WO2021006268A1 - ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法 - Google Patents

ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法 Download PDF

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伸明 白木
辰也 矢野
俊宏 木方
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国立大学法人東京工業大学
第一三共株式会社
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing insulin-producing cells from pluripotent stem cells by three-dimensional culture.
  • Diabetes is a serious disease that develops against the background of various genetic factors and environmental factors, and as a result of chronic hyperglycemia causing complications such as nephropathy, the QOL of patients is significantly reduced.
  • the number of diabetic patients in the world exceeds 400 million, which is regarded as a problem in terms of medical economy.
  • Diabetes is broadly classified into type 1 and type 2 diabetes, and in any of the pathological conditions, the loss of pancreatic ⁇ -cells having an insulin secretory function is a major cause.
  • Insulin preparations are a common treatment for type 1 diabetes and serious type 2 diabetes with marked loss of pancreatic ⁇ cells, but side effects such as hypoglycemia and frequent self-injection are required. There are many problems such as being said.
  • pancreatic islet cells isolated from organ donors In recent years, it has become possible to transplant pancreatic islet cells isolated from organ donors to type 1 diabetic patients, and it is expected as a therapeutic method that can replace insulin treatment and enable complete remission of diabetes.
  • pancreatic islet cells isolated from organ donors since it is difficult to disseminate it due to the shortage of islet donors, it is desired to quickly realize a technique for producing a large amount of insulin-producing cells from pluripotent stem cells.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1, 2, 3, 4, 5
  • insulin-producing cells can be produced from human iPS cells through a stepwise 5-step differentiation step.
  • iPS cells are grown in a maintenance medium, and then in stage 1, they are cultured in a medium containing activin A or the GSK3 ⁇ inhibitor CHIR99201 for several days to induce Sox17-positive embryonic embryonic cells.
  • stage 2 germ layer cells in the embryo are treated with FGF10 and the sonic hedgehog inhibitor KAAD-cyclopamine for several days to induce Foxa2-positive primitive intestinal cells.
  • stage 3 primordial intestinal cells are treated with a medium containing retinoic acid, KAAD-cyclopamine, the TGF ⁇ receptor kinase inhibitor SB431542 and the BMP signal inhibitor Noggin for several days to induce differentiation into PDX1-positive pancreatic progenitor cells. ..
  • pancreatic progenitor cells are stimulated with protein kinase C activator Indractam V, TGF ⁇ receptor kinase inhibitor ALK5 inhibitor II, and Noggin to induce Ngn3-positive pancreatic endocrine progenitor cells.
  • insulin-producing cells are obtained by culturing pancreatic endocrine progenitor cells in a medium containing a GLP-1 receptor agonist or nicotine amide for several days.
  • the small molecule inhibitor LDN193189 may be used instead of Noggin used in the above-mentioned differentiation culture, and SANT-1 (Non-Patent Documents 2 and 6) and Dorsomorphin may be used instead of KAAD-cyclopamine (Non-Patent Document 5). .. Further, in the final step of differentiation culture, Forskolin or Dexamethasone may be used as a differentiation inducer (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 3 the AXL inhibitor R428 promotes the functional maturation of insulin-producing cells
  • AKT inhibitor AT7867 is a compound that promotes the proliferation of PDX-1 positive pancreatic progenitor cells.
  • An object of the present invention is to provide a means for achieving high efficiency of differentiation of stem cells into insulin-producing cells, which was difficult with conventional techniques.
  • the present inventors have found that the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has a remarkable effect of promoting the induction of differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells. , They found that these compounds or salts thereof were useful for the production of insulin-producing cells, and completed the present invention.
  • the compound represented by the general formula (I) has a novel structure completely different from that of known differentiation inducers, and is further added to known differentiation-promoting compounds and growth factors in the latter step of the differentiation process. It has the effect of increasing the efficiency of differentiation induction.
  • the present invention relates to [1] to [21] described below.
  • [1] A method for producing insulin-producing cells by differentiating pluripotent stem cells into insulin-producing cells, wherein the general formula (I)
  • each substituent is defined as follows.
  • R 1 Hydrogen atom, halogen atom, or C1-C6 alkyl group
  • R 2 Hydrogen atom, or C1-C6 alkyl group
  • R 3 Substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ It may be an aryl group, which is independently selected from the substituent group ⁇ . It is independently selected from a C5-C10 cycloalkoxy group which may be substituted with 1 to 4 substituents, or a substituent group ⁇ .
  • the carbamoyl group is substituted with a substituted C1-C6 alkoxy group, a sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, and 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ .
  • Benoxyl group substituents optionally substituted with ⁇ halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy).
  • each substituent is defined as follows. - and *: indicates a bond, - is attached to the nitrogen atom of the amide group of the general formula (I), * is attached to R 3 R 4: a hydrogen atom, C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl Group or (C1-C6 alkoxy) carbonyl group R 5 : hydrogen atom, halogen atom, or C1-C6 alkyl group Y: N or CH)]
  • a method for producing insulin-producing cells which comprises a step of three-dimensionally culturing cells in a medium containing the compound represented by (1) or a salt thereof.
  • R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C10 cycloalkenyl group, It is substituted with a phenyl group which may be substituted with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 1 or one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 1.
  • Substituent group ⁇ 1 Halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 Alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5 or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups C1-C6 alkoxy group, sulfamo
  • Phenyl group substituent group ⁇ 1 Halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group [3]
  • R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C10 cycloalkenyl group, It is substituted with a phenyl group which may be substituted with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 2, or with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 2.
  • Substituent group ⁇ 2 Halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 Alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5 or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, carbamo
  • R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C8 cycloalkene-1.
  • Substituent group ⁇ 3 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, halogeno C1-C2 alkyl group, halogeno C1-C2 alkoxy group, hydroxy C1-C4 Alkoxy group, C1-C2 alkoxy C1-C2 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C4 alkoxy group, morpholin- 1-yl group A carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups C1-C2 substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups Alkoxy group, sulfamoyl group substituted
  • Group ⁇ 3 Fluorine atom, chlorine atom, C1-C4 alkyl group, and C1-C4 alkoxy group
  • Substituent group ⁇ 3 Halogen atom, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, And (C1-C4 alkoxy) carbonyl group
  • R 1 in the compound represented by the general formula (I) is a hydrogen atom, a chlorine atom, or a methyl group. Law.
  • [6] The method for producing an insulin-producing cell according to any one of [1] to [5], wherein R 2 in the compound represented by the general formula (I) is a hydrogen atom or a methyl group.
  • a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (i)
  • R 4 is a hydrogen atom, C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl or (C1-C6,
  • R 4 is a hydrogen atom in the compound represented by formula (I), method of producing insulin-producing cells according to [7], which is a methyl group or a trifluoromethyl group.
  • a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (ii)
  • R 5 is characterized in that hydrogen atom, a halogen atom or a C1-C6 alkyl group, [1 ] To [6].
  • the method for producing insulin-producing cells according to any one of the following items.
  • a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (iii), characterized in that R 5 is a hydrogen atom, a fluorine atom or a methyl group, [1] - [ The method for producing insulin-producing cells according to any one of 6].
  • [12] The method for producing an insulin-producing cell according to any one of [1] to [6], wherein A in the compound represented by the general formula (I) is a group represented by the formula (iv). .. [13] The method for producing insulin-producing cells according to any one of [1] to [12], wherein n in the compound represented by the general formula (I) is 1.
  • R 3 is a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxoryl group, 1-tert-butoxycarbonyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-4-yl.
  • R 3 Independently selected from the group consisting of a group or a group consisting of a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group, and a phenoxy group.
  • R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a phenyl group or a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group and a benzyl. Any one of [1] to [13], which is a phenyl group whose m-position or p-position is substituted with any one substituent selected from the group consisting of an oxy group and a phenoxy group.
  • the differentiation process from pluripotent stem cells to insulin-producing cells includes the following steps 1 to 5, and is represented by the general formula (I) in at least one step selected from the group consisting of steps 3, 4, and 5.
  • Step 1 From pluripotent stem cells into the embryo body The process of inducing germ layer cells, Step 2: Inducing primitive intestinal cells from germ layer cells in the embryo. Step 3: Inducing pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells, Step 4: Induce pancreatic endocrine progenitor cells from pancreatic progenitor cells, and Step 5: Induce insulin-producing cells from pancreatic endocrine progenitor cells.
  • Step 1 From pluripotent stem cells into the embryo body The process of inducing germ layer cells, Step 2: Inducing primitive intestinal cells from germ layer cells in the embryo.
  • Step 3 Inducing pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells
  • Step 4 Induce pancreatic endocrine progenitor cells from pancreatic progenitor cells
  • Step 5 Induce insulin-producing cells from pancreatic endocrine progenitor cells.
  • a therapeutic agent for a disease caused by abnormal insulin secretion or deficiency of insulin secretion which comprises insulin-producing cells derived from pluripotent stem cells produced by the method according to any one of [1] to [21].
  • the therapeutic agent according to [23], wherein the disease caused by abnormal insulin secretion or insulin secretion deficiency is type 1 diabetes or type 2 diabetes.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has a remarkable effect in differentiating pluripotent stem cells derived from mammals into insulin-producing cells, as compared with known differentiation-inducing methods. Therefore, the method of the present invention using this compound can efficiently produce insulin-producing cells. Further, since the method of the present invention cultivates cells three-dimensionally, it is possible to cultivate cells in an environment closer to the living body as compared with the two-dimensional culturing method.
  • Ff-I01s01 was used and cultured under differentiation protocol # 2.
  • K-1 and its derivatives promote the differentiation of human iPS cell-derived ⁇ cells.
  • Halogen atom Fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, or iodine atom.
  • C1-C6 alkyl group A linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, or an isobutyl group.
  • Aryl group A monocyclic or bicyclic aromatic carbocycle having 6 to 10 carbon atoms, which may be condensed with a non-aromatic heterocycle or cycloalkane. Specifically, for example, a phenyl group, a naphthyl group, a tetralinyl group, an indanyl group, a chromanyl group, a 2,3-dihydrobenzofuranyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,3-dihydro-1, 4-Benzodioxynyl group, 1,2,3,4-tetrahydroquinolinyl group, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolinyl group, indolinyl group, or 3,4-dihydro-2H-1 , 4-benzoxazinyl group, etc.
  • C5-C10 cycloalkenyl group A hydrocarbon ring having one double bond in a ring having 5 to 10 carbon atoms, which may be crosslinked with an alkylene group.
  • cyclo examples thereof include a pentenyl group, a cyclohexenyl group, a cycloheptenyl group, a cyclooctenyl group, a bicyclo [2.2.1] heptenyl group, a bicyclo [2.2.2] octenyl group and the like.
  • Heterocyclyl group A group of 4 to 10-membered rings in which the atoms constituting the ring are composed of 1 to 4 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen and sulfur in addition to carbon, and are aromatic or aromatic. It may be non-aromatic, and in the case of non-aromatic, it may be crosslinked by an alkylene group.
  • non-aromatic heterocyclyl groups azetidinyl group, pyrrolidinyl group, piperidinyl group, azepanyl group, diazepanyl group, azocanyl group, piperazinyl group, homopiperazinyl group, morpholinyl group, oxazepanyl group, thiomorpholinyl group, thiazepanyl group, Tetrahydropyranyl group, tetrahydrofuryl group, dioxanyl group, dioxolanyl group, 2-azabicyclo [2.2.1] heptyl group, 2,5-diazabicyclo [2.2.1] heptyl group, 3-azabicyclo [3.2] .1] Octyl group, 8-azabicyclo [3.2.1] octyl group, 9-azabicyclo [3.3.1] nonyl group, 3,9-diazabicyclo [3.3.1] nonyl group
  • Aromatic heterocyclyl groups include frill group, pyrrolyl group, thienyl group, oxazolyl group, thiazolyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, oxadiazolyl group, thiadiazolyl group, triazolyl group, tetrazolyl group, pyridyl group, pyrazil group, pyrimidyl group and pyridadinyl group. , Triazinyl group, indrill group, isoindrill group, indazolyl group, prynyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, naphthyldinyl group and the like.
  • C1-C6 alkoxy group A group in which the C1-C6 alkyl group is bonded to an oxygen atom. Specifically, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, or an n-butoxy group. , Se-butoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group, pentyloxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, hexyloxy group, isohexyloxy group and the like.
  • Halogeno C1-C6 alkyl group A group in which the C1-C6 alkyl group is substituted with 1 to 7 halogen atoms. Specifically, for example, a trifluoromethyl group, a difluoromethyl group, 1,1-. It may be a difluoroethyl group, a 2,2-difluoroethyl group, or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
  • Halogeno C1-C6 alkoxy group A group in which the C1-C6 alkoxy group is substituted with 1 to 7 of the halogen atoms. Specifically, for example, a fluoromethoxy group, a difluoromethoxy group, or a dichloromethoxy group.
  • Dibromomethoxy group Dibromomethoxy group, trifluoromethoxy group, trichloromethoxy group, 2-fluoroethoxy group, 2-bromoethoxy group, 2-chloroethoxy group, 2-iodoethoxy group, 2,2-difluoroethoxy group, 2,2 2-Trifluoroethoxy group, 2,2,2-trichloroethoxy group, pentafluoroethoxy group, 3-fluoropropoxy group, 3-chloropropoxy group, 4-fluorobutoxy group, 5-fluoropentyloxy group, or 6- Fluorohexyloxy group and the like.
  • Hydroxy C1-C6 alkyl group A group in which one hydroxy group is substituted on the C1-C6 alkyl group. Specifically, for example, a hydroxymethyl group, a hydroxyethyl group, a hydroxypropyl group, or a hydroxybutyl group. , Hydroxypentyl group, or hydroxyhexyl group.
  • C1-C6 Alkoxy C1-C6 Alkoxy Group A group in which the C1-C6 alkoxy group is substituted with the C1-C6 alkoxy group. Specifically, for example, a methoxymethoxy group, a methoxyethoxy group, or a methoxypropoxy group. , Ethoxymethoxy group, ethoxyethoxy group, ethoxypropoxy group, propoxypropoxy group and the like.
  • (C1-C6 alkyl) carbonyl group A group in which the C1-C6 alkyl group is bonded to a carbonyl group, specifically, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, or the like. Can be mentioned.
  • (C1-C6 alkoxy) carbonyl group A group in which the C1-C6 alkoxy group is bonded to a carbonyl group. Specifically, for example, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, an n-propoxycarbonyl group, or an isopropoxy.
  • (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group A group in which the C1-C6 alkoxy group is bonded to a carbonyloxy group. Specifically, for example, a methoxycarbonyloxy group, an ethoxycarbonyloxy group, or an n-propoxycarbonyl.
  • Oxy group isopropoxycarbonyloxy group, n-butoxycarbonyloxy group, isobutoxycarbonyloxy group, sec-butoxycarbonyloxy group, tert-butoxycarbonyloxy group, n-pentyloxycarbonyloxy group, isopentyloxycarbonyloxy group , Neopentyloxycarbonyloxy group, n-hexyloxycarbonyloxy group, isohexyloxycarbonyloxy group and the like.
  • Phenyl C1-C6 alkoxy group A group in which a phenyl group is substituted at an arbitrary position of the C1-C6 alkoxy group. Specifically, for example, a benzyloxy group, a 1-phenylethyloxy group, or a 2-phenyl group. Ethyloxy group, 1-phenylpropyloxy group, 2-phenylpropyloxy group, 3-phenylpropyloxy group and the like can be mentioned.
  • Carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups A carbamoyl group or a group in which one or two of the C1-C6 alkyl groups are bonded to a carbamoyl group, specifically. Is, for example, a carbamoyl group, a methylcarbamoyl group, a dimethylcarbamoyl group, an ethylcarbamoyl group, a diethylcarbamoyl group, an ethylmethylcarbamoyl group, a propylcarbamoyl group, or a dipropylcarbamoyl group.
  • C1-C6 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups the C1-C6 alkoxy group substituted with the one or two C1-C6 alkyl groups.
  • the carbamoyl group may be substituted, and specifically, for example, carbamoylmethyloxy group, carbamoylethyloxy group, methylcarbamoylmethyloxy group, methylcarbamoylethyloxy group, dimethylcarbamoylmethyloxy group, dimethyl.
  • Carbamoyl ethyloxy group ethyl carbamoyl methyloxy group, ethyl carbamoyl ethyloxy group, diethyl carbamoyl methyloxy group, diethyl carbamoyl ethyloxy group, ethyl methyl carbamoyl methyl oxy group, ethyl methyl carbamoyl ethyl oxy group, propyl carbamoyl methyl oxy group, propyl Carbamoylethyloxy group, dipropylcarbamoylmethyloxy group, dipropylcarbamoylethyloxy group and the like.
  • “Sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups” A group in which one or two of the C1-C6 alkyl groups are bonded to a sulfamoyl group, specifically, for example, methyl sulfamoyl. Group, dimethylsulfamoyl group, ethylsulfamoyl group, ethylmethylsulfamoyl group, diethylsulfamoyl group, propylsulfamoyl group, dipropylsulfamoyl group and the like.
  • C1-C4 alkyl group A linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, specifically, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, or an isobutyl group. , The sec-butyl group, or the tert-butyl group.
  • C1-C4 alkoxy group A group in which the C1-C4 alkyl group is bonded to an oxygen atom. Specifically, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, or an n-butoxy group. , The sec-butoxy group, the isobutoxy group, or the tert-butoxy group.
  • C1-C2 alkyl group A linear alkyl group having 1 or 2 carbon atoms, which is a methyl group and an ethyl group.
  • Halogeno C1-C2 alkyl group A group in which the C1-C2 alkyl group is substituted with 1 to 5 halogen atoms. Specifically, for example, a trifluoromethyl group, a difluoromethyl group, 1,1-. It may be a difluoroethyl group, a 2,2-difluoroethyl group, or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
  • C1-C2 alkoxy group A group in which the C1-C2 alkyl group is bonded to an oxygen atom, specifically, a methoxy group and an ethoxy group.
  • Halogeno C1-C2 alkoxy group A group in which the C1-C2 alkoxy group is substituted with 1 to 5 of the halogen atoms. Specifically, for example, a fluoromethoxy group, a difluoromethoxy group, or a dichloromethoxy group.
  • Dibromomethoxy group Dibromomethoxy group, trifluoromethoxy group, trichloromethoxy group, 2-fluoroethoxy group, 2-bromoethoxy group, 2-chloroethoxy group, 2-iodoethoxy group, 2,2-difluoroethoxy group, 2,2 It is a 2-trifluoroethoxy group, a 2,2,2-trichloroethoxy group, a pentafluoroethoxy group, or the like.
  • HydroxyC1-C4 alkyl group A group in which one hydroxy group is substituted on the C1-C4 alkyl group. Specifically, for example, a hydroxymethyl group, a hydroxyethyl group, or a hydroxypropyl group or hydroxybutyl. Group and so on.
  • C1-C2 Alkoxy C1-C2 Alkoxy Group A group in which the C1-C2 alkoxy group is substituted with the C1-C2 alkoxy group. Specifically, for example, a methoxymethoxy group, a methoxyethoxy group, or an ethoxymethoxy group. , Or an ethoxyethoxy group.
  • (C1-C4 alkyl) carbonyl group A group in which the C1-C4 alkyl group is bonded to a carbonyl group, specifically, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, or the like. Can be mentioned.
  • (C1-C4 alkoxy) carbonyl group A group in which the C1-C4 alkoxy group is bonded to a carbonyl group. Specifically, for example, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, an n-propoxycarbonyl group, or an isopropoxy. Examples thereof include a carbonyl group, an n-butoxycarbonyl group, an isobutoxycarbonyl group, a sec-butoxycarbonyl group, a tert-butoxycarbonyl group and the like.
  • (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group A group in which the C1-C4 alkoxy group is bonded to a carbonyloxy group. Specifically, for example, a methoxycarbonyloxy group, an ethoxycarbonyloxy group, or an n-propoxycarbonyl. Examples thereof include an oxy group, an isopropoxycarbonyloxy group, an n-butoxycarbonyloxy group, an isobutoxycarbonyloxy group, a sec-butoxycarbonyloxy group, and a tert-butoxycarbonyloxy group.
  • Phenyl C1-C4 alkoxy group A group in which a phenyl group is substituted at an arbitrary position of the C1-C4 alkoxy group. Specifically, for example, a benzyloxy group, a 1-phenylethyloxy group, or a 2-phenyl group. Ethyloxy group, 1-phenylpropyloxy group, 2-phenylpropyloxy group, 3-phenylpropyloxy group and the like can be mentioned.
  • Carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups A carbamoyl group or a group in which one or two of the C1-C4 alkyl groups are bonded to a carbamoyl group, specifically. Is, for example, a carbamoyl group, a methylcarbamoyl group, a dimethylcarbamoyl group, an ethylcarbamoyl group, a diethylcarbamoyl group, an ethylmethylcarbamoyl group, a propylcarbamoyl group, or a dipropylcarbamoyl group.
  • C1-C2 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups the C1-C2 alkoxy group substituted with the one or two C1-C4 alkyl groups.
  • the carbamoyl group may be substituted, and specifically, for example, carbamoylmethyloxy group, carbamoylethyloxy group, methylcarbamoylmethyloxy group, methylcarbamoylethyloxy group, dimethylcarbamoylmethyloxy group, dimethyl.
  • Carbamoyl ethyloxy group ethyl carbamoyl methyloxy group, ethyl carbamoyl ethyloxy group, diethyl carbamoyl methyloxy group, diethyl carbamoyl ethyloxy group, ethyl methyl carbamoyl methyl oxy group, ethyl methyl carbamoyl ethyl oxy group, propyl carbamoyl methyl oxy group, propyl Carbamoylethyloxy group, dipropylcarbamoylmethyloxy group, dipropylcarbamoylethyloxy group and the like.
  • “Sulfamoyl group substituted with one or two C1-C4 alkyl groups” A group in which one or two of the C1-C4 alkyl groups are bonded to a sulfamoyl group, specifically, for example, methyl sulfamoyl. Group, dimethylsulfamoyl group, ethylsulfamoyl group, ethylmethylsulfamoyl group, diethylsulfamoyl group, propylsulfamoyl group, dipropylsulfamoyl group and the like.
  • “Stem cell” A cell having self-renewal ability and pluripotency, and examples thereof include ES cells, iPS cells, and adult stem cells.
  • Pluripotent stem cell A cell having the ability to differentiate into various cells in a living body, preferably an ES cell or an iPS cell.
  • Insulin-producing cells cells that secrete insulin in response to hyperglycemia, etc., and have superior insulin expression capacity compared to other pancreatic hormones such as glucagon or somatostatin.
  • Three-dimensional culture By culturing under conditions where cells do not adhere to the culture vessel, the cells are cultured in a sphere (also called “embryoid body” in pluripotent stem cells) formed by adhesion between cells. In this specification, it may be referred to as "sphere culture”.
  • the present invention is a method for producing insulin-producing cells by differentiating pluripotent stem cells into insulin-producing cells, in which the cells are three-dimensionally cultured in a medium containing the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof.
  • a method for producing an insulin-producing cell which comprises a step. The effect of promoting the differentiation of the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof into insulin-producing cells can be confirmed by the methods of Reference Example 1 and Example 1 described later.
  • various stem cells can be adopted as long as they have the ability to differentiate into endoblast cells, but are preferably ES cells or iPS cells, and more preferably iPS cells.
  • various mammals can be adopted, but preferably, pet animals such as humans, mice, rats, dogs and cats, cows, horses, pigs, sheep and the like. Domestic animals, more preferably humans.
  • stage 1 in which Sox17-positive embryonic embryo cells are induced from pluripotent stem cells
  • stage 2 in which Foxa2-positive primitive intestinal cells are induced from embryonic embryonic cells
  • PDX1-positive pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells.
  • Stage 3 is induced
  • stage 4 in which Ngn3-positive pancreatic endocrine progenitor cells are induced from pancreatic progenitor cells
  • stage 5 in which insulin-producing cells are finally induced from pancreatic endocrine progenitor cells.
  • stage 1 is further subdivided into the state of mesoendoderm cells, and then stage 1-2, in which endoderm cells are induced, and stage 2 is the concentration of zinc in the differentiation medium.
  • stage 2-1 and stage 2-2 may be further subdivided, and stage 5 may be further subdivided into stage 5-1 and stage 5-2 due to the difference in retinoic acid concentration in the differentiation medium.
  • the display of the differentiation stage of a cell may be indicated by these stages.
  • the medium used for these cultures is not particularly limited as long as it is a medium used for normal cell culture, and various media can be used.
  • DMEM medium ⁇ -MEM medium, RPMI medium, StemFit medium.
  • Essential8 ThermoFisher, A151001
  • TeSR1 TeSR1
  • NutriStem Step, 01-0005
  • CMRL ThermoFisser, etc.
  • Serum may be added to the medium, and serum substitutes such as KO-Serum and B-27 supplements can be added to the serum-free medium for use.
  • the medium contains saccharides such as glucose, antioxidants such as ⁇ -mercaptoethanol and vitamin C, various amino acids such as essential amino acids and non-essential amino acids (NEAA), and various metals such as Ca 2+ , Mg 2+ , and Zn 2+.
  • various culture aids used in normal cell culture such as an ion source and various growth factors such as EGF, FGF, KGF, and IGF, may be added.
  • methionine-removed or reduced medium uses pluripotent stem cells for short-term (eg, 1 hour, 5 hours, 10 hours, 24 hours, etc.) culture treatment to induce differentiation of the treated cells.
  • the medium in which the zinc ion concentration is reduced for example, 1 ⁇ M or less, preferably 0.5 ⁇ M or less
  • the medium in which the zinc ion concentration is reduced is used only in the first half of the differentiation culture step (for example, at least a part of stage 1 or stage 2, preferably.
  • the medium in which the concentration of such a specific component is adjusted can be prepared by not adding the desired component or reducing the amount of the desired component based on the information of the known medium composition. It is also possible to obtain a medium containing no desired component and add a specific component to a desired concentration.
  • the methionine-reducing or removing medium can be prepared based on, for example, WO2015 / 125662.
  • the AKM medium used as the zinc-removing medium in the examples was obtained from Ajinomoto Co., Inc. Bio-Fine Research Institute.
  • the differentiation stage progresses by culturing in a medium containing an additive for signal induction suitable for each stage.
  • the additives used for the medium of each stage are illustrated below. As such an additive, an appropriate type may be selected and used, or all the additives for the relevant stage may be used. In addition, additives for the front and rear stages may be used.
  • stage 1 at least one selected from the activation of activin receptor and Wnt signal is required, and the medium additive used is usually an activin receptor agonist (eg, activin A), activation of WNT signal.
  • Factors eg, Wnt proteins such as Wnt3A, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, CHIR990221), etc.
  • the culture period of stage 1 is 1 to 4 days, preferably 2 to 3 days.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor may be added throughout the period of stage 1 or may be added only to stage 1-1 and then in stage 1-2 a medium for stage 1 with reduced or no GSK3 ⁇ inhibitor may be used. ..
  • An example of a medium for stage 1 is a medium containing 10 to 1000 ng / mL (preferably 100 ng / mL) of activin A and / or 1 to 10 ⁇ M (preferably 3 ⁇ M) of CHIR99021.
  • stage 2 activation of the FGF receptor signal is required, and as an additive for the medium to be used, an FGF receptor agonist (for example, FGF10, KGF) or the like is usually used.
  • an FGF receptor agonist for example, FGF10, KGF
  • a sonic hedgehog inhibitor for example, KAAD-cyclopamine, SANT-l
  • the culture period of stage 2 is 1 to 7 days, preferably 2 to 6 days.
  • the sonic hedgehog inhibitor may be added throughout the stage 2 period or only in the first half of stage 2.
  • stage 2 medium is a medium containing 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of FGF10 or KGF and / or 0.05 to 5 ⁇ M (preferably 0.25 ⁇ M) of SANT1.
  • Stage 3 requires at least one selected from activation of retinoic acid receptor signal, inhibition of BMP receptor signal, inhibition of sonic hedgehog signal, and activation of FGF receptor signal, addition of the medium used.
  • the agents are usually retinoic acid receptor agonists (eg, retinoic acid), sonic hedgehog inhibitors (eg, KAAD-cyclopamine, SANT-l), BMP signal inhibitors (eg, Noggin, LDN193189), protein kinase C.
  • An activator eg, indactum V
  • a TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, SB431542 can also be used as an additive.
  • stage 3 media include 0.05 to 5 ⁇ M (preferably 0.15 ⁇ M) of SANT1, 0.1 to 10 ⁇ M (preferably 2 ⁇ M) of retinoic acid, and 0.01 to 1 ⁇ M (preferably 0.).
  • Stage 4 requires at least one selected from inhibition of BMP receptor signal, inhibition of sonic hedgehog signal, activation of FGF receptor signal, and activation of retinoic acid receptor signal, addition of the medium used.
  • a BMP signal inhibitor for example, Noggin, LDN193189
  • a sonic hedgehog inhibitor for example, SANT-l
  • a protein kinase C activator for example, indolactam V
  • a TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, ALK5 inhibitor II
  • the culture period of stage 4 is 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days.
  • Examples of media for stage 4 are 0.5-50 ⁇ M (preferably 5 ⁇ M) ALK5 inhibitor (Calbiochem, 616452), 0.01-10 ⁇ M (preferably 0.3 ⁇ M) Indlactam V, and 0. Medium containing at least one of 01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M) LDN193189, 0.05-5 ⁇ M (preferably 0.25 ⁇ M) SANT1, 0.01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M).
  • Retinoic acid 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of KGF or FGF10, and 10 to 1000 nMM (preferably 100 nM of LDN193189) containing at least one medium.
  • At stage 5 at least one selected from inhibition of TGF ⁇ receptor signal, inhibition of NOTCH signal, activation of thyroid hormone receptor signal, and activation of retinoic acid receptor signal is required and is an additive of the medium to be used.
  • TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, ALK5 inhibitor II
  • ⁇ -secretase inhibitor for example, DAPT
  • thyroid hormone T3, EGFR agonist for example, EGF
  • retinoic acid receptor agonist for example, for example.
  • Retinoic acid vitamin C and the like are used.
  • a GLP-1 receptor agonist for example, GLP-1 peptide, exendin-4, etc.
  • a nicotine amide for example, an adenylyl acid cyclase activator (for example, Forskolin), a glucocorticoid receptor agonist (for example, for example).
  • Dexamethasone can also be used.
  • the culture period of stage 5 is 5 to 20 days, preferably 7 to 15 days.
  • Examples of media for stage 5 are media containing 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of exendin 4 and / or 1 to 100 nM (preferably 10 mM) of nicotine amide, 0.5 to 100 ⁇ M (preferably 10 mM).
  • ALK5 inhibitor (Calbiochem, 616452) preferably 10 ⁇ M), retinoic acid 0.01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M), DAPT 1-100 ⁇ M (preferably 10 ⁇ M), 1-500 ng / mL (preferably 33).
  • the reduced retinoic acid concentration medium is preferably used in the latter half of stage 5.
  • the method for producing insulin-producing cells of the present invention includes a step of three-dimensionally culturing cells in a medium containing a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof.
  • a method usually used by those skilled in the art can be appropriately adopted, but a culture method using a low-adhesive or non-adhesive culture container, a stirring culture method, a hanging drop culture method, hydrogel or porous.
  • An example of a culture method using a sex scaffold can be used.
  • the bottom surface or side surface of a normal culture container may be coated with a polymer-based reagent or the like that inhibits cell adhesion, and the cell adhesion to the substrate is low.
  • a culture vessel in which the material is adopted.
  • Various shapes can be used for the container, but by using a container with a round bottom, sphere formation of cells can be promoted.
  • sphere formation can be promoted by culturing on a shaker. Stirring culture using a spinner flask or a culture reactor can also promote sphere formation and can be adapted to mass culture.
  • differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells is usually performed by three-dimensional culture over the entire process, but some steps (for example, pluripotent stem cells to endoplasmic reticulum).
  • steps for example, pluripotent stem cells to endoplasmic reticulum.
  • Inducing embryonic cells inducing primitive intestinal cells from embryonic embryonic cells, inducing pancreatic precursor cells from primitive intestinal cells, inducing pancreatic endocrine precursor cells from pancreatic precursor cells, or pancreatic endocrine precursor cells
  • Three-dimensional culture may be performed only in one or more steps of inducing insulin-producing cells from the cells. When 3D culture is adopted in some steps, it is desirable to be in the late stage of the differentiation process (for example, after primitive intestinal cells).
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may be added at least in at least a part of the steps in which the three-dimensional culture is adopted, and need not be added to all of them, and is not required for the three-dimensional culture. It does not prevent it from being added in the process (usually adhesive culture).
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is added to the insulin-producing cells in the process of differentiation into insulin-producing cells, for example, by being added to the three-dimensional culture step of the differentiation stage after the primitive intestinal cells. Differentiation can be significantly promoted.
  • the compound represented by the general formula (I) may be added at any step in the differentiation process from pluripotent stem cells to insulin-producing cells, but preferably, progenitor intestinal cells derived from pluripotent stem cells. It is added when culturing pancreatic progenitor cells and / or pancreatic endocrine progenitor cells. In the above differentiation stage, it corresponds to stage 3 to stage 5, and may be added to only one stage, two stages, or all three stages, but from stage 3 It is preferably added to all of Stage 5.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may be added in place of the above-mentioned additives for each stage, or may be additionally added.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof can be added to the medium as a solid compound as it is, in the form of powder, or dissolved in an organic solvent such as dimethylsulfoxide.
  • the amount of the addition is not particularly limited, but is set by those skilled in the art so that the differentiation progresses efficiently from pluripotent stem cells to insulin-producing cells.
  • the compound represented by the general formula (I) is 1 ng / mL-5 mg / mL, preferably 10 ng / mL-5 mg / mL, more preferably 50 ng / mL-5 mg / mL. Even more preferably, it is added so as to be present in 100 ng / mL to 1 mg / mL medium.
  • Examples of the method for producing insulin-producing cells of the present invention include the methods shown below, and specific examples thereof include protocol # 1 and protocol # 2 adopted in Example 1.
  • the medium used for each stage is exemplified, but not limited to, below.
  • Stage 1 Pluripotent stem cells (which may be pretreated) are cultured in a stage 1 medium which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof for 1 to 4 days. Induces germ layer cells in the embryo. Preferably, after culturing in the differentiation medium 1-1 or M1-1 AKM medium for 24 hours, the medium is replaced with the differentiation medium 1-2 or M1-2 AKM medium and cultured for 1 to 2 days.
  • Stage 2 The culture containing the germ layer cells in the embryo is cultured for 2 to 6 days in a medium for stage 2 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce primitive intestinal cells. ..
  • the cells are cultured in differentiation medium 2, M2 AKM medium or S2 medium for 2 to 3 days.
  • the cells are cultured in a stage 2 medium having a reduced zinc concentration (for example, M2 AKM medium) for 2 days, and then in a normal zinc concentration medium for stage 2 (for example, S2 medium, differentiation medium 2). Incubate for 2-3 days.
  • Stage 3 Cultures containing primitive intestinal cells are cultured for 2 to 8 days in a medium for stage 3 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce pancreatic progenitor cells.
  • the cells are cultured in differentiation medium 3 for 5 to 7 days or in S3 medium for 2 to 4 days.
  • Stage 4 Cultures containing pancreatic progenitor cells are cultured for 1 to 7 days in a medium for stage 4 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce pancreatic endocrine progenitor cells. .. Preferably, the cells are cultured in the differentiation medium 4 for 2 to 3 days, or in the S4 medium for 4 to 6 days.
  • Stage 5 A culture containing pancreatic endocrine progenitor cells is cultured for 5 to 20 days in a medium for stage 5 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce insulin-producing cells. .. Preferably, the cells are cultured in the differentiation medium 5 for 10 to 15 days.
  • the cells are cultured in a medium for stage 5 containing 0.1 ⁇ M or more of retinoic acid (for example, S5-1 medium) for 3 to 5 days, and then stage 5 containing a low concentration of retinoic acid of 0.05 ⁇ M or less. Incubate in medium (eg, S5-2 medium) for 2-4 days.
  • a medium for stage 5 containing 0.1 ⁇ M or more of retinoic acid for example, S5-1 medium
  • stage 5 containing a low concentration of retinoic acid of 0.05 ⁇ M or less Incubate in medium (eg, S5-2 medium) for 2-4 days.
  • the AKM medium is insulin and Zn 2+ depleted StemFit Basic 03 medium (Ajinomoto).
  • Differentiation medium 1-1 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021
  • Differentiation Medium 1-2 DMEM High Glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL Actibin A, B27 Supplement M1-1
  • AKM Medium 100 ng / mL Actibin A, 3 ⁇ M CHIR990221
  • M1-2 AKM medium AKM medium supplemented with 100 ng / mL activin A and supplemented with 100 ng / mL IGF1 and 0.5 ⁇ M Zn.
  • Differentiation medium 2 RPMI, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, B27 supplement without insulin, 50 ng / mL FGF10, 0.25 ⁇ M SANT1.
  • M2 AKM medium AKM medium supplemented with 50 ng / mL of FGF10 and 250 nM of SANT1 and supplemented with 0.5 ⁇ M of Zn.
  • S2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • Differentiation medium 3 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.15 ⁇ M SANT1, 2 ⁇ M retinoic acid, 0.1 ⁇ M LDN193189, B27 supplement.
  • S3 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 50 nM indactam V, 2 ⁇ M retinoic acid, 250 nM SANT1, and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • Differentiation Medium 4 DMEM High Glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 5 ⁇ M ALK5 Inhibitor (Calbiochem, 616452), 0.3 ⁇ M Indractam V, 0.1 ⁇ M LDN193189, B27 Supplement S4 medium: StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 100 nM retinoic acid, 250 nM SANT1, 44 ⁇ g / mL vitamin C, and 100 nM LDN193189.
  • Differentiation medium 5 KO DMEM / F12, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 50 ng / mL exendin 4 , 10 mM nicotinamide, 10 ⁇ M ZnSO 4 , 1 mM N-acetyl-L- Cysteine, B27 supplement.
  • S5-1 Medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 100 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3, 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • S5-2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 25 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3.
  • test compound and negative control 0.01% DMSO
  • NKX6 insulin, NKX6.
  • Immunocytochemical staining was performed on days 14 and 21 to confirm the positive effects of .1 and PDX1.
  • GSIS was conducted on the 21st day.
  • R 1 in the present invention is a hydrogen atom, a halogen atom, it can be mentioned C1-C6 alkyl group.
  • a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, or a methyl group is preferable, and a hydrogen atom, a chlorine atom, or a methyl group is more preferable.
  • Any position can be taken as the replacement position of R 1 , and (Ii) to (Iiii) shown below can be taken.
  • substituent R 2 in the present invention may be mentioned hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group. It is preferably a hydrogen atom or a C1-C2 alkyl group, and more preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • substituents optionally substituted aryl groups are independently selected from ⁇ substituent groups as substituents R 3 in the present invention, 1 to 4 independently selected from Substituent group ⁇
  • substituent groups as substituents R 3 in the present invention, 1 to 4 independently selected from Substituent group ⁇
  • Examples thereof include a C5-C10 cycloalkenyl group which may be substituted with a substituent of 1 to 4, or a heterocyclyl group which may be substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ . It is preferably selected independently from the naphthyl group, 1,3-benzodioxolyl group, 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, C5-C10 cycloalkenyl group and substituent group ⁇ 1.
  • 1,3-benzodioxolyl group 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, C5-C8 cycloalkene-1-yl group, substituent group ⁇ 3. It may be substituted with one or two substituents independently selected, or with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 35. Alternatively, it is a 6-membered ring heterocyclyl group, particularly a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, a 1-tert-butoxycarbonyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-4-yl group, or a fluorine.
  • a phenyl group which may be substituted with two substituents is preferable. More particularly preferably, it consists of a phenyl or fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group and a phenoxy group.
  • the respective substituent groups ⁇ to ⁇ are as follows.
  • the substituent group ⁇ in the present invention includes a halogen atom, a cyano group, a carboxy group, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 alkoxy group, a halogeno C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkoxy group, and a hydroxy C1-C6 alkyl group.
  • C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, non-aromatic heterocyclyl
  • Preferred substituent group ⁇ 1 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group A 5- or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups.
  • Harogeno C1-C6 Alkoxy Group Hydroxy C1-C6 Alkoxy Group, C1-C6 Alkoxy C1-C6 Alkoxy Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Oxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5- or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, one or two C1-C6 alkyl A C1-C6 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with a group, a sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, and one independently selected from the substituent group ⁇ 2.
  • substituent group ⁇ 3 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, halogeno C1-C2 alkyl group, halogeno C1-C2 alkoxy group.
  • Hydroxy C1-C4 alkyl group C1-C2 alkoxy C1-C2 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C4 An alkoxy group, a morpholin-1-yl group, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups, and a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups.
  • a good phenyl group particularly preferably a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group, or a phenoxy group. is there.
  • substituent group ⁇ in the present invention examples include a halogen atom, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 alkoxy group, a halogeno C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkoxy group, and a (C1-C6 alkoxy) carbonyl group. .. Preferred are substituent group ⁇ 1: halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, and more preferably substituent group ⁇ 2: halogen atom, C1-C6.
  • the substituent group ⁇ 3 a fluorine atom, a chlorine atom, a C1-C4 alkyl group, and a C1-C4 alkoxy group, and particularly preferably a methyl group or a methoxy group.
  • Substituent groups ⁇ in the present invention include substituent group ⁇ 2: halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group. .. Preferred are substituent group ⁇ 3: halogen atom, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, and (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, more preferably a fluorine atom. , Chlorine atom, methyl group, isobutoxy group, or tert-butoxycarbonyl group.
  • n in the present invention can be 0 or 1.
  • the compound represented by the general formula (I) has the following formula (II):
  • R 1 ⁇ R 3 represents the same meaning] It is a compound having a dihydroindridinong structure represented by.
  • ⁇ , *, R 4, R 5, and Y is a defined above] It is a group represented by.
  • R 1 to R 4 , and n have the same meaning as above] It is a compound represented by.
  • R 1 ⁇ R 3, R 5, n, and Y is a defined above] It is a compound represented by. Any position can be taken as the replacement position of R 5 , and (Vi) to (Viii) shown below can be taken.
  • R 1 ⁇ R 3, R 5, and n have the same meaning] It is a compound represented by. Any position can be taken as the replacement position of R 5 , and (VI-i) to (VI-iii) shown below can be taken.
  • R 1 to R 3 and n have the same meaning as above] It is a compound represented by.
  • Hydrogen atoms as substituents R 4 in the present invention C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl or (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, and the like. It is preferably a hydrogen atom, a C1-C4 alkyl group, or a halogeno C1-C2 alkyl group, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group, or a trifluoromethyl group.
  • substituent R 5 in the present invention is a hydrogen atom, a halogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • a hydrogen atom, a fluorine atom or a methyl group is preferable.
  • Examples of Y in the present invention include N or CH.
  • Y is N
  • (ii) in A represents a pyridine ring
  • (ii) in A represents a benzene ring.
  • the Y in (ii) of A is preferably CH.
  • the compound having the general formula (I) is preferably the compound described in the synthesis example, and more preferably the following compound.
  • Separation and analysis of each optical isomer from the racemic compound can be achieved by high performance liquid chromatography (HPLC) using a chiral column or the like. Identification of optical isomers by HPLC can be performed with reference to the retention time, but the retention time may be affected by column deterioration, reproducibility between devices, etc., so racemic compounds or optical isomers are preferable. This can be done by analyzing a mixture of body standard samples and analytical samples. Further, in the measurement of each optical isomer by HPLC, the order in which each optical isomer is eluted does not change under the same measurement conditions, so that it is relatively relative to the first peak having a relatively short retention time under specific conditions. It is possible that the second peak, which has a long retention time, characterizes the optical isomer.
  • salt What is "the salt”? When a compound has an acidic group or a basic group, it can be made into a “salt with a base” or an “acid addition salt” by reacting with a base or an acid. Is shown. When used for the purpose of treating warm-blooded animals (particularly humans), the salt is preferably a pharmaceutically acceptable salt. In addition, “the salt” and “the pharmaceutically acceptable salt” also include the hydrate thereof.
  • Preferred examples of the "salt with base" of the compound include alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts; N-methylmorpholin salts, Organic base salts such as triethylamine salt, tributylamine salt, diisopropylethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N-methylpiperidine salt, pyridine salt, 4-pyrrolidinopyridine salt, picolin salt, or glycine salt, lysine salt, arginine salt, Amino acid salts such as ornithine salts, glutamates, asparaginates, and more preferably alkali metal salts or alkaline earth metal salts.
  • alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts
  • alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts
  • N-methylmorpholin salts Organic base salts such as triethylamine
  • the "acid addition salt" of the compound include hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydrohalogenates such as hydroiodide, nitrates, perchlorates, Inorganic acid salts such as sulfates and phosphates; lower alkane sulfonates such as methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, benzene sulfonate, p-toluene sulfonate and the like.
  • Organic acid salts such as aryl sulfonate, acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, ascorbate, tartrate, oxalate, maleate; and glycine, lysine.
  • Amino acid salts such as salts, arginine salts, ornithine salts, glutamates, asparaginates, more preferably hydrohalogenates (particularly hydrochlorides).
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may absorb water and become adsorbed water or become a hydrate when left in the air or recrystallized.
  • the present invention also includes compounds of such various hydrates, solvates and crystalline polyforms.
  • the compound represented by the general formula (I) may have tautomers and geometric isomers depending on the type of substituent.
  • the compound represented by the general formula (I) may be described in only one form of the isomer, but the present invention also includes other isomers, and the isomers are separated. Also includes those, or mixtures thereof.
  • the compound represented by the general formula (I) may have an asymmetric carbon atom or an axial asymmetry, and an optical isomer based on this may exist.
  • the present invention also includes separated optical isomers or mixtures thereof.
  • isotope The compound represented by formula (I), the label body, i.e., one or more atoms isotope compounds (e.g., 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 35 S , etc.) was replaced with Compounds are also included.
  • the label body i.e., one or more atoms isotope compounds (e.g., 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 35 S , etc.) was replaced with Compounds are also included.
  • the present invention also includes pharmacologically acceptable prodrugs of the compounds represented by the general formula (I).
  • a pharmacologically acceptable prodrug is a compound having a group that can be converted to an amino group, a hydroxyl group, a carboxy group, or the like by solvolysis or under physiological conditions. Examples of the group forming the prodrug include Prog. The groups described in Med, 5, 2157-2161 (1985) can be mentioned.
  • the prodrug is a compound in which the amino group is acylated and phosphorylated (for example, the amino group is ecosanoidized, alanylated, or pentylaminocarbonyl).
  • the amino group is ecosanoidized, alanylated, or pentylaminocarbonyl.
  • a compound has a hydroxyl group
  • the hydroxyl group is acylated, alkylated, phosphorylated, or booxidized (for example, the hydroxyl group is acetylated, palmitoylated, propanoylated, pivaloylated, succinylated, or fumarylated. , Alanylated, dimethylaminomethylcarbonylated compounds, etc.) and the like.
  • the compound in which the carboxy group is esterified or amidated for example, the carboxy group is ethyl esterified, phenyl esterified, carboxymethyl esterified, dimethylaminomethyl esterified, pi Baroyloxymethyl esterification, ethoxycarbonyloxyethyl esterification, amidated or methylamided compounds, etc.
  • the carboxy group is ethyl esterified, phenyl esterified, carboxymethyl esterified, dimethylaminomethyl esterified, pi Baroyloxymethyl esterification, ethoxycarbonyloxyethyl esterification, amidated or methylamided compounds, etc.
  • the compounds represented by the general formula (I), their salts and their synthetic intermediates shall be produced by utilizing the characteristics based on the type of their basic skeleton or substituents and applying various known production methods. Can be done. As known methods, for example, “ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS”, 2nd edition, ACADEMIC PRESS, INC. , 1989, “Comprehensive Organic Transitions”, VCH Publicers Inc. , 1989, etc.
  • the compound represented by the general formula (I) and a salt thereof can be synthesized according to the methods A to C described below.
  • an appropriate protecting group a group that can be easily converted to the functional group
  • it may be effective in manufacturing technology to protect with.
  • protecting groups include the protecting groups described in Protective Groups in Organic Synthesis (3rd edition, 1999) by PGM Wuts and TW Greene. These reaction conditions may be appropriately selected and used.
  • the optimum protecting group for the synthetic route is appropriately set by those skilled in the art.
  • a desired compound can be obtained by introducing the protecting group, carrying out the reaction, and then removing the protecting group as necessary.
  • the prodrug of the compound represented by the general formula (I) introduces a specific group at the stage from the raw material to the intermediate, or further reacts using the obtained compound, as in the case of the above protecting group.
  • Can be manufactured by The reaction can be carried out by applying ordinary methods such as esterification, amidation and dehydration.
  • the compound represented by the general formula (I) can be produced by using a known method or an intermediate that can be synthesized by a modified method thereof.
  • an intermediate containing a group represented by the general formulas (ii) to (iv) corresponding to A can be produced by applying a known method or a modified method thereof using a commercially available raw material.
  • the compound obtained in each of the following steps A to C may be a salt formed together with the compound.
  • a salt formed together with the compound for example, hydrochloride or sulfate or the like, or sodium salt or potassium salt or the like can be mentioned.
  • solvent used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and partially dissolves the starting material.
  • Solvents include aliphatic hydrocarbons such as hexane, pentane, petroleum ether, cyclohexane; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; methylene chloride (methylene chloride), chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, Halogenized hydrocarbons such as chlorobenzene and dichlorobenzene; ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether; ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone and cyclohexanone; acetic acid Et
  • the acid used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, and is selected from the following acid group.
  • the acid group includes inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, phosphoric acid, sulfuric acid and nitrate, organic acids such as acetic acid, propionic acid, trifluoroacetic acid and pentafluoropropionic acid, and methane. It consists of organic sulfonic acids such as sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and camphorsulfonic acid.
  • the base used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, and is selected from the following base group.
  • the base group is an alkali metal carbonate such as lithium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate; an alkali metal hydrogen carbonate such as lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate; lithium hydroxide, sodium hydroxide.
  • Alkali metal hydroxides such as potassium hydroxide; alkaline earth metal hydroxides such as calcium hydroxide, barium hydroxide; alkali metal hydrides such as lithium hydride, sodium hydride, potassium hydride; Alkalimetal amides such as lithium amide, sodium amide, potassium amide; alkali metal alkoxides such as lithium methoxyd, sodium methoxyd, sodium ethoxydo, sodium tert-butoxide, potassium tert-butoxide; lithium such as lithium diisopropylamide Alkylamides; silylamides such as lithium bistrimethylsilylamide, sodium bistrimethylsilylamide; alkyllithiums such as n-butyllithium, sec-butyllithium, tert-butyllithium; methylmagnesium chloride, methylmagnesium bromide, methylmagnesium iodide Alkyl magnesium halides such as ethyl magnesium chloride, e
  • reaction temperature differs depending on the solvent, starting material, reagent, etc.
  • reaction time differs depending on the solvent, starting material, reagent, reaction temperature, etc.
  • the target compound of each step is isolated from the reaction mixture according to a conventional method.
  • the target compound is, for example, (i) leaking an insoluble matter such as a catalyst as necessary, and (ii) adding water and a solvent immiscible to water (for example, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate, etc.) to the reaction mixture.
  • a solvent immiscible to water for example, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate, etc.
  • the target compound is extracted, the (iii) organic layer is washed with water, dried with a desiccant such as anhydrous magnesium sulfate, and (iv) the solvent is distilled off.
  • the obtained target compound is further purified by a conventional method, for example, recrystallization, reprecipitation, distillation, column chromatography (including normal phase and reverse phase) using silica gel or alumina, if necessary. can do.
  • the obtained target compound can be identified by standard analytical techniques such as elemental analysis, NMR, mass spectrometry, and IR analysis, and its composition or purity can be analyzed.
  • the target compound in each step can be used as it is in the next reaction without purification.
  • the optical isomers are separated and purified by fractional recrystallization using an optically active amine such as (R) or (S) -phenethylamine, or separation using an optically active column. can do.
  • an optically active amine such as (R) or (S) -phenethylamine
  • Method A is a method for producing a compound (A2) that can be used as a synthetic intermediate when producing a compound represented by the general formula (I).
  • Compound (A2) can also be produced by a known method or a modified method thereof, in addition to the synthetic method exemplified in this method and Examples.
  • Step A-1 is a step of producing compound (A2) by allowing equal or excess amounts of a halogenating agent or bromotrimethylsilane and thiourea to act on compound (A1). is there.
  • a halogenating agent include chlorine and bromine.
  • the solvent for the reaction is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane, chloroform, ethanol, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, acetic acid and the like are used.
  • the reaction temperature is usually 0 to 100 ° C., and the reaction time is usually about 0.5 hours to 2 days.
  • Method B is a method for producing a compound (B3) that can be used as a synthetic intermediate when producing a compound represented by the general formula (I).
  • P 1 and P 2 in the figure below indicate a protecting group for an amino group or a hydrogen atom, and specific protecting groups include a Boc group (tert-butoxycarbonyl group), a Cbz group (benzyloxycarbonyl group), and a benzylidene group. , Or a diphenylmethylene group and the like.
  • P 1 is a benzylidene group or a diphenylmethylene group
  • P 2 shows the same protecting group as P 1 .
  • R 3 and A may have a protecting group on the substituents contained therein, and each step includes a step of protecting the substituent and removing the protecting group as necessary.
  • R 3 is synonymous with the above, X 1 is a halogen atom or a methanesulfonyloxy group, a leaving group such as a trifluoromethanesulfonyloxy group or a p-toluenesulfonyloxy group, and P 1 and P 2 are arbitrary protecting groups. Show]
  • Step B1 to the coupling reaction step B1 of the substituent X 1 on A compound (B1), the presence of a palladium catalyst, an equal amount or excess amount of acid or boronic acid ester (R 3 - Conditions using B (OH) 2 or R 3- B (OR) 2 , R indicates an arbitrary alkyl group) (Suzuki-Miyaura coupling); Conditions using an organic tin reagent (R 3- SnR 3 ) (Stille coupling); or an organic zinc reagent (R 3 -ZnX; by X conditions using a halogen atom) (Negishi coupling) or the like, is a step of obtaining compound by performing the introduction of a substituent R 3 and (B2) ..
  • a base can be added in the above reaction.
  • the palladium catalyst include tetrakis (triphenylphosphine) palladium, [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] palladium (II) dichloride dichloromethane complex (1: 1), and chloro (2-dicyclohexylphosphino-2').
  • Organic bases such as potassium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, potassium phosphate, or inorganic bases such as sodium phosphate can be mentioned.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but methanol, ethanol, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, 1,4-dioxane, water, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, benzene, toluene. , Xylene, or a mixture thereof and the like.
  • the reaction temperature is usually about 20 to 150 ° C.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 2 days.
  • this coupling reaction see A. Meijere and F.M. It can be performed according to the method described in "Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions (2nd edition, 2004)" by Diederich.
  • Step B2 deprotection step B2 is a step for preparing a compound compound by removing the protecting groups P 1 and P 2 in (B2) (B3). It can be carried out for removing the protective group in R 3, if necessary in the present step.
  • the reaction conditions vary depending on the kind of the protecting group P 1 and P 2 is, for example, T. W. Greene and P.M. G. It can be carried out according to the method described in "Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Edition, 1999)" by Wuts.
  • Method C is a method for producing a compound represented by the general formula (I) from a compound (C1) that can be synthesized by using a known method or a modified method thereof.
  • R 1 to R 3 , n, A and X 1 are synonymous with the above, X 2 is a halogen atom, and P 3 is an arbitrary protecting group].
  • Step C1 alkylation reaction step C1 introduces a substituent R 2 eq or excess amount of alkylating agent presence to the compound (C1), by treatment with a base, compound (C2 ) Is the process of manufacturing.
  • a base compound (C2 )
  • the alkylating agent an alkyl halide, an alkyl methanesulfonic acid ester, an alkyl p-toluenesulfonic acid ester or the like can be used.
  • the base include potassium hexamethyldisilazide and sodium hexamethyldisilazide.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but tetrahydrofuran is preferable.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 78 to 0 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 24 hours.
  • Step C-2 Halogenation and Alkylation
  • the compound (C1) is halogenated with an equal amount or an excess amount of a halogenating agent, and then alkylated to obtain a compound (step C-2).
  • the order of halogenation and alkylation can be changed as appropriate.
  • the halogenating agent include N-bromosuccinimide and N-iodosuccinimide.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane and dimethylformamide are preferable.
  • the reaction temperature is usually about 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 24 hours. Alkylation can be carried out in the same manner as in step C-1.
  • Step C-3 is a step of carrying out a coupling reaction with compound (C3) to produce compound (C4). It can be carried out in the same manner as in step B-1.
  • Step C-4 is a step of subjecting compound (C2) or compound (C5) to halogenation or a coupling reaction following halogenation to obtain compound (C4) or a compound represented by the general formula (I). is there.
  • Halogenation can be carried out in the same manner as in step C-2, and the coupling reaction can be carried out in the same manner as in step B-1.
  • Step C-5 Condensation reaction
  • the protective group of the carboxy group of the compound (C2) or the compound (C4) is removed to obtain a carboxylic acid, and then the compound (A2) of the method A or the method B is used.
  • This is a step of producing a compound represented by the compound (C5) or the general formula (I) by performing condensation using the compound (B3) of the above in an equal amount or an excess amount.
  • Deprotection of the carboxy group is carried out by T.I. W. Greene and P.M. G. It can be carried out according to the method described in "Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Edition, 1999)" by Wuts.
  • the condensation reaction is carried out by allowing an appropriate sulfonylating agent or an appropriate condensing agent to act on the compound (C2) and the carboxylic acid obtained from the compound (C4) in the presence of a base.
  • an appropriate sulfonylating agent or an appropriate condensing agent to act on the compound (C2) and the carboxylic acid obtained from the compound (C4) in the presence of a base.
  • additives that accelerate the reaction can be added as needed.
  • the sulfonylating agent include 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride, p-toluenesulfonyl chloride, benzenesulfonyl chloride and the like.
  • condensing agent examples include WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), and DMT-MM (4- (4,6-dimethoxy-1,3).
  • WSC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3).
  • 5-Triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride examples include CDI (1,1'-carbonyldiimidazole), DEPC (diethylphosphorusianidate), DPPA (diphenylphosphoryl azide) and the like. ..
  • Examples of the base include aromatic amines such as pyridine and rutidin, and tertiary amines such as triethylamine, N, N-diisopropylethylamine and DMAP (4-dimethylaminopyridine).
  • Typical examples of additives are HOAt (3H- [1,2,3] triazolo [4,5-b] pyridin-3-ol), HOBt (1H-benzotriazole-1-ol), HOSu (N). -Hydroxysuccinimide) and the like.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane and N, N-dimethylformamide are preferable.
  • the reaction temperature is usually 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 24 hours.
  • Step (C-6) is a step of removing the protecting group of the carboxy group of the compound (C4) and then condensing it with an amine derivative to produce the compound (C6).
  • the same method as in step (C-5) can be used.
  • Step C-7 Coupling reaction Step (C-7) is a step of performing a coupling reaction with compound (C6) to produce a compound represented by the general formula (I). It can be carried out by using the same method as in step (B-1).
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are useful for the treatment of diabetes because they exhibit functions similar to those of living pancreatic ⁇ cells.
  • the cells produced by the production method of the present invention have a characteristic that the amount of insulin secreted is small when the sugar level in the surrounding environment is low, and the amount of insulin secreted is increased in an environment where the sugar level is high. Has. Therefore, the cells produced by the production method of the present invention provide a highly safe therapeutic method with a low risk of hypoglycemia.
  • the cells are the target cells by evaluating the expression of pancreatic ⁇ -cell marker genes (eg, insulin, NKX6.1, PDX1, etc.) at the mRNA level or protein level in the cells prepared by the method of the present invention. be able to.
  • pancreatic ⁇ -cell marker genes eg, insulin, NKX6.1, PDX1, etc.
  • the insulin secretory capacity of the cells produced by the method of the present invention can be evaluated by the time-dependent GSIS activity measurement described in the method (6) of Example 1 below.
  • the cells produced by the method of the present invention have the property of exhibiting rapid phase 1 insulin secretion and / or long-lasting phase 2 insulin secretion in time-dependent GSIS activity measurements.
  • the cells produced by the method of the present invention are insulin in response to stimulation by an insulin secretagogue (eg, SU agent such as glybenclamide, GLP-1 receptor agonist such as exendin 4, KCl, etc.). It has properties such as enhanced secretion and enhanced c-peptide secretion.
  • an insulin secretagogue eg, SU agent such as glybenclamide, GLP-1 receptor agonist such as exendin 4, KCl, etc.
  • NKX6.1 which indicates functional maturation
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are considered to be cells with enhanced functional maturation as pancreatic ⁇ cells, and are clearly different from known pluripotent stem cell-derived insulin-producing cells. The cells that are distinguished.
  • the target of treatment with such insulin-producing cells is a patient with a disease caused by abnormal insulin secretion or deficiency of insulin secretion in pancreatic ⁇ cells, and specifically, a patient with type 1 diabetes or type 2 diabetes is exemplified.
  • the cells produced by the method of the present invention may be transplanted as aggregates (spheres) formed by three-dimensional culture, or may be transplanted as dispersed cells. In addition, once dispersed cells can be processed into reaggregated aggregates or sheets and transplanted.
  • the nuclear magnetic resonance (hereinafter, 1 H NMR) spectrum is described with a chemical shift value of ⁇ value (ppm) using tetramethylsilane as a standard substance.
  • the split pattern is indicated by s for the single line, d for the double line, t for the triple line, q for the quadruple line, m for the multiple line, and br for the broad line.
  • Mass spectrometry (hereinafter referred to as MS) was performed by an EI (Electrospray Ionization) method, an ESI (Electrospray Ionization) method, or a FAB (Fast Atom Bombardment) method.
  • Reference synthesis example 12 5- (1,3-Benzodioxole-5-yl) Thiazole-2-amine Results according to the method of Reference Synthesis Example 10 using commercially available 1,3-benzodioxole-5-ylboronic acid. After obtaining the body, 123 mg (31%, 2 steps) of the title compound was obtained as a solid according to the method of Reference Synthesis Example 11.
  • reaction mixture was concentrated under reduced pressure, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and the mixture was extracted with dichloromethane.
  • Reference synthesis example 18 2-Bromo-8-oxo-N- [5- [4- (trifluoromethoxy) phenyl] thiazole-2-yl] -6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide Obtained in Reference Synthesis Example 17 1N aqueous sodium hydroxide solution (0) in ethanol (2 mL) solution of methyl 2-bromo-8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide (56.9 mg, 0.209 mmol). .5 mL, 0.50 mmol) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hours.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound (48 mg, optical purity 99.9% ee) as a solid.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound (48 mg, optical purity 99.8% ee) as a solid.
  • Synthesis example 75 N- [4- [4- (difluoromethoxy) phenyl] phenyl] -8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide
  • Synthesis example 82 8-oxo-N- [5- [4- (trifluoromethoxy) phenyl] -2-pyridyl] -6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide
  • Reference Synthesis Example 7 N- ( Synthesis Example 11 using 5-bromo-2-pyridyl) -8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide and commercially available [4- (trifluoromethoxy) phenyl] boronic acid. According to the method, 4.0 mg (yield 17%) of the title compound was obtained.
  • the table below shows the structural formulas and physicochemical data of the reference synthesis examples and the compounds synthesized in the synthesis examples.
  • the compound of Synthesis Example 1 was used as a positive control, and dimethyl sulfoxide (DMSO) (SIGMA, D2650) having a final concentration of 0.1% was used as a compound-free control. All compounds were dissolved in DMSO and two compound solutions were prepared so that the final concentrations of the compounds after addition to the medium were 2 ⁇ M and 10 ⁇ M. In the following evaluation, the compound solution was added to the medium to a final concentration of DMSO of 0.1%.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Non-Patent Document 6 the human iPS cell Toe strain (Pharmaceutical Infrastructure Research Institute) was replaced with cells (differentiation medium C) on day 7 of culture. after 2 days until (cell differentiation processes from FOXA2 positive primitive intestinal cells to PDX1-positive pancreatic progenitor cells) induced, the cells were harvested, bang-bang car liquid at 1x10 7 cells / mL / tube using a (Japan Genetics) The cells were stored in nitrogen to prepare cell stocks for evaluation.
  • the cell stocks were lysed, and differentiation medium C (DMEM high glucos (Life technologies, 11965092), 0.25 ⁇ M SANT-1 for stage 3) was prepared.
  • DMEM high glucos (Life technologies, 11965092), 0.25 ⁇ M SANT-1 for stage 3) was prepared.
  • 0.1 ⁇ M LDN193189 (Stemgent, 04-0074), 10 ⁇ M SB431542, 2 ⁇ M Retinoic acid (Stemgent, 04-0021), 1% B27 serum free supplement (Life technology), after suspension in IIC, 17504044.
  • # 5656 96-well plates coated with (Corning, after # 3340 1x10 5 were cells / well seeded in a).
  • Differentiation medium E for stage 5 GLP-1 receptor agonist and nicotine amide-free; Knockout DMEM / F-20 (Life technologies, 12660012), 1% B27 cellum free), to which only the compound or DMSO was added. (Supplement) was added at 200 ⁇ L / well. After culturing for 2 days, the medium. Was removed, 150 ⁇ L / well of 4% paraformaldehyde phosphate buffer (Wako, 163-20145) was added, and the cells were fixed at room temperature for 30 to 60 minutes.
  • PBS phosphate buffer
  • T9181 phosphate buffer
  • T9183 PBS-T
  • Blocking was performed at room temperature for 1 hour using 20% Blocking One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan) diluted with.
  • 50 ⁇ L / well of guinea pig anti-insulin antibody (abcam, ab7842) diluted 200-fold with 20% Blocking One was added and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • Alexa Fluor 548-labeled anti-guinea antibody (Life Technologies, A11075) and 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Roche Diagnostics, Basel) diluted 1000-fold with 20% Blocking One after washing 3 times with PBS-T. Switzerland) was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing with PBS-T three times, fluorescence images of cells were analyzed.
  • the increase in the insulin-positive cell rate at each concentration of each compound was converted into a percentage (%) and used as the activity value.
  • the primary evaluation of the compounds was performed using multiple wells at two concentrations of 2 ⁇ M and 10 ⁇ M for each compound, including positive controls.
  • the activity intensity was determined by comparing the sum of the activity values at both concentrations with the positive control. The sum of the activity values at both concentrations was clearly higher than that of the compound untreated control, but it was described as + when it was lower than the positive control, ++ when it was equivalent to the positive control, and +++ when it was higher than the positive control. ..
  • Example 1 (A) Results (1) Screening of novel ⁇ -cell differentiation inducers As previously reported (Sakano et al., 2014; Shiraki et al., 2008), it carries a GFP reporter gene driven by the Pdx1 promoter. Mouse ES cell line SK7 was used to establish an assay system for screening small molecule compounds that enhance ⁇ -cell differentiation. After a primary screening campaign with approximately 55,000 compounds followed by an iterative assay to confirm efficacy reproducibility and dose dependence, hit compound K-1 (compound synthesized in Synthesis Example 1) It was discovered as a novel compound that enhances ⁇ -cell differentiation (Fig. 1).
  • K-1 increased the ratio of Pdx1-GFP + insulin + double positive cells and the expression of insulin 1 in a dose-dependent manner. K-1 further enhanced the increase in Pdx1-GFP + Ins + double-positive cells (Treff et al., 2006) by the ⁇ -secretase inhibitor LY411575. This result indicates that K-1 exhibits its efficacy by a mechanism of action different from that of ⁇ -secretase inhibition, which has previously been reported to promote pancreatic endocrine differentiation.
  • K-1 and its derivatives promote the differentiation of human iPS cell-derived ⁇ cells.
  • the efficacy of the compound for the differentiation of human iPS cells into insulin-expressing ⁇ (hiPS- ⁇ ) cells was shown in two different differentiation protocols and three human iPS cell lines (Toe, RPChiPSC771, and Ff-I01s01 (HLA homozygous patients). It was investigated using the derived iPSC)) (Fig. 2-1a).
  • the present inventor first tested the treatment of Toe iPSCs with K-1 from late stage 3 to early stage 5 in monolayer cultures under differentiation protocol # 1. It resulted in enhanced differentiation into iPS- ⁇ cells (FIGS. 2-1a and b).
  • K-3 compound synthesized in Synthesis Example 9
  • K-4 compound synthesized in Synthesis Example 33
  • K-5 compound synthesized in Synthesis Example 101b
  • the effects of other derivatives were examined.
  • K-3 and K-5 were found to be more potent than the original compound K-1 (Fig. 2-1b).
  • K-3 was tested using another differentiation protocol recently established by the present inventor.
  • the present inventor has previously discovered that a short period of pre-differentiation methionine removal treatment results in enhanced differentiation (Shiraki et al., 2014). Therefore, the present inventor incorporated short-term (5 hours) methionine removal and performed sphere culture of RPChiPS771 iPSC under differentiation protocol # 1 to obtain highly functional iPS- ⁇ cells (Shiraki et al.,. 2014).
  • K-3 enhanced differentiation into INSULIN + PDX1 + double-positive cells at 0.25 ⁇ M (Fig. 2-1c).
  • differentiation protocol # 2 was used. Here, cells were pretreated with methionine removal prior to differentiation and differentiated using a medium with adjustable zinc concentration.
  • K-3 enhanced the differentiation of Ff-I01s01 into INSULIN + NKX6.1 +, NKX6.1 + PDX1 + double positive, and INSULIN + NKX6.1 + PDX1 + triple positive cells. These appeared at the end of stage 4 and then increased (Fig. 2-1d).
  • K-3 most effectively enhances differentiation.
  • K-3 also promoted the production of NKX6.1 + and INSULIN + NKX6.1 + double positive cells, especially by treatment in stages 3-5 (FIG. 2-1d).
  • iPS- ⁇ cells treated with K-3 showed enhanced c-peptide secretion by stimulation with insulin secretagogues (glibenclamide, exendin 4, and KCl) (Fig. 2-2g), which is not the case. , Indicates that the compound enhances functional maturation or increases the insulin content of the cell.
  • RPChiPS771 cells and Ffl-01s01 cells were cultured on syntheticmax II (Invitrogen, 3535XX1) coated dishes using Essential8 (Invitrogen, A151001) and StemFit AK03N (Ajinomoto), respectively.
  • SK7 mouse ES cells were basically differentiated into ⁇ cells according to a previous report (Nakashima et al., 2015). Briefly, cells were placed in CellBIND 384-well (CORNING, 3770) cell culture plates with 5,000 cells per well, or in 96-well plates (Sigma) coated with 0.2% gelatin 20 per well, It was seeded with 000 cells. The cells were then cultured in medium 1 from day 1 to day 5.
  • CORNING 384-well
  • Medium 1 contains 0.1 mM NEAA (Gibco, 11140-50), 2 mM L-glutamine (Nacalai, 16948-04), 100 U / mL penicillin-streptomycin (Nacalai, 26252-94), 0.01 mM ⁇ . -Mercaptoethanol (Sigma), 1% insulin-transferase-selenium supplement (ITS: Life Technologies, 41400045), 0.25% Albumax (ThermoFisher, 11020021), and 10 ng / mL recombinant human activin-A (R & D). It consists of DMEM high glucose (Life Technologies, 11965092) supplemented with Systems, 338-AC).
  • medium 2 consisting of medium 1 supplemented with 10 ⁇ M retinoic acid (Stemgent, 04-0021).
  • the medium was replaced with medium 3 on day 6, and culture was continued until day 12 to induce differentiation into ⁇ -cells.
  • Medium 3 contains 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin-streptomycin, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% ITS, 0.25% Albumax, and 3 mM nicotinamide. It consists of DMEM low glucose (Life Technologies, 11885084) supplemented with (Sigma-Aldrich, N0636-500G). The test compound was added on day 8 and cells were fixed with 4% paraformaldehyde for analysis by a high content imager.
  • Toe human iPS cells were seeded on CellBIND 6-well (CORNING, CLS3335) cell culture plates coated with synthemax II and differentiated into primitive intestinal cells by the method previously described (Shahjaral et al., 2014). Cells were dissociated with TrypLE Select (Thermo Fisher, 12563011) and cryopreserved in BanBanker (Nippon genesics) at a density of 1.0-2.0 ⁇ 10 7 cells / mL until use.
  • stage 3 medium DMEM high glucose, 0.25 ⁇ M SANT1 (Wako, 197-16351), 0.1 ⁇ M LDN193189 (Stepment, 04-0074), 10 ⁇ M SB431542, 2 ⁇ M.
  • the cells were thawed in retinoic acid, 1% B27 serum-free supplement (Life Technologies, 17504044), and seeded in CellBIND 96-well (Corning, 3340) cell culture plates coated with Synthemax II at 150,000 cells per well.
  • Cells were cultured for 1 day in stage 3 medium containing test compound or negative control (0.01% DMSO) for 2 days and 1 day in stage 4 and 5 medium containing test compound or negative control, respectively. The cells were further cultured. The next day, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde for analysis with a high content imager.
  • RPChipS771 cells were maintained as described above and differentiated according to protocol # 1. Briefly, on day 0, cells were dissociated with a TrypLE Select and transferred to a low-adhesion 6-well plate (Greener, 657185) at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL in Ethential 8 medium and rotary shaker (95 rpm). ) Cultivated on. On the first day, the medium was replaced with methionine-depleted medium KA01 (Ajinomoto) and cultured for 5 hours.
  • KA01 Ajinomoto
  • the medium was replaced with differentiation medium 1 (DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021) and the cells were cultured for 1 day ( Stage 1-1). Then, the medium was replaced with medium 1 containing no CHIR99021 and cultured for 2 days (stage 1-2).
  • differentiation medium 1 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021
  • N-acetyl-L-cysteine (B27 supplement) was continued for 13 days (stage 5).
  • test compounds and negative controls (0.01% DMSO) were treated between stages 3 and 4 (Days 6-14) for insulin positives.
  • immunostaining was performed on the 19th day, and a GSIS (Glucose Dimethyl Insulin Secretion) assay was performed on the 27th day.
  • FfI-01s01 cells were maintained as described above and differentiated according to protocol # 2. Briefly, cells were dissociated with TripLE Select, transferred to a low adherence 6-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL in AK03N medium (Ajinomoto), cultured on a rotary shaker (95 rpm) for 24 hours, and cultured. The medium was then replaced with AK03N-based methionine-removing medium KA01 and the cells were cultured for 5 hours. The medium was then replaced with M1-1 AKM medium and the cells were cultured for 24 hours (stage 1-1).
  • AK03N medium Ajinomoto
  • the cells were cultured in M1-2 AKM medium for 2 days (stage 1-2), then in M2 AKM medium for 2 days (stage 2-1), and in S2 medium for 2 days (stage 2-2). Incubate in S3 medium for 2 days (stage 3), in S4 medium for 5 days (stage 4), in S5-1 medium for 4 days (stage 5-1), and in S5-2 medium for 3 days (stage 5). Stage 5).
  • the AKM medium is insulin and Zn 2+ depleted StemFit Basic 03 medium.
  • M1-1 AKM medium AKM (100 ng / mL IGF1, 0.5 ⁇ M Zn) medium supplemented with 100 ng / mL activin A and 3 ⁇ M CHIR990221.
  • M1-2 AKM medium AKM (100 ng / mL IGF1, Z0.5 ⁇ M Zn) medium supplemented with 100 ng / mL activin A.
  • M2 AKM medium AKM (0.5 ⁇ M Zn) supplemented with 50 ng / mL FGF10 and 250 nM SANT1.
  • S2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • S3 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 50 nM indactam V, 2 ⁇ M retinoic acid, 250 nM SANT1, and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • S4 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 100 nM retinoic acid, 250 nM SANT1, 44 ⁇ g / mL vitamin C, and 100 nM LDN193189.
  • S5-1 Medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 100 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3, 44 ⁇ g / mL vitamin C.
  • S5-2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 25 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3.
  • the test compound and negative control 0.01% DMSO
  • Insulin staining was performed on the 14th day (at the end of stage 4) and the 21st day (at the end of stage 5) to confirm the effect on the positive of 1. and PDX1.
  • the GSIS assay was performed on day 21.
  • Nuclei were identified by DAPI staining and positive antibody staining was determined by the fluorescence intensity of the cytoplasmic region surrounding the nuclei. The number of cells positive for both insulin and GFP was counted and normalized by the total number of DAPI-positive cells or the positive area area. The median quadruple data was calculated and screening hits were defined as conditions with increased insulin and GFP positive cell counts compared to DMSO controls. The primary hit compounds were further tested for dose dependence and reproducibility as described in the text. The activity of the candidate compound was confirmed using the resynthesized compound. The activity of the selected candidate compounds was further analyzed by the Toe Human iPS Cell Assay System to select hit compounds that are effective against both mouse and human ⁇ -cell differentiation. Compounds were added as described above and efficacy was assessed by mRNA expression level by q-PCR in a series of experiments. Screening hits were defined as a dose-dependent condition with increased insulin expression levels compared to ⁇ -actin over DMSO controls.
  • Mouse anti-NKX6.1 (Developmental Systems Hybridma Bank, University of Iowa; F64A6B4; 1 / 100x), Mormot anti-INSULIN (Dako; IR002; I1 / I-Si2; , Rabbit anti-C-peptide (Cell Signaling; 4595; 1 / 100x), rabbit anti-GFP (MBL International Corp; 598; 1 / 1000x), and mouse anti-GLUCAGON (Sigma-Aldrich; G2654; 1 / 1000x).
  • the secondary antibodies used were Alexa 488-binding goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11029, 1/1000x), Alexa 488-binding donkey anti-guinea pig IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, 706-546-148), AF647-binding donkey anti-rabbit IgG.
  • AF568-conjugated donkey anti-mouse IgG (BIOTIUM, 20105), Alexa 568-conjugated goat anti-guinea pig IgG (Invitrogen, A11075, 1/1000x), Alexa 568-conjugated goat A11031, 1/1000x), Alexa 568-binding goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11036, 1/1000x), Alexa 633-binding goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A21072, 1/1000x). Cells were counterstained with DAPI (Thermo Fisher, D1306).
  • Quantitative real-time PCR CDNA preparation of mouse ES cells is performed using the VILO master mix, and real-time PCR analysis is performed using the Taqman qPCR assay (Applied Biosystems TaqMan gene expression assay ID: mouse Hprt1, Mm03024075_m1; went. Gene expression was calculated by using a standard curve for each gene created by using a dilution series of the appropriate test sample mixture. The expression level of each gene was corrected by the Hprt1 expression level.
  • GSIS glucose-stimulated insulin secretion
  • High glucose stimulation was initiated by adding an additional amount of glucose to the cell suspension to increase the final glucose concentration from 3 to 20 mM. Sampling of the supernatant over time (10, 30, 60 minutes after the start of HG stimulation; 10 minutes for HG, 30 minutes for HG, and 60 minutes for HG, respectively), followed by 100 ⁇ M eccentric 4 and 20 mM KCl in sequence. It was added and incubated for 30 minutes (Ex4 30 minutes and KCl 30 minutes, respectively).
  • the batch mode GSIS assay was performed as follows. After washing the resulting aliquot of human iPS- ⁇ cells with LG-KRBH as described above, the cells are incubated in LG-HKRB buffer for 30 minutes or 1 hour, followed by the same in HG-HKRB buffer. Incubated for hours. In some experiments, after washing the cells, the cells were divided into several aliquots and incubated for 1 hour in HG-HKRB buffer containing 0.01% DMSO or several insulin secretagogues. The C-peptide concentration of the sample was measured using an alphaLISA C-peptide kit (PerkinElmer, AL299F) or C-peptide ELISA and adjusted for the DNA content of the cells used in the GSIS assay.
  • Neural cells play an inhibitory role in pancreatic differentiation of pluripotent stem cells. Genes Cells 1028-1045. Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., et al. (2014). VMAT2 identified as a regulator of late-stage ⁇ -cell differentiation. Nat. Chem. Biol.

Abstract

多能性幹細胞をインスリン産生細胞へと効率的に分化誘導する手段として、ジヒドロインドリジノン誘導体を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含む方法を提供する。

Description

ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法
　本発明は、三次元培養により、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を作製する方法に関する。
　糖尿病は、様々な遺伝要因や環境要因を背景として発症し、慢性的な高血糖により腎症などの合併症が惹起された結果、患者のＱＯＬを著しく低下させる重篤な疾患である。現在、世界の糖尿病患者数は４億人を超え、医療経済的にも問題視されている。糖尿病は大きく１型および２型糖尿病に分類されるが、何れの病態においても、インスリン分泌機能を有する膵β細胞の喪失が大きな原因である。１型糖尿病や膵β細胞の喪失が著しい重篤な２型糖尿病の治療法としてはインスリン製剤の投与が一般的な手段となっているが、低血糖などの副作用や頻回の自己注射が必要とされるなど問題点が多い。近年、臓器提供者から単離した膵島細胞の１型糖尿病患者への移植が可能となり、インスリン治療を代替し糖尿病の完全寛解を可能とする治療法として期待されている。しかしながら、膵島ドナーの不足により普及が困難な状況であるため、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を大量に作製するための技術の早急な実現化が望まれている。
　多能性幹細胞からインスリン産生細胞を作製するための技術としては、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から下式に記載の化合物を用いて５段階から７段階の工程を経てインスリン産生細胞へ分化誘導する方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１，２，３，４，５）。Ｓｈａｈｊａｌａｌらの方法（特許文献１、非特許文献４）では、ステップワイズに５段階の分化工程を経てヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を作製できる。まず、ｉＰＳ細胞を維持培地中で増殖させた後、ステージ１では、アクチビンＡやＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９２０１を含む培地で数日間培養しＳｏｘ１７陽性の胚体内胚葉細胞へと誘導させる。ステージ２では、胚体内胚葉細胞にＦＧＦ１０やソニックヘッジホッグ阻害剤ＫＡＡＤ－シクロパミンを数日間処置し、Ｆｏｘａ２陽性の原始腸管細胞へと誘導する。更に、ステージ３において、原始腸管細胞をレチノイン酸、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２やＢＭＰシグナル阻害因子Ｎｏｇｇｉｎを含む培地で数日処置し、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞へと分化誘導させる。ステージ４では、膵臓前駆細胞に対してプロテインキナーゼＣ活性化剤インドラクタムＶ、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤であるＡＬＫ５　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩやＮｏｇｇｉｎで刺激を与え、Ｎｇｎ３陽性の膵内分泌前駆細胞へと誘導する。最終段階のステージ５において、膵内分泌前駆細胞をＧＬＰ－１受容体アゴニストやニコチンアミドを含有する培地で数日間培養することにより、インスリン産生細胞が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　さらに下式に記載される化合物を用いた報告もある。上述の分化培養において使用されるＮｏｇｇｉｎの代わりに低分子阻害剤ＬＤＮ１９３１８９、ＫＡＡＤ－シクロパミンの代わりにＳＡＮＴ－１（非特許文献２、６）やＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが使用される場合がある（非特許文献５）。また、分化培養最終工程では、ＦｏｒｓｋｏｌｉｎやＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅが分化誘導剤として使用される場合がある（非特許文献５）。その他、ＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８が、インスリン産生細胞の機能成熟化を促進すること（非特許文献３）、ＡＫＴ阻害剤ＡＴ７８６７が、ＰＤＸ－１陽性の膵前駆細胞の増殖を促進する化合物として報告されている（非特許文献７）。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を細胞治療に応用するためには、細胞機能の安定性と製造法の効率性が重要である。細胞機能の安定性については、得られたインスリン産生細胞における高グルコースに応答してインスリン分泌する能力やインスリンの分泌動態が、実験毎に再現性良く、一定の能力を示すことであるが、従来の方法で得られた細胞では、製造ロットや細胞株によって、これらの能力が変動し、安定した品質の確保が困難であるとの問題がある。製造法の効率性については、従来の方法では、分化誘導できるインスリン産生細胞の数が少ないことによりコスト効率が悪いという問題がある。
国際出願公開第２０１５／１７８３９７号パンフレット
Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ｇｌｕｃｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２６：　４４３－４５２，　２００８． Ｐａｇｌｉｕｃａ　Ｆ．Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈｕｍａｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　β　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｃｅｌｌ，１５９：４２８－４３９，２０１４． Ｒｅｚａｎｉａ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：１１２２－１１３３，２０１４． Ｓｈａｈｊａｌａｌ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　β－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：３９４－４０８，２０１４． Ｋｕｎｉｓａｄａ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：２７４－２８４，２０１２． Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，２０：１０２８－１０４５，２０１５． Ｋｉｍｕｒａ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ＡＴ７８６７　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｓ　ＰＤＸ１－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：６１－６８，２０１７．
　本発明の課題は、従来の技術では困難であった幹細胞からインスリン産生細胞への高い分化の効率性を達成する手段を提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討を行った結果、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する顕著な効果を有すること、また、それら化合物またはその塩がインスリン産生細胞の製造に有用であることを見出し、本発明を完成させた。一般式（Ｉ）で表される化合物は、既知の分化誘導剤とは全く異なる新規構造を有しており、分化過程の後半のステップにおいて、既知の分化促進化合物や増殖因子に上乗せして更に分化誘導効率を高める効果を発揮する。
すなわち、本発明は以下に説明する[１]～[２１]に関する。
[１]
　多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、各置換基は以下のように定義される。
Ｒ１：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ２：水素原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ３：置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
置換基群α：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
置換基群β：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
ｎ：０、または１
Ａ：下記式（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかで表される基

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、各置換基は以下のように定義される。
・および＊：結合手を示し、・は一般式（Ｉ）のアミド基の窒素原子に結合し、＊はＲ３に結合する
Ｒ４：水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
Ｒ５：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｙ：ＮまたはＣＨ）]
で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
[２]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[３]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基
置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
[４]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基
置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基
[５]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ１が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[４]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[６]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ２が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[５]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[７]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉ）で表される基であって、Ｒ４が水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[８]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ４が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする[７]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[９]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１０]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１１]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１２]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｖ）で表される基であることを特徴とする[１]～[６]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１３]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるｎが１であることを特徴とする[１]～[１２]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１４]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３が２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１５]
　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基であることを特徴とする[１]～[１３]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１６]
　一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［１７］
　多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
［１８］
　三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする[１]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[１９]
　多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程１～５を含み、工程３、工程４および工程５からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[１]～[１８]のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法
工程１：多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
工程２：胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
工程３：原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
工程４：膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
工程５：膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。
[２０]
　工程３、工程４および工程５において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[１９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
［２１］
　工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする [１９]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[２２]
　[１]～[２１]のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞。
[２３]
　[１]～[２１]のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含むインスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患の治療薬。
[２４]
　インスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患が、１型糖尿病又は２型糖尿病である[２３]に記載の治療薬。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019-126861の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、公知の分化誘導方法と比較し、哺乳類動物由来の多能性幹細胞をインスリン産生細胞へと分化させる際に顕著な効果を有する。したがって、この化合物を使用する本発明の方法は、インスリン産生細胞を効率的に製造することができる。また、本発明の方法は、三次元的に細胞を培養するので、二次元的培養法に比べ、より生体内に近い環境で細胞を培養することができる。
β細胞の分化を促進する新規小分子化合物のスクリーニング。ａ）ＳＫ７　ｍＥＳ細胞を使用したβ細胞分化を増強する化合物のスクリーニングのための培養系の概略図。ｂ）β細胞分化促進剤のスクリーニングフローの概要。ｃ）Ｋ－１の化学構造。ｄ）全細胞中のＰｄｘ１－ＧＦＰ＋Ｉｎｓ＋二重陽性細胞の割合に対するＫ－１の効果。ｅ）インスリン１遺伝子発現レベル。ｄ、ｅ）ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ　＜０．００１として示されている。ｆ）γ－セクレターゼ阻害剤ＬＹ４１１５７５とのＫ－１の相加効果。全細胞数（ＤＡＰＩ＋）に対するＰｄｘ１－ＧＦＰ＋およびインスリン＋二重陽性細胞の割合を計算した。インスリン１　ｍＲＮＡ発現レベルは、Ｈｐｒｔ１発現レベルによって正規化されている。値は３回の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。有意性は、片側独立ｔ検定で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。 Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。ａ）ヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｏｅ、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１、およびＦｆｌ－０１ｓ０１）を用いたβ細胞分化に対する化合物の有効性を評価するための培養系の概略図。ｂ）Ｔｏｅ　ｈｉＰＳ細胞の単層培養におけるＤＭＳＯ対照からの全細胞数中の得られたＩＮＳ＋細胞数の割合における倍率変化。ｃ）ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１　ｉＰＳ細胞を用い、分化プロトコール＃１、スフェア培養下での全細胞中の産生されたＩＮＳ＋ＰＤＸ１＋二重陽性細胞の割合。ｄ）ｉＰＳ由来細胞におけるステージ４の終わり（左）またはステージ５の終わり（右）での分子マーカーの陽性。異なるタイムウィンドウ、即ち、ステージ３（Ｓ３）、ステージ４（Ｓ４）、ステージ５（Ｓ５）、ステージ３＆４（Ｓ３／４）、またはステージ３、４＆５（Ｓ３／４／５）においてＫ－３で処理された。Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１を使用し、分化プロトコール＃２の下で培養された。ｂ）、ｃ）およびｄ）：有意性は、ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。 Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。ｅ）（左）１μＭのＫ－３およびその誘導体または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞の時間依存的ＧＳＩＳ活性。処理はステージ３および４の間に行った。分化プロトコール＃１の下でスフェア培養を行った。ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１　ｉＰＳ細胞を用いた。測定は、段階的な経時的方法で行った。（右）ステージ３および４の間にＫ－３または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞のＧＳＩＳ活性をバッチ式で測定した。ｆ）（左）ｉＰＳ－β細胞の時間依存的ＧＳＩＳ活性。ｉＰＳ－β細胞を、ステージ３および４の間に、１μＭのＫ－３、－５、－６および２μＭのＫ－４または陰性対照で処理した。分化プロトコール＃２の下でスフェア培養を行った。Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１　ｉＰＳ細胞を用いた。測定は、段階的な経時的方法で行った。（右）ステージ３および４の間にＫ－３または陰性対照で処理したｉＰＳ－β細胞のＧＳＩＳ活性をバッチ式で測定した。ｇ）Ｋ－３または陰性対照（ＤＭＳＯ）で処理したｉＰＳ－β細胞の、異なる分泌促進物質（１００ｎＭエキセンディン４、１０μＭグリベンクラミド、および２０ｍＭ　ＫＣｌ）に対する応答を試験する。ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。ｅ）左およびｆ）左：有意性は、ダネットの多重比較検定で、有意性が＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。ｅ）右およびｆ）右およびｇ）：有意性は、片側独立ｔ検定で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、または＊＊＊ｐ＜０．００１として示されている。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　本明細書中では以下に説明する用語を使用する。
　「ハロゲン原子」：フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
　「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」：炭素数１～６個の直鎖若しくは分枝鎖アルキル基であり、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、ネオペンチル基、１－エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、または１，２－ジメチルブチル基などである。
　「アリール基」：炭素数６～１０の単環または２環式芳香族炭素環であって非芳香族ヘテロ環もしくはシクロアルカンと縮合していてもよい。具体的には、例えば、フェニル基、ナフチル基、テトラリニル基、インダニル基、クロマニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラニル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシニル基、１，２，３，４－テトラヒドロキノリニル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリニル基、インドリニル基、または３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジニル基などである。好適にはフェニル基、ナフチル基、または１，３－ベンゾジオキソリル基などである。
　「Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基」：炭素数５～１０の環内に二重結合を１つ有した炭化水素環であり、アルキレン基で架橋されていてもよく、具体的には、例えば、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル基、またはビシクロ［２．２．２］オクテニル基などが挙げられる。
　「ヘテロシクリル基」：環を構成する原子が炭素以外に窒素、酸素、硫黄から独立して選択される１～４のヘテロ原子によって構成される４～１０員環の基であって、芳香族または非芳香族であってもよく、また非芳香族の場合はアルキレン基によって架橋されていても良い。具体的には、例えば、非芳香族ヘテロシクリル基としてはアゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、アゼパニル基、ジアゼパニル基、アゾカニル基、ピペラジニル基、ホモピペラジニル基、モルホリニル基、オキサゼパニル基、チオモルホリニル基、チアゼパニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフリル基、ジオキサニル基、ジオキソラニル基、２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、３－アザビシクロ［３．２．１］オクチル基、８－アザビシクロ［３．２．１］オクチル基、９－アザビシクロ［３．３．１］ノニル基、３，９－ジアザビシクロ［３．３．１］ノニル基、ジヒドロピラニル基、ジヒドロピロリル基、ジヒドロピリジル基、テトラヒドロピリジル基、テトラヒドロピラジル基、３，９－ジアザスピロ［５．５］ウンデカ－３－イル基、１，９－ジアザスピロ［５．５］ウンデカ－９－イル基、１，８－ジアザスピロ［４．５］デカ－８－イル基、または１，４－ジオキサ－８－アザスピロ［４．５］デカ－８－イル基などが挙げられる。芳香族ヘテロシクリル基としてはフリル基、ピロリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、またはナフチリジニル基などが挙げられる。
　「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、またはイソヘキシルオキシ基などである。
　「ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基に１～７個のハロゲン原子が置換した基であり、具体的には、例えば、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、１，１－ジフルオロエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基などである。
　「ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が１～７個の前記ハロゲン原子で置換された基であり、具体的には、例えば、フルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、ジクロロメトキシ基、ジブロモメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、２－フルオロエトキシ基、２－ブロモエトキシ基、２－クロロエトキシ基、２－ヨードエトキシ基、２，２－ジフルオロエトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，２－トリクロロエトキシ基、ペンタフルオロエトキシ基、３－フルオロプロポキシ基、３－クロロプロポキシ基、４－フルオロブトキシ基、５－フルオロペンチルオキシ基、または６－フルオロヘキシルオキシ基などである。
　「ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基に１個のヒドロキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、またはヒドロキシヘキシル基などである。
　「Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシプロポキシ基、エトキシメトキシ基、エトキシエトキシ基、エトキシプロポキシ基、またはプロポキシプロポキシ基などである。
　「（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、またはピバロイル基などが挙げられる。
　「（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニル基、またはイソヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　「（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基」：カルボニルオキシ基に前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ－プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ｎ－ブトキシカルボニルオキシ基、イソブトキシカルボニルオキシ基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシカルボニルオキシ基、イソペンチルオキシカルボニルオキシ基、ネオペンチルオキシカルボニルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニルオキシ基、またはイソヘキシルオキシカルボニルオキシ基などが挙げられる。
　「フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基の任意の位置にフェニル基が置換した基であり、具体的には、例えば、ベンジルオキシ基、１－フェニルエチルオキシ基、２－フェニルエチルオキシ基、１－フェニルプロピルオキシ基、２－フェニルプロピルオキシ基、または３－フェニルプロピルオキシ基などが挙げられる。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基」：カルバモイル基、またはカルバモイル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、エチルメチルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、またはジプロピルカルバモイル基などである。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基に前記１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換した基であり、具体的には、例えば、カルバモイルメチルオキシ基、カルバモイルエチルオキシ基、メチルカルバモイルメチルオキシ基、メチルカルバモイルエチルオキシ基、ジメチルカルバモイルメチルオキシ基、ジメチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルカルバモイルエチルオキシ基、ジエチルカルバモイルメチルオキシ基、ジエチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルエチルオキシ基、プロピルカルバモイルメチルオキシ基、プロピルカルバモイルエチルオキシ基、ジプロピルカルバモイルメチルオキシ基、またはジプロピルカルバモイルエチルオキシ基などである。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基」：スルファモイル基に前記Ｃ１－Ｃ６アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えばメチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、エチルメチルスルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、プロピルスルファモイル基、またはジプロピルスルファモイル基などである。
　「Ｃ１－Ｃ４アルキル基」：炭素数１～４個の直鎖若しくは分枝鎖アルキル基であり、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基などである。
　「Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、イソブトキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシ基などである。
　「Ｃ１－Ｃ２アルキル基」：炭素数１または２個の直鎖アルキル基であり、メチル基およびエチル基である。
　「ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルキル基に１～５個のハロゲン原子が置換した基であり、具体的には、例えば、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、１，１－ジフルオロエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基などである。
　「Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基」：酸素原子に前記Ｃ１－Ｃ２アルキル基が結合した基であり、具体的には、メトキシ基およびエトキシ基である。
　「ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基が１～５個の前記ハロゲン原子で置換された基であり、具体的には、例えば、フルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、ジクロロメトキシ基、ジブロモメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、２－フルオロエトキシ基、２－ブロモエトキシ基、２－クロロエトキシ基、２－ヨードエトキシ基、２，２－ジフルオロエトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，２－トリクロロエトキシ基、またはペンタフルオロエトキシ基などである。
　「ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基」：前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基に１個のヒドロキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、またはヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基などである。
　「Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基に前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基が置換した基であり、具体的には、例えば、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、エトキシメトキシ基、またはエトキシエトキシ基などである。
　「（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が結合した基であり、具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、またはピバロイル基などが挙げられる。
　「（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基」：カルボニル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基などが挙げられる。
　「（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基」：カルボニルオキシ基に前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基が結合した基であり、具体的には、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ－プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ｎ－ブトキシカルボニルオキシ基、イソブトキシカルボニルオキシ基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニルオキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ基などが挙げられる。
　「フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基の任意の位置にフェニル基が置換した基であり、具体的には、例えば、ベンジルオキシ基、１－フェニルエチルオキシ基、２－フェニルエチルオキシ基、１－フェニルプロピルオキシ基、２－フェニルプロピルオキシ基、または３－フェニルプロピルオキシ基などが挙げられる。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基」：カルバモイル基、またはカルバモイル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、エチルメチルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、またはジプロピルカルバモイル基などである。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基」：前記Ｃ１－Ｃ２アルコキシ基に前記１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換した基であり、具体的には、例えば、カルバモイルメチルオキシ基、カルバモイルエチルオキシ基、メチルカルバモイルメチルオキシ基、メチルカルバモイルエチルオキシ基、ジメチルカルバモイルメチルオキシ基、ジメチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルカルバモイルエチルオキシ基、ジエチルカルバモイルメチルオキシ基、ジエチルカルバモイルエチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルメチルオキシ基、エチルメチルカルバモイルエチルオキシ基、プロピルカルバモイルメチルオキシ基、プロピルカルバモイルエチルオキシ基、ジプロピルカルバモイルメチルオキシ基、またはジプロピルカルバモイルエチルオキシ基などである。
　「１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基」：スルファモイル基に前記Ｃ１－Ｃ４アルキル基が１つもしくは２つ結合した基であり、具体的には、例えばメチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、エチルメチルスルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、プロピルスルファモイル基、またはジプロピルスルファモイル基などである。
　「幹細胞」：自己複製能および多分化能を有する細胞であって、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞などが挙げられる。
　「多能性幹細胞」：生体の種々の細胞に分化する能力を有する細胞であって、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　「インスリン産生細胞」：高血糖などに反応してインスリンを分泌する細胞であって、グルカゴンまたはソマトスタチンなどの他の膵ホルモンに比べてインスリン発現能力が優位に優れている細胞のことである。
　「三次元培養」：細胞が培養容器に接着しない条件で培養することで、細胞同士の接着により形成されるスフェア（多能性幹細胞では、「胚様体」とも呼ばれる。）の状態で培養することを意味し、本明細書中では、「スフェア培養」と表記する場合もある。
＜インスリン細胞の製造法＞
　本発明は、多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）であらわされる化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法を提供する。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩のインスリン産生細胞への分化促進効果は、後述の参考例１や実施例１の方法により確認することができる。
　対象とする多能性幹細胞は、内胚葉細胞への分化能を有する幹細胞であれば、さまざまな幹細胞を採用できるが、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。多能性幹細胞の由来は、哺乳動物であれば、さまざまなものを採用することができるが、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌやネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの家畜動物であり、より好ましくはヒトである。
　多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程は、例えば、非特許文献４に記載されるように、５段階に分けられる。すなわち、多能性幹細胞からＳｏｘ１７陽性の胚体内胚葉細胞が誘導されるステージ１、胚体内胚葉細胞からＦｏｘａ２陽性の原始腸管細胞が誘導されるステージ２、原始腸管細胞からＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞が誘導されるステージ３、膵臓前駆細胞からＮｇｎ３陽性の膵内分泌前駆細胞が誘導されるステージ４、および、膵内分泌前駆細胞から最終的にインスリン産生細胞が誘導されるステージ５である。場合によっては、ステージ１が更に細分化し、中内胚葉細胞の状態となるステージ１－１とその後胚体内胚葉細胞が誘導されるステージ１－２に、ステージ２が更に分化培地中の亜鉛濃度の違いによりステージ２－１とステージ２－２に、ステージ５が更に分化培地中のレチノイン酸濃度の違いによりステージ５－１とステージ５－２に、それぞれ細分化される場合がある。本明細書において、細胞の分化段階の表示にはこれらのステージにより表示する場合がある。
　これらの培養に用いられる培地としては、通常の細胞培養に用いられる培地であれば特に限定されず、さまざまな培地を用いることができるが、例えばＤＭＥＭ培地、α―ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素、ＡＫ０３、ＡＫ０３Ｎなど）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ａ１５１７００１）、ＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８５８５０）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（ｓｔｅｍｇｅｎｔ，０１－０００５）、ＣＭＲＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１５３００３７）などを採用することができる。培地には、血清を添加しても良く、無血清培地に、ＫＯ―ＳｅｒｕｍやＢ－２７サプリメントのような血清代替物を添加して用いることができる。また、培地には、グルコースなどの糖類、βメルカプトエタノールやビタミンＣなどの抗酸化剤、必須アミノ酸や非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）などの各種アミノ酸類、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋などの各種金属イオン源、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦなどの各種成長因子など、通常の細胞培養に用いられる様々な培養補助剤が添加されていても良い。
　このような分化誘導またはその前処理の培養において、通常の培地組成から、アミノ酸や金属イオンなど、特定の成分の濃度を低減させ、または除去した培地を用いることもできる。例えば、メチオニン除去または低減培地は、多能性幹細胞を短時間（例えば、1時間、５時間、１０時間、２４時間など）の培養処理に用い、処理後の細胞を分化誘導する。また、別の態様においては、亜鉛イオン濃度を低減（例えば、１μM以下、好ましくは０．５μＭ以下）または除去した培地を分化培養工程前半のみ（例えば、ステージ１またはステージ２の少なくとも一部、好ましくはステージ１を含む期間、より好ましくはステージ１のみ、ステージ１～ステージ２の前半部、あるいは、ステージ１～ステージ２の全期間）に用いても良い。このような特定の成分の濃度を調整した培地は、公知の培地組成の情報に基づき、所望の成分を添加しない、または、添加量を低減させることによって作製することができる。また、所望の成分を含有しない培地を入手し、所望の濃度となるように特定の成分を添加することもできる。メチオニン低減または除去培地については例えばＷＯ２０１５／１２５６６２などに基づき作製することができる。実施例において亜鉛除去培地として使用されているＡＫＭ培地については、味の素株式会社バイオ・ファイン研究所から入手した。
　多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程では、各ステージに適したシグナル誘導のための添加剤を含有する培地で培養することによって、分化段階が進行する。以下に、各ステージの培地に用いる添加剤を例示する。このような添加剤は、適切な種類を選択して用いてもよく、該当ステージ用の全ての添加剤を用いても良い。また、前後のステージ用の添加剤を用いても良い。
　ステージ１では、アクチビン受容体およびＷｎｔシグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、アクチビン受容体アゴニスト（例えば、アクチビンＡ）、ＷＮＴシグナルの活性化因子（例えば、Ｗｎｔ３ＡのようなＷｎｔタンパク質、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２２１）など）などが用いられる。ステージ１の培養期間は１～４日間であり、好ましくは２～３日間である。ＧＳＫ３β阻害剤は、ステージ１の期間を通じて添加しても良く、ステージ１－１にのみ添加し、その後ステージ１－２ではＧＳＫ３β阻害剤を低減、または含まないステージ１用培地を使用しても良い。ステージ１用培地の例としては、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のアクチビンＡ、および／または、１～１０μＭ（好ましくは３μＭ）のＣＨＩＲ９９０２１を含む培地である。
　ステージ２では、ＦＧＦ受容体シグナルの活性化が必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＦＧＦ受容体アゴニスト（例えば、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ）などが用いられる。また、添加剤として、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＳＡＮＴ－ｌ）を使用することもできる。ステージ２の培養期間は、１～７日間であり、好ましくは２～６日間である。ソニックヘッジホッグ阻害剤は、ステージ２の期間を通じて添加されても良く、ステージ２の前半のみに添加されても良い。ステージ２用培地の例は、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ１０またはＫＧＦ、および／または、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１を含む培地である。
　ステージ３では、レチノイン酸受容体シグナルの活性化、ＢＭＰ受容体シグナルの阻害、ソニックヘッジホッグシグナルの阻害、及びＦＧＦ受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、レチノイン酸）、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＳＡＮＴ－ｌ）、ＢＭＰシグナル阻害因子（例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９）、プロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、インドラクタムＶ）などが用いられる。また、添加剤として、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）を使用することもできる。ステージ３の培養期間は、１～８日間、好ましくは２～６日間である。ステージ３用培地の例としては、０．０５～５μＭ（好ましくは０．１５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．１～１０μＭ（好ましくは２μＭ）のレチノイン酸、および、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のＬＤＮ１９３１８９のうち少なくとも一つを含む培地、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．１～１０μＭ（好ましくは２μＭ）のレチノイン酸、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＫＧＦまたはＦＧＦ１０、および、５～５００ｎＭ（好ましくは５０ｎＭ）のインドラクタムＶのうち少なくとも１つを含む培地などである。
　ステージ４では、ＢＭＰ受容体シグナルの阻害、ソニックヘッジホッグシグナルの阻害、ＦＧＦ受容体シグナルの活性化、及びレチノイン酸受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＢＭＰシグナル阻害因子（例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９）、ソニックヘッジホッグ阻害剤（例えば、ＳＡＮＴ－ｌ）などが用いられる。また、添加剤として、プロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、インドラクタムＶ）、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＬＫ５　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩ）を使用することもできる。ステージ４の培養期間は、１～７日間、好ましくは２～５日間である。ステージ４用培地の例としては、０．５～５０μＭ（好ましくは５μＭ）のＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　６１６４５２）、０．０１～１０μＭ（好ましくは０．３μＭ）のインドラクタムＶ、および、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のＬＤＮ１９３１８９、のうち少なくとも一つを含む培地、０．０５～５μＭ（好ましくは０．２５μＭ）のＳＡＮＴ１、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のレチノイン酸、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のＫＧＦ又ＦＧＦ１０、および、１０～１０００ｎＭＭ（好ましくは１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９のうち少なくとも一つを含む培地、などである。
　ステージ５では、ＴＧＦβ受容体シグナルの阻害、ＮＯＴＣＨシグナルの阻害、甲状腺ホルモン受容体シグナルの活性化、及びレチノイン酸受容体シグナルの活性化から選択される少なくとも一つが必要であり、用いる培地の添加剤としては、通常、ＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＬＫ５　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩ）、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ）、甲状腺ホルモンＴ３、ＥＧＦＲアゴニスト（例えば、ＥＧＦ）、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、レチノイン酸）、ビタミンＣなどが用いられる。また、添加剤として、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（例えば、ＧＬＰ－１ペプチド、エキセンジン－４など）、ニコチンアミド、アデニリル酸シクラーゼの活性化剤（例えば、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、グルココルチコイド受容体アゴニスト（例えば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を使用することもできる。ステージ５の培養期間は、５～２０日間、好ましくは７～１５日間である。ステージ５用培地の例としては、５～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ）のエキセンディン４および／または１～１００ｎＭ（好ましくは１０ｍＭ）のニコチンアミド、を含む培地、０．５～１００μＭ（好ましくは１０μＭ）のＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　６１６４５２）、０．０１～１μＭ（好ましくは０．１μＭ）のレチノイン酸、１～１００μＭ（好ましくは１０μＭ）のＤＡＰＴ、１～５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは３３．３ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦ、および、０．１～１０μＭ（好ましくは１μＭ）のＴ３、のうち少なくとも一つを含む培地、前記のレチノイン酸の濃度を低減（例えば、０．０５μＭ以下、好ましくは、０．０２５μＭ）させた培地などである。レチノイン酸の濃度低減培地は、ステージ５の後半において使用するのが好ましい。
　本発明のインスリン産生細胞の作製法は、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有する培地中で細胞を三次元培養する工程を含む。三次元培養の方法は当業者が通常用いる手法を適宜採用することができるが、低接着性または非接着性の培養容器を使用した培養法、攪拌培養法、ハンギングドロップ培養法、ハイドロゲルや多孔性スキャフォールドを用いた培養法などを例示することができる。低接着性または非接着性の培養容器としては、通常の培養容器の底面または側面を、細胞接着を阻害するポリマー系試薬等でコーティングして使用しても良く、基材に細胞接着性が低い素材が採用された培養容器を使用することもできる。容器の形状としては、様々なものを使用することができるが、丸底の容器を用いることで、 細胞のスフェア形成を促進することができる。平底容器を採用する場合、シェイカー上で培養することによってスフェア形成を促進することができる。スピナーフラスコや培養リアクタを用いた攪拌培養によっても、スフェア形成を促進することができ、大量培養への適応が可能である。
　本発明のインスリン産生細胞の作製法では、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化は、通常、全工程にわたって三次元培養を行うが、一部の工程（例えば、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、または膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程のうち一つまたは複数の工程）においてのみ三次元培養を行ってもよい。三次元培養を一部の工程に採用する場合、分化過程の後期（例えば、原始腸管細胞以降）とするのが望ましい。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、三次元培養が採用される工程の少なくとも一部において添加されればよく、全てに添加される必要は無く、また、三次元培養以外の工程（通常は接着培養）において添加されることを妨げない。
　一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、インスリン産生細胞への分化過程において、例えば、原始腸管細胞以降の分化段階の三次元培養工程に添加されることによって、インスリン産生細胞への分化を顕著に促進することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程のどの工程において添加してもよいが、好ましくは、多能性幹細胞から誘導された原始腸管細胞、膵臓前駆細胞および／または膵内分泌前駆細胞の培養時に添加する。上記の分化段階においては、ステージ３からステージ５に相当し、いずれかひとつのステージのみに添加しても良く、２つのステージ、または３つすべてのステージで添加しても良いが、ステージ３からステージ５のすべてに添加されることが好ましい。
　一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、上記の各ステージ用の添加剤の代わりに添加してもよく、また追加して添加されても良い。一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は固体状の化合物をそのまま、もしくは粉末状にして、またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解して培地に添加することができる。その添加量は特に限定されないが、多能性幹細胞からインスリン産生細胞へと効率的に分化が進むように当業者によって設定される。本発明のいくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）で表される化合物は１ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ培地中に存在するように添加される。
　本発明のインスリン産生細胞の作製方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられ、具体的には実施例１に採用されたプロトコール＃１およびプロトコール＃２を例示することができる。以下のプロトコールにおいて、各ステージに用いられる培地は、下に例示されるがこれらに限定されるものではない。
［細胞の処理・培養方法］
　前処理：多能性幹細胞を未分化維持培地（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ培地（味の素））中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー（９５　ｒｐｍ）上で２４時間以上培養する。以降の培養工程にも、同条件で三次元培養を適用する。分化誘導開始日に、培地を、ＡＫ０３Ｎベースのメチオニン除去培地（ＫＡ０１，味の素）に交換し、細胞を５時間培養する。
　ステージ１；多能性幹細胞（前処理されていても良い）を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ１用培地で１～４日間培養して、胚体内胚葉細胞を誘導する。好ましくは、分化培地１－１またはＭ１－１　ＡＫＭ培地で２４時間培養した後、培地を分化培地１－２またはＭ１－２　ＡＫＭ培地に交換して１～２日間培養する。
　ステージ２：胚体内胚葉細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ２用培地で２～６日間培養し、原始腸管細胞を誘導する。好ましくは、分化培地２、Ｍ２　ＡＫＭ培地またはＳ２培地で２～３日間培養する。別の例としては、亜鉛濃度を低減させたステージ２用培地（例えば、Ｍ２　ＡＫＭ培地）で２日間培養し、その後通常の亜鉛濃度のステージ２用培地（例えば、Ｓ２培地、分化培地２）で２～３日間培養する。
　ステージ３：原始腸管細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ３用培地で２～８日間培養して膵臓前駆細胞を誘導する。好ましくは、分化培地３で５～７日間またはＳ３培地で２～４日間培養する。
　ステージ４：膵臓前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ４用培地で１～７日間培養し、膵内分泌前駆細胞を誘導する。好ましくは分化培地４で２～３日間、または、Ｓ４培地で４～６日間培養する。
　ステージ５：膵内分泌前駆細胞を含む培養物を、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ５用培地で５～２０日間培養し、インスリン産生細胞を誘導する。好ましくは、分化培地５で１０～１５日間培養する。別の態様としては、０．１μＭ以上のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－１培地）で３～５日間培養し、その後０．０５μＭ以下の低濃度のレチノイン酸を含むステージ５用培地（例えば、Ｓ５－２培地）で２～４日間培養する。
［培地］
ＡＫＭ培地はインスリンおよびＺｎ２＋除去ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３培地（味の素）である。
（ステージ１用培地例）
　分化培地１－１；ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１
　分化培地１－２：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント
　Ｍ１－１　ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
　Ｍ１－２　ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加し、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
（ステージ２用培地例）
　分化培地２：ＲＰＭＩ、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、インスリンを除いたＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、０．２５μＭのＳＡＮＴ１。
　Ｍ２　ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を添加し、０．５μＭのＺｎを補充したＡＫＭ培地。
　Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
（ステージ３用培地例）
　分化培地３：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１５μＭのＳＡＮＴ１、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント。
　Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
（ステージ４用培地例）
　分化培地４：ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　６１６４５２）、０．３μＭのインドラクタムＶ、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント
　Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
（ステージ５用培地例）
　分化培地５：ＫＯ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２　、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４、１０ｍＭのニコチンアミド、１０μＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｂ２７サプリメント。
　Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
　Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３　ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５　ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
　分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（５日目～１３日目）に処理し、インスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１の陽性に対する効果を確認するために、１４日目および２１日目に免疫細胞化学染色を実施した。ＧＳＩＳは２１日目に実施した。
　＜化合物＞
　本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい態様について以下に説明する。
　本発明における置換基Ｒ１としては水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基を挙げることができる。好適には水素原子、塩素原子、臭素原子、またはメチル基であり、より好適には水素原子、塩素原子、またはメチル基である。Ｒ１の置換位置としては任意の位置をとることができ、以下に示す（Ｉ－ｉ）～（Ｉ－ｉｉｉ）をとり得る。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本発明における置換基Ｒ２としては水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基を挙げることができる。好適には水素原子またはＣ１－Ｃ２アルキル基であり、より好適には水素原子またはメチル基である。
　本発明における置換基Ｒ３としては置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基が挙げられる。好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であり、より好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基である。さらにより好適にはナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であり、特に２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基が好ましい。さらに特に好適には、フェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基である。各置換基群α～γに関しては以下の通りである。
　本発明における置換基群αとしてはハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基が挙げられる。好適には置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、より好適には置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１～Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基である。さらにより好適には置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、特に好適にはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、またはフェノキシ基である。
　本発明における置換基群βとしてはハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であり、より好適には置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基である。さらにより好適には置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基であり、特に好適にはメチル基、またはメトキシ基である。
　本発明における置換基群γとしては置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基であり、より好適にはフッ素原子、塩素原子、メチル基、イソブトキシ基、またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基である。
　本発明におけるｎとしては０または１の数値を取り得る。ｎ＝０のとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＩ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、Ｒ１～Ｒ３は上記と同義を示す］
で表されるジヒドロピロリジノン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｉｚｉｎｏｎｅ）構造を有する化合物であり、ｎ＝１のとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＩＩ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、Ｒ１～Ｒ３は上記と同義を示す］
で表されるジヒドロインドリジノン構造を有する化合物である。本発明におけるｎとして好適にはｎ＝１であり、ジヒドロインドリジノン構造を有する化合物がより好ましい。
　本発明におけるＡとしては以下の一般式（ｉ）～（ｉｖ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［式中、・、＊、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは上記と同義を示す］
で表される基である。
　Ａが一般式（ｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＩＶ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、Ｒ１～Ｒ４、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。
　Ａが一般式（ｉｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（Ｖ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式中、Ｒ１～Ｒ３、Ｒ５、ｎ、およびＹは上記と同義を示す］
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（Ｖ－ｉ）～（Ｖ－ｉｉｉ）をとり得る。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　Ａが一般式（ｉｉｉ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＶＩ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、Ｒ１～Ｒ３、Ｒ５、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。Ｒ５の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す（ＶＩ－ｉ）～（ＶＩ－ｉｉｉ）をとり得る。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　Ａが一般式（ｉｖ）で表される基を有するとき、一般式（Ｉ）で表される化合物は以下の式（ＶＩＩ）：

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、Ｒ１～Ｒ３、およびｎは上記と同義を示す］
で表される化合物である。
　本発明における置換基Ｒ４としては水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基が挙げられる。好適には水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、またはハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基であり、より好適には水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基である。
　本発明における置換基Ｒ５としては水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基が挙げられる。好適には水素原子、フッ素原子またはメチル基である。
　本発明におけるＹとしてはＮまたはＣＨが挙げられ、ＹがＮのとき、Ａにおける（ｉｉ）はピリジン環を表し、ＹがＣＨのとき、Ａにおける（ｉｉ）はベンゼン環を表す。当該Ａの（ｉｉ）におけるＹとしては好適にはＣＨである。
　一般式（Ｉ）を有する化合物は、好適には、合成例に記載の化合物であり、より好適には、以下の化合物である。
　８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　なお、その構造式は、順に以下に示すとおりである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記の８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、およびＮ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドは光学活性体を含む。
　８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドであり、
　Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド、または
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドである。
　なお、その構造式は、順に以下に示すとおりである。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ラセミ化合物からの各光学異性体の分離・分析はキラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより達成され得る。ＨＰＬＣによる光学異性体の同定は、その保持時間を参考に行われ得るが、その保持時間はカラムの劣化や装置間の再現性などによって影響を受ける場合があるため、好ましくはラセミ化合物または光学異性体の標準試料と分析試料との混合物を分析することによって行われ得る。また、各光学異性体のＨＰＬＣによる測定においては、同一測定条件下では各光学異性体が溶出される順序が変化しないため、特定条件下で相対的に保持時間が短い第一ピークと相対的に保持時間が長い第二ピークによって光学異性体を特徴付ける場合もあり得る。
（塩）
　「その塩」とは化合物では、酸性基または塩基性基を有する場合に、塩基または酸と反応させることにより、「塩基との塩」または「酸付加塩」にすることができるので、その塩を示す。温血動物（特にヒト）に対する治療の目的で使用する場合、その塩は薬学的に許容される塩が好ましい。また、「その塩」および「薬学的に許容される塩」とは、その水和物も包含する。
　化合物の「塩基との塩」としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；Ｎ－メチルモルホリン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ－メチルピペリジン塩、ピリジン塩、４－ピロリジノピリジン塩、ピコリン塩のような有機塩基塩類、またはグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり、より好適には、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。
　化合物の「酸付加塩」としては、好適には、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり、より好適には、ハロゲン化水素酸塩（特に、塩酸塩）である。
（水和物等）
　一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、大気中に放置したりまたは再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物および結晶多形の化合物も包含する。
（異性体）
　一般式（Ｉ）で表される化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、一般式（Ｉ）で表される化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
　一般式（Ｉ）で表される化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
（同位体）
　一般式（Ｉ）で表される化合物は、ラベル体、すなわち、化合物の１または２以上の原子を同位元素（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、３５Ｓ等）で置換した化合物も含まれる。
（プロドラッグ）
　本発明には、一般式（Ｉ）で表される化合物の薬理学上許容されるプロドラッグも包含する。薬理学上許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、アミノ基、水酸基、カルボキシ基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ，５，２１５７－２１６１（１９８５）に記載の基が挙げられる。
　当該プロドラッグとして、より具体的には、化合物にアミノ基が存在する場合には、そのアミノ基がアシル化、リン酸化された化合物（例えば、そのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化された化合物等である）等を挙げることができる。
　化合物に水酸基が存在する場合には、その水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化された化合物（例えば、その水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、サクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物等である。）等を挙げることができる。
　化合物にカルボキシ基が存在する場合には、そのカルボキシ基がエステル化、アミド化された化合物（例えば、そのカルボキシ基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、アミド化またはメチルアミド化された化合物等である。）等が挙げられる。
（製造方法）
　次に、一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的な製造方法について説明する。一般式（Ｉ）で表される化合物は種々の製造方法により製造することができ、以下に示す製造方法は一例であり、本発明はこれらに限定して解釈されるべきではない。
　一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩およびそれらの合成中間体は、それらの基本骨格または置換基の種類に基づく特徴を利用し、各種の公知の製造方法を適用して製造することができる。公知の方法としては、例えば、「ＯＲＧＡＮＩＣ　ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ　ＧＲＯＵＰ　ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」、第２版、ＡＣＡＤＥＭＩＣ　ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．，１９８９年、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．，１９８９年等に記載された方法がある。
　また、一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩は、以下に記載するＡ～Ｃ法に従って合成することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物を合成する際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）で保護しておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）およびグリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件を適宜選択して用いればよい。一般的に当業者によって合成ルートが設定されると、当該合成ルートに最適な保護基は当業者によって適宜設定される。
　このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物のプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で、特定の基を導入、あるいは得られた化合物を用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等の方法を適用することにより行うことができる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物は公知の方法またはその変法によって合成可能な中間体を用いて製造することができる。特にＡに相当する一般式（ｉｉ）～（ｉｖ）で表される基を含む中間体については市販の原料を用いて公知の方法またはその変法を適用することによって製造することができる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程で得られる化合物はその化合物とともに形成される塩であってもよい。例えば、塩酸塩もしくは硫酸塩等、またはナトリウム塩もしくはカリウム塩等が挙げられる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される溶媒は、反応を阻害せず、出発原料を一部溶解するものであれば特に限定はなく、例えば、下記溶媒群より選択される。溶媒群は、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル、シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド（塩化メチレン）、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンのようなケトン類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルのようなエステル類；アセ卜ニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；酢酸、プロピオン酸のようなカルボン酸類；メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、１－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノールのようなアルコール類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ卜アミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類；水；および、それらの混合物からなる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される酸は、反応を阻害しないものであれば特に限定はなく、下記酸群より選択される。酸群は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸のような無機酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸のような有機酸、および、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸のような有機スルホン酸からなる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において使用される塩基は、反応を阻害しないものであれば特に限定はなく、下記塩基群より選択される。塩基群は、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウムのようなアルカリ金属炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属炭酸水素塩；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物；水酸化カルシウム、水酸化バリウムのようなアルカリ土類金属水酸化物；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物；リチウムアミド、ナトリウムアミド、カリウムアミドのようなアルカリ金属アミド；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド；リチウムジイソプロピルアミドのようなリチウムアルキルアミド；リチウムビストリメチルシリルアミド、ナトリウムビストリメチルシリルアミドのようなシリルアミド； ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウムのようなアルキルリチウム；塩化メチルマグネシウム、臭化メチルマグネシウム、ヨウ化メチルマグネシウム、塩化エチルマグネシウム、臭化エチルマグネシウム、塩化イソプロピルマグネシウム、臭化イソプロピルマグネシウム、塩化イソブチルマグネシウムのようなハロゲン化アルキルマグネシウム；および、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－エチルモルホリン、ピリジン、ピコリン、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）ピリジン、４－ピロリジノピリジン、２，６－ジ（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアニリン、１，５－ジアザビシクロ［４，３，０］ノナ－５－エン（ＤＢＮ）、１, ４－ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１, ８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）のような有機アミンからなる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において、反応温度は、溶媒、出発原料、試薬等により異なり、反応時間は、溶媒、出発原料、試薬、反応温度等により異なる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程の反応において、反応終了後、各工程の目的化合物は、常法にしたがって反応混合物から単離される。目的化合物は、例えば、（ｉ）必要に応じて触媒等の不溶物を漏去し、（ｉｉ）反応混合物に水および水と混和しない溶媒（例えば、塩化メチレン、ジエチルエーテル、酢酸エチル等）を加えて目的化合物を抽出し、（ｉｉｉ）有機層を水洗して、無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤を用いて乾燥させ、（ｉｖ）溶媒を留去することによって得られる。得られた目的化合物は、必要に応じ、常法、例えば、再結晶、再沈澱、蒸留、または、シリカゲルもしくはアルミナなどを用いたカラムクロマトグラフィー（順相および逆相を含む）等により、更に精製することができる。得られた目的化合物は、元素分析、ＮＭＲ、質量分析（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＩＲ分析等の標準的な分析技術によって同定され、その組成または純度を分析することができる。また、各工程の目的化合物は精製することなくそのまま次の反応に使用することもできる。
　下記Ａ～Ｃ法の各工程において、（Ｒ）または（Ｓ）－フェネチルアミンのような光学活性アミンを用いた分別再結晶、または、光学活性カラムを用いた分離により、光学異性体を分離、精製することができる。
　以下に一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法について述べる。ただし、製造方法は、下記の方法に何ら限定されるものではない。
［Ａ法］
　Ａ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ａ２）を製造する方法である。化合物（Ａ２）は本法および実施例で例示される合成法の他に公知の方法またはその変法などによっても製造することができる。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ［式中、Ｒ３およびＲ４は上記と同義を示す］
（工程Ａ－１）チアゾール環形成
　工程Ａ－１は化合物（Ａ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤もしくはブロモトリメチルシラン、およびチオウレアを作用させ、化合物（Ａ２）を製造する工程である。ハロゲン化剤としては塩素、臭素などが挙げられる。反応の溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、クロロホルム、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸等が用いられる。反応温度は通常、０～１００℃であり、反応時間は通常、０．５時間～２日間程度である。
（Ｂ法）
　Ｂ法は一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物（Ｂ３）を製造する方法である。以下の図中のＰ１およびＰ２はアミノ基の保護基あるいは水素原子を示し、具体的な保護基としてはＢｏｃ基（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基）、Ｃｂｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）、ベンジリデン基、またはジフェニルメチレン基などが挙げられる。Ｐ１がベンジリデン基、ジフェニルメチレン基の場合にはＰ２はＰ１と同一保護基を示す。Ｒ３およびＡはそれらに含まれる置換基上に保護基を有していてもよく、各工程は必要に応じて置換基の保護や保護基の除去を行う工程を含む。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 ［式中、Ｒ３は上記と同義、Ｘ１はハロゲン原子またはメタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基もしくはｐ－トルエンスルホニルオキシ基などの脱離基、Ｐ１およびＰ２は任意の保護基を示す］
（工程Ｂ－１）カップリング反応
　工程Ｂ－１は化合物（Ｂ１）のＡ上の置換基Ｘ１に対し、パラジウム触媒存在下、等量もしくは過剰量のボロン酸もしくはボロン酸エステル（Ｒ３－Ｂ（ＯＨ）２またはＲ３－Ｂ（ＯＲ）２、Ｒは任意のアルキル基を示す）を用いる条件（鈴木・宮浦カップリング）；有機スズ試薬（Ｒ３－ＳｎＲ３）を用いる条件（Ｓｔｉｌｌｅカップリング）；または有機亜鉛試薬（Ｒ３－ＺｎＸ；Ｘはハロゲン原子を示す）を用いる条件（根岸カップリング）等により、置換基Ｒ３の導入を行って化合物（Ｂ２）を得る工程である。上記反応では必要により、塩基を加えることができる。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド　ジクロロメタン錯体（１：１）、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、酢酸パラジウム（ＩＩ）、アセチルアセトンパラジウム（ＩＩ）、またはビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド等が挙げられる。また、塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、または１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］－５－ノネン（ＤＢＮ）等の有機塩基、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウム等の無機塩基が挙げられる。反応溶媒としては、反応が進行する限り特に限定はされないが、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン、水、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、またはこれらの混合物等を挙げることができる。反応温度は通常２０～１５０℃程度である。反応時間は通常１時間～２日程度である。本カップリング反応についてはＡ．ＭｅｉｊｅｒｅおよびＦ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ著、「Ｍｅｔａｌ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（第２版、２００４年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
（工程Ｂ－２）脱保護
　工程Ｂ－２は化合物（Ｂ２）における保護基Ｐ１およびＰ２を除去して化合物（Ｂ３）を製造する工程である。本工程では必要に応じてＲ３における保護基の脱保護を行うことができる。本反応条件は保護基Ｐ１およびＰ２の種類により変わるが、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。
（Ｃ法）
　Ｃ法は公知の方法またはその変法などを用いて合成可能な化合物（Ｃ１）から一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する方法である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 ［式中、Ｒ１～Ｒ３、ｎ、ＡおよびＸ１は上記と同義、Ｘ２はハロゲン原子、Ｐ３は任意の保護基を示す］
（工程Ｃ－１）アルキル化反応
　工程Ｃ－１は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のアルキル化剤存在下、塩基で処理することにより置換基Ｒ２を導入し、化合物（Ｃ２）を製造する工程である。アルキル化剤としてはハロゲン化アルキル、メタンスルホン酸アルキルエステルまたはｐ－トルエンスルホン酸アルキルエステル等を用いることができる。塩基としては、カリウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、テトラヒドロフランが好ましい。反応温度は通常、－７８～０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
（工程Ｃ－２）ハロゲン化およびアルキル化
　工程Ｃ－２は化合物（Ｃ１）に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤を用いてハロゲン化を行った後、アルキル化を行うことによって化合物（Ｃ３）を製造する工程である。ハロゲン化とアルキル化の順番は適宜入れ替えることができる。ハロゲン化剤としては、例えばＮ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常０～５０℃程度である。反応時間は通常０．５～２４時間である。アルキル化は工程Ｃ－１と同様の方法で行うことができる。
（工程Ｃ－３）カップリング反応
　工程Ｃ－３は化合物（Ｃ３）にカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）を製造する工程である。工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
（工程Ｃ－４）
　工程Ｃ－４は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ５）に対してハロゲン化、またはハロゲン化に続くカップリング反応を行って化合物（Ｃ４）または一般式（Ｉ）で表される化合物を得る工程である。ハロゲン化は工程Ｃ－２、カップリング反応は工程Ｂ－１と同様の方法で行うことができる。
（工程Ｃ－５）縮合反応
　工程（Ｃ－５）は化合物（Ｃ２）または化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去してカルボン酸とした後、Ａ法の化合物（Ａ２）またはＢ法の化合物（Ｂ３）を等量もしくは過剰量用いて縮合を行い、化合物（Ｃ５）または一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。カルボキシ基の脱保護はＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版、１９９９年）」に記載の方法に準じて行うことができる。縮合反応は化合物（Ｃ２）および化合物（Ｃ４）から得られたカルボン酸に対して塩基存在下、適当なスルホニル化剤または適当な縮合剤を作用させることによって行う。縮合反応では必要に応じて反応を促進する添加剤を加えることができる。スルホニル化剤としては、例えば２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。縮合剤としては、例えばＷＳＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド），ＤＣＣ（１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＭＴ－ＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）、ＣＤＩ（１、１´－カルボニルジイミダゾール）、ＤＥＰＣ（ジエチルホスホロシアニダート）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）などが挙げられる。塩基としては、ピリジン、ルチジンなどの芳香族アミン類やトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）などの３級アミン類などが挙げられる。添加剤の代表的な例として、ＨＯＡｔ（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－オール）、ＨＯＢｔ（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オール）、ＨＯＳｕ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）などが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常、０～５０℃である。反応時間は通常、０．５～２４時間である。
（工程Ｃ－６）縮合反応
　工程（Ｃ－６）は化合物（Ｃ４）のカルボキシ基の保護基を除去した後、アミン誘導体と縮合し、化合物（Ｃ６）を製造する工程である。工程（Ｃ－５）と同様の方法を用いることができる。
（工程Ｃ－７）カップリング反応
　工程（Ｃ－７）は化合物（Ｃ６）に対してカップリング反応を行って一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。工程（Ｂ－１）と同様の方法を用いて行うことができる。
＜インスリン産生細胞＞
　本発明の方法で製造されるインスリン産生細胞は、生体の膵臓β細胞と類似した機能を示すため、糖尿病の治療に有用である。本発明の製法で製造された細胞は、良好なインスリン産生能に加えて、周辺環境の糖レベルが低い状況ではインスリンを分泌量が少なく、糖レベルが高い環境ではインスリン分泌量が増加するという特性を有する。そのため、本発明の製法で製造される細胞は、低血糖のリスクが少なく、安全性が高い治療方法を提供する。
　本発明の方法で作製された細胞における膵臓β細胞マーカー遺伝子（例えばインスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１など）のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルでの発現を評価することにより、目的細胞であることを確認することができる。また、本発明の方法で作製された細胞のインスリン分泌能力は、以下の実施例１の方法（６）に記載された時間依存的ＧＳＩＳ活性測定により評価することができる。
　本発明の方法で作製された細胞は、時間依存的ＧＳＩＳ活性測定において、急速な第１相インスリン分泌及び／又は長期持続する第２相インスリン分泌を示すという特性を有する。また、本発明の方法で作製された細胞は、インスリン分泌促進薬（例えば、グリベンクラミドのようなＳＵ剤、エキセンディン４のようなＧＬＰ－１受容体アゴニスト、ＫＣｌなど）による刺激に反応してインスリン分泌増強、ｃ－ペプチド分泌増強などを示す特性を有する。また、機能的成熟化を示すマーカーＮＫＸ６．１の陽性率が高い、細胞当たりのインスリン分泌量が多い、という特性を有する。これらの特性から、本発明の方法で作製されたインスリン産生細胞は、膵β細胞として機能的成熟が増強された細胞であると考えられ、公知の多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞と明確に区別される細胞である。
　このようなインスリン産生細胞による治療対象は、膵臓β細胞におけるインスリン分泌異常又は分泌不全に起因する疾患の患者であり、具体的には１型糖尿病又は２型糖尿病の患者が例示される。
　このような細胞を治療に用いる場合、患者の皮下、腹腔内、膵臓内、膵臓表面、またはその周辺へ移植することができる。
　本発明の方法で製造された細胞は、三次元培養で形成された凝集体（スフェア）として移植してもよく、分散された細胞として移植しても良い。また、一度分散させた細胞を再凝集させた凝集体やシート状に加工して移植することもできる。
　以下、参考合成例、合成例、参考例、および実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
　参考合成例および合成例のカラムクロマトグラフィーにおける溶出はＴＬＣ（Ｔｈｉｎ　Ｌａｙｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、薄層クロマトグラフィー）による観察下に行われた。ＴＬＣ観察においては、ＴＬＣプレートとしてメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製のシリカゲル６０Ｆ２５４を、展開溶媒としてはカラムクロマトグラフィーで溶出溶媒として用いられた溶媒を、検出法としてＵＶ検出器を採用した。カラム用シリカゲルは同じくメルク社製のシリカゲルＳＫ－８５（２３０～４００メッシュ）、もしくは富士シリシア化学　Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ　ＮＨ（２００－３５０メッシュ）を用いた。通常のカラムクロマトグラフィーの他に、昭光サイエンティフィック社の自動クロマトグラフィー装置（Ｐｕｒｉｆ－α２もしくはＰｕｒｉｆ－ｅｓｐｏｉｒ２）などを適宜使用した。溶出溶媒はＴＬＣ観察を基に決定した。
　なお、以下の参考合成例、合成例、参考例、および実施例で用いる略号は、次のような意義を有する。
ｍｇ：ミリグラム，ｇ：グラム，μＬ：マイクロリットル，ｍＬ：ミリリットル，ｍｍｏｌ：ミリモル，ｍＭ：ミリモル濃度，μＭ：マイクロモル濃度，μｍ：マイクロメートル，ｍｍ：ミリメートル，ＭＨｚ：メガヘルツ。
　以下の参考合成例および合成例において、核磁気共鳴（以下、１Ｈ　ＮＭＲ）スペクトルは、テトラメチルシランを標準物質として、ケミカルシフト値をδ値（ｐｐｍ）にて記載した。***パターンは一重線をｓ、二重線をｄ、三重線をｔ、四重線をｑ、多重線をｍ、ブロードをｂｒで示した。質量分析（以下、ＭＳ）は、ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、もしくはＦＡＢ（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法で行った。
参考合成例１
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５１ｇ，８．４３ｍｍｏｌ）、市販の５－ブロモチアゾール－２－アミン（２．６４ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）および３－ヒドロキシトリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン（１．２３ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液に、１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド　塩酸塩（２．４３ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．９４ｍＬ，１６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を１Ｎ塩酸および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール　酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物１．８８ｇ（収率６６％）を固体として得た。
参考合成例２
Ｎ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－ブロモアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４．６６ｇ（収率８４％）を固体として得た。
参考合成例３
Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－ブロモ－２－フルオロアニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物３４５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
参考合成例４
Ｎ－（５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－ブロモ－４－メチル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２５２ｍｇ（収率２５％）を固体として得た。
参考合成例５
Ｎ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２－アミノ－６－ブロモベンゾチアゾールを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５８５ｍｇ（収率４２％）を固体として得た。
参考合成例６
Ｎ－（４－ブロモ－２－メチル－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－ブロモ－２－メチル－アニリンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物５１５ｍｇ（収率６６％）を固体として得た。
参考合成例７
Ｎ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－ブロモピリジン－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物４５５ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
参考合成例８
Ｎ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６３７ｍｇ（収率７６％）を固体として得た。
参考合成例９
５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン
　ＷＯ２００３０１４０９５記載のＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－１，１－ジフェニル－メタンイミン（１．４６ｇ，４．２５ｍｍｏｌ）、市販の４－（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（４．３０ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．９７ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）、水（３ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１５ｍＬ）の混合物に［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド　ジクロロメタン錯体（１：１）（３３８ｍｇ，０．４１４ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－３／１）にて精製した。得られた油状物のメタノール（２０ｍＬ）溶液に、１Ｎ塩酸（５ｍＬ，５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５．５時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、析出した固体をジクロロメタンにて洗浄し、標記化合物８９７ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
参考合成例１０
ｔｅｒｔ－ブチル　Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）カーバメート（５００ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（３０ｍＬ）溶液に、室温にて［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］ボロン酸（５１９ｍｇ，２．６９ｍｍｏｌ）および［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド　ジクロロメタン錯体（１：１）（７４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。反応混合物に炭酸カリウム（７４３ｍｇ，５．３８ｍｍｏｌ）および水（３．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、１００℃にて４．５時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９３／７、９０／１０－７０／３０）にて精製し、標記化合物１７２ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
参考合成例１１
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミド
　参考合成例１０で得られたｔｅｒｔ－ブチル　Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］カーバメート（１７２ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、室温にてトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ，２６ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、放置した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物１１８ｍｇ（収率９６％）を固体として得た。
参考合成例１２
５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミン
　市販の１，３－ベンゾジオキソール－５－イルボロン酸を用いて、参考合成例１０の方法に準じて成績体を得た後、参考合成例１１の方法に準じて標記化合物１２３ｍｇ（３１％，２ｓｔｅｐｓ）を固体として得た。
参考合成例１３
４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリル
　市販の４－（２－オキソエチル）ベンゾニトリル（１４２ｍｇ，０９７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍL）溶液に、氷冷下、臭素（５６μL，１．０９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５６ｍL）溶液を加えた。反応液を室温まで戻した後、３時間攪拌した。氷冷下、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣のエタノール（３０ｍL）溶液に、チオウレア（１５０ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を加え、４．５時間加熱還流下、攪拌した。冷却後、減圧下にて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物８．３ｍｇ（４．２％）を固体として得た。
参考合成例１４
ｔｅｒｔ－ブチル　２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　２－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェノキシ］アセテート（２．４ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１０の方法に準じて標記化合物２４８ｍｇ（１１％）を固体として得た。
参考合成例１５
メチル　２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテート
　参考合成例１４で得られたｔｅｒｔ－ブチル　２－［４－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（１９３ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１１の方法に準じて固体を得た。得られた固体のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）およびメタノール（３ｍＬ）の混合溶液に、室温にてトリメチルシリルジアゾメタン（０．６Ｍ　ヘキサン溶液，１．０ｍL）を加え、６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９７／３）にて精製し、標記化合物９２．５ｍｇ（収率７４％）を固体として得た。
参考合成例１６
メチル　２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート
　参考合成例１５で得られたメチル　２－［４－（２－アミノチアゾール－５－イル）フェノキシ］アセテートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物８５．７ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
参考合成例１７
メチル　２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
　市販のメチル　８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（２６１ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシンイミド（２２８ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加え、４時間攪拌した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－２／１）にて精製し、標記化合物５６．９ｍｇ（収率１６％）を固体として得た。
参考合成例１８
２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１７で得られたメチル　２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（５６．９ｍｇ，０．２０９ｍｍｏｌ）のエタノール（２ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて２時間攪拌した。１Ｎ塩酸を用いて酸性とした後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、黄色固体（５２．５ｍｇ）を得た。得られた固体（５２．５ｍｍｏｌ）および参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物４８．０ｍｇ（収率５５％）を固体として得た。
参考合成例１９
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１７で得られたメチル　２－ブロモ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６５．２ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０，２０１ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１７１ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、［１，１‘－ビス（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（１５．６ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて２．５時間攪拌した。反応液に水および１Ｎ塩酸を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２３．９ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
参考合成例２０
メチル　２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート
　市販のＮ－クロロスクシンイミドを用いて、参考合成例１７の方法に準じて標記化合物５６．３ｍｇ（収率５．２％）を固体として得た。
参考合成例２１
メチル　５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート
　市販のメチル　８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（９８７ｍｇ，４．８９ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（１．２７ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、－７８℃において１．０Ｍ　カリウム　ビス（トリメチルシリル）アミド　テトラヒドロフラン溶液（１１．２ｍＬ，１１．２ｍｍｏｌ）を３０分以上かけて滴下した。同温度で１時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチした。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝６／１－１／１）にて精製し、標記化合物５９２ｍｇ（収率５６％）を油状物として得た。
参考合成例２２
５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸
　参考合成例２１で得られたメチル　５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキシレート（６３．０ｍｇ，０．３０４ｍｍｏｌ）のエタノール（１．０ｍＬ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．９１ｍＬ，０．９１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃にて２時間攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸を加えて中和した後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物４８．３ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
参考合成例２３
Ｎ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２２で得られた５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボン酸（４７２ｍｇ，２．４４ｍｍｏｌ）を用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物６２８ｍｇ（収率７３％）を固体として得た。
参考合成例２４
Ｎ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－アミンを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２８７ｍｇ（収率４３％）を固体として得た。
参考合成例２５
メチル　５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
　市販のメチル　２－アミノ－５－ブロモチアゾール－４－カルボキシレートを用いて、参考合成例１の方法に準じて標記化合物２１９ｍｇ（収率２９％）をアモルファス状物として得た。
合成例１
８－オキソ－Ｎ－（５－フェニルチアゾール－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１．５ｇ，８．４ｍｍｏｌ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８３， ２６， １１５８－１１６３記載の５－フェニルチアゾール－２－アミン（１．０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．１４ｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、室温にて市販の２，４，６－トリイソプロピルスルホニル　クロリド（２．５ｇ，８．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物１．５９ｇ（収率８３％）を固体として得た。
合成例２
メチル　４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート
　ＷＯ２０１２１２１１６８記載のメチル　４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾエートを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１８．４ｇ（収率５４％）を固体として得た。
合成例３
Ｎ－［５－［４－（ジメチルカルバモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１１で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルベンズアミドを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物７．１７ｇ（収率７５％）を固体として得た。
合成例４
Ｎ－［５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１２で得られた５－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１３０ｍｇ（収率６２％）を固体として得た。
合成例５
４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸
　合成例２で得られたメチル　４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］ベンゾエート（３８３ｍｇ，０．９６９ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３．８ｍＬ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加え、１Ｎ塩酸にて中和し、析出した固体をろ取した。得られた固体を水で洗浄した後、乾燥し、標記化合物３２６ｍｇ（収率８８％）を固体として得た。
合成例６
Ｎ－［５－（４－カルバモイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例５で得られた４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］安息香酸（１７ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液に、室温にて［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］－ジメチル－アンモニウム　ヘキサフルオロホスフェート（２５ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３９μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）および７Ｍアンモニア　メタノール溶液（６４μＬ，０．４５ｍｍｏｌ）を加え、１５時間攪拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／５０％メタノール　酢酸エチル溶液　＝９５／５－９０／１０）にて精製し、標記化合物４．９ｍｇ（収率２９％）を得た。
合成例７
Ｎ－［５－（４－シアノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１３で得られた４－（２－アミノチアゾール－５－イル）ベンゾニトリルを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率６０％）を得た。
合成例８
Ｎ－［５－［４－［２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－エトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１６で得られたメチル　２－［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェノキシ］アセテート（８４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８．０ｍＬ）およびメタノール（３．０ｍＬ）の混合溶液に、室温にて５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．２０ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した後、一晩放置した。５Ｎ塩酸にて中和し、減圧下にて溶媒を留去し固体を得た。得られた固体のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、室温にてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５２μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）および２．０Ｍジメチルアミン　テトラヒドロフラン溶液（０．５０ｍＬ, １．０ｍｍｏｌ）を加えた後、［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イロキシ）メチレン］ジメチルアンモニウム　ヘキサフルオロホスフェート（４２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え、３時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９９／１－９５／５）にて精製し、標記化合物３９．１ｍｇ（収率８９％）を固体として得た。
合成例９
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボン酸（１０９ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）、参考合成例９で得られた５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－アミン（１２７ｍｇ，０．４８８ｍｍｏｌ）、３－ヒドロキシトリアゾール［４，５－ｂ］ピリジン（１２８ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に、室温にて１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド　塩酸塩（３５２ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５３１ｍＬ，３．０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、ろ過し、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル溶液＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物７４．３ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
合成例１０
（５Ｒ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド　および
（５Ｓ）－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例９で得られた８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いてＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ　ＣＨＩＲＡＬ　ＡＲＴ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＢ（５μｍ）　２５０ｘ３０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：３１．８ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度　９９．９％ｅｅ）を固体として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（４８ｍｇ，光学純度　９９．８％ｅｅ）を固体として得た。
合成例１１
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１３７ｍｇ，０．４０１ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（３８９ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（６７０ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３３．２ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物６３．３ｍｇ（収率３９％）を固体として得た。
合成例１２
Ｎ－［５－（４－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．０ｍｇ（収率６．４％）を固体として得た。
合成例１３
Ｎ－［５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（３－クロロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１５８ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
合成例１４
Ｎ－［５－（２－クロロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率８．０％）を得た。
合成例１５
Ｎ－［５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（３－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１２７ｍｇ（収率８７％）を固体として得た。
合成例１６
Ｎ－［５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（４－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１９８ｍｇ（収率６４％）を固体として得た。
合成例１７
Ｎ－［５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（２－フルオロフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例１の方法に準じて標記化合物１１９ｍｇ（収率８２％）を固体として得た。
合成例１８
８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール］－２－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２４．７ｍｇ（収率１８％）を固体として得た。
合成例１９
Ｎ－［５－（ｏ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１６．６ｍｇ（収率１１％）を固体として得た。
合成例２０
Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１１５ｍｇ（収率５８％）を得た。
合成例２１
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（トリフルオロメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３２．９ｍｇ（収率１７％）を得た。
合成例２２
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（２－メトキシフェニル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１６％）を得た。
合成例２３
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（ｐ－トリル）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（ｐ－トリル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４２％）を得た。
合成例２４
Ｎ－［５－（２－ナフチル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（２－ナフチル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．６ｍｇ（収率８．２％）を得た。
合成例２５
８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．０ｍｇ（収率４３％）を得た。
合成例２６
Ｎ－［５－（４－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１９．７ｍｇ（収率１７％）を固体として得た。
合成例２７
Ｎ－［５－（３－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（３－メトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．９ｍｇ（収率３８％）を得た。
合成例２８
Ｎ－［５－［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［２－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．２ｍｇ（収率１９％）を得た。
合成例２９
Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８．４ｍｇ（収率３８％）を得た。
合成例３０
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１２％）を得た。
合成例３１
Ｎ－［５－［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－（ヒドロキシメチル）－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．１ｍｇ（収率４０％）を得た。
合成例３２
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－ベンジルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３４％）を得た。
合成例３３
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２９．０ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
合成例３４
Ｎ－（４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－メチル－５－フェニルチアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物１６０ｍｇ（収率８２％）を得た。
合成例３５
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－メチルチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１０６ｍｇ，０．３００ｍｍｏｌ）、市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸（２９２ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５９６ｍｇ，１．８３ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´，４´，６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（２５．０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて５時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製した後、得られた固体をジエチルエーテルにて洗浄し、標記化合物６５．０ｍｇ（収率５１％）を固体として得た。
合成例３６
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７２．０ｍｇ（収率４９％）を得た。
合成例３７
Ｎ－［５－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．３ｍｇ（収率２９％）を得た。
合成例３８
Ｎ－［５－［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（２－メトキシエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率２．７％）を得た。
合成例３９
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３５％）を得た。
合成例４０
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．４ｍｇ（収率４５％）を得た。
合成例４１
Ｎ－［５－（４－モルフォリノフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－［４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル］モルホリンを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２７．６ｍｇ（収率２４％）を固体として得た。
合成例４２
Ｎ－［５－［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（ジメチルスルファモイル）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４４％）を得た。
合成例４３
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６２．８ｍｇ（収率３３％）を固体として得た。
合成例４４
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－ベンジルオキシ－２－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物９．７ｍｇ（収率４２％）を得た。
合成例４５
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
合成例４６
８－オキソ－Ｎ－［５－（４－フェノキシフェニル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－フェノキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５３．０ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
合成例４７
Ｎ－［５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の５－（４－ブロモフェニル）チアゾール－２－アミンを用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７５５ｍｇ（収率５９％）を固体として得た。
合成例４８
ｔｅｒｔ－ブチル　［４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］フェニル］カーボネート
　市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率４．３％）得た。
合成例４９
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．５ｍｇ（収率３２％）を得た。
合成例５０
Ｎ－［５－（シクロヘキセン－１－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２－（シクロヘキセン－１－イル）－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．８ｍｇ（収率１３％）を固体として得た。
合成例５１
ｔｅｒｔ－ブチル　４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．７ｍｇ（収率３５％）を得た。
合成例５２
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．２ｍｇ（収率１５％）を得た。
合成例５３
ｔｅｒｔ－ブチル　３－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレート
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－２，５－ジヒドロピロール－１－カルボキシレートを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．６ｍｇ（収率３５％）を得た。
合成例５４
Ｎ－［５－（５－メチル－２－フリル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４，４，５，５－テトラメチル－２－（５－メチル－２－フリル）－１，３，２－ジオキサボロランを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．３ｍｇ（収率４３％）を得た。
合成例５５
Ｎ－［５－（２，４－ジメチルチアゾール－５－イル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の２，４－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）チアゾールを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物３．６ｍｇ（収率１９％）を得た。
合成例５６
Ｎ－［５－（５－クロロ－２－チエニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（５－クロロ－２－チエニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．０ｍｇ（収率５．２％）を得た。
合成例５７
Ｎ－［５－（４－アセチルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－アセチルフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．２ｍｇ（収率３３％）を得た。
合成例５８
１－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボキサミド
　市販の１－オキソ－２，３－ジヒドロピロリジン－３－カルボン酸を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物７１．９ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
合成例５９
８－オキソ－Ｎ－［６－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５９．５ｍｇ（収率４６％）を固体として得た。
合成例６０
Ｎ－［６－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．２ｍｇ（収率４９％）を得た。
合成例６１
Ｎ－［６－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１２．６ｍｇ（収率５４％）を得た。
合成例６２
２－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１８で得られた２－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（４２．８ｍｇ，０．０８５６ｍｍｏｌ）、市販の２，４，６－トリメチル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリボリナン（０．１２７ｍＬ，０．９０８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８４ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）の混合物に１，４－ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（１５．３ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１００℃にて４時間攪拌した。原料が残存していたため、再度同様の操作を繰り返し原料の消失を確認した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝９／１－１／１）にて精製し、標記化合物５．６ｍｇ（収率１５％）を固体として得た。
合成例６３
Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）チアゾール－２－イル］－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例１９で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－２－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物６．４ｍｇ（収率２２％）を固体として得た。
合成例６４
２－クロロ－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２０で得られたメチル　２－クロロ－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキシレート（６６．２ｍｇ，０．２９１ｍｍｏｌ）のエタノール（１ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１ｍＬ）混合溶液に、室温にて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ，０．５ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応液に水を加えた後、１Ｎ塩酸を加えて酸性とし、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣（カルボン酸化合物６２ｍｇ）を用いて、合成例９の方法に準じて標記化合物６８．０ｍｇ（収率３７％）を固体として得た。
合成例６５
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［４－トリフルオロメトキシ］フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２３で得られたＮ－（５－ブロモチアゾール－２－イル）－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド（１６８ｍｇ，０．４７５ｍｍｏｌ）、市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸（５８８ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（１．０３ｇ，３．１６ｍｍｏｌ）の混合物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えた後、クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２´４´６´－トリイソプロピル－１，１´－ビフェニル）［２－（２´－アミノ－１，１´－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）（３８．６ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、９０℃にて４時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３／１－０／１）にて精製し、標記化合物５９．７ｍｇ（収率２９％）を固体として得た。
合成例６６
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－（ｐ－トリル）チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．６ｍｇ（収率４７％）を得た。
合成例６７
５－メチル－Ｎ－［５－（ｍ－トリル）チアゾール－２－イル］－８オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の３－メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．１ｍｇ（収率４４％）を得た。
合成例６８
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物０．６ｍｇ（収率３．０％）を得た。
合成例６９
Ｎ－［５－（４－イソプロポキシフェニル）チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－イソプロポキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物６．８ｍｇ（収率３３％）を得た。
合成例７０
５－メチル－Ｎ－［５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物８．３ｍｇ（収率３７％）を得た。
合成例７１
Ｎ－［５－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－５－メチル－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
合成例７２
５－メチル－８－オキソ－Ｎ－［５－［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例６５の方法に準じて標記化合物７．８ｍｇ（収率３６％）を得た。
合成例７３
８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１．２１ｇ，３．６２ｍｍｏｌ）および市販の４－（トリフルオロメトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１．２９ｇ（収率８６％）を固体として得た。
合成例７４
Ｎ－［４－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率５０％）を得た。
合成例７５
Ｎ－［４－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１１．５ｍｇ（収率５８％）を得た。
合成例７６
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２で得られたＮ－（４－ブロモフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７．０ｍｇ（収率３１％）を得た。
合成例７７
３－ブロモ－８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例７３で得られた８－オキソ－Ｎ－［４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド（１５０ｍｇ，０．３６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、室温にてＮ－ブロモスクシイミド（４５．９ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）を加え４．５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／１０％メタノール　酢酸エチル溶液＝３／１－１／１）にて精製し、標記化合物９３．６ｍｇ（収率５２％）を固体として得た。
合成例７８
Ｎ－［２－フルオロ－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７３．４ｍｇ（収率９１％）を固体として得た。
合成例７９
Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－クロロ－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物５．０ｍｇ（収率２１％）を得た。
合成例８０
Ｎ－［４－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－フルオロフェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例３で得られたＮ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドを用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．０ｍｇ（収率８４％）を固体として得た。
合成例８１
Ｎ－［２－メチル－４－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］フェニル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例６で得られたＮ－（４－ブロモ－２－メチルフェニル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１８４ｍｇ（収率９２％）を固体として得た。
合成例８２
８－オキソ－Ｎ－［５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－２－ピリジル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例７で得られたＮ－（５－ブロモ－２－ピリジル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物４．０ｍｇ（収率１７％）を得た。
合成例８３
８－オキソ－Ｎ－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾトリアゾール－６－イル］－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例８で得られたＮ－（２－クロロ－１，３－ベンゾチアゾール－６－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物８６．８ｍｇ（収率５８％）を固体として得た。
合成例８４
Ｎ－［５－（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロインドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４８％）を得た。
合成例８５
Ｎ－［５－（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－ベンジルオキシ－３－フルオロフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．４ｍｇ（収率４４％）を得た。
合成例８６
Ｎ－［５－（４－イソブトキシフェニル）－４－メチル－チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（４－イソブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．２ｍｇ（収率５８％）を得た。
合成例８７
Ｎ－［５－（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の（５－クロロ－６－イソブトキシ－３－ピリジル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物６．６ｍｇ（収率２９％）を得た。
合成例８８
Ｎ－［４－メチル－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１３．２ｍｇ（収率５９％）を得た。
合成例８９
Ｎ－［４－メチル－５－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物７．５ｍｇ（収率３３％）を得た。
合成例９０
ｔｅｒｔ－ブチル　４－［４－メチル－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート
　市販のｔｅｒｔ－ブチル　４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートを用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１２．８ｍｇ（収率５６％）を得た。
合成例９１
Ｎ－［５－［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（ジフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１０．９ｍｇ（収率５２％）を得た。
合成例９２
Ｎ－［６－［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［３－メチル－４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１４．０ｍｇ（収率５８％）を得た。
合成例９３
Ｎ－［６－（４－クロロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物２．８ｍｇ（収率１３％）を得た。
合成例９４
Ｎ－［６－（４－フルオロフェニル）－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例５で得られたＮ－（６－ブロモ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の４－フルオロフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物１３．０ｍｇ（収率６４％）を得た。
合成例９５
Ｎ－［５－（４－ベンゾイルフェニル）チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　市販の４－ベンゾイルフェニルボロン酸を用いて、合成例１１の方法に準じて標記化合物７５．４ｍｇ（収率２８％）を固体として得た。
合成例９６
Ｎ－［４－イソプロピル－５－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　参考合成例２４で得られたＮ－（５－ブロモ－４－イソプロピル－チアゾール－２－イル）－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよび市販の［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物１１２．２ｍｇ（収率６６％）を得た。
合成例９７
Ｎ－［５－［１－（２－メチルプロパノイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル　４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレート（１３９ｍｇ，０．３１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、室温にてトリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を加え、２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを加えて数回共沸し、油状物（２２６ｍｇ）を得た。得られた油状物（６８ｍｇ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１０ｍＬ）のジクロロメタン溶液（３ｍＬ）に、氷冷下、２－メチルプロパノイル　クロリド（０．０３２ｍＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１－１／２）にて精製し、標記化合物５０．３ｍｇ（収率８１％）を固体として得た。
合成例９８
Ｎ－［５－［１－（イソプロピルカルバモイル）－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル］チアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例５１で得られたｔｅｒｔ－ブチル　４－［２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－５－イル］－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－１－カルボキシレートおよび２－イソシアナートプロパンを用いて、合成例９７の方法に準じて標記化合物３０．６ｍｇ（収率４８％）を固体として得た。
合成例９９
メチル　２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］－５－［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］チアゾール－４－カルボキシレート
　参考合成例２５で得られたメチル　５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の［４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）フェニル］ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４２．３ｍｇ（収率３１％）を得た。
合成例１００
メチル　５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレート
　参考合成例２５で得られたメチル　５－ブロモ－２－［（８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボニル）アミノ］チアゾール－４－カルボキシレートおよび市販の（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）ボロン酸を用いて、合成例３５の方法に準じて標記化合物４５．８ｍｇ（収率３８％）を得た。
合成例１０１
（５Ｒ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド　および
（５Ｓ）－Ｎ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミド
　合成例３５で得られたＮ－［５－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－４－メチルチアゾール－２－イル］－８－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－インドリジン－５－カルボキサミドおよびＹＭＣ　ＣＨＩＲＡＬ　ＡＲＴ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＳＣ（１０μｍ）　２５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、流速：２．３ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒：ｎ－ヘキサン／エタノール＝４０／６０）にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度　＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物（５３ｍｇ，光学純度　＞９９％ｅｅ）をアモルファス状物として得た。
　以下の表に参考合成例および合成例で合成した化合物の構造式および物理化学データを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
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［参考例１］ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果の評価
　ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果（薬効）の評価系は、公知情報（非特許文献６）を参考に構築した。また、各分化ステージで使用する培地も上記公知情報を参考に作成した（ステージ１～５に対して、各々、非特許文献６記載の分化培地Ａ～Ｅ（Ｍｅｄｉｕｍ Ａ～Ｅ）を使用。ただし、分化培地Ｅに関してはＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミドを含んでいないものを使用）。
　化合物の薬効を評価するため、陽性コントロールとして合成例１の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＳＩＧＭＡ、Ｄ２６５０）を用いた。全ての化合物はＤＭＳＯで溶解させ、培地へ添加後の化合物の終濃度が２μＭおよび１０μＭとなるように２種類の化合物溶液を調製した。以下の評価において、化合物溶液はＤＭＳＯの終濃度０．１％となるように培地に添加した。
　まず、非特許文献６の「ヒトｉＰＳ細胞から膵β細胞への分化誘導」の方法に従い、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｏｅ株（医薬基盤研究所）から培養７日目の細胞（分化培地Ｃに交換して２日後（ＦＯＸＡ２陽性原始腸管細胞からＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化過程の細胞）まで誘導し、細胞を回収後、バンバンカー（日本ジェネティクス）を用いて１ｘ１０７細胞／ｍＬ／チューブにて液体窒素中に保存し、評価用細胞ストックを作製した。薬効評価の開始時に本細胞ストックを溶解し、ステージ３用の分化培地Ｃ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９６５０９２）、０．２５μＭ ＳＡＮＴ－１、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００７４）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２, ２μＭ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００２１）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）に懸濁後、シンセマックスＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃５６５６）でコートした９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３３４０）に１ｘ１０５細胞／ウェル播種した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ３用の分化培地Ｃを１００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ４用の分化培地Ｄ（ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、 ０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９、５μＭ ＴＧＦ－β ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ６１６４５２）、０．３μＭ （－）－ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ （Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ＡＬＸ－４２０－０１１－Ｃ３００）、１％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を１００μＬ／ウェル添加した。２～３日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはＤＭＳＯのみを添加した新しいステージ５用の分化培地Ｅ（ＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびニコチンアミド不含；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ/Ｆ－２０ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６６００１２）、 １％ Ｂ２７ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を２００μＬ／ウェル添加した。２日間培養後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（Ｗａｋｏ、１６３－２０１４５）を１５０μＬ／ウェル添加し、３０～６０分間室温に置いて細胞を固定した。１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）を含むりん酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８１）で１５分間室温に置いた後、ＰＢＳ－Ｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｔ９１８３）で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔで希釈した２０％　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅを除去後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅで２００倍に希釈したモルモット抗インスリン抗体（アブカム、ａｂ７８４２）を５０μＬ／ウェル添加し、一晩４℃に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅで１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４８標識抗モルモット抗体（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１０７５）および６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加して２時間室温に置いた。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、細胞の蛍光画像の解析を行った。
　細胞画像の撮影はハイコンテンツイメージングシステムＯｐｅｒａ　ＰｈｅｎｉｘあるいはＯｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて行った。更に、Ｈａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた解析によりインスリン陽性細胞およびＤＡＰＩ陽性総細胞数を計測し、総細胞数に対するインスリン陽性細胞数の割合（インスリン陽性細胞率）を算出した。陽性コントロールとして合成例１の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度０．１％のＤＭＳＯを用いた。１０μＭの合成例１の化合物におけるインスリン陽性細胞率（３０例の平均インスリン陽性細胞率、１３％）の化合物無処置コントロール(３０例の平均インスリン陽性細胞率、４．９％)からの増加分を１００％とし、これを基準に各化合物各濃度のインスリン陽性細胞率増加分を百分率（％）に換算し、活性値とした。化合物の一次評価は、陽性コントロールを含めて各化合物は、２μＭおよび１０μＭの２種類の濃度で、複数のウェルを用いて実施した。両濃度における活性値の和を陽性コントロールと比較することにより活性強度を判断した。両濃度における活性値の和が、化合物無処置コントロールに比べて明らかに高いが、陽性コントロールよりも低い場合を＋、陽性コントロールと同等な場合を＋＋、陽性コントロールよりも高い場合を＋＋＋と表記した。活性強度が弱い化合物に関しては、０．４、２、５あるいは１０μＭの濃度で、複数のウェルを用いて再評価を実施し、化合物無処置コントロールに比べて明らかに活性値が高いか、もしくは何れかの濃度での活性値が１５％以上を示し、化合物無処置コントロールと比較したｔ検定によって有意差（Ｐ＜０．０５）を示した化合物を有効と判断した。比較的強い薬効を示した化合物については、濃度依存的効果を調べるため、０．０１～１０μＭの濃度で複数のウェルを用いて二次評価を実施し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＥＣ５０（１０μＭの合成例１の化合物の薬効を１００％とした場合に、その５０％に相当する薬効を発揮できる化合物の濃度）を算出した。
　参考例１の結果を表３および表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　参考例１の結果より、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は化合物を添加しない場合と比較し、多能性幹細胞を効率的にインスリン産生細胞に分化させ得ることが分かった。
［実施例１］
（Ａ）結果
（１）新規β細胞分化誘導剤のスクリーニング
　以前に報告されたように（Ｓａｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４；　Ｓｈｉｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子を担持するマウスＥＳ細胞株ＳＫ７を、β細胞分化を増強する小分子化合物のスクリーニングのためのアッセイ系の確立のために使用した。
　約５５，０００の化合物を用いた一次スクリーニングキャンペーン、続いて有効性の再現性および用量依存性を確認するための反復アッセイの後に、ヒット化合物Ｋ－１（合成例１で合成された化合物）がβ細胞分化を増強する新規化合物として発見された（図１）。Ｋ－１はＰｄｘ１－ＧＦＰ＋インスリン＋二重陽性細胞の比率およびインスリン１の発現を用量依存的に増加させた。Ｋ－１は、γ－セクレターゼ阻害剤ＬＹ４１１５７５によるＰｄｘ１－ＧＦＰ＋Ｉｎｓ＋二重陽性細胞の増加（Ｔｒｅｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）を更に亢進した。この結果は、以前に膵臓内分泌分化を促進することが報告されているγ－セクレターゼ阻害とは異なる作用機序によって、Ｋ－１がその効力を示すことを表している。
（２）Ｋ－１とその誘導体はヒトｉＰＳ細胞由来β細胞の分化を促進する。
　ヒトｉＰＳ細胞のインスリン発現β（ｈｉＰＳ－β）細胞への分化に対する化合物の有効性を、２つの異なる分化プロトコールおよび３つのヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｏｅ、ＲＰＣｈｉＰＳＣ７７１、およびＦｆ－Ｉ０１ｓ０１（ＨＬＡホモ接合体患者由来のｉＰＳＣ））を用いて調べた（図２－１ａ）。本発明者は、分化プロトコール＃１の下で単層培養において、ステージ３の後期からステージ５の初期までの間のＫ－１によるＴｏｅ　ｉＰＳＣの処理を最初に試験した。それはｉＰＳ－β細胞への強化された分化をもたらした（図２－１ａおよびｂ）。本発明者はまたＫ－３（合成例９で合成された化合物）、Ｋ－４（合成例３３で合成された化合物）、およびＫ－５（合成例１０１ｂで合成された化合物）のような他の誘導体の効果を検査した。Ｋ－３およびＫ－５は、元の化合物であるＫ－１よりも強力な効力を示すことが判明した（図２－１ｂ）。
　次に、本発明者が最近確立した他の分化プロトコールを用いてＫ－３の効果を試験した。本発明者は以前、分化前の短期間のメチオニン除去処理が分化の増強をもたらすことを発見した（Ｓｈｉｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）。従って、本発明者は、短時間（５時間）のメチオニン除去を組み入れ、分化プロトコール＃１の下でＲＰＣｈｉＰＳ７７１　ｉＰＳＣのスフェア培養を行い、高機能性ｉＰＳ－β細胞を得た（Ｓｈｉｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）。Ｋ－３は、０．２５μＭでＩＮＳＵＬＩＮ＋ＰＤＸ１＋二重陽性細胞への分化を増強した（図２－１ｃ）。次に、分化プロトコール＃２を用いた。ここでは、分化前に細胞をメチオニン除去で前処理し、そして亜鉛濃度を調節できる培地を用いて分化を行った。このプロトコールの下で、Ｋ－３はＦｆ－Ｉ０１ｓ０１のＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋、ＮＫＸ６．１＋ＰＤＸ１＋二重陽性、およびＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋ＰＤＸ１＋三重陽性細胞への分化を増強した。これらは、ステージ４の終わりに現れ、その後増加した（図２－１ｄ）。Ｋ－３がステージ３を含むタイムウィンドウに添加された場合、Ｋ－３が分化を最も効果的に増強することを見出した。Ｋ－３はまた特にステージ３から５における処理によりＮＫＸ６．１＋およびＩＮＳＵＬＩＮ＋ＮＫＸ６．１＋二重陽性細胞の生成を促進した（図２－１ｄ）。
　次いで、プロトコール＃１、ＲｐＣｈｉＰＳＣ７７１のスフェア培養の下で生成されたｉＰＳ－β細胞の機能アッセイを実施した。この機能アッセイでは、Ｋ－３のほか、Ｋ－５、Ｋ－６（合成例４５で合成された化合物）、Ｋ－７（合成例９３で合成された化合物）も使用した。Ｋ－３を含むヒット化合物は、得られたｉＰＳ－β細胞のグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の活性を増強し、段階的な経時的測定で、急速な第１相および長期持続する第２相インスリン分泌を示した（図２－２ｅ、左）。ＧＳＩＳ活性を定量するために、従来のバッチアッセイもまた実施した（図２－２ｅ、右）。Ｋ－３は培養プロトコール＃２においても同様の効果を示した（図２－２ｆ）。従って、これは、それらの有効性が培養プロトコールや細胞株の変動性に依存しないことを示している。Ｋ－３によって処理されたｉＰＳ－β細胞は、インスリン分泌促進薬（グリベンクラミド、エキセンディン４、およびＫＣｌ）への刺激によって増強されたｃ－ペプチド分泌を示し（図２－２ｇ）、このことは、化合物が機能的成熟を増強するかまたは細胞のインスリン含有量を増加させることを示す。
（Ｂ）方法
（１）ｍＥＳおよびｈｉＰＳ細胞株の培養
　ＳＫ７マウスＥＳ細胞株は、Ｐｄｘ１－ＧＦＰ遺伝子を有するトランスジェニックマウス系統から樹立され、以前に記載されているように（Ｓｈｉｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）、ＭＥＦフィーダー細胞（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で維持された。ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞株は、国立バイオメディカルイノベーション研究所（Ｊａｐａｎ）の細胞バンクから入手し、以前に記載されたように（Ｓｈａｈｊａｌａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）、フィーダーフリー異種条件で維持した。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞はリプロセルから購入し、ＦｆＩ－０１ｓ０１細胞はＣｉＲＡから提供された。ＲＰＣｈｉＰＳ７７１細胞およびＦｆｌ－０１ｓ０１細胞を、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　３５３５ＸＸ１）被覆皿上で、それぞれＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１５１７００１）およびＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ（味の素）を使って培養した。
（２）ＳＫ７マウスＥＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞の分化
　ＳＫ７マウスＥＳ細胞を、基本的に以前の報告（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１５）に従って、β細胞に分化させた。手短に言えば、細胞を、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　３８４ウェル（ＣＯＲＮＩＮＧ，　３７７０）細胞培養プレートに１ウェルあたり５，０００細胞で、または０．２％ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）に１ウェルあたり２０，０００細胞で、播種した。その後、細胞を培地１で１日目から５日目まで培養した。培地１は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ，　１１１４０－５０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｎａｋａｌａｉ，　１６９４８－０４）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｎａｋａｌａｉ，　２６２５２－９４）、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％のインスリン－トランスフェリン－セレンサプリメント（ＩＴＳ：Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　４１４０００４５）、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，　１１０２００２１）、および１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトアクチビン－Ａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　３３８－ＡＣ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　１１９６５０９２）からなる。続いて、１０μＭのレチノイン酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，　０４－００２１）を補充した培地１からなる培地２中で１日間培養した。６日目に培地を培地３に交換し、β細胞への分化を誘導するために１２日目まで培養を続けた。培地３は、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％のＩＴＳ、０．２５％のＡｌｂｕｍａｘ、および３ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，　Ｎ０６３６－５００Ｇ）を添加したＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　１１８８５０８４）からなる。試験化合物を８日目に添加し、細胞をハイコンテントイメージャーによる分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
　ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞を、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ　ＩＩで被覆したＣｅｌｌＢＩＮＤ　６ウェル（ＣＯＲＮＩＮＧ，　ＣＬＳ３３３５）細胞培養プレートに播種し、以前に記載した方法（Ｓｈａｈｊａｌａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）によって原始腸管細胞に分化させた。細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，　１２５６３０１１）で解離させ、使用するまで１．０～２．０×１０７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度でＢａｎＢａｎｋｅｒ（Ｎｉｐｐｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）中で凍結保存した。化合物添加の１日前に、細胞を、ステージ３の培地（ＤＭＥＭ高グルコース、０．２５μＭのＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ，　１９７－１６３５１）、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，　０４－００７４）、１０μＭのＳＢ４３１５４２、２μＭのレチノイン酸、１％のＢ２７無血清サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　１７５０４０４４）中で解凍し、１ウェルあたり１５０，０００細胞でｓｙｎｔｈｅｍａｘ　ＩＩで被覆したＣｅｌｌＢＩＮＤ　９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，　３３４０）細胞培養プレートに播種した。試験化合物または陰性対照（０．０１％　ＤＭＳＯ）を含有するステージ３の培地中で細胞を１日間培養した。試験化合物または陰性対照を含有するステージ４および５の培地中でそれぞれ２日間および１日間さらに細胞を培養した。翌日、細胞をハイコンテントイメージャーで分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
　ＲＰＣｈｉｐＳ７７１細胞を上記のように維持し、プロトコール＃１に従って分化させた。手短に言えば、０日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで解離させ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，　６５７１８５）に移し、ロータリーシェーカー（９５　ｒｐｍ）上で培養した。１日目に、培地をメチオニン除去培地ＫＡ０１（Ａｊｉｎｏｍｏｔ）に交換し、５時間培養した。培地を分化培地１（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、Ｂ２７サプリメント、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）に交換し、細胞を１日間培養した（ステージ１－１）。その後、培地を、ＣＨＩＲ９９０２１を含まない培地１に交換し、２日間培養した（ステージ１－２）。細胞培養を培地２（ＲＰＭＩ、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、インスリンを除いたＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、０．２５μＭのＳＡＮＴ１）で２日間（ステージ２）、培地３（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１５μＭのＳＡＮＴ１、２μＭのレチノイン酸、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント）で６日間（ステージ３）、培地４（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　６１６４５２）、０．３μＭのインドラクタムＶ、０．１μＭのＬＤＮ１９３１８９、Ｂ２７サプリメント）で２日間（ステージ４）、培地５（ＫＯ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２　、Ｌ－Ｇｌｎ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４、１０ｍＭのニコチンアミド、１０μＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｂ２７サプリメント）で１３日間（ステージ５）続けた。分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％　ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（６日目～１４日目）に処理し、インスリン陽性に対する効果を確認するために１９日目に免疫染色を行い、２７日目にＧＳＩＳ（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）アッセイを行った。
　ＦｆＩ－０１ｓ０１細胞を上記のように維持し、そしてプロトコール＃２に従って分化させた。手短に言えば、細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで解離させ、ＡＫ０３Ｎ培地（味の素）中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で低付着６ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー（９５　ｒｐｍ）上で２４時間培養し、その後、培地を、ＡＫ０３Ｎベースのメチオニン除去培地ＫＡ０１に交換し、細胞を５時間培養した。その後、培地をＭ１－１　ＡＫＭ培地に交換し、細胞を２４時間培養した（ステージ１－１）。細胞をＭ１－２　ＡＫＭ培地で２日間培養し（ステージ１－２）、続いてＭ２　ＡＫＭ培地で２日間培養し（ステージ２－１）、Ｓ２培地で２日間培養し（ステージ２－２）、Ｓ３培地で２日間培養し（ステージ３）、Ｓ４培地で５日間培養し（ステージ４）、Ｓ５－１培地で４日間培養し（ステージ５－１）、Ｓ５－２培地で３日間培養した（ステージ５）。
ＡＫＭ培地はインスリンおよびＺｎ２＋除去ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３培地である。
Ｍ１－１　ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２２１を補充したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ１－２　ＡＫＭ培地：１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを添加したＡＫＭ（１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、Ｚ０．５μＭのＺｎ）培地。
Ｍ２　ＡＫＭ培地：５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１を補充したＡＫＭ（０．５μＭのＺｎ）。
Ｓ２培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦと４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
Ｓ３培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、５０ｎＭのインドラクタムＶ、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
Ｓ４培地：５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣ、１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９を補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
Ｓ５－１培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１００ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３、４４μｇ／ｍＬのビタミンＣを補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
Ｓ５－２培地：１０μＭのＡＬＫ５阻害剤、１０μＭのＤＡＰＴ、３３．３　ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２５　ｎＭのレチノイン酸、１μＭのＴ３を補充したＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ　０３。
　分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照（０．０１％ＤＭＳＯ）をステージ３および４の間（５日目～１３日目）に処理し、インスリン、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１の陽性に対する効果を確認するために、１４日目（ステージ４終了時）および２１日目（ステージ５終了時）に免疫染色を実施した。ＧＳＩＳアッセイは２１日目に実施した。
（３)β細胞分化を増強する化合物のスクリーニングおよびハイコンテントイメージングによる定量分析
　約５５，０００の化合物からなる化学ライブラリーを、β細胞分化誘導物質についてスクリーニングした。一次スクリーニングに関しては、化合物を２ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、ＳＫ－７マウスＥＳ細胞の分化の過程で、８日目に１：１０００で添加し、１０日目に培地を交換した。細胞を、１２日目にモルモット抗インスリン、ウサギ抗ＧＦＰで免疫染色することによりアッセイした。蛍光画像は、ＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステムおよびＨａｒｍｏｎｙ画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）により定量化した。核はＤＡＰＩ染色により同定され、抗体染色の陽性は核を囲む細胞質領域の蛍光強度により決定された。インスリンおよびＧＦＰの両方が陽性の細胞の数を数え、ＤＡＰＩ陽性総細胞数もしくは陽性エリア面積によって正規化した。４重データの中央値を計算し、スクリーニングヒットを、ＤＭＳＯ対照よりもインスリンおよびＧＦＰ陽性細胞数が増加した状態として定義した。本文に記載されているように、一次ヒット化合物を用量依存性および再現性についてさらに試験した。候補化合物の活性は再合成したものを用いて確認した。選択された候補化合物の活性は、マウスおよびヒトβ細胞分化の両方に対して有効性を有するヒット化合物を選択するために、ＴｏｅヒトｉＰＳ細胞アッセイシステムによってさらに分析された。化合物の添加は上記のようにして行い、有効性は３連の実験においてｑ－ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルによって評価した。スクリーニングヒットは、用量依存的に、ＤＭＳＯ対照よりもβ－アクチンと比較して増加したインスリン発現レベルを伴う状態として定義された。
（４）免疫細胞化学
　以下の抗体を使用して、通常のプロトコールと共に免疫細胞化学を実施した：ウサギ抗ＭＡＦＡ（Ａｂｃａｍ；　ａｂ２６４０５；　１／１００ｘ）、ヤギ抗ＰＤＸ１（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ；　ＡＦ２４１９；　１／１００ｘ）、マウス抗ＮＫＸ６．１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｏｗａ；　Ｆ６４Ａ６Ｂ４；　１／１００ｘ）、モルモット抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｄａｋｏ；　ＩＲ００２；　１／１０ｘ）、マウス抗ＩＮＳＵＬＩＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｉ２０１８；　１／１０００ｘ）、ウサギ抗Ｃ－ペプチド（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；　４５９３；　１／１００ｘ）、ウサギ抗ＧＦＰ（ＭＢＬ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒｐ；　５９８；　１／１０００ｘ）、およびマウス抗ＧＬＵＣＡＧＯＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｇ２６５４；　１／１０００ｘ）。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ　４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１１０２９，　１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ　４８８結合ロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　７０６－５４６－１４８）、ＡＦ６４７結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　７１１－６０６－１５２）、ＡＦ５６８結合ロバ抗マウスＩｇＧ（ＢＩＯＴＩＵＭ，　２０１０５）、Ａｌｅｘａ　５６８結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１１０７５，　１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ　５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１１０３１、１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ　５６８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ１１０３６，　１／１０００ｘ）、Ａｌｅｘａ　６３３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ａ２１０７２，　１／１０００ｘ）であった。細胞をＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，　Ｄ１３０６）で対比染色した。
（５）定量的リアルタイムＰＣＲ
　マウスＥＳ細胞のｃＤＮＡ調製はＶＩＬＯマスターミックスを使用して行い、リアルタイムＰＣＲ分析はＴａｑｍａｎ　ｑＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＴａｑＭａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ＩＤ：　ｍｏｕｓｅ　Ｈｐｒｔ１，　Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ１；　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ１，　Ｍｍ０１９５０２９４＿ｓ１）を用いて製造元の説明書に従って行った。適切な試験試料の混合物の希釈系列を使用することによって作成された各遺伝子についての標準曲線を用いることによって遺伝子発現量を計算した。各遺伝子の発現レベルは、Ｈｐｒｔ１発現レベルで補正した。
（６）ヒトｉＰＳ細胞由来β細胞のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）反応の測定
　時間依存的ＧＳＩＳ活性測定は以下のようにして行った。得られたヒトｉＰＳ－β細胞のアリコートを低グルコース（ＬＧ：３ｍＭグルコース）ＨＫＲＢ緩衝液（ＣＯＳＭＯＢＩＯ，　ＰＭＣ－ＰＮＩＭＧ）中で１０分間数回洗浄した。細胞を、２４ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、３４１５）中のトランスウェル透過性支持体中のＬＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中でさらに３０分間インキュベートし、上清のごく一部をｃ－ペプチド測定（ＬＧ　３０分）用のサンプルとして取った。細胞懸濁液に追加の量のグルコースを添加して最終グルコース濃度を３から２０ｍＭに増加させることによって、高グルコース刺激を開始した。上清のサンプリングを経時的に行い（ＨＧ刺激の開始後１０、３０、６０分；それぞれＨＧ　１０分、ＨＧ　３０分、およびＨＧ　６０分）、続いて１００μＭのエキセンディン４および２０ｍＭのＫＣｌを順次添加し、３０分間インキュベートした（それぞれＥｘ４　３０分およびＫＣｌ　３０分）。
　バッチモードＧＳＩＳアッセイは以下のように実施した。得られたヒトｉＰＳ－β細胞のアリコートを上記のようにＬＧ－ＫＲＢＨで洗浄した後、細胞をＬＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で３０分または１時間インキュベートし、続いてＨＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で同じ時間インキュベートした。いくつかの実験では、細胞を洗浄した後、細胞をいくつかのアリコートに分配し、０．０１％のＤＭＳＯまたは数種類のインスリン分泌促進薬を含有するＨＧ－ＨＫＲＢ緩衝液中で１時間インキュベートした。サンプルのＣ－ペプチド濃度は、ａｌｐｈａＬＩＳＡ　Ｃ－ペプチドキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，　ＡＬ２９９Ｆ）またはＣ－ペプチドＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＧＳＩＳアッセイに用いた細胞のＤＮＡ含有量によって補正した。
（７）ＤＮＡ量の測定
　ＧＳＩＳアッセイ後に細胞を回収し、そのＤＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ　ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ，　８０２８４）を用いて精製し、そしてＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｑ３２８５４）を用いて測定した。
［参考文献］
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Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., et al. (2014). VMAT2 identified as a regulator of late-stage β-cell differentiation. Nat. Chem. Biol. 10, 141-8.
Shahjalal, H. M., Shiraki, N., Sakano, D., Kikawa, K., Ogaki, S., Baba, H., Kume, K. and Kume, S. (2014). Generation of insulin-producing β-like cells from human iPS cells in a defined and completely xeno-free culture system. J. Mol. Cell Biol. 0, 1-15.
Shiraki, N., Yoshida, T., Araki, K., Umezawa, A., Higuchi, Y., Goto, H., Kume, K. and Kume, S. (2008). Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells 26, 874-85.
Shiraki, N., Shiraki, Y., Tsuyama, T., Obata, F., Miura, M., Nagae, G., Aburatani, H., Kume, K., Endo, F. and Kume, S. (2014). Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metab. 19, 780-794.
Treff, N. R., Vincent, R. K., Budde, M. L., Browning, V. L., Magliocca, J. F., Kapur, V. and Odorico, J. S. (2006). Differentiation of Embryonic Stem Cells Conditionally Expressing Neurogenin 3. Stem Cells 24, 2529-2537.
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (24)

  1. 　多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、各置換基は以下のように定義される。
    Ｒ１：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
    Ｒ２：水素原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
    Ｒ３：置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいＣ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
    置換基群α：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される１～４の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
    置換基群β：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
    ｎ：０、または１
    Ａ：下記式（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかで表される基

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、各置換基は以下のように定義される。
    ・および＊：結合手を示し、・は一般式（Ｉ）のアミド基の窒素原子に結合し、＊はＲ３に結合する
    Ｒ４：水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
    Ｒ５：水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基
    Ｙ：ＮまたはＣＨ）]
    で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
  2. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
    置換基群α１：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β１より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
    置換基群β１：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
  3. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジハロゲノ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルケニル基、置換基群α２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
    置換基群α２：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ６アルコキシ基、５もしくは６員環非芳香族ヘテロシクリル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ６アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ６アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β２より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
    置換基群β２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、およびＣ１－Ｃ６アルコキシ基
    置換基群γ２：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ６アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基
  4. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がナフチル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、Ｃ５－Ｃ８シクロアルケン－１－イル基、置換基群α３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよい５もしくは６員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
    置換基群α３：ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ２アルコキシ基、ヒドロキシＣ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルコキシＣ１－Ｃ２アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニルオキシ基、フェニルＣ１－Ｃ４アルコキシ基、モルホリン－１－イル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したＣ１－Ｃ２アルコキシ基、１つもしくは２つのＣ１－Ｃ４アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β３より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
    置換基群β３：フッ素原子、塩素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、およびＣ１－Ｃ４アルコキシ基
    置換基群γ３：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４アルキル）カルボニル基、および（Ｃ１－Ｃ４アルコキシ）カルボニル基
  5. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ１が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  6. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ２が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  7. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉ）で表される基であって、Ｒ４が水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、ハロゲノＣ１－Ｃ６アルキル基、または（Ｃ１－Ｃ６アルコキシ）カルボニル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  8. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ４が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする請求項７に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  9. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、またはＣ１－Ｃ６アルキル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  10. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  11. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｉｉ）で表される基であって、Ｒ５が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  12. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＡが式（ｉｖ）で表される基であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  13. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるｎが１であることを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  14. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３が２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソリル基、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３，６－ジヒドロ－２Ｈ－ピリジン－４－イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される１つもしくは２つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  15. 　一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ３がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか１つの置換基でｍ位またはｐ位が置換されたフェニル基であることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  16. 　一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  17. 　多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  18. 　三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする請求項１に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  19. 　多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程１～５を含み、工程３、工程４および工程５からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項１～１８のいずれか１項に記載のインスリン産生細胞の作製法
    工程１：多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
    工程２：胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
    工程３：原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
    工程４：膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
    工程５：膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。
  20. 　工程３、工程４および工程５において、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項１９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  21. 　工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする 請求項１９に記載のインスリン産生細胞の作製法。
  22. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞。
  23. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含むインスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患の治療薬。
  24. 　インスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患が、１型糖尿病又は２型糖尿病である請求項２３に記載の治療薬。
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