WO2020250927A1

WO2020250927A1 - 赤血球除去装置、単核球回収器、細胞培養装置、細胞培養システム、細胞培養方法、及び単核球の回収方法

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Publication number: WO2020250927A1
Application number: PCT/JP2020/022839
Authority: WO
Inventors: 剛士田邊; 亮二平出; 健太須藤
Original assignee: アイピース，インコーポレイテッド; 剛士田邊
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-12-17
Also published as: EP3981870A1; EP3981870A4; CN113785049A; US20220306993A1; JP7343881B2; JPWO2020250927A1

Abstract

細胞培養器内で細胞に因子を導入し、前記細胞培養器と同一の細胞培養器内で前記因子を導入された細胞を培養する、細胞の培養方法が提供される。また、血液を処理して、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を作製することと、処理血液を希釈することと、希釈された処理血液に含まれる単核球を沈降させることと、希釈された処理血液の上澄みを除去することと、単核球を回収することと、を含む、単核球の回収方法が提供される。

Description

赤血球除去装置、単核球回収器、細胞培養装置、細胞培養システム、細胞培養方法、及び単核球の回収方法

　本発明は細胞技術に関し、赤血球除去装置、単核球回収器、細胞培養装置、細胞培養システム、細胞培養方法、及び単核球の回収方法に関する。

　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。

　このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１、２参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。

特許第４１８３７４２号公報特開２０１４－１１４９９７号公報

　ｉＰＳ細胞は血液細胞から誘導される場合がある。ｉＰＳ細胞を誘導する用途に限らず、血液細胞を効率的に処理可能な技術が望まれている。また、ｉＰＳ細胞に限らず、様々な細胞を効率よく培養可能な装置が望まれている。そこで、本発明は、赤血球除去装置、単核球回収器、細胞培養装置、細胞培養システム、細胞培養方法、及び単核球の回収方法を提供することを目的の一つとする。

　本発明の態様によれば、血液を収容する血液容器と、血液容器から血液を受け、血液から赤血球を少なくとも部分的に除去する赤血球除去器と、血液容器から赤血球除去器に少なくとも血液を送るための流路と、を備える赤血球除去装置が提供される。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器から赤血球除去器に血液を送るための流路の内部が外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球除去器から赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を受け、処理血液から単核球を回収する単核球回収器と、赤血球除去器から単核球回収器に少なくとも赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を送るための流路と、をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、赤血球除去器が内部の気体を除去可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液が流れる流路をさらに備え、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液が流れる流路の内部が外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器が内部の気体を除去可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器の内部及び赤血球除去器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器の内部及び赤血球除去器の内部を含む閉鎖空間が、外部と気体の交換をしなくてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器及び赤血球除去器が、包埋されていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器の少なくとも一部及び／又は赤血球除去器の少なくとも一部が、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器が包埋されていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器の少なくとも一部が部材に彫り込まれて形成されていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、赤血球除去器内で、血液と、赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方と、が混合されてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方を収容する赤血球処理剤容器をさらに備え、赤血球除去器が、赤血球処理剤容器から赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方を受けてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、血液と、赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方と、を混合する混合器をさらに備え、赤血球除去器が、混合器から、赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方と混合された血液を受けてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、混合器が、血液と赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方との混合液が流れる、折れ曲がり流路を備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、血液容器から赤血球除去器に少なくとも血液を送るための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、血液容器から赤血球除去器に少なくとも血液を送るための流路に接続された、内部を真空にすることができる真空容器を備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方を収容する赤血球処理剤容器と、赤血球処理剤容器から赤血球除去器に赤血球沈降剤及び赤血球除去剤の少なくとも一方を送るための流路と、をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、血液容器から赤血球除去器に少なくとも血液を送るための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、血液容器が当該血液容器の容積を変更可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、赤血球除去器が当該赤血球除去器の容積を変更可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器が当該単核球回収器の容積を変更可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、赤血球処理剤容器が当該赤血球処理剤容器の容積を変更可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、赤血球除去器内で、赤血球が沈降し、赤血球除去器内の上澄みが赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液として単核球回収器に送られてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球除去器から単核球回収器に少なくとも赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を送るための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球除去器から単核球回収器に少なくとも赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を送るための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器内で、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液が希釈されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器内で、単核球が沈降してもよい。

　上記の赤血球除去装置において、処理血液の希釈液中で血小板が浮遊してもよい。

　上記の赤血球除去装置において、処理血液の希釈液中で、赤血球除去剤により赤血球が溶血してもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を希釈するための希釈用液を収容する希釈用液容器をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、希釈用液が緩衝液であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、希釈用液容器が当該希釈用液容器の容積を変更可能であってもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器内で単核球が沈降した後、単核球回収器内の上澄みが除去されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、上澄みを除去することにより、上澄み中に浮遊している血小板が除去されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、上澄みを除去することにより、上澄み中に浮遊している溶血した赤血球の成分が除去されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器の底部に第１開口が設けられており、重力方向において第１開口より高い位置に第２開口が設けられていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器の底部が漏斗状であり、漏斗状の底部の先端に第１開口が設けられており、漏斗状の底部の側面に第２開口が設けられていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、単核球回収器に赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液が導入されると、底部に単核球が蓄積し、第２開口から上澄みが排出されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、上澄みが排出されることにより、上澄み中に浮遊している血小板が除去されてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、上澄みが排出されることにより、上澄み中に浮遊している溶血した赤血球の成分が除去されてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、第１開口から単核球を吸引する単核球吸引装置をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置において、第１開口の大きさが、単核球が単核球吸引装置で吸引されない場合に、単核球が第１開口に詰まるよう設定されていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球除去器内の流体を血液容器に送るための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、血液容器から赤血球除去器に少なくとも血液を送るための流体機械、及び赤血球除去器内の流体を血液容器に送るための流体機械の少なくも一方をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、単核球回収器内の流体を赤血球除去器に送るための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の赤血球除去装置が、赤血球除去器から単核球回収器に少なくとも赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を送るための流体機械、及び単核球回収器内の流体を赤血球除去器に送るための流体機械の少なくも一方をさらに備えていてもよい。

　本発明の態様によれば、単核球を含む溶液を収容する回収容器を備える単核球回収器であって、回収容器の底部が漏斗状であり、漏斗状の底部の先端に第１開口が設けられており、漏斗状の底部の側面に第２開口が設けられている、単核球回収器が提供される。

　上記の単核球回収器において、回収容器に溶液が導入されると、漏斗状の底部の先端に単核球が蓄積し、第２開口から溶液が排出されてもよい。

　上記の単核球回収器が、漏斗状の底部の先端に蓄積した単核球を吸引する単核球吸引装置をさらに備えていてもよい。

　上記の単核球回収器において、第１開口の大きさが、単核球が単核球吸引装置で吸引されない場合に、単核球が第１開口に詰まるよう設定されていてもよい。

　本発明の態様によれば、細胞を培養するための細胞培養器と、細胞培養器に接続された容積可変容器と、を備え、細胞培養器及び容積可変容器内を流体が移動可能である、細胞培養装置が提供される。

　上記の細胞培養装置が、容積可変容器として、少なくとも第１容積可変容器及び第２容積可変容器を備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内の流体が第１容積可変容器内に移動すると、第１容積可変容器の容積が膨張し、第２容積可変容器の容積が収縮してもよい。

　上記の細胞培養装置において、第１容積可変容器内の流体が細胞培養器内に移動すると、第１容積可変容器の容積が収縮し、第２容積可変容器の容積が膨張してもよい。

　上記の細胞培養装置において、第２容積可変容器内の流体が細胞培養器内に移動すると、第２容積可変容器の容積が収縮し、第１容積可変容器の容積が膨張してもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器の内部、第１容積可変容器の内部、及び第２容積可変容器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器、第１容積可変容器、及び第２容積可変容器が、包埋されていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器の少なくとも一部、第１容積可変容器の少なくとも一部、及び第２容積可変容器の少なくとも一部が、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、第１容積可変容器が物質を収容し、流体の移動により、細胞に物質が接触してもよい。

　上記の細胞培養装置において、物質が誘導因子であり、流体の移動により、細胞に誘導因子が導入されてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内の流体を第１容積可変容器に移動させるための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内の流体を第２容積可変容器に移動させるための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内に細胞を供給するための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内に細胞を供給するための流路に接続された、培養液を供給するための流路をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内に細胞を供給するための流路内で細胞と培養液が混合し、細胞を含む培養液が細胞培養器内に供給されてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞を供給するための流路から細胞培養器内に細胞が導入される際に、第１容積可変容器及び第２容積可変容器の少なくとも一方の容積が膨張してもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内に細胞を供給するための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞が体細胞又は幹細胞であってもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内に供給される流体を収容する流体容器をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、流体が、体細胞培地又は幹細胞培地であってもよい。

　上記の細胞培養装置において、幹細胞培地が、誘導培養培地、拡大培養培地、又は維持培養培地であってもよい。

　上記の細胞培養装置において、流体容器から細胞培養器内に流体が供給される際に、第１容積可変容器及び第２容積可変容器の少なくともいずれかの容積が膨張してもよい。

　上記の細胞培養装置が、流体を細胞培養器内に供給するための流体機械をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内の温度を調節する温度調節部をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内で細胞が接着培養されてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内が細胞接着性コーティング剤でコートされていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内で細胞が浮遊培養されてもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器内に配置された中空糸膜をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養装置において、中空糸膜の内側で細胞が培養されてもよい。

　上記の細胞培養装置において、細胞培養器内の細胞を容積可変容器に移動可能であってもよい。

　上記の細胞培養装置が、細胞培養器に接続された流路と、当該流路に設けられた流体機械と、をさらに備え、流体機械が、細胞培養器内の細胞を流路に吸引し、流路内の細胞を細胞培養器内に戻すことにより、細胞の継代及び拡大培養の少なくとも一方を行ってもよい。

　上記の細胞培養装置において、流路が、細胞塊を分割する構造を有していてもよい。

　本発明の態様によれば、血液から単核球を回収する単核球回収器と、単核球回収器から単核球を受ける細胞培養器と、を備える、細胞培養システムが提供される。

　上記の細胞培養システムにおいて、単核球回収器が赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を受け、処理血液から単核球を回収してもよい。

　上記の細胞培養システムが、単核球回収器に赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を供給するための赤血球除去器をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養システムが、赤血球除去器に赤血球を少なくとも部分的に除去される前の血液を供給するための血液容器をさらに備えていてもよい。

　上記の細胞培養システムが、細胞培養器に接続された容積可変容器を備え、細胞培養器内の流体が容積可変容器に移動すると、容積可変容器の容積が膨張してもよい。

　上記の細胞培養システムが、細胞培養器に接続された第１容積可変容器と、細胞培養器に接続された第２容積可変容器と、を備え、細胞培養器内の流体が第１容積可変容器に移動すると、第１容積可変容器の容積が膨張し、第２容積可変容器の容積が収縮してもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、単核球回収器の内部及び細胞培養器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、赤血球除去器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、血液容器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、第１容積可変容器の内部及び第２容積可変容器の内部が、外気から閉鎖可能であってもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、血液容器、赤血球除去器、単核球回収器、及び細胞培養器が、包埋されていてもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、血液容器の少なくとも一部、赤血球除去器の少なくとも一部、単核球回収器の少なくとも一部、及び細胞培養器の少なくとも一部が、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、第１容積可変容器及び第２容積可変容器が、包埋されていてもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、第１容積可変容器の少なくとも一部及び第２容積可変容器の少なくとも一部が、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。

　上記の細胞培養システムにおいて、第１容積可変容器の内部及び第２容積可変容器の内部が、外部と気体の交換をしなくともよい。

　本発明の態様によれば、細胞培養器内で細胞に因子を導入し、細胞培養器と同一の細胞培養器内で因子を導入された細胞を培養する、細胞の培養方法が提供される。

　上記の細胞の培養方法において、細胞に因子を導入し、因子を導入された細胞を培養している間、細胞培養器が閉鎖されていてもよい。

　上記の細胞の培養方法において、細胞培養器に容積可変容器が接続されており、細胞培養器及び容積可変容器内を流体が移動してもよい。

　上記の細胞の培養方法において、容積可変容器から因子が供給されてもよい。

　上記の細胞の培養方法において、同一の細胞培養器内で因子を導入された第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導してもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態が分化状態であり、第２の状態が未分化状態であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態が脱分化状態であり、第２の状態が分化状態であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態が脱分化状態であり、第２の状態が第１の状態とは異なる脱分化状態であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が体細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が血液細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が単核球であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第２の状態の細胞が幹細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第２の状態の細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が幹細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第２の状態の細胞が体細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が体細胞であり、第２の状態の細胞が第１の状態の細胞とは異なる体細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が、赤血球を少なくとも部分的に除去された血液細胞であってよい。

　上記の細胞の培養方法において、第１の状態の細胞が、血小板を少なくとも部分的に除去された血液細胞であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、因子が、第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導する因子であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、因子が、特定の細胞の状態を誘導する因子であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、因子が初期化因子であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、因子が分化誘導因子であってもよい。

　上記の細胞の培養方法において、因子を導入された細胞を細胞培養器から回収し、当該細胞培養器と同一の細胞培養器に細胞を戻して、細胞を継代又は拡大培養してもよい。

　本発明の態様によれば、血液を処理して、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を作製することと、処理血液を希釈することと、希釈された処理血液に含まれる単核球を沈降させることと、希釈された処理血液の上澄みを除去することと、単核球を回収することと、を含む、単核球の回収方法が提供される。

　上記の単核球の回収方法において、赤血球除去器内で処理血液を作製し、単核球回収器内で処理血液の希釈、単核球の沈降、及び上澄みの除去がなされ、赤血球除去器及び単核球回収器が閉鎖されていてもよい。

　上記の単核球の回収方法において、赤血球沈降剤又は赤血球除去剤で血液を処理してもよい。

　上記の単核球の回収方法において、処理血液をリン酸緩衝液で希釈してもよい。

　上記の単核球の回収方法において、希釈された処理血液の上澄みが血小板を含んでいてもよい。

　上記の単核球の回収方法において、回収された単核球において、赤血球が少なくとも部分的に除去されていてもよい。

　上記の単核球の回収方法において、回収された単核球において、血小板が少なくとも部分的に除去されていてもよい。

　本発明によれば、赤血球除去装置、単核球回収器、細胞培養装置、細胞培養システム、細胞培養方法、及び単核球の回収方法を提供可能である。

第１実施形態に係る細胞培養システムの模式図である。第１実施形態に係る単核球回収器の模式図である。第２実施形態に係る赤血球除去装置の模式図である。第３実施形態に係る赤血球除去装置の模式図である。実施例１に係る細胞塊の顕微鏡写真である。実施例１に係るｉＰＳ細胞のフローサイトメトリーの結果を示すヒストグラムである。実施例２に係る蛍光活性化セルソーティングの分析結果である。実施例２に係る単核球回収器に入れる前の処理血液の顕微鏡写真（ａ）と、単核球回収器から回収された単核球を含む溶液の顕微鏡写真（ｂ）である。実施例２に係る単核球回収器に入れる前の処理血液における血小板の数と、単核球回収器から回収された単核球を含む溶液における血小板の数と、を示すグラフである。実施例２に係る単核球回収器に入れる前の血小板を含む処理血液入れた培養液の写真（ａ）と、血小板を除去された単核球を含む溶液を入れた培養液の写真（ｂ）である。実施例３に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞の顕微鏡写真である。実施例３に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。実施例４に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞の顕微鏡写真である。実施例４に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。実施例５に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞の顕微鏡写真である。実施例５に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。実施例６に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞の顕微鏡写真である。実施例６に係るｉＰＳ細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。

　以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。

　（第１実施形態）
　図１に示すように、第１実施形態に係る赤血球除去装置１００は、血液を収容する血液容器１０と、血液容器１０から血液を受け、血液から赤血球を少なくとも部分的に除去する赤血球除去器１１と、を備える。

　血液容器１０は、内部に血液を収容する。血液容器１０は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。血液容器１０の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体の交換をしないよう構成され得る。血液容器１０は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。血液容器１０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。血液容器１０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。血液容器１０は、当該血液容器１０の容積を変更可能であってもよい。

　赤血球除去器１１は、例えば、内部に赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を収容する。赤血球除去器１１は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。赤血球除去器１１の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。赤血球除去器１１は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。赤血球除去器１１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。赤血球除去器１１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。赤血球除去器１１は、当該赤血球除去器１１の容積を変更可能であってもよい。

　血液容器１０と、赤血球除去器１１と、の間には、血液容器１０から赤血球除去器１１に血液を送るための流路１３が設けられている。流路１３は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１３の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１３は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　また、血液容器１０と、赤血球除去器１１と、の間には、赤血球除去器１１から血液容器１０に空気等の気体等の流体を送るための流路１２が設けられている。流路１２は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１２の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１２は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　血液容器１０と、流路１２、１３のそれぞれと、は、コネクターで接続されてもよい。コネクターは無菌コネクターであってもよい。コネクターは、ニードルレスコネクターであってもよい。ニードルレスコネクターは、スプリットセプタム型であってもよいし、メカニカルバルブ型であってもよい。

　流路１３には、流路１３内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械１４が設けられている。なお、流路１２に流体機械が設けられていてもよいし、流路１２と流路１３の両方に流体機械が設けられていてもよい。なお、本開示において、流体とは気体及び液体の両方を含む。

　流体機械１４としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプは、ペリスタルティックポンプと呼ばれる場合もある。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュールを用いてもよい。本開示における他の流体機械についても同様である。ペリスタルティックポンプ、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、流路内部の流体にポンプが直接接触することなく、流体を送ることが可能である。

　予め赤血球除去器１１内に気体と赤血球沈降剤が充填されている場合、流体機械１４が流路１３を介して血液容器１０内の血液を吸引し、吸引した血液を赤血球除去器１１内に供給すると、赤血球除去器１１内の気体は、圧力に押され、流路１２を介して、血液容器１０内に送られる。このように、血液容器１０内の血液を、赤血球除去器１１内に送り、赤血球除去器１１内の気体を血液容器１０内に送ることにより、血液容器１０内と赤血球除去器１１内の圧力を平均化することが可能である。

　なお、流体機械１４が流路１３を介して赤血球除去器１１内の気体を吸引し、吸引した気体を血液容器１０内に供給してもよい。この場合、血液容器１０内の血液は、気圧に押され、流路１２を介して、赤血球除去器１１内に送られる。このように、赤血球除去器１１内の気体を除去することによっても、血液容器１０内の血液を、赤血球除去器１１内に送ることが可能である。

　赤血球除去器１１内に送り込まれた血液は、赤血球除去器１１内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤と接触する。流体機械１４は、赤血球除去器１１内から流体の吸引と、赤血球除去器１１内への流体の送り出しを繰り返して、血液を攪拌してもよい。赤血球除去器１１内に赤血球沈降剤が収容されている場合、赤血球除去器１１内で赤血球が沈降し、血液から、赤血球が少なくとも部分的に除去される。赤血球除去器１１内に赤血球除去剤が収容されている場合、赤血球除去器１１内で赤血球が溶血し、血液から、赤血球が少なくとも部分的に除去される。

　赤血球除去装置１００は、赤血球除去器１１から、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を受け、処理血液から単核球を回収する単核球回収器１５をさらに備えていてもよい。単核球回収器１５は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。単核球回収器１５の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。単核球回収器１５は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。単核球回収器１５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。単核球回収器１５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。単核球回収器１５は、当該単核球回収器１５の容積を変更可能であってもよい。

　図２に示すように、例えば、単核球回収器１５の底部には第１開口１１５が設けられており、単核球回収器１５の側面には第２開口１１６が設けられている。第１開口１１５の位置は、重力方向において第２開口１１６より下である。

　単核球回収器１５の第１開口１１５には流路１９が接続されている。流路１９は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１９の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１９は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１９の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１９の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　単核球回収器１５の第２開口１１６には流路１１７が接続されている。流路１１７は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１１７の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１１７は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１１７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１１７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。図１に示すように、流路１１７には、流路１１７内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械２１が設けられている。

　図２に示すように、単核球回収器１５の底部が漏斗状であってもよい。この場合、例えば、単核球回収器１５の漏斗状の底部の先端に第１開口１１５が設けられ、漏斗状の底部の側面に第２開口１１６が設けられる。第２開口１１６には、単核球が通過することができないフィルターが設けられていてもよい。

　単核球回収器１５は、内部に、緩衝液等の希釈液を収容可能である。希釈液は、希釈用液を収容する図１に示す希釈用液容器６１から流路６０を介して、単核球回収器１５内に導入されてもよい。希釈用液容器６１は、当該希釈用液容器の容積を変更可能であってもよい。また、例えば、流路１９及び流路１１７内部は、希釈液で充填される。

　希釈用液容器６１及び流路６０の少なくともいずれかは、内部を外気から閉鎖可能な構造を有していてもよい。希釈用液容器６１及び流路６０の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。希釈用液容器６１及び流路６０は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。希釈用液容器６１及び流路６０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。希釈用液容器６１及び流路６０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　赤血球除去器１１と、単核球回収器１５と、の間には、赤血球除去器１１から単核球回収器１５に赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を送るための流路１７が設けられている。流路１７は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１７の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１７は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　また、赤血球除去器１１と、単核球回収器１５と、の間には、単核球回収器１５から赤血球除去器１１に空気等の気体等の流体を送るための流路１６が設けられている。流路１６は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路１６の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路１６は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路１６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路１６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　流路１７には、流路１７内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械１８が設けられている。なお、流路１６に流体機械が設けられていてもよいし、流路１６と流路１７の両方に流体機械が設けられていてもよい。

　予め単核球回収器１５内に気体と希釈液が充填されている場合、流体機械１８が流路１７を介して赤血球除去器１１内の赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を吸引し、吸引した赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を単核球回収器１５内に供給すると、単核球回収器１５内の気体は、圧力に押され、流路１６を介して、赤血球除去器１１内に送られる。このように、赤血球除去器１１内の赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を単核球回収器１５内に送り、単核球回収器１５内の気体を赤血球除去器１１内に送ることにより、赤血球除去器１１内と単核球回収器１５内の圧力を平均化することが可能である。希釈液は希釈用液容器６１から繰り返し供給されてもよい。

　なお、流体機械１８が流路１７を介して単核球回収器１５内の気体を吸引し、吸引した気体を赤血球除去器１１内に供給してもよい。この場合、赤血球除去器１１内の赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液は、気圧に押され、流路１６を介して、単核球回収器１５内に送られる。このように、単核球回収器１５内の気体を除去することによっても、赤血球除去器１１内の赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を、単核球回収器１５内に送ることが可能である。

　赤血球除去器１１内で、赤血球を沈降させた場合、赤血球除去器１１内の上澄みが赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液として単核球回収器１５に送られる。

　単核球回収器１５に送り込まれた、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液は、図２（ａ）に示すように、希釈液で希釈される。希釈された処理血液溶液中において、血小板は浮遊し、単核球は、単核球回収器１５の底に向かって沈降する。なお、希釈液が赤血球除去剤を含んでいてもよい。この場合、処理血液溶液中に残存する赤血球が溶血する。

　図２（ｂ）に示すように、沈降した単核球は、単核球回収器１５の漏斗状の底部の先端に蓄積する。希釈された処理血液溶液中において単核球が沈降した後、図２（ｃ）に示すように、単核球回収器１５の第２開口１１６に接続された流路１１７に設けられた図１に示す流体機械２１が、上澄みである希釈された処理血液溶液を吸引する。上澄みを吸引する吸引力は、図２（ｃ）に示す沈降した単核球を吸引しにくいように設定される。上澄みは、血小板及び溶血した赤血球を含んでいる。したがって、上澄みを単核球回収器１５内から吸引除去することにより、血小板及び赤血球から単核球を分離することが可能である。吸引された上澄みは、図１に示す赤血球除去器１１内あるいは血液容器１０内に送られてもよい。また、単核球回収器１５内から吸引された上澄みと同程度の容積の気体を、赤血球除去器１１内あるいは血液容器１０内から単核球回収器１５内に送ってもよい。

　流路１９には、単核球回収器１５の底部に蓄積した単核球を吸引する単核球吸引装置２０が設けられている。単核球吸引装置２０としては、ポンプ等の流体機械が使用可能である。図２に示す第１開口１１５の大きさは、例えば、単核球吸引装置２０が単核球を吸引していない場合に単核球が第１開口１１５に詰まり、単核球吸引装置２０が単核球を吸引している場合に単核球が第１開口１１５を通過できるよう設定されている。単核球吸引装置２０が単核球を吸引すると、単核球は、単核球回収器１５内から流路１９に移動する。

　なお、単核球回収器１５内を加圧することにより、単核球回収器１５内の単核球を流路１９に移動させてもよい。この場合、流路１９に単核球吸引装置２０が設けられていてもよいし、設けられていなくてもよい。

　図１に示すように、第１実施形態に係る細胞培養装置２００は、細胞を培養するための細胞培養器２２を備える。細胞培養器２２は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。細胞培養器２２の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。細胞培養器２２は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。細胞培養器２２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。細胞培養器２２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　細胞培養器２２内で、細胞を接着培養してもよいし、細胞を浮遊培養してもよい。細胞を接着培養する場合、細胞培養器２２内を、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、及びラミニン等の細胞接着用コーティング剤でコーティングしてもよい。以下においては、浮遊培養を例に挙げて説明する。細胞培養器２２内部は、細胞は透過できないが、培地成分及び老廃物は透過可能な培地成分透過部材で区切られていてもよい。細胞培養器２２の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）等の細胞非接着性物質をコーティングして、細胞培養器２２の内壁を細胞非接着性にしてもよい。細胞培養器２２には、内部を観察可能な窓が設けられていてもよい。窓の材料としては、例えば、ガラス及び樹脂が使用可能である。

　細胞培養器２２には、窓を加熱及び冷却するための、温度調節部が設けられていてもよい。温度調節部は、窓に配置され、窓を加熱する透明導電膜等の透明ヒーターであってもよい。あるいは、細胞培養器２２には、筐体を加熱及び冷却するための温度調節部を備えていてもよい。筐体を温度調節部で温度調節することにより、細胞培養器２２内の培地を温度調節することが可能である。細胞培養器２２には、細胞培養器２２内の培地の温度を測る温度計をさらに備えていてもよい。温度計は、培地に接触することなく細胞培養器２２の温度に基づいて培地の温度を測ってもよいし、培地に接触して培地の温度を直接測ってもよい。この場合、培地の温度が所定の温度となるよう、温度調節部がフィードバック制御されてもよい。培地の温度は、例えば、２０℃から４５℃に調節される。

　細胞培養器２２には流路１９が接続されている。流路１９を介して、細胞培養器２２内に細胞が送られる。流路１９には、流路２３が接続されている。流路２３は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路２３の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路２３は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路２３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路２３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。流路２３には、流路２３内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械２４が設けられている。

　流路２３には、例えば分化細胞培地等の体細胞培地を収容する流体容器である第１培地容器２５が接続されている。体細胞培地は、ゲルであってもよいし、液体であってもよい。

　培地がゲル状である場合、培地は、高分子化合物を含んでいてもよい。高分子化合物は、例えば、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であってもよい。また、培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。

　あるいは、培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。

　なお、本開示において、ゲル状の培地あるいはゲル培地とは、ポリマー培地を包含する。

　流路１９から細胞培養器２２内に送られる細胞が体細胞である単核球である場合、体細胞培地としては、例えば、血液細胞培地が使用可能である。第１培地容器２５は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。第１培地容器２５の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。第１培地容器２５は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。第１培地容器２５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。第１培地容器２５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。第１培地容器２５は、当該第１培地容器２５の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、第１培地容器２５は、体細胞培地を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の体細胞培地を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、第１培地容器２５は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　単核球回収器１５から流路１９に単核球が送られると、流体機械２４は、第１培地容器２５から流路１９に、流路２３を介して体細胞培地を送る。第１培地容器２５は、体細胞培地を収容可能な容積を減少させる。なお、第１培地容器２５は、能動的に容積を収縮させてもよいし、流路２３内部からの吸引力により、受動的に容積を収縮させてもよい。流路２３を介して流路１９に送られてきた体細胞培地と、流路１９内の単核球と、が混合し、細胞培養器２２内に送られる。

　第１培地容器２５には、第１培地容器２５内の培地の温度を調節する温度調節装置が設けられていてもよい。

　細胞培養器２２には、例えば、流路２６を介して第１容積可変容器２７が接続されている。流路２６は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路２６の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路２６は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路２６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路２６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。流路２６には、流路２６内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械２８が設けられていてもよい。

　第１容積可変容器２７は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。第１容積可変容器２７の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。第１容積可変容器２７は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。第１容積可変容器２７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。第１容積可変容器２７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。第１容積可変容器２７は、当該第１容積可変容器２７の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、第１容積可変容器２７は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、第１容積可変容器２７は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　細胞培養器２２には、例えば、流路２９を介して第２容積可変容器３０が接続されている。流路２９は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路２９の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路２９は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路２９の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路２９の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。流路２９には、流路２９内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械が設けられていてもよい。

　第２容積可変容器３０は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。第２容積可変容器３０の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。第２容積可変容器３０は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。第２容積可変容器３０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。第２容積可変容器３０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。第２容積可変容器３０は、当該第２容積可変容器３０の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、第２容積可変容器３０は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、第２容積可変容器３０は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　流路１９から細胞培養器２２内に単核球と体細胞培地が送り込まれると、細胞培養器２２内の空気等の気体は、例えば、第２容積可変容器３０内に移動し、第２容積可変容器３０は容積を膨張させて、細胞培養器２２内から移動してきた気体を受け入れる。なお、第２容積可変容器３０は、能動的に容積を膨張させてもよいし、圧力を受けて受動的に容積を膨張させてもよい。

　第１容積可変容器２７は、例えば、内部に、誘導因子等の第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導する因子等の物質を収容する。誘導因子はＲＮＡであってもよいし、タンパク質であってもよいし、化合物であってもよい。ＲＮＡは、修飾ＲＮＡであってもよいし、非修飾ＲＮＡであってもよい。第１容積可変容器２７は、例えば、リポフェクション試薬を収容していてもよい。誘導因子は、プラスミドベクター、あるいはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクター等のウイルスベクターあるいはウイルスに含まれていてもよい。本開示において、誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。リプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣを含む。単核球細胞にリプログラミング因子等の誘導因子を導入し、ｉＰＳ細胞を作製する際には、流体機械２８が、細胞培養器２２内の単核球を含む体細胞培地を、流路２６を介して、第１容積可変容器２７内に移動させる。また、第１容積可変容器２７は容積を膨張させ、単核球細胞を含む体細胞培地を受け入れる。なお、第１容積可変容器２７は、能動的に容積を膨張させてもよいし、圧力を受けて受動的に容積を膨張させてもよい。気体を収容している第２容積可変容器３０は容積を収縮させ、収容している気体が細胞培養器２２内に送り込まれる。なお、第２容積可変容器３０は、能動的に容積を収縮させてもよいし、細胞培養器２２内部からの吸引力により、受動的に容積を収縮させてもよい。

　単核球は、細胞培養器２２内から第１容積可変容器２７内へ移動することにより、第１容積可変容器２７内の誘導因子と接触し、単核球に誘導因子が導入される。なお、第１容積可変容器２７は、容積の膨張と収縮を繰り返し、単核球と誘導因子を含む体細胞培地を攪拌させてもよい。

　所定の期間経過後、流体機械２８が、第１容積可変容器２７内の誘導因子を導入された単核球を含む体細胞培地を、流路２６を介して、細胞培養器２２内に移動させる。第１容積可変容器２７は容積を収縮させる。また、第２容積可変容器３０は容積を膨張させ、細胞培養器２２内から気体を受け入れる。

　あるいは、単核球細胞にリプログラミング因子等の誘導因子を導入し、ｉＰＳ細胞を作製する際には、流体機械２８が、第１容積可変容器２７内の誘導因子を、流路２６を介して、細胞培養器２２内に移動させてもよい。この際、第１容積可変容器２７は容積を収縮させ、第２容積可変容器３０は容積を膨張させてもよい。誘導因子は、第１容積可変容器２７内から細胞培養器２２内へ移動することにより、細胞培養器２２内の単核球と接触し、単核球に誘導因子が導入される。なお、流体機械２８が、第１容積可変容器２７内の誘導因子を、流路２６を介して、細胞培養器２２内に、複数回に分けて移動させてもよい。これにより、単核球に誘導因子が、複数回に分けて導入される。

　細胞培養器２２には、例えば、流路３１を介して、例えば幹細胞培地や体細胞培地等の培地を収容する流体容器である第２培地容器３２が接続されている。以下においては、第２培地容器３２が幹細胞培地を収容している例を説明する。幹細胞培地は、ゲルであってもよいし、液体であってもよい。幹細胞培地としては、誘導培養培地、拡大培養培地、及び維持培養培地が使用可能である。

　流路３１は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路３１の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路３１は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路３１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路３１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。流路３１には、流路３１内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械３３が設けられていてもよい。

　第２培地容器３２は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。第２培地容器３２の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。第２培地容器３２は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。第２培地容器３２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。第２培地容器３２の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。第２培地容器３２は、当該第２培地容器３２の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、第２培地容器３２は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、第２培地容器３２は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　第２培地容器３２には、第２培地容器３２内の培地の温度を調節する温度調節装置が設けられていてもよい。

　細胞培養器２２には、例えば、流路３４を介して、第３容積可変容器３５が接続されている。流路３４は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路３４の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路３４は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路３４の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路３４の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　第３容積可変容器３５は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。第３容積可変容器３５の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。第３容積可変容器３５は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。第３容積可変容器３５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。第３容積可変容器３５の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。第３容積可変容器３５は、当該第３容積可変容器３５の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、第３容積可変容器３５は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、第３容積可変容器３５は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　単核球に誘導因子が導入されてから所定の期間経過後、流体機械３３が、第２培地容器３２内の幹細胞培地を、流路３１を介して、細胞培養器２２内に移動させる。幹細胞培地は、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在する区画に接し、細胞が存在しない区画に入れられてもよい。内部から幹細胞培地を吸引された第２培地容器３２は、容積を収縮させる。なお、第２培地容器３２は、能動的に容積を収縮させてもよいし、受動的に容積を収縮させてもよい。第３容積可変容器３５は容積を膨張させ、幹細胞培地の流入により細胞培養器２２内の余剰となった流体を流路３４を介して受け入れる。流路３４は、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在する区画に接し、細胞が存在しない区画に接続していてもよい。なお、第３容積可変容器３５は、能動的に容積を膨張させてもよいし、圧力を受けて受動的に容積を膨張させてもよい。

　あるいは、流路３４は、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在する区画に接していてもよい。この場合、細胞培養器２２内の余剰な細胞を、流路３４を介して第３容積可変容器３５に送り出してもよい。

　細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在する区画の培地と、細胞が存在しない区画の培地と、は、例えば浸透圧により、培地成分や老廃物を交換する。培養成分透過部材としては、例えば、半透膜、メッシュ、及び中空糸膜が使用可能である。半透膜は、透析膜を含む。

　培養成分透過部材が半透膜である場合、半透膜の分画分子量は、例えば、０．１ＫＤａ以上、１０ＫＤａ以上、あるいは５０ＫＤａ以上である。半透膜は、例えば、セルロースエステル、エチルセルロース、セルロースエステル類、再生セルロース、ポリスルホン、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、銅アンモニウムレーヨン、鹸化セルロース、ヘモファン膜、フォスファチジルコリン膜、及びビタミンＥコーティング膜等からなる。

　培養成分透過部材がメッシュである場合、メッシュは、細胞培養器２２内で培養される細胞よりも小さい孔を有する。メッシュの材料は、例えば樹脂及び金属であるが、特に限定されない。培養成分透過部材の表面は、細胞非接着性であってもよい。

　培養成分透過部材が中空糸膜である場合、中空糸膜は、細胞培養器２２内で培養される細胞よりも小さい孔を有する。例えば、中空糸膜の内側で細胞が培養されてもよい。

　細胞培養器２２内で細胞を培養している間、所定のタイミングで、流体機械３３が、第２培地容器３２内の幹細胞培地を、流路３１を介して、細胞培養器２２内に移動させてもよい。第３容積可変容器３５は容積を膨張させ、新鮮な幹細胞培地の流入により細胞培養器２２内の余剰となった使用済み幹細胞培地を受け入れてもよい。流体機械３３は、例えば、培地の状態、培地中の細胞塊の状態、細胞数、細胞塊数、培地の濁度、及びｐＨの変化に応じて、培地の送液量を制御したり、培地の送液の開始及び終了をしたりしてもよい。

　細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在する区画には、流路３６を介してポンプ等の流体機械３７が接続されていてもよい。流路３６は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路３６の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路３６は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路３６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路３６の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　例えば、流体機械３７は、細胞の凝集を制御するために、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち細胞が存在する区画と、流路３６と、の間で培地を循環させる。流体機械３７は、常時培地を循環させてもよいし、任意のタイミングで培地を循環させてもよい。あるいは、流体機械３７は、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち細胞が存在する区画と、流路３６と、の間で培地を往復運動させ、培地を攪拌してもよい。流体機械３７は、常時培地を攪拌してもよいし、任意のタイミングで培地を攪拌してもよい。流体機械３７は、例えば、培地の状態、培地中の細胞塊の状態、細胞数、細胞塊数、培地の濁度、及びｐＨの変化に応じて、培地の送液量を制御したり、培地の送液の開始及び終了をしたりしてもよい。

　細胞培養器２２内の細胞を流路３６内に吸引し、細胞を細胞培養器２２内に戻すことによって、細胞を継代及び拡大培養してもよい。流路３６内は、細胞塊を分割する構造を有していてもよい。例えば、流路３６内が、蛇行する構造や、径が増減する構造を有することにより、流路３６内を流れる細胞塊を分割することが可能である。

　細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち、細胞が存在しない区画には、流路３８を介してポンプ等の流体機械３９が接続されていてもよい。流路３８は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路３８の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路３８は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路３８の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路３８の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　例えば、流体機械３９は、培地成分透過部材に培地が接触する機会を増やすために、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち細胞が存在しない区画と、流路３８と、の間で培地を循環させる。流体機械３９は、常時培地を循環させてもよいし、任意のタイミングで培地を循環させてもよい。あるいは、流体機械３９は、細胞培養器２２内の培地成分透過部材で区切られた区画のうち細胞が存在しない区画と、流路３８と、の間で培地を往復運動させ、培地を攪拌してもよい。流体機械３９は、常時培地を攪拌してもよいし、任意のタイミングで培地を攪拌してもよい。流体機械３９は、例えば、培地の状態、培地中の細胞塊の状態、細胞数、細胞塊数、培地の濁度、及びｐＨの変化に応じて、培地の送液量を制御したり、培地の送液の開始及び終了をしたりしてもよい。

　例えば、細胞培養器２２内で誘導因子を導入された単核球からｉＰＳ細胞が作製され、拡大培養された後、ｉＰＳ細胞が細胞培養器２２内から回収される。ｉＰＳ細胞は、細胞培養器２２内で細胞塊（コロニー）を形成してもよい。

　本発明者らの知見により、細胞は、完全に閉鎖された密閉空間で培養可能であるため、細胞培養器２２内に、二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガス等を積極的に供給しなくともよい。そのため、細胞培養器２２をＣＯ_２インキュベーター内に配置しなくともよい。また、密閉されている細胞培養器２２内に、細胞培養器２２外に存在する細胞、微生物、ウイルス、及び塵等が進入しないため、細胞培養器２２内の清浄度が保たれる。そのため、細胞培養器２２をクリーンルーム内に配置しなくともよい。ただし、細胞が存在する閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガス等を供給することは、必ずしも妨げられない。

　実施形態に係る細胞培養装置２００によれば、例えば、完全閉鎖系で細胞が培養されるため、培養装置からの細胞の漏れ出しによるクロスコンタミネーションのリスクを低減することが可能である。また、例えば、細胞がＨＩＶ肝炎ウイルス等のウイルスに感染している場合であっても、細胞の漏れ出しによるオペレーターへの感染のリスクを低減することが可能である。さらに、細胞培養器内の培地が、細胞培養器外の空気中の細菌、ウイルス及びカビ等にコンタミネーションするリスクを低減することが可能である。またさらに、実施形態に係る細胞培養器によれば、ＣＯ_２インキュベーターを用いることなく、細胞を培養することも可能である。

　（第２実施形態）
　図３に示すように、第２実施形態に係る赤血球除去装置１０１は、血液を収容する血液容器５０と、赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を収容する赤血球処理剤容器５３を備える。

　血液容器５０は、内部に血液を収容する。血液容器５０は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。血液容器５０の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。血液容器５０は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。血液容器５０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。血液容器５０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。血液容器５０は、当該血液容器５０の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、血液容器５０は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、血液容器５０は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　赤血球処理剤容器５３は、内部に赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を収容する。赤血球処理剤容器５３は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。赤血球処理剤容器５３の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。赤血球処理剤容器５３は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。赤血球処理剤容器５３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。赤血球処理剤容器５３の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。赤血球処理剤容器５３は、当該赤血球処理剤容器５３の容積を変更可能であってもよい。この場合、例えば、赤血球処理剤容器５３は、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能である。あるいは、赤血球処理剤容器５３は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　第２実施形態に係る赤血球除去装置１０１は、例えば、血液と、赤血球沈降剤又は赤血球除去剤と、を混合する混合器５７をさらに備える。混合器５７は、例えば、血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤との混合液が流れる、折れ曲がり流路を備える。折れ曲がり流路は、らせん状に折れ曲がっていてもよい。折れ曲がり流路において流路が蛇行していてもよい。折れ曲がり流路において、断面積が増減を繰り返していてもよい。混合器５７は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。混合器５７の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。混合器５７は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。混合器５７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。混合器５７の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　血液容器５０には、少なくとも血液を血液容器５０から混合器５７に送るための流路５１が接続されている。赤血球処理剤容器５３には、少なくとも赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を赤血球処理剤容器５３から混合器５７に送るための流路５４が接続されている。流路５１と流路５４は流路５６に合流する。流路５６は混合器５７に接続されている。混合器５７には、混合器５７内で混合された血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤との混合液を赤血球除去器１１内に送るための流路５８が接続されている。

　流路５１には、流路５１内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械５２が設けられていてもよい。流路５４には、流路５４内の流体を移動させるためのポンプ等の流体機械５５が設けられていてもよい。

　流路５１、５４、５６、５８は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。流路５１、５４、５６、５８の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。流路５１、５４、５６、５８は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。流路５１、５４、５６、５８の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。流路５１、５４、５６、５８の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。

　赤血球除去器１１に血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤との混合液を送る際、流体機械５２が、血液容器５０内の血液を、流路５１、５６を介して混合器５７内に移動させる。また、流体機械５５が、赤血球処理剤容器５３内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を、流路５４、５６を介して混合器５７内に移動させる。なお、流路５１、５４に流体機械を設けず、流路５６に流体機械を設け、流路５６に設けられた流体機械が、血液容器５０内の血液と、赤血球処理剤容器５３内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤と、を、混合器５７内に移動させてもよい。混合器５７内で、血液と、赤血球沈降剤又は赤血球除去剤と、が混合する。混合器５７内で混合された血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤との混合液は、流路５８を介して赤血球除去器１１に送られる。赤血球除去器１１内で、赤血球が沈降するか、あるいは溶血するのは、第１実施形態と同様である。また、第２実施形態に係る赤血球除去装置１０１の他の構成要素は、第２実施形態に係る赤血球除去装置１００と同様であってもよい。

　（第３実施形態）
　図４に示すように、第３実施形態に係る赤血球除去装置１０１は、血液容器５０から混合器５７に少なくとも血液を送るための流路５１に設けられた、内部を真空にすることができる真空容器７０を備える。

　真空容器７０は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。真空容器７０の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。真空容器７０は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。真空容器７０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。真空容器７０の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。真空容器７０は、当該真空容器７０の容積を変更可能であってもよい。真空容器７０は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　第３実施形態に係る赤血球除去装置１０１は、赤血球処理剤容器５３から混合器５７に少なくとも赤血球沈降剤又は赤血球除去剤を送るための流路５４に設けられた、内部を真空にすることができる真空容器７１を備える。

　真空容器７１は、内部を外気から閉鎖可能な構造を有し得る。真空容器７１の内部を含む閉鎖空間は、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしないよう構成され得る。真空容器７１は、ガス非透過性物質に埋め込まれ、包埋されていてもよい。真空容器７１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて形成されていてもよい。真空容器７１の少なくとも一部は、部材に彫り込まれて凹部を重ね合わせて形成されていてもよい。真空容器７１は、当該真空容器７１の容積を変更可能であってもよい。真空容器７１は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。

　予め真空容器７０内を真空にした状態で、流路５１に血液容器５０を接続すると、血液容器５０内の血液が真空容器７０内に移動し、さらに血液が流路５１、５６を介して混合器５７内に移動する。また、予め真空容器７１内を真空にした状態で、流路５４に赤血球処理剤容器５３を接続すると、赤血球処理剤容器５３内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤が真空容器７１内に移動し、さらに血液が流路５４、５６を介して混合器５７内に移動する。

　第３実施形態に係る赤血球除去装置１０１の他の構成要素は、第２実施形態と同様であってもよい。

　（第４実施形態）
　図４に示した真空容器７０、７１を省略し、赤血球除去器１１を予め真空にしてもよい。予め赤血球除去器１１内を真空にした状態で、流路５１に血液容器５０を接続し、流路５４に赤血球処理剤容器５３を接続すると、血液容器５０内の血液が流路５１、５６を介して混合器５７内に移動し、赤血球処理剤容器５３内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤が流路５４、５６を介して混合器５７内に移動する。さらに、混合器５７内で混合された血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤が、流路５８を介して赤血球除去器１１内に移動する。

　あるいは、流路５１及び流路５４を弁等で閉塞し、赤血球除去器１１内を真空にし、流路５１及び流路５４の弁を開放すると、血液容器５０内の血液が流路５１、５６を介して混合器５７内に移動し、赤血球処理剤容器５３内の赤血球沈降剤又は赤血球除去剤が流路５４、５６を介して混合器５７内に移動する。さらに、混合器５７内で混合された血液と赤血球沈降剤又は赤血球除去剤が、流路５８を介して赤血球除去器１１内に移動する。

　（他の実施形態）
　上記のように、本発明を実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、図１に示す細胞培養器２２に送られる細胞は、単核球に限定されない。細胞培養器２２に送られる細胞は、幹細胞、線維芽細胞、あるいは他の体細胞であってもよい。細胞培養器２２に送られる細胞は、任意である。

　さらに、第１実施形態では、細胞培養器２２内で単核球からｉＰＳ細胞を作製する例を説明したが、細胞培養器２２内で幹細胞から神経細胞等の分化細胞を作製してもよい。幹細胞は、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体性幹細胞あるいは他の人工的に誘導された幹細胞等であってもよい。この場合は、例えば、第１容積可変容器２７は、内部に分化誘導因子を収容する。このように、本発明は様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

　（実施例１）
　本実施例においては、完全に閉鎖された環境下において、培地交換及びガス交換をすることなく、細胞を培養可能である例を示す。増殖因子を培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００、登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）に添加し、さらに培地に脱アシル化ゲランガムを添加して、ゲル培地を用意した。

　用意したゲル培地を１５ｍＬチューブに入れ、ゲル培地に２×１０^５個の血液細胞を播種した。その後、１５ｍＬチューブをＣＯ_２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞（単核球）を培養した。その後、ゲル培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクターを感染多重度（ＭＯＩ）が１０．０となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。

　ゲル培地にセンダイウイルスを添加した後、ゲル培地に１５ｍＬのゲル化した幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、そのうち１５ｍＬのセンダイウイルスに感染した細胞を含む培地を密閉可能な細胞培養器に入れ、ゲル培地を細胞培養器に注入した。その後、細胞培養器内部を密閉し、細胞培養器の内部と外部とで、ガス交換が完全に生じないようにした。

　細胞培養器内で初期化因子を導入された細胞の浮遊培養を開始した。その後、２日に一度、培地保持槽４０内の２ｍＬのゲル培地を、２ｍＬの新鮮なゲル培地に交換した。

　１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図５に示すように、ＥＳ細胞様コロニーを形成していることが確認された。また、４％－パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０の発現量を測定したところ、図６に示すように、９０％以上ＴＲＡ－１－６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、完全に閉鎖された環境下において、培地交換及びガス交換をすることなく、幹細胞以外の体細胞からｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。

　（実施例２）
　血液を赤血球沈降剤で処理し、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を得た。処理血液を表面細胞マーカー抗体で処理し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で分析した結果を図７に示す。処理血液は、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ３３陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１９陽性細胞、ＣＤ４１陽性細胞、ＣＤ４２陽性細胞、及びＣＤ５６陽性細胞を含んでいた。

　赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を図２に示したような単核球回収器に入れ、緩衝液で希釈し、上澄みを除去した。その後、単核球回収器から単核球を回収した。図８（ａ）に示すように、単核球回収器に入れる前の処理血液は、血小板を多く含んでいた。一方、図８（ｂ）に示すように、単核球回収器から回収された単核球を含む溶液は、血小板がほぼ除去されていた。同一面積あたりにおける、単核球回収器に入れる前の処理血液における血小板の数と、単核球回収器から回収された単核球を含む溶液における血小板の数と、を示すグラフを図９に示す。

　単核球回収器に入れる前の血小板を含む処理血液を培養液に入れると、図１０（ａ）に示すように、凝集した。これに対し、単核球回収器から回収された、血小板を除去された単核球を含む溶液を培養液に入れると、図１０（ｂ）に示すように、凝集しなかった。

　（実施例３）
　血液培地に脱アシル化ゲランガムを添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地をラミニンコートした６ウェルディッシュに入れ、２×１０^５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、６ウェルディッシュを３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、血液増殖培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を感染多重度（ＭＯＩ）が５となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。

　細胞を６ウェルディッシュに入れたまま、血液増殖培地にセンダイウイルスを添加した二日後に、５００μＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）又はステムフィットを利用して培地交換した。

　血液増殖培地にセンダイウイルスを添加して１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１１に示すように、ＥＳ細胞様コロニーが形成されていることが確認された。また、４％－パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０の発現量を測定したところ、図１２に示すように、誘導後の細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ－１－６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、細胞培養器内で細胞にリプログラミング因子を導入し、同一の細胞培養器内でリプログラミング因子を導入された細胞を培養して、細胞をリプログラミングすることが可能であることが示された。

　（実施例４）
　血液培地に脱アシル化ゲランガムを添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地をラミニンコートしたフラスコに入れ、５×１０^５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、血液増殖培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を感染多重度（ＭＯＩ）が５となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。

　血液増殖培地にセンダイウイルスを添加した二日後、フラスコ内に空気が残らないように、幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）又はステムフィットでフラスコを完全に満たし、外部とのガス交換が生じないように、フラスコのキャップを閉め、細胞、微生物、及び不純物等が透過しないよう、フラスコの内部を閉鎖した。

　血液増殖培地にセンダイウイルスを添加して１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１３に示すように、ＥＳ細胞様コロニーが形成されていることが確認された。また、４％－パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０の発現量を測定したところ、図１４に示すように、誘導後の細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ－１－６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、細胞培養器内で細胞にリプログラミング因子を導入し、同一の閉鎖された細胞培養器内でリプログラミング因子を導入された細胞を培養して、細胞をリプログラミングすることが可能であることが示された。

　（実施例５）
　ゲル状ではない液体の血液増殖培地をラミニンコートした６ウェルディッシュに入れ、２×１０^５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、６ウェルディッシュを３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、血液増殖培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を感染多重度（ＭＯＩ）が５となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。

　血液増殖培地にセンダイウイルスを添加して１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１５に示すように、ＥＳ細胞様コロニーが形成されていることが確認された。また、４％－パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０の発現量を測定したところ、図１６に示すように、誘導後の細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ－１－６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、細胞培養器内で細胞にリプログラミング因子を導入し、同一の細胞培養器内でリプログラミング因子を導入された細胞を培養して、細胞をリプログラミングすることが可能であることが示された。

　（実施例６）
　ゲル状ではない液体の血液増殖培地をラミニンコートしたフラスコに入れ、５×１０^５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、フラスコを３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、血液増殖培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を感染多重度（ＭＯＩ）が５となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。

　血液増殖培地にセンダイウイルスを添加して１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１７に示すように、ＥＳ細胞様コロニーが形成されていることが確認された。また、４％－パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０の発現量を測定したところ、図１８に示すように、誘導後の細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ－１－６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、細胞培養器内で細胞にリプログラミング因子を導入し、同一の閉鎖された細胞培養器内でリプログラミング因子を導入された細胞を培養して、細胞をリプログラミングすることが可能であることが示された。

　１０・・・血液容器、１１・・・赤血球除去器、１２・・・流路、１３・・・流路、１４・・・流体機械、１５・・・単核球回収器、１６・・・流路、１７・・・流路、１８・・・流体機械、１９・・・流路、２０・・・単核球吸引装置、２１・・・流体機械、２２・・・細胞培養器、２３・・・流路、２４・・・流体機械、２５・・・培地容器、２６・・・流路、２７・・・容積可変容器、２８・・・流体機械、２９・・・流路、３０・・・容積可変容器、３１・・・流路、３２・・・培地容器、３３・・・流体機械、３４・・・流路、３５・・・容積可変容器、３６・・・流路、３７・・・流体機械、３８・・・流路、３９・・・流体機械、４０・・・培地保持槽、５０・・・血液容器、５１・・・流路、５２・・・流体機械、５３・・・赤血球処理剤容器、５４・・・流路、５５・・・流体機械、５６・・・流路、５７・・・混合器、５８・・・流路、６０・・・流路、６１・・・希釈用液容器、７０・・・真空容器、７１・・・真空容器、１００・・・赤血球除去装置、１０１・・・赤血球除去装置、１１５・・・開口、１１６・・・開口、１１７・・・流路、２００・・・細胞培養装置

Claims

　細胞培養器内で細胞に因子を導入し、
　前記細胞培養器と同一の細胞培養器内で前記因子を導入された細胞を培養する、
　細胞の培養方法。
　前記細胞に因子を導入し、前記因子を導入された細胞を培養している間、前記細胞培養器が閉鎖されている、請求項１に記載の細胞の培養方法。
　前記細胞培養器に容積可変容器が接続されており、
　前記細胞培養器及び前記容積可変容器内を流体が移動する、
　請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
　前記容積可変容器から前記因子が供給される、請求項３に記載の細胞の培養方法。
　前記細胞培養器と同一の細胞培養器内で前記因子を導入された第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導する、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
　前記第１の状態の細胞が体細胞である、請求項５に記載の細胞の培養方法。
　前記第２の状態の細胞が幹細胞である、請求項５又は６に記載の細胞の培養方法。
　前記第２の状態の細胞がｉＰＳ細胞である、請求項５又は６に記載の細胞の培養方法。
　前記第１の状態の細胞が幹細胞である、請求項５に記載の細胞の培養方法。
　前記第２の状態の細胞が体細胞である、請求項５に記載の細胞の培養方法。
　前記第１の状態の細胞が体細胞であり、前記第２の状態の細胞が前記第１の状態の細胞とは異なる体細胞である、請求項５に記載の細胞の培養方法。
　前記第１の状態の細胞が、血小板及び赤血球の少なくとも一方を少なくとも部分的に除去された血液細胞である、請求項５に記載の細胞の培養方法。
　前記因子が、第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導する因子である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
　前記因子が初期化因子である、請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
　前記因子が分化誘導因子である、請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
　前記因子を導入された細胞を前記細胞培養器から回収し、前記細胞培養器と同一の細胞培養器に前記細胞を戻して、前記細胞を継代又は拡大培養する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
　血液を処理して、赤血球を少なくとも部分的に除去された処理血液を作製することと、
　前記処理血液を希釈することと、
　前記希釈された処理血液に含まれる単核球を沈降させることと、
　前記希釈された処理血液の上澄みを除去することと、
　前記単核球を回収することと、
　を含む、単核球の回収方法。
　赤血球除去器内で前記処理血液を作製し、
　単核球回収器内で前記処理血液の希釈、前記単核球の沈降、及び前記上澄みの除去がなされ、前記赤血球除去器及び前記単核球回収器が閉鎖されている、請求項１７に記載の単核球の回収方法。
　赤血球沈降剤又は赤血球除去剤で前記血液を処理する、請求項１７又は１８に記載の単核球の回収方法。
　前記回収された単核球において、血小板及び赤血球の少なくとも一方が少なくとも部分的に除去されている、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の単核球の回収方法。