WO2021182228A1 - 発光色素含有粒子、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤 - Google Patents

発光色素含有粒子、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤 Download PDF

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WO2021182228A1
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WO
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group
luminescent dye
containing particles
resin
dye
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PCT/JP2021/008160
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English (en)
French (fr)
Inventor
理枝 櫻木
武寿 磯田
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials

Definitions

  • the present invention relates to luminescent dye-containing particles, a method for producing the same, and a labeling agent for pathological diagnosis using the same. More specifically, the present invention relates to luminescent dye-containing particles having a small particle size, capable of emitting high-luminance light, and having high storage stability, a method for producing the same, and a labeling agent for pathological diagnosis using the same.
  • the luminescent dye-containing particles preferably have a small particle size in order to perform immunostaining with high accuracy and good spatial resolution.
  • biomolecules emit autofluorescence, and autofluorescence is detected as noise at the same time when fluorescence emission derived from a fluorescent dye is detected by a fluorescence microscope. Therefore, the luminescent dye-containing particles for pathological staining include biomolecules.
  • High emission brightness that is not buried in autofluorescence is required. Further, high storage stability that maintains high emission brightness for a long period of time is required.
  • the particles containing a luminescent dye having a small particle size have a problem that the emission brightness of the particles is lowered and the detection sensitivity is lowered as compared with the particles having a large particle size.
  • particles having a high pigment content have a high density, and there is a problem that they settle and aggregate in a solution during storage. Further, when the dye density in the particles is high, the dyes tend to aggregate in the particles and the brightness is lowered due to the concentration quenching, which is a serious problem.
  • a nonionic surfactant As a surfactant used for nanoparticle synthesis, a nonionic surfactant has been generally used. Since the nonionic surfactant is electrically neutral, it can be used regardless of the material to be mixed, it is easy to adjust the balance between hydrophilicity and hydrophobicity, and it has excellent emulsification / dispersibility and solubility. There is. On the other hand, an example in which a charged substance such as an anionic surfactant is used for improving the dispersion stability of the luminescent dye-containing particles and suppressing the aggregation of the dye in the particles is not yet known.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and the problem to be solved is to provide luminescent dye-containing particles capable of emitting high-luminance light and having high storage stability while having a small particle size. It is to be. Another object of the present invention is to provide a method for producing the same and a labeling agent for pathological diagnosis using the same.
  • the particle density increases, and as a result, the particles are in the solution. It tends to settle and aggregates when stored for a long period of time. Further, when the density of the dye in the particles is high, the dyes tend to aggregate with each other, causing concentration quenching and reducing the brightness.
  • anionic surfactant is used as a surfactant used in a polymerization process for polymerizing a resin raw material to generate resin particles containing a luminescent dye. It has been found that the use of the agent increases the amount of dye contained in the particles, and further, when the particles are stored for a long period of time, the particles are less likely to settle and aggregate, and the decrease in emission brightness of the particles is suppressed. It came to. That is, the above problem according to the present invention is solved by the following means.
  • It is a luminescent dye-containing particle containing a resin and a luminescent dye, and is characterized by containing an anionic surfactant and having a particle size D50 obtained from a volume-based cumulative particle size distribution curve in the range of 1 to 150 nm. Luminescent dye-containing particles.
  • the luminescent dye-containing particles according to any one of items 1 to 4, wherein the anionic surfactant has an alkyl group having 8 or more carbon atoms.
  • the method for producing luminescent dye-containing particles according to any one of items 1 to 10, wherein the luminescent dye-containing particles are produced. It has a polymerization step of polymerizing the resin raw material to generate resin particles containing the luminescent dye by heating a mixture containing the luminescent dye, a resin raw material, and a surfactant.
  • a marker for pathological diagnosis which comprises using the luminescent dye-containing particles according to any one of items 1 to 10.
  • the anionic surfactant can disperse a luminescent dye (particularly a hydrophobic luminescent dye) or a hydrophobic solvent in water
  • the dye is used in the polymerization step of polymerizing a resin raw material to generate resin particles containing the luminescent dye. It is considered that the amount of dye taken in during resin polymerization increases when the solvent is uniformly dispersed in the polymerization system.
  • the trace amount of anionic surfactant remaining in the particles has a negative charge, which suppresses the aggregation of the luminescent dye-containing particles and makes it difficult for the dyes in the particles to approach each other, resulting in aggregation, that is, concentration quenching. It is presumed that the storage stability will be improved as well as the high-intensity light emission will be possible.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention are luminescent dye-containing particles containing a resin and a luminescent dye, contain an anionic surfactant, and have a particle size D50 of 1 to 150 nm obtained from a volume-based cumulative particle size distribution curve. It is characterized in that it is within the range of. This feature is a technical feature common to or corresponding to each of the following embodiments (forms). In an embodiment of the present invention, it is preferable that the anionic surfactant is contained in the range of 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass. By leaving a small amount of the anionic surfactant in the luminescent dye-containing particles in this way, the dye in the particles is less likely to aggregate.
  • the anionic surfactant is in the range of 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass, and the nonionic surfactant is in the range of 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass. It is preferable to contain in. This is preferable because more hydrophobic dye can be contained in the luminescent dye-containing particles.
  • the anionic surfactant has an alkyl group having 8 or more carbon atoms from the viewpoint of an anionic surfactant that does not agglomerate the dye.
  • the nonionic surfactant has eight or more repeating unit structures of polyethylene glycol from the viewpoint of controlling the particle size of the luminescent dye-containing particles.
  • 20 of the luminescent dyes are used with respect to the total of the monomers forming the resin and the luminescent dyes. It is preferably contained in the range of ⁇ 80 mol%.
  • the AlogP value of the luminescent dye is in the range of 10.0 to 60.0 because the hydrophobicity is appropriate, it is difficult to aggregate in the particles, and it is difficult to quench the concentration.
  • the resin is a hydrophilic resin because it becomes luminescent dye-containing particles that easily stain cells and the like (cell staining in an aqueous system is easy). Further, in the present invention, it is preferable that the resin is a melamine resin from the viewpoint of ease of dyeing of the luminescent dye-containing particles and fastness during storage.
  • the resin raw material is polymerized by heating a mixture containing the luminescent dye, a resin raw material and a surfactant, and the luminescent dye is polymerized.
  • the production method has a polymerization step of producing resin particles containing the above-mentioned, and the surfactant contains the anionic surfactant.
  • the surfactant is a method for producing luminescent dye-containing particles containing the anionic surfactant in the range of 1 to 20% by mass of the total surfactant.
  • the surfactant contains a nonionic surfactant in the range of 80 to 99% by mass.
  • the particle size of the luminescent dye-containing particles can be made into particles having an appropriate particle size.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention are suitably used as a labeling agent for pathological diagnosis.
  • the present invention, its constituent elements, and modes and modes for carrying out the present invention will be described in detail.
  • "-" is used to mean that the numerical values described before and after the value are included as the lower limit value and the upper limit value.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention are luminescent dye-containing particles containing a resin and a luminescent dye, contain an anionic surfactant, and have a particle size D50 of 1 to 150 nm obtained from a volume-based cumulative particle size distribution curve. It is characterized in that it is within the range of.
  • the luminescent dye-containing particles preferably contain an anionic surfactant in the range of 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass. As described above, it is considered that the pigment in the particles is less likely to aggregate by containing a small amount of the anionic surfactant.
  • the luminescent dye-containing particles further contain a nonionic surfactant, and even more preferably, the luminescent dye-containing particles add 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0 of the anionic surfactant.
  • the nonionic surfactant is contained in the range of 1.0 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass.
  • the luminescent dye-containing particles are a general term for substances having a structure in which one or more luminescent dye molecules are immobilized on resin particles by a chemical or physical action, and the form thereof is a general term. It is not particularly limited. All of the luminescent dyes may be adsorbed to the resin by a weak interaction, or a part of the luminescent dye may be covalently bonded to the organic resin. As for the presence state of the resin and the dye in the particles, it is preferable that the dye is uniformly dispersed in the resin throughout the particles because concentration quenching is unlikely to occur.
  • the luminescent dye-containing particles contain an anionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include known anionic surfactants such as carboxylates, sulfates, sulfonates, and phosphates.
  • Kao Corporation's anionic surfactants Emar 0, Emar 10G, Emar 2FG, Emar TD, Emar 20C, Emar E-27C, Emar 270J, Emar 20CM and other Emar series, Latemuru E-118B , Latemul series such as Latemul E-150, Neoperex GS, Neoperex G-15, Neoperex G-25, Neoperex G-65, etc.
  • Neoperex series Perex NB-L, Perex OT-P, Perex TR, Perex CS, Perex TA, Perex SS-L, Perex SS-H, etc. Perex series, etc.) and NOF Corporation's anionic surfactant (Sintrex EHR, etc.) Series, Persoft series such as Persoft SP, Nissan Tracks series such as Nissan Tracks K-40, Nissan Tracks K-300, Sunamide series such as Sunamide CF-3 and Sunamide CF-10, Diapon S, Diapon LM, Diapon Diapon series such as K, Softilt series such as Softilt AS-L, Softilt AT-L, Fillet series such as Fillet L, Lapizol series such as Lapizol A-30, Lapizol A-80, Neurox R-25L, Examples include the Neulex series such as Nurex R, Nurex soft type 30, and Nurex soft 60-N, and the non-sal series such as non-sal LK-2 and non-sal MK-1).
  • Persoft series such as Per
  • an anionic surfactant having an alkyl group having 8 or more carbon atoms is preferable.
  • the number of carbon atoms is 8 or more, the hydrophobicity of the anionic surfactant is insufficient and the dye does not easily aggregate.
  • surfactants In addition to the anionic surfactant, other surfactants can be used in the present invention.
  • other surfactants include cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants, but it is preferable to use nonionic surfactants together with anionic surfactants.
  • nonionic surfactant a known nonionic surfactant can be used.
  • Nonionic surfactants include polyethylene glycol alkyl ethers, polyethylene glycol fatty acid esters, alkyl glycosides, fatty acid alkanolamides, glycerin fatty acid esters, alkyl glyceryl ethers, sorbitan fatty acid esters, polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, etc. It has functions such as emulsifying property, detergency, permeability, pH resistance, low foaming property, safety, and low irritation, and is widely used in cosmetics, foods, industrial products, and the like.
  • nonionic surfactant used in the present invention examples include nonionic surfactants manufactured by Kao Corporation (Emalgen series such as Emalgen 105 and Emalgen 210P, Leodor series such as Leodor SP-L10, and Latemul PD-.
  • Latemul series such as 420, Emazole series such as Emazole L-10V, Exel series such as Exel S-95, Emmanon series such as Emmanone 1112, Amit series such as Amit 102, Aminone such as Aminone L-02 Series, etc.), Nonion surfactants manufactured by NOF CORPORATION (Nonion K-204, Nonion K-220, etc., Nonion series, Persoft NK-60, Persoft NK-100, etc., Persoft series, Monoguri D, etc.
  • Monoguri series Uniguri series such as Uniguri MK-207, Uniox series such as Uniox HC-40, Pronon series such as Pronon # 102, Naimeen series such as Naimeen L-201, Naimine F-202, etc.
  • Stahome series such as Stahome FK, Namid series such as Namid MF-203, Unisafe series such as Unisafe A-LM, Dispanol series such as Dispanol WI-106, etc.
  • Unisafe series such as Unisafe A-LM, Dispanol series such as Dispanol WI-106, etc.
  • a nonionic surfactant having 8 or more repeating structures of polyethylene glycol is preferable.
  • an anionic surfactant it becomes easier to control the particle size of the luminescent dye-containing particles, which is preferable.
  • the particle size can be adjusted to be large.
  • the content of the surfactant in the luminescent dye-containing particles can be measured by the following operation.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention have a particle size D50 obtained from a volume-based cumulative particle size distribution curve in the range of 1 to 150 nm.
  • the particle size of the luminescent dye-containing particles is larger than 150 nm, it is too large compared to biomolecules such as proteins to be recognized by the luminescent dye-containing particles, so that it is detected as luminescent dye-containing particles for pathological staining.
  • the sensitivity will be low. For example, there is a high possibility that only one particle can approach a plurality of proteins, and the accuracy of the evaluation method becomes insufficient.
  • the particle size D50 of the coloring dye-containing particles is preferably in the range of 20 to 130 nm, more preferably 30 to 100 nm.
  • the resin used in the present invention is preferably a hydrophilic resin because it becomes grain-emitting dye-containing particles that easily stain cells and the like (cell staining in an aqueous system is easy).
  • the hydrophilic resin is preferably a resin containing a carbon atom in the main chain and having a number average molecular weight of 300 or more.
  • the hydrophilic resin according to the present invention is preferably a hydrophilic organic resin. Specific examples include urea resin, melamine resin, polyvinyl alcohol resin, poly (N-vinylformamide) resin, poly (N-vinylisobutylamide) resin, polyacrylic acid resin, polyacrylamide resin, and poly (N-isopropylacrylamide).
  • Examples of the resin raw material for forming the luminescent dye-containing particles of the present invention include an acrylic resin monomer, a urethane resin monomer, a silicon resin monomer, a fluorine resin monomer, an epoxy resin monomer, an alkyd resin monomer, and a polyester resin monomer.
  • a resin raw material monomer generally known as a polymerizable resin, such as a melamine-based resin monomer, can be used.
  • Examples of the monomer preferably used in the present invention for forming the melamine resin include MW-30, MS-21, MS-002, MX-002, MX-730, MX-750, MX-708, and MX-. 45, MX-41 (manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) and the like.
  • the hydrophilic resin according to the present invention may be a thermosetting resin or a thermoplastic resin.
  • a thermosetting resin such as a melamine resin capable of immobilizing the luminescent dye inside a dense crosslinked structure is used.
  • a hydrophilic resin contained therein is preferable, and a hydrophilic resin composed only of a melamine resin is more preferable.
  • thermosetting resin examples include those containing a structural unit formed of at least one monomer selected from the group consisting of melamine, urea, guanamines (including benzoguanamine, acetoguanamine, etc.) and derivatives thereof. .. Any one of these monomers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. If desired, one or more comonomer other than the above compounds may be used in combination.
  • specific examples of the thermosetting resin include melamine / formaldehyde resin and urea / formaldehyde resin.
  • thermosetting resins not only the monomer itself as described above, but also a prepolymer obtained by reacting the monomer with a compound such as formaldehyde or another cross-linking agent in advance may be used.
  • a prepolymer obtained by reacting the monomer with a compound such as formaldehyde or another cross-linking agent in advance
  • methylolmelamine prepared by condensing melamine and formaldehyde under alkaline conditions is generally used as a prepolymer, and the compound is further alkyl etherified (in water). It may be methylated to improve the stability of formaldehyde, butylated to improve the solubility in an organic solvent, etc.).
  • thermosetting resin at least a part of hydrogen contained in the constituent unit may be replaced with a charged substituent or a substituent capable of forming a covalent bond.
  • a thermosetting resin can be synthesized by using a monomer in which at least one hydrogen is replaced with the above-mentioned substituent (derivatized) by a known method as a raw material.
  • thermosetting resin can be synthesized according to a known method.
  • the melamine / formaldehyde resin can be synthesized by polycondensing methylolmelamine, which has been prepared in advance as described above, by adding a reaction accelerator such as an acid as necessary and then heating to polycondensate.
  • thermoplastic resin is a structural unit formed of a polyfunctional monomer such as divinylbenzene (a group involved in a polymerization reaction in one molecule, a monomer having two or more vinyl groups in the above example), that is, a crosslink. It may include a site. For example, a crosslinked product of polymethyl methacrylate can be mentioned.
  • a polyfunctional monomer such as divinylbenzene (a group involved in a polymerization reaction in one molecule, a monomer having two or more vinyl groups in the above example)
  • a crosslink may include a site.
  • a crosslinked product of polymethyl methacrylate can be mentioned.
  • thermoplastic resin may contain a structural unit having a functional group for surface-modifying the luminescent dye-containing particles in the present invention.
  • a monomer such as glycidyl methacrylate having an epoxy group as a raw material
  • luminescent dye-containing particles in which the epoxy group is oriented on the surface can be prepared.
  • This epoxy group can be converted to an amino group by reacting with excess aqueous ammonia.
  • biomolecules can be introduced into the amino group thus formed according to a known method (via a molecule that serves as a linker, if necessary).
  • the content of the luminescent dye in the luminescent dye-containing particles was calculated by the following method.
  • (1) Measure the molar extinction coefficient in methanol or ethanol under a specific temperature (value is ⁇ ).
  • the specific temperature is set to the temperature at which the luminescent dye has the highest or relatively high solubility in methanol or ethanol. For methanol or ethanol, the one having higher solubility in the luminescent dye is selected.
  • the absorbance of the luminescent dye-containing particles in water is measured at the same temperature as in (1), and the value of the absorbance per 1 g of the luminescent dye-containing particles is defined as A.
  • the surface of the luminescent dye-containing particles may be modified with a bio-related binding substance or the like, or may contain a hydrophilic resin and other components other than the luminescent dye.
  • Mp molecular weight
  • the number of moles of the component is calculated based on the mass and molecular weight of the component for each component, and each component other than the luminescent dye is calculated.
  • the total number of moles of the components may be calculated as "the number of moles of the components other than the dye".
  • the number of moles of the component other than the dye is used instead of the number of moles of 1 g of the luminescent dye-containing particles, and "other than the dye”.
  • the content (mol%) of the luminescent dye with respect to the "number of moles of the component” may be calculated.
  • the luminescent dye-containing particles contain a plurality of types of luminescent dyes, perform (1) to (3) for each type of luminescent dye, calculate the number of moles of the luminescent dye of the type, and calculate the number of moles of each type of luminescent dye.
  • the ratio of the total number of moles of the luminescent dye to the number of moles of 1 g of the luminescent dye-containing particles or "the number of moles of components other than the dye" may be calculated as the content of the luminescent dye (mol%).
  • the luminescent dye contained in the luminescent dye-containing particles of the present invention is an oil-soluble luminescent dye.
  • Oil-soluble means that it is difficult to dissolve in water and easily dissolves in oil in a broad sense, but oil-soluble in the present invention means 1% by mass or more in any one of the following organic solvents at room temperature (20 ° C.). It means something that dissolves.
  • the organic solvent means the organic solvent described in the "Solvent Handbook" and the like, and examples thereof include methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, cyclohexanone and benzene. , Toluene, dioxane, acetonitrile, dichloromethane, chloroform and the like. Further, in the present invention, those dissolved in methanol, chloroform or tetrahydrofuran in an amount of 3% by mass or more are particularly preferable.
  • the luminescent dye used in the present invention may be either a fluorescent dye or a phosphorescent dye.
  • Luminescent dyes include, for example, naphthaleneimide dye molecule, peryleneimide dye molecule, fluorescein dye molecule, rhodamine dye molecule, cascade dye molecule, coumarin dye molecule, eodin dye molecule, NBD dye molecule, pyrene dye.
  • Examples of the luminescent dye according to the present invention include a naphthaleneimide-based dye molecule and an imide derivative of a peryleneimide-based dye molecule.
  • these dyes suppress concentration quenching even if the dye content is increased, and the emission quantum yield is improved. It has the feature. Therefore, it can be suitably used in the present invention.
  • a peryleneimide derivative will be described as an example.
  • a relatively large substituent R is introduced at the ortho position of the phenyl group having an N-phenylimide structure.
  • the substituent R at the ortho position is effective because the phenyl group is oriented perpendicular to the perylene ring due to the steric hindrance between the carbonyl group of the imide and the substituent relatively large at the ortho position of the phenyl group having the N-phenylimide structure. Can shield the ⁇ plane.
  • R 1 each independently represent a hydrogen atom or a substituent, at least one further substituted in.
  • a benzene ring or a naphthalene ring carbon atoms represents a group of 4 to 30
  • * represents the position of a substituent which may be contained in the benzene ring or the naphthalene ring.
  • the ⁇ plane (here, the naphthalene ring) can be shielded and a high emission quantum yield can be exhibited. ..
  • the substituent which may be held at the position indicated by * is not particularly limited.
  • alkyl groups for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, etc.
  • Cycloalkyl group eg, cyclopentyl group, cyclohexyl group, etc.
  • alkenyl group eg, vinyl group, allyl group, etc.
  • alkynyl group eg, ethynyl group, propargyl group, etc.
  • aryl group eg, phenyl group, p- Chlorophenyl group, mesityl group, trill group, xylyl group, naphthyl group, anthryl group, azurenyl group, acenaftenyl group, fluorenyl
  • substituents may be further substituted by the above-mentioned substituents. Further, these substituents may be bonded to each other to form a ring.
  • the cyclic structure formed by adjacent substituents may be an aromatic ring or an alicyclic ring, or may contain a hetero atom, and the cyclic structure is a fused ring having two or more rings. You may.
  • the * position does not have a substituent, or the substituent is an alkyl group, a halogen atom cyano group, a carboxylic acid anhydride obtained by condensing two carboxylic acids, or a fused ring in which group substituents are bonded to each other. be.
  • R 1 independently represents a hydrogen atom or a substituent, and at least one represents a group having 4 to 30 carbon atoms.
  • the substituent represented by R 1 can be selected from the above-mentioned substituents that * may have, but at least one is a group having 4 to 30 carbon atoms. Since the group has 4 to 30 carbon atoms, the phenyl group substituted with a nitrogen atom due to steric hindrance between the carbonyl group of the imide and R 1 is oriented perpendicular to the naphthalene ring, so that the substituent R at the ortho position 1 can effectively shield the ⁇ plane.
  • R 1 preferably has an oxygen atom or a sulfur atom in the carbon chain. More preferably, it has an oxygen atom in the carbon chain. By having an oxygen atom or a sulfur atom in the carbon chain, the structure becomes more flexible, and the shielding effect of the ⁇ plane by R 1 can be enhanced.
  • R 1 is preferably an alkyl group (eg, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, 3-ethylpentyl, etc.), cycloalkyl group (eg, 3-ethylpentyl group, etc.).
  • alkyl group eg, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, 3-ethylpentyl, etc.
  • cycloalkyl group eg, 3-ethylpentyl group, etc.
  • R 1 is more preferably a bulky group, and is an aryl group, a heteroaryl group, an alkyl group containing a secondary or higher carbon (for example, a secondary carbon: isobutyl group, cyclohexyl group, cyclopentyl group, cholesteryl group, 3).
  • Class carbon tert-butyl group, adamantyl group, [2,2,2] bicyclooctyl group, etc.), tertiary amino group (eg, diethylamino group, diphenylamino group, etc.), tertiary silyl group (eg, triisopropylsilyl) Groups, triphenylsilyl groups, phenyldiethylsilyl groups, etc.) and the like. It is also possible to have such a bulky group at the end of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, an acyl group, an acyloxy group, or an amide group.
  • tertiary amino group eg, diethylamino group, diphenylamino group, etc.
  • tertiary silyl group eg, triisopropylsilyl
  • triphenylsilyl groups phenyldie
  • the imide derivative having the structure represented by the general formula (A1) has the structure represented by the following general formulas (A2-1) to (A2-6).
  • R 1 each independently represent a hydrogen atom or a substituent, .R 5, R 6 and R 7 at least one of carbon atoms represents a 4 to 30 groups, each independently , Hydrogen atom, alkyl group, aryl group, heteroaryl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group represent aryloxy group.
  • imide derivative having a structure represented by the general formula (A3) It is preferable that the imide derivative having the structure represented by the general formula (A2-2) has the structure represented by the following general formula (A3).
  • a plurality of R 1 each independently represent a hydrogen atom or a substituent, represents.
  • a plurality of R 5 at least one group of 4 to 30 carbon atoms, each independently, a hydrogen atom, Represents an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group or an aryloxy group.
  • R 6 independently represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkenyl group and an alkynyl. Represents a group, an alkoxy group or an aryloxy group.
  • Perylene bisimide derivatives are desirable because they not only exhibit high emission quantum yields, but also exhibit high light resistance.
  • R 5 independently represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group or an aryloxy group, and is synonymous with R 5 represented by the general formula (A2).
  • R 6 independently represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group or an aryloxy group, and is synonymous with R 6 represented by the general formula (A2). ..
  • imide derivative having a structure represented by the general formula (A4) It is preferable that the imide derivative having the structure represented by the general formula (A3) has the structure represented by the following general formula (A4).
  • a plurality of R 1 each independently represent a hydrogen atom or a substituent, and at least one of them represents a group having a carbon number of 4 to 30.
  • the bay area is a phenoxy group, it is desirable as a fluorescent dye because it can improve solubility and lengthen the wavelength.
  • Each of R 1 independently represents a hydrogen atom substituent, and at least one represents a group having 4 to 30 carbon atoms, which is synonymous with R 1 represented by the general formula (A1).
  • the imide derivative according to the present invention preferably has a structure represented by the general formula (B1).
  • R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • Multiple R 3 are each independently structure represented by hydrogen atom or the following general formula (B2) At least one represents a group having a structure represented by the following general formula (B2).
  • the naphthalene ring may further have a substituent, and * may be contained in the naphthalene ring. Represents the position of a good substituent.
  • the ortho-substituted group R 4 of the aryl ring or heteroaryl ring represented by Ar is oriented toward the perylene ring and effectively shields the ⁇ plane, so that a high quantum yield can be exhibited.
  • Ar represents an aryl ring or a heteroaryl ring which may have a substituent, and examples of the aryl ring include a benzene ring, a naphthalene ring, an azulene ring, an anthracene ring, a phenanthrene ring, a naphthalene ring and a pyrene ring. be able to.
  • the heteroaryl ring includes a pyridine ring, a pyrimidine ring, a furan ring, a pyrrole ring, an imidazole ring, a benzimidazole ring, a pyrazole ring, a pyrazine ring, a triazole ring, a pyrazolotriazole ring, an oxazole ring, a benzoxazole ring, a thiazole ring, and a thiophene.
  • Ar preferably represents an aryl ring.
  • R 4 represents a substituent other than the phenyl group, and in the general formula (A1), a group other than the phenyl group can be selected from the substituents * may have.
  • the alkyl group, aryl group and heteroaryl group represented by R' are synonymous with the alkyl group, aryl group and heteroaryl group listed as the substituents that * may have in the general formula (A1).
  • R 4 is preferably an alkyl group (eg, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, isopropyl group, tert-butyl group, isobutyl group, neopentyl group), cycloalkyl group (eg cyclopentyl).
  • alkyl group eg, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, isopropyl group, tert-butyl group, isobutyl group, neopentyl group
  • cycloalkyl group eg cyclopentyl
  • aryl group excluding phenyl group (eg naphthyl group, anthryl group), heteroaryl group (eg pyridyl group, carbazoly
  • the imide derivative having the structure represented by the general formula (B1) has the structure represented by the following general formulas (B3-1) to (B3-4).
  • R 2 and R 3 has the same meaning as R 2 and R 3 in the general formula (B1).
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, heteroaryl group, alkoxy group and aryloxy group represented by R 8 and R 9 are used as substituents that * may have in the general formula (A1). It is synonymous with the above-mentioned alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, heteroaryl group, alkoxy group and aryloxy group.
  • imide derivative having a structure represented by the general formula (B4) It is preferable that the imide derivative having the structure represented by the general formula (B3-1) has the structure represented by the following general formula (B4).
  • R 2 are each independently a substituted or unsubstituted alkyl group, .R 4 is connected to each other .R 4 each other represent a substituent other than a phenyl group an aryl group or a heteroaryl group
  • R 11 may independently have a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an amino group, an acyl group, an acyloxy group, and an amide.
  • R 4 Represents a group, carboxy group or sulfo group.
  • the substituent R 4 is oriented vertically on the perylene ring, which is desirable because the shielding effect is enhanced.
  • R 2 and R 4 are the same meanings as R 2 and R 4 in the general formula (B1) and the general formula (B2).
  • the luminescent dye according to the present invention is preferably a luminescent dye-containing particle dye having an AlogP value in the range of 10.0 to 60.0, and more preferably in the range of 15.5 to 45.0. Is.
  • the AlogP value is a Ghose-Crippen-Viswanathan octanol-water partition coefficient, which is an expected value of the logP value.
  • the logP value is a dimensionless index that defines the hydrophobicity of a compound, and is generally represented by an octanol / water partition coefficient using n-octanol and water. The larger the value, the higher the hydrophobicity.
  • the AlogP value of the present specification is a non-patent document (Ghose, Arup K. , Vellarkad N. et al. Viswanathan, and John J. et al. Wendoloski, The Journal of Physical Chemistry A 1998, 102, 3762. ), The calculation was performed using the calculation software CANVAS manufactured by Schrodinger.
  • the dye When the AlogP value is 10.0 or more, the dye is not hydrophilic and the dye once introduced into the resin is less likely to leak into water. Therefore, the dye content of the luminescent dye-containing particles is less likely to decrease, and fluorescence emission is performed. Easy to maintain brightness.
  • the AlogP value is 60.0 or less, the hydrophobicity of the dye is not too high, so that the type of organic solvent to be dissolved can be appropriately secured, and the mixture with the hydrophilic resin containing the dye is appropriate. Therefore, the risk of not being incorporated into the particles is reduced.
  • the luminescent dye according to the present invention preferably has a free volume fraction in the range of 10 to 70%. More preferably, it is in the range of 15 to 60%.
  • the free volume fraction represents the ratio of the remaining volume obtained by subtracting the volume occupied by the molecule from the volume per unit mass of the molecule itself under a constant temperature and pressure.
  • the volume fraction of the present specification is calculated by using the Materials Science (Suite) of Schrodinger Co., Ltd. as the volume fraction occupied by the numerator with respect to the unit volume.
  • the emission wavelength of the luminescent dye can be selected as desired depending on the application. For example, in pathological diagnosis, when it is assumed that immunostaining using a luminescent dye is performed at the same time as staining for morphological observation using eosin or the like, the luminescence from the luminescent dye can be visually observed and It is preferable that the emission wavelength of the luminescent dye is red to near infrared so as not to overlap with the emission wavelength of eosin that emits fluorescence. For example, a luminescent dye having an excitation maximum wavelength in the range of 555 to 620 nm and an emission maximum wavelength in the range of 580 to 770 nm is preferable.
  • the hydrophilic resin and the luminescent dye may be adsorbed by a weak interaction, or the hydrophilic resin and the luminescent dye may be covalently bonded.
  • the interaction between the hydrophilic resin and the dye is stronger than the intramolecular interaction between the dyes.
  • the dye is uniformly dispersed in the hydrophilic resin in the entire particles. Concentration quenching is likely to occur when the dye is localized.
  • the resin raw material is polymerized by heating a mixture containing the luminescent dye, a resin raw material, and a surfactant, and the resin particles containing the luminescent dye are polymerized.
  • the surfactant is characterized by containing the anionic surfactant.
  • the amount of the dye contained in the particles is increased. Further, when the particles are stored for a long period of time, the particles are less likely to settle and aggregate, and the decrease in the brightness of the particles can be suppressed.
  • nonionic surfactants have been used to produce nano-sized luminescent dye-containing particles.
  • anionic surfactants facilitates the dispersion of hydrophobic pigments in water.
  • highly hydrophobic dyes that could not be dispersed in water until now can be contained in the particles by using an anionic surfactant, the types of dyes that can be used for the particles can be increased.
  • the amount of the anionic surfactant in the polymerization step of polymerizing the resin raw material to generate the resin particles containing the luminescent dye is preferably 1 to 20% by mass of the total surfactant. If it is within 20% by mass, the polymerization of the resin is unstable, the degree of polymerization becomes non-uniform, and the particle size of the particles does not easily vary. When it is 1% or more, the effect of the anionic surfactant is observed, and the particles do not easily aggregate during storage.
  • the surfactant to be combined with the anionic surfactant is not limited as long as it is a surfactant other than the anionic surfactant, but is preferably a nonionic surfactant or a cationic surfactant, and more preferably a nonionic surfactant. be. If only an anionic surfactant is used as the surfactant, the particle size of the luminescent dye-containing particles may become small. By using a mixture of the anionic surfactant and the nonionic surfactant, the hydrophobic dye is used. Can be contained in the particles in a larger amount.
  • the surfactant contains the nonionic surfactant in the range of 80 to 99% by mass.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention can be produced according to the known polymerization step (1) for various resins using the luminescent dye and an anionic surfactant. Further, the luminescent dye-containing particles obtained by such a method may be further linked with a bio-related binding substance by the modification step (2).
  • the luminescent dye-containing particles using the thermosetting resin can be basically produced according to the emulsion polymerization method, but it is preferably produced by the following polymerization step using a surfactant and a polymerization reaction accelerator.
  • most of the luminescent dye is preferably immobilized in a state where substantially all of the luminescent dye is contained in the resin particles, but some of the luminescent dyes are present. It is not excluded that the resin particles are immobilized in a state of being bonded or adhered to the surface of the resin particles.
  • the present invention it is not necessary to provide a derivatization step for covalently bonding the resin raw material and the luminescent dye in advance or introducing a positively charged substituent into the resin raw material prior to the polymerization step (its). Even if such a step is not used, luminescent dye-containing particles having excellent light emission intensity and light resistance can be obtained), but it is not excluded that such a step is used in combination as desired.
  • the resin raw material is polymerized by heating a mixture containing a luminescent dye, a resin raw material (monomer or oligomer or prepolymer), and a surfactant to contain the luminescent dye. It is a step of producing resin particles, and is characterized in that the surfactant contains the anionic surfactant. Further, it is preferable that the mixture further contains a polymerization reaction accelerator or the like.
  • each component contained in the reaction mixture is not particularly limited. Typically, a surfactant is added to the aqueous solution of the luminescent dye, then a resin raw material is added, and finally a polymerization reaction accelerator is added. Alternatively, the order may be such that the resin raw material is added to the aqueous solution of the surfactant, and then the polymerization reaction accelerator is added to proceed the synthesis reaction of the resin particles, and the aqueous solution of the luminescent dye is added.
  • the concentration of the aqueous solution of the specific luminescent dye used in such a polymerization step according to the present invention can be adjusted in a range relatively higher than the concentration of the conventional aqueous solution of the luminescent dye (for example, 250 to 450 ⁇ M). can.
  • the conditions of the polymerization reaction (temperature, time, etc.) can be appropriately set in consideration of the type of resin, the composition of the raw material mixture, and the like.
  • the polymerization method is not particularly limited as long as it is a known polymerization method.
  • Known polymerization methods include, for example, bulk polymerization, emulsion polymerization, soap-free emulsion polymerization, seed polymerization, suspension polymerization and the like.
  • resin particles having a desired particle size can be obtained by pulverizing and then classifying.
  • Emulsion polymerization is a polymerization method in which a medium such as water, a monomer that is difficult to dissolve in the medium, and an emulsifier (surfactant) are mixed, and a polymerization initiator that is soluble in the medium is added thereto. It is characterized by a small variation in the obtained particle size.
  • Soap-free emulsion polymerization is emulsion polymerization that does not use an emulsifier. It is characterized in that particles having a uniform diameter can be obtained.
  • the seed polymerization is a polymerization carried out by inserting seed particles separately prepared at the start of polymerization. As seed particles, the particle size, particle size distribution, and amount (number) are arbitrarily determined for polymerization, and there is a feature that polymerization can be performed aiming at a desired particle size and particle size distribution.
  • Suspension polymerization is a polymerization method in which a monomer and water as a solvent are mechanically stirred and suspended. It is characterized in that particles having a small particle size and being well-ordered can be obtained.
  • thermosetting resin such as a melamine resin
  • the reaction temperature is usually 70 to 200 ° C., and the reaction time is usually 20 to 120 minutes. It is appropriate that the reaction temperature is a temperature (within the heat resistant temperature range) at which the performance of the luminescent dye does not deteriorate.
  • the heating may be divided into a plurality of stages, and for example, the reaction may be carried out at a relatively low temperature for a certain period of time, and then the temperature may be raised and the reaction may be carried out at a relatively low temperature for a certain period of time.
  • reaction solution After completion of the polymerization reaction, impurities such as excess resin raw materials, luminescent dyes, and surfactants may be removed from the reaction solution, and the generated luminescent dye-containing particles may be recovered and purified.
  • impurities such as excess resin raw materials, luminescent dyes, and surfactants may be removed from the reaction solution, and the generated luminescent dye-containing particles may be recovered and purified.
  • the reaction solution is centrifuged to remove the supernatant containing impurities, and then ultrapure water is added and ultrasonically irradiated to disperse and wash the reaction solution again. It is preferable to repeat these operations a plurality of times until no absorption or fluorescence derived from the resin or luminescent dye is observed in the supernatant.
  • the surfactant As the surfactant, the above-mentioned surfactant can be used. Further, by adjusting the amount of the surfactant added, the particle size of the resin particles can be adjusted, and the luminescent dye-containing particles having a small coefficient of variation of the particle size, that is, having the same particle size can be produced. Can be done.
  • the amount of the surfactant added is preferably 10 to 60% by mass with respect to the resin raw material. Alternatively, it is preferably 0.1 to 3.0% by mass with respect to the entire raw material mixture. Increasing the amount of surfactant added tends to reduce the particle size, and conversely, decreasing the amount of surfactant added tends to increase the particle size.
  • the polymerization reaction accelerator promotes the polycondensation reaction of a thermosetting resin such as a melamine resin, and imparts a proton (H +) to a functional group such as an amino group contained in the resin or a luminescent dye to charge the resin. It has a function of facilitating electrostatic interaction.
  • the reaction of the thermosetting resin proceeds only by heating, but when a polymerization reaction accelerator is added, the reaction proceeds at a lower temperature, so that the reaction and performance can be controlled within a controllable range.
  • Examples of such a polymerization reaction accelerator include acids such as formic acid, acetic acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, and dodecylbenzenesulfonic acid.
  • acids such as formic acid, acetic acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, and dodecylbenzenesulfonic acid.
  • the luminescent dye is a compound having a carboxy group or a sulfo group, the luminescent dye can also donate a proton in the same manner as the above acid.
  • the modification step performed as necessary is a step for linking a bio-related binding substance or the like to the surface of the luminescent dye-containing particles according to the use of the luminescent dye-containing particles.
  • various methods for linking a fluorescent label and a bio-related binding substance or the like are known, and such methods can also be used in the present invention.
  • a fluorescent label one of the reactive functional groups present on the surface thereof
  • a fluorescently labeled substance can bind to a bio-related binding substance (the other reactive functional group present in the molecule).
  • the functional groups contained therein cannot be directly bonded to each other, they can be bonded to both ends of the molecule via "linker molecules" having predetermined functional groups.
  • Such a reaction can be carried out by adding necessary reagents and allowing a predetermined time to elapse.
  • a silane coupling agent for example, aminopropyltrimethoxysilane
  • a luminescent dye-containing particle having a hydroxy group on the surface to introduce an amino group
  • a thiol group introducing reagent for example, N
  • streptavidin a thiol group introducing reagent
  • -Succimidyl S acetylthioacetic acid is reacted to introduce a thiol group
  • a PEG (polyethylene glycol) -based linker molecule having a maleimide group reactive with both an amino group and a thiol group is reacted at both ends.
  • an epoxy group derived from the monomer appears on the surface of the luminescent dye-containing particles.
  • the epoxy group can be converted into an amino group, and a desired bio-related binding substance or the like can be linked to the amino group.
  • the marker for pathological diagnosis of the present invention is characterized by using the luminescent dye-containing particles of the present invention.
  • the use of the luminescent dye-containing particles of the present invention is not particularly limited, but typically, a substance to be detected (hereinafter, also referred to as a target substance) contained in a sample (tissue section) is labeled and immunostained. It can be used as a labeling agent for pathological diagnosis in order to enable fluorescence observation. That is, it is preferable that the luminescent dye-containing particles of the present invention as described above are used as a complex (conjugate) by linking bio-related binding substances according to the embodiment of immunostaining.
  • the labeling agent for pathological diagnosis of the present invention can also be used for a culture sample.
  • the substance to be detected is not particularly limited, but in pathological diagnosis, a biomarker such as an antigen according to the purpose is generally selected.
  • HER2 can be a detection target substance in the pathological diagnosis of breast cancer.
  • units smaller than proteins such as peptides and biomarkers such as RNA can be used as detection target substances.
  • the substance to be detected does not have to be unique to the living body as long as it is present in the sample.
  • the substance to be detected may be a drug introduced into the living body from outside the body.
  • the bio-related binding substance is not particularly limited as long as it can specifically recognize the substance to be detected, but as a first example, an antibody (primary antibody) that specifically binds to the substance to be detected. Can be mentioned.
  • the complex composed of the luminescent dye-containing particles and the primary antibody can be directly bound to the substance to be detected and fluorescently labeled (primary antibody method).
  • the bio-related binding substance may be one that can specifically recognize the substance to be detected.
  • an antibody second example of a bio-related binding substance
  • the primary antibody is an antibody (IgG) produced from a rabbit
  • the secondary antibody will be an anti-rabbit IgG antibody.
  • the substance to be detected can be indirectly fluorescently labeled by binding the complex consisting of the luminescent dye-containing particles and the secondary antibody to the primary antibody bound to the substance to be detected (secondary antibody method). ..
  • the bio-related binding substance is a substance that can specifically recognize a substance complexed with a substance that can be specifically recognized, or a substance that can specifically recognize the substance to be detected.
  • a substance complexed with a substance that can be specifically recognized may be a substance that can be specifically recognized.
  • a third example of a bio-related binding substance is avidin, streptavidin or biotin.
  • the secondary antibody is complexed with a substance that can bind to the substance complexed with the luminescent dye-containing particles. For example, when a complex of a luminescent dye-containing particle and avidin or streptavidin is used, a complex of a secondary antibody and biotin is used in combination.
  • a complex of a secondary antibody and biotin binds to a primary antibody bound to a substance to be detected, and a complex consisting of a luminescent dye-containing particle and avidin or streptavidin further binds to the complex.
  • the substance to be detected can be indirectly fluorescently labeled (biotin-avidin method or sandwich method).
  • a complex of luminescent dye-containing particles and biotin can also be used in combination with a complex of a secondary antibody and avidin or streptavidin.
  • the primary antibody may be selected to specifically bind to the selected substance to be detected.
  • an anti-HER2 monoclonal antibody can be used as the primary antibody.
  • Such a primary antibody can be produced by a general method using mice, rabbits, cows, goats, sheep, dogs, chickens and the like as immune animals.
  • the secondary antibody one that binds to the selected primary antibody may be selected.
  • the primary antibody is a rabbit anti-HER2 monoclonal antibody
  • an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Such a secondary antibody can also be produced by a general method.
  • the complex in which the bio-related binding substance is linked to the luminescent dye-containing particles may be produced by any known method. For example, amidation by the reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, and amination by reaction of epoxy and amine can be utilized.
  • the functional group involved in such a reaction may be one existing on the surface of the resin particles in advance (a functional group derived from the raw material monomer of the resin), or a functional group existing on the surface of the resin particles is known. It may be a functional group converted according to a method or a functional group introduced by surface modification or the like. Appropriate linker molecules may be utilized as needed.
  • kits for tissue immunostaining using the luminescent dye-containing particles of the present invention includes at least the luminescent dye-containing particles of the present invention, a complex in which a bio-related binding substance is linked to the luminescent dye-containing particles, or a luminescent dye-containing particle for preparing the complex, a bio-related binding substance, and the like.
  • a bio-related binding substance e.g., biotin
  • the kit further comprises a primary antibody, a secondary antibody, other bio-related binding material (eg, biotin) used in combination with said bio-related binding material (eg, streptavidin), the desired complex, as required. It may contain reagents for forming, other reagents used for immunohistochemical staining, and the like.
  • the fluorescent labeling agent using the luminescent dye-containing particles of the present invention is, for example, a method for detecting a biological substance in which immunostaining and morphological observation staining are used in combination in order to enhance information, and more specifically, (1) a fluorescent labeling substance. It includes a step of immunostaining the tissue section using morphological observation, (2) a step of morphological observation staining of the tissue section using a stain for morphological observation, and (3) a step of fluorescently observing the tissue section after staining. It can be used in a biological substance detection method. Either of the immunostaining step (1) and the morphological observation staining step (2) may be performed first.
  • the tissue section is deparaffinized and the antigen is activated according to a conventional method.
  • the immunostaining step (1) is necessary so that the substance to be detected can be appropriately labeled according to the form of the fluorescent labeling agent (complex of luminescent dye-containing particles and bio-related binding substance) as described above. Substances may be sequentially added to the tissue sections and reacted.
  • the morphological observation dyeing step (2) can be performed according to a conventional method.
  • staining with eosin in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinized cells are stained in red to deep red
  • staining with hematoxylin in which the cell nucleus, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus are stained in blue to pale blue
  • HE stain Known as eosin stain (HE stain).
  • a dehydration treatment by immersing in ethanol a permeation treatment by immersing in an organic solvent such as xylene, a sealing treatment using an encapsulant, and the like are performed.
  • the tissue section subjected to immunostaining and morphological observation staining by the above step is irradiated with excitation light having an appropriate wavelength according to the luminescent dye used, thereby displaying the fluorescence. Observe the fluorescence emitted by the body.
  • a predetermined biomolecule such as an antigen present in the tissue section can be detected, and a molecular target drug (for example, an antibody drug "Herceptin” (trademark) which is a humanized anti-HER2 monoclonal antibody) can be detected. It can be used as information for determining the suitability of application.
  • an irradiation means similar to that for general fluorescence observation may be used.
  • a filter that selectively transmits a predetermined wavelength from a laser light source provided in a fluorescence microscope may be used.
  • Excitation light of appropriate wavelength and output may be applied to the stained tissue section.
  • Fluorescence observation may be performed from the lens barrel of the fluorescence microscope, or an image taken by a camera installed in the fluorescence microscope may be separately displayed on a display means (monitor or the like). Although it depends on the luminescent dye, it may be possible to observe the fluorescence through taking an image with a camera even if the fluorescence cannot be sufficiently observed by visual observation from the lens barrel of a fluorescence microscope. If necessary, a filter that selectively transmits a predetermined wavelength may be used.
  • both immunostaining and morphological observation staining are performed on the same tissue section, but when observing an image by morphological observation staining, a luminescent dye for immunostaining is excited. It is not necessary to irradiate the excitation light of the above, and observation may be performed under the same observation conditions as that of an optical microscope.
  • the reliability of the HER2 protein detection sensitivity of the luminescent dye-containing particles of the present invention can be verified by correlating with the FISH score by the FISH (Fluorescence in situ hybridization) method.
  • the FISH method is an experimental method in which a probe with a fluorescent substance is hybridized with a target gene and observed with a fluorescence microscope, and is generally known as a HER2 protein detection method.
  • Luminescent dye-containing particles No. 1 to 40 and 42 were prepared according to the predetermined conditions shown in the table below.
  • Surfactants types listed in Tables I and II
  • 20 mL of water was added so as to be 0.5 vol%. While stirring this solution on a hot stirrer, the temperature was raised to the melting temperatures shown in Tables 1 and II, and then resin raw materials (types and amounts shown in Tables I and II) were added.
  • Additives (types and amounts shown in Tables I and II) were added to this solution to prepare luminescent dye-containing particles.
  • the obtained dispersion was centrifuged (20,000 G for 90 minutes) to collect particles, washed with ultrapure water, and purified. The treatment by removing the supernatant after centrifugation and redispersing in ultrapure water was repeated 5 times.
  • Streptavidin introduced with a thiol group was prepared as follows. First, 40 ⁇ L of an aqueous solution of streptavidin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted to 1 mg / mL and 70 ⁇ L of an aqueous solution of N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (manufactured by SATA, price) adjusted to 64 mg / mL. In addition, a thiol group (-NH-CO-CH 2- S-CO-CH 3 ) protected against the amino group of streptavidin was introduced by reacting at room temperature for 1 hour.
  • Each luminescent dye-containing resin particle surface-modified with a PEG chain having a maleimide group at the prepared terminal and the prepared streptavidin having a thiol group introduced were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA, and 1 By reacting for a time, streptavidin was bound to the resin particles via a PEG chain. 10 mM mercaptoethanol was added to this reaction solution to stop the reaction. After concentrating the obtained solution with a centrifugal filter, unreacted substances were removed using a gel filtration column for purification, and streptavidin-modified luminescent dye-containing resin particles No. luminescent dye-containing particles No. 1-40 and 42 were obtained. Details of the above manufacturing conditions are shown in Tables I and II below.
  • Luminescent dye No. 15 and 3 ⁇ L of 3-aminopropyltrimethoxysilane were mixed in N, N-dimethylformamide (DMF) to obtain an organoalkoxysilane compound.
  • the obtained organoalkoxysilane compound 0.6 mL was mixed with 48 mL of 99% ethanol, 0.6 mL of tetraethoxysilane (TEOS), 2 mL of ultrapure water, and 2.0 mL of 28 mass% aqueous ammonia for 3 hours at 5 ° C. ..
  • the mixed solution prepared in the above step was centrifuged at 10000 G for 20 minutes to remove the supernatant.
  • ethanol was added to disperse the precipitate, and the washing step of centrifuging again was repeated three times to obtain luminescent dye-containing particles.
  • the obtained luminescent dye-containing particles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffer physiological saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM was added to this solution to a final concentration of 10 mM.
  • PBS phosphate buffer physiological saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the following evaluations were performed on the produced luminescent dye-containing particles 1 to 42.
  • the particle size D50 obtained from the volume-based cumulative particle size distribution curve of each of the produced luminescent dye-containing particles was measured using a particle size distribution measuring device LA-950V2 manufactured by Tsu Seisakusho.
  • the content of the surfactant in the luminescent dye-containing particles As for the content of the surfactant in the luminescent dye-containing particles, the content of the surfactant such as the anionic surfactant and the nonionic surfactant was analyzed by using the above-mentioned HPLC.
  • ⁇ Tissue staining process> [Immunohistochemical staining]
  • the dyeing agent for tissue staining a buffer solution such as PBS buffer solution containing 1% BSA was used.
  • a tissue array slide (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd., product number CB-A712) was used as the stained section.
  • the FISH score for each spot was calculated in advance using the Pathvision HER2 DNA probe kit (manufactured by Abbott Laboratories, Inc.). This FISH score was calculated according to the procedure described in the document attached to the HER2 Gene Kit Pathvision ® HER2 DNA Probe Kit from Abbott Japan.
  • tissue array slide After deparaffinizing the tissue array slide, it was replaced with water, washed, and autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 15 minutes to activate the antigen.
  • the tissue array slide after the antigen activation treatment was washed with PBS buffer, and then the anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (4B5) diluted to 0.05 nM with PBS buffer containing 1% BSA was reacted with the tissue section for 2 hours. I let you. After washing with PBS, it was reacted with biotin-labeled anti-rabbit antibody diluted with PBS buffer containing 1% BSA for 30 minutes.
  • immunohistochemically stained sections were obtained by reacting with the above-mentioned dyeing agent for tissue staining, that is, with the above-mentioned produced dye resin particles having streptavidin for 2 hours, and then washing.
  • the obtained immunohistochemically stained section was immersed in a 4% neutral paraformaldehyde aqueous buffer solution for 10 minutes for fixation treatment.
  • the excitation 575 ⁇ irradiation light intensity is 900 W / cm 2 of 600nm near the central portion of the visual field in the excitation 450 to the irradiation light intensity of 900 W / cm 2 near the central portion of the visual field in 490 nm
  • the irradiation light intensity near the center of the visual field was 500 W / cm 2
  • the irradiation light intensity near the center of the visual field was 500 W / cm 2
  • the irradiation light intensity near the center of the visual field was 500 W / cm 2 .
  • the irradiation light intensity is calculated by measuring the light energy value when the objective 40x lens is attached with a power meter 8230 manufactured by Advantest, and dividing by the 40x lens irradiation field area (about ⁇ 450 ⁇ m).
  • the exposure time at the time of image acquisition was arbitrarily set so that the brightness of the image was not saturated, and the image was acquired. For example, the measurement was performed in 1000 msec. The acquired image was not corrected so that the brightness value became linear in the full range.
  • the cell shape (position of the cell membrane) was identified by image processing using the stained image for morphology, and the streptavidin-modified luminescent dye containing the HER2 protein expressed on the cell membrane was superposed on the immunostained image.
  • the bright spots representing the particles were extracted and measured as the number of luminescent dye-containing particles.
  • those having a brightness equal to or higher than a predetermined value were converted into the number of luminescent dye-containing particles by dividing the brightness of the bright spot by the brightness per particle of the number of luminescent dye-containing particles.
  • the content of the luminescent dye was measured by the method described above.
  • the particle size is the diameter (equivalent to an area circle) when an electron micrograph is taken using a scanning electron microscope (SEM), the cross-sectional area of the luminescent dye-containing particles is measured, and the measured value is taken as the area of the corresponding circle. Diameter) was measured.
  • SEM scanning electron microscope
  • the details of the manufacturing conditions are shown in Tables I and II.
  • the evaluation results of the luminescent dye-containing particles and the results of the dyeing evaluation are shown in Tables III and IV.
  • Emargen 150 Polyoxyethylene lauryl ether manufactured by Kao Corporation (polyoxyethylene repeating unit number 50)
  • Emargen 409PV Polyoxyethylene oleyl ether made by Kao Corporation Polyoxyethylene number of repeating units 9)
  • Emargen 430 Polyoxyethylene oleyl ether made by Kao Corporation Polyoxyethylene number of repeating units 30)
  • Neoperex G-15 Sodium dodecylbenzene sulfonate acetylamine manufactured by Kao Corporation 24: Coconatamine acetate coatamine manufactured by Kao Corporation 24P: Lauryltrimethylammonium chloride manufactured by Kao Corporation
  • the resin raw materials shown in the table are as follows. MS-002: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) MW-30: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) MX-002: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) MX-035: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) MX-45: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) MX-708: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industry Co., Ltd.) MX-730: (Melamine resin raw material manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) MMA: Methyl Methacrylate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) Urea: (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the particle size D50 obtained from the volume-based cumulative particle size distribution curve is abbreviated as the volume-based particle size D50.
  • the ratio of the surfactant represents the mass% of the total surfactant used.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention are capable of emitting high-luminance light and have high storage stability even though they have a small particle size.
  • the number of volatilization points per unit volume is large, the dyeing performance is excellent, and the dyeing method is highly reliable.
  • the luminescent dye-containing particles of the present invention can be applied as a labeling agent for pathological diagnosis because they can emit high-intensity light and have high storage stability even though they have a small particle size.

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Abstract

本発明の課題は、小粒径でありながら、高輝度の発光が可能で、かつ、保存安定性が高い発光色素含有粒子を提供することである。また、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することである。　本発明の発光色素含有粒子は、樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、アニオン界面活性剤を含有し、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が１～１５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする。

Description

発光色素含有粒子、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤
　本発明は、発光色素含有粒子、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤に関する。より詳しくは、小粒径でありながら、高輝度の発光が可能で、かつ、保存安定性が高い発光色素含有粒子、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤に関する。
　高精度で空間分解能が良い免疫染色をするために、発光色素含有粒子は、小粒径であることが好ましい。また、生体分子は自家蛍光を発し、蛍光顕微鏡で蛍光色素由来の蛍光発光を検出する際に自家蛍光がノイズとして同時に検出されてしまうため、病理染色用の発光色素含有粒子には、生体分子の自家蛍光に埋もれない高い発光輝度が求められる。さらに、高い発光輝度を長期間維持する高い保存安定性が求められている。しかし、小粒径の発光色素含有粒子は、大粒径の粒子に比べて、粒子の発光輝度が低下し、検出感度が下がるという問題があった。
　色素を粒子中に含有させた状態で輝度を高く維持するには、輝度が高い色素を効率よく粒子中に含有させることが必要である。しかし、色素の含有量が多い粒子は密度が高く、保存時に溶液中で沈降・凝集するという問題があった。また、粒子中の色素密度が高いと、粒子中で色素同士が凝集しやすく濃度消光により、輝度が低下してしまうという重大な問題を抱えていた。
　保存安定性を改良した報告例としては、粒子の凝集を抑制するためにグリセロールなど高粘性添加物を加えた例があるが（特許文献１参照）、粒子中の色素の凝集までは抑えられないため輝度低下は避けられなかった。
　また、ナノ粒子合成に使う界面活性剤として、一般的にはノニオン界面活性剤が使われてきた。ノニオン界面活性剤は、電気的に中性であるため、混合する材料を選ばずに使用できる上、親水性と疎水性のバランスを調整しやすく、乳化・分散性、可溶力にも優れている。一方、発光色素含有粒子の分散安定性を向上させ、粒子中の色素の凝集を抑制するためのものとして、アニオン界面活性剤など電荷を帯びるものを用いた例はまだ知られていない。
国際公開第２０１５／１６３２０９号
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、小粒径でありながら、高輝度の発光が可能で、かつ、保存安定性が高い発光色素含有粒子を提供することである。また、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することである。
　上記説明したように、発光色素含有粒子の発光輝度を高くするには、粒子中の色素量を増やす必要があるが、色素含有量を上げると粒子密度が高くなり、結果として粒子が溶液中で沈降しやすくなり長期間保存する際には凝集してしまう。また、粒子中の色素の密度が高いと色素同士の凝集が生じやすくなり濃度消光を起こし輝度が低下しやすくなる。
　これらの問題点を解決するために、発明者らが鋭意検討を重ねた結果、樹脂原料を重合して発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程において使用する界面活性剤として、アニオン界面活性剤を用いることにより、粒子中に含有する色素量が増大し、さらに、粒子を長期間保存する際に、粒子が沈降・凝集しにくく、粒子の発光輝度低下が抑制されることを見いだし本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、アニオン界面活性剤を含有し、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が１～１５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする発光色素含有粒子。
　２．前記アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することを特徴とする第１項に記載の発光色素含有粒子。
　３．さらに、ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする第１項又は第２項に記載の発光色素含有粒子。
　４．前記アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で及び前記ノニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することを特徴とする第３項に記載の発光色素含有粒子。
　５．前記アニオン界面活性剤が、炭素数８以上のアルキル基を有することを特徴とする第１項から第４項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　６．前記ノニオン界面活性剤が、ポリエチレングリコールの繰り返し単位構造を８個以上有することを特徴とする第３項から第５項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　７．前記樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して、前記発光色素を２０～８０ｍｏｌ％の範囲内で含有することを特徴とする第１項から第６項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　８．前記発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０．０～６０．０の範囲内であることを特徴とする第１項から７までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　９．前記樹脂が、親水性樹脂であることを特徴とする第１項から第８項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　１０．前記樹脂が、メラミン樹脂であることを特徴とする第１項から第９項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
　１１．第１項から第１０項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を製造する発光色素含有粒子の製造方法であって、
前記発光色素と樹脂原料と界面活性剤とを含有する混合物を加熱することにより、前記樹脂原料を重合して前記発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程を有し、
前記界面活性剤が、前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする発光色素含有粒子の製造方法。
　１２．前記界面活性剤が、全界面活性剤のうち１～２０質量％の範囲内で前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする第１１項に記載の発光色素含有粒子の製造方法。
　１３．前記界面活性剤が、８０～９９質量％の範囲で前記ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする第１１項又は第１２項に記載の発光色素含有粒子の製造方法。
　１４．第１項から第１０項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を用いることを特徴とする病理診断用標識剤。
　本発明の上記手段により、小粒径でありながら、高輝度の発光が可能で、かつ、保存安定性が高い発光色素含有粒子を提供することができる。また、その製造方法及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することができる。
　本発明の効果の発現機構ないし作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。
　アニオン界面活性剤は、発光色素（特に疎水性発光色素）や疎水性溶媒を水中に分散させることができるため、樹脂原料を重合して発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程において、色素が重合系中で均一に分散されることにより、樹脂重合時に取り込まれる色素量が増えると考えらえる。粒子形成後には、粒子中に残存した微量のアニオン界面活性剤がマイナスの電荷をもつことにより、発光色素含有粒子同士の凝集が抑制され、粒子中の色素同士が近づきにくくなり、凝集すなわち濃度消光が抑えられ高輝度の発光が可能となるとともに保存安定性も改善されるものと推測される。
　本発明の発光色素含有粒子は、樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、アニオン界面活性剤を含有し、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が１～１５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする。この特徴は、下記各実施態様（形態）に共通する又は対応する技術的特徴である。
　本発明の実施態様としては、アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することが好ましい。このように少量のアニオン界面活性剤が発光色素含有粒子中に残存することで、粒子中の色素が凝集しにくくなる。
　さらに、ノニオン界面活性剤を含有することが、発光色素含有粒子の粒径を適度な粒径の粒子にすることができることから好ましい。
　本発明においては、アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で及び前記ノニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することが好ましい。これにより、疎水性色素をより多く発光色素含有粒子に含有させることができることから好ましい。
　本発明の実施態様としては、色素を凝集させないアニオン界面活性剤の観点から、アニオン界面活性剤が、炭素数８以上のアルキル基を有することが好ましい。
　また、ノニオン界面活性剤が、ポリエチレングリコールの繰り返し単位構造を８個以上有することが、発光色素含有粒子の粒径を制御する観点から好ましい。
　さらに、本発明においては、多岐にわたる染色形態において濃度消光の発生を抑制し、適切な輝度を確保する観点から、樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して、前記発光色素を２０～８０ｍｏｌ％の範囲内で含有することが好ましい。
　また、発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０．０～６０．０の範囲内であることが、疎水性が適度にあり、粒子中で凝集しにくく、濃度消光しにくくなることから好ましい。
　また、樹脂が、親水性樹脂であることが、細胞などを染色しやすい発光色素含有粒子になる（水系での細胞染色がしやすい）ことから好ましい。
　さらに、本発明においては、樹脂が、メラミン樹脂であることが、発光色素含有粒子の染色しやすさと保存時の堅ろう性の観点から好ましい。
　本発明の発光色素含有粒子を製造する発光色素含有粒子の製造方法としては前記発光色素と樹脂原料と界面活性剤とを含有する混合物を加熱することにより、前記樹脂原料を重合して前記発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程を有し、前記界面活性剤が、前記アニオン界面活性剤を含有する態様の製造方法であることが、好ましい。
　また、前記界面活性剤が、全界面活性剤のうち１～２０質量％の範囲内で前記アニオン界面活性剤を含有する発光色素含有粒子の製造方法であることが好ましい。
　さらに、前記界面活性剤が、８０～９９質量％の範囲でノニオン界面活性剤を含有することが好ましい。これにより、発光色素含有粒子の粒径を適度な粒径の粒子にすることができる。
　本発明の発光色素含有粒子は、病理診断用標識剤に好適に用いられる。
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
　《発光色素含有粒子》
　本発明の発光色素含有粒子は、樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、アニオン界面活性剤を含有し、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が１～１５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする。
　本発明においては、発光色素含有粒子が、アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することが好ましい。このように、アニオン界面活性剤を微量含有することで、粒子中の色素が凝集しにくくなるものと考えられる。
　より好ましくは、発光色素含有粒子が、さらに、ノニオン界面活性剤を含有することであり、さらに好ましくは、発光色素含有粒子が、前記アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で及び前記ノニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することである。ノニオン界面活性剤も組み合わせて用いることで、粒径の制御を容易にすることができる。
　なお、本発明において、発光色素含有粒子とは、単数又は複数の発光色素分子が化学的又は物理的な作用により樹脂粒子に固定化された構造を有する物質を総称する用語であり、その形態は特に限定されるものではない。発光色素は、その全てが樹脂と弱い相互作用で吸着していてもよく、またその一部が有機樹脂と共有結合で結合していてもよい。粒子中の樹脂と色素の存在状態としては、粒子全体で色素が樹脂中に均一に分散していることが、濃度消光が生じにくいことから好ましい。
　［界面活性剤］
　本発明においては、発光色素含有粒子が、アニオン界面活性剤を含有する。
　（アニオン界面活性剤）
　本発明に用いられるアニオン界面活性剤は、カルボン酸塩、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、リン酸エステル塩等、公知のアニオン界面活性剤を挙げることができる。
　具体的には、花王（株）社製アニオン界面活性剤（エマール０、エマール１０Ｇ、エマール２ＦＧ、エマールＴＤ、エマール２０Ｃ、エマールＥ－２７Ｃ、エマール２７０Ｊ、エマール２０ＣＭ等のエマールシリーズ、ラテムルＥ－１１８Ｂ、ラテムルＥ－１５０等のラテムルシリーズ、ネオペレックスＧＳ、ネオペレックスＧ－１５、ネオペレックスＧ－２５、ネオペレックスＧ－６５等のネオペレックスシリーズ、ペレックスＮＢ－Ｌ、ペレックスＯＴ－Ｐ、ぺレックスＴＲ、ぺレックスＣＳ、ぺレックスＴＡ、ぺレックスＳＳ－Ｌ、ぺレックスＳＳ－Ｈ等のぺレックスシリーズ等）や日油（株）社製アニオン界面活性剤（シントレッキスＥＨ－Ｒ等のシントレッキスシリーズ、パーソフトＳＰ等のパーソフトシリーズ、ニッサントラックスＫ－４０、ニッサントラックスＫ－３００等のニッサントラックスシリーズ、サンアミドＣＦ－３、サンアミドＣＦ－１０等のサンアミドシリーズ、ダイヤポンＳ、ダイヤポンＬＭ、ダイヤポンＫ等のダイヤポンシリーズ、ソフティルトＡＳ－Ｌ、ソフティルトＡＴ－Ｌ等のソフティルトシリーズ、フィレットＬ等のフィレットシリーズ、ラピゾールＡ－３０、ラピゾールＡ－８０等のラピゾールシリーズ、ニューレックスＲ－２５Ｌ、ニューレックスＲ、ニューレックスソフトタイプ３０、ニューレックスソフト６０－Ｎ等のニューレックスシリーズ、ノンサールＬＫ－２、ノンサールＭＫ－１等のノンサールシリーズ等）が例として挙げられる。
　これらの中で、炭素数８以上アルキル基を有するアニオン界面活性剤が好ましい。炭素数が８以上の場合、アニオン界面活性剤の疎水性が不足して色素が凝集しやすくなることがない。
　（他の界面活性剤）
　本発明には、アニオン界面活性剤の他に他の界面活性剤を用いることができる。他の界面活性剤として、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン界面活性剤、が挙げられるが、ノニオン界面活性剤をアニオン界面活性剤とともに用いることが好ましい。ノニオン界面活性剤として、公知のノニオン界面活性剤を用いることができる。
　（ノニオン界面活性剤）
　ノニオン界面活性剤には、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、アルキルグリコシド、脂肪酸アルカノールアミド、グリセリン脂肪酸エステル、アルキルグリセリルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどがあり、乳化性、洗浄性、浸透性、耐ｐＨ性、低発泡性、安全性、低刺激性、などの機能を持ち、化粧品や食品、工業用製品などに広く使われている。
　本発明に用いられるノニオン界面活性剤として、具体的には、花王（株）社製ノニオン界面活性剤（エマルゲン１０５、エマルゲン２１０Ｐ等のエマルゲンシリーズ、レオドールＳＰ－Ｌ１０等のレオドールシリーズ、ラテムルＰＤ－４２０等のラテムルシリーズ、エマゾールＬ－１０Ｖ等のエマゾールシリーズ、エキセルＳ－９５等のエキセルシリーズ、エマノーン１１１２等のエマノーンシリーズ、アミート１０２等のアミートシリーズ、アミノーンＬ－０２等のアミノーンシリーズ等）、日油（株）社製ノニオン界面活性剤（ノニオンＫ－２０４、ノニオンＫ－２２０等のノニオンシリーズ、パーソフトＮＫ－６０、パーソフトＮＫ－１００等のパーソフトシリーズ、モノグリＤ等のモノグリシリーズ、ユニグリＭＫ－２０７等のユニグリシリーズ、ユニオックスＨＣ－４０等のユニオックスシリーズ、プロノン＃１０２等のプロノンシリーズ、ナイミーンＬ－２０１、ナイミーンＦ－２０２等のナイミーンシリーズ、スタホームＦＫ等のスタホームシリーズ、ナイミッドＭＦ－２０３等のナイミッドシリーズ、ユニセーフＡ－ＬＭ等のユニセーフシリーズ、ディスパノールＷＩ－１０６等のディスパノールシリーズ等）等が挙げられる。
　これらの中で、ポリエチレングリコールの繰り返し構造を８個以上有するノニオン界面活性剤が好ましい。アニオン界面活性剤と組み合わせて使う際に好ましい発光色素含有粒子の粒径を制御しやすくなる。ポリエチレングリコールの繰り返し構造を８個以上有する場合、粒径を大きく調製することができる。
　（界面活性剤量の測定方法）
　本発明において、発光色素含有粒子中の界面活性剤量の含有量は、下記操作によって測定することができる。
　発光色素含有粒子０．１ｍｇに対し、ギ酸１ｍＬを加えて５０℃に加熱し３時間かき混ぜ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整する。水を減圧留去して濃縮し、逆相カラム、ＵＶ検出器、ＲＩ検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、略称：ＨＰＬＣ）を用いて溶液中のアニオン界面活性剤及びノニオン界面活性剤等の界面活性剤の含有量を分析することができる。
　（ＨＰＬＣの分析条件）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＫＷ－８０３
展開溶媒：Ｈ2Ｏ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度：３０℃
検出方法：Ｓｈｏｄｅｘ　ＲＩ
試料濃度：１０質量％
注入量：５μＬ
　［粒径］
　本発明の発光色素含有粒子は、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が、１～１５０ｎｍの範囲内である。発光色素含有粒子の粒径が１５０ｎｍよりも大きい場合には、本来、発色色素含有粒子によって認識しようとするタンパク質などの生体分子に比べて大きすぎるため、病理染色用の発光色素含有粒子としては検出感度が低くなってしまう。例えば、複数存在するタンパク質に対して一つの粒子しか近づくことができない可能性が高く、評価方法としての正確性が不十分となる。
　発色色素含有粒子の粒径Ｄ５０として好ましくは、２０～１３０ｎｍ、より好ましくは３０～１００ｎｍの範囲内である。
　本発明の発光色素含有粒子の体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０は、堀場製作所製の粒度分布測定装置ＬＡ－９５０Ｖ２型を用いて測定することができる。累積粒度分布曲線において積算体積分率が、累積５０％の粒径をＤ５０として求めることができる。
　［樹脂］
　本発明に用いられる樹脂は、親水性樹脂であることが、細胞などを染色しやすい粒発光色素含有粒子になる（水系での細胞染色がしやすい）ことから好ましい。
　（親水性樹脂）
　本発明において、親水性樹脂は、主鎖に炭素原子を含む数平均分子量が３００以上の樹脂が好ましい。本発明に係る親水性樹脂として、好ましくは、親水性の有機樹脂である。具体例としては、尿素樹脂、メラミン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルホルムアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルイソブチルアミド）樹脂、ポリアクリル酸樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルピロリジノン）樹脂、ポリヒドロキシエチルメタクリレート樹脂、ポリオキシエチレンメタクリレート樹脂、ポリエチレングリコールジメチルエーテル樹脂、ポリスチレンスルホン酸樹脂などが好ましい。これらの中では、樹脂がメラミン樹脂が、発光色素含有粒子の染色しやすさと保存時の堅ろう性の観点から好ましい。
　本発明の発光色素含有粒子を形成する樹脂原料としては、アクリル系樹脂モノマー、ウレタン系樹脂モノマー、シリコン系樹脂モノマー、ふっ素系樹脂モノマー、エポキシ系樹脂モノマー、アルキド系樹脂モノマー、ポリエステル系樹脂モノマー、メラミン系樹脂モノマー等、一般的に重合性樹脂として知られる樹脂原料モノマーを使うことができる。
　本発明で好ましく用いられる、メラミン樹脂の形成するためのモノマーとしては、例えば、ＭＷ－３０、ＭＳ－２１、ＭＳ－００２、ＭＸ－００２、ＭＸ－７３０、ＭＸ－７５０、ＭＸ－７０８、ＭＸ－４５、ＭＸ－41（日本カーバイド工業社製）等が挙げられる。
　本発明に係る親水性樹脂は、熱硬化性樹脂であっても、熱可塑性樹脂であってもよい。例えば、キシレンのような有機溶媒を用いる透徹工程において発光色素が溶出しにくいという観点からは、緻密な架橋構造の内部に発光色素を固定化することができる、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を含有する親水性樹脂が好ましく、さらには、メラミン樹脂のみからなる親水性樹脂が、より好ましい。
　熱硬化性樹脂としては、例えば、メラミン、尿素、グアナミン類（ベンゾグアナミン、アセトグアナミンなどを含む）及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーから形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、何れか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。
　熱硬化性樹脂の具体例としては、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂、尿素・ホルムアルデヒド樹脂が挙げられる。
　これらの熱硬化性樹脂の原料としては、上述したようなモノマーそのもののみならず、モノマーとホルムアルデヒドやその他の架橋剤等の化合物とをあらかじめ反応させて得られるプレポリマーを用いてもよい。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂の製造においては一般的に、メラミンとホルムアルデヒドとをアルカリ条件下で縮合して調製されるメチロールメラミンがプレポリマーとして用いられており、当該化合物はさらにアルキルエーテル化（水中での安定性を向上させるためのメチル化、有機溶媒中での溶解性を向上させるためのブチル化等）されたものであってもよい。
　また、上記の熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が、電荷を持つ置換基、又は共有結合を形成しうる置換基に置き換えられたものでもよい。このような熱硬化性樹脂は、公知の手法により少なくとも一つの水素が上記の置換基に置き換えられた（誘導体化された）モノマーを原料として用いることにより合成することができる。
　このような熱硬化性樹脂は、公知の手法に従って合成することができる。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂は、前述したようにしてあらかじめ調製されたメチロールメラミンを、必要に応じて酸等の反応促進剤を添加した上で加熱して重縮合させることにより合成することができる。
　一方、熱可塑性樹脂としては、例えば、（メタ）アクリル酸及びそのアルキルエステル、アクリロニトリル、ならびにこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種の単官能モノマー（一分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を一個持つモノマー）から形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、何れか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。上記の熱可塑性樹脂は、例えばジビニルベンゼンのような多官能モノマー（１分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を２個以上持つモノマー）から形成される構成単位、つまり架橋部位を含んでいてもよい。例えば、ポリメタクリル酸メチルの架橋物が挙げられる。
　さらに、上記の熱可塑性樹脂は、本発明における発光色素含有粒子を表面修飾するための官能基を有する構成単位を含んでいてもよい。例えば、エポキシ基を有するメタクリル酸グリシジルのようなモノマーを原料とすることにより、エポキシ基が表面に配向した発光色素含有粒子を調製することができる。このエポキシ基は、過剰のアンモニア水と反応させることによりアミノ基に変換することができる。このようにして形成されるアミノ基には、公知の手法に従って（必要に応じてリンカーとなる分子を介して）、各種の生体分子を導入することができる。
　（発光色素含有粒子中の発光色素の含有量の測定）
　本発明において、発光色素含有粒子中の発光色素の含有量は、次に示す方法によって算出した。
　（１）特定の温度下で、メタノール又はエタノール中でのモル吸光係数を測定する（値をεとする）。特定の温度は、メタノール又はエタノールにおいて発光色素の溶解度が最も高い又は比較的高い温度に設定する。なお、メタノール又はエタノールは、発光色素に対して溶解度の高い方を選択する。
　（２）（１）と同じ温度下で発光色素含有粒子の水中での吸光度を測定し、発光色素含有粒子１ｇあたりの吸光度の値をＡとする。なお、発光色素含有粒子は、表面に生体関連結合性物質等が修飾されており、又は親水性樹脂と発光色素以外の他の成分を含有するものであっても良い。
　（３）（１）のεと（２）のＡの値から、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素のモル数Ｃ［ｍｏｌ］を算出する。
　Ａ／ε＝粒子１ｇあたりの発光色素量Ｃ［ｍｏｌ］
　（４）発光色素の分子量（Ｍｄ）と（３）のＣ［ｍｏｌ］の値から、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素量Ｄ［ｇ］を算出する。
　Ｍｄ×Ｃ［ｍｏｌ］＝Ｄ［ｇ］／粒子１ｇ
　（５）発光色素含有粒子１ｇから、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素量Ｄ［ｇ］を引いた質量Ｅ（＝１－Ｄ［ｇ］）［ｇ］を、親水性樹脂のモノマー単位の分子量（Ｍｐ）で除算し、その商を親水性樹脂のモル数Ｅｍとして算出する。
　なお、親水性樹脂と発光色素以外にも他の成分が含有されている場合は、それぞれの成分について、当該成分の質量と分子量に基づいて当該成分のモル数を算出し、発光色素以外の各成分のモル数の総計を「色素以外の成分のモル数」として算出すれば良い。発光色素以外の各成分の質量を特定することができない場合は、発光色素以外の各成分の質量の総計を、親水性樹脂のモノマー単位の分子量（Ｍｐ）で除算し、その商を「色素以外の成分のモル数」と見なしても良い。
　Ｅ［ｇ］／Ｍｐ＝Ｅｍ［ｍｏｌ］
　（６）発光色素含有粒子１ｇのモル数を算出し、それに対する発光色素の含有量（ｍｏｌ％）を算出する。
　発光色素含有粒子１ｇのモル数＝発光色素含有粒子１ｇあたりの親水性樹脂のモル数Ｅｍ［ｍｏｌ］＋発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素のモル数Ｃ［ｍｏｌ］
　発光色素含有粒子中の発光色素の含有量（ｍｏｌ％）＝Ｃ／（Ｅｍ＋Ｃ）×１００
　なお、親水性樹脂と発光色素以外にも他の成分が含有されている場合は、「色素以外の成分のモル数」を発光色素含有粒子１ｇのモル数の代わりに使用し、「色素以外の成分のモル数」に対する発光色素の含有量（ｍｏｌ％）を算出すれば良い。また、発光色素含有粒子に複数種類の発光色素が含有されている場合は、それぞれの種類の発光色素について（１）～（３）を行い当該種類の発光色素のモル数を算出し、各種類の発光色素のモル数の総計と発光色素含有粒子１ｇのモル数又は「色素以外の成分のモル数」との比を、発光色素の含有量（ｍｏｌ％）として算出すれば良い。
　［発光色素］
　本発明の発光色素含有粒子が含有する発光色素は、油溶性発光色素である。油溶性とは広義には水に溶けにくく油に溶けやすいことをいうが、本発明における油溶性とは、室温（２０℃）において以下に示す有機溶剤のうち何れか１つにおいて１質量％以上溶解するものをいう。有機溶剤とは「溶剤ハンドブック」等に記載の有機溶剤を意味し、それらの例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノン、ベンゼン、トルエン、ジオキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。また、本発明においては、特に、メタノール、クロロホルム又はテトラヒドロフランに３質量％以上溶解するものが好ましい
　本発明で用いる発光色素は、蛍光発光する色素でもリン光発光する色素でもどちらでもよい。発光色素として、例えば、ナフタレンイミド系色素分子、ペリレンイミド系色素分子、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香族炭化水素系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子等が挙げられる。
　具体的には、フルオレセイン、２′，７′ジクロロフルオレセイン、２′，７′ジフルオロフルオレセイン、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２４，４′，５′，７，７′－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２′，４，７，７′－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４′，５′－ジクロロ－２′，７′－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４０５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４３０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５１４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。特に好ましい発光色素として、ナフタレンイミド系色素分子、ペリレンイミド系色素分子を挙げることができる。
　本発明に係る発光色素として、ナフタレンイミド系色素分子及びペリレンイミド系色素分子のイミド誘導体を挙げることができる。
　これらの色素は、以下（Ａ）及び（Ｂ）に示す立体障害を起こす、かさ高い置換基を導入することにより、色素含有量を増やしても濃度消光が抑制され、発光量子収率が向上するという特徴を有している。このため、本発明に好適に用いることができる。以下ペリレンイミド誘導体を例にして説明する。
　（Ａ）Ｎ－フェニルイミド構造のフェニル基のオルト位に比較的大きな置換基Ｒを導入する。

　イミドのカルボニル基とＮ－フェニルイミド構造のフェニル基のオルト位に比較的大きな置換基との立体障害によりフェニル基がペリレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒが効果的にπ平面を遮蔽することができる。
　（Ｂ）ペリレン環のベイエリアにオルト置換基Ｒを持つアリール基を導入する。
　ペリレン環のベイエリアの立体的混み合いによりアリール基（この場合フェニル基）がペリレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒが効果的にπ平面を遮蔽することができる。
　以下、一般式（Ａ１）又は一般式（Ｂ１）で表される構造を有する化合物について説明する。
　［一般式（Ａ１）で表される構造を有するイミド誘導体］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表す。ベンゼン環又はナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ベンゼン環又はナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す。）
　イミドの窒素原子に置換したフェニル基のオルト位にかさ高い（炭素数４以上）の置換基があることでπ平面（ここではナフタレン環）を遮蔽し、高い発光量子収率を示すことができる。
　＊に示した位置に有しても良い置換基としては、特に制限されない。
　具体的には、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アルケニル基（例えば、ビニル基、アリル基等）、アルキニル基（例えば、エチニル基、プロパルギル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ｐ－クロロフェニル基、メシチル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基、アズレニル基、アセナフテニル基、フルオレニル基、フェナントリル基、インデニル基、ピレニル基、ビフェニリル基等）、ヘテロアリール基（例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、トリアゾリル基（例えば、１，２，４－トリアゾール－１－イル基、１，２，３－トリアゾール－１－イル基等）、ピラゾロトリアゾリル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、フラザニル基、チエニル基、キノリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、インドリル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、ジアザカルバゾリル基（前記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、キナゾリニル基、フタラジニル基等）、複素環基（例えば、ピロリジル基、イミダゾリジル基、モルホリル基、オキサゾリジル基等）、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ドデシルオキシ基等）、シクロアルコキシ基（例えば、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等）、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、ドデシルチオ基等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基等）、アルコキシカルボニル基（例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等）、スルファモイル基（例えば、アミノスルホニル基、メチルアミノスルホニル基、ジメチルアミノスルホニル基、ブチルアミノスルホニル基、ヘキシルアミノスルホニル基、シクロヘキシルアミノスルホニル基、オクチルアミノスルホニル基、ドデシルアミノスルホニル基、フェニルアミノスルホニル基、ナフチルアミノスルホニル基、２－ピリジルアミノスルホニル基等）、アシル基（例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、オクチルカルボニル基、２－エチルヘキシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、ピリジルカルボニル基等）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、ブチルカルボニルオキシ基、オクチルカルボニルオキシ基、ドデシルカルボニルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基等）、アミド基（例えば、メチルカルボニルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ジメチルカルボニルアミノ基、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロヘキシルカルボニルアミノ基、２－エチルヘキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基、ドデシルカルボニルアミノ基、フェニルカルボニルアミノ基、ナフチルカルボニルアミノ基等）、カルバモイル基（例えば、アミノカルボニル基、メチルアミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、オクチルアミノカルボニル基、２－エチルヘキシルアミノカルボニル基、ドデシルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ナフチルアミノカルボニル基、２－ピリジルアミノカルボニル基等）、ウレイド基（例えば、メチルウレイド基、エチルウレイド基、ペンチルウレイド基、シクロヘキシルウレイド基、オクチルウレイド基、ドデシルウレイド基、フェニルウレイド基ナフチルウレイド基、２－ピリジルアミノウレイド基等）、スルフィニル基（例えば、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、２－エチルヘキシルスルフィニル基、ドデシルスルフィニル基、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、２－ピリジルスルフィニル基等）、アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ブチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基、２－エチルヘキシルスルホニル基、ドデシルスルホニル基等）、アリールスルホニル基又はヘテロアリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、２－ピリジルスルホニル基等）、アミノ基（例えば、アミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジフェニルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジタートブチル基、シクロヘキシルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２－エチルヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基、アニリノ基、ナフチルアミノ基、２－ピリジルアミノ基等）、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、フッ化炭化水素基（例えば、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ペンタフルオロフェニル基等）、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、シリル基（例えば、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）、ホスホノ基、カルボキシ基、スルホ基が挙げられる。
　また、これらの置換基は、上記の置換基によってさらに置換されていてもよい。さらに、これらの置換基同士が結合して環を形成してもよい。隣接する置換基同士が形成する環状構造は、芳香環であっても脂肪環であってもよく、またヘテロ原子を含むものであってもよく、さらに環状構造は２環以上の縮合環であってもよい。
　好ましくは、＊の位置には置換基を有しないか、又は置換基がアルキル基、ハロゲン原子シアノ基、二つカルボン酸が縮合したカルボン酸無水物、若しくは基置換基同士が結合した縮合環である。
　Ｒ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表す。
　Ｒ1で示される置換基は、具体的には、＊が有してもよい上記の置換基の中から選ぶことができるが、少なくとも一つは、炭素数が４～３０の基である。炭素数が４～３０の基であることによって、イミドのカルボニル基とＲ1との立体障害により窒素原子に置換したフェニル基がナフタレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒ1が効果的にπ平面を遮蔽することができる。また、Ｒ1は、炭素鎖中に酸素原子又は硫黄原子を有することが好ましい。より好ましくは、炭素鎖中に酸素原子を有することである。炭素鎖中に酸素原子又は硫黄原子を有するにより、より柔軟な構造となり、Ｒ1によるπ平面の遮蔽効果を高めることができる。
　Ｒ1は、好ましくは、アルキル基（例えば、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、３－エチルペンチル等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルエチル等）、アルケニル基（例えば、プロぺニル基、ヘキセニル基等）、アルキニル基（例えば、プロピニル基、ヘキシニル基、フェニルエチニル等）、アリール基（例えば、フェニル基、ｐ－クロロフェニル基、メシチル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基、アズレニル基、アセナフテニル基、フルオレニル基、フェナントリル基、インデニル基、ピレニル基、ビフェニリル基等）、ヘテロアリール基（例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、フリル基、ピロリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、ベンゾオキサゾリル基、チエニル基、キノリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、インドリル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、ジアザカルバゾリル基（前記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、キナゾリニル基、フタラジニル基等）、複素環基（例えば、ピロリジル基、イミダゾリジル基、モルホリル基、オキサゾリジル基等）、アルコキシ基（例えば、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ドデシルオキシ基、２－エチルブチルオキシ等）、シクロアルコキシ基（例えば、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等）、アルキルチオ基（例えば、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、ドデシルチオ基等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基等）、アルコキシカルボニル基（例えば、ブチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等）、スルファモイル基（例えば、ブチルアミノスルホニル基、ヘキシルアミノスルホニル基、シクロヘキシルアミノスルホニル基、オクチルアミノスルホニル基、ドデシルアミノスルホニル基、フェニルアミノスルホニル基、ナフチルアミノスルホニル基、２－ピリジルアミノスルホニル基等）、アシル基（例えば、ブチルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、オクチルカルボニル基、２－エチルヘキシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、ピリジルカルボニル基等）、アシルオキシ基（例えば、ブチルカルボニルオキシ基、オクチルカルボニルオキシ基、ドデシルカルボニルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基等）、アミド基（例えば、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロヘキシルカルボニルアミノ基、２－エチルヘキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基、ドデシルカルボニルアミノ基、フェニルカルボニルアミノ基、ナフチルカルボニルアミノ基等）、カルバモイル基（例えば、ジエチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、オクチルアミノカルボニル基、２－エチルヘキシルアミノカルボニル基、ドデシルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ナフチルアミノカルボニル基、２－ピリジルアミノカルボニル基等）、ウレイド基（例えば、ペンチルウレイド基、シクロヘキシルウレイド基、オクチルウレイド基、ドデシルウレイド基、フェニルウレイド基ナフチルウレイド基、２－ピリジルアミノウレイド基等）、スルフィニル基（例えば、ブチルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、２－エチルヘキシルスルフィニル基、ドデシルスルフィニル基、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、２－ピリジルスルフィニル基等）、アルキルスルホニル基（例えば、ブチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基、２－エチルヘキシルスルホニル基、ドデシルスルホニル基等）、アリールスルホニル基又はヘテロアリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、２－ピリジルスルホニル基等）、アミノ基（例えば、ジフェニルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２－エチルヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基、アニリノ基、ナフチルアミノ基、２－ピリジルアミノ基等）フッ化炭化水素基（例えば、デカフルオロブチル基、ペンタフルオロフェニル基等）シリル基（例えば、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）である。
　Ｒ1は、かさ高い基であることがより好ましく、アリール基、ヘテロアリール基、２級以上の炭素が含まれるアルキル基（例えば２級炭素：イソブチル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、コレステリル基、３級炭素：ｔｅｒｔ－ブチル基、アダマンチル基、［２，２，２］ビシクロオクチル基等）、３級アミノ基（例えば、ジエチルアミノ基、ジフェニルアミノ基等）、３級シリル基（例えば、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）などが挙げられる。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アミド基の末端にこのようなかさ高い基を有することもできる。
　［一般式（Ａ２－１）～一般式（Ａ２－６）で表される構造を有するイミド誘導体］
　一般式（Ａ１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ２－１）～一般式（Ａ２－６）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表す。Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基はアリールオキシ基を表す。）
　［一般式（Ａ３）で表される構造を有するイミド誘導体］
　一般式（Ａ２－２）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ３）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表す。複数のＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。Ｒ6は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。）
　ペリレンビスイミド誘導体は、高い発光量子収率を示すだけでなく、高い耐光性を示すため望ましい。
　Ｒ5は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、一般式（Ａ２）で示したＲ5と同義である。
　Ｒ6は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、一般式（Ａ２）で示したＲ6と同義である。
　［一般式（Ａ４）で表される構造を有するイミド誘導体］
　一般式（Ａ３）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ４）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表す。）
　ベイエリアがフェノキシ基の場合、溶解性の向上及び波長の長波長化できることから蛍光色素として望ましい。
　Ｒ1は、それぞれ独立に、水素原子置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４～３０の基を表し、一般式（Ａ１）で示したＲ1と同義である。
　［一般式（Ｂ１）で表される構造を有するイミド誘導体］
　本発明に係るイミド誘導体は、一般式（Ｂ１）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　（式中、Ｒ2は、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。ナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　（式中、Ａｒは、アリール環又はヘテロアリール環を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。一般式（Ｂ２）で表される基を二つ以上有する場合は、二つのＲ4同士が互いに連結していてもよい。Ｌは、単結合、酸素原子、硫黄原子又は－ＮＲ′－を表す。Ｒ′は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。）
　Ａｒで表したアリール環又はヘテロアリール環のオルト置換基Ｒ4がペリレン環に向かって配向し、効果的にπ平面を遮蔽するため高い量子収率を示すことができる。
　Ａｒは、置換基を有しても良いアリール環又はヘテロアリール環を表し、アリール環としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アズレン環、アントラセン環、フェナントレン環、ナフタセン環及びピレン環等を挙げることができる。
　ヘテロアリール環としては、ピリジン環、ピリミジン環、フラン環、ピロール環、イミダゾール環、ベンゾイミダゾール環、ピラゾール環、ピラジン環、トリアゾール環、ピラゾロトリアゾール環、オキサゾール環、ベンゾオキサゾール環、チアゾール環、チオフェン環、キノリン環、ベンゾフラン環、ジベンゾフラン環、インドール環、キノキサリン環、トリアジン環等を挙げることができる。
　Ａｒは、アリール環を表すことが好ましい。
　Ｒ4は、フェニル基以外の置換基を表し、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基からフェニル基以外の基を選択することができる。
　Ｒ′で表されるアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基として挙げたアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基と同義である。
　Ｒ4は、好ましくはアルキル基（例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソブチル基、ネオペンチル基）、シクロアルキル基（例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基）、フェニル基を除くアリール基（例えばナフチル基、アントリル基）、ヘテロアリール基（例えばピリジル基、カルバゾリル基）、アルケニル基（例えばブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基）、アルキニル基（例えばプロピニル基、ヘキシニル基、フェニルエチニル基、トリメチルシリルエチニル基）、シリル基（例えばトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリフェニルシリル基）、アルコキシ基（メトキシ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ基）又はアリールオキシ基（フェノキシ基、ナフトキシ基）である。
　［一般式（Ｂ３－１）～一般式（Ｂ３－４）で表される構造を有するイミド誘導体］
　一般式（Ｂ１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ｂ３－１）～一般式（Ｂ３－４）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　（式中、Ｒ2は、それぞれ独立に、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は前記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、前記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。）
　Ｒ2及びＲ3は、一般式（Ｂ１）におけるＲ2及びＲ3と同義である。
　Ｒ8及びＲ9で表されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基は、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基として挙げたアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基と同義である。
　［一般式（Ｂ４）で表される構造を有するイミド誘導体］
　前記一般式（Ｂ３－１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ｂ４）で表される構造を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　（式中、複数のＲ2は、それぞれ独立に、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。Ｒ4同士が互いに連結していてもよい。Ｒ11は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アシル基、アシルオキシ基、アミド基、カルボキシ基又はスルホ基を表す。）
　ベイエリア４カ所全てがフェノキシ基の場合、置換基Ｒ4が、それぞれペリレン環の上下に配向し、遮蔽効果が高まるため望ましい。
　Ｒ2及びＲ4は、それぞれ一般式（Ｂ１）及び一般式（Ｂ２）におけるＲ2及びＲ4と同義である。
　更に、前記一般式（Ｂ４）において、Ｒ4のいずれか２つがペリレン上を横断し連結していることが望ましい。連結することによりペリレン環同士の相互作用を効果的に阻害し、より高い発光量子収率を示す。
　さらに、本発明に係る発光色素として、好ましくは、ＡｌｏｇＰ値が１０．０～６０．０の範囲内である発光色素含有粒子色素であり、より好ましくは、１５．５～４５．０の範囲内である。
　ＡｌｏｇＰ値とは、Ｇｈｏｓｅ－Ｃｒｉｐｐｅｎ－Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ　ｏｃｔａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔのことであり、ｌｏｇＰ値の予想値である。ｌｏｇＰ値とは、化合物の疎水性を規定する無次元数の指標であり、一般的に、ｎ－オクタノールと水を用いたオクタノール／水の分配係数で表される。値が大きいほど疎水性が高い。本明細書のＡｌｏｇＰ値は、非特許文献（Ｇｈｏｓｅ，
　Ａｒｕｐ　Ｋ．，Ｖｅｌｌａｒｋａｄ　Ｎ．Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，ａｎｄ　Ｊｏｈｎ　Ｊ．Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａ　１９９８，１０２，３７６２．）に記載の手法を用いて、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社の計算ソフトＣＡＮＶＡＳを使って計算した。
　ＡｌｏｇＰ値が１０．０以上であると、色素が親水的ではなくなり、樹脂に一旦導入された色素が水中に漏れ出しにくくなることから、発光色素含有粒子の色素含有量が減少しにくく、蛍光発光輝度を維持しやすい。一方、ＡｌｏｇＰ値が６０．０以下であると、色素の疎水性が高すぎることがないため、溶解する有機溶媒の種類を適度に確保でき、また色素を含有する親水性樹脂との混合が適度に可能となるため、粒子中に取り込まれなくなる恐れが小さくなる。
　本発明に係る発光色素は、自由体積率が１０～７０％の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、１５～６０％の範囲内である。自由体積率とは、一定温度・圧力下で，分子自身がもつ単位質量当たりの体積から，その分子の占有している体積を差し引いた残りの体積の比率を表す。自由体積が１０～７０％の範囲内にある場合には、発光色素が粒子中で凝集しにくいために濃度消光が起こりにくい。本明細書の自由体積率は、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社のＭａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｕｉｔｅ）を使って、単位体積に対して、分子が占める占有体積を自由体積率として計算した。
　また、発光色素の発光波長は用途に応じて所望のものを選択することができる。例えば、病理診断において、エオジン等を用いた形態観察用の染色と同時に発光色素を用いた免疫染色を行う用途が想定される場合は、発光色素からの発光を目視で観察することができ、かつ蛍光を発するエオジンの発光波長と被らないよう、発光色素の発光波長は赤～近赤外とすることが好適である。例えば、励起極大波長が５５５～６２０ｎｍ、発光極大波長が５８０～７７０ｎｍの範囲にある発光色素が好ましい。
　（例示化合物）
　本発明において用いることのできる発光色素の具体例は次のとおりであるが、本発明はこれらの発光色素を用いる実施形態に限定されるものではない。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　本発明の発光色素含有粒子は、親水性樹脂と発光色素が弱い相互作用で吸着していてもよく、親水性樹脂と発光色素が共有結合で結合していてもよい。
　本発明においては、色素どうしの分子内相互作用よりも親水性樹脂と色素の相互作用が強いほうが好ましい。
　粒子中の親水性樹脂と色素の存在状態としては、粒子全体で色素が親水性樹脂中に均一に分散していることが好ましい。色素が局在化すると濃度消光が生じやすい。
　《発光色素含有粒子の製造方法》
　上記説明した本発明の発光色素含有粒子の製造方法は、発光色素と樹脂原料と界面活性剤とを含有する混合物を加熱することにより、前記樹脂原料を重合して前記発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程を有し、前記界面活性剤が、前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする。
　本発明において、樹脂原料を重合して発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程において使用する界面活性剤として、アニオン界面活性剤を用いることにより、粒子中に含有する色素量が増大し、さらに、粒子を長期間保存する際に、粒子が沈降・凝集しにくく、粒子の輝度低下を抑制することができる。
　これまでは、ナノサイズの発光色素含有粒子の製造には、ノニオン界面活性剤だけを使っていた。アニオン界面活性剤を使うと、疎水性色素が水中に分散しやすくなる。さらに、これまでは水中に分散できなかった、疎水性が高い色素も、アニオン界面活性剤を使えば粒子中に含有させることができるので、粒子に使える色素の種類が増やすことができる。
　樹脂原料を重合して発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程におけるアニオン界面活性剤の量は、全界面活性剤のうち１～２０質量％であることが好ましい。２０質量％以内であれば、樹脂の重合が不安定で重合度が不均一になり、粒子の粒径にばらつきが生じやすくなることがない。１％以上の場合は、アニオン界面活性剤の効果が見られ、保存時に粒子が凝集しやすくなることがない。
　アニオン界面活性剤と組み合わせる界面活性剤は、アニオン界面活性剤以外の界面活性剤であれば制限はないが、好ましくは、ノニオン界面活性剤又はカチオン界面活性剤、より好ましくは、ノニオン界面活性剤である。
　界面活性剤としてアニオン界面活性剤のみを用いると、発光色素含有粒子の粒径が小さくなってしまう場合があり、アニオン界面活性剤とノニオン界面活性剤とを混合して使うことで、疎水性色素をより多く粒子に含有させることもできる。
　好ましい態様としては、前記界面活性剤が、８０～９９質量％の範囲で前記ノニオン界面活性剤を含有することである。
　具体的には、本発明の発光色素含有粒子は、発光色素とアニオン界面活性剤を用いた上で、各種の樹脂について公知の重合工程（１）に準じて製造することができる。また、そのような方法により得られた発光色素含有粒子は、さらに修飾工程（２）により、生体関連結合性物質を連結させてもよい。
　熱硬化性樹脂を用いた発光色素含有粒子は、基本的に乳化重合法に従って製造することができるが、界面活性剤及び重合反応促進剤を用いる次のような重合工程により製造することが好ましい。なお、このような製造方法により得られる発光色素含有粒子において、発光色素の大部分が、望ましくは実質的に全てが樹脂粒子に含有された状態で固定化されるが、一部の発光色素が樹脂粒子の表面に結合ないし付着した状態で固定化されることが排除されるものではない。また、発光色素が含有された状態において、どのような化学的又は物理的な作用で発光色素が樹脂粒子に固定化されているかは限定されるものではない。本発明では、重合工程に先立って、樹脂原料と発光色素とをあらかじめ共有結合させたり、樹脂原料に積極的に荷電した置換基を導入したりするための誘導体化工程を設ける必要はない（そのような工程を用いなくても、発光強度や耐光性に優れた発光色素含有粒子が得られる）が、所望によりそのような工程を併用することも排除されるものではない。
　（１）重合工程
　重合工程は、発光色素と樹脂原料（モノマー又はオリゴマーないしプレポリマー）と界面活性剤とを含有する混合物を加熱することにより、前記樹脂原料を重合して前記発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる工程であり、前記界面活性剤が、前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする。
　また、上記混合物には、さらに重合反応促進剤等を含有することが好ましい。
　反応混合物に含まれる各成分の添加順序は特に限定されるものではない。典型的には、発光色素の水溶液に界面活性剤を添加し、続いて樹脂原料を添加し、最後に重合反応促進剤を添加するという順序が用いられる。あるいは、界面活性剤の水溶液に樹脂原料を添加し、続いて重合反応促進剤を添加して樹脂粒子の合成反応を進行させながら、発光色素の水溶液を添加するという順序であってもよい。なお、このような重合工程に用いられる、本発明による特定の発光色素の水溶液の濃度は、従来の発光色素の水溶液の濃度よりも比較的高めの範囲（例えば２５０～４５０μＭ）で調節することができる。
　重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料混合物の組成などを考慮しながら適切に設定することができる。
　重合方法としては、公知の重合方法であれば特に限定されるものではない。公知の重合法としては、例えば塊状重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合、シード重合、懸濁重合等の方法が挙げられる。塊状重合の場合は、粉砕後、分級することで所望の粒径の樹脂粒子を得ることができる。乳化重合とは、水等の媒体と、媒体に溶解し難いモノマーと乳化剤（界面活性剤）を混合し、そこに媒体に溶解可能な重合開始剤を加えて行う重合法である。得られる粒径のバラツキが少ないという特徴がある。ソープフリー乳化重合とは、乳化剤を用いない乳化重合である。均一径の粒子が得られるという特徴がある。シード重合とは、重合開始の際に別途で作られた種（シード）粒子を入れて行われる重合である。種粒子として粒径と粒径分布、量（個数）を任意に定めて重合することになり、所望の粒径と粒径分布を狙って重合できるという特徴がある。懸濁重合とは、モノマーと溶媒の水とを機械的に攪拌して、懸濁させて行う重合方法である。粒径が小さくかつ整った粒子を得られることが特徴である。
　具体例としてメラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成を挙げると、反応温度は通常７０～２００℃、反応時間は通常２０～１２０分間である。なお、反応温度は発光色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、例えば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に降温で一定時間反応させるようにしてもよい。
　重合反応の終了後は、反応液から余剰の樹脂原料、発光色素、界面活性剤等の不純物を除去し、生成した発光色素含有粒子を回収して精製すればよい。例えば、反応液を遠心分離にかけ、不純物が含まれている上澄みを除去した後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させて洗浄する。これらの操作は、上澄みに樹脂や発光色素に由来する吸光、蛍光が見られなくなるまで複数回繰り返し行うことが好ましい。
　（界面活性剤）
　界面活性剤としては、前記した界面活性剤を用いることができる。また、界面活性剤の添加量を調節することにより、樹脂粒子の粒径を調節することができるとともに、その粒径の変動係数が小さい、つまり粒子サイズの揃った発光色素含有粒子を製造することができる。界面活性剤の添加量は、樹脂原料に対して１０～６０質量％の割合であることが好ましい。又は、原料混合物全体に対して０．１～３．０質量％であることが好ましい。界面活性剤の添加量を増やすと粒径が小さくなる傾向にあり、逆に界面活性剤の添加量を減らすと粒径が大きくなる傾向にある。
　（重合反応促進剤）
　重合反応促進剤は、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の重縮合反応を促進するとともに、当該樹脂又は発光色素に含まれるアミノ基のような官能基にプロトン（Ｈ＋）を付与して荷電させ、静電的相互作用を起こしやすくする機能を有する。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、重合反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。このような重合反応促進剤としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸などの酸が挙げられる。なお、発光色素がカルボキシ基やスルホ基を有する化合物である場合、当該発光色素も上記の酸と同様にプロトンを供与することもできる。
　（２）修飾工程
　必要に応じて行われる修飾工程は、発光色素含有粒子の用途に応じて、発光色素含有粒子の表面に生体関連結合性物質などを連結するための工程である。
　本発明の属する技術分野においては、蛍光標識体と生体関連結合性物質などとを連結するための様々な手法が知られており、本発明においてもそのような手法を利用することができる。
　例えば、カルボキシ基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、マレイミド基等の反応性官能基同士の間で起きる反応を利用して、蛍光標識体（その表面に存在する一方の反応性官能基）と生体関連結合性物質（その分子中に存在するもう一方の反応性官能基）とを結合させることができる。また、これらが有する官能基同士を直接的に結合することができない場合は、分子の両末端にそれぞれ所定の官能基を有する「リンカー分子」を介して結合させることもできる。このような反応は、必要な試薬類を添加して所定の時間経過させることにより行うことができる。
　具体例としては、表面にヒドロキシ基を有する発光色素含有粒子にシランカップリング剤（例えばアミノプロピルトリメトキシシラン）を反応させてアミノ基を導入し、一方でストレプトアビジンにチオール基導入試薬（例えばＮ－スクシミジルＳアセチルチオ酢酸）を反応させてチオール基を導入し、最後に、アミノ基とチオール基の両方と反応性を有するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）系のリンカー分子を反応させて、発光色素含有粒子とストレプトアビジンとを連結させる方法が挙げられる。
　また、例えばグリシジルメタクリレートを原料モノマーとして用いて樹脂（アクリル系樹脂）を合成した場合、発光色素含有粒子の表面には当該モノマーに由来するエポキシ基が表れている。この発光色素含有粒子にアンモニア水を添加することにより、そのエポキシ基をアミノ基に変換し、さらにそのアミノ基に所望の生体関連結合性物質などを連結させることができる。
　《病理診断用標識剤》
　本発明の病理診断用標識剤は、本発明の発光色素含有粒子を用いることを特徴とする。
　本発明の発光色素含有粒子の用途は特に限定されるものではないが、典型的には、試料（組織切片）に含まれる検出対象物質（以下、目的物質ともいう。）を標識し、免疫染色において蛍光観察できるようにするための、病理診断用標識剤としての用途が挙げられる。すなわち、上述したような本発明の発光色素含有粒子は、免疫染色の実施形態に応じた生体関連結合性物質を連結させて、複合体（コンジュゲート）として使用することが好適である。また、本発明の病理診断用標識剤は、培養サンプルに用いることも可能である。
　検出対象物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原などのバイオマーカーが選択される。例えば、乳癌に関する病理診断においてはＨＥＲ２を検出対象物質とすることができる。その他にも、ペプチド等のタンパク質より小さな単位や、ＲＮＡなどのバイオマーカーを検出対象物質とすることができる。また、検出対象物質は、試料に存在するものであれば、生体固有のものでなくても良い。例えば、検出対象物質は、体外から生体内に導入された薬剤であっても良い。
　生体関連結合性物質は、検出対象物質を特異的に認識可能なものであれば特に限定されるものではないが、第一の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）が挙げられる。発光色素含有粒子と一次抗体とからなる複合体は、検出対象物質に直接結合して蛍光標識することができる（一次抗体法）。
　また、生体関連結合性物質は、検出対象物質を特異的に認識可能なものを特異的に認識可能なものであっても良い。例えば、生体関連結合性物質の第二の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）に結合する抗体（二次抗体）が挙げられる。例えば、一次抗体がウサギから産生した抗体（ＩｇＧ）である場合、二次抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体となる。検出対象物質に結合している一次抗体に、発光色素含有粒子と二次抗体とからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（二次抗体法）。
　また、生体関連結合性物質は、検出対象物質を特異的に認識可能なものに複合体化された物質を特異的に認識可能なものであり、又は検出対象物質を特異的に認識可能なものを特異的に認識可能なものに複合体化された物質を、特異的に認識可能なものであっても良い。例えば、生体関連結合性物質の第三の例として、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが挙げられる。この場合、二次抗体は、発光色素含有粒子と複合体化している物質と結合しうる物質と複合体化される。例えば、発光色素含有粒子とアビジン又はストレプトアビジンとの複合体を用いる場合は、二次抗体とビオチンとの複合体が組み合わされて用いられる。検出対象物質に結合している一次抗体に、二次抗体とビオチンとの複合体が結合し、当該複合体にさらに発光色素含有粒子とアビジン又はストレプトアビジンとからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（ビオチン－アビジン法又はサンドイッチ法）。これとは逆に、発光色素含有粒子とビオチンとの複合体を、二次抗体とアビジン又はストレプトアビジンとの複合体と組み合わせて用いることもできる。
　一次抗体は、選択された検出対象物質に応じて、それと特異的に結合するものを選択すればよい。例えば、検出対象物質がＨＥＲ２である場合、一次抗体としては抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いることができる。このような一次抗体（モノクローナル抗体）は、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキンなどを免疫動物とする一般的な手法により産生することができる。
　二次抗体は、選択された一次抗体に応じて、それと結合するものを選択すればよい。例えば、一次抗体がウサギ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である場合、二次抗体としては抗ウサギＩｇＧ抗体を用いることができる。このような二次抗体も一般的な手法により産生することができる。
　その他にも、検出対象物質を核酸分子とし、それに対応する生体関連結合性物質として、当該核酸分子と相補的な塩基配列を有する核酸分子を用いることも可能である。
　発光色素含有粒子に生体関連結合性物質が連結した複合体は、公知のいかなる手法によって作製されたものであってもよい。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化を利用することができる。このような反応に関与する官能基は、樹脂粒子の表面にあらかじめ存在するもの（樹脂の原料モノマーに由来する官能基）であってもよいし、樹脂粒子の表面に存在する官能基を公知の手法に従って変換した官能基や、表面修飾等により導入された官能基であってもよい。必要に応じて適切なリンカー分子を利用してもよい。
　したがって、本発明の別の側面において、本発明の発光色素含有粒子を使用した組織免疫染色用キットが提供される。このキットは少なくとも、本発明の発光色素含有粒子、発光色素含有粒子に生体関連結合性物質が連結された複合体、又は当該複合体を調製するための発光色素含有粒子、生体関連結合性物質及び試薬類を含む。このキットはさらに、必要に応じて、一次抗体、二次抗体、前記生体関連結合性物質（例えばストレプトアビジン）と組み合わせて用いられる他の生体関連結合性物質（例えばビオチン）、所望の複合体を形成するための試薬類、その他の免疫組織染色に用いられる試薬類などを含んでいてもよい。
　（目的物質検出方法）
　本発明の発光色素含有粒子を用いた蛍光標識剤は、例えば、情報性を高めるために免疫染色と形態観察染色を併用する生体物質検出方法、より具体的には、（１）蛍光標識体を用いて組織切片を免疫染色する工程と、（２）形態観察用の染色剤を用いて組織切片を形態観察染色する工程と、（３）染色後の組織切片を蛍光観察する工程、とを含む生体物質検出方法において使用することができる。なお、（１）の免疫染色工程及び（２）の形態観察染色工程はどちらを先におこなってもよい。
　通常、上記の生体物質検出方法の工程（１）に先だって、常法に従って、組織切片の脱パラフィン処理、及び抗原の賦活化処理が行われる。
　免疫染色工程（１）は、前述したような蛍光標識剤（発光色素含有粒子及び生体関連結合性物質の複合体）の形態に応じて、検出対象物質を適切に標識することができるよう、必要な物質を順次組織切片に添加して反応させればよい。
　形態観察染色工程（２）は、常法に従って行うことができる。組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
　通常、工程（１）及び（２）の後、工程（３）の前に、エタノールに浸漬する脱水処理、キシレン等の有機溶媒に浸漬する透徹処理、封入剤を用いる封入処理などが行われる。
　蛍光観察工程（３）では、上記工程により免疫染色及び形態観察染色が施された組織切片に、用いられている発光色素に応じた適切な波長を有する励起光を照射することにより、その蛍光標識体が発する蛍光を観察する。このような工程により、その組織切片内に存在する抗原等の所定の生体分子を検出することができ、分子標的薬（例えばヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である抗体医薬「ハーセプチン」（商標））の適用の適否を判定するための情報として利用することができる。
　励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長及び出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。蛍光観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。発光色素によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒からの目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合であっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いてもよい。
　なお、本発明においては同一の組織切片に対して免疫染色及び形態観察染色の両方が施されているが、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の発光色素を励起させるための励起光を照射する必要はなく、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察すればよい。
　本発明の発光色素含有粒子によるＨＥＲ２タンパク質検出感度の信頼性については、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法によるＦＩＳＨスコアと相関をとることで検証することができる。ＦＩＳＨ法は、蛍光物質をつけたプローブを目的の遺伝子とハイブリダイゼーションさせて蛍光顕微鏡で観察する実験法であり、ＨＥＲ２タンパク質検出方法として一般的に知られている。本発明の発光色素含有粒子を用いて得られるＨＥＲ２タンパク質に対する発光色素含有粒子数とＦＩＳＨスコアと相関値が高い方が、検出感度に信頼性が高いことを示している。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」又は「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」又は「質量％」を表す。
　＜発光色素含有粒子Ｎｏ．１～４０及び４２の作製＞
　発光色素含有粒子Ｎｏ．１～４０及び４２を、下記表に示す所定の条件に従って作製した。
　表Ｉ及びIIに記載の種類（構造Ｎｏ）の発光色素の５０μｍｏｌを、表Ｉ及びIIに記載の溶解溶媒０．２ｍＬに溶解した溶液に、界面活性剤（表Ｉ及びIIに記載の種類）を０．５ｖｏｌ％になるように水２０ｍＬを加えた。この溶液をホットスターラー上で攪拌しながら、表１及びIIに記載の溶解温度まで昇温させたのちに、樹脂原料（表Ｉ及びIIに記載の種類と量）を加えた。
　この溶液に、添加剤（表Ｉ及びIIに記載の種類と量）を加え、発光色素含有粒子を作製した。得られた分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで９０分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
　遠心分離後の上澄み除去及び超純水への再分散による処理を５回繰り返した。
　洗浄後の樹脂粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ－３１５０」（信越化学工業株式会社製）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。表面がアミノ化された樹脂粒子の濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液にリンカー試薬「ＳＭ（ＰＥＧ）１２」（サーモサイエンティフィック社製、ｃａｔ．Ｎｏ．２２１１２）を最終濃度１０ｍＭとなるよう添加、混合して、撹拌しながら室温で１時間反応させた。反応液を１０，０００Ｇで２０分間の遠心分離にかけ、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された樹脂粒子を得た。
　チオール基を導入したストレプトアビジンは以下のようにして調製した。まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社製）の水溶液４０μＬに、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）の水溶液７０μＬを加え、室温で１時間より反応させることにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ2－Ｓ－ＣＯ－ＣＨ3）を導入した。続いて、ヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（－ＳＨ）を生成させて、ストレプトアビジンにチオール基（－ＳＨ）を導入する処理を完了させた。この溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）に通して脱塩し、チオール基を導入したストレプトアビジンを得た。
　調製した末端に、マレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された、それぞれの発光色素含有樹脂粒子と、調製したチオール基を導入したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有するＰＢＳ中で混合し、１時間反応させることで、樹脂粒子にＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンを結合させた。この反応液に１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去し、ストレプトアビジン修飾発光色素含有樹脂粒子である、発光色素含有粒子Ｎｏ．１～４０及び４２を得た。
　以上の製造条件の詳細を、以下の表Ｉ及びIIに示す。
　＜発光色素含有粒子Ｎｏ．４１の作製＞
　発光色素Ｎｏ．１５と３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
　得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍＬを、９９％エタノール４８ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．６ｍＬ、超純水２ｍＬ、及び２８質量％のアンモニア水２．０ｍＬと５℃で３時間混合した。
　上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をする洗浄工程を３回繰り返し、発光色素含有粒子を得た。
　得られた発光色素含有粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有してＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、スクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ドデカエチレングリコール］エステル）を混合し、５℃で１時間反応させた。この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基がついた発光色素含有粒子Ｎｏ．４１を得た。
　上記作製した発光色素含有粒子１～４２について、以下の評価を行った。
　（粒径の測定）
　上記作製した各発光色素含有粒子の体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０を津製作所製の粒度分布測定装置ＬＡ－９５０Ｖ２型を用いて測定した。
　（界面活性剤量の測定方法）
　発光色素含有粒子中の界面活性剤量の含有量は、前述したＨＰＬＣを用いてアニオン界面活性剤及びノニオン界面活性剤等の界面活性剤の含有量を分析した。
　（発光色素含有粒子の発光強度の測定）
　発光色素含有粒子１０μｇ／ｍＬとなるように水分散液を調製し、日立ハイテクサイエンス社製分光蛍光光度計Ｆ－７１００を用いて、蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度の値を発光強度とした。
　上記発光色素含有粒子の発光強度を製造直後に測定し、さらに、密封した発光色素含有粒子を２５℃の環境下、６か月保存した後、再度測定した。この結果を６か月後の発光強度として、製造直後の発光強度に対するパーセントとして表に示した。
　＜組織染色工程＞
　［免疫組織染色］
　次に、上記で作製した発光色素含有粒子を含む組織染色用染色剤を用いて、ヒト***組織の免疫染色を行った。ここで組織染色用染色剤は、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液等の緩衝液を用いた。染色切片は組織アレイスライド（コスモ・バイオ社製、品番ＣＢ－Ａ７１２）を用いた。
　染色切片はあらかじめパスビジョンＨＥＲ２　ＤＮＡプローブキット（アボット社製）を用いて、各スポット当りのＦＩＳＨスコアを算出した。このＦＩＳＨスコアは、アボットジャパ　ン社製ＨＥＲ２遺伝子キット　パスビジョン＆ｒｅｇ；ＨＥＲ２　ＤＮＡプローブキットに添付されている文書に記載の手順に従って算出した。
　組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と、３０分間反応させた。さらに、上記組織染色用染色剤を用いて、すなわち上記製造したストレプトアビジンを有する色素樹脂粒子と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系緩衝液に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
　［形態染色］
　上記で固定処理した免疫組織化学染色切片に対してＨＥ染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。なお、形態染色としてＨＥ染色を行なっても、後述の耐光性評価に影響は無い。
　［封入］
　上記形態染色を行なったものについて、キシレン系封入剤であるエンテランニュー（メルク社製）を滴下し、カバーガラスを被せ封入した。
　＜組織サンプルの評価＞
　顕微鏡観察及び画像取得時の励起波長条件は、励起５７５～６００ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起４５０～４９０ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起３６５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、励起３４５～３９５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、になるようにした。なお、照射光強度は対物４０倍レンズ装着時の光エネルギー値をアドバンテスト社製パワーメータ８２３０で測定し、４０倍レンズ照射視野面積（約φ４５０μｍ）で割ることで算出している。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないよう任意に設定し画像を取得した。例えば１０００ｍ秒で測定を行なった。なお、取得画像は補正を加えず、輝度値がフルレンジでリニアとなるようにした。
　形態観察用染色像を用いた画像処理により、細胞の形状（細胞膜の位置）を特定し、免疫染色像と重ねあわせて、細胞膜上に発現しているＨＥＲ２タンパク質を標識したストレプトアビジン修飾発光色素含有粒子を表す輝点を発光色素含有粒子数として抽出して計測した。細胞膜上の輝点のうち輝度が所定の値以上のものは、その輝点の輝度を発光色素含有粒子数１粒子あたりの輝度で除して発光色素含有粒子数に換算した。
　単位面積（１００μｍ2）あたりの発光色素含有粒子数の平均値、あるいは、１枚の染色スライドあたり５視野においてそれぞれ１００個ずつ選択した細胞における１細胞あたりの発光色素含有粒子数の平均値を測定した。
　さらに、発光色素の含有量は前述の方法で測定した。粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、発光色素含有粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定した。
　以上、製造条件の詳細を表Ｉ及びIIに示した。及び発光色素含有粒子の評価結果と染色評価の結果を表III及びIVに示した。
　表中に示した界面活性剤の種類は、以下のとおりである。
エマール　２０Ｃ：花王株式会社製ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ポリオキシエチレン繰り返し単位数３）
エマール　Ｅ－２７Ｃ：花王株式会社製ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ポリオキシエチレン繰り返し単位数２）
エマール　２７０Ｊ：花王株式会社製ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ポリオキシエチレン繰り返し単位数２）
ぺレックスＮＢ－Ｌ：日油株式会社製アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム
ぺレックスＴＲ：日油株式会社製アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム
デモールＮＬ：日油株式会社製β‐ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩パーソフトＥＦ：日油株式会社製ポリオキシエチレンアルキルエーテル-硫酸エステルナトリウム塩
パーソフトＳＫ：日油株式会社製アルキル硫酸エステルナトリウム塩
ニッサントラックスＫ－４０：日油株式会社製ポリオキシエチレンオレイルエーテルポリオキシエチレン繰り返し単位数４）
ニッサントラックスＫ－３００：日油株式会社製ポリオキシエチレンラウリルエーテル－硫酸エステルナトリウム塩（ポリオキシエチレン繰り返し単位数３０）
エマルゲン　１５０：花王株式会社製ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ポリオキシエチレン繰り返し単位数５０）
エマルゲン　４０９ＰＶ：花王株式会社製ポリオキシエチレンオレイルエーテルポリオキシエチレン繰り返し単位数９）
エマルゲン　４３０：花王株式会社製ポリオキシエチレンオレイルエーテルポリオキシエチレン繰り返し単位数３０）
ネオぺレックス　Ｇ－１５：花王株式会社製ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
アセタミン　２４：花王株式会社製ココナットアミンアセテート
コータミン　２４Ｐ：花王株式会社製ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド
　表中に示した樹脂原料は、以下のとおりである。
ＭＳ－００２：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＷ－３０：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＸ－００２：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＸ－０３５：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＸ－４５：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＸ－７０８：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＸ－７３０：（メラミン樹脂原料　日本カーバイド工業社製）
ＭＭＡ：メチルメタクリレート（東京化成工業株式会社製）
尿素：（東京化成工業株式会社製）
ＴＥＯＳ：テトラエトキシシラン（東京化成工業株式会社製）
ＡＰＳ：（東京化成工業株式会社製）
　また、以下の略号を用いた。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホアミド
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＰＴＳＡ：ｐ－トルエンスルホン酸
　さらに、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０を、体積基準の粒径Ｄ５０と略記した。 また、界面活性剤の比率は、使用した全界面活性剤のうちの質量％を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表III及び表IVより、本発明の発光色素含有粒子は、小粒径でありながら、高輝度の発
光が可能で、かつ、保存安定性が高いことが分かる。また、単位体積当たりの揮点数が多く、染色性能が優れ信頼性の高い染色方法であることが分かる。
　本発明の発光色素含有粒子は、小粒径でありながら、高輝度の発光が可能で、かつ、保存安定性が高いことから、病理診断用標識剤に適用することができる。

Claims (14)

  1. 　樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、アニオン界面活性剤を含有し、体積基準の累積粒度分布曲線から得られる粒径Ｄ５０が１～１５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする発光色素含有粒子。
  2. 　前記アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することを特徴とする請求項１に記載の発光色素含有粒子。
  3. 　さらに、ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の発光色素含有粒子。
  4. 　前記アニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で及び前記ノニオン界面活性剤を１．０×１０-3～５．０質量％の範囲内で含有することを特徴とする請求項３に記載の発光色素含有粒子。
  5. 　前記アニオン界面活性剤が、炭素数８以上のアルキル基を有することを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  6. 　前記ノニオン界面活性剤が、ポリエチレングリコールの繰り返し単位構造を８個以上有することを特徴とする請求項３から請求項５までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  7. 　前記樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して、前記発光色素を２０～８０ｍｏｌ％の範囲内で含有することを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  8. 　前記発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０．０～６０．０の範囲内であることを特徴とする請求項１から７までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  9. 　前記樹脂が、親水性樹脂であることを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  10. 　前記樹脂が、メラミン樹脂であることを特徴とする請求項１から請求項９までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
  11. 　請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を製造する発光色素含有粒子の製造方法であって、
    前記発光色素と樹脂原料と界面活性剤とを含有する混合物を加熱することにより、前記樹脂原料を重合して前記発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる重合工程を有し、
    前記界面活性剤が、前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする発光色素含有粒子の製造方法。
  12. 　前記界面活性剤が、全界面活性剤のうち１～２０質量％の範囲内で前記アニオン界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１１に記載の発光色素含有粒子の製造方法。
  13. 　前記界面活性剤が、８０～９９質量％の範囲で前記ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１１又は請求項１２に記載の発光色素含有粒子の製造方法。
  14. 　請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を用いることを

    特徴とする病理診断用標識剤。
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