溶液の溶媒を、タンパク質変性剤を含まない溶媒に置換すること；
〔Ｂ２〕　溶媒置換後の抗体溶液と試料とを混合し、対象物質と、不溶性担体粒子が結合した第１抗体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体、とを接触させ、凝集を形成させること；
〔Ｂ３〕　凝集を測定すること；
〔４〕　試料として既知濃度の対象物質を用いて、工程〔Ｂ１ａ〕－工程〔Ｂ２〕を行い、対象物質濃度と凝集の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕　工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔Ｂ３〕の測定により得られた測定値とから、試料中の対象物質の濃度を決定すること。 [Measurement method 8: Latex agglutination method 3]
Further, this embodiment can also be preferably implemented as a latex agglutination method including, for example, the following steps.
[B1a] To prepare an antibody solution by dissolving the first antibody to which the insoluble carrier particles are bound and the complex recognition type antibody to which the insoluble carrier particles are bound in a solvent containing a protein denaturing agent;
[B1b] Replacing the solvent of the antibody solution with a solvent containing no protein denaturant;
[B2] The antibody solution after solvent replacement and the sample are mixed, and the target substance, the first antibody to which the insoluble carrier particles are bound, and the complex recognition type antibody to which the insoluble carrier particles are bound are brought into contact with each other to cause aggregation. To form;
[B3] Measuring aggregation;
[4] Using a target substance of a known concentration as a sample, perform step [B1a] -step [B2] to prepare a calibration curve showing the relationship between the target substance concentration and the measured value of aggregation; and [5]. Determine the concentration of the target substance in the sample from the calibration curve prepared in step [4] and the measured value obtained by the measurement in step [B3].

４．免疫測定用キット
　本発明に係る免疫測定用キットは、以下の（１）－（３）を含む。
（１）対象物質を認識する第１抗体。
（２）対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体。
（３）タンパク質変性剤。
　タンパク質変性剤は、単独で固体あるいは液体の形態で適当な容器に収容されて提供されるものであってよい。あるいは、第１抗体溶液、複合体認識型抗体溶液、第１抗体及び／又は複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒、又は対象物質を含む試料を希釈するための溶媒のいずれか１以上の液体に溶解され適当な容器に収容されて提供されるものであってもよい。
　また、後述するイムノクロマト法用キットにおいては、タンパク質変性剤は、試料供給部、標識化抗体保持部、展開部及び検出部のいずれか１以上の部位、及び／又は、試料を希釈するための溶媒に含まれていればよい。 4. Immunoassay Kit The immunoassay kit according to the present invention includes the following (1)-(3).
(1) A first antibody that recognizes a target substance.
(2) A complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of a target substance and a first antibody.
(3) Protein denaturant.
The protein denaturant may be provided alone in the form of a solid or liquid in a suitable container. Alternatively, one or more of a first antibody solution, a complex recognition type antibody solution, a solvent for redissolving the first antibody and / or a complex recognition type antibody, or a solvent for diluting a sample containing a target substance. It may be provided by being dissolved in the liquid of the above and contained in a suitable container.
Further, in the kit for the later-described immunochromatography method, the protein denaturant is one or more of a sample supply part, a labeled antibody holding part, a developing part and a detection part, and / or a solvent for diluting the sample. It suffices if it is included in.

　本発明に係る免疫測定用キットが適用される試料及び対象物質、並びにキットに包含される第１抗体及び複合体認識型抗体は、上述したとおりである。
　第１抗体及び複合体認識型抗体は、乾燥物又は溶解物として適当な容器に収容されて提供されるものであってよい。乾燥物である場合、第１抗体及び複合体認識型抗体は、適当な溶媒に再溶解されて使用される。第１抗体及び複合体認識型抗体は、単独であるいは混合されて提供され得る。第１抗体及び／又は複合体認識型抗体、並びにサンプルの溶媒は、特に限定されないが、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等の水性溶媒が好ましい。媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質及び蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。 The sample and target substance to which the immunoassay kit according to the present invention is applied, and the first antibody and complex recognition type antibody included in the kit are as described above.
The first antibody and the complex recognition type antibody may be provided in a suitable container as a dried product or a lysate. In the case of a dried product, the first antibody and the complex recognition type antibody are redissolved in a suitable solvent and used. The first antibody and the complex recognition type antibody can be provided alone or in combination. The solvent of the first antibody and / or the complex recognition type antibody and the sample is not particularly limited, but an aqueous solvent such as deionized water, distilled water, or a buffer solution is preferable. The medium may contain the above-mentioned salts, metal ions, sugars, preservatives, proteins, protein stabilizers and the like.

　第１抗体の使用時の濃度は、特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。
　複合体認識型抗体の使用時の濃度は、特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。
　また、第１抗体及び複合体認識型抗体は、不溶性担体に固定化されて提供されるものであってもよい。 The concentration of the first antibody when used is not particularly limited, and is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09. , 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg / mL and the like, preferably in the range of 0.1 to 20 μg / mL.
The concentration of the complex recognition antibody when used is not particularly limited, and is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0. .09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg / mL and the like, preferably in the range of 0.1 to 20 μg / mL.
Further, the first antibody and the complex recognition type antibody may be provided by being immobilized on an insoluble carrier.

　タンパク質変性剤は、上述したカオトロピック変性剤、界面活性剤及び／又は還元剤であってよい。タンパク質変性剤は、第１抗体と複合体認識型抗体とが接触される溶液における濃度が、例えば０．０００５％（ｗ/ｖ）以上４８％（ｗ/ｖ）以下、好ましくは０．００１％（ｗ/ｖ）以上３６％（ｗ/ｖ）以下、より好ましくは０．００２５％（ｗ/ｖ）以上２４％（ｗ/ｖ）以下とされるために必要な量でキットに包含される。
　特に尿素が用いられる場合、当該溶液中のタンパク質変性剤の濃度は、例えば０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍが挙げられ、例えば０．１Ｍ以上８Ｍ以下、好ましくは０．５Ｍ以上６Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以上４Ｍ以下とできる。
　特にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが用いられる場合、当該溶液中のタンパク質変性剤の濃度は、例えば、０．０００５％、０．００１％、０．００２５％、０．００５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％が挙げられ、例えば０．０００５％以上１０％以下、好ましくは０．００１％以上５％以下、より好ましくは０．００２５％以上２．５％以下、特に好ましくは０．２５％以上０．５％以下とできる。 The protein denaturant may be the chaotropic denaturant, surfactant and / or reducing agent described above. The concentration of the protein denaturant in the solution in which the first antibody and the complex recognition antibody are in contact is, for example, 0.0005% (w / v) or more and 48% (w / v) or less, preferably 0.001%. (W / v) or more and 36% (w / v) or less, more preferably 0.0025% (w / v) or more and 24% (w / v) or less, which is included in the kit. ..
Especially when urea is used, the concentration of the protein denaturant in the solution is, for example, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M. , 0.9M, 1M, 2M, 3M, 4M, 5M, 6M, 7M, 8M, for example, 0.1M or more and 8M or less, preferably 0.5M or more and 6M or less, more preferably 2M or more and 4M or less. ..
Especially when polyoxyethylene sorbitan monolaurate is used, the concentration of the protein modifier in the solution is, for example, 0.0005%, 0.001%, 0.0025%, 0.005%, 0.01%. , 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, Examples thereof include 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% and 10%, for example, 0.0005% or more and 10% or less, preferably 0.001% or more and 5% or less. It can be more preferably 0.0025% or more and 2.5% or less, and particularly preferably 0.25% or more and 0.5% or less.

　免疫測定用キットは、洗浄液を含んでいてもよいが、本発明に係る免疫測定方法では好適に洗浄工程を省略することが可能であるので洗浄液を含まないものとできる。 The immunoassay kit may contain a cleaning solution, but the immunoassay method according to the present invention can preferably omit the cleaning step, and thus can be free of the cleaning solution.

［キット１：サンドイッチＥＬＩＳＡ１］
　上述の測定方法１に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　不溶性担体に固定化された第１抗体。
　タンパク質変性剤を含む複合体認識型抗体溶液。 [Kit 1: Sandwich ELISA1]
When used in the measurement method 1 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A first antibody immobilized on an insoluble carrier.
A complex recognition antibody solution containing a protein denaturant.

［キット２：ラテックス凝集法１］
　上述の測定方法２に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　不溶性担体粒子が結合した第１抗体。
　不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体。
　タンパク質変性剤を含む、複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒。 [Kit 2: Latex agglutination method 1]
When used in the measurement method 2 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A first antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A complex recognition antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A solvent for redissolving complex recognition antibodies, including protein denaturants.

［キット３：イムノクロマト法１］
　上述の測定方法３に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　試料供給部、標識化抗体保持部、展開部、検出部及び吸収部を備えたテストストリップ。
　標識化抗体保持部に溶出可能に保持された第１抗体。
　検出部に固定化された複合体認識型抗体。
　タンパク質変性剤を含む、試料を希釈するための溶媒。 [Kit 3: Lateral flow test 1]
When used in the measurement method 3 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A test strip with a sample supply section, a labeled antibody holding section, a developing section, a detection section and an absorption section.
The first antibody that is eluted and retained in the labeled antibody retainer.
A complex recognition type antibody immobilized on the detection part.
A solvent for diluting a sample, including a protein denaturant.

［キット４：イムノクロマト法１］
　上述の測定方法３に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなるものであってもよい。
　試料供給部、タンパク質変性剤を含む標識化抗体保持部、展開部、検出部及び吸収部を備えたテストストリップ。
　標識化抗体保持部に溶出可能に保持された第１抗体。
　検出部に固定化された複合体認識型抗体。
　試料を希釈するための溶媒。 [Kit 4: Lateral flow test 1]
When used in the measurement method 3 described above, the immunoassay kit according to the present invention may include, for example, the following components.
A test strip comprising a sample supply section, a labeled antibody holding section containing a protein denaturant, a developing section, a detecting section and an absorbing section.
The first antibody that is eluted and retained in the labeled antibody retainer.
A complex recognition type antibody immobilized on the detection part.
A solvent for diluting the sample.

［キット５：サンドイッチＥＬＩＳＡ２］
　上述の測定方法４に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　タンパク質変性剤を含む第１抗体溶液。
　不溶性担体に固定化された複合体認識型抗体。 [Kit 5: Sandwich ELISA2]
When used in the measurement method 4 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A first antibody solution containing a protein denaturant.
A complex recognition antibody immobilized on an insoluble carrier.

［キット６：ラテックス凝集法２］
　上述の測定方法５に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　不溶性担体粒子が結合した第１抗体。
　不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体。
　タンパク質変性剤を含む、第１抗体及び／又は複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒。 [Kit 6: Latex agglutination method 2]
When used in the measurement method 5 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A first antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A complex recognition antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A solvent for redissolving the first antibody and / or complex recognition type antibody, which comprises a protein denaturing agent.

［キット７：イムノクロマト法２］
　上述の測定方法６に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　試料供給部、標識化抗体保持部、展開部、検出部及び吸収部を備えたテストストリップ。
　標識化抗体保持部に溶出可能に保持された複合体認識型抗体。
　検出部に固定化された第１抗体。
　タンパク質変性剤を含む、試料を希釈するための溶媒。 [Kit 7: Lateral flow test 2]
When used in the measurement method 6 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A test strip with a sample supply section, a labeled antibody holding section, a developing section, a detection section and an absorption section.
A complex-recognizing antibody that is eluted and retained in the labeled antibody retainer.
The first antibody immobilized on the detection part.
A solvent for diluting a sample, including a protein denaturant.

［キット８：イムノクロマト法２］
　上述の測定方法６に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなるものであってもよい。
　試料供給部、タンパク質変性剤を含む標識化抗体保持部、展開部、検出部及び吸収部を備えたテストストリップ。
　標識化抗体保持部に溶出可能に保持された複合体認識型抗体。
　検出部に固定化された第１抗体。
　試料を希釈するための溶媒。 [Kit 8: Lateral flow test 2]
When used in the measurement method 6 described above, the immunoassay kit according to the present invention may include, for example, the following components.
A test strip comprising a sample supply section, a labeled antibody holding section containing a protein denaturant, a developing section, a detecting section and an absorbing section.
A complex-recognizing antibody that is eluted and retained in the labeled antibody retainer.
The first antibody immobilized on the detection part.
A solvent for diluting the sample.

［キット９：サンドイッチＥＬＩＳＡ３］
　上述の測定方法７に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　第１抗体。
　複合体認識型抗体。
　タンパク質変性剤を含む、第１抗体及び複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒。 [Kit 9: Sandwich ELISA3]
When used in the measurement method 7 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
First antibody.
Complex recognition type antibody.
A solvent for redissolving the first antibody and the complex recognition type antibody, which comprises a protein denaturing agent.

［キット１０：ラテックス凝集法３］
　上述の測定方法８に供される場合、本発明に係る免疫測定用キットは例えば以下のコンポーネントを含んでなる。
　不溶性担体粒子が結合した第１抗体。
　不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体。
　タンパク質変性剤を含む、第１抗体及び複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒。 [Kit 10: Latex agglutination method 3]
When used in the measurement method 8 described above, the immunoassay kit according to the present invention comprises, for example, the following components.
A first antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A complex recognition antibody to which insoluble carrier particles are bound.
A solvent for redissolving the first antibody and the complex recognition type antibody, which comprises a protein denaturing agent.

　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention at all.

　本実施例で共通して用いた試薬は以下のとおりである。
　アルドステロン（シグマアルドリッチ社製）
　リン酸水素二ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）
　リン酸二水素ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：オリエンタル酵母工業社製）
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ：関東化学社製）
　塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬工業社製）
　尿素（関東化学社製）
　サッカロース（富士フイルム和光純薬工業社製）
　コール酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）
　カゼイン（富士フイルム和光純薬社製） The reagents commonly used in this example are as follows.
Aldosterone (manufactured by Sigma-Aldrich)
Disodium hydrogen phosphate (phosphate buffer; manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.)
Sodium dihydrogen phosphate (phosphate buffer; manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.)
Bovine serum albumin (BSA: manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.)
Tris hydroxymethylaminomethane (Tris: manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.)
Sodium chloride (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Urea (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.)
Saccharose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Sodium cholic acid (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Casein (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

［参考例１］抗アルドステロンモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の作製
　ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯ（アルドステロン　３－カルボキシメチルオキシム；ＳＴＥＲＡＬＯＩＤＳ社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマアルドリッチ社製）に溶解して１００ｍｇ／ｍＬ　ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯのＤＭＳＯ溶液を調製した。１００ｍｇ／ｍＬ　ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯのＤＭＳＯ溶液（２５μＬ）に、１０ｍｇ／ｍＬ　ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＰＢＳ溶液（２ｍＬ）、１００ｍｇ／ｍＬ　ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）、及び１００ｍｇ／ｍＬ　ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）を添加して混合し、４℃で１６時間反応させて、ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯとＫＬＨとを結合させ、ＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯ溶液を調製した。ＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いてＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯ溶液の溶媒の置換を行い、ＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯのＰＢＳ溶液を調製した。 [Reference Example 1] Preparation of anti-aldosterone monoclonal antibody (1) Preparation of immunogen ALDOSTERONE 3-CMO (aldosterone 3-carboxymethyl oxime; manufactured by STARALOIDS) is dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (manufactured by Sigma Aldrich). A DMSO solution of 100 mg / mL aldosterone 3-CMO was prepared. 100 mg / mL ALDOSTERONE 3-CMO DMSO solution (25 μL), 10 mg / mL KLH (Keyhole limpet hemocyanin; Thermofisher Scientific) PBS solution (2 mL), 100 mg / mL EDC (1-ethyl-3-3) DMSO solution (50 μL) of (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; Thermofisher Scientific Co., Ltd. and DMSO solution (10 μL) of 100 mg / mL NHS (N-hydroxysuccinimide; Thermofisher Scientific Co., Ltd.) ) Was added and mixed, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 16 hours to combine ALDOSTERONE 3-CMO and KLH to prepare a KLH-linked ALDOSTERONE 3-CMO solution. A PD-10 column (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) equilibrated with the PBS solution was used to replace the solvent of the KLH-linked ALDOSTERONE 3-CMO solution, and a PBS solution of the KLH-linked ALDOSTERONE 3-CMO was prepared.

（２）ハイブリドーマ細胞の作製
　（１）で調製したＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯを０．５ｍｇ含む免疫原をアジュバントと混合してエマルジョン化した。ＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ　３－ＣＭＯのエマルジョンを計４回、ウサギ（ＮＺＷ種）へ皮下注射した。１回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２～４回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２週間間隔で計４回免疫を行った後に採血した。血清中の抗体価をＥＬＩＳＡにて評価し、血清中の抗体価が上昇していることを確認した。さらに、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用し、２週間間隔で２回免疫を行ったウサギから脾臓を摘出した。
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１９９５　Ｓｅｐ　２６；　９２（２０）：　９３４８-９３５２に記載の方法に従い脾臓細胞を調製し、２４０Ｅ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作製した。
　ハイブリドーマ細胞を１０％ＦＣＳとＨＡＴを含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に懸濁後、マイクロウェルプレートに播種し培養した。生育したハイブリドーマ細胞の培養上清を取得した。 (2) Preparation of hybridoma cells An immunogen containing 0.5 mg of KLH-bound aldosterone 3-CMO prepared in (1) was mixed with an adjuvant and emulsified. The emulsion of KLH-conjugated ALDOSTERONE 3-CMO was subcutaneously injected into rabbits (NZW species) four times in total. For the first immunization, Freund's Complete Adjuvant (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant. For the 2nd to 4th immunization, Freund's Incomplete Adjuvant (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant. Blood was collected after immunization a total of 4 times at 2-week intervals. The antibody titer in serum was evaluated by ELISA, and it was confirmed that the antibody titer in serum was elevated. In addition, Freund's Incomplete Adjuvant (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant, and the spleen was removed from rabbits that had been immunized twice at 2-week intervals.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Sep 26; 92 (20): Spleen cells were prepared according to the method described in 9348-9352 and fused with 240E cells to produce hybridoma cells.
Hybridoma cells were suspended in RPMI1640 medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 10% FCS and HAT, and then seeded and cultured on a microwell plate. The culture supernatant of the grown hybridoma cells was obtained.

（３）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
　マイクロウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のウェルに、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（５μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液５０μＬ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を固定化した後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）にてブロッキングした。上記（２）で得られたハイブリドーマの培養上清５０μＬをウェルに添加し２５℃で反応させ、培養上清中のモノクローナル抗体を捕捉した。洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）でウェルを３回洗浄した後、ＨＲＰ標識アルドステロン溶液（コスモバイオ社製）５０μＬをウェルに添加し、２５℃で反応させた。洗浄液でウェルを３回洗浄した後、基質である１－Ｓｔｅｐ^TM　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５０μＬを添加して反応させた。２ｍｏｌ／Ｌ　硫酸（関東化学社製）５０μＬをウェルに添加した後に、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、吸光度が高いウェル（結合能の高いモノクローナル抗体が存在するウェル）を選択した。選択したウェル中のハイブリドーマ細胞のクローニングを限界希釈法により行うことにより、抗アルドステロンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株（ＫＴＭ－２０１２）を樹立した。 (3) Screening of hybridoma cells After immobilizing a goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody (5 μg / mL PBS solution 50 μL: Thermo Fisher Scientific) in a well of a microwell plate (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Blocking was performed with a blocking solution (PBS solution containing 1% BSA). 50 μL of the hybridoma culture supernatant obtained in (2) above was added to the wells and reacted at 25 ° C. to capture the monoclonal antibody in the culture supernatant. After washing the wells three times with a washing solution (pH 7.4, 10 mmol / L phosphate buffer containing 0.05% Tween 20, 150 mmol / L sodium chloride), 50 μL of HRP-labeled aldosterone solution (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) is added to the wells. Was added to and reacted at 25 ° C. After washing the wells with a washing solution three times, ^{50 μL of the substrate 1-Step TM} Ultra TMB-ELISA (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was added and reacted. After adding 50 μL of 2 mol / L sulfuric acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) to the wells, the absorbance of the reaction solution was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub-wavelength of 660 nm. Was selected. An anti-aldosterone monoclonal antibody-producing hybridoma cell line (KTM-2012) was established by cloning the hybridoma cells in the selected wells by the limiting dilution method.

（４）抗アルドステロンモノクローナル抗体の作製
　ハイブリドーマ細胞ＫＴＭ－２０１２をＨｙＣｌｏｎｅ　ＳＦＭ４ＭＡｂ－Ｕｔｉｌｉｔｙ培地（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）にて培養した。細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した。Ｈａｒｌｏｗ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ：　１９８８に記載の方法に従い、プロテインＡセファロース（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）を用いて培養上清から抗アルドステロンモノクローナル抗体ＫＴＭ－２０１２を精製した。 (4) Preparation of anti-aldosterone monoclonal antibody Hybridoma cells KTM-2012 were cultured in HyClone SFM4MAb-Utility medium (manufactured by Global Life Science Technologies Japan). The cell suspension was collected and centrifuged at 3000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes, and the culture supernatant was collected. Harlow et. al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY: The anti-aldosterone monoclonal antibody KTM-2012 was purified from the culture supernatant using Protein A Sepharose (manufactured by Global Life Science Technologies Japan) according to the method described in 1988.

［参考例２］アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体の作製
（１）マウスへの免疫
　参考例１（４）で取得したＫＴＭ－２０１２抗体をペプシン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で消化した後、ＨＰＬＣシステム（日立製作所社製）でＦ（ａｂ'）₂を分離した。移動相には、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。カラムには、Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製；口径：２１．５ｍｍ；長さ：６０ｃｍ）を用いた。Ｆ（ａｂ'）₂とアルドステロンをモル比で１：５４０でＰＢＳ溶液中で混合し、２５℃で１時間放置し、抗原溶液を調製した。抗原溶液とアジュバンドを等量混合したエマルジョンを調製した。エマルジョンを計３回、Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）へ皮下注射した。１回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２～３回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２週間間隔で計３回免疫を行った後に採血し、血清中の抗体価を後述の（２）の手順に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。血清中の抗体価が上昇していることを確認した後、ＰＢＳ溶液と抗原溶液を等量混合した溶液をマウスの皮下に注射し、３日後にマウスから脾臓を摘出した。 [Reference Example 2] Preparation of monoclonal antibody against aldosterone-anti-aldosterone antibody complex (1) Immunization to mice The KTM-2012 antibody obtained in Reference Example 1 (4) was pepsin (manufactured by Roche Diagnostics). After digestion with, F (ab') ₂ was separated by an HPLC system (manufactured by Hitachi, Ltd.). A 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 7.4) was used as the mobile phase. A G3000SW column (manufactured by Tosoh Corporation; diameter: 21.5 mm; length: 60 cm) was used as the column. F (ab') ₂ and aldosterone were mixed in a PBS solution at a molar ratio of 1: 540 and left at 25 ° C. for 1 hour to prepare an antigen solution. An emulsion was prepared by mixing an equal amount of the antigen solution and the adjuvant. The emulsion was subcutaneously injected into Balb / c mice (manufactured by Nippon SLC Co., Ltd.) three times in total. For the first immunization, Freund's Complete Adjuvant (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant. For the second and third immunizations, Freund's Incomplete Adjuvant (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant. Blood was collected after immunization a total of 3 times at 2-week intervals, and the antibody titer in serum was evaluated by ELISA according to the procedure (2) described later. After confirming that the antibody titer in serum was elevated, an equal amount of PBS solution and antigen solution were injected subcutaneously into the mouse, and the spleen was removed from the mouse 3 days later.

（２）ＥＬＩＳＡによる抗体価の評価
　９６穴マイクロウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のウェルに、参考例１（４）で取得したＫＴＭ－２０１２抗体（５μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液５０μＬ）を固定化した後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）１００μＬでブロッキングした。試料希釈液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））を用いて１ｎｇ／ｍＬに調製したアルドステロン溶液を、ＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートのウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させ、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体を形成させた。陰性コントロールとして試料希釈液のみを添加したウェルを用意した。洗浄液（０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、免疫中のマウスから採取した血清を試料希釈液で１００００倍に希釈した血清希釈液をウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、試料希釈液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）をウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ（Ｋｅｍ―Ｅｎ-ＴｅｃＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）５０μＬを分注し、２５℃で３０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬをウェルに添加し攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。
　この評価により、陰性コントロールには反応せず、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体に特異的に反応する血清が確認でき、免役されたマウスに所望の抗体が産生されていると判断した。 (2) Evaluation of antibody titer by ELISA The KTM-2012 antibody (5 μg / mL PBS solution 50 μL) obtained in Reference Example 1 (4) was immobilized in a well of a 96-well microwell plate (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Then, blocking was performed with 100 μL of a blocking solution (PBS solution containing 1% BSA). An aldosterone solution prepared at 1 ng / mL using a sample diluent (PBS (pH 7.4) containing 1% BSA) was added to the wells of a KTM-2012 antibody-immobilized plate (50 μL) and at 25 ° C. for 1 hour. The reaction was carried out to form a complex of KTM-2012 antibody and aldosterone. As a negative control, a well to which only the sample diluent was added was prepared. After washing the wells three times (B / F separation) with a washing solution (PBS (pH 7.4) containing 0.05% tween 20), serum collected from immunized mice is diluted 10000 times with a sample diluent. The serum diluent was added to the wells (50 μL) and reacted at 25 ° C. for 1 hour. After washing the wells 3 times (B / F separation) with a washing solution, HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Millipore) diluted 10000 times with a sample diluent was added to the wells (50 μL), and the temperature was 25 ° C. for 1 hour. It was reacted. After washing the wells with a washing solution three times (B / F separation), 50 μL of TMB-ONE (manufactured by Kem-En-Tec Diagnostics) was dispensed and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. After adding 50 μL of 0.5 mol / L sulfuric acid to the wells and stirring and mixing, the absorbance of the reaction solution was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub-wavelength of 660 nm.
By this evaluation, sera that did not react with the negative control and specifically reacted with the complex of KTM-2012 antibody and aldosterone could be confirmed, and it was judged that the desired antibody was produced in the immunized mice.

（３）細胞融合によるハイブリドーマの作製
　抗体価の上昇が確認されたマウスから脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を調製した。
スーパー細胞融合装置　ＥＧＦＧ２１（ネッパジーン社製）を用いたエレクトロフュージョン法により脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（Ｐ３－Ｕ１）と融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマ細胞を１０％　ＢＭ　Ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０×）（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とＨＡＴを含むＧＩＴ培地（コージンバイオ社製）に懸濁後、マイクロウェルプレートに播種し培養した。生育したハイブリドーマ細胞の培養上清を取得した。 (3) Preparation of hybridoma by cell fusion The spleen was excised from the mouse in which an increase in antibody titer was confirmed, and spleen cells were prepared according to a conventional method.
A hybridoma was prepared by fusing spleen cells with mouse myeloma cells (P3-U1) by an electrofusion method using a super cell fusion device EGFG21 (manufactured by Neppagene). Hybridoma cells were suspended in 10% BM Conditioned H1 Hybridoma Cloning Supplement (10 ×) (manufactured by Roche Diagnostics) and HAT-containing GIT medium (manufactured by Kojin Bio), and then seeded and cultured on a microwell plate. .. The culture supernatant of the grown hybridoma cells was obtained.

（４）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
　（２）で作製したＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートのウェルに、試料希釈液を用いて１ｎｇ／ｍＬに調製したアルドステロン溶液を添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させ、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体を形成させた。陰性コントロールとして試料希釈液のみを添加したウェルを用意した。洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、（３）で得られた培養上清を試料希釈液で２倍に希釈してウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、試料希釈液で１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）をウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ５０μＬを分注し、２５℃で３０分間反応させた。その後、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬをウェルに添加し攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。陰性コントロールには反応性せず、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体に特異的に反応する培養上清を選択した。選択した培養上清中のハイブリドーマ細胞のクローニングを限界希釈法にて行うことにより、アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（ＫＴＭ－６１１）を樹立した。 (4) Screening of hybridoma cells To the wells of the KTM-2012 antibody-immobilized plate prepared in (2), an aldosterone solution prepared at 1 ng / mL using a sample diluent was added (50 μL), and the temperature was 25 ° C. for 1 hour. The reaction was carried out to form a complex of KTM-2012 antibody and aldosterone. As a negative control, a well to which only the sample diluent was added was prepared. After washing the wells with a washing solution three times (B / F separation), the culture supernatant obtained in (3) was diluted 2-fold with a sample diluent and added to the wells (50 μL), and the mixture was added to the wells at 25 ° C. for 1 hour. It was reacted. After washing the wells 3 times (B / F separation) with a washing solution, a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Millipore) diluted 10000 times with a sample diluent was added to the wells (50 μL), and the temperature was 25 ° C. for 1 hour. It was reacted. After washing the wells with a washing solution three times (B / F separation), 50 μL of TMB-ONE was dispensed and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. Then, 50 μL of 0.5 mol / L sulfuric acid was added to the wells, stirred and mixed, and then the absorbance of the reaction solution was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub-wavelength of 660 nm. Culture supernatants that did not react with the negative control and specifically reacted with the complex of KTM-2012 antibody and aldosterone were selected. By cloning the hybridoma cells in the selected culture supernatant by the limiting dilution method, a hybridoma cell line (KTM-611) producing a monoclonal antibody against the aldosterone-anti-aldosterone antibody complex was established.

　ハイブリドーマＫＴＭ－６１１は、特許法施行規則第２７条の２及び３の規定に基づく寄託機関であり、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく国際寄託当局である、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に国際寄託されている。 Hybridoma KTM-611 is a depositary organization based on the provisions of Article 27-2 and 3 of the Patent Law Enforcement Regulations, and an international depositary authority based on the Budapest Treaty on International Approval of Deposits of Microorganisms. It has been internationally deposited at the Japan Biotechnology Center, Patented Microbial Deposit Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture).

（５）アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体の作製
　ハイブリドーマ細胞ＫＴＭ－６１１をＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて培養した。細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した。Ｈａｒｌｏｗ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ：　１９８８に記載の方法に従い、プロテインＡセファロース（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）を用いて培養上清からアルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体ＫＴＭ－６１１を精製した。 (5) Preparation of Monoclonal Antibody against Aldosterone-Anti-Ardosterone Antibody Complex Hybridoma cells KTM-611 were cultured in Hybridoma-SFM medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The cell suspension was collected and centrifuged at 3000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes, and the culture supernatant was collected. Harlow et. al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY: Monoclonal antibody against aldosterone-anti-aldosterone antibody complex from culture supernatant using protein A Sepharose (manufactured by Global Life Science Technologies Japan) according to the method described in 1988. KTM-611 was purified.

［実施例１］アルドステロン測定試薬１の作製
　以下のＫＴＭ－６１１抗体固定化メンブレン、及び、ＱｕａｒｔｚＤｏｔ（ＱＤ）標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液を含むアルドステロン測定試薬１を作製した。 [Example 1] Preparation of aldosterone measuring reagent 1 An aldosterone measuring reagent 1 containing the following KTM-611 antibody-immobilized membrane and a QuartzDot (QD) -labeled KTM-2012 antibody solution was prepared.

（１）ＫＴＭ－６１１抗体固定化メンブレンの作製
　メンブレンには、Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦ１３５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社制）を幅２．５ｃｍ×長さ２５ｃｍに裁断したものを用いた。メンブレンの短軸方向の一端から１１．５ｍｍ離れた位置にＢｉｏＪｅｔ　Ｑｕｏｎｔｉ分注モジュール（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いてＲａｔｅ　１．０μＬ／ｃｍでＫＴＭ－６１１抗体を線状に塗布して検出領域を形成した。塗布後、２５℃で２時間乾燥させた。乾燥後、ブロッキング緩衝液（０．５％カゼインを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５））に３０分間浸し、次いで洗浄液（０．５％サッカロース、０．０５％コール酸ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に３０分間浸した。洗浄後のメンブレンはデシケーター内で一晩以上乾燥させた。プレカットバッキングシート（ニップンエンジニアリング社製）にメンブレン及びＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を固定化し、シートを５ｍｍ幅に裁断し、ＫＴＭ－６１１抗体固定化メンブレンを作製した。なお、当該ＫＴＭ－６１１抗体固定化メンブレン（幅５ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）の長軸方向の一端であって、前記検出領域から近い一端を下端、反対側を上端とした。 (1) Preparation of KTM-611 antibody-immobilized membrane As the membrane, a Hi-Flow Plus HF135 (Millipore company system) cut into a width of 2.5 cm and a length of 25 cm was used. A detection region is formed by linearly applying KTM-611 antibody at Rate 1.0 μL / cm using a BioJet Quonti dispensing module (manufactured by BioDot) at a position 11.5 mm away from one end in the minor axis direction of the membrane. bottom. After application, it was dried at 25 ° C. for 2 hours. After drying, soak in blocking buffer (0.05 mol / L borate buffer containing 0.5% casein (pH 8.5)) for 30 minutes, then wash (0.5% saccharose, 0.05% sodium cholicate). It was immersed in 0.05 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing (pH 7.5) for 30 minutes. The washed membrane was dried in a desiccator overnight or longer. A membrane and CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS (manufactured by Millipore) were immobilized on a precut backing sheet (manufactured by Nippon Engineering), and the sheet was cut to a width of 5 mm to prepare a KTM-611 antibody-immobilized membrane. One end of the KTM-611 antibody-immobilized membrane (width 5 mm × length 2.5 cm) in the major axis direction, one end close to the detection region was defined as the lower end, and the opposite side was defined as the upper end.

（２）ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液の調製
　ＱｕａｒｔｚＤｏｔ（古河電工アドバンストエンジニアリング社製）の「粒子への抗体感作プロトコル（ブロッキングｖｅｒ．）」に従い、ＱｕａｒｔｚＤｏｔと、分散剤Ａ、反応試薬Ｂ、反応試薬Ｃ、反応試薬Ｄ、分散剤Ｅ及び溶媒Ｆと、ＫＴＭ－６１１抗体とを用いて、ＱＤ識ＫＴＭ－２０１２抗体を作製した。
　ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体を、以下の組成からなる標識抗体希釈液で８００倍希釈して、ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液とした。
　　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　４％
　　塩化ナトリウム　　　　　　　０．１５ｍｏｌ／Ｌ
　　尿素　　　　　　　　　　　　２ｍｏｌ／Ｌ
　　サッカロース　　　　　　　　１％ (2) Preparation of QD-labeled KTM-2012 antibody solution According to "Antibody sensitization protocol for particles (blocking ver.)" By QuartzDot (manufactured by Furukawa Denko Advanced Engineering Co., Ltd.), QuartzDot, dispersant A, reaction reagent B, and reaction A QD-knowledge KTM-2012 antibody was prepared using the reagent C, the reaction reagent D, the dispersant E, the solvent F, and the KTM-611 antibody.
The QD-labeled KTM-2012 antibody was diluted 800-fold with a labeled antibody diluent having the following composition to obtain a QD-labeled KTM-2012 antibody solution.
Phosphate buffer (pH 7.4) 10 mmol / L
BSA 4%
Sodium chloride 0.15 mol / L
Urea 2 mol / L
Saccharose 1%

［実施例２］アルドステロン測定試薬２の作製
　以下のＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレン、及び、ＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体溶液を含むアルドステロン測定試薬２を作製した。 [Example 2] Preparation of aldosterone measuring reagent 2 An aldosterone measuring reagent 2 containing the following KTM-2012 antibody-immobilized membrane and QD-labeled KTM-611 antibody solution was prepared.

（１）ＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレンの作製
　メンブレンには、Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　ＨＦ１３５を幅２．５ｃｍ×長さ２５ｃｍに裁断したものを用いた。メンブレンの短軸方向の一端から１１．５ｍｍ離れた位置にＢｉｏＪｅｔ　Ｑｕｏｎｔｉ分注モジュールを用いてＲａｔｅ　１．０μＬ／ｃｍでＫＴＭ－２０１２抗体を線状に塗布して検出領域を形成した。塗布後、２５℃で２時間乾燥させた。乾燥後、前記ブロッキング緩衝液に３０分間浸し、次いで前記洗浄液に３０分間浸した。洗浄後のメンブレンはデシケーター内で一晩以上乾燥させた。プレカットバッキングシートにメンブレン及びＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳを固定化し、シートを５ｍｍ幅に裁断し、ＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレンを作製した。なお、当該ＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレン（幅５ｍｍ×長さ２．５ｃｍ）の長軸方向の一端であって、前記検出領域から近い一端を下端、反対側を上端とした。 (1) Preparation of KTM-2012 antibody-immobilized membrane As the membrane, a Hi-Flow Plus HF135 cut into a width of 2.5 cm and a length of 25 cm was used. A detection region was formed by linearly applying the KTM-2012 antibody at a rate of 1.0 μL / cm using a BioJet Quonti dispensing module at a position 11.5 mm away from one end in the minor axis direction of the membrane. After application, it was dried at 25 ° C. for 2 hours. After drying, it was immersed in the blocking buffer for 30 minutes and then in the washing solution for 30 minutes. The washed membrane was dried in a desiccator overnight or longer. A membrane and CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS were immobilized on a precut backing sheet, and the sheet was cut to a width of 5 mm to prepare a KTM-2012 antibody-immobilized membrane. One end of the KTM-2012 antibody-immobilized membrane (width 5 mm × length 2.5 cm) in the major axis direction, one end close to the detection region was defined as the lower end, and the opposite side was defined as the upper end.

（２）ＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体溶液の調製
　ＱｕａｒｔｚＤｏｔと、分散剤Ａ、反応試薬Ｂ、反応試薬Ｃ、反応試薬Ｄ、分散剤Ｅ及び溶媒Ｆと、ＫＴＭ－６１１抗体とを用いて、ＱＤ識ＫＴＭ－６１１抗体を作製した。
　前記標識抗体希釈液でＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体を８００倍希釈し、ＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体溶液とした。 (2) Preparation of QD-labeled KTM-611 antibody solution Using QuartzDot, dispersant A, reaction reagent B, reaction reagent C, reaction reagent D, dispersant E and solvent F, and KTM-611 antibody, QD knowledge A KTM-611 antibody was prepared.
The QD-labeled KTM-611 antibody was diluted 800-fold with the labeled antibody diluent to prepare a QD-labeled KTM-611 antibody solution.

［比較例１］アルドステロン測定試薬３の作製
　アルドステロン測定試薬１（実施例１）の標識抗体希釈液について、尿素を不添加に変更し、試薬アルドステロン測定試薬３として調製した。 [Comparative Example 1] Preparation of Aldosterone Measuring Reagent 3 The labeled antibody diluent of aldosterone measuring reagent 1 (Example 1) was prepared as the reagent aldosterone measuring reagent 3 by changing the addition of urea to no addition.

［比較例２］アルドステロン測定試薬４の作製
　アルドステロン測定試薬２（実施例２）の標識抗体希釈液について、尿素を不添加に変更し、試薬アルドステロン測定試薬４として調製した。 [Comparative Example 2] Preparation of Aldosterone Measuring Reagent 4 The labeled antibody diluent of Aldosterone Measuring Reagent 2 (Example 2) was prepared as the reagent Aldosterone Measuring Reagent 4 by changing the addition of urea to no addition.

［試験例１］アルドステロンの測定
（１）アルドステロン試料の調製
　試料希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１％サッカロースを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を用いてアルドステロンを希釈し、アルドステロン試料（２０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。 [Test Example 1] Measurement of aldosterone (1) Preparation of aldosterone sample Sample diluent (4% BSA, 0.15 mol / L sodium chloride, 0.01 mol / L phosphate buffer containing 1% saccharose (pH 7.4)) ) Was diluted to prepare an aldosterone sample (2000 pg / mL).

（２）アルドステロンの測定
　アルドステロン試料（２０μＬ）及びＱＤ標識抗体溶液（２０μＬ）を反応容器に添加して混合し、試料混合液（アルドステロン終濃度１０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。また、試料希釈液（２０μＬ）及びＱＤ標識抗体溶液（２０μＬ）を別の反応容器に添加して混合し、ブランク混合液も調製した。
　抗体固定化メンブレンの下端を試料混合液又はブランク混合液に１５分間浸した。１５分経過後、抗体固定化メンブレンを当該混合液から取り出し、メンブレンの検出領域のシグナルを蛍光イムノクロマトリーダー（ＤｉａＳｃａｎ　α：大塚電子社製）で測定した。 (2) Measurement of aldosterone An aldosterone sample (20 μL) and a QD-labeled antibody solution (20 μL) were added to a reaction vessel and mixed to prepare a sample mixture (final aldosterone concentration of 1000 pg / mL). Further, a sample diluent (20 μL) and a QD-labeled antibody solution (20 μL) were added to another reaction vessel and mixed to prepare a blank mixture.
The lower end of the antibody-immobilized membrane was immersed in the sample mixture or blank mixture for 15 minutes. After 15 minutes, the antibody-immobilized membrane was taken out from the mixed solution, and the signal in the detection region of the membrane was measured with a fluorescent immunochromatographic reader (DiaScan α: manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).

　アルドステロン測定試薬１～４を用いて、試料混合液及びブランク混合液を測定した結果（蛍光強度及びＳ／Ｎ比）を表１に示す。Ｓ／Ｎ比は以下の式により算出した。
　Ｓ／Ｎ比＝試料混合液の蛍光強度／ブランク混合液の蛍光強度 Table 1 shows the results (fluorescence intensity and S / N ratio) of measuring the sample mixture and the blank mixture using the aldosterone measuring reagents 1 to 4. The S / N ratio was calculated by the following formula.
S / N ratio = Fluorescence intensity of sample mixture / Fluorescence intensity of blank mixture

　アルドステロン測定試薬１及び２（標識抗体希釈液に尿素を含む）を用いた測定では、Ｓ／Ｎ比は１．０以上であった。
　一方、アルドステロン測定試薬３及び４（標識抗体希釈液に尿素を含まない）を用いた測定では、ブランク混合液の蛍光強度が試料混合液の蛍光強度よりも高く、Ｓ／Ｎ比は１．０未満であった。ＫＴＭ６１１抗体とＫＴＭ２０１２抗体との結合に起因する測定ノイズがＳ／Ｎ比の低下の要因と考えられた。
　これらの結果から、尿素の使用によって、ＫＴＭ６１１抗体とＫＴＭ２０１２抗体との非特異的結合を抑制し測定精度を向上させられることが明らかである。 The S / N ratio was 1.0 or more in the measurement using the aldosterone measuring reagents 1 and 2 (the labeled antibody diluent contained urea).
On the other hand, in the measurement using the aldosterone measuring reagents 3 and 4 (the labeled antibody diluent does not contain urea), the fluorescence intensity of the blank mixture is higher than that of the sample mixture, and the S / N ratio is 1.0. Was less than. The measurement noise caused by the binding between the KTM611 antibody and the KTM2012 antibody was considered to be the cause of the decrease in the S / N ratio.
From these results, it is clear that the use of urea suppresses non-specific binding between the KTM611 antibody and the KTM2012 antibody and improves the measurement accuracy.

［試験例２］尿素濃度の検討１
　アルドステロン測定試薬１（実施例１）のＱＤ標識抗体溶液における尿素濃度を２ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌ又は４ｍｏｌ／Ｌに変更し、アルドステロン測定試薬１Ａ，１Ｂを調製した。アルドステロン測定試薬１Ａ，１，１Ｂ，３を用いて試験例１（２）と同様の方法で試料混合液及びブランク混合液の測定を行った。結果を表２に示す。 [Test Example 2] Examination of urea concentration 1
The urea concentration of the aldosterone measuring reagent 1 (Example 1) in the QD-labeled antibody solution was changed from 2 mol / L to 1 mol / L or 4 mol / L to prepare aldosterone measuring reagents 1A and 1B. The sample mixture and the blank mixture were measured by the same method as in Test Example 1 (2) using the aldosterone measurement reagents 1A, 1, 1B, and 3. The results are shown in Table 2.

　尿素濃度に依存してＳ／Ｎ比の向上が認められた。アルドステロン測定試薬２（実施例２）について同様の測定を行った場合にも、尿素濃度に依存してＳ／Ｎ比の向上が認められた。 An improvement in the S / N ratio was observed depending on the urea concentration. When the same measurement was performed for the aldosterone measuring reagent 2 (Example 2), an improvement in the S / N ratio was observed depending on the urea concentration.

［試験例３］尿素濃度の検討２
（１）アルドステロン試料の調製
　試験例１（１）に記載の試料希釈液に濃度２，４，６，８ｍｏｌ／Ｌで尿素を添加した。当該試料希釈液を用いてアルドステロンを希釈し、アルドステロン試料（２０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。 [Test Example 3] Examination of urea concentration 2
(1) Preparation of aldosterone sample Urea was added to the sample diluent described in Test Example 1 (1) at a concentration of 2,4,6,8 mol / L. Aldosterone was diluted with the sample diluent to prepare an aldosterone sample (2000 pg / mL).

（２）ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液の調製
　ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体を、以下の組成からなる標識抗体希釈液で２００倍希釈して、ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液とした。
　　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　　１％
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　０．１５ｍｏｌ／Ｌ
　　尿素　　　　　　　　　　　　　表３に記載の濃度
　　サッカロース　　　　　　　　　１％ (2) Preparation of QD-labeled KTM-2012 antibody solution The QD-labeled KTM-2012 antibody was diluted 200-fold with a labeled antibody diluent having the following composition to obtain a QD-labeled KTM-2012 antibody solution.
Phosphate buffer (pH 7.4) 10 mmol / L
BSA 1%
Sodium chloride 0.15 mol / L
Urea Concentrations listed in Table 3 Saccharose 1%

（３）アルドステロンの測定
　試験例１（２）と同様の方法で試料混合液及びブランク混合液の測定を行った。結果を表３に示す。尿素濃度２～６ｍｏｌ／Ｌの範囲で良好な測定が可能であった。なお、尿素濃度８ｍｏｌ／Ｌでは、試料混合液の蛍光強度の測定値の低下が認められた。 (3) Measurement of aldosterone The sample mixture and the blank mixture were measured in the same manner as in Test Example 1 (2). The results are shown in Table 3. Good measurement was possible in the range of urea concentration of 2 to 6 mol / L. At a urea concentration of 8 mol / L, a decrease in the measured value of the fluorescence intensity of the sample mixture was observed.

［試験例４］測定可能なアルドステロン濃度範囲の検討
（１）アルドステロン試料の調製
　試験例１（１）に記載の試料希釈液を用いてアルドステロンを希釈し、６２、１２５、２５０、５００、１０００、２０００、４０００ｐｇ／ｍＬのアルドステロン試料を調製した。また、試料希釈液をブランク試料（アルドステロン濃度０ｐｇ／ｍＬ）に用いた。 [Test Example 4] Examination of measurable aldosterone concentration range (1) Preparation of aldosterone sample Aldosterone was diluted with the sample diluent described in Test Example 1 (1), and 62, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 pg / mL aldosterone samples were prepared. In addition, the sample diluent was used as a blank sample (aldosterone concentration 0 pg / mL).

（２）アルドステロンの測定
　アルドステロン測定試薬１Ｂ（ＱＤ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液中の尿素濃度４ｍｏｌ／Ｌ）を用いて、試験例１（２）と同様の方法で試料混合液（アルドステロン終濃度：３１、６２、１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｐｇ／ｍＬ）及びブランク混合液の測定を行った。また、アルドステロン測定試薬３（比較例１）を用いて、試料混合液（アルドステロン終濃度：１０００ｐｇ／ｍＬ）及びブランク混合液の測定を行った。
結果を表４に示す。 (2) Measurement of aldosterone Using the aldosterone measuring reagent 1B (urea concentration 4 mol / L in the QD-labeled KTM-2012 antibody solution), a sample mixture (final aldosterone concentration: 31) was used in the same manner as in Test Example 1 (2). , 62, 125, 250, 500, 1000, 2000 pg / mL) and the blank mixture were measured. Further, the sample mixture (final concentration of aldosterone: 1000 pg / mL) and the blank mixture were measured using the aldosterone measuring reagent 3 (Comparative Example 1).
The results are shown in Table 4.

　アルドステロン測定試薬１Ｂでは、アルドステロン濃度３１～２０００ｐｇ／ｍＬの範囲で良好な測定が可能であった。アルドステロン測定試薬３（比較例１）では、ブランク混合液でも強い蛍光強度が測定され、アルドステロンの定量的測定は不能であった。 With the aldosterone measuring reagent 1B, good measurement was possible in the range of aldosterone concentration of 31 to 2000 pg / mL. With the aldosterone measuring reagent 3 (Comparative Example 1), strong fluorescence intensity was measured even in the blank mixed solution, and quantitative measurement of aldosterone was impossible.

［試験例５］Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）の検討
（１）アルドステロン測定試薬の作製
　以下のＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレン、及び、ＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体溶液を含むアルドステロン測定試薬を作製した。 [Test Example 5] Examination of Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) (1) Preparation of aldosterone measurement reagent The following KTM-2012 antibody-immobilized membrane and aldosterone measurement reagent containing a QD-labeled KTM-611 antibody solution were used. Made.

（１－１）ＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレンの作製
　実施例２（１）と同様の方法でＫＴＭ－２０１２抗体固定化メンブレンを作製した。 (1-1) Preparation of KTM-2012 antibody-immobilized membrane A KTM-2012 antibody-immobilized membrane was prepared in the same manner as in Example 2 (1).

（２－１）ＱＤ識ＫＴＭ－６１１抗体溶液の調製
　実施例２（２）に記載の方法で作成したＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体を、以下の組成からなる標識抗体希釈液で１６００倍希釈して、ＱＤ標識ＫＴＭ－６１１抗体溶液とした。
　　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　　４％
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　０．１５ｍｏｌ／Ｌ
　　Ｔｗｅｅｎ２０　　　　　　　　表５に記載した濃度
　　サッカロース　　　　　　　　　１％ (2-1) Preparation of QD knowledge KTM-611 antibody solution The QD-labeled KTM-611 antibody prepared by the method described in Example 2 (2) was diluted 1600 times with a labeled antibody diluent having the following composition. , QD-labeled KTM-611 antibody solution.
Phosphate buffer (pH 7.4) 10 mmol / L
BSA 4%
Sodium chloride 0.15 mol / L
Tween 20 Concentrations listed in Table 5 Saccharose 1%

（２）アルドステロンの測定
　アルドステロン測定試薬を用いて、試験例１（２）と同様の方法で試料混合液（アルドステロン終濃度：１０００ｐｇ／ｍＬ）及びブランク混合液の測定を行った。結果を表５に示す。 (2) Measurement of aldosterone Using the aldosterone measuring reagent, the sample mixture (final concentration of aldosterone: 1000 pg / mL) and the blank mixture were measured in the same manner as in Test Example 1 (2). The results are shown in Table 5.

　Ｔｗｅｅｎ２０を含まない測定試薬を用いた測定に比して、Ｔｗｅｅｎ２０を含む測定試薬を用いた測定では、高いＳ／Ｎ比が得られた。
　この結果から、Ｔｗｅｅｎ２０の使用によって、ＫＴＭ－６１１抗体とＫＴＭ－２０１２抗体との非特異的結合を抑制し測定精度を向上させられることが明らかである。 A higher S / N ratio was obtained in the measurement using the measurement reagent containing Tween 20 as compared with the measurement using the measurement reagent not containing Tween 20.
From this result, it is clear that the use of Tween 20 suppresses non-specific binding between the KTM-611 antibody and the KTM-2012 antibody and improves the measurement accuracy.

［試験例６］測定可能なアルドステロン濃度範囲の検討
（１）アルドステロン測定試薬の調製
　試験例５のアルドステロン測定試薬において、標識抗体希釈液中のＴｗｅｅｎ２０濃度を０．５％としたものを用いた。比較のため、標識抗体希釈液にＴｗｅｅｎ２０を含まない測定試薬も調製し用いた。 [Test Example 6] Examination of measurable aldosterone concentration range (1) Preparation of aldosterone measuring reagent In the aldosterone measuring reagent of Test Example 5, the Tween 20 concentration in the labeled antibody diluent was set to 0.5%. For comparison, a measurement reagent containing no Tween 20 in the labeled antibody diluent was also prepared and used.

（２）アルドステロン試料の調製
　試験例１（１）に記載の試料希釈液を用いてアルドステロンを希釈し、６２、１２５、２５０、５００、１０００、２０００、４０００ｐｇ／ｍＬのアルドステロン試料を調製した。また、試料希釈液をブランク試料（アルドステロン濃度０ｐｇ／ｍＬ）に用いた。 (2) Preparation of aldosterone sample Aldosterone was diluted with the sample diluent described in Test Example 1 (1) to prepare 62, 125, 250, 500, 1000, 2000 and 4000 pg / mL aldosterone samples. In addition, the sample diluent was used as a blank sample (aldosterone concentration 0 pg / mL).

（３）アルドステロンの測定
　試験例１（２）と同様の方法で試料混合液（アルドステロン終濃度：３１、６２、１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｐｇ／ｍＬ）及びブランク混合液の測定を行った。結果を表６に示す。 (3) Measurement of aldosterone The sample mixture (final aldosterone concentration: 31, 62, 125, 250, 500, 1000, 2000 pg / mL) and the blank mixture were measured by the same method as in Test Example 1 (2). .. The results are shown in Table 6.

　Ｔｗｅｅｎ２０を含む測定試薬を用いた測定では、アルドステロン濃度３１～２０００ｐｇ／ｍＬの範囲で良好な測定が可能であった。Ｔｗｅｅｎ２０を含まない測定試薬を用いた測定では、ブランク混合液でも強い蛍光強度が測定され、アルドステロンの定量的測定は不能であった。 In the measurement using the measurement reagent containing Tween 20, good measurement was possible in the range of aldosterone concentration 31 to 2000 pg / mL. In the measurement using the measurement reagent containing no Tween 20, strong fluorescence intensity was measured even in the blank mixed solution, and quantitative measurement of aldosterone was impossible.

Claims

　対象物質と、対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含んでなる多重複合体の検出に基づく、試料中の物質の免疫測定方法であって、
第１抗体と複合体認識型抗体とがタンパク質変性剤の存在下で接触する工程を含む、
方法。 In a sample based on the detection of a multiplex complex comprising a target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of the target substance and the first antibody. It is a method of measuring the immunity of substances in
The step of contacting the first antibody and the complex recognition type antibody in the presence of a protein denaturing agent is included.
Method.
　前記タンパク質変性剤が、カオトロピック変性剤、界面活性剤及び還元剤からなる群から選択されるいずれか１以上である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the protein denaturant is at least one selected from the group consisting of a chaotropic denaturant, a surfactant and a reducing agent.
　前記タンパク質変性剤が、尿素及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである、請求項１又は２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the protein denaturing agent is urea and / or polyoxyethylene sorbitan monolaurate.
（１）試料中の対象物質と第１抗体とを接触させて複合体を形成させる工程と、
（２）複合体と複合体認識型抗体とを接触させて多重複合体を形成させる工程と（ここで、工程（１）及び工程（２）は同時に行われても別時に行われてもよい）、
（３）多重複合体を検出する工程と、を含み、
前記工程（１）及び／又は工程（２）がタンパク質変性剤の存在下で行われる、請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。 (1) A step of contacting the target substance in the sample with the first antibody to form a complex, and
(2) The step of contacting the complex with the complex recognition type antibody to form a multiplex complex (here, steps (1) and (2) may be performed simultaneously or at different times. ),
(3) Including a step of detecting a multiple complex
The method according to any one of claims 1-3, wherein the step (1) and / or the step (2) is performed in the presence of a protein denaturing agent.
　前記工程（１）と前記工程（２）との間、及び／又は、前記工程（２）との前記工程（３）との間に洗浄工程を含まない、請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein a cleaning step is not included between the step (1) and the step (2) and / or between the step (2) and the step (3).
　前記対象物質が、ペプチドホルモン又はハプテンである、請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1-5, wherein the target substance is a peptide hormone or a hapten.
　対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含む、試料中の物質の免疫測定用キットであって、
（１）タンパク質変性剤を含む、又は、
（２）前記第１抗体溶液、前記複合体認識型抗体溶液、前記第１抗体及び／又は前記複合体認識型抗体を再溶解させるための溶媒、並びに前記対象物質を含む試料を希釈するための溶媒からなる群から選択されるいずれか１以上の液体を含んでなり、かつ該いずれか１以上の液体がタンパク質変性剤を含有する、
キット。 An immunoassay kit for a substance in a sample, which comprises a first antibody that recognizes a target substance and a complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of the target substance and the first antibody.
(1) Contains a protein denaturant or
(2) For diluting a sample containing the first antibody solution, the complex recognition type antibody solution, the first antibody and / or a solvent for redissolving the complex recognition type antibody, and the target substance. It comprises any one or more liquids selected from the group consisting of solvents, and the one or more liquids contain a protein modifier.
kit.
　対象物質と、対象物質を認識する第１抗体と、対象物質と第１抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含んでなる多重複合体の検出に基づく、試料中の物質の免疫測定において、第１抗体と複合体認識型抗体との結合を抑制する方法であって、
第１抗体と複合体認識型抗体とをタンパク質変性剤を含む溶媒中に保持する工程を含む、方法。 In a sample based on the detection of a multiplex complex comprising a target substance, a first antibody that recognizes the target substance, and a complex recognition type antibody that specifically recognizes a complex of the target substance and the first antibody. It is a method of suppressing the binding between the first antibody and the complex recognition type antibody in the immunoassay of the substance of the above.
A method comprising holding a first antibody and a complex recognition antibody in a solvent containing a protein denaturant.