WO2021090982A1 - 동애등에 유래 키토산의 제조방법 - Google Patents

동애등에 유래 키토산의 제조방법 Download PDF

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WO2021090982A1
WO2021090982A1 PCT/KR2019/015019 KR2019015019W WO2021090982A1 WO 2021090982 A1 WO2021090982 A1 WO 2021090982A1 KR 2019015019 W KR2019015019 W KR 2019015019W WO 2021090982 A1 WO2021090982 A1 WO 2021090982A1
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dongae
chitin
larvae
chitosan
genus
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PCT/KR2019/015019
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French (fr)
Inventor
김태훈
권민정
정병옥
이유석
Original Assignee
농업회사법인푸디웜주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing chitosan derived from Dongae et al., and more specifically, after undergoing pretreatment processes such as slaughter, pulverization and compression from larvae on Dongae et al., and then extracting chitin by a biological process, and deacetylating the chitosan. It relates to a method of manufacturing.
  • Chitin is a structure in which N-acetyl-D-glucosamine units are connected by beta bonds (1 ⁇ 4), and is the second most abundant polysaccharide on earth after cellulose.
  • Such chitin is a component that mainly constitutes the exoskeleton of crustaceans or insects, or part of the cell wall of fungi or bacteria.
  • chemical extraction methods for obtaining chitin by treating with hydrochloric acid solution and sodium hydroxide solution from crustaceans such as crabs and shrimps are mainstream. Achieved.
  • the chemical substances used in the above chemical extraction method are harmful to the environment and human body.
  • the protein removal process treated with sodium hydroxide solution requires a high temperature and consumes a lot of energy, and is recycled as a large amount of contaminated wastewater is discharged in the washing process. This has the disadvantage of being difficult and expensive.
  • the chemical extraction method of chitin there is a possibility that chitin may be denatured during the process, and thus the purity of chitin is deteriorated.
  • the present inventors while studying the process of biologically extracting chitin derived from insects, pretreatment processes such as special slaughter, pulverization and compression from larvae of Dongae et al., before performing biological processes such as enzyme hydrolysis or microbial fermentation. It was found that the purity of chitin as well as the degree of deacetylation in the process of conversion to chitosan can be increased, and the present invention has been completed.
  • the present invention was conceived in consideration of the above problems, and an object of the present invention is to extract chitin by a biological process after undergoing pretreatment such as slaughtering, crushing and pressing from larvae in Dongae, etc., and deacetylating it. It is intended to provide a method for producing chitosan with high purity and deacetylation.
  • the heating and drying process in the microwave is characterized in that it is carried out for 0.5 to 1 hour at 70 to 80 °C.
  • the pulverization and compression process is characterized in that the larva particles are adjusted to a size of 150 to 200 ⁇ m in Dongae, etc. using a pulverizer, and then compressed with a double screw compactor.
  • the enzyme used in the enzymatic hydrolysis process is characterized in that it is a single protease or a mixture of proteases.
  • the protease is characterized by at least one selected from the group consisting of aminopeptidase, metallocarboxypeptidase, serine endopeptidase, cysteine endopeptidase, aspartic acid endopeptidase, and metalloendopeptidase. do.
  • the enzymatic hydrolysis process is characterized in that it is performed for 5 to 10 hours at 35 to 40 °C in an acidic medium of pH 1.5 to 2.5.
  • the microorganism used in the microbial fermentation process is characterized in that it is a mixture of lactic acid-producing microorganisms and protease-producing microorganisms.
  • the lactic acid-producing microorganism is characterized in that it is a microorganism of the genus Lactobacillus or Saccharomyces.
  • the protease-producing microorganism is characterized in that it is a microorganism of the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Pseudomonas, the genus Streptomyces, the genus Brevibacterium, or the genus Micrococcus.
  • the microbial fermentation process is characterized in that it is carried out for 5 to 7 days at 30 ⁇ 40 °C.
  • the deacetylation reaction process is characterized in that it is carried out for 4 to 24 hours at 60 to 100 °C with a sodium hydroxide solution having a concentration of 20 to 70% by weight.
  • Chitin prepared according to the present invention may have a purity of 80%, preferably a purity of 85% or more.
  • chitin prepared according to the present invention may have a degree of deacetylation of 90%, preferably 95% or more.
  • chitosan prepared according to the present invention may be ⁇ , ⁇ , ⁇ chitosan, preferably ⁇ chitosan.
  • a method for producing chitosan having high purity and deacetylation degree by extracting chitin by a biological process and deacetylating it after undergoing pretreatment processes such as slaughtering, crushing and pressing from larvae to Dongae et al. is provided. can do.
  • 1 is a schematic process diagram showing step-by-step a method for producing chitosan from larvae of Dongae et al. according to the present invention.
  • the present invention comprises the steps of: I) slaughtering the larvae in Dongae, etc. while heating and drying in microwave while alive;
  • Dongae-deung is a generic term for insects belonging to the family (Stratiomyidae) of the order of the fly (Diptera) and (Stratiomyidae). About 1,500 species are known around the world, and in Korea, 14 species of 9 genera are reported. In particular, the larvae of Dongae et al. are carnivorous or herbivorous and live in various habitats (water, rotten organic matter, vegetables, etc.).
  • larvae of Dongae et al. are used in various fields such as feed additives, fertilizers, biodiesel, etc., because mass breeding and freezing storage are easy.
  • these larvae of Dongae et al. contain chitin components in their outer shells, and in recent years, research on the process of extracting chitin from the larvae of Dongae et al. has been actively conducted.
  • steps III) related to the process of extracting chitin and IV) related to the process of converting chitin to chitosan It will be described in detail for each step shown in the accompanying Figure 1 with respect to the method for producing chitosan derived from Dongae et al. including the steps sequentially.
  • the present invention is characterized in that the larvae are killed while heating and drying in a microwave while still alive.
  • the heating drying process in the microwave is preferably performed at 70 to 80° C. for 0.5 to 1 hour, and when the above conditions are out, some larvae may not be completely slaughtered or browning may occur.
  • the larvae are pulverized and compressed on the larvae slaughtered in step I).
  • This pulverization and compression process is characterized in that the larva particles are adjusted to a size of 150 to 200 ⁇ m in Dongae, etc. using a pulverizer, and then compressed with a double screw compactor.
  • the larvae on the slaughtered Dongae, etc. are adjusted to a size of 150 to 200 ⁇ m using a blade grinder, and a certain amount of water is added to facilitate pulverization. It is difficult to mechanically control the particles of larvae in Dongae et al. to a size of less than 150 ⁇ m using a grinder, and if the size exceeds 200 ⁇ m, the purity of chitin obtained from the chitin extraction process in step III) decreases, and IV) In the step of chitosan conversion process, the degree of deacetylation may not be high because the surface area is relatively small and the reactivity is low.
  • the compression process is carried out by compressing the pulverized wet larva particles with a double-screw compactor to increase the compression efficiency, thereby adjusting the oil content in the larvae to less than 10% by weight and the dry matter content to less than 30 to 50% by weight. You can get one squeezed cake.
  • the chitin component is extracted by enzymatic hydrolysis of the pressed cake of the larva on the pulverized and compressed copper ae.
  • the pressed cake is put into a reactor containing an enzyme together with water, and enzyme hydrolysis is performed for 4 to 8 hours at 40 to 60° C. in an atmosphere of pH 6.5 to 8.5.
  • the enzyme used in the enzymatic hydrolysis process may be a single protease, or may be a mixture of various proteases.
  • the protease is aminopeptidase, metallocarboxypeptidase, serine endopeptidase, cysteine endopeptidase, aspartic endopeptidase. ) And at least one selected from the group consisting of metalloendopeptidase.
  • the enzyme hydrolysis process may use an enzyme having an activity in an acidic medium.
  • Phosphoric acid as an acidic medium and pepsin as an enzyme are preferably used, and 5 to 40° C. in an acidic medium of pH 1.5 to 2.5 Run for 10 hours.
  • the microorganism used in the microbial fermentation process may be a mixture of a lactic acid-producing microorganism and a protease-producing microorganism.
  • the lactic acid-producing microorganism is preferably a microorganism of the genus Lactobacillus or Saccharomyces
  • the protease-producing microorganism is of the genus Bacillus, Pseudomonas, Pseudoalteromonas. It is preferably a microorganism of the genus, Streptomyces genus, Brevibacterium genus or Micrococcus genus.
  • the microbial fermentation process may be performed at 30 to 40° C. for 5 to 7 days to extract chitin from larvae such as Dongae.
  • Chitosan is obtained by deacetylating the chitin extracted from step III), and the deacetylation reaction is performed at 60 to 100°C for 4 to 24 hours with a sodium hydroxide solution having a concentration of 20 to 70% by weight.
  • chitosan having various molecular weight ranges such as high molecular weight chitosan having a number average molecular weight of 100,000 or more and low molecular weight chitosan having a number average molecular weight of 10,000 or less can be obtained.
  • the number average molecular weight is in the range of 1,000 to 5,000, which greatly improves water solubility and is applied to various fields. It can be used as possible material.
  • Chitosan obtained through the deacetylation process may be naturally dried or dried in a vacuum oven to prepare chitosan in powder form.
  • a vacuum oven it is not limited, but is preferably dried in a vacuum oven at 50 to 80° C. to prepare chitosan in the form of a powder.
  • the larvae of Dongae et al. were killed by heating and drying in microwave at 70°C for 0.5 hours while still alive.
  • the larvae were mixed with water on the slaughtered Dongae et al., and the larva particles were adjusted to a size of 170 ⁇ m using a grinder, and the pulverized wet larva particles were compressed with a double-screw press to obtain a compressed cake.
  • the pressed cake was put into a reactor containing an enzyme [papain: cysteine endopeptidase series] with water, and then subjected to enzymatic hydrolysis at 40° C. for 6 hours in an atmosphere of pH 8.0 to extract chitin.
  • Chitosan was obtained by deacetylating the extracted chitin with sodium hydroxide solution at a concentration of 30% by weight for 10 hours at 100° C., and dried naturally to prepare chitosan in the form of a powder.
  • Chitosan was prepared in the same manner as in Example 1, except that an enzyme having activity [pepsin] was used for 6 hours at 35°C in a phosphoric acid solution of pH 2.0 as an enzymatic hydrolysis process.
  • the pressurized cake according to Example 1 was introduced into a reactor containing a mixture of microorganisms of Lactobacillus genus and Pseudomonas genus, except that the microbial fermentation process was performed at 30° C. for 7 days. Chitosan was prepared in the same manner as in 1.
  • Chitosan was prepared in the same manner as in Example 1, except that the pretreatment process of the slaughtering, crushing, and pressing steps according to Example 1 was not performed.
  • Table 1 shows the purity and deacetylation of chitin prepared from Examples 1 to 3 and Comparative Examples.
  • the purity of chitin was calculated by weight measurement, that is, by measuring the mass of the insoluble sample before and after treating the insoluble portion with 1.25 mol/L sodium hydroxide solution at 90° C. for 1 hour.
  • the degree of deacetylation (%) of chitin was quantified by performing elemental analysis of the obtained chitosan, acid-base titration and infrared spectroscopy (FT-IR spectroscopy) in parallel.
  • chitosan prepared according to the present invention is expected to be a material that can be applied to various industrial fields such as bio-pharmaceuticals, food, agriculture, feed additives, etc.
  • chitosan according to the present invention has an ⁇ structure.

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Abstract

본 발명은 I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계; II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계; III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하는 단계; 및 IV) 상기 추출된 키틴을 탈아세틸화하여 키토산을 수득하는 단계;를 포함하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 동애등에 유충으로부터 도살, 분쇄 및 압착 등의 전처리 과정을 거친 후, 생물학적 공정에 의하여 키틴을 추출하고, 이를 탈아세틸화 함으로써 순도 및 탈아세틸화도가 높은 키토산을 제조할 수 있다. {대표도} 도 3

Description

동애등에 유래 키토산의 제조방법
본 발명은 동애등에 유래 키토산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동애등에 유충으로부터 도살, 분쇄 및 압착 등의 전처리 과정을 거친 후, 생물학적 공정에 의하여 키틴을 추출하고, 이를 탈아세틸화하여 키토산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
키틴은 N-아세틸-D-글루코사민 단위가 베타결합(1→4)으로 연결된 구조로서 셀룰로오스에 이어 지구상에서 2번째로 많은 다당류이다. 이러한 키틴은 주로 갑각류나 곤충의 외골격 또는 진균이나 세균 등의 세포벽 일부를 구성하는 성분인데, 전통적으로는 게, 새우 등의 갑각류로부터 염산 용액 및 수산화나트륨 용액으로 처리하여 키틴을 얻는 화학적 추출방법이 주류를 이루었다. 그러나 상기 화학적 추출방법에 사용되는 화학물질은 환경 및 인체에 유해한 것이고, 특히 수산화나트륨 용액으로 처리하는 단백질 제거 공정은 고온이 필요하여 에너지 소모가 많으며, 세척공정에서도 다량의 오염폐수를 배출함에 따라 재활용이 어려워 비용이 많이 드는 단점이 있다. 아울러 키틴의 화학적 추출방법에 의하면 그 공정 중에 키틴이 변성할 가능성이 존재하여 키틴의 순도가 떨어지는 문제점도 있다.
따라서 최근에는 상술한 키틴의 화학적 추출방법에 따른 문제점을 해소하고자 효소가수분해 또는 미생물 발효에 의한 생물학적 추출방법이 각광을 받고 있다. 게다가 곤충산업 시장이 크게 성장하고, 게, 새우 등의 갑각류에 의한 알러지 반응을 피하기 위하여 곤충 유충의 외피에서 유래한 키틴의 추출에 대하여 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.
그런데 곤충 유충의 외피에서 유래한 키틴의 생물학적 추출방법에 있어서도 키틴의 순도 및 키토산으로 전환하는 과정에서 탈아세틸화도에 영향을 미치는 전처리 공정에 대해서는 구체적으로 알려진바 없다.
그러므로 본 발명자 등은 곤충에서 유래한 키틴을 생물학적으로 추출하는 공정을 연구하는 중에, 효소가수분해 또는 미생물 발효와 같은 생물학적 공정을 수행하기 전에 동애등에의 유충으로부터 특별한 도살, 분쇄 및 압착 등의 전처리 과정을 거치면 키틴의 순도뿐만 아니라, 키토산으로 전환하는 과정에서 탈아세틸화도를 높일 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
{선행기술문헌}
[특허문헌]
공개특허공보 제10-2003-0013804호
공개특허공보 제10-2015-0113318호
공개특허공보 제10-2018-0069310호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 동애등에 유충으로부터 도살, 분쇄 및 압착 등의 전처리 과정을 거친 후, 생물학적 공정에 의하여 키틴을 추출하고, 이를 탈아세틸화하여 순도 및 탈아세틸화도가 높은 키토산을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은,
I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계;
II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계;
III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하는 단계; 및
IV) 상기 추출된 키틴을 탈아세틸화하여 키토산을 수득하는 단계;를 포함하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법을 제공한다.
상기 마이크로웨이브에서 가열건조 과정은 70~80℃로 0.5~1시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 분쇄 및 압착 과정은 분쇄기를 사용하여 동애등에 유충의 입자를 150~200 ㎛ 크기로 조절한 후, 이중 스크류 압착기로 압착하는 것을 특징으로 한다.
상기 효소가수분해 공정에 사용되는 효소는 단일 프로테아제 또는 프로테아제의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
상기 프로테아제는 아미노펩티다제, 메탈로카르복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트산 엔도펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 효소가수분해 공정은 pH 1.5~2.5의 산성 매질 하에서 35~40℃로 5~10시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 미생물 발효 공정에 사용되는 미생물은 젖산 생성 미생물 및 프로테아제 생성 미생물의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
상기 젖산 생성 미생물은 락토바실러스 속 또는 사카로마이세스 속 미생물인 것을 특징으로 한다.
상기 프로테아제 생성 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 슈도알테로모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 브레비박테리움 속 또는 마이크로코커스 속 미생물인 것을 특징으로 한다.
상기 미생물 발효 공정은 30~40℃로 5~7일 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 탈아세틸화 반응과정은 20~70 중량% 농도의 수산화나트륨 용액으로 60~100℃에서 4~24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 제조된 키틴은 순도 80%, 바람직하게는 순도 85% 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 키틴은 탈아세틸화도가 90%, 바람직하게는 95% 이상일 수 있다.
키틴의 순도 및 탈아세틸화도가 높아질수록 고품질의 키토산을 제조할 수 있으므로, 키틴의 순도 및 탈아세틸화도가 높을수록 바람직하다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 키토산은 α, β, γ 키토산일 수 있으나, 바람직하게는 α 키토산일 수 있다.
본 발명에 따르면, 동애등에 유충으로부터 도살, 분쇄 및 압착 등의 전처리 과정을 거친 후, 생물학적 공정에 의하여 키틴을 추출하고, 이를 탈아세틸화 함으로써 순도 및 탈아세틸화도가 높은 키토산을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 동애등에의 유충으로부터 키토산을 제조하는 방법을 단계별로 나타낸 개략적인 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 키틴의 XRD 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 키토산의 XRD 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 키토산의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계;
II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계;
III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하는 단계; 및
IV) 상기 추출된 키틴을 탈아세틸화하여 키토산을 수득하는 단계;를 포함하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법을 제공한다.
동애등에는 파리 목(Diptera) 동애등에 과(Stratiomyidae)에 속하는 곤충들을 총칭하는 것으로 전 세계적으로 약 1,500종이 알려져 있으며, 우리나라의 경우에는 9속 14종이 보고되어 있다. 특히, 동애등에의 유충은 육식 또는 초식성으로 다양한 서식지(물이나 썩은 유기물질, 야채 등)에 서식하고 있다.
또한, 동애등에의 유충은 대량사육과 냉동보관이 쉬워 사료 첨가제, 비료, 바이오디젤 등 다양한 분야에 응용되고 있다. 게다가 이러한 동애등에의 유충은 그 외피에 키틴 성분을 함유하고 있어 최근에는 동애등에의 유충으로부터 키틴을 추출하는 공정에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나 동애등에와 같은 곤충으로부터 키틴을 추출하는 방법으로서는 곤충을 염산 용액으로 처리하여 탈회를 비롯한 무기물 제거 과정 및 수산화나트륨 용액으로 처리하여 단백질을 제거하는 과정 등 전통적인 화학적 추출공정 위주로 공지되어 있다.
또한, 곤충으로부터 키틴을 추출할 수 있는 효소가수분해 또는 미생물 발효에 의한 생물학적 추출공정의 경우에도 대부분 효소가수분해 또는 미생물 발효 과정의 조건(농도, 온도, 시간 등)은 크게 다를 바 없이 효소 또는 미생물의 종류를 달리하여 키틴의 추출효과를 실험하는 것에 집중되어 있을 뿐, 추출한 키틴의 순도 및 그 키틴을 키토산으로 전환 시 중요한 인자인 탈아세틸화도에 영향을 미치는 곤충의 전처리 공정에 대해서는 구체적으로 알려진 바 없다.
아래에서는 본 발명에 따라 동에등애 유충을 전처리하는 공정에 관련된 상기 I) 단계 내지 II) 단계를 거친 후, 키틴을 추출하는 공정에 관련된 III) 단계 및 키틴을 키토산으로 전환하는 공정에 관련된 IV) 단계를 순차적으로 포함하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법에 대하여 첨부된 도 1에 나타낸 각 단계별로 상세히 서술한다.
I) 동애등에 유충의 도살 단계
본 발명에서는, 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 것을 기술적 특징으로 한다.
종래에는 곤충의 유충을 도살하기 위해서 주로 탕침 또는 블랜칭을 수행하였다. 그러나 탕침 또는 블랜칭을 수행하는데는 기본적으로 대량의 물과 100℃ 이상의 고온 및 별도의 건조과정이 필요하여 에너지 소모가 많고 경우에 따라서는 곤충의 갈변 현상이 나타날 우려가 있다.
따라서 본 발명에서는 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 간단한 공정으로 에너지 소모를 줄이고 갈변 현상을 방지할 수 있었다.
이때, 상기 마이크로웨이브에서 가열건조 과정은 70~80℃로 0.5~1시간 동안 수행하는 것이 바람직한바, 상기 조건을 벗어날 경우에는 일부 유충이 완벽하게 도살되지 않거나 갈변 현상이 발생할 수 있다.
II) 분쇄 및 압착 단계
상기 I) 단계에서 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착한다. 이러한 분쇄 및 압착 과정은 분쇄기를 사용하여 동애등에 유충의 입자를 150~200 ㎛ 크기로 조절한 후, 이중 스크류 압착기로 압착하는 것을 특징으로 한다.
먼저, 도살된 동애등에 유충을 칼날 분쇄기를 사용하여 유충의 입자를 150~200 ㎛ 크기로 조절하는데, 분쇄를 용이하게 하기 위하여 일정량의 물을 첨가한다. 동애등에 유충의 입자를 분쇄기를 사용하여 150 ㎛ 미만의 크기로 기계적으로 제어하는 것은 어렵고, 그 크기가 200 ㎛를 초과하는 경우에는 III) 단계의 키틴 추출공정으로부터 얻어지는 키틴의 순도가 떨어지고, IV) 단계의 키토산 전환공정 시 상대적으로 표면적이 작아 반응성이 낮기 때문에 탈아세틸화도가 높지 않을 수 있다.
또한, 압착과정은 상기 분쇄된 습윤 상태의 유충 입자를 이중-스크류 압착기로 압착하여 수행함으로써 압착효율을 높여 유충에 함유된 오일 함량을 10 중량% 미만, 건조물 함량을 30~50 중량% 미만으로 조절한 압착 케이크를 얻을 수 있다.
III) 키틴 추출 단계
상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충의 압착 케이크를 효소가수분해 함으로써 키틴 성분을 추출한다. 상기 압착 케이크를 물과 함께 효소가 포함된 반응기에 투입하여 pH 6.5~8.5 분위기 하에서 40~60℃로 4~8시간 동안 효소가수분해를 수행한다.
이때, 상기 효소가수분해 공정에 사용되는 효소는 단일 프로테아제(protease)일 수 있고, 또는 다양한 프로테아제의 혼합물일 수도 있다.
상기 프로테아제는 아미노펩티다제(aminopeptidase), 메탈로카르복시펩티다제(metallocarboxypeptidase), 세린 엔도펩티다제(serine endopeptidase), 시스테인 엔도펩티다제(cysteine endopeptidase), 아스파르트산 엔도펩티다제(aspartic endopeptidase) 및 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이 바람직하다.
또한, 상기 효소가수분해 공정은 산성 매질 하에서 활성을 갖는 효소를 사용할 수도 있는바, 산성 매질로서는 인산, 효소로서는 펩신을 바람직하게 사용하며, pH 1.5~2.5의 산성 매질 하에서 35~40℃로 5~10시간 동안 수행한다.
한편, 상기 효소가수분해 대신에 미생물 발효 공정에 의해서도 동애등에 유충으로부터 키틴을 추출할 수 있다.
상기 미생물 발효 공정에 사용되는 미생물은 젖산 생성 미생물 및 프로테아제 생성 미생물의 혼합물일 수 있다. 상기 젖산 생성 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 미생물인 것이 바람직하며, 상기 프로테아제 생성 미생물은 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 마이크로코커스(Micrococcus) 속 미생물인 것이 바람직하다.
상기 미생물 발효 공정은 30~40℃로 5~7일 동안 수행함으로써 동애등에 유충으로부터 키틴을 추출할 수 있다.
IV) 키틴을 키토산으로 전환하는 단계
상기 III) 단계로부터 추출된 키틴을 탈아세틸화함으로써 키토산을 수득하는바, 상기 탈아세틸화 반응과정은 20~70 중량% 농도의 수산화나트륨 용액으로 60~100℃에서 4~24시간 동안 수행한다. 또한, 상기 탈아세틸화 반응과정의 온도 및 시간을 조절함으로써 수평균분자량 10만 이상의 고분자량 키토산 및 수평균분자량 1만 이하의 저분자량 키토산 등 다양한 분자량 범위를 갖는 키토산을 얻을 수 있다. 특히, 30~50 중량% 농도의 수산화나트륨 용액으로 80~100℃에서 8~16시간 동안 탈아세틸화 반응을 수행하면 수평균분자량이 1,000~5,000 범위를 갖게 됨으로써 수용성이 크게 향상되어 다양한 분야에 응용 가능한 소재로 사용할 수 있다.
상기 탈아세틸화 공정을 거쳐 수득한 키토산은 자연건조 또는 진공 오븐에서 건조하여 분말 형상의 키토산을 제조할 수 있다. 진공오븐에서 건조할 경우, 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 50~80℃의 진공 오븐에서 건조하여 목적물인 분말 형상의 키토산을 제조한다.
이하에서는 본 발명에 따른 동애등에 유래 키토산의 제조방법에 대한 실시예 및 비교예를 구체적으로 서술한다.
< 실시예 1>
동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 70℃로 0.5시간 동안 가열건조하여 도살하였다. 상기 도살한 동애등에 유충을 물과 혼합하고 분쇄기를 사용하여 유충의 입자를 170 ㎛ 크기로 조절한 후, 상기 분쇄된 습윤 상태의 유충 입자를 이중-스크류 압착기로 압착하여 압착 케이크를 얻었다. 상기 압착 케이크를 물과 함께 효소[파파인(papain): 시스테인 엔도펩티다제 계열]가 포함된 반응기에 투입하여 pH 8.0 분위기 하에서 40℃로 6시간 동안 효소가수분해를 수행하여 키틴을 추출하였다. 상기 추출된 키틴을 30 중량% 농도의 수산화나트륨 용액으로 100℃에서 10시간 동안 탈아세틸화함으로써 키토산을 수득하였고, 이를 자연건조 시켜 목적물인 분말 형상의 키토산을 제조하였다.
< 실시예 2>
효소가수분해 공정으로서 pH 2.0의 인산 용액 하에서 활성을 갖는 효소[펩신(pepsin)]를 사용하여 35℃로 6시간 동안 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 키토산을 제조하였다.
< 실시예 3>
효소가수분해 공정 대신에, 실시예 1에 따른 압착 케이크를 락토바실러스 속 미생물 및 슈도모나스 속 미생물의 혼합물이 포함된 반응기에 투입하여 30℃로 7일 동안 미생물 발효 공정을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 키토산을 제조하였다.
< 비교예 >
실시예 1에 따른 도살, 분쇄 및 압착 단계의 전처리 공정을 수행하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 키토산을 제조하였다.
< 실험예1 > 본 발명의 키틴의 순도 및 탈아세틸화도 분석
하기 표 1에는 상기 실시예 1 내지 3 및 비교예로부터 제조된 키틴의 순도 및 탈아세틸화도를 나타내었다. 키틴의 순도는 중량 측정, 즉 불용 부분을 1.25 mol/L의 수산화나트륨 용액으로 90℃에서 1시간 동안 처리하기 전과 후에 불용 시료의 질량을 측정함으로써 계산하였다.
순도(%)=[(처리 후 불용 부분의 질량)/(처리 전 불용 부분의 질량)] x 100
또한, 키틴의 탈아세틸화도(%)는 수득한 키토산의 원소분석(Elemental analysis) 결과, 산-염기 적정법 및 적외선 분광 분석법(FT-IR spectroscopy)을 병행하여 정량하였다.
샘플 순도(%) 탈아세틸화도(%)
실시예 1 90 95
실시예 2 92 98
실시예 3 85 90
비교예 70 80
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 3으로부터 추출된 키틴은 순도가 비교예로부터 추출된 키틴에 비하여 현저하게 높은 것을 확인할 수 있고, 아울러 탈아세틸화도가 크게 높아져 고품질의 키토산을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
특히, 실시예 2에서처럼 산성 매질 하에서 활성을 갖는 효소를 사용하여 효소가수분해 공정을 수행함으로써 추출되는 키틴은 그 순도 및 탈아세틸화도가 가장 높은 것으로 확인되었다.
< 실험예2 > 본 발명의 키틴 및 키토산의 XRD 분석
상기 실시예에서 제조된 키틴 및 키토산 각가에 대해 XRD 분석을 진행하였고, 키틴의 XRD 분석 결과는 도 2에, 상기 키틴을 이용하여 제조된 키토산의 XRD 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
분석 결과, 본 발명에 따른 키틴(도 3의 빨간색 부분)이 거의 나타나있지 않으므로 본 발명에 따른 고순도의 키틴이 키토산으로 잘 전환되었음을 알 수 있다.
상기 실험예의 결과를 종합해보면 본 발명에 따라 제조된 키토산은 바이오·제약, 식품, 농업, 사료 첨가제 등 다양한 산업분야에 응용이 가능한 소재로 기대된다.
< 실험예3 > 본 발명의 키토산의 NMR 분석
본 발명에 따라 추출된 키토산의 구조적 특성을 분석하기 위해 NMR 분석을 하였고, 그 결과는 도 4에 도시하였다.
분석결과, 본 발명에 따른 키토산은 α 구조를 갖는 것을 확인하였다.

Claims (17)

  1. I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계;
    II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계;
    III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하는 단계; 및
    IV) 상기 추출된 키틴을 탈아세틸화하여 키토산을 수득하는 단계;
    를 포함하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로웨이브에서 가열건조 과정은 70~80℃로 0.5~1시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분쇄 및 압착 과정은 분쇄기를 사용하여 동애등에 유충의 입자를 150~200 ㎛ 크기로 조절한 후, 이중 스크류 압착기로 압착하는 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소가수분해 공정에 사용되는 효소는 단일 프로테아제 또는 프로테아제의 혼합물인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로테아제는 아미노펩티다제, 메탈로카르복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트산 엔도펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효소가수분해 공정은 pH 1.5~2.5의 산성 매질 하에서 35~40℃로 5~10시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물 발효 공정에 사용되는 미생물은 젖산 생성 미생물 및 프로테아제 생성 미생물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 젖산 생성 미생물은 락토바실러스 속 또는 사카로마이세스 속 미생물인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 프로테아제 생성 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 슈도알테로모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 브레비박테리움 속 또는 마이크로코커스 속 미생물인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미생물 발효 공정은 30~40℃로 5~7일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 탈아세틸화 반응과정은 20~70 중량% 농도의 수산화나트륨 용액으로 60~100℃에서 4~24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키토산의 제조방법.
  12. I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계;
    II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계;
    III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하는 단계; 및
    IV) 상기 추출된 키틴을 탈아세틸화하여 제조된 동애등에 유래 키토산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 키토산은 α 키토산인 것을 특징으로 하는 키토산.
  14. I) 동애등에 유충을 살아있는 채로 마이크로웨이브에서 가열건조하면서 도살하는 단계;
    II) 상기 도살된 동애등에 유충을 분쇄 및 압착하는 단계;
    III) 상기 분쇄 및 압착된 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 키틴을 추출하여 키틴을 수득하는 단계를 포함하는 동애등에 유래 키틴의 제조방법.
  15. 동애등에 유충으로부터 효소가수분해 또는 미생물 발효 공정에 의해서 추출된 키틴.
  16. 제15항에 있어서, 상기 키틴은 탈아세틸화도가 90% 이상인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키틴.
  17. 제15항에 있어서, 상기 키틴은 순도 85% 이상인 것을 특징으로 하는 동애등에 유래 키틴.
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