WO2021095824A1 - 大腸癌の診断を補助する方法、キット及びバイオマーカー - Google Patents

大腸癌の診断を補助する方法、キット及びバイオマーカー Download PDF

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WO2021095824A1
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ナナ 川崎
悠葵 太田
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富士フイルム和光純薬株式会社
公立大学法人横浜市立大学
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    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Definitions

  • the present invention relates to methods, kits and biomarkers that assist in the diagnosis of colorectal cancer.
  • the sugar chain is a general term for monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, and N-acetylgalactosamine, and molecules in which these derivatives are linked in a chain by glycosidic bonds.
  • Sugar chains are mainly present on the cell surface in the form of complex sugars bound to proteins and lipids in the living body, and physiology such as cell proliferation, bacterial and virus infection, nerve elongation, inflammation, and immunity Involved in the action.
  • An object of the present invention is to provide a new biomarker, kit, and diagnostic aid method for colorectal cancer.
  • it is an object to provide highly accurate biomarkers for colorectal cancer.
  • Biomarkers for assisting the diagnosis of colorectal cancer including sugar chains selected from the following (1) to (4): (1) At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin. (2) A sugar chain represented by the following formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein. (3) At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antichymotrypsin. (4) A sugar chain represented by the following formula 1 present in complement component 9. (In Equation 1, X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H, and A 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • (2-1) Represented by the above formula 1, which is bound to the 79th asparagine residue or the 186th asparagine residue or the 269th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • Sugar chain (3-1) At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2, which is bound to the 93rd asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antichymotrypsin.
  • (4-1) A sugar chain represented by the above formula 1 which is bound to the 415th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of complement component 9.
  • the sugar chain is at least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2 which is bound to the asparagine residue at position 70 from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antitrypsin, [1] or [ 2] The biomarker.
  • the sugar chain selected from the following (1) to (4) in the sample derived from the test animal is measured, and based on the obtained measurement result, it is determined whether or not the test animal has colorectal cancer. , How to help diagnose colorectal cancer: (1) At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin. (2) A sugar chain represented by the following formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H
  • a 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively.
  • X 4 , X 5 , X 6 and X 7 independently represent Fuc or H
  • a 3 , A 4 and A 5 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • sugar chain is a sugar chain represented by any one of the following (1-1) to (4-1): (1-1) At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2, which is bound to the 70th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antitrypsin. (2-1) Represented by the above formula 1, which is bound to the 79th asparagine residue or the 186th asparagine residue or the 269th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • Sugar chain (3-1) At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2, which is bound to the 93rd asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antichymotrypsin.
  • (4-1) A sugar chain represented by the above formula 1 which is bound to the 415th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of complement component 9.
  • the sugar chain is at least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2 which is bound to the asparagine residue at position 70 from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antitrypsin, [4] or [ 5].
  • [7] The method according to any one of [4] to [6], wherein the sample is whole blood, serum or plasma.
  • a reagent kit for assisting the diagnosis of colorectal cancer which contains a substance having an affinity for a sugar chain selected from the following (1) to (4): (1) At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin. (2) A sugar chain represented by the following formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein. (3) At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antichymotrypsin. (4) A sugar chain represented by the following formula 1 present in complement component 9. (In Equation 1, X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H, and A 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • X 4 , X 5 , X 6 and X 7 independently represent Fuc or H, and A 3 , A 4 and A 5 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • (2-1) Represented by the above formula 1, which is bound to the 79th asparagine residue or the 186th asparagine residue or the 269th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • Sugar chain (3-1) At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2, which is bound to the 93rd asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antichymotrypsin.
  • (4-1) A sugar chain represented by the above formula 1 which is bound to the 415th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of complement component 9.
  • the diagnosis of colorectal cancer can be assisted with high accuracy.
  • the biomarker for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention contains a sugar chain selected from the following (1) to (4).
  • At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin hereinafter, may be abbreviated as the biomarker (1) of the present invention
  • a sugar chain represented by the following formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein hereinafter, may be abbreviated as the biomarker (2) of the present invention),.
  • At least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha-1 antitrypsin (hereinafter, may be abbreviated as the biomarker (3) of the present invention),.
  • a sugar chain represented by the following formula 1 existing in complement component 9 (hereinafter, may be abbreviated as the biomarker (4) of the present invention).
  • the biomarker of the present invention may contain any one of the biomarkers (1) to (4) of the present invention alone, or may contain a plurality of types. The biomarkers (1) to (4) of the present invention will be described below.
  • the biomarker (1) of the present invention contains at least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin.
  • X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H
  • a 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively.
  • X 4 , X 5 , X 6 and X 7 independently represent Fuc or H
  • a 3 , A 4 and A 5 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • Neu5Ac represents N-acetylneuraminic acid
  • Gal represents galactose
  • GlcNAc represents N-acetylglucosamine
  • Man represents mannose
  • Fuc represents fucose
  • H represents a hydrogen atom.
  • X 1 is H
  • X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 or / and X 7 is H
  • X 1- GlcNAc represents GlcNAc. ..
  • a 1- Gal- represents Gal-.
  • those having only the sugar chain represented by the formula 1 may be represented by the formula. It may have only the sugar chain represented by 2 or both the sugar chain represented by the formula 1 and the sugar chain represented by the formula 2. Further, it may have only a single sugar chain contained in the formula 1, a plurality of sugar chains contained in the formula 1, or a single sugar chain contained in the formula 2. It may have a plurality of sugar chains contained in 2.
  • the alpha-1 antitrypsin according to the biomarker (1) of the present invention is a glycoprotein consisting of 394 amino acids, which is an acute phase reactant that is mainly produced in hepatocytes and increases in blood during various inflammations. It is one. It is also known to function as the most important protease inhibitor in blood.
  • the amino acid sequence of the alpha-1 antitrypsin is registered in a database such as Uniprot (accession number: P01009), for example.
  • the alpha-1 antitrypsin according to the biomarker (1) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants that can occur in vivo.
  • the alpha 1 antitrypsin 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted, or / and added, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
  • the amino acid of the alpha 1 antitrypsin which is the binding site between at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (1) of the present invention and the alpha 1 antitrypsin. It is preferable that the 70th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the sequence is conserved.
  • At least one sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (1) of the present invention is the 70th amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antitrypsin (terminal N-acetylglucosamine). It is preferably bound to (asparagine residue) (N-glycosidic bond).
  • the sugar chains represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (1) of the present invention will be described below.
  • the combinations of A 1 and A 2 in the above formula 1 are preferably the combinations shown in Table 2 below, and the combinations 1, 2 and 4 are more preferable.
  • X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 in the above formula 1 are preferably those shown in Table 3 below, and the combinations 16, 17, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32 and 34 are more preferred.
  • the sugar chain represented by the above formula 1 is preferably represented by the following formula 1', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 1', X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above)
  • Equation 1'', X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above (however, any one of X 1 , X 2 and X 3 is Fuc, and the remaining two are H, respectively. , and the total number of Neu5Ac in a 1 and a 2 is 2)) (In Equation 1''', A 1 and A 2 are the same as above (however, the total number of Neu5Ac in A 1 and A 2 is 2)).
  • Fuc is preferably bound to GlcNAc by, for example, ⁇ 1-6 glycosidic bond.
  • a 1 and / and A 2 are Neu5Ac, it is preferable that Neu5Ac binds to Gal by, for example, ⁇ 2-3 glycosidic bond or ⁇ 2-6 glycoside bond.
  • a 1 or A 2 is Neu5Ac-Neu5Ac, it is preferable that Neu5Ac binds to Neu5Ac by, for example, ⁇ 2-8 glycosidic bond.
  • Specific examples and combinations of X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 in the formulas 1', 1'and 1'' are the same as those in the above formula 1.
  • a 3, A 4 and A 5 in the above formula 2 is preferably a combination shown in Table 5 below.
  • the sugar chain represented by the above formula 2 is preferably represented by the following formula 2', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 2', X 4 , X 5 , X 6 and X 7 , and A 3 , A 4 and A 5 are the same as above)
  • the above formula 2' is preferably represented by the following formula 2 ′′ or formula 2 ′ ′′.
  • X 4 , X 5 , X 6 and X 7 , and A 3 , A 4 and A 5 are the same as above (provided that any of X 4 , X 5 , X 6 and X 7 ).
  • one is Fuc, a remaining 3 turn, each H, the total number of Neu5Ac in a 3, a 4 and a 5 is 2)
  • the Fuc may bind to GlcNAc by, for example, ⁇ 1-6 glycosidic bond. preferable.
  • a 3 , A 4 or / and A 5 are Neu5Ac, it is preferred that Neu5Ac binds Gal, for example, by an ⁇ 2-3 glycosidic bond or an ⁇ 2-6 glycosidic bond.
  • a 3, A 4 or A 5 is Neu5Ac-Neu5Ac, Neu5Ac, for example, preferably combined with Neu5Ac by ⁇ 2-8 glycosidic bond.
  • the biomarker (1) of the present invention that is, the formula present in alpha 1 antitrypsin (i) containing at least one sugar chain represented by formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin. It is a part of at least one sugar chain itself represented by 1 or 2, alpha 1 antitrypsin to which at least one sugar chain represented by formula (ii) or formula 1 or 2 is bound, and (iii) alpha 1 antitrypsin. , Peptide fragment to which at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 is bound, and the like, and (ii) or (iii) is preferable.
  • the peptide fragment is the 70th amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antitrypsin, which is a binding site between at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 and alpha 1 antitrypsin.
  • Specific examples thereof include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting alpha 1 antitrypsin to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically, 2 to 50. Examples thereof include those consisting of individual amino acid residues, and those represented by SEQ ID NO: 1 are preferable.
  • Biomarker of the present invention (2) contains at least one sugar chain represented by the following formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H
  • a 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively.
  • the biomarker (2) of the present invention may have only a single sugar chain contained in the above formula 1 or may have a plurality of sugar chains contained in the formula 1.
  • the leucine-rich alpha 2 glycoprotein according to the biomarker (2) of the present invention is a protein contained in blood and is characterized by having a leucine-rich repeat structure. It has been reported to be involved in various diseases such as rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease.
  • the amino acid sequence of the leucine-rich alpha 2 glycoprotein is registered in a database such as Uniprot (accession number: P02750), for example.
  • the leucine-rich alpha 2 glycoprotein according to the biomarker (2) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants that can occur in vivo.
  • the leucine-rich alpha 2 glycoprotein 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or / and added, which is caused by polymorphism, mutation, or the like. is there.
  • the amino acid sequence of the leucine-rich alpha 2 glycoprotein which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 1 in the biomarker (2) of the present invention and the leucine-rich alpha 2 glycoprotein. It is preferable that the 79th amino acid residue (asparagin residue), the 186th amino acid residue (asparagin residue), or the 269th amino acid residue (asparagin residue) is conserved from the N-terminal.
  • the sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 1 in the biomarker (2) of the present invention is the 79th amino acid residue (asparagin residue) from the N terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein. ), which is bound to the 186th amino acid residue (asparagin residue) or the 269th amino acid residue (asparagin residue) (N-glycoside bond) is preferable.
  • the sugar chain represented by the formula 1 in the biomarker (2) of the present invention will be described below.
  • the combinations of X 1 , X 2 and X 3 in the above formula 1 are preferably the combinations shown in the above table 1.
  • the sugar chain represented by the above formula 1 is preferably represented by the following formula 1', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 1', X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above)
  • formula 1' is preferably represented by the following formula 1 ′′, formula 1 ′ ′′ or formula 1 ′′ ′′.
  • formula 1 ′′ formula 1 ′ ′′ or formula 1 ′′ ′′.
  • X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above (however, any one of X 1 , X 2 and X 3 is Fuc, and the remaining two are H, respectively. , and the total number of Neu5Ac in a 1 and a 2 is 2)
  • the biomarker (2) of the present invention that is, the sugar chain represented by the formula 1 present in the leucine-rich alpha 2 glycoprotein
  • the biomarker is (i) the formula 1 present in the leucine-rich alpha 2 glycoprotein. It is a part of the sugar chain itself represented by (iii) leucine-rich alpha 2 glycoprotein to which the sugar chain represented by formula 1 is bound, and (iii) leucine-rich alpha 2 glycoprotein, and is represented by formula 1. Examples thereof include a peptide fragment to which a sugar chain is bound, and (ii) or (iii) is preferable.
  • the peptide fragment is the 70th amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 1 and leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • Asparagine residue any fragment having at least the 186th amino acid residue (asparagine residue) or the 269th amino acid residue (asparagine residue).
  • Specific examples thereof include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting alpha 1 antitrypsin to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically, 2 to 50.
  • Examples thereof include those consisting of individual amino acid residues, and those represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 are preferable.
  • the biomarker (3) of the present invention contains at least one sugar chain represented by the following formula 1 or 2 present in alpha-1 antitrypsin.
  • X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H
  • a 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively.
  • X 4 , X 5 , X 6 and X 7 independently represent Fuc or H
  • a 3 , A 4 and A 5 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • those having only the sugar chain represented by the formula 1 may be represented by the formula. It may have only the sugar chain represented by 2 or both the sugar chain represented by the formula 1 and the sugar chain represented by the formula 2. Further, it may have only a single sugar chain contained in the formula 1, a plurality of sugar chains contained in the formula 1, or a single sugar chain contained in the formula 2. It may have a plurality of sugar chains contained in 2.
  • the alpha-1 antichymotrypsin according to the biomarker (3) of the present invention is a glycoprotein consisting of 433 amino acids and is one of the serine protease inhibitor family present in serum. It is also known to function as the most important protease inhibitor in blood. Moreover, the amino acid sequence of the above-mentioned alpha 1 antichymotrypsin is registered in a database such as Uniprot (accession number: P01011), for example.
  • the alpha-1 antitrypsin according to the biomarker (3) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants that can occur in vivo.
  • 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, or / or added to the alpha 1 antichymotrypsin, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
  • the alpha 1 anti-kimo which is a binding site between at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (3) of the present invention and the alpha 1 anti-chimotripsi.
  • the 93rd amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of trypsi is conserved.
  • At least one sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (3) of the present invention is the 93rd amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antichymotrypsis. Those bound to a group (asparagin residue) (N-glycosidic bond) are preferable.
  • the sugar chains represented by the formula 1 or 2 in the biomarker (3) of the present invention will be described below.
  • the combinations of X 1 , X 2 and X 3 in the above formula 1 are preferably the combinations shown in Table 1 above, and the combinations 4 to 7 are more preferable.
  • the combinations of A 1 and A 2 in the above formula 1 are preferably the combinations shown in the above table 2, and the combinations 1, 2 and 4 are more preferable.
  • X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 in the above formula 1 are preferably those shown in Table 3 above, and the combinations 16, 17, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32 and 34 are more preferred.
  • the sugar chain represented by the above formula 1 is preferably represented by the following formula 1', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 1', X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above)
  • formula 1' is preferably represented by the following formula 1 "or formula 1'".
  • X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above (however, any one of X 1 , X 2 and X 3 is Fuc, and the remaining two are H, respectively. , and the total number of Neu5Ac in a 1 and a 2 is 2)
  • Fuc is preferably bound to GlcNAc by, for example, ⁇ 1-6 glycosidic bond.
  • a 1 and / and A 2 are Neu5Ac, it is preferable that Neu5Ac binds to Gal by, for example, ⁇ 2-3 glycosidic bond or ⁇ 2-6 glycoside bond.
  • a 1 or A 2 is Neu5Ac-Neu5Ac, it is preferable that Neu5Ac binds to Neu5Ac by, for example, ⁇ 2-8 glycosidic bond.
  • Specific examples and combinations of X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 in the formulas 1', 1'and 1'' are the same as those in the above formula 1.
  • the sugar chain represented by the above formula 2 is preferably represented by the following formula 2', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 2', X 4 , X 5 , X 6 and X 7 , and A 3 , A 4 and A 5 are the same as above)
  • the above formula 2' is preferably represented by the following formula 2 ′′ or formula 2 ′ ′′. (Wherein 2 ', X 4, X 5, X 6 and X 7, and A 3, A 4 and A 5, as defined above (however, any one of X 4, X 5, X 6 and X 7 One is Fuc, a remaining 3 turn, each H, the total number of Neu5Ac in a 3, a 4 and a 5 is 2))
  • the Fuc may bind to GlcNAc by, for example, ⁇ 1-6 glycosidic bond. preferable.
  • a 3 , A 4 or A 5 is Neu5Ac
  • a 1 or A 2 is Neu5Ac-Neu5Ac
  • Neu5Ac binds to Neu5Ac by, for example, ⁇ 2-8 glycosidic bond.
  • Specific examples of the formula 2 ', wherein 2' X 4, X 5, X 6 and X 7 in ') and (2''', and A 3, A 4 and A 5, the combination is the same as the above formula 1 ..
  • the biomarker (3) of the present invention that is, the formula containing at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 present in the alpha 1 antichymotrypsin, (i) the formula present in the alpha 1 antichymotrypsin. It is a part of at least one sugar chain itself represented by 1 or 2, alpha 1 anti-chymotrypsin to which at least one sugar chain represented by formula (ii) or formula 1 or 2 is bound, and (iii) alpha 1 anti-chymotrypsin. , Peptide fragment to which at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 is bound, and the like, (ii) or (iii) is preferable.
  • the peptide fragment is the 93rd amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 anti-chymotrypsin, which is a binding site between at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 and alpha 1 anti-chymotrypsin.
  • Specific examples thereof include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting alpha-1 antitrypsin to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically, 2 to 50.
  • Examples thereof include those consisting of individual amino acid residues, and those represented by SEQ ID NO: 5 are preferable.
  • the biomarker (4) of the present invention contains a sugar chain represented by the following formula 1 present in the complement component 9.
  • X 1 , X 2 and X 3 independently represent Fuc or H
  • a 1 and A 2 independently represent Neu 5Ac, Neu 5Ac-Neu 5 Ac or H, respectively).
  • the complement component 9 according to the biomarker (4) of the present invention is one of the proteins that assist the immune reaction (antigen-antibody reaction). Known physiological functions include opsonization of antigens, destruction of bacteria by a membrane attack complex, and activation of phagocytic cells such as macrophages. Further, the amino acid sequence of the complement component 9 is registered in a database such as Uniprot (accession number: P02748), for example.
  • the complement component 9 according to the biomarker (4) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants and the like that can occur in vivo.
  • 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, or / or added to the complement component 9, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
  • the complement component 9 which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 1 in the biomarker (4) of the present invention and the complement component 9.
  • the sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 1 in the biomarker (4) of the present invention is located at the 415th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of complement component 9. Those that are bound (N-glycoside bond) are preferable.
  • the sugar chains represented by the formula 1 in the biomarker (4) of the present invention will be described below.
  • the combinations of A 1 and A 2 in the above formula 1 are preferably the combinations shown in the above table 2, and the combinations 1, 2 and 4 are more preferable.
  • the sugar chain represented by the above formula 1 is preferably represented by the following formula 1', depending on the binding mode between each monosaccharide such as GlcNAc, Man, Gal, Neu5Ac, and Fuc. (In Equation 1', X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 are the same as above)
  • Equation 1''' A 1 and A 2 are the same as above (however, the total number of Neu5Ac in A 1 and A 2 is 2)).
  • X 1 , X 2 or X 3 in the above formula 1' is Fuc
  • Fuc binds to GlcNAc by, for example, ⁇ 1-6 glycosidic bond.
  • a 1 and / and A 2 in the above formulas 1'and 1''' are Neu5Ac
  • a 1 or A 2 is Neu5Ac-Neu5Ac
  • Neu5Ac binds to Neu5Ac by, for example, ⁇ 2-8 glycosidic bond.
  • Specific examples and combinations of X 1 , X 2 and X 3 , and A 1 and A 2 in the formulas 1'and 1''' are the same as those in the above formula 1.
  • the biomarker (4) of the present invention that is, the sugar chain represented by the formula 1 present in the complement component 9, is represented by the formula 1 present in (i) complement component 9.
  • the sugar chain itself, a complement component 9 to which the sugar chain represented by the formula 1 is bound, a peptide fragment to which the sugar chain represented by the formula 1 is bound, etc., which is a part of the complement component 9 (iii). (Ii) or (iii) is preferable.
  • the peptide fragment is the 415th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of the complement component 9, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 1 and the complement component 9. Any fragment having at least.
  • Specific examples thereof include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting complement component 9 to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically, 2 to 50. Examples thereof include those consisting of individual amino acid residues, and those represented by SEQ ID NO: 6 are preferable.
  • the biomarkers of the present invention include (i) those containing at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin, or (ii) existing in leucine-rich alpha 2 glycoprotein. Those containing a sugar chain represented by 1 are preferable, those containing at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 present in (i) alpha 1 antitrypsin are more preferable, and (iii) alpha 1 anti Amino acid sequence of trypsin At least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 attached to the 70th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal is particularly preferable.
  • Colorectal cancer according to the present invention is a cancer (malignant tumor) originating from the large intestine.
  • Colorectal cancer according to the present invention includes, for example, colon cancer, rectal cancer and the like.
  • the method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention uses sugar chains selected from the following (1) to (4) in a sample derived from a test animal. Measurement (hereinafter, may be abbreviated as the measurement step according to the present invention), and determining whether or not the test animal has colorectal cancer based on the obtained measurement results (hereinafter, the present invention). It may be abbreviated as such a determination step).
  • At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2 present in alpha 1 antitrypsin
  • a sugar chain represented by the above formula 1 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • At least one sugar chain represented by the above formula 1 or 2 present in alpha-1 antitrypsin
  • a sugar chain represented by the above formula 1 present in complement component 9 present in complement component 9 (biomarker (4) of the present invention).
  • the auxiliary method of the present invention may be carried out using any one of the biomarkers (1) to (4) of the present invention alone, or may be carried out using a plurality of types.
  • test animal according to the present invention examples include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, pigs, rabbits, and chimpanzees. Humans, monkeys, mice, or rats are preferable, and humans are more preferable.
  • sample according to the present invention may be derived from the above-mentioned test animal, and may be, for example, serum, plasma, whole blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid, tissue fluid, sweat, tears, sheep's water, bone marrow fluid, chest water, etc.
  • biological samples such as ascites, indirect fluid, aqueous humor, and vitreous body fluid
  • blood-derived samples such as serum, plasma, and whole blood are preferable, and serum is more preferable.
  • the method for obtaining (collecting) the sample according to the present invention from the test animal is not particularly limited, and is performed, for example, by obtaining (collecting) the sample from the test animal based on a method known per se. However, if necessary, separation, concentration, purification, and the like may be performed according to a method known per se.
  • the sample may be a sample immediately after being obtained (collected) from the test animal, or may be a preserved sample.
  • any method usually used in this field may be used.
  • the measuring step according to the present invention is performed by measuring a sugar chain selected from the following (1) to (4).
  • any one of the biomarkers (1) to (4) of the present invention is measured alone. It may be done by this, or it may be done by measuring a plurality of types.
  • the measurement of the sugar chain selected from the above (1) to (4) in the measurement step according to the present invention is to measure one selected from the biomarkers (1) to (4) of the present invention.
  • (Iii), (iii) or (iii) is preferable, and examples thereof include measurement of the amount of a peptide fragment to which a sugar chain is bound, which is a part of the core protein in the biomarker of the present invention.
  • the core protein in the biomarker of the present invention means a portion other than the sugar chain in the biomarker of the present invention
  • the biomarker (1) of the present invention means alpha 1 antitrypsin of the present invention.
  • the biomarker (2) means leucine-rich alpha 2 glycoprotein
  • the biomarker (3) of the present invention means alpha 1 antichymotrypsin
  • the biomarker (4) of the present invention Means the complement component 9.
  • the “amount” may be any of an absolute value such as volume and mass or a relative value such as a value calculated from ionic strength, absorbance, fluorescence intensity, turbidity, peak area and the like.
  • any method usually used in this field may be used.
  • (A) having an affinity for the biomarker of the present invention examples thereof include a method using a substance (for example, antibody, lectin, etc.), (B) a method using mass spectrometry, and the like, and (A) is preferable.
  • a substance for example, antibody, lectin, etc.
  • B a method using mass spectrometry, and the like, and (A) is preferable.
  • the above (A) and (B) will be specifically described below.
  • the substance having an affinity for the biomarker of the present invention is an antibody that specifically binds to a core protein (or peptide fragment) in the biomarker of the present invention, or a sugar chain in the biomarker of the present invention.
  • examples thereof include lectins and antibodies that bind to.
  • an immunological measurement method is used, and when a substance other than the antibody (for example, lectin) or a substance other than the antibody and the antibody are used, immunology is used.
  • the biomarker of the present invention may be measured by a method according to a specific measurement method. Examples of the principle of these measurement methods include a sandwich method and a competitive method, and the measurement system may be a homogeneous measurement system or a heterogeneous measurement system.
  • the substance having an affinity for the biomarker of the present invention As a method of using the substance having an affinity for the biomarker of the present invention, specifically, for example, the substance having an affinity for the biomarker of the present invention is brought into contact with the biomarker of the present invention. Therefore, it may be carried out by forming a complex of a substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the biomarker of the present invention, and measuring the amount of the biomarker of the present invention.
  • Specific examples of the method using a substance having an affinity for the biomarker of the present invention include an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method), an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA method), and a radioimmunoassay method.
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • radioimmunoassay method radioimmunoassay method
  • RIA method fluorescence immunoassay (FIA method), chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method), immunoturbidimetric method such as latex aggregation turbidimetric method, immunoassay fistula method, immunochromatography method, western blot method, Luminescent Oxygen Channel Immunoassay (LOCI method), Liquid-phase Binding Assay-ElectroKinetic Analite Transport Assay (LBA-EATA method), Lectin electrophoresis method, etc. Capillary electrophoresis method, Lectin electrophoresis method, etc. , EIA method, RIA method, FIA method, CLEIA method, LBA-EATA method, lectin electrophoresis and other capillary electrophoresis methods are more preferable.
  • the antibody that specifically binds to the core protein (or peptide fragment) in the biomarker of the present invention include, for example, the biomarker (1) of the present invention being an anti-alpha 1 antitrypsin antibody.
  • the biomarker (2) of the present invention may be an anti-leucine-rich alpha 2 glycoprotein antibody
  • the biomarker (3) of the present invention may be an anti-alpha 1 anti-chymotrypsin antibody
  • the biomarker (4) of the present invention for example, an anti-complement component 9 antibody and the like can be mentioned.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and these may be used alone or in combination.
  • the antibody may be an antibody fragment such as Fab, F (ab'2), Fv, sFv, or a synthetic antibody such as diabody, triabody, or tetrabody.
  • a commercially available antibody may be used, or an antibody prepared according to a method known per se may be used.
  • the above antibody is prepared according to a method known per se, for example, it may be carried out according to the method described in "Immunoassay" (edited by Biochemical Measurement Study Group, Kodansha, 2014).
  • the said antibody may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance include horseradish peroxidase (HRP), bovine small intestinal alkaline phosphatase, enzymes such as ⁇ -galactosidase, 99 m Tc, 131 I, 125 I, 14 C, 3 H, 32 P, Radioisotopes such as 35 S, fluorescent substances such as fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 4-methylumbelliferone, rhodamine or derivatives thereof, luminescent substances such as luciferin, luminol, ruthenium complex, phenol, naphthol
  • a spin labeling agent typified by substances having absorption in the ultraviolet such as anthracein or derivatives thereof, and compounds having an oxyl group such as 4-amino-2,2,6, -tetramethylpiperidine-1-oxyl Examples thereof include substances having the above-mentioned properties, dyes such as HiLite dyes, Alexa, Alex
  • Neu5Ac such as Aleuria Aurantia Lectin (AAL) and Rotus Terragloonobus Lectin (LTL) that bind to the Fuc (fucose) of the sugar chain represented by the above formula 1
  • Elderbury Balk Lectin EBL
  • Macchia Amurensis Lectin MAA
  • acetylneuraminic acid AAL, LTL, etc.
  • EBL that binds to Neu5Ac (N-acetylneuraminic acid)
  • AAL and LTL that bind to Fuc (fucose) of the sugar chain represented by the above formula 1.
  • MAA and the like can be mentioned.
  • the lectin may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance is as described in the antibody that specifically binds to the core protein (or peptide fragment) in the biomarker of the present invention. Yes, the same applies to specific examples. Further, as a method for binding the above-mentioned labeling substance to the lectin, a method known per se may be used.
  • the antibody that specifically binds to the sugar chain in the biomarker of the present invention are as follows. That is, in the case of the biomarker (1) of the present invention, an antibody that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 1, an antibody that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 2, and the like can be mentioned. Be done. In the case of the biomarker (2) of the present invention, an antibody or the like that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 1 can be mentioned. Examples of the biomarker (3) of the present invention include an antibody that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 1, an antibody that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 2, and the like. In the case of the biomarker (4) of the present invention, an antibody or the like that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 1 can be mentioned.
  • the antibody may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance is as described for the antibody that specifically binds to the protein (or peptide fragment) in the biomarker of the present invention. , Specific examples, etc. are the same. Further, as a method for binding the above-mentioned labeling substance to the lectin, a method known per se may be used.
  • the method for measuring the amount of the complex of the substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the biomarker of the present invention may be any method as long as it can measure the amount of the complex.
  • a method for detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the biomarker of the present invention, a substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the present invention examples thereof include a method of utilizing the property derived from the complex with the biomarker of the present invention, and a method of detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the biomarker of the present invention is preferable.
  • the method for detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the biomarker of the present invention include, for example, a substance having an affinity for the biomarker of the present invention. It may be done by detecting a signal derived from a labeling substance bound to the substance by a method known per se.
  • the labeling substance is an enzyme
  • a conventional method of immunoassay for example, "enzyme immunoassay” (protein nucleic acid enzyme separate volume No.
  • the measurement may be performed according to the method described in 63, Kyoritsu Shuppan, 1987), etc., and when the labeling substance is a radioactive substance, for example, according to the conventional method performed by RIA, the radiation emitted by the radioactive substance is emitted. Measurements may be performed by appropriately selecting and using measuring instruments such as a immersion type GM counter, a liquid scintillation counter, a well type scintillation counter, and an HPLC counter according to the type and strength (for example, medical chemistry experiment course, No. 1).
  • measuring instruments such as a immersion type GM counter, a liquid scintillation counter, a well type scintillation counter, and an HPLC counter according to the type and strength (for example, medical chemistry experiment course, No. 1).
  • the labeling substance is a fluorescent substance
  • a conventional method used in FIA using a measuring device such as a fluorometer for example, "Illustrated fluorescent antibody, by Akira Kawao, 1st edition, Soft Science Co., Ltd.
  • the measurement may be performed according to the method described in "1983" or the like
  • a conventional method using a measuring device such as a photo counter, for example, "enzyme immunoassay” (protein nucleic acid enzyme separate volume No.
  • the measurement may be performed by a conventional method using a measuring device such as a spectrophotometer, and when the labeling substance has spin properties, an electron spin resonance device may be used.
  • a measuring device such as a spectrophotometer
  • an electron spin resonance device may be used.
  • Specific examples of the method for utilizing the property derived from the complex of the substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the biomarker of the present invention include a homogenia swimnoassay such as a surface plasmon resonance method. Examples include methods such as systems. The specific method of the above method may be performed according to a method known per se.
  • target core protein or target peptide fragment
  • target sugar chain the sugar chain in the biomarker of the present invention
  • leucine-rich alpha 2 glycoprotein means “target core protein (or target peptide fragment)", and the sugar chain represented by the formula 1 means “target sugar chain”. ..
  • alpha 1 antichymotrypsin is a “target core protein (or target peptide fragment)”, and at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 is a “target sugar chain”. means.
  • the complement component 9 means “target core protein (or target peptide fragment)"
  • the sugar chain represented by the formula 1 means “target sugar chain”.
  • Step 1 A step of separating a target core protein (biomarker of the present invention) to which a target sugar chain is bound from a sample.
  • Step 2 A step of measuring the amount of the target core protein to which the target sugar chain separated in the step 1 is bound.
  • the step 1 may be any method as long as it can separate the target core protein to which the target sugar chain is bound from the sample. Specifically, for example, with the target core protein to which the target sugar chain present in the sample is bound. A method of separating from other components can be mentioned. As such a method, specifically, for example, a substance having two or more kinds of affinity, that is, a substance that specifically binds to a target sugar chain and a substance that specifically binds to a target core protein are used. Then, a complex (a substance that specifically binds to the target core protein-a substance that specifically binds to the biomarker target sugar chain of the present invention) with a substance having an affinity with the target core protein to which the target sugar chain is bound is formed.
  • a substance having two or more kinds of affinity that is, a substance that specifically binds to a target sugar chain and a substance that specifically binds to a target core protein are used.
  • a complex a substance that specifically binds to the target core protein-a substance that
  • the target core protein to which the target sugar chain is bound may be separated by a method known per se. Further, for example, by utilizing the interaction between a substance that specifically binds to a target sugar chain (for example, a protein that specifically binds to a sugar chain in the above-mentioned biomarker of the present invention) and the biomarker of the present invention, Separate the component that interacts with the target sugar chain such as the biomarker of the present invention from other components, and further separate the biomarker of the present invention from other components by using a substance that specifically binds to the target core protein.
  • a substance that specifically binds to a target sugar chain for example, a protein that specifically binds to a sugar chain in the above-mentioned biomarker of the present invention
  • the biomarker of the present invention Separate the component that interacts with the target sugar chain such as the biomarker of the present invention from other components, and further separate the biomarker of the present invention from other components by using a substance that specifically binds
  • a method for example, a substance that specifically binds to a target core protein is used to separate the biomarker of the present invention from other components, and a substance that specifically binds to a target sugar chain (for example, the above-mentioned substance of the present invention).
  • a substance that specifically binds to a target sugar chain for example, the above-mentioned substance of the present invention.
  • a component that interacts with a target sugar chain such as the biomarker of the present invention and another component are separated.
  • the target core protein (biomarker of the present invention) to which the target sugar chain is bound may be separated from the sample.
  • the biomarker of the present invention can be separated by, for example, a lectin electrophoresis method or a lectin column method.
  • a substance having an affinity labeled with a labeling substance is used, the separation of the target protein to which the target sugar chain is bound is carried out between the substance having the affinity labeled with the labeling substance and the biomarker of the present invention. It may be paraphrased as separation of the complex, in which case, the affinity labeled with the complex and / or the free labeling substance of the substance having the affinity labeled with the labeling substance and the component other than the biomarker of the present invention. It is sufficient to separate from the substance having.
  • the step 2 may be any method as long as it can measure the target core protein to which the target sugar chain separated in the step 1 is bound, and specific examples and the like are as described above.
  • the target peptide fragment to which the target sugar chain is bound is separated in step 1, and the target sugar is separated in step 2.
  • the target peptide fragment to which the chain is bound may be measured.
  • the fragmentation treatment may be carried out, for example, by adding a protease such as trypsin, lysylendopeptidase, or AspN to the sample before performing step 1, and binds to the target sugar chain in step 1.
  • a complex of a substance that binds to a target peptide fragment and a substance that has an affinity for the target peptide fragment to which the target sugar chain is bound (a substance that specifically binds to the target peptide fragment-the substance of the present invention).
  • a substance that specifically binds to the biomarker target sugar chain may be formed, the complex may be separated as described above, and then the amount of the complex may be measured.
  • the fragmentation may be followed by concentration by a column such as a lectin column.
  • concentration may be carried out according to a method known per se, and a column such as a commercially available lectin column may be used.
  • the target sugar chain may be separated from the target protein to which the target sugar chain separated in step 1 is bound, and only the target sugar chain may be measured. Specifically, for example, after separating the target sugar chain by treating the target protein to which the target sugar chain separated in step 1 is bound with glycanase, hydrazine, or the like, only the amount of the sugar chain is described above. It may be measured as follows.
  • the specific method in the method using the above-mentioned mass spectrometry may be a method known per se or a method described in WO2014 / 038524, WO2017 / 19588, WO2018 / 034346 and the like.
  • the total protein may be extracted from the sample in advance, and specifically, for example, the sample may be prepared with acetone, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, an aqueous solution of hydrochloric acid or the like. It may be done by adding a solvent to precipitate all the proteins.
  • the total protein may be fragmented before or after the total protein is extracted from the sample.
  • the fragmentation is followed by concentration by a column such as a lectin column. May be good.
  • concentration are as described above.
  • the formula 1 is present in (i) at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 or (ii) leucine-rich alpha 2 glycoprotein present in the alpha 1 antitrypsin. It is preferable to measure the sugar chain to be produced, (i) it is more preferable to measure at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 present in the alpha 1 antitrypsin, and (i) the alpha 1 antitrypsin. It is more preferable to measure at least one sugar chain represented by the formula 1 or 2 bound to the 70th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of.
  • a method using a substance having an affinity for the biomarker of the present invention is preferable, and an ELISA method, an EIA method, an RIA method, an FIA method, a CLEIA method, a latex aggregation turbidimetric method, etc.
  • Capillary electrophoresis methods such as method, EIA method, RIA method, FIA method, CLEIA method, LBA-EATA method, and lectin electrophoresis method are more preferable.
  • a substance having an affinity for the biomarker of the present invention is brought into contact with the biomarker of the present invention to separate the biomarker of the present invention, and a substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the present invention.
  • a method of forming a complex with the biomarker of the present invention and measuring the amount of the complex is more preferable, and a substance having an affinity for the biomarker of the present invention is brought into contact with the biomarker of the present invention.
  • a method of forming a complex of a substance having an affinity for the biomarker of the present invention and the biomarker of the present invention and detecting a signal derived from the labeling substance bound to the complex is further preferable.
  • the present invention utilizes the interaction between a substance that specifically binds to a target sugar chain (for example, a lectin that specifically binds to a sugar chain in the above-mentioned biomarker of the present invention) and the biomarker of the present invention.
  • the biomarker of the present invention and other components are separated by separating the component that interacts with the target sugar chain such as the biomarker of the present invention from other components, and further separating the biomarker of the present invention from other components by using a substance that specifically binds to the target core protein. It is more preferable to measure the amount of the biomarker of the invention, Utilizing the interaction between a substance that specifically binds to a target sugar chain and the biomarker of the present invention, a component that interacts with the target sugar chain such as the biomarker of the present invention and another component are separated, and further targeted.
  • a method of detecting a signal derived from a substance is more preferable.
  • the determination step according to the present invention is a step for determining whether or not the test animal has colorectal cancer based on the measurement results obtained by the measurement step according to the present invention.
  • the determination step according to the present invention may be abbreviated as, for example, a value obtained by a measurement step according to the present invention using a sample derived from a test animal (hereinafter, abbreviated as a value derived from a test animal). ) And a preset reference value (cutoff value, etc.). That is, (i) when the value derived from the test animal is equal to or higher than a preset reference value (cutoff value, etc.), "the test animal may have colorectal cancer, or the test animal has a large intestine.
  • the above reference values are the measured values obtained by the measurement step according to the present invention using a sample derived from an animal suffering from colorectal cancer and the present invention using a sample derived from a healthy animal. It can be determined based on statistical analysis such as ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis using the value obtained by the measurement step according to the above (hereinafter, may be abbreviated as a value derived from a healthy animal).
  • the sensitivity or / and specificity of the reference value (cutoff value, etc.) is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • the value derived from the test animal is compared with the value derived from the healthy animal, and (i) when the value derived from the test animal is larger than the value derived from the healthy animal, "the test animal develops colorectal cancer. It is possible to make a judgment such as "there is a possibility of being affected, or the test animal is likely to be suffering from colorectal cancer", and (ii) the value derived from the test animal and the value derived from the healthy animal. If no significant difference is observed between the two, it is possible to make a judgment such as "the test animal is unlikely to have colorectal cancer or is unlikely to have colorectal cancer".
  • the value derived from the test animal at a certain time point is compared with the value derived from the test animal at a different time point, and the presence / absence or / or the degree of increase / decrease of the value is determined.
  • the determination step according to the present invention may be performed as described above using the obtained plurality of values, and the accuracy is higher. Can be judged highly.
  • the reagent kit for diagnosing colorectal cancer of the present invention contains a substance having an affinity for a sugar chain selected from the following (1) to (4). It is a waste.
  • the kit of the present invention contains substances having an affinity for the biomarkers of the present invention, in other words, the biomarkers (1) to (4) of the present invention, respectively.
  • the biomarker and colorectal cancer of the present invention in the kit of the present invention are as described in ⁇ Biomarker of the present invention> and ⁇ Assistant method of the present invention>, and specific examples, preferred examples and the like are also the same. Is.
  • the substance having the above affinity is a substance that specifically binds to a sugar chain or protein (or peptide fragment) in the biomarker of the present invention, and examples thereof include lectins and antibodies.
  • the substance having the above affinity is as described in ⁇ Auxiliary method of the present invention>, and specific examples, preferred examples and the like are also the same.
  • the kit of the present invention further includes reagents usually used in this field, for example, reagents for peptide fragmentation such as trypsin, lysylendopeptidase, AspN, columns for concentration such as lectin columns, solvents for protein extraction, and buffers. , Cleaning agents, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, solutions for diluting samples, lectin-immobilized solid phase, antibody-immobilized solid phase, antigen-immobilized solids.
  • reagents usually used in this field for example, reagents for peptide fragmentation such as trypsin, lysylendopeptidase, AspN, columns for concentration such as lectin columns, solvents for protein extraction, and buffers.
  • Cleaning agents reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, solutions for diluting samples, lectin-immobilized solid phase, antibody
  • the concentration and pH may be in the range usually used in this field.
  • Examples of the immobilized solid phase such as the lectin-immobilized solid phase, antibody-immobilized solid phase, and antigen-immobilized solid phase include magnetic particles such as magnetic silica particles, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, and the like.
  • An antibody, a fragment of the antibody, etc. may be immobilized.
  • the material in the immobilized solid phase such as the lectin-immobilized solid phase, the antibody-immobilized solid phase, and the antigen-immobilized solid phase
  • a commercially available material may be used even if it is produced by a method known per se. You may.
  • magnetic particles such as the magnetic silica particles are produced by a method known per se, they can be produced by the method described in WO2012 / 173002.
  • the secondary antibody labeled with the above-mentioned labeling substance or an antibody fragment thereof is an antibody or an antibody fragment thereof that binds to each of the above-immobilized substances having an affinity (lectin, antibody, fragment of the antibody, etc.). ..
  • the method for binding the labeling substance and the labeling substance in the secondary antibody labeled with the above-mentioned labeling substance or the antibody fragment thereof is as described in ⁇ Auxiliary method of the present invention>, and preferred examples and specific examples. Etc. are the same.
  • the above-mentioned reagent for detecting a labeling substance is, when a substance having an affinity such as a lectin, an antibody or a fragment of the antibody is labeled with a labeling substance, such as a lectin, an antibody or a fragment of the antibody labeled with the labeling substance. It detects a label in a substance having affinity and / and a label in the above-labeled secondary antibody or a fragment of the secondary antibody, and is a substrate for measuring absorbance such as tetramethylbenzidine and orthophenylenediamine, hydroxy.
  • Fluorescent substrates such as phenylpropionic acid and hydroxyphenylacetic acid, luminescent substances such as luminol, and reagents for measuring absorbance such as 4-nitrophenyl phosphate, fluorescent substrates such as 4-methylumbelliferyl phosphate, and the like can be mentioned. ..
  • the kit of the present invention may include an instruction manual or the like for performing the auxiliary method of the present invention.
  • the "instruction manual” is an instruction manual and package insert for the reagent according to the present invention, in which the features, principles, operating procedures, determination procedures, etc. of the auxiliary method of the present invention are substantially described in text or / and in figures and tables. , Pamphlet (leaflet), etc. Specifically, for example, (i) the principle of the measurement process and the operation procedure according to the present invention are described, and (ii) the principle and the operation procedure of the measurement process and the determination process according to the present invention are described. Things etc. can be mentioned.
  • the auxiliary method of the present invention can be performed easily, in a short time and with high accuracy.
  • the device for assisting the diagnosis of colorectal cancer according to the present invention includes at least (1) a measuring unit. Further, it may include (2) a determination unit, (3) an output unit, and (4) an input unit.
  • the (1) measuring unit in the auxiliary device according to the present invention is configured to measure the amount of sugar chains selected from the above-mentioned biomarkers (1) to (4) of the present invention in a sample. Specific examples thereof include measuring devices such as various mass spectrometers used in the measuring step according to the present invention and devices used in a method based on an immunological measuring method. If necessary, the (1) measuring unit may be configured to calculate the amounts of the biomarkers (1) to (4) of the present invention based on the measured measured values.
  • the (2) determination unit in the auxiliary device according to the present invention is configured to determine whether or not the test animal has colorectal cancer based on the results obtained by (1) the measurement unit.
  • the (3) output unit in the auxiliary device according to the present invention is configured to output (1) the result obtained by the measuring unit and / and (2) the result obtained by the determination unit.
  • the (4) input unit in the auxiliary device according to the present invention is configured to send a signal for operating the (1) measurement unit to (1) the measurement unit in response to the operation of the operator.
  • the measurement, determination, and the like performed by the (1) measuring unit and (2) determining unit of the auxiliary device according to the present invention are as described in ⁇ Auxiliary method of the present invention>, and preferred examples and specific examples. The same applies to the examples.
  • the auxiliary method of the present invention can be performed easily, in a short time, and with high accuracy.
  • the method for treating colorectal cancer according to the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the treatment method according to the present invention) is selected from the biomarkers (1) to (4) of the present invention in a sample derived from a test animal.
  • the amount of sugar chains to be treated is measured, and based on the obtained measurement results, it is determined whether or not the test animal has colorectal cancer, and based on the determination results, there is a risk of colorectal cancer or colorectal cancer. It is done by giving appropriate treatment to patients who are judged to be at high risk.
  • ⁇ Auxiliary method of the present invention> and preferred examples, specific examples, and the like are also the same.
  • Specific examples of the appropriate treatment in the treatment method according to the present invention include endoscopic treatment, open surgery, surgical therapy such as laparoscopic surgery, radiation therapy such as chemoradiotherapy, and oxaliplatin (generic name).
  • Irinotecan (generic name), fluorouracil (generic name), bevasizumab (generic name), ramsylumab (generic name), afribercept (generic name), cetuximab (generic name), panitumumab (generic name), etc. Examples include drug therapy and the like.
  • Example 1 Selection of colorectal cancer markers [(1) Specimen (sample)] Serum (18 samples) derived from colorectal cancer patients and serum (20 samples) derived from healthy subjects provided by Yokohama City University Center Hospital and Biobank, Advanced Medical Research Center, Yokohama City University were used as samples (samples).
  • a digestive buffer consisting of 100 mM Tris-HCl (pH 9.0) containing 12 mM Sodium deoxycholate (SDC) and 12 mM N-lauroylsarcosine (LS) was prepared, and 90 ⁇ L of the digestive buffer and the serum derived from the colorectal cancer patient in (1) above and the serum from the colon cancer patient were prepared. 10 ⁇ L of serum derived from a healthy subject was mixed with each other. The mercaptoethanol solution was then added to a final concentration of 10 mM and incubated at 95 ° C. for 5 minutes to denature the protein.
  • SDC Sodium deoxycholate
  • LS N-lauroylsarcosine
  • Cysteine was then alkylated by adding each acrylamide (AA) solution to a final concentration of 20 mM and incubating at 25 ° C. for 30 minutes in the dark.
  • the protein was then digested by incubation with 5 ⁇ g Lys-C at 37 ° C. for 1 hour.
  • the protein was then further digested by diluting each with 400 ⁇ L of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1.5 mM CaCl 2 and then incubating with 5 ⁇ g of trypsin at 37 ° C. for 12 hours.
  • Each glycopeptide of 38 samples (colon cancer patients: 18 samples, healthy subjects: 20 samples) prepared in (2) above was concentrated by the following procedure. That is, first, 300 ⁇ L of cellulose microcrystalline resin was washed with 10 mL of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) / 90% acetonitrile (ACN) in a 15 mL centrifuge tube. Then, the washed 300 ⁇ L cellulose microcrystalline resin, 10 ml of 0.1% TFA / 90% ACN and 8 ⁇ L of each glycopeptide prepared in (2) were mixed and incubated at 1 rpm for 6 minutes.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • ACN acetonitrile
  • the cellulose microcrystalline resin on which each glycopeptide was adsorbed was washed 4 times with 10 mL of 0.1% TFA / 80% ACN, respectively.
  • each glycopeptide was washed twice with 600 ⁇ L of 30% ACN, and each glycopeptide was eluted from the above-mentioned cellulose microcrystalline resin to concentrate each glycopeptide.
  • concentration in order to remove fine cellulose particles, the mixture was centrifuged at 14000 ⁇ g, evaporated with a centrifugal evaporator, and redissolved in 50 ⁇ L of 0.1% formic acid / 3% ACN, respectively.
  • the amount of glycopeptide was then measured by eluting with a binary linear gradient of 0.1% formic acid (solvent A) and 0.1% formic acid / ACN at a flow rate of 300 nL / min (0-150 min: 0-150 min: 0% solvent B-35% solvent B, 150-155 minutes: 100% solvent B).
  • the nanobore trap column and analytical column were initialized with 12 ⁇ L and 5 ⁇ L of 0.1% FA, respectively, before each analysis.
  • Full MS was monitored from m / z 350 to m / z 2000 with Resolution 70000 and product ion scans were obtained by Data dependent accuracy.
  • the ionization parameters and the Q-Exactive Data dependent accuracy parameters in the above measurement are as follows.
  • ⁇ Ionization parameters spray voltage: 1800V
  • Ogujirari gas and sheath gas were not used.
  • the order of measurement of serum samples from healthy subjects and colorectal cancer patients was randomized to avoid the effects of confounding factors.
  • glycopeptides A to M derived from alpha 1 antitrypsin, leucine-rich alpha 2 glycoprotein, alpha 1 antichymotrypsin and complement component 9, respectively, were identified. It was. Regarding the peak area values of the glycopeptides A to M, the average value of colorectal cancer patients (18 samples) and the average value of healthy subjects (20 samples) are shown in Table 8 and FIGS. 1 to 4, respectively.
  • glycopeptide A having a sugar chain represented by formula (i) 1 ′′ derived from alpha 1 antitrypsin (mean peak area value of colorectal cancer patients: 19393588.62.2222, Average peak area value of healthy subjects: 306335029.7), Glycopeptide B having a sugar chain represented by (ii) formula 1''' (average peak area value of colorectal cancer patients: 1099675503.77778, average peak area value of healthy subjects) : 245395191.4), Glycopeptide C having a sugar chain represented by (iii) formula 2 ′′ (mean peak area value of colorectal cancer patients: 132975907.444444, average peak area value of healthy subjects; 14027932.45) and ( iv) The expression level of glycopeptide D (mean peak area value for colorectal cancer patients: 1382623873.055556, average peak area value for healthy subjects: 25985005.75) having a sugar chain represented by the formula 2
  • glycopeptide E (mean peak area value of colorectal cancer patients: 36204545.) Derived from leucine-rich alpha 2 glycoprotein and having a sugar chain represented by formula (i) 1 ′′.
  • glycopeptide F having a sugar chain represented by (ii) formula 1'''' (average peak area value of colorectal cancer patients: 53995609.7777778, average of healthy subjects) Peak area value: 341533.355)
  • Glycopeptide G having a sugar chain represented by (iii) formula 1'''' (mean peak area value of colorectal cancer patients: 53995609.7777778, average peak area value of healthy subjects: 3415333) .55) and (iv) Expression level of glycopeptide H (mean peak area value for colorectal cancer patients: 387390364.555556, average peak area value for healthy subjects: 92357205.6) having a sugar chain represented by the formula 1'''.
  • the sugar chain represented by 1 ′′ in the glycopeptide E and the sugar chain represented by the formula 1 ′′ ′′ in the glycopeptide F are 79th from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein. It was confirmed that it was bound to the asparagine residue of. It was confirmed that the sugar chain represented by the formula 1'''' in the glycopeptide G was bound to the asparagine residue at position 186 from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein. It was confirmed that the sugar chain represented by the formula 1'''in the glycopeptide H was bound to the asparagine residue at position 269 from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
  • glycopeptide I (mean peak area value of colorectal cancer patients: 162903669.9444444, which is derived from alpha 1 antichymotrypsin and has a sugar chain represented by formula (i) 2 ′′, Average peak area value of healthy subjects: 8899400.75), Glycopeptide J having a sugar chain represented by equation (ii) 2''' (average peak area value of colorectal cancer patients: 206514550.4444444, average peak area value of healthy subjects) : 1895273.73), Glycopeptide K having a sugar chain represented by (iii) formula 1 ′′ (mean peak area value of colorectal cancer patients: 13321110.3333333, average peak area value of healthy subjects: 913077) and (iv).
  • glycopeptide L (mean peak area value of colorectal cancer patients: 14098497.33333333, average peak area value of healthy subjects: 2290770.7) having a sugar chain represented by the formula 1'''is compared with that of healthy subjects. It was found that there was a significant increase in colorectal cancer patients. Further, the sugar chain represented by the formula 2 ′′ in the glycopeptide I, the sugar chain represented by the formula 2 ′′ in the glycopeptide J, the sugar chain represented by the formula 1 ′′ in the glycopeptide K, and the sugar. It was confirmed that the sugar chain represented by the formula 1''in the peptide L was bound to the 93rd asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of alpha 1 antichymotrypsin.
  • glycopeptide M (mean peak area value of colorectal cancer patients: 733351267.666667) having a sugar chain represented by (i) formula 1''', which is derived from complement component 9. , The average peak area value of healthy subjects: 202557121.85) was found to be significantly increased in colorectal cancer patients as compared with healthy subjects.
  • an AUC value (Area Under the Curve: curve area value) was calculated by ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis. The results are shown in Table 9 below. It is said that the closer the AUC value is to 1, the higher the determination ability.

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Abstract

本発明は、大腸癌の診断を可能とするバイオマーカーの提供を課題とする。　本発明は、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を含む、大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー： （１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、 （２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、式１で表される糖鎖、 （３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、 （４）補体成分９に存在する、式１で表される糖鎖等に関する。

Description

大腸癌の診断を補助する方法、キット及びバイオマーカー
　本発明は、大腸癌の診断を補助する方法、キット及びバイオマーカーに関する。
　糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン等の単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
　糖鎖は、生体内ではタンパク質や脂質と結合した複合糖質の形態で主に細胞表面に存在しており、細胞の増殖、細菌やウィルスへの感染、神経の伸長、炎症、免疫等の生理作用に関与している。
　一方、糖鎖は、大腸癌等の疾患に伴いその構造が変化することも知られている。近年、糖鎖を大腸癌等の疾患のバイオマーカーとして用いるための研究が盛んに行われている。
　上記バイオマーカーとしては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン等が知られている（特許文献１）。
特開２０１５－１８４１６８号公報
　しかしながら、上記の公知のバイオマーカーは、正確度の点で十分ではなかった。
　本発明は、新たな大腸癌のバイオマーカー、キット及び診断補助方法の提供を課題とする。
　特に、正確度の高い大腸癌のバイオマーカーの提供を課題とする。
　本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
［１］
　下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を含む、大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー：
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
［２］
　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、［１］に記載のバイオマーカー：
（１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
（３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４－１）補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
［３］
　前記糖鎖が、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖である、［１］又は［２］に記載のバイオマーカー。
［４］
　被検動物由来の試料中の、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を測定し、得られた測定結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定する、大腸癌の診断を補助する方法：
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
［５］
　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、［４］に記載の方法：
（１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
（３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４－１）補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
［６］
　前記糖鎖が、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖である、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］
　前記試料が、全血、血清又は血漿である、［４］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
　下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖に親和性を有する物質を含む、大腸癌の診断を補助するための試薬キット：
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
［９］
　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、［８］に記載の試薬キット：
（１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
（３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４－１）補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
　本発明の大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー及び方法、並びにそのための試薬キットによれば、高い正確度で大腸癌の診断を補助することができる。
糖ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのピーク面積値について、大腸癌患者（ｎ＝１８）の平均値及び健常者（ｎ＝２０）の平均値を示した図である。 糖ペプチドＥ，Ｆ、Ｇ及びＨのピーク面積値について、大腸癌患者（ｎ＝１８）の平均値及び健常者（ｎ＝２０）の平均値を示した図である。 糖ペプチドＩ、Ｊ、Ｋ及びＬのピーク面積値について、大腸癌患者（ｎ＝１８）の平均値及び健常者（ｎ＝２０）の平均値を示した図である。 糖ペプチドＭのピーク面積値について、大腸癌患者（ｎ＝１８）の平均値及び健常者（ｎ＝２０）の平均値を示した図である。
＜本発明の大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー＞
　本発明の大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー（以下、本発明のバイオマーカーと略記する場合がある。）は、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を含むものである。
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（以下、本発明のバイオマーカー（１）と略記する場合がある。）、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖（以下、本発明のバイオマーカー（２）と略記する場合がある。）、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（以下、本発明のバイオマーカー（３）と略記する場合がある。）、
（４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖（以下、本発明のバイオマーカー（４）と略記する場合がある。）。
　尚、本発明のバイオマーカーは、本発明のバイオマーカー（１）～（４）の何れかを単独で含むものでも、或いは複数種を含むものであってもよい。
　以下に本発明のバイオマーカー（１）～（４）についてそれぞれ説明する。
［本発明のバイオマーカー（１）］
　本発明のバイオマーカー（１）は、アルファ１アンチトリプシンに存在する下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含むものである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式１及び２における、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ－アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、Ｈは水素原子を表す。
　上記式１及び２における、Ｘ１がＨの場合（Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６又は／及びＸ７がＨの場合も同様）、Ｘ１－ＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃを表す。また、上記式１及び２における末端のＡ１がＨの場合（Ａ２、Ａ３、Ａ４又は／及びＡ５がＨの場合も同様）、Ａ１－Ｇａｌ－は、Ｇａｌ－を表す。以下、本明細書において同じ意味を表す。
　尚、本発明のバイオマーカー（１）としては、上記式１で表される糖鎖及び上記式２で表される糖鎖のうち、式１で表される糖鎖のみを有するものでも、式２で表される糖鎖のみを有するものでも、式１で表される糖鎖と式２で表される糖鎖の両方を有するものでもよい。また、式１に含まれる単一の糖鎖のみを有するものでも、式１に含まれる複数の糖鎖を有するものでもよく、式２に含まれる単一の糖鎖のみを有するものでも、式２に含まれる複数の糖鎖を有するものでもよい。
　本発明のバイオマーカー（１）に係るアルファ１アンチトリプシンとは、３９４個のアミノ酸からなる糖タンパク質であり、主に肝細胞で生成され、種々の炎症時に血中で増加する急性相反応物質の一つである。また、血中における最も主要なプロテアーゼインヒビターとして機能していることも知られている。
　また、上記アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０１００９）等のデータベースに登録されている。
　本発明のバイオマーカー（１）に係るアルファ１アンチトリプシンは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、当該アルファ１アンチトリプシンにおいて１～５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって、多型性や突然変異等により生じるものである。
　但し、変異体であっても、本発明のバイオマーカー（１）における式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖とアルファ１アンチトリプシンとの結合部位である、当該アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。
　本発明のバイオマーカー（１）における式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（末端のＮ－アセチルグルコサミン）は、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ－グリコシド結合）しているものが好ましい。
　以下に、本発明のバイオマーカー（１）における式１又は２で表される糖鎖について、それぞれ説明する。
［アルファ１アンチトリプシンに存在する式１で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、下記表１に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ４～７がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　上記式１におけるＡ１及びＡ２は、下記表２に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ１、２及び４がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の組み合わせとしては、下記表３に示すものが好ましく、組み合わせ１６、１７、１９、２１、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２及び３４がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　上記式１で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式１’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019

（式１’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ）
　更に、上記式１’は、下記式１’’又は式１’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
（式１’’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の何れか１つがＦｕｃ、残り２つがそれぞれＨであり、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021

（式１’’’中、Ａ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））
　上記式１’、式１’’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２又はＸ３がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。Ａ１又は／及びＡ２がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ１又はＡ２がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式１’、式１’’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の具体例、組み合わせは、上記式１と同じである。
［アルファ１アンチトリプシンに存在する式２で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式２におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、例えば、下記表４に示す組み合わせが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　上記式２におけるＡ３、Ａ４及びＡ５は、下記表５に示す組み合わせが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　上記式２におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５の組み合わせとしては、下記表６に示すものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　上記式２で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式２’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026

（式２’中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ）
　更に、上記式２’は、下記式２’’又は式２’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027

（式２’’中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ（但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７の何れか１つがＦｕｃ、残り３つがそれぞれＨであり、Ａ３、Ａ４及びＡ５におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028

（式２’’’中、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ（但し、Ａ３、Ａ４及びＡ５におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））
　上記式２’、式２’’及び式２’’’におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６又はＸ７がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。Ａ３、Ａ４又は／及びＡ５がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ３、Ａ４又はＡ５がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式２’、式２’’及び式２’’’におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５の具体例、組み合わせは、上記式２と同じである。
　本発明のバイオマーカー（１）、即ち、アルファ１アンチトリプシンに存在する式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含む、バイオマーカーとしては、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンに存在する式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖そのもの、（ｉｉ）式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したアルファ１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）アルファ１アンチトリプシンの一部分であって、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
　尚、上記ペプチド断片とは、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖とアルファ１アンチトリプシンとの結合部位である、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片である。具体的には、例えば、生体内で生じるものや、アルファ１アンチトリプシンを、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、２～５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号１で表されるものが好ましい。
［本発明のバイオマーカー（２）］
　本発明のバイオマーカー（２）は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する下記式１で表される少なくとも１つの糖鎖を含むものである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　尚、本発明のバイオマーカー（２）としては、上記式１に含まれる単一の糖鎖のみを有するものでも、式１に含まれる複数の糖鎖を有するものでもよい。
　本発明のバイオマーカー（２）に係るロイシンリッチアルファ２グリコプロテインとは、血液に含まれるタンパク質であり、ロイシンリッチリピート構造を有することを特徴とするものである。関節リウマチ、炎症性腸疾患等種々の疾患に関与していることが報告されている。
　また、上記ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０２７５０）等のデータベースに登録されている。
　本発明のバイオマーカー（２）に係るロイシンリッチアルファ２グリコプロテインは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、当該ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインにおいて１～５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって、多型性や突然変異等により生じるものである。
　但し、変異体であっても、本発明のバイオマーカー（２）における式１で表される糖鎖とロイシンリッチアルファ２グリコプロテインとの結合部位である、当該ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、又は２６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。
　本発明のバイオマーカー（２）における式１で表される糖鎖（末端のＮ－アセチルグルコサミン）は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、又は２６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ－グリコシド結合）しているものが好ましい。
　以下に、本発明のバイオマーカー（２）における式１で表される糖鎖について、説明する。
［ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイに存在する式１で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、上記表１に示す組み合わせが好ましい。
　上記式１におけるＡ１及びＡ２は、上記表２に示す組み合わせが好ましい。
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の組み合わせとしては、上記表３に示すものが好ましい。
　上記式１で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式１’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031

（式１’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ）
　更に、上記式１’は、下記式１’’、式１’’’又は式１’’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032

（式１’’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の何れか１つがＦｕｃ、残り２つがそれぞれＨであり、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033

（式１’’’中、Ａ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034

（式１’’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の何れか２つがそれぞれＦｕｃ、残り１つがＨであり、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が１である））
　上記式１’、式１’’、式１’’’及び式１’’’’におけるＸ１、Ｘ２又はＸ３がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。Ａ１又は／及びＡ２がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ１又はＡ２がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式１’、式１’’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の具体例、組み合わせは、上記式１と同じである。
　本発明のバイオマーカー（２）、即ち、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する式１で表される糖鎖を含む、バイオマーカーとしては、（ｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する式１で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式１で表される糖鎖が結合したロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン、（ｉｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインの一部分であって、式１で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
　尚、上記ペプチド断片とは、式１で表される糖鎖とロイシンリッチアルファ２グリコプロテインとの結合部位である、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、又は２６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片である。具体的には、例えば、生体内で生じるものや、アルファ１アンチトリプシンを、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、２～５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表されるものが好ましい。
［本発明のバイオマーカー（３）］
　本発明のバイオマーカー（３）は、アルファ１アンチキモトリプシンに存在する下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含むものである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　尚、本発明のバイオマーカー（３）としては、上記式１で表される糖鎖及び上記式２で表される糖鎖のうち、式１で表される糖鎖のみを有するものでも、式２で表される糖鎖のみを有するものでも、式１で表される糖鎖と式２で表される糖鎖の両方を有するものでもよい。また、式１に含まれる単一の糖鎖のみを有するものでも、式１に含まれる複数の糖鎖を有するものでもよく、式２に含まれる単一の糖鎖のみを有するものでも、式２に含まれる複数の糖鎖を有するものでもよい。
　本発明のバイオマーカー（３）に係るアルファ１アンチキモトリプシンとは、４３３個のアミノ酸からなる糖タンパク質であり、血清中に存在するセリンプロテアーゼインヒビターファミリーの１つである。また、血中における最も主要なプロテアーゼインヒビターとして機能していることが知られている。
　また、上記アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０１０１１）等のデータベースに登録されている。
　本発明のバイオマーカー（３）に係るアルファ１アンチキモトリプシンは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、当該アルファ１アンチキモトリプシンにおいて１～５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって、多型性や突然変異等により生じるものである。
　但し、変異体であっても、本発明のバイオマーカー（３）における式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖とアルファ１アンチキモトリプシとの結合部位である、当該アルファ１アンチキモトリプシのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。
　本発明のバイオマーカー（３）における式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（末端のＮ－アセチルグルコサミン）は、アルファ１アンチキモトリプシのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ－グリコシド結合）しているものが好ましい。
　以下に、本発明のバイオマーカー（３）における式１又は２で表される糖鎖について、それぞれ説明する。
［アルファ１アンチキモトリプシンに存在する式１で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、上記表１に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ４～７がより好ましい。
　上記式１におけるＡ１及びＡ２は、上記表２に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ１、２及び４がより好ましい。
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の組み合わせとしては、上記表３に示すものが好ましく、組み合わせ１６、１７、１９、２１、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２及び３４がより好ましい。
　上記式１で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式１’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038

（式１’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ）
　更に、上記式１’は、下記式１’’又は式１’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039

（式１’’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の何れか１つがＦｕｃ、残り２つがそれぞれＨであり、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040

（式１’’’中、Ａ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））
　上記式１’、式１’’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２又はＸ３がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。Ａ１又は／及びＡ２がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ１又はＡ２がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式１’、式１’’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の具体例、組み合わせは、上記式１と同じである。
［アルファ１アンチキモトリプシンに存在する式２で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041

（式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式２におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、例えば、上記表４に示す組み合わせが好ましい。
　上記式２におけるＡ３、Ａ４及びＡ５は、上記表５に示す組み合わせが好ましい。
　上記式２におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５の組み合わせとしては、上記表６に示すものが好ましい。
　上記式２で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式２’で示されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042

（式２’中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ）
　更に、上記式２’は、下記式２’’又は式２’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043

（式２’中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ（但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７の何れか１つがＦｕｃ、残り３つがそれぞれＨであり、Ａ３、Ａ４及びＡ５におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044

（式２’’’中、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、上記と同じ（但し、Ａ３、Ａ４及びＡ５におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））
　上記式２’、式２’’及び式２’’’におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６又はＸ７がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。Ａ３、Ａ４又はＡ５がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ１又はＡ２がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式２’、式２’’及び式２’’’におけるＸ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７、並びにＡ３、Ａ４及びＡ５の具体例、組み合わせは、上記式１と同じである。
　本発明のバイオマーカー（３）、即ち、アルファ１アンチキモトリプシンに存在する式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含む、バイオマーカーとしては、（ｉ）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖そのもの、（ｉｉ）式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したアルファ１アンチキモトリプシン、（ｉｉｉ）アルファ１アンチキモトリプシンの一部分であって、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
　尚、上記ペプチド断片とは、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖とアルファ１アンチキモトリプシンとの結合部位である、アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片である。具体的には、例えば、生体内で生じるものや、アルファ１アンチキモトリプシンを、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、２～５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号５で表されるものが好ましい。
［本発明のバイオマーカー（４）］
　本発明のバイオマーカー（４）は、補体成分９に存在する下記式１で表される糖鎖を含むものである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　本発明のバイオマーカー（４）に係る補体成分９とは、免疫反応（抗原抗体反応）を補助するタンパク質の１つである。生理的な機能としては、抗原のオプソニン化、膜侵襲複合体による細菌の破壊、マクロファージ等の貪食細胞の活性化等が知られている。
　また、上記補体成分９のアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０２７４８）等のデータベースに登録されている。
　本発明のバイオマーカー（４）に係る補体成分９は、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、当該補体成分９において１～５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって、多型性や突然変異等により生じるものである。
　但し、変異体であっても、本発明のバイオマーカー（４）における式１で表される糖鎖と補体成分９との結合部位である、当該補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。
　本発明のバイオマーカー（４）における式１で表される糖鎖（末端のＮ－アセチルグルコサミン）は、補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ－グリコシド結合）しているものが好ましい。
　以下に、本発明のバイオマーカー（４）における式１で表される糖鎖について、それぞれ説明する。
［補体成分９に存在する式１で表される糖鎖］

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046

（式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、上記表１に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ７がより好ましい。
　上記式１におけるＡ１及びＡ２は、上記表２に示す組み合わせが好ましく、組み合わせ１、２及び４がより好ましい。
　上記式１におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の組み合わせとしては、上記表３に示すものが好ましく、組み合わせ３１、３２及び３４がより好ましい。
　上記式１で表される糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｆｕｃ等の各単糖同士の結合様式により、例えば、下記式１’で示されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047

（式１’中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２は、上記と同じ）
　更に、上記式１’は、下記式１’’’で表されるものが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048

（式１’’’中、Ａ１及びＡ２は、上記と同じ（但し、Ａ１及びＡ２におけるＮｅｕ５Ａｃの総数が２である））
　上記式１’におけるＸ１、Ｘ２又はＸ３がＦｕｃである場合、Ｆｕｃは、例えば、α１－６グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃと結合するのが好ましい。上記式１’及び式１’’’におけるＡ１又は／及びＡ２がＮｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－３グリコシド結合又はα２－６グリコシド結合によりＧａｌと結合するのが好ましい。また、Ａ１又はＡ２がＮｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃである場合、Ｎｅｕ５Ａｃは、例えば、α２－８グリコシド結合によりＮｅｕ５Ａｃと結合するのが好ましい。
　式１’及び式１’’’におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３、並びにＡ１及びＡ２の具体例、組み合わせは、上記式１と同じである。
　本発明のバイオマーカー（４）、即ち、補体成分９に存在する式１で表される糖鎖を含む、バイオマーカーとしては、（ｉ）補体成分９に存在する式１で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式１で表される糖鎖が結合した補体成分９、（ｉｉｉ）補体成分９の一部分であって、式１で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
　尚、上記ペプチド断片とは、式１で表される糖鎖と補体成分９との結合部位である、補体成分９のアミノ酸配列のＮ末端より４１５番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片である。具体的には、例えば、生体内で生じるものや、補体成分９を、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、２～５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号６で表されるものが好ましい。
　本発明のバイオマーカーとしては、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含むもの又は（ｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、式１で表される糖鎖を含むものが好ましく、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を含むものがより好ましく、（ｉｉｉ）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列Ｎ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合している式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が特に好ましい。
［本発明に係る大腸癌］
　本発明に係る大腸癌とは、大腸から発生した癌（悪性腫瘍）のことである。本発明に係る大腸癌には、例えば、結腸癌、直腸癌等が含まれる。
＜本発明の大腸癌の診断を補助する方法＞
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法（以下、本発明の補助方法と略記する場合がある）は、被検動物由来の試料中の下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を測定し（以下、本発明に係る測定工程と略記する場合がある）、得られた測定結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定すること（以下、本発明に係る判定工程と略記する場合がある）によりなされる。
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（本発明のバイオマーカー（１））、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式１で表される糖鎖（本発明のバイオマーカー（２））、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖（本発明のバイオマーカー（３））、
（４）補体成分９に存在する、上記式１で表される糖鎖（本発明のバイオマーカー（４））
　尚、本発明の補助方法は、本発明のバイオマーカー（１）～（４）の何れか単独を用いてなされても、或いは複数種を用いてなされてもよい。
［本発明に係る被検動物］
　本発明に係る被検動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、チンパンジー等の哺乳動物が挙げられ、ヒト、サル、マウス又はラットが好ましく、ヒトがより好ましい。
［本発明に係る試料］
　本発明に係る試料としては、上記被検動物由来のものであればよく、例えば、血清、血漿、全血、尿、唾液、脳脊髄液、組織液、汗、涙、羊水、骨髄液、胸水、腹水、間接液、眼房水、硝子体液等の生体由来試料が挙げられ、血清、血漿、全血等の血液由来試料が好ましく、血清がより好ましい。
　本発明に係る試料を上記被検動物から得る（採取する）方法は、特に限定されず、例えば、自体公知の方法に基づいて、当該被検動物から当該試料を得る（採取する）ことによりなされればよく、要すれば自体公知の方法に従って、分離、濃縮、精製等を行ってもよい。
　尚、上記試料は、上記被検動物から得られた（採取された）直後のものであっても、当該試料を保存したものであってもよい。試料を保存する方法としては、通常この分野で行われている方法であれば何れでもよい。
［本発明に係る測定工程］
　本発明に係る測定工程は、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を測定することによりなされる。
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式１で表される糖鎖、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖
　尚、本発明に係る測定工程としては、本発明のバイオマーカー（１）～（４）の何れか単独を測定することによりなされても、或いは複数種を測定することによりなされてもよい。
　本発明に係る測定工程における上記（１）～（４）から選ばれる糖鎖の測定とは、本発明のバイオマーカー（１）～（４）から選ばれる１つを測定することであり、具体的には、例えば、（ｉ）本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質に結合した（由来する）糖鎖そのものの量の測定、（ｉｉ）本発明のバイオマーカーにおける糖鎖が結合したコアタンパク質の量の測定、（ｉｉｉ）本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質の一部分であって、糖鎖が結合したペプチド断片の量の測定等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
　上記本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質とは、本発明のバイオマーカーにおける糖鎖以外の部分を意味し、本発明のバイオマーカー（１）であれば、アルファ１アンチトリプシンを意味し、本発明のバイオマーカー（２）であれば、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインを意味し、本発明のバイオマーカー（３）であれば、アルファ１アンチキモトリプシンを意味し、本発明のバイオマーカー（４）であれば、補体成分９を意味する。
　尚、上記「量」とは、容量、質量等の絶対値又は濃度、イオン強度、吸光度、蛍光強度、濁度、ピーク面積等から算出された値等の相対値の何れであってもよい。
　本発明に係る測定工程における測定方法としては、通常この分野で行われているものであれば何れでもよく、具体的には、例えば、（Ａ）本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質（例えば、抗体、レクチン等）を用いる方法、（Ｂ）質量分析法を利用する方法等が挙げられ、（Ａ）が好ましい。
　以下に、上記（Ａ）及び（Ｂ）についてそれぞれ具体的に説明する。
（Ａ）本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法
　上記本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質とは、本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体や、本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチンや抗体等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質として、抗体のみを用いる場合は免疫学的測定方法により、抗体以外の物質（例えばレクチン等）あるいは抗体以外の物質及び抗体を用いる場合は免疫学的測定方法に準じた方法により、本発明のバイオマーカーを測定すればよい。これらの測定方法の原理としては、例えばサンドイッチ法や競合法が挙げられ、また、ホモジニアスな測定系であってもヘテロジニアスな測定系であってもよい。
　上記本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法としては、具体的には、例えば、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとを接触させて、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体を形成させ、本発明のバイオマーカーの量を測定することによりなされればよい。
　本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法としては、具体的には、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ラテックス凝集比濁法等の免疫比濁法、免疫比ろう法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｏｘｙｇｅｎ　ＣｈａｎｎｅｌｉｎｇＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＯＣＩ法）、Ｌｉｑｕｉｄ－ｐｈａｓｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓｓａｙ－ＥｌｅｃｔｒｏＫｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｔｅ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　Ａｓｓａｙ（ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法）、レクチン電気泳動法等のキャピラリー電気泳動法、表面プラズモン共鳴法、レクチンカラム法等が挙げられ、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法、レクチン電気泳動法等のキャピラリー電気泳動法がより好ましい。
　上記本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体としては、具体的には、例えば、本発明のバイオマーカー（１）であれば、抗アルファ１アンチトリプシン抗体、本発明のバイオマーカー（２）であれば、抗ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン抗体、本発明のバイオマーカー（３）であれば、抗アルファ１アンチキモトリプシン抗体、本発明のバイオマーカー（４）であれば、抗補体成分９抗体等が挙げられる。
　上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独で或いは組み合わせて用いてもよい。
　上記抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’２）、Ｆｖ、ｓＦｖ等の抗体フラグメントやダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等の合成抗体等であってもよい。
　また、上記抗体は、市販の抗体を用いても、自体公知の方法に従って調製したものを用いてもよい。
　尚、自体公知の方法に従って、上記抗体を調製する場合には、例えば、「免疫測定法」（生物化学的測定研究会編集、講談社、２０１４年）等に記載の方法に従ってなされればよい。
　また、上記抗体は、標識物質で標識されたものであってもよい。当該標識物質としては、具体的には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ等の酵素、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位元素、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、４－メチルウンベリフェロン、ローダミン或いはこれらの誘導体等の蛍光性物質、ルシフェリン、ルミノール、ルテニウム錯体等の発光性物質、フェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、４－アミノ－２，２，６，－テトラメチルピぺリジン－１－オキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質、ＨｉＬｙｔｅ系色素、Ａｌｅｘａ系色素、ＣｙＤｙｅ系色素等の色素、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等が挙げられる。
　尚、上記標記物質を抗体に結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。
　上記本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチンとしては、具体的には、例えば、下記の通りである。
　即ち、本発明のバイオマーカー（１）であれば、上記式１で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡｌｅｕｒｉａ　Ａｕｒａｎｔｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＡＬ）やＬｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｌｏｎｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）等、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）に結合するＥｌｄｅｒｂｅｒｒｙ　Ｂａｌｋ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＢＬ），Ｍａａｃｋｉａ　Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＭＡＡ）等、上記式２で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡＡＬやＬＴＬ等、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）に結合するＥＢＬ、ＭＡＡ等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカー（２）であれば、上記式１で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡＡＬやＬＴＬ等、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）に結合するＥＢＬ、ＭＡＡ等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカー（３）であれば、上記式１で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡＡＬやＬＴＬ等、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）に結合するＥＢＬ、ＭＡＡ等が挙げられる。
　また、本発明のバイオマーカー（４）であれば、上記式１で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡＡＬやＬＴＬ等、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）に結合するＥＢＬ、ＭＡＡ等が挙げられる。
　上記レクチンは、標識物質で標識されたものであってもよく、当該標識物質としては、上記本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体にて説明した通りであり、具体例等も同じである。また、上記標識物質をレクチンに結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。
　上記本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合する抗体としては、具体的には、例えば、下記の通りである。
　即ち、本発明のバイオマーカー（１）であれば、上記式１で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、上記式２で表される糖鎖に特異的に結合する抗体等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカー（２）であれば、上記式１で表される糖鎖に特異的に結合する抗体等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカー（３）であれば、上記式１で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、上記式２で表される糖鎖に特異的に結合する抗体等が挙げられる。
　本発明のバイオマーカー（４）であれば、上記式１で表される糖鎖に特異的に結合する抗体等が挙げられる。
　上記抗体は、標識物質で標識されたものであってもよく、当該標識物質としては、上記本発明のバイオマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体にて説明した通りであり、具体例等も同じである。
　また、上記標識物質をレクチンに結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。
　上記本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体の量を測定する方法としては、当該複合体の量を測定し得る方法であれば何れでもよく、具体的には、例えば、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体に由来する性質を利用する方法等が挙げられ、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法が好ましい。
　上記本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法としては、具体的には、例えば、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを自体公知の方法により検出することによりなされればよい。例えば、標識物質が酵素の場合には、免疫測定法の常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質　核酸　酵素　別冊　Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１～６３，共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合には、例えばＲＩＡで行われている常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型ＧＭカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１等参照）。また、標識物質が蛍光物質の場合には、例えば蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩＡで行われている常法、例えば「図説　蛍光抗体、川生明著、第１版、ソフトサイエンス社、１９８３」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質　核酸　酵素　別冊　Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２５２～２６３、共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質　核酸　酵素　別冊　Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２６４～２７１、共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。
　上記本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体に由来する性質を利用する方法としては、具体的には、例えば、表面プラズモン共鳴法等のホモジニアスイムノアッセイ系等の方法等が挙げられる。
　尚、上記方法の具体的な手法については、自体公知の手法に従ってなされればよい。
　以下に、（Ａ）本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法について、より具体的に説明する。
　尚、下記説明において、本発明のバイオマーカーにおけるコアタンパク質（又はペプチド断片）を「標的コアタンパク質（又は標的ペプチド断片）」、本発明のバイオマーカーにおける糖鎖を「標的糖鎖」と表記する。
　例えば、本発明のバイオマーカー（１）を測定する場合、アルファ１アンチトリプシンが「標的コアタンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が「標的糖鎖」を意味する。
　本発明のバイオマーカー（２）を測定する場合、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインが「標的コアタンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式１で表される糖鎖が「標的糖鎖」を意味する。
　本発明のバイオマーカー（３）を測定する場合、アルファ１アンチキモトリプシンが「標的コアタンパク質（又は標的ペプチド断片）」、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖が「標的糖鎖」を意味する。
　本発明のバイオマーカー（４）を測定する場合、補体成分９が「標的コアタンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式１で表される糖鎖が「標的糖鎖」を意味する。
　上記（Ａ）本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法としては、具体的には、例えば、下記工程１及び２を含む方法が挙げられる。
（工程１）試料から標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質（本発明のバイオマーカー）を分離する工程、
（工程２）前記工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質の量を測定する工程
　工程１としては、試料から標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質を分離し得る方法であれば何れでもよく、具体的には、例えば、試料中に存在する標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質と他の成分とを分離する方法が挙げられる。このような方法としては、具体的には、例えば、２種以上の親和性を有する物質、即ち、標的糖鎖に特異的に結合する物質、及び標的コアタンパク質に特異的に結合する物質を用いて、標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質と親和性を有する物質との複合体（標的コアタンパク質に特異的に結合する物質－本発明のバイオマーカー標的糖鎖に特異的に結合する物質）を形成させ、自体公知の方法により、標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質を分離すればよい。
　また、例えば、標的糖鎖に特異的に結合する物質（例えば、上記の本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチン）と本発明のバイオマーカーとの相互作用を利用して、本発明のバイオマーカー等の標的糖鎖と相互作用する成分と他の成分を分離し、さらに標的コアタンパク質に特異的に結合する物質を用いて、本発明のバイオマーカーと他の成分を分離する方法、例えば、標的コアタンパク質に特異的に結合する物質を用いて、本発明のバイオマーカーと他の成分を分離し、さらに標的糖鎖に特異的に結合する物質（例えば、上記の本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチン）と本発明のバイオマーカーとの相互作用を利用して、本発明のバイオマーカー等の標的糖鎖と相互作用する成分と他の成分を分離する方法により、試料から標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質（本発明のバイオマーカー）を分離してもよい。当該本発明のバイオマーカーの分離は、例えばレクチン電気泳動法やレクチンカラム法によりおこなうことができる。
　尚、標識物質で標識された親和性を有する物質を用いる場合には、標的糖鎖が結合した標的タンパク質の分離は、標識物質で標識された親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体の分離と言い換えてもよく、この場合、標識物質で標識された親和性を有する物質と本発明のバイオマーカー以外の成分との複合体又は／及び遊離の標識物質で標識された親和性を有する物質とを分離すればよい。標識物質で標識された親和性を有する物質を構成成分として含まない成分との分離は不要である。
　また、上記糖鎖に特異的に結合する親和性を有する物質及びコアタンパク質に特異的に結合する親和性を有する物質については、上述の通りであり、具体例等も同じである。
　工程２としては、前記工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的コアタンパク質を測定し得る方法であれば何れでもよく、具体例等は上述の通りである。
　上記方法において、工程１を行う前に、予め試料中の全タンパク質（標的タンパク質を含む）をペプチド断片化し、工程１で標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片を分離し、工程２で当該標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片を測定してもよい。
　該断片化処理としては、具体的には、例えば、工程１を行う前に、試料にトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼを加えることによりなされればよく、工程１で標的糖鎖に結合する物質、及び標的ペプチド断片に結合する物質をそれぞれ用いて、標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片と親和性を有する物質との複合体（標的ペプチド断片に特異的に結合する物質－本発明のバイオマーカー標的糖鎖に特異的に結合する物質）を形成させ、該複合体を上述の如く分離した後、該複合体の量を測定すればよい。
　また、上記全タンパク質の断片化を行った場合、当該断片化に引き続いて、レクチンカラム等のカラムによる濃縮を行ってもよい。当該濃縮は自体公知の方法に従ってなされればよく、市販のレクチンカラム等のカラムを用いればよい。
　更に、上記方法において、工程２のかわりに、工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質から標的糖鎖を分離し、当該標的糖鎖のみを測定してもよい。
　具体的には、例えば、工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質を、グリカナーゼ、ヒドラジン等にて処理することにより標的糖鎖を分離した後、当該糖鎖の量のみを上述の如く測定すればよい。
（Ｂ）質量分析法を利用する方法
　質量分析法を利用する方法としては、具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）等を利用する方法が挙げられる。
　上記方法としては、具体的には、例えば、液体クロマトグラフ等のクロマトグラフを有する分離部にて、試料中の成分を分離し、分離された種々の成分を質量分析部にてイオン化させ、更に質量電荷比（ｍ／ｚ）毎に分離することによりなされればよい。
　尚、上記質量分析法を利用する方法における具体的な手法は自体公知の手法やＷＯ２０１４／０３８５２４、ＷＯ２０１７／１９５８８、ＷＯ２０１８／０３４３４６等に記載の手法に従ってなされればよい。
　上記質量分析法を利用する方法において、試料から予め全タンパク質を抽出してもよく、その方法としては、具体的には、例えば、試料に、アセトン、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、塩酸水溶液等の溶媒を加えて全タンパク質を沈殿させることによりなされればよい。
　また、必要に応じ、試料から全タンパク質を抽出する前又は後に、全タンパク質を断片化してもよく、断片化を行った場合、当該断片化に引き続いて、レクチンカラム等のカラムによる濃縮を行ってもよい。当該断片化及び濃縮については、上述の通りである。
［好ましい測定工程］
　本発明に係る測定工程では、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖又は（ｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、式１で表される糖鎖を測定することが好ましく、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンに存在する、式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を測定することがより好ましく、（ｉ）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合している式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖を測定することが更に好ましい。
　また、上記測定を行う場合には、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法が好ましく、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ラテックス凝集比濁法等の免疫比濁法、免疫比ろう法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法、ＬＯＣＩ法、ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法、レクチン電気泳動法等のキャピラリー電気泳動法、表面プラズモン共鳴法、レクチンカラム法がより好ましく、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法、レクチン電気泳動法等のキャピラリー電気泳動法がさらに好ましい。
　本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとを接触させて、本発明のバイオマーカーを分離し、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体を形成させ、当該複合体の量を測定する方法がより好ましく、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとを接触させて、本発明のバイオマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体を形成させ、当該複合体に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法がさらに好ましい。
　また、標的糖鎖に特異的に結合する物質（例えば、上記の本発明のバイオマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチン）と本発明のバイオマーカーとの相互作用を利用して、本発明のバイオマーカー等の標的糖鎖と相互作用する成分と他の成分を分離し、さらに標的コアタンパク質に特異的に結合する物質を用いて、本発明のバイオマーカーと他の成分を分離し、本発明のバイオマーカーの量を測定するのがより好ましく、
標的糖鎖に特異的に結合する物質と本発明のバイオマーカーとの相互作用を利用して、本発明のバイオマーカー等の標的糖鎖と相互作用する成分と他の成分を分離し、さらに標的コアタンパク質に特異的に結合する物質を用いて、本発明のバイオマーカーと他の成分を分離し、標的コアタンパク質に特異的に結合する物質と本発明のバイオマーカーとの複合体に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法がさらに好ましい。
［本発明に係る判定工程］
　本発明に係る判定工程は、本発明に係る測定工程により得られた測定結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定する工程である。
　本発明に係る判定工程は、具体的には、例えば、被検動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた値（以下、被検動物由来の値と略記する場合がある）と予め設定した基準値（カットオフ値等）とを用いてなされる。
　即ち、（ｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）以上の場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が大腸癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）未満の場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれはない、或いは大腸癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。
　また、別の態様として、（ｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）以下の場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が大腸癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）超の場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれはない、或いは大腸癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。
　尚、上記基準値（カットオフ値等）は、大腸癌に罹患している動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた測定値と健常動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた値（以下、健常動物由来の値と略記する場合がある）とを用いてＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線解析等の統計解析に基づいて決定することができる。
　また、上記基準値（カットオフ値等）の感度又は／及び特異度は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。
　別の形態として、被検動物由来の値と健常動物由来の値とを比較し、（ｉ）被検動物由来の値が、健常動物由来の値より多い場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が大腸癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値と、健常動物由来の値との間に顕著な差が認められない場合、「被検動物が大腸癌に罹患しているおそれはない、或いは大腸癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。
　更に別の形態として、同一の被検動物において、ある時点における被検動物由来の値と、異なる時点での被検動物由来の値とを比較し、該値の有無又は／及び増減の程度を評価することにより、大腸癌の進行度、悪性度の診断、術後の予後診断等が可能である。即ち、（ｉ）値の増加が認められた場合、大腸癌へ病態が進行した（或いは大腸癌の悪性度が増した）、又は大腸癌への病態の進行の兆候が認められる（或いは大腸癌の悪性度が増す兆候が認められる）等の判定を下すことができ、（ｉｉ）値の減少が認められた場合、大腸癌の病態が改善した、又は大腸癌の病態の改善の兆候が認められる等の判定を下すことができる。
　尚、本発明に係る測定工程にて本発明のバイオマーカーを複数種測定した場合は、得られた複数の値を用いて上述の通りに本発明に係る判定工程を行えばよく、より正確度の高い判定が可能となる。
＜本発明の大腸癌の診断を補助するための試薬キット＞
　本発明の大腸癌の診断を行うための試薬キット（以下、本発明のキットと略記する場合がある）は、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖に親和性を有する物質を含むものである。
（１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式１で表される糖鎖、
（３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、上記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体成分９に存在する、上記式１で表される糖鎖。
　本発明のキットは、本発明のバイオマーカー、言い換えると、本発明のバイオマーカー（１）～（４）にそれぞれ親和性を有する物質を含むものである。
　尚、本発明のキットにおける、本発明のバイオマーカー及び大腸癌については、＜本発明のバイオマーカー＞及び＜本発明の補助方法＞にて説明した通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。
　上記親和性を有する物質とは、本発明のバイオマーカーにおける糖鎖やタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合するものであり、レクチン、抗体等が挙げられる。
　上記親和性を有する物質については、＜本発明の補助方法＞にて説明した通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。
　本発明のキットには、更に、通常この分野で用いられる試薬類、例えば、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のペプチド断片化用試薬、レクチンカラム等の濃縮用カラム、タンパク質抽出用溶媒、緩衝剤、洗浄剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤、試料を希釈するための液、レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相、標識物質で標識された二次抗体又は該二次抗体の断片、標識物質検出用試薬等であって、共存する試薬等の安定性を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度、ｐＨも通常この分野で用いられている範囲であればよい。
　上記レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相としては、磁性シリカ粒子等の磁性粒子、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、セラミック等の素材に、本発明のバイオマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）や糖鎖に特異的に結合する親和性を有する物質（レクチン、抗体又は該抗体の断片等）を固相化したものであれば何れでもよい。
　尚、上記レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相における素材については、自体公知の方法により製造されたものを用いても、市販のものを用いてもよい。例えば、自体公知の方法により上記磁性シリカ粒子等の磁性粒子を製造する場合、ＷＯ２０１２／１７３００２に記載の方法により製造することができる。
　上記標識物質で標識された二次抗体又はその抗体断片とは、上記固相化された親和性を有する物質（レクチン、抗体又は当該抗体の断片等）にそれぞれ結合する抗体又はその抗体断片である。
　尚、上記標識物質で標識された二次抗体又はその抗体断片における、標識物質及び標識物質を結合させる方法については、＜本発明の補助方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。
　上記標識物質検出用試薬とは、レクチン、抗体又は当該抗体の断片等の親和性を有する物質が標識物質で標識されている場合、標識物質で標識されたレクチン、抗体又は当該抗体の断片等の親和性を有する物質中の標識又は／及び上記標識された二次抗体又は当該二次抗体の断片中の標識を検出するものであり、テトラメチルベンジジン、オルトフェニレンジアミン等の吸光度測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール等の発光物質が挙げられ、４－ニトロフェニルフォスフェート等の吸光度測定用試薬、４－メチルウンベリフェリルフォスフェート等の蛍光基質等が挙げられる。
　更に、本発明のキットには、本発明の補助方法を行うための説明書等を含まれていてもよい。当該「説明書」とは、本発明の補助方法の特徴、原理、操作手順、判定手順等が文章又は／及び図表により実質的に記載されている本発明に係る試薬の取扱い説明書、添付文書、パンフレット（リーフレット）等を意味する。具体的には、例えば、（ｉ）本発明に係る測定工程の原理、操作手順等が記載されたもの、（ｉｉ）本発明に係る測定工程及び判定工程の原理、操作手順等が記載されたもの等が挙げられる。
　このように本発明のキットによれば、本発明の補助方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係る大腸癌の診断を補助するための装置＞
　本発明に係る大腸癌の診断を補助するための装置（以下、本発明に係る補助装置と略記する場合がある）は、少なくとも（１）測定部を備えている。更に、（２）判定部、（３）出力部及び（４）入力部を備えていてもよい。
　本発明に係る補助装置における（１）測定部は、試料中の上記本発明のバイオマーカー（１）～（４）から選ばれる糖鎖の量を測定するように構成されている。具体的には、例えば、本発明に係る測定工程にて用いられる各種質量分析計、免疫学的測定法に準じた方法に用いられる装置等の測定装置が挙げられる。
　尚、要すれば、（１）測定部では、測定された測定値に基づいて、上記本発明のバイオマーカー（１）～（４）の量を算出するように構成されていてもよい。
　本発明に係る補助装置における（２）判定部は、（１）測定部にて得られる結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定するように構成されている。
　本発明に係る補助装置における（３）出力部は、（１）測定部にて得られる結果又は／及び（２）判定部にて得られる結果を出力するよう構成されている。
　本発明に係る補助装置における（４）入力部は、操作する者の操作を受けて、（１）測定部へ、当該（１）測定部を作動させるための信号を送るよう構成されている。
　尚、上記本発明に係る補助装置の（１）測定部及び（２）判定部によりなされる測定、判定等については、＜本発明の補助方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。
　上記本発明に係る補助装置によれば、本発明の補助方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係る大腸癌を治療する方法＞
　本発明に係る大腸癌を治療する方法（以下、本発明に係る治療方法と略記する場合がある）は、被検動物由来の試料中の本発明のバイオマーカー（１）～（４）から選ばれる糖鎖の量を測定し、得られた測定結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定し、その判定結果に基づいて大腸癌のおそれがある又は大腸癌のおそれが高いと判定された患者に適切な治療を施すことによりなされる。
　尚、本発明に係る治療方法における試料、マーカー、測定、判定等については、＜本発明の補助方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。
　本発明に係る治療方法における適切な治療としては、具体的には、例えば、内視鏡治療、開腹手術、腹腔鏡手術等の外科療法、化学放射線療法等の放射線治療、オキサリプラチン（一般名）、イリノテカン（一般名）、フルオロウラシル（一般名）、ベバシズマブ（一般名）、ラムシルマブ（一般名）、アフリベルセプト（一般名）、セツキシマブ（一般名）、パニツムマブ（一般名）等の薬剤を投与することによりなされる薬物療法等が挙げられる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１．大腸癌マーカーの選別
［（１）検体（サンプル）］
　横浜市立大学センター病院及び横浜市立大学先端医科学研究センターバイオバンクより提供された、大腸癌患者由来の血清（１８検体）及び健常者由来の血清（２０検体）を検体（サンプル）として用いた。
［（２）糖ペプチドの調製］
　１２ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍｎ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＳＤＣ）、１２ｍＭ　Ｎ－ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ＬＳ）を含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）からなる消化バッファーを調製し、当該消化バッファー９０μＬと上記（１）の大腸癌患者由来の血清及び健常者由来の血清１０μＬとをそれぞれ混合した。次いで、メルカプトエタノール溶液を最終濃度１０ｍＭとなるようそれぞれ添加し、９５℃で５分間インキュベートすることにより、タンパク質を変性させた。次いで、最終濃度２０ｍＭとなるようａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＡＡ）溶液をそれぞれ添加し、２５℃で３０分間、暗所でインキュベートすることにより、システインをアルキル化させた。次いで、５μｇのＬｙｓ－Ｃを用いて３７℃で１時間インキュベートすることにより、タンパク質を消化した。次いで、１．５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む４００μＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でそれぞれ希釈した後、５μｇのトリプシンを用いて３７℃で１２時間インキュベートすることにより、タンパク質を更に消化した。次いで、５００μＬの酢酸エチルと１０μＬのギ酸をそれぞれ加えた後、３０秒間ボルテックスし、１４０００×ｇで５分間遠心した。その後、ＳＤＣとＬＣを含む上層（酢酸エチル層）を除去し、遠心エバポレーターで約３０μＬまで蒸発させることにより、糖ペプチドをそれぞれ調製した。
［（３）糖ペプチドの濃縮］
　上記（２）で調製した３８検体分（大腸癌患者：１８検体、健常者：２０検体）の各糖ペプチドを、下記手順によりそれぞれ濃縮した。
　即ち、先ず、１５ｍＬ遠心管内で、セルロース微結晶樹脂３００μＬを１０ｍＬの０．１％ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＦＡ）／９０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＣＮ）を用いて洗浄した。次いで、洗浄済の３００μＬセルロース微結晶樹脂、１０ｍｌの０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ及び８μＬの（２）で調製した各糖ペプチドをそれぞれ混合し、１ｒｐｍで６分間インキュベートした。次いで、各糖ペプチドを吸着させたセルロース微結晶樹脂を、１０ｍＬの０．１％ＴＦＡ／８０％ＡＣＮでそれぞれ４回洗浄した。次いで、各糖ペプチドを６００μＬの３０％ＡＣＮでそれぞれ２回洗浄し、上記セルロース微結晶性樹脂から各糖ペプチドをそれぞれ溶出させることにより、糖ペプチドをそれぞれ濃縮した。尚、濃縮後、微細なセルロース粒子を除去するために、１４０００×ｇで遠心分離し、遠心エバポレーターで蒸発させ、５０μＬの０．１％ギ酸／３％ＡＣＮでそれぞれ再溶解した
［（４）脱糖鎖ペプチドの調製］
　上記（３）で調製した濃縮糖ペプチド試料２５μＬを、糖鎖修飾部位の同定のために、ＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理にそれぞれ付した。即ち、上記試料に、２０μＬの１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をそれぞれ添加することで中和し、１ユニットのＰＮＧａｓｅ　Ｆとそれぞれ混合した。次いで、３７℃で１時間インキュベートした後、５μＬのＡＣＮと０．１％ギ酸で事前に洗浄した脱塩カラムにそれぞれロードした。５μＬの０．１％ギ酸でそれぞれ２回洗浄した後、５μＬの５０％ＡＣＮでそれぞれ溶出することにより、脱糖鎖ペプチドをそれぞれ調製した。尚、調製後、２０μＬの０．１％ギ酸でそれぞれ希釈し、使用するまでは－３０℃で保存した。
［（５）ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ｎａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による解析］
　上記（３）で調製した各濃縮糖ペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にてそれぞれ解析（分離／分析）した。
　具体的には、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅに接続したｎａｎｏＬＣ、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に各糖ペプチド１．６μＬを２００ｂａｒでナノボアトラップカラムにそれぞれ注入し、２０μＬの０．１％ギ酸でそれぞれ洗浄した。次いで、流量３００ｎＬ／分にて０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及び０．１％ギ酸／ＡＣＮの二元線形グラジエントでそれぞれ溶出することにより、糖ペプチドの量を測定した（０－１５０分：０％溶媒Ｂ－３５％溶媒Ｂ、１５０－１５５分：１００％溶媒Ｂ）。
　尚、ナノボアトラップカラムと分析カラムは、各分析の前に、それぞれ１２μＬ及び５μＬの０．１％ＦＡで初期化した。フルＭＳはｍ／ｚ３５０からｍ／ｚ２０００までＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　７００００でモニタリングし、プロダクトイオンスキャンはＤａｔａ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎにより取得した。上記測定におけるイオン化パラメーター及びＱ－ＥｘａｃｔｉｖｅのＤａｔａ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎパラメーターは、それぞれ下記の通りである。
＜イオン化パラメーター＞
ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ：１８００Ｖ
ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５０℃
Ｓ－ｌｅｎｓ　ＲＦ　ｌｅｖｅｌ：５０（単位なし）
　尚、オグジリラリガス及びシースガスは使用しなかった。また、健常者と大腸癌患者由来の血清サンプルの測定順序は、交絡因子の影響を避けるためにランダム化した。
＜Ｑ－ＥｘａｃｔｉｖｅのＤａｔａ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎパラメーター＞
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：１７５００
ＡＧＣ　ｔａｒｇｅｔ：１００００００
ｍａｘｉｍｕｍ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ：３５０ミリ秒
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｗｉｄｔｈ：３．０ｍ／ｚ
：ｓｔｅｐｐｅｄ　ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ：２５及び３５
　また、（４）で調製した各脱糖鎖糖ペプチド１．６　μＬを、上記と同一の条件にてそれぞれ解析（分離／分析）した。その後、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　１．４（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて脱糖鎖ペプチドにおける糖鎖結合部位をそれぞれ同定した。更に、上記同定情報を基に、糖ペプチドの構造をそれぞれ確認した。
［（６）結果］
　上記（１）～（５）により、下記表７に示す通り、アルファ１アンチトリプシン、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン、アルファ１アンチキモトリプシン及び補体成分９にそれぞれ由来する糖ペプチドＡ～Ｍが同定された。
　また、上記糖ペプチドＡ～Ｍのピーク面積値について、大腸癌患者（１８検体）の平均値及び健常者（２０検体）の平均値を表８及び図１～４にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　上記表７及び８、並びに図１より、アルファ１アンチトリプシンに由来する、（ｉ）式１’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＡ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１９３９３５８１８６．２２２２２、健常者平均ピーク面積値：３０６３３５０２９．７）、（ｉｉ）式１’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＢ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１０９９６７５５０３．７７７７８、健常者平均ピーク面積値：２４５３９５１９１．４）、（ｉｉｉ）式２’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＣ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１３２９７５９０７．４４４４４４、健常者平均ピーク面積値；１４０２７９３２．４５）及び（ｉｖ）式２’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＤ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１３８２６３８７３．０５５５５６、健常者平均ピーク面積値：２５９８５００５．７５）の発現量は、健常者と比較して、大腸癌患者において有意に増加していることが分かった。
　また、上記糖ペプチドＡにおける式１’’で表される糖鎖、糖ペプチドＢにおける式１’’’で表される糖鎖、糖ペプチドＣにおける式２’’で表される糖鎖及び糖ペプチドＤにおける式２’’’で表される糖鎖は、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より７０番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。
　上記表７及び８、並びに図２より、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに由来する、（ｉ）式１’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＥ（大腸癌患者平均ピーク面積値：３６２０４５４５．５５５５５５６、健常者平均ピーク面積値：２０３７２９７．６）、（ｉｉ）式１’’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＦ（大腸癌患者平均ピーク面積値：５３９９５６０９．７７７７７７８、健常者平均ピーク面積値：３４１５３３３．５５）、（ｉｉｉ）式１’’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＧ（大腸癌患者平均ピーク面積値：５３９９５６０９．７７７７７７８、健常者平均ピーク面積値：３４１５３３３．５５）及び（ｉｖ）式１’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＨ（大腸癌患者平均ピーク面積値：３８７３９０３６４．５５５５５６、健常者平均ピーク面積値：９２３５７２０５．６）の発現量は、健常者と比較して、大腸癌患者において有意に増加していることが分かった。
　また、上記糖ペプチドＥにおける１’’で表される糖鎖及び糖ペプチドＦにおける式１’’’’で表される糖鎖は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より７９番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。上記糖ペプチドＧにおける式１’’’’で表される糖鎖は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。上記糖ペプチドＨにおける式１’’’で表される糖鎖は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より２６９番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。
　上記表７及び８、並びに図３より、アルファ１アンチキモトリプシンに由来する、（ｉ）式２’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＩ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１６２９０３６６９．９４４４４４、健常者平均ピーク面積値：８８９９０４０．７５）、（ｉｉ）式２’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＪ（大腸癌患者平均ピーク面積値：２０６５１４５５０．４４４４４４、健常者平均ピーク面積値：１８９５２７３７．３５）、（ｉｉｉ）式１’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＫ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１３３２１１１０．３３３３３３３、健常者平均ピーク面積値：９１３０７７）及び（ｉｖ）式１’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＬ（大腸癌患者平均ピーク面積値：１４０９８４９７．３３３３３３３、健常者平均ピーク面積値：２２９０７７０．７）の発現量は、健常者と比較して、大腸癌患者において有意に増加していることが分かった。
　また、上記糖ペプチドＩにおける式２’’で表される糖鎖、糖ペプチドＪにおける式２’’’で表される糖鎖、糖ペプチドＫにおける式１’’で表される糖鎖及び糖ペプチドＬにおける式１’’’で表される糖鎖は、アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のＮ末端より９３番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。
　上記表７及び８、並びに図１より、補体成分９に由来する、（ｉ）式１’’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＭ（大腸癌患者平均ピーク面積値：７３３３５１２６７．６６６６６７、健常者平均ピーク面積値：２０２５５７１２１．８５）の発現量は、健常者と比較して、大腸癌患者において有意に増加していることが分かった。
　更に、上記糖ペプチドＡ～Ｍの発現量について、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線解析によりＡＵＣ値（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ：曲線面積値）を算出した。
　その結果を下記表９に示す。尚、ＡＵＣ値については、１に近づく程高い判定能があるとされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　上記表９より、上記糖ペプチドＡ～Ｍは、何れも良好なＡＵＣ値を示した。
　以上より、上記糖ペプチドＡ～Ｍを大腸癌のバイオマーカーとして用いることにより、被験者が大腸癌に罹患しているか否かを判定することができることが分かった。

Claims (9)

  1. 　下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を含む、大腸癌の診断を補助するためのバイオマーカー：
    （１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
    （３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001

    （式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

    （式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
  2. 　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、請求項１に記載のバイオマーカー：
    （１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のN末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のN末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
    （３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のN末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４－１）補体成分９のアミノ酸配列のN末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
  3. 　前記糖鎖が、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のN末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖である、請求項１に記載のバイオマーカー。
  4. 　被検動物由来の試料中の、下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖を測定し、得られた測定結果に基づいて被検動物が大腸癌に罹患しているか否かを判定する、大腸癌の診断を補助する方法：
    （１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
    （３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

    （式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004

    （式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
  5. 　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、請求項４に記載の方法：
    （１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のN末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のN末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
    （３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のN末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４－１）補体成分９のアミノ酸配列のN末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
  6. 　前記糖鎖が、アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のN末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖である、請求項４に記載の方法。
  7. 　前記試料が、全血、血清又は血漿である、請求項４に記載の方法。
  8. 　下記（１）～（４）から選ばれる糖鎖に親和性を有する物質を含む、大腸癌の診断を補助するための試薬キット：
    （１）アルファ１アンチトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式１で表される糖鎖、
    （３）アルファ１アンチキモトリプシンに存在する、下記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４）補体成分９に存在する、下記式１で表される糖鎖。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005

    （式１中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006

    （式２中、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立してＦｕｃ又はＨを表し、Ａ３、Ａ４及びＡ５はそれぞれ独立してＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ又はＨを表す）
  9. 　前記糖鎖が、下記（１－１）～（４－１）の何れか１つで表される糖鎖である、請求項８に記載の試薬キット：
    （１－１）アルファ１アンチトリプシンのアミノ酸配列のN末端より７０番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （２－１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のN末端より７９番目のアスパラギン残基、１８６番目のアスパラギン残基又は２６９番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖、
    （３－１）アルファ１アンチキモトリプシンのアミノ酸配列のN末端より９３番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１又は２で表される少なくとも１つの糖鎖、
    （４－１）補体成分９のアミノ酸配列のN末端より４１５番目のアスパラギン残基に結合している、前記式１で表される糖鎖。
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