WO2020184605A1 - 角膜疾患治療剤 - Google Patents

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WO2020184605A1
WO2020184605A1 PCT/JP2020/010465 JP2020010465W WO2020184605A1 WO 2020184605 A1 WO2020184605 A1 WO 2020184605A1 JP 2020010465 W JP2020010465 W JP 2020010465W WO 2020184605 A1 WO2020184605 A1 WO 2020184605A1
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corneal
substituent
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carbon atoms
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菜月 深澤
泰斗 西野
里奈 渡辺
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日産化学株式会社
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    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel therapeutic agent for corneal diseases and a method for treating corneal diseases using the same.
  • the cornea is one of the transparent layered tissues that make up the eyeball.
  • the diameter is about 12 mm
  • the thickness of the central part is about 0.5 mm
  • the thickness of the peripheral part is about 0.7 mm
  • the corneal epithelium Bowman's membrane, corneal parenchyma, Descemet's membrane, and corneal endothelium. It is composed of 5 layers.
  • Corneal epithelial cells play a barrier function to prevent the invasion of foreign substances and pathogens, and when corneal epithelial cells are deficient due to various diseases or trauma, not only pain and invisible conditions continue, but also complications such as infectious diseases occur. Complications occur.
  • corneal endothelial cells are cells that are indispensable for keeping the water content and thickness of the cornea constant and maintaining the transparency of the cornea. Defects in corneal endothelial cells result in corneal opacity and cause significant loss of vision. Since corneal epithelial cells and corneal endothelial cells play an important role in the expression of eye function, there is a need for the development of therapeutic agents for diseases and trauma that cause defects in these cells.
  • corneal transplantation therapy As a treatment method for serious corneal diseases and trauma, corneal transplantation therapy has been conventionally performed. However, due to the lack of donors who can provide the necessary cornea and the possibility of rejection of the donor-derived cornea, corneal epithelial cells and corneal endothelial cells are amplified in vitro before transplantation. The development of a law has been desired (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 3 the growth promoting effect of the compound on corneal epithelial cells and corneal endothelial cells has not been reported.
  • An object of the present invention is to provide a drug for treating a corneal disease and a method for treating a corneal disease using the same.
  • a therapeutic agent for corneal diseases which comprises the compound represented by the following formula (I) or a salt thereof.
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n 0, Ar is a phenyl or naphthyl group, which may have a hydroxyl group or a C 1-4 alkyl group.
  • Y is a single bond, and Z is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the therapeutic agent for corneal disease [3] R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n 0, Ar is a phenyl or naphthyl group which may have a halogen atom, a C 1-4 alkyl group, a hydroxyl group or a C 1-4 alkoxy group.
  • Y is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms substituted with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and Z is a single bond.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n is 0
  • Ar is a phenyl group which may have a hydroxyl group or a methyl group
  • Y is a methylene group which may have a methyl group or an ethyl group.
  • the therapeutic agent for corneal disease [5] R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n 0
  • Ar is a phenyl group which may have a hydroxyl group or a halogen atom
  • Y is a methylene group which may have a methyl group or an ethyl group.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n is 0
  • Corneal diseases include corneal epithelial disorders, punctate superficial keratopathy, corneal vulgaris, corneal ulcers, dry eyes, corneal epithelial detachment, airidia, winged pieces, cornealized cornea, corneal dystrophy, keratitis, and corneal epithelium.
  • a method for treating a corneal disease which comprises administering the compound represented by the formula (I) below or a salt thereof to a subject in need thereof.
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2.
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2.
  • a method for producing corneal epithelial cells or corneal endothelial cells which comprises using the method according to the above [11]. [13] The following formula:
  • a growth-promoting agent for corneal epithelial cells or corneal endothelial cells which comprises the compound represented by the formula (I) below or a salt thereof.
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n 0, Ar is a phenyl or naphthyl group, which may have a hydroxyl group or a C 1-4 alkyl group.
  • Y is a single bond, and Z is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • Ar is a phenyl or naphthyl group which may have a halogen atom, a C 1-4 alkyl group, a hydroxyl group or a C 1-4 alkoxy group.
  • Y is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms substituted with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and Z is a single bond.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n is 0
  • Ar is a phenyl group which may have a hydroxyl group or a methyl group
  • Y is a methylene group which may have a methyl group or an ethyl group.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n is 0
  • Ar is a phenyl group which may have a hydroxyl group or a halogen atom
  • Y is a methylene group which may have a methyl group or an ethyl group.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group.
  • n 0
  • Ar is a phenyl group which may have a hydroxyl group or a methyl group
  • Y is a single bond.
  • the proliferation of corneal epithelial cells and corneal endothelial cells can be efficiently promoted. Therefore, according to the present invention, it is possible to treat diseases and trauma associated with deficiency of corneal epithelial cells and corneal endothelial cells. Furthermore, corneal epithelial cells and corneal endothelial cells for transplantation can be efficiently produced in vitro.
  • n- means normal, i- means iso, sec- means secondary, and tert- means tertiary. Further, in the present specification, o- means ortho, m- means meta, and p- means para.
  • halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • a "halogeno group” is fluoro, chloro, bromo or iodine.
  • alkyl group having 1 to 6 carbon atoms means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, and the like. Examples thereof include C 1-6 alkyl groups such as isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, n-hexyl and 2-hexyl.
  • a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (C 1-4 alkyl group) is preferable, and a methyl group and an ethyl group are particularly preferable.
  • cyclic alkyl preferably means a cycloalkyl (C 3-8 cycloalkyl) group having 3 to 8 carbon atoms, and for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like, unless otherwise specified. Cycloheptyl, cyclooctyl and the like can be mentioned.
  • a hetero atom may be contained in the ring" it may contain one or more hetero atoms as a ring-constituting atom, and also includes a 3- to 8-membered saturated heterocyclyl group. ..
  • Examples of the 3- to 8-membered saturated heterocyclyl group include tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, aziridinyl, azetidinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, morpholinyl and the like.
  • the "aryl group” includes monocyclic, bicyclic, tricyclic and tetracyclic carbocyclic groups in which at least one ring is an aromatic group and each ring has 5 to 8 ring atoms. Specific examples thereof include phenyl, indenyl, naphthyl, fluorenyl and the like.
  • the aryl group is preferably a C 6-10 aryl group such as phenyl, indenyl, naphthyl, etc., more preferably phenyl or naphthyl, and particularly preferably phenyl.
  • alkylene group having 1 to 6 carbon atoms means a linear carbon chain having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include groups such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene and hexylene. ..
  • the alkylene group is preferably an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably methylene.
  • heteroaryl group means a monocyclic, bicyclic or polycyclic aromatic heterocyclic group in which at least one ring atom is a heteroatom and the remaining ring atoms are carbon.
  • Monocyclic heteroaryl groups include, but are not limited to, 5- or 6-membered aromatic heterocyclic groups in which at least one ring atom is a heteroatom and the remaining ring atoms are carbon.
  • heteroaryl groups include simple compounds such as frill, thiophenyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl, pyridyl, pyridadinyl, pyrimidinyl and pyrazinyl.
  • Cyclic aromatic heterocyclic groups indolyl, isoindrill, indazolyl, benzofuryl, benzothiophenyl, benzimidazolyl, benzoxazolyl, benzothiazolyl, benzisothiazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, phthalazinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, pteridinyl, imidazoline Oxazolyl, imidazothiazolyl, imidazoimidazolyl, benzoxaziazolyl, benzothiadiazolyl, benzoxazinyl, benzisooxazolyl, benzothiazinyl, flo [2,3-b] pyridyl, thieno [2, 3-b]
  • Examples thereof include bicyclic or polycyclic aromatic heterocyclic groups such as pyridyl, naphthylidineyl, imidazolopylid
  • May have a substituent means having one or two or more substituents at positions that are unsubstituted or substitutable, and each of the cases where it has two or more substituents.
  • the substituents may be the same or different.
  • alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may each have a substituent, and examples of such a substituent include the following.
  • the basis of is mentioned.
  • substituents for the "alkyl group having 1 to 6 carbon atoms” include the following (1) to (40), and the substituents for the "aryl group” and the “alkylene group having 1 to 6 carbon atoms” include. , The following (1) to (41) can be mentioned.
  • -Pentyl isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, n-hexyl, 2-hexyl and the like can be mentioned.
  • Carbamic group (28) Mono- or di-substituted carbamoyl groups (eg, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, etc.) with alkyl groups (synonymous with "alkyl group” in (26) above), (29) Sulfamoyl group, (30) Mono or di-substituted sulfamoyl groups with alkyl groups (synonymous with "alkyl group” in (26) above) (eg, methyl sulfamoyl, ethyl sulfamoyl, di
  • the "C 1-6 alkyl group” is one of the above “alkyl groups” having 1 to 6 carbon atoms
  • the "C 6-10 aryl group” is the above “aryl group”. Of these, those having 6 to 10 carbon atoms.
  • Specific examples of the acyl group include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyroyl group, isobutyroyl group, valeroyl group, isovaleroyl group, pivaloyl group, hexanoyl group, acryloyl group, methacryloyl group, crotonoyl group, isocrotonoyl group and benzoyl.
  • Alkoxycarbonylamino group eg, carbonylamino group substituted with an alkoxy group (synonymous with (12) above)
  • Alkylsulfonyl groups eg, sulfonyl groups substituted with alkyl groups (synonymous with "alkyl group” in (26) above)
  • Alkyl sulfinyl group eg, sulfinyl group substituted with an alkyl group (synonymous with "alkyl group” in (26) above)
  • Alkoxycarbonyl group eg, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2.
  • ⁇ Or a salt thereof hereinafter, the compound represented by the formula (I) or a salt thereof is generically referred to simply as "a specific compound used in the present invention” or "a compound forming the present invention”. Etc.).
  • the compound represented by the formula (I) may be in the form of a salt.
  • the salt of the compound represented by the formula (I) include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid and hydrobromic acid, and acetic acid, propionic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, and oxalic acid.
  • Salts with organic acids such as succinic acid, citric acid, benzoic acid and the like. These salts are produced by known methods.
  • the compound represented by the formula (I) may have an E-form having an E configuration and a Z-form geometric isomer having a Z configuration.
  • the present invention includes these E-forms, Z-forms, or mixtures containing E-forms and Z-forms in arbitrary proportions.
  • the compound represented by the formula (I) may have an optically active substance due to the presence of one or two or more asymmetric carbon atoms, but the compound represented by the formula (I) is all. Includes optically active or racemic forms.
  • therapeutic agent for corneal diseases The present invention shall be referred to as a therapeutic agent for corneal diseases and trauma (hereinafter, "therapeutic agent for corneal diseases” or “therapeutic agent of the present invention” and the like, which comprises the compound represented by the formula (I) below or a salt thereof. There is) to provide.
  • X is -NHCO- and R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y and Z each independently have a single bond or a substituent. It is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (Ar is an aryl group which may have a substituent), and R 2 has a carbon number which may have a substituent. It is an alkyl group of 1 to 6, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2 ⁇ .
  • Z is an alkylene group which may have a substituent (more preferably, an alkylene group which does not have a substituent, particularly preferably a methylene group).
  • Ar has an aryl group (more preferably, an aryl group or a substituent having a hydroxyl group) which may have a substituent (more preferably, a halogen atom, a methyl group, a hydroxyl group, or a methoxy group).
  • R 2 has an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably, it has a substituent). It is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably an ethyl group), and n is 0, 1 or 2, and n is preferably 0.
  • Y is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably, an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which has a substituent, particularly preferably a methyl group or a methyl group.
  • Z is a single bond and Ar is an aryl group which may have a substituent (more preferably, an aryl group having a substituent).
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more). It is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having no substituent (preferably a methyl group, an ethyl group, or an isopropyl group), and n is 0, 1 or 2, preferably 0, 1 or 2. n is 0.
  • X in the formula (I) is -NHCO-
  • R 1 is -Y-NH-Z-Ar (in the formula, Y is a single bond
  • Z is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 alkylene group)
  • Ar is a halogen. It is a C 6-10 aryl group that may have an atom, a C 1-6 alkyl group, a hydroxyl group or a C 1-6 alkoxy group).
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 alkyl)
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (C 1-4 alkyl group; eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl) and The compound represented by the formula (I), in which n is 0.
  • X in the formula (I) is -NHCO-
  • R 1 is -Y-NH-Z-Ar
  • Y is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms (C 1 ) substituted with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (C 1-4 alkyl group).
  • -4 alkylene group where Z is a single bond and Ar may have a halogen atom, a C 1-4 alkyl group, a hydroxyl group or a C 1-4 alkoxy group, a phenyl group or a naphthyl group.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (C 1-4 alkyl), and n is 0, compounds of formula (I).
  • X in the formula (I) is -NHCO-
  • R 1 is -Y-NH-Z-Ar
  • Y is a methylene group substituted with a methyl group or an ethyl group
  • Z is a single bond
  • Ar is a halogen atom, a methyl group
  • It is a phenyl group which may have an ethyl group, a hydroxyl group, a methoxy group or an ethoxy group (preferably a phenyl group which may have a hydroxyl group or a methyl group).
  • R 2 is methyl group, an ethyl group or an isobutyl group
  • n is 0, compounds of formula (I).
  • X in the formula (I) is -NHCO-
  • R 1 is -Y-NH-Z-Ar
  • Y is a methylene group substituted with a methyl group or an ethyl group
  • Z is a single bond
  • Ar is a halogen atom (preferably, preferably). It is a phenyl group that may have a fluorine atom, a bromine atom) or a hydroxyl group.
  • R 2 is methyl group, an ethyl group or an isobutyl group, and n is 0, compounds of formula (I).
  • Particularly preferable specific examples of the compound represented by the formula (I) include the compounds described in Table 1 described later.
  • the application target of the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is an animal that may suffer from corneal disease, but the application target of the therapeutic agent of the present invention is usually a mammal, and humans, dogs, cats, and cows. , Sheep, pigs, horses, mice, rats and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention is applied to humans.
  • the therapeutic agent of the present invention may have any shape at the time of delivery or storage.
  • the therapeutic agent of the present invention may be in the form of solid, liquid, gel or the like.
  • the therapeutic agent of the present invention can usually be administered as an oral administration agent such as tablets, capsules, powders, granules, pills and syrups, eye drops, eye ointments, transdermal absorbents or ophthalmic injections.
  • eye drops, eye ointments, and ophthalmic injections are preferable, and eye drops are most preferable because they can be easily and easily administered locally to the eye with minimal invasiveness.
  • the therapeutic agents of the present invention can be administered alone or in admixture with other therapeutic agents.
  • compositions may be administered as a single compound represented by the formula (I), but are generally administered in the form of a pharmaceutical composition.
  • These preparations can be produced by a conventional method by adding pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives. That is, ordinary excipients, lubricants, binders, disintegrants, wetting agents, plasticizers, coating agents and other additives can be used as oral preparations.
  • Oral solutions may be in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups, elixirs, etc., or may be provided as dry syrups prepared in water or other suitable solvent prior to use. Good.
  • the solution can include conventional additives such as suspending agents, fragrances, diluents or emulsifiers.
  • Ophthalmic injections are solubilizers or solubilizers such as distilled water for injection, physiological saline, 5% glucose solution, propylene glycol, and pH adjusters in order to form an aqueous dosage form or a soluble dosage form at the time of use. , Tonicity agents, stabilizers and other formulation components are used.
  • Eye drops include tonicity agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin and propylene glycol, buffering agents such as sodium phosphate, sodium acetate, sodium borate and sodium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and polyoxyl stearate.
  • tonicity agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin and propylene glycol
  • buffering agents such as sodium phosphate, sodium acetate, sodium borate and sodium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and polyoxyl stearate.
  • Surfactants such as polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, stabilizers such as disodium edetate and sodium citrate, benzalkonium chloride, sorbic acid , Preservatives such as methyl paraoxybenzoate, thickeners such as methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose and polyvinylpyrrolidone, antioxidants such as ascorbic acid and tocophenol, and the like can be used as necessary.
  • the pH may be in the range acceptable for ophthalmic preparations, but is preferably in the range of 4-8.
  • hydrochloric acid When adjusting the pH, hydrochloric acid, phosphoric acid, citric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate and the like can be used.
  • the following are examples of formulations of the therapeutic agent of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
  • Formulation Example 1 An eye ointment (in 100 g) containing the following components is produced.
  • Formulation Example 2 An eye drop (in 100 mL) containing the following components is produced.
  • Compound represented by component formula (I) 500 mg Sodium hydroxide 900 mg Sterile purified water Appropriate amount
  • Formulation Example 3 An eye drop (in 100 mL) containing the following components is produced.
  • Compound represented by component formula (I) 500 mg Polyoxyl 35 castor oil 90 mg Hydrochloric acid Appropriate amount Sodium hydroxide Appropriate amount Sterilized purified water Appropriate amount
  • Formulation Example 4 A tablet containing the following ingredients is produced.
  • Formulation Example 5 Manufacture an injectable preparation containing the following ingredients.
  • the content of the specific compound or a salt thereof contained in the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but in the case of eye drops, the lower limit is preferably 0.001% (w / v) and 0.01% (w / v). v) is more preferable, 0.1% (w / v) is further preferable, and 0.5% (w / v) is most preferable.
  • the upper limit is preferably 5% (w / v), more preferably 3% (w / v), even more preferably 2% (w / v), and most preferably 1% (w / v).
  • the dose of the specific compound or a salt thereof is not particularly limited, but can be appropriately selected according to the age, sex and condition of the patient.
  • the dose is 0.00001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg, more preferably 0.01 to 1 mg, and most preferably 0.1 to 0.5 mg per day. ..
  • the administration can be a single dose or multiple doses.
  • the therapeutic agent of the present invention is an eye drop
  • one drop is usually 0.01 to 0.1 mL.
  • Methods for selecting and producing suitable prodrugs are described, for example, in Design of Prodrugs (Elsevier, Amsterdam 1985).
  • an acyloxy derivative obtained by reacting the compound with an appropriate acyl halide or an appropriate acid anhydride is exemplified as a prodrug.
  • Particularly preferred acyloxys as prodrugs include -OCOC 2 H 5 , -OCO (t-Bu), -OCOC 15 H 31 , -OCO (m-CO 2 Na-Ph), -OCOC 2 CH 2 CO 2 Na, -OCOCH (NH 2 ) CH 3 , -OCOCH 2 N (CH 3 ) 2, and the like can be mentioned.
  • an amide derivative produced by reacting a compound having an amino group with an appropriate acid halide or an appropriate mixed acid anhydride is exemplified as a prodrug. .
  • Particularly preferable amides as prodrugs include -NHCO (CH 2 ) 20 OCH 3 , -NHCOCH (NH 2 ) CH 3, and the like.
  • corneal diseases to which the therapeutic agent of the present invention can be applied include corneal epithelial disorders, punctate superficial keratopathy, corneal erosion, corneal ulcers, dry eyes, corneal epithelial detachment, aniridia, wing pieces, cornealized cornea, and cornea Dystrophy, keratitis, corneal epithelial stem cell exhaustion, drug injury, burn, Stevens Johnson syndrome, ocular syphilis, diabetic keratopathy, bullous keratopathy, corneal endothelitis, Fuchs corneal endothelial dystrophy, droplet cornea, iris Examples include corneal endothelial syndrome and transplant failure after corneal transplantation.
  • the therapeutic agent of the present invention has a main mechanism of action for the treatment of corneal diseases by promoting the proliferation of corneal cells (corneal epithelial cells and / or corneal endothelial cells). Therefore, the therapeutic agent of the present invention can be rephrased as a growth promoter of corneal cells (corneal epithelial cells and / or corneal endothelial cells) (hereinafter, also referred to as “proliferation promoter of the present invention”).
  • the growth promoter of the present invention may be applied to the target of application of the therapeutic agent of the present invention, or may be added to a culture medium for test or transplantation of corneal cells.
  • the present invention also comprises administering an effective amount of the compound represented by the formula (I) or a salt thereof to a subject in need thereof (hereinafter, "therapeutic method of the present invention”). (Sometimes referred to as).
  • the compound represented by the formula (I) the treatment target, the dose, the route of administration, the number of administrations, the applicable corneal diseases, etc. It is the same as that described in [Therapeutic agent for corneal disease].
  • the present invention also comprises using a medium composition containing the compound represented by the formula (I) or a salt thereof (hereinafter, may be referred to as "medium of the present invention” or the like) and corneal epithelial cells.
  • a method for promoting the proliferation of corneal endothelial cells is provided. By using the method for promoting the growth of corneal cells of the present invention, it is possible to promote the growth of corneal epithelial cells and corneal endothelial cells and / or the formation of cell aggregates (spheres).
  • the concentration of the specific compound contained as an active ingredient in the medium of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, but for example, the lower limit of the concentration is usually 0.001 ⁇ M or more, preferably 0. It can be 01 ⁇ M or more, more preferably 0.1 ⁇ M or more, still more preferably 1 ⁇ M or more, and particularly preferably 10 ⁇ M or more.
  • the upper limit of the concentration is usually 100 ⁇ M or less, preferably 50 ⁇ M or less, and particularly preferably 10 ⁇ M or less.
  • the medium of the present invention can be the same as the composition of a known medium except that the compound used in the present invention or the composition of the present invention is blended.
  • the medium of the present invention is prepared by adding a specific compound used in the present invention or a composition containing the specific compound (hereinafter, also referred to as “composition of the present invention”) to a commercially available medium.
  • composition of the present invention may include, for example, water, saline, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerin, propylene glycol, butylene glycol, and various alcohols such as methanol, ethanol, butanol, propanol and the like.
  • the composition of the present invention may be sterilized if necessary.
  • the sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and filter sterilization.
  • the material of the filter part when performing filter sterilization is not particularly limited, but for example, glass fiber, nylon, PES (polyether sulfone), hydrophilic PVDF (polyvinylidene fluoride). ), Cellulose mixed ester, cellulose acetate, polytetrafluoroethylene and the like.
  • the composition of the present invention may have any shape when provided or stored.
  • the composition is bound to a formulated solid such as tablets, pills, capsules, granules, a liquid such as a solution or suspension dissolved in a suitable solvent and solubilizer, or a substrate or carrier. Can be in a suspended state.
  • the commercially available medium that can be used as the medium of the present invention by adding the specific compound used in the present invention or the composition of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, but for example, Dulbecco's modified Eagle's medium (Dulbecco).
  • DMEM DMEM
  • DMEM DMEM
  • DMEM DMEM
  • DMEM / F12 medium McCoy's 5A medium
  • Eagle's Medium Eagle's Medium
  • Eagle's Medium Eagle's Medium
  • ⁇ MEM Eagle's Medium
  • MEM Minim's Essential Medium
  • RPMI1640 medium Iskov's modified Dalbeco medium (Iskov's ModiMediMedium , X-VIVO10 (manufactured by Kenbrex), X-VIVO15 (manufactured by Kenbrex), HPGM (manufactured by Kenbrex), StemlineII (manufactured by Sigma Aldrich), QBSF-60 (manufactured by Quality Biological) ), StemProhESCSFM (manufactured by Invigen), CSTI-7 medium (manufactured by Cell Science Institute), MesenPRO RS medium (manufactured by Gibco),
  • a medium obtained by adding a polysaccharide such as deacylated gellan gum to these media to form a three-dimensional cell culture medium can be used.
  • a three-dimensional cell culture medium include, but are not limited to, FCeM (registered trademark) (manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd.).
  • sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, cell growth factors, differentiation inducers, cell adhesion factors, antibodies, enzymes, Cytokines, hormones, lectins, extracellular matrix, physiologically active substances and the like may be added depending on the purpose.
  • Specific examples include basic fibroblast growth factor, transforming growth factor- ⁇ , epidermal growth factor, insulin-like growth factor, Wnt protein, interferons, interleukins, vascular endothelial growth factor, albumin, and insulin.
  • KSR Knockout Protein Replacement
  • Glutamax manufactured by Thermofisher Scientific
  • hydrocortisone hydrocortisone
  • epidermal growth L-glutamine, pyruvate, selenic acid and the like.
  • Culture of cells in the medium of the present invention includes petri dishes, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, dishes, petridish, tissue culture dishes, multi-dish, microplates, and microwells that are generally used for cell culture. It can be carried out using a culture container such as a plate, a multi-plate, a multi-well plate, a chamber slide, a tube, a tray, a culture bag, and a roller bottle. These culture vessels can be coated with extracellular matrix such as collagen, gelatin, laminin, fibronectin, vitronectin, Matrigel®, poly-L-ornithine / laminin or poly-D-lysine.
  • extracellular matrix such as collagen, gelatin, laminin, fibronectin, vitronectin, Matrigel®, poly-L-ornithine / laminin or poly-D-lysine.
  • the surface of the culture container is not artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving the adhesion to cells, or the culture container.
  • Those whose surface has been artificially treated for the purpose of reducing adhesion to cells can be used.
  • Examples of such containers include Smilon Celtite Plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), Prime Surface (registered trademark) plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), ultra-low adhesive surface plate (manufactured by Corning), and Nuncron Sfera plate. (Manufactured by Thermo Fisher Scientific), etc., but is not limited to this.
  • corneal epithelial cells examples include corneal epithelial cells and corneal endothelial cells.
  • corneal endothelial cells can be obtained by exfoliating the Descemet's membrane from the corneal tissue and separating the endothelial cells by enzymatic treatment. These cells may be genetically engineered by a virus, genome editing, or the like.
  • corneal epithelial cells and corneal endothelial cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells can also be preferably used.
  • the origin of these cells is not particularly limited, but rats, mice, rabbits, guinea pigs, squirrels, hamsters, pigeons, platypus, dolphins, whales, dogs, cats, goats, cows, horses, sheep, pigs, elephants, Cells derived from mammals such as common marmosets, whales, platypus, chimpanzees and humans are preferred.
  • the medium of the present invention can promote the growth of corneal cells (corneal epithelial cells and / or corneal endothelial cells)
  • the composition of the medium for promoting the growth of corneal cells corneal epithelial cells and / or corneal endothelial cells. In other words, it is a thing.
  • the present invention also comprises using a medium containing an effective amount of the compound represented by the formula (I) or a salt thereof (hereinafter, "the production method of the present invention"). May be referred to as).
  • the corneal epithelial cells and corneal endothelial cells obtained by the production method of the present invention can be suitably used as cells for transplantation in treating corneal diseases.
  • the compound represented by the formula (I), the amount thereof added, the cells to be cultured, the corneal disease to be transplanted using the obtained cells, etc. are described in [1. Therapeutic agents for corneal diseases] and [3. It is the same as that described in [Method for promoting proliferation of corneal cells].
  • the cell culture conditions (for example, temperature, carbon dioxide concentration, culture period, etc.) in the production method of the present invention may be a method known per se, or may be appropriately modified depending on the intended purpose.
  • the temperature at which cells are cultured is usually 25 ° C. to 39 ° C., preferably 33 ° C. to 39 ° C. (eg, 37 ° C.) for animal cells.
  • the carbon dioxide concentration is usually 4% by volume to 10% by volume, preferably 4% by volume to 6% by volume in the culture atmosphere.
  • the culturing period is usually 1 to 35 days, but it may be appropriately set according to the purpose of culturing.
  • the present invention will be described in more detail in the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the compound represented by the formula (I) can be produced by the method described in International Publication No. 2019/022222 or International Publication No. 2019/235569, or a method similar thereto.
  • Examples of the compounds used in the examples of the present invention are shown in Table 1, but the compounds that can be used in the present invention are not limited to these.
  • the description of Me represents methyl
  • the description of Et represents ethyl.
  • R 4 (R) means a R configuration
  • (rac) means racemic.
  • R 5 is a substituent of the aryl group, substituents for the aryl group are the same as those described above.
  • R 5 "-" description refers to an unsubstituted.
  • Number on the structural formula represents the substitution position of R 5.
  • n is 0, 1 or 2
  • m is 0, 1, 2, 3, 4 or 5. If R 5 there are a plurality, R 5 may each may be the same or different.
  • k-1 B-1
  • k-1 J-1
  • k-1 D-1
  • k-1 H-1
  • k-1 I- 10, GA-002A and GA-005A
  • CE-001, CE-002 and CE-003 are novel compounds.
  • 1 H-NMR represents a proton nuclear magnetic resonance spectrum, and was measured in deuterated dimethyl sulfoxide at 270 MHz.
  • the chemical shift value is described with the value of tetramethylsilane as 0.00 ppm.
  • s represents a singlet, and similarly, brs represents a broad singlet, d represents a doublet, dd represents a double doublet, t represents a triplet, q represents a quartet, and m represents a multiplet.
  • Lithium aluminum hydride (554 mg, 14.6 mmol) is suspended in THF (20 mL) under ice cooling, and 3-fluoro-5-hydroxybenzonitrile (1) (1.0 g, 7.3 mmol) is added. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours and at 60 ° C. for 18 hours. After allowing to cool, lithium aluminum hydride (830 mg, 21.9 mmol) was added, and the mixture was further stirred for 4 hours. Distilled water (1.4 mL), 15% aqueous sodium hydroxide solution (1.4 mL), and distilled water (4.2 mL) were sequentially added in ice-cooled water, and the precipitated solid was filtered by Celite filtration.
  • the obtained compound (3) (0.44 g, 1.7 mmol) is dissolved in ethanol (3.4 mL), hydrazine monohydrate (0.41 mL, 8.5 mmol) is added, and the mixture is added at 60 ° C. for 18 hours. Stirred.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure and azeotropically distilled with toluene to obtain compound (4) (273 mg, 1.37 mmol, yield 81%).
  • 5-Aminomethyl-2-fluorophenol hydrochloride (6) (0.50 g, 2.1 mmol) was suspended in methylene chloride (5.0 mL) and water (5.0 mL), and sodium hydrogen carbonate (1.16 g). , 14.0 mmol) was added, and phenylchloroformate (0.58 mL, 5.0 mmol) was slowly added dropwise under ice-cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours.
  • the compound (8) (0.41 g, 2.0 mmol, 2-step yield 98%) was obtained as a pale yellow solid.
  • the obtained compound (8) (144 mg, 0.72 mmol), 2', 4'-dihydroxy-3'-methylpropiophenone (5) (100 mg, 0.55 mmol) was dissolved in DMSO (1.0 mL). The mixture was stirred at 100 ° C. for 1 day.
  • CE-002 (96.4 mg, 0.267 mmol, yield 48%) was obtained as a colorless solid by filtration and suspension washing with methylene chloride.
  • CE-003 (159 mg, 0.377 mmol, yield 68%) was obtained as a colorless solid by filtration and suspension washing with methylene chloride.
  • Example 1 Cell proliferation test using human corneal epithelial cells
  • human primary corneal epithelial cells ⁇ American Type Culture Collection (ATCC), # PCS-700-010 ⁇ was used as a corneal epithelial cell lineage additive kit (ATCC,).
  • the specific compounds used in the present invention dissolved in DMSO were added so as to have a final concentration of 10 ⁇ M, and a 96-well flat bottom plate (Corning, # 3585) and imaging analysis were performed.
  • a plate (PerkinElmer, CellCarrier-96 Ultra) was seeded at 700 cells / 64 ⁇ L / well to 1600 cells / 64 ⁇ L / well. The cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 days. As a control, DMSO was added to a final concentration of 0.1%. After culturing, the number of viable cells was measured using an ATP reagent (Promega, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay). 64 ⁇ L / well of ATP reagent was added to the culture solution of the flat bottom plate and suspended, and 100 ⁇ L / well of the suspension was transferred to a white plate for assay (Corning, # 3912).
  • ATP reagent Promega, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay
  • the amount of luminescence was measured using a plate reader (PerkinElmer, EnSpire).
  • the cells cultured on the imaging analysis plate were fixed by exchanging the medium with a 4% paraformaldehyde solution and allowing the cells to stand at room temperature for 10 minutes.
  • p63- ⁇ antibody Cell Signaling Technology, # 4892
  • AlexaFluor647 modified anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific, # A-21244
  • Fluorescent immunostaining was performed.
  • cell nuclei were stained with 10 ⁇ g / mL Hoechst 33342 solution. The stained cells were imaged in 9 fields per well using a 20x objective lens of Operatta CLS.
  • the luminescence amount was increased by 1.5 times or more by adding the following compound. That is, the number of cells increased by 1.5 times or more by adding the following compounds.
  • all the cells when k-1: B-1 or k-1: J-1 was added were p63 ⁇ positive. From this, it was shown that the composition of the present invention has a growth promoting effect on p63 ⁇ -positive human corneal epithelial cells.
  • Example 2 Cell proliferation test using bovine corneal endothelial cells
  • a bovine corneal endothelial cell line BCE C / D-1b (American Type Culture Collection (ATCC), # CRL-2048) was used in 10% bovine serum (ATCC, #).
  • the cells were seeded on a 96-well flat-bottomed plate (Corning, # 3585) at 700 cells / 90 ⁇ L / well by the monolayer culture method (2D).
  • 96-well U-bottom cell low-adhesion plates (Corning, # 4520) were seeded at 700 cells / 90 ⁇ L / well. Subsequently, 10 ⁇ L / well of the specific compound used in the present invention dissolved in DMSO was added to a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 days. As a control, DMSO was added to a final concentration of 0.1%. After culturing, the number of viable cells was measured using an ATP reagent (Promega, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay).
  • ATP reagent Promega, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay.
  • the luminescence amount was 1.4 times or more in 2D and 2 times or more in 3D by adding the following compounds. Increased. That is, the number of cells increased 1.4 times or more by the addition of the following compounds. From this, it was shown that the composition of the present invention has a growth promoting effect on corneal endothelial cells.
  • the corneal therapeutic agent of the present invention is suitably used for the treatment of various corneal diseases and is extremely useful in the medical field.

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Abstract

本発明は、角膜疾患に対する新しい治療手段に関する。本発明によれば、下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、角膜疾患の治療剤：｛式中の各記号の定義は、明細書に記載の通りである。｝を提供することができる。

Description

角膜疾患治療剤
　本発明は、新規な角膜疾患治療剤およびそれを用いた角膜疾患の治療方法に関する。
　角膜は、眼球を構成する透明な層状組織の一つである。ヒトの場合は、直径が約１２ｍｍ、中央部の厚さが約０．５ｍｍ、周辺部の厚さが約０．７ｍｍであり、表面から角膜上皮、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜、角膜内皮という５層から構成されている。角膜上皮細胞は、異物や病原菌等の侵入を防ぐバリア機能を果たしており、各種の疾患や外傷により角膜上皮細胞が欠損すると、痛みや見えにくい状態が続くだけではなく、感染症等の合併症も併発する。一方、角膜内皮細胞は、角膜の含水量と厚みを一定に保ち、角膜の透明性を維持する上で欠かせない細胞である。角膜内皮細胞の欠損は角膜の混濁をもたらし、著しい視力の低下を引き起こす。角膜上皮細胞および角膜内皮細胞は目の機能発現に重要な役割を果たしているため、これらの細胞の欠損をもたらす疾患や外傷の治療剤の開発が求められている。
　重篤な角膜の疾患や外傷の治療法としては、従来から角膜移植療法が行われてきた。しかしながら、必要な角膜を提供できるドナーが不足していることやドナー由来の角膜に対する拒絶反応が生じる場合があることなどから、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞を生体外で増幅してから移植する治療法の開発が望まれてきた（特許文献１、２）。
　近年、様々な細胞の増殖を促進する低分子化合物の報告がなされている（特許文献３）。しかしながら、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞に対する当該化合物の増殖促進効果は報告されていない。
国際公開第２０１３／０１２０８７号 国際公開第２０１３／１００２０８号 国際公開第２０１９／０２２２２２号
　本発明は、角膜疾患を治療するための薬剤、およびそれを用いた角膜疾患の治療方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の化合物が、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の増殖を促進することを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、角膜疾患の治療剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
［２］Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
ｎが、０であり、
Ａｒが、水酸基またはＣ１－４アルキル基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
Ｙが、単結合であり、および
Ｚが、炭素数１～４のアルキレン基である、
［１］記載の角膜疾患の治療剤。
［３］Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
ｎが、０であり、
Ａｒが、ハロゲン原子、Ｃ１－４アルキル基、水酸基またはＣ１－４アルコキシ基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
Ｙが、炭素数１～４のアルキル基で置換された炭素数１～４のアルキレン基であり、および
Ｚが、単結合である、
［１］記載の角膜疾患の治療剤。
［４］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
［１］記載の角膜疾患の治療剤。
［５］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはハロゲン原子を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
［１］記載の角膜疾患の治療剤。
［６］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、単結合である、［１］記載の角膜疾患の治療剤：
［７］Ｚが、単結合である、［４］記載の角膜疾患の治療剤。
［８］Ｚが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、［５］または［６］に記載の角膜疾患の治療剤。
［９］角膜疾患が、角膜上皮障害、点状表層角膜症、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、角膜上皮剥離、無虹彩症、翼状片、強膜化角膜、角膜ジストロフィー、角膜炎、角膜上皮幹細胞疲弊症、薬傷、熱傷、スティーヴンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、糖尿病角膜症、水疱性角膜症、角膜内皮炎、フックス角膜内皮ジストロフィー、滴状角膜、虹彩角膜内皮症候群、および角膜移植後の移植不全からなる群から選択される、［１］～［８］のいずれかに記載の角膜疾患の治療剤。
［１０］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、角膜疾患の治療方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
［１１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地組成物中で角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の培養することを特徴とする、角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖を促進する方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
［１２］前記［１１］に記載の方法を用いることを特徴とする角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の製造方法。
［１３］下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で示される化合物またはその塩。
［１４］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
［１５］Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
ｎが、０であり、
Ａｒが、水酸基またはＣ１－４アルキル基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
Ｙが、単結合であり、および
Ｚが、炭素数１～４のアルキレン基である、
［１４］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［１６］Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
ｎが、０であり、
Ａｒが、ハロゲン原子、Ｃ１－４アルキル基、水酸基またはＣ１－４アルコキシ基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
Ｙが、炭素数１～４のアルキル基で置換された炭素数１～４のアルキレン基であり、および
Ｚが、単結合である、
［１４］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［１７］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
［１４］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［１８］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはハロゲン原子を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
［１４］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［１９］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
Ｙが、単結合である、［１４］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［２０］Ｚが、単結合である、［１７］記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
［２１］Ｚが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、［１８］または［１９］に記載の角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖促進剤。
　本発明によれば、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の増殖を効率的に促進することができる。従って、本発明によれば、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の欠損を伴う疾患や外傷を治療することができる。更に、移植用の角膜上皮細胞および角膜内皮細胞を生体外にて効率的に製造することができる。
　本明細書において使用する用語を以下に定義する。
　本明細書において、ｎ－はノルマル、ｉ－はイソ、ｓｅｃ－はセカンダリーおよびｔｅｒｔ－はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ－はオルト、ｍ－はメタおよびｐ－はパラを各々意味する。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードである。
　「炭素数１～６のアルキル基」とは、炭素数１～６の直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等のＣ１－６アルキル基が挙げられる。かかるアルキル基としては、炭素数１～４の低級アルキル基（Ｃ１－４アルキル基）が好ましく、メチル基およびエチル基が特に好ましい。
　「環状アルキル」とは、特に限定がない場合には、好ましくは、炭素数３～８のシクロアルキル（Ｃ３－８シクロアルキル）基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。また、「環中にヘテロ原子を含んでもよい」との記載がある場合には、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい、３～８員の飽和ヘテロシクリル基も包含する。３～８員の飽和ヘテロシクリル基としては、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル等が挙げられる。
　「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族基であり、各環が５～８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。アリール基としては、好ましくは、フェニル、インデニル、ナフチル等のＣ６－１０アリール基であり、より好ましくは、フェニルまたはナフチルであり、特に好ましくは、フェニルである。
　「炭素数１～６のアルキレン基」とは、炭素数１～６の直鎖の炭素鎖を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。かかるアルキレン基としては、好ましくは、炭素数１～４のアルキレン基であり、より好ましくは、メチレンである。
　「ヘテロアリール基」とは、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子であり、残りの環原子が炭素である、単環式、二環式または多環式芳香族複素環基を意味する。単環式ヘテロアリール基としては、限定されないが、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子であり、残りの環原子が炭素である、５員または６員の芳香族複素環基が挙げられる。かかるヘテロアリール基としては、具体的には、例えば、フリル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル等の単環式芳香族複素環基；インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンズオキサジニル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチアジニル、フロ［２，３－ｂ］ピリジル、チエノ［２，３－ｂ］ピリジル、ナフチリジニル、イミダゾピリジル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル、プリニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル等の二環式または多環式芳香族複素環基が挙げられる。
　「置換基を有していてもよい」とは、無置換、または置換可能な位置に１個または２個以上の置換基を有することを意味し、２個以上の置換基を有する場合の各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
　「炭素数１～６のアルキル基」、「アリール基」および「炭素数１～６のアルキレン基」は、それぞれ置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば、以下の基が挙げられる。尚、「炭素数１～６のアルキル基」に対する置換基としては、下記（１）～（４０）が挙げられ、「アリール基」および「炭素数１～６のアルキレン基」に対する置換基としては、下記（１）～（４１）が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２－１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２－１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（Ｃ３－８シクロアルキル基；例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等、３～８員の飽和ヘテロシクリル基；例、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル等）、
(10)アリール基（Ｃ６－１０アリール基；例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（５または６員の単環式ヘテロアリール基；例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル）等、二環式ヘテロアリール基；ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル等）、
(12)アルコキシ基（Ｃ１－６アルコキシ基；例、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、３－ペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（Ｃ１－６アルキルチオ基；例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ－ブチルチオ、ｔｅｒｔ－ブチルチオ、ｎ－ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ－ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２－ペンチルチオ、３－ペンチルチオ、ｎ－ヘキシルチオ、２－ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（Ｃ３－８シクロアルキル基；例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ等、３～８員の飽和ヘテロシクリル基；例、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ等）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
　ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１－６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル等）、
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル等）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子またはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）がカルボニル基に結合した基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）がカルボニル基に結合した基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
　ここで、「アシル基」とは、例えば、水素原子またはＣ１－６アルキル基がカルボニル基に結合した基（Ｃ１－７アルカノイル基）、Ｃ６－１０アリール基がカルボニル基に結合した基（Ｃ７－１１アロイル基）等である。ここで、「Ｃ１－６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１～６のものであり、「Ｃ6－１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６～１０のものである。アシル基としては、具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1－６アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等）等が挙げられる。
　置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
　本発明において用いられる特定化合物は、下記式（Ｉ）に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝で表される化合物、またはその塩である（以下、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を総称して、単に「本発明に用いられる特定化合物」、「本発明を形成する化合物」等と称する場合がある）。
　式（Ｉ）で示される化合物は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、および酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸等の有機酸との塩等が挙げられる。これらの塩は、公知の方法によって製造される。
　式（Ｉ）で示される化合物は、置換基の種類によっては、Ｅの立体配置を有するＥ体、およびＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明は、これらＥ体、Ｚ体、またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
　また、式（Ｉ）で示される化合物は、１個または２個以上の不斉炭素原子の存在に起因する光学活性体が存在する場合があるが、式（Ｉ）で示される化合物は全ての光学活性体またはラセミ体を包含する。
［1.角膜疾患の治療剤］
　本発明は、下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、角膜の疾患および外傷の治療剤（以下、「角膜疾患の治療剤」或いは「本発明の治療剤」等と称することがある）を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である｝。
　一態様において、Ｙが、単結合である場合は、Ｚは、置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していないアルキレン基、特に好ましくは、メチレン基）であり、Ａｒは置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、メチル基、水酸基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基または置換基を有していないアリール基、特に好ましくはフェニル基または水酸基を有するフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎは、０、１または２であり、好ましくは、ｎは０である。
　また、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基（より好ましくは、置換基を有している炭素数１～６のアルキレン基、特に好ましくは、メチル基またはエチル基で置換されたメチレン基）である場合は、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、メチル基、水酸基もしくはエトキシ基を有する、フェニル基またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎは、０、１または２であり、好ましくは、ｎは０である。
　式（Ｉ）で示される化合物の具体的な好ましい態様としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
［化合物（Ｉ－１）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、単結合であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキレン基（Ｃ１－６アルキレン基）であり、Ａｒは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル基、水酸基またはＣ１－６アルコキシ基を有していてもよいＣ６－１０アリール基である。）であり、
Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基（Ｃ１－６アルキル基）であり、
Ｒ３が、水酸基であり、且つ
ｎが、０、１または２である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－２）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、単結合であり、Ｚが、炭素数１～４のアルキレン基（Ｃ１－４アルキレン基）であり、Ａｒは、水酸基またはＣ１－４アルキル基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基である。）であり、
Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基（Ｃ１－４アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）であり、且つ
ｎが、０である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－３）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、単結合であり、Ｚが、メチレンであり、Ａｒは、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基である。）であり、
Ｒ２が、メチル、エチルまたはイソブチル（好ましくは、エチル）であり、且つ
ｎが、０である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－４）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基（Ｃ１－６アルキル基）で置換された炭素数１～６のアルキレン基（Ｃ１－６アルキレン基）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル基、水酸基またはＣ１－６アルコキシ基を有していてもよいＣ６－１０アリール基である。）であり、
Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基（Ｃ１－６アルキル基）であり、
Ｒ３が、水酸基であり、且つ
ｎが、０、１または２である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－５）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、炭素数１～４のアルキル基（Ｃ１－４アルキル基）で置換された炭素数１～４のアルキレン基（Ｃ１－４アルキレン基）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒは、ハロゲン原子、Ｃ１－４アルキル基、水酸基またはＣ１－４アルコキシ基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基である。）であり、
Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基（Ｃ１－４アルキル基）であり、且つ
ｎが、０である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－６）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されたメチレン基であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒは、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、水酸基、メトキシ基またはエトキシ基を有していてもよいフェニル基（好ましくは、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基）である。）であり、
Ｒ２が、メチル基、エチル基またはイソブチル基であり、且つ
ｎが、０である、式（Ｉ）で示される化合物。
［化合物（Ｉ－７）］
　前記式（Ｉ）中の
Ｘが、－ＮＨＣＯ－であり、
Ｒ１が、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されたメチレン基であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒは、ハロゲン原子（好ましくは、フッ素原子、臭素原子）または水酸基を有していてもよいフェニル基である。）であり、
Ｒ２が、メチル基、エチル基またはイソブチル基であり、且つ
ｎが、０である、式（Ｉ）で示される化合物。
　式（Ｉ）で示される化合物の特に好ましい具体例としては、後述する第１表に記載の化合物が挙げられる。
　本発明の治療剤の適用対象は、角膜疾患を罹患する可能性のある動物であれば特に限定されないが、本発明の治療剤の適用対象は通常哺乳動物であり、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウス、ラット等が例示される。好ましくは、本発明の治療剤の適用対象は、ヒトである。
　本発明の治療剤は、提供時または保存時に任意の形状であり得る。本発明の治療剤は、固形状、液体状、およびゲル状等の形状であり得る。本発明の治療剤は、通常、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤等の経口投与剤、点眼剤、眼軟膏剤、経皮吸収剤または眼科用注射剤として投与できる。これらの中では、低侵襲で簡便に眼局所に投与することができることから、点眼剤、眼軟膏剤、眼科用注射剤が好ましく、点眼剤が最も好ましい。本発明の治療剤は、単独で、または他の治療薬との混合物として投与できる。それらは、式（Ｉ）で示される化合物単体で投与してもよいが、一般的には医薬組成物の形態で投与する。それらの製剤は、薬理的、製剤学的に許容しうる添加物を加え、常法により製造することができる。すなわち、経口剤には通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、可塑剤、コーティング剤等の添加物を使用することができる。経口用液剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシル等の形態であってもよく、または使用前に水またはほかの適当な溶媒で調製するドライシロップとして供されてもよい。前記液剤は、懸濁化剤、香料、希釈剤または乳化剤のような通常の添加剤を含むことができる。眼科用注射剤は、水性剤形または用時溶解型剤形を形成するために、注射用蒸留水、生理食塩水、5%ブドウ糖溶液、プロピレングリコール等の溶解剤若しくは溶解補助剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、安定化剤等の製剤成分が使用される。
　眼軟膏剤は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用的な基材を調製することができる。点眼剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、プロピレングリコール等の等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等の緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、エデト酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の安定化剤、ベンザルコニウム塩化物、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル等の防腐剤、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の粘稠化剤、アスコルビン酸、トコフェノール等の抗酸化剤等を必要に応じて用いて調製することができる。ｐＨは、眼科製剤に許容される範囲内であればよいが、４～８の範囲が好ましい。ｐＨを調節する際には、塩酸、リン酸、クエン酸、水酸化ナトリム、水酸化カリウム、炭酸ナトリム等を用いることができる。以下に、本発明の治療剤の製剤例を例示するが、これらに限定されるものではない。
製剤例１
　以下の成分を含有する眼軟膏剤（１００ｇ中）を製造する。
成分
式（Ｉ）で示される化合物　　３００ｍｇ
　　　　　流動パラフィン　　　　１０ｇ
　　　　　　白色ワセリン　　　　　適量
製剤例２
　以下の成分を含有する点眼剤（１００ｍＬ中）を製造する。
成分
式（Ｉ）で示される化合物　　５００ｍｇ
　　　　水酸化ナトリウム　　９００ｍｇ
　　　　　　　滅菌精製水　　　　　適量
製剤例３
　以下の成分を含有する点眼剤（１００ｍＬ中）を製造する。
成分
式（Ｉ）で示される化合物　　５００ｍｇ
ポリオキシル３５ヒマシ油　　　９０ｍｇ
　　　　　　　　　　塩酸　　　　　適量
　　　　水酸化ナトリウム　　　　　適量
　　　　　　　滅菌精製水　　　　　適量
製剤例４
　以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分
式（Ｉ）で示される化合物　　　１０ｍｇ
　　　　　　　　　　乳糖　　　９０ｍｇ
　　　　微結晶セルロース　　　３０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　５ｍｇ
　　　　　　　　　CMC-Na　　　１５ｍｇ
　　　　　　　　　　　計　　１５０ｍｇ
製剤例５
　以下の成分を含有する注射用製剤を製造する。
式（Ｉ）で示される化合物　　　１００ｍｇ
　　飽和脂肪酸グリセリド　　１０００ｍＬ
　本発明の治療剤に含有される特定化合物またはその塩の含有量は、特に制限されないが、点眼剤の場合、下限は０．００１％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。上限は、５％（ｗ／ｖ）が好ましく、３％（ｗ／ｖ）がより好ましく、２％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、１％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
　本発明の治療剤をヒトに投与する場合、特定化合物またはその塩の投与量は、特に制限されないが、患者の年齢、性別、状態に応じて適宜選択できる。例えば、眼局所投与の場合は、投与量は１日あたり０．００００１～１００ｍｇ、好ましくは０．００１～１０ｍｇ、より好ましくは０．０１～１ｍｇ、最も好ましくは０．１～０．５ｍｇである。投与は、単回投与または複数回投与であり得る。例えば、本発明の治療剤が点眼剤の場合は、１回量１～５滴、より好ましくは１～２滴、最も好ましくは１滴を、１日１～３回、より好ましくは１日１～２回、最も好ましくは１日１回投与することができる。ここで１滴は、通常０．０１～０．１ｍＬである。これらの数値はあくまでも例示であり、投与量は患者の症状にあわせて決定されるものである。
　加溶媒分解によりまたは生理的条件下のインビボにおいて本発明の薬理学的に活性な化合物を生成する、化学的または代謝的に分解できる基を有する本発明に用いられる特定化合物の誘導体を、プロドラッグとして利用し得る。適当なプロドラッグを選択する方法および製造する方法は、例えば、Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９８５）に記載されている。本発明において、水酸基を有する化合物である場合は、該化合物と適当なアシルハライドまたは適当な酸無水物とを反応させることによって得られるアシルオキシ誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアシルオキシとしては、－ＯＣＯＣ２Ｈ５、－ＯＣＯ（ｔ－Ｂｕ）、－ＯＣＯＣ１５Ｈ３１、－ＯＣＯ（ｍ－ＣＯ２Ｎａ－Ｐｈ）、－ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ、－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、－ＯＣＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２等が挙げられる。本発明を形成する化合物がアミノ基を有する場合は、アミノ基を有する化合物と適当な酸ハロゲン化物または適当な混合酸無水物とを反応させることにより製造されるアミド誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアミドとしては、－ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２０ＯＣＨ３、－ＮＨＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３等が挙げられる。
　本発明の治療剤が適用され得る角膜疾患としては、角膜上皮障害、点状表層角膜症、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、角膜上皮剥離、無虹彩症、翼状片、強膜化角膜、角膜ジストロフィー、角膜炎、角膜上皮幹細胞疲弊症、薬傷、熱傷、スティーヴンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、糖尿病角膜症、水疱性角膜症、角膜内皮炎、フックス角膜内皮ジストロフィー、滴状角膜、虹彩角膜内皮症候群、角膜移植後の移植不全等が挙げられる。
　本発明の治療剤は、角膜細胞（角膜上皮細胞および／または角膜内皮細胞）の増殖を促進することを角膜疾患の治療の主な作用機序とする。従って、本発明の治療剤は、角膜細胞（角膜上皮細胞および／または角膜内皮細胞）の増殖促進剤（以下、「本発明の増殖促進剤」とも称する）とも言い換えることができる。なお、本発明の増殖促進剤は、本発明の治療剤の適用対象に適用してもよく、また、試験用または移植用の角膜細胞の培養培地に添加することもできる。
［2.角膜疾患の治療方法］
　本発明はまた、有効量の前記式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、角膜疾患の治療方法（以下、「本発明の治療方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の治療方法における、式（Ｉ）で示される化合物、治療対象、投与量、投与経路、投与回数、適用し得る角膜疾患等は、[1．角膜疾患の治療剤]に記載したものと同様である。
［3.角膜細胞の増殖促進方法］
　本発明はまた、前記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地組成物（以下、「本発明の培地」等と称することがある）を用いることを特徴とする角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の増殖促進方法を提供する。本発明の角膜細胞の増殖促進方法を用いることにより、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の増殖の促進および／または細胞凝集塊（スフェア）形成の促進を達成することができる。
　本発明の培地に有効成分として含まれる特定化合物の濃度は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、その濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下であり得る。
　本発明の培地は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物が配合されている以外は、公知の培地の組成と同様とすることができる。
　一態様において、本発明の培地は、市販される培地に、本発明に用いられる特定化合物または特定化合物を含有する組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう）を添加することにより調製することができる。当該組成物の成分としては、例えば、水、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびメタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール等の各種アルコール、等が含まれ得る。また、本発明の組成物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、「ろ過滅菌」という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は、特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。また、本発明の組成物は、提供時または保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒および溶解剤で溶解した溶液または懸濁液のような液体、あるいは基板や担体に結合させた状態であり得る。
　本発明に用いられる特定化合物または本発明の組成物を添加することにより本発明の培地とし得る市販の培地としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、角膜上皮細胞基礎培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＰＣＳ－７００－０３０（登録商標））、Ｐｒｉｇｒｏｗ　ｍｅｄｉｕｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）、イーグル基礎培地（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地等の培地が挙げられる。また、これらの培地に、脱アシル化ジェランガム等の多糖類を添加して３次元細胞培養培地化した培地を用いることができる。このような３次元細胞培養培地としては、例えば、ＦＣｅＭ（登録商標）（日産化学株式会社製）が挙げられるが、これに限定されない。
　また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等を目的に応じて添加してもよい。具体的な例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子－β、上皮成長因子、インスリン様成長因子、Ｗｎｔ蛋白質、インターフェロン類、インターロイキン類、血管内皮細胞増殖因子、アルブミン、インスリン、β－メルカプトエタノール、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸、亜セレン酸等が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の培地における細胞の培養は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。これらの培養容器には、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル（登録商標）、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニンまたはポリ－Ｄ－リジン等の細胞外マトリックスをコーティングすることができる。細胞凝集塊（スフェア）を形成させる際には、細胞が培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞低接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、または培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。このような容器の例としては、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト株式会社製）、超低接着表面プレート（コーニング社製）、ヌンクロンスフェラプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の培地により、細胞増殖促進等が達成される細胞種としては、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞が挙げられる。例えば、角膜内皮細胞は、角膜組織よりデスメ膜を剥離し、酵素学的処理にて内皮細胞を分離することにより得ることができる。これらの細胞は、ウイルスやゲノム編集等で遺伝子操作をなされたものであってもよい。また、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得られた角膜上皮細胞および角膜内皮細胞も好適に使用することができる。なお、これらの細胞の由来は、特に限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が好ましい。
　上述した通り、本発明の培地は角膜細胞（角膜上皮細胞および／または角膜内皮細胞）の増殖を促進することができるため、角膜細胞（角膜上皮細胞および／または角膜内皮細胞）増殖促進用培地組成物とも言い換えられる。
［4.角膜細胞の製造方法］
　本発明はまた、有効量の前記式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地を用いることを特徴とした、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある）を提供する。本発明の製造方法により得られた角膜上皮細胞および角膜内皮細胞は、角膜疾患を治療する際の移植用細胞として好適に用いることができる。
　本発明の製造方法における、式（Ｉ）で示される化合物、その添加量、培養する細胞、得られた細胞を用いた移植治療の対象となる角膜疾患等は、[1．角膜疾患の治療剤]および[3．角膜細胞の増殖促進方法]に記載したものと同様である。
　本発明の製造方法における細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は、自体公知の方法を用いればよく、または、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば、通常２５℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４体積％～１０体積％であり、４体積％～６体積％が好ましい。培養期間は、通常１乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
　以下の実施例において、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
　式（Ｉ）に示される化合物は、国際公開第２０１９／０２２２２２号または国際公開第２０１９／２３５５６９号に記載された方法またはそれらに準じた方法により製造することができる。本発明の実施例において用いた化合物の例を第１表に示すが、本発明に用いることが可能な化合物は、これらのみに限定されるものではない。
　表中、Ｍｅとの記載は、メチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載は、エチルを表す。Ｒ４における（Ｒ）は、Ｒ配置を意味し、（ｒａｃ）は、ラセミ体を意味する。また、Ｒ５は、アリール基の置換基であり、アリール基の置換基は、前記したものと同様である。なお、Ｒ５における「－」との記載は、無置換を表す。構造式に記載された番号は、Ｒ５の置換位置を表す。ｎは、０、１または２であり、ｍは、０、１、２、３、４または５である。Ｒ５が複数存在する場合、Ｒ５は、それぞれ同一であってもよく、または異なっていてもよい。
　　〔第１表〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　上記第１表に記載された化合物のうち、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：I－１０、ＧＡ－００２ＡおよびＧＡ－００５Ａは、国際公開第２０１９／０２２２２２号または国際公開第２０１９／２３５５６９号に記載されており、ＣＥ－００１、ＣＥ－００２およびＣＥ－００３は、新規化合物である。
　以下に、本発明の新規化合物の合成方法および構造式を示す。尚、１Ｈ－ＮＭＲはプロトン核磁気共鳴スペクトラムを表し、２７０ＭＨｚにて、重ジメチルスルホキシド中で測定した。ケミカルシフト値は、テトラメチルシランの値を０．００ｐｐｍとして記載した。また、ｓとの記載はシングレットを表し、以下同様にｂｒｓはブロードシングレットを、ｄはダブレットを、ｄｄはダブルダブレットを、ｔはトリプレットを、ｑはカルテットを、ｍはマルチプレットをそれぞれ表す。
〔合成例１〕ＣＥ－００１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　水素化アルミニウムリチウム（５５４ｍｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を氷冷下、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に懸濁させ、３－フルオロ－５－ヒドロキシベンゾニトリル（１）（１．０ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２時間、６０℃で１８時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウムリチウム（８３０ｍｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を追加して、更に４時間撹拌した。氷冷中、蒸留水（１．４ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．４ｍＬ）、蒸留水（４．２ｍＬ）を順次加え、析出した固体をセライトろ過にてろ別した。ろ液を減圧濃縮することにより、化合物（２）（７２６ｍｇ、５．１４ｍｍｏｌ、収率７０％）を無色固体として得た。得られた化合物（２）（７２６ｍｇ、５．１４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６．５ｍＬ）、蒸留水（６．５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、クロロギ酸フェニル（１．３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で３時間撹拌し、分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５０／５０）にて精製し、化合物（３）（４４２ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ、収率３３％）を無色固体として得た。得られた化合物（３）（０．４４ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をエタノール（３．４ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．４１ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を加えて、６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して、化合物（４）（２７３ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。得られた化合物（４）（１４４ｍｇ、０．７２３ｍｍｏｌ）および２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（５）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０～１００／０）にて精製し、得られた固体を水で懸濁洗浄することにより、ＣＥ－００１（９９．６ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ、収率５０％）を無色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.41(s, 1H), 9.87(s, 1H), 9.61(s, 1H), 9.54(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 6.84(t, J=8.1Hz, 1H), 6.60-6.40(m, 3H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.26(d, J=8.1Hz, 2H), 2.66(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
〔合成例２〕ＣＥ－００２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　５－アミノメチル－２－フルオロフェノール塩酸塩（６）（０．５０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．０ｍＬ）、水（５．０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（１．１６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．５８ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で２．５時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、酢酸エチル（２０ｍＬｘ２）で抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過、減圧濃縮することにより、化合物（７）（０．９５ｇ）を無色固体として得た。得られた化合物（７）（０．９５ｇ）をエタノール（４．０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた淡黄色固体を塩化メチレンで洗浄した後、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～１０／９０）にて精製することにより、化合物（８）（０．４１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、２工程収率９８％）を淡黄色固体として得た。得られた化合物（８）（１４４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（５）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで懸濁洗浄することにより、ＣＥ－００２（９６．４ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、収率４８％）を無色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.43(s, 1H), 9.82(brs, 1H), 9.59(s, 1H), 9.55(brs, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11-7.00(m, 1H), 6.91(d, J=10.8Hz, 1H), 6.79(t, J=8.1Hz, 1H), 6.75-6.70(m, 1H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.23(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.1Hz, 3H).
〔合成例３〕ＣＥ－００３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　５－アミノメチル－２－ブロモフェノール塩酸塩（９）（０．４８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．０ｍＬ）、水（５．０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（１．１６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．５６ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で１日撹拌した。水（５．０ｍＬ）、酢酸エチル（１０ｍＬ）を加えて分液し、酢酸エチル（５ｍＬｘ３）で抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過、減圧濃縮することにより、化合物（１０）（１．０ｇ）を黄色液体として得た。得られた化合物（１０）（１．０ｇ）をエタノール（４．０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて、６０℃で５時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた淡黄色固体を塩化メチレンで洗浄した後、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～１０／９０）にて精製することにより、化合物（１１）（０．４２ｇ、１．６ｍｍｏｌ、２工程収率８０％）を淡黄色固体として得た。得られた化合物（１１）（１８８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（５）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で４日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで懸濁洗浄することにより、ＣＥ－００３（１５９ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌ、収率６８％）を無色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.42(s, 1H), 10.20(brs, 1H), 9.62(s, 1H), 9.55(brs, 1H), 7.42(d, J=8.1Hz, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 6.83(t, J=8.1Hz, 1H), 6.79(d, J=8.1Hz, 1H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.24(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［実施例１］ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞増殖試験
　ヒト初代角膜上皮細胞は、{Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），＃ＰＣＳ－７００－０１０}を、角膜上皮細胞系添加物キット（ＡＴＣＣ，＃ＰＣＳ－７００－０４０）を添加した角膜上皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ，＃ＰＣＳ－７００－０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。角膜上皮細胞を同培地に懸濁した後、終濃度１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物をそれぞれ添加し、９６ウェル平底プレート（コーニング社，＃３５８５）およびイメージング解析用プレート（パーキンエルマー社，ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－９６Ｕｌｔｒａ）に７００ｃｅｌｌｓ／６４μＬ／ウェル乃至１６００ｃｅｌｌｓ／６４μＬ／ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。培養後、ＡＴＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）を用いて生細胞数を計測した。平底プレートの培養液に対してＡＴＰ試薬を６４μＬ／ウェル添加し懸濁させ、懸濁液１００μＬ／ウェルをアッセイ用白色プレート（コーニング社，＃３９１２）へ移した。１０分間室温で静置した後、プレートリーダー（パーキンエルマー社，ＥｎＳｐｉｒｅ）を用いて発光量を測定した。また、イメージング解析用プレートで培養した細胞は、培地を４％パラホルムアルデヒド溶液へ交換し、室温で１０分間静置することによって固定した。固定した細胞に対して、ｐ６３－α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，＃４８９２）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７修飾抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，＃Ａ－２１２４４）を用いて、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の推奨プロトコルに従い、蛍光免疫染色を行った。さらに、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液で細胞核を染色した。染色した細胞はＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳの２０倍対物レンズを用いて、１ウェルあたり９視野撮像した。
　測定した発光量について、対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、発光量が１．５倍以上増加した。すなわち、下記の化合物の添加により細胞数が１．５倍以上に増加していた。また、イメージング解析の結果、ｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１を添加したときのすべての細胞がｐ６３α陽性であった。このことから、本発明の組成物は、ｐ６３α陽性のヒト角膜上皮細胞の増殖促進効果を有していることが示された。
　細胞数が、１．５倍以上に増加した化合物：
ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ＧＡ－００２Ａ、ＧＡ－００５Ａ、ＣＥ－００１、ｋ－１：I－１０、ＣＥ－００２、ＣＥ－００３
　細胞数が、２倍以上に増加した化合物：
ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ＧＡ－００５Ａ、ＣＥ－００１、ｋ－１：I－１０、ＣＥ－００２
［実施例２］ウシ角膜内皮細胞を用いた細胞増殖試験
　ウシ角膜内皮細胞株ＢＣＥ　Ｃ／Ｄ－１ｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），＃ＣＲＬ－２０４８）を、１０％ウシ血清（ＡＴＣＣ，＃３０－２０３０）を添加したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ，＃３０－２００２）を用いて前培養した。角膜内皮細胞を同培地に懸濁した後、単層培養法（２Ｄ）では、９６ウェル平底プレート（コーニング社，＃３５８５）に７００ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。三次元培養法（３Ｄ）では、９６ウェルＵ底細胞低接着プレート（コーニング社，＃４５２０）に７００ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物を１０μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。培養後、ＡＴＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）を用いて生細胞数を計測した。培養液に対してＡＴＰ試薬を１００μＬ／ウェル添加し懸濁させ、懸濁液１００μＬ／ウェルをアッセイ用白色プレート（コーニング社，＃３９１２）へ移した。１０分間室温で静置した後、プレートリーダー（パーキンエルマー社，ＥｎＳｐｉｒｅ）を用いて発光量を測定した。
　測定した発光量について、２Ｄおよび３Ｄそれぞれにおける対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、発光量が、２Ｄでは１．４倍以上、３Ｄでは２倍以上増加した。すなわち、下記の化合物の添加により細胞数が１．４倍以上に増加していた。このことから本発明の組成物は、角膜内皮細胞の増殖促進効果を有していることが示された。
　細胞数が、１．４倍以上に増加した化合物（２Ｄ）：
５μＭ；ＧＡ－００５Ａ、ＣＥ－００１
１０μＭ；ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：I－１０
　細胞数が、２倍以上に増加した化合物（３Ｄ）：
１０μＭ；ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ＧＡ－００２Ａ、ＧＡ－００５Ａ、ＣＥ－００１、ｋ－１：I－１０、ｋ－１：Ｈ－１
　本発明の角膜治療剤の投与により、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の減少に起因する疾患を治療することができる。従って、本発明の角膜治療剤は、各種角膜疾患の治療に好適に用いられ、医療分野において極めて有益である。
　本出願は、日本国で２０１９年３月１２日に出願された特願２０１９－０４４８５４を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、角膜疾患の治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
  2. 　Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
    ｎが、０であり、
    Ａｒが、水酸基またはＣ１－４アルキル基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
    Ｙが、単結合であり、および
    Ｚが、炭素数１～４のアルキレン基である、
    請求項１記載の角膜疾患の治療剤。
  3. 　Ｒ２が、炭素数１～４のアルキル基であり、
    ｎが、０であり、
    Ａｒが、ハロゲン原子、Ｃ１－４アルキル基、水酸基またはＣ１－４アルコキシ基を有していてもよい、フェニル基またはナフチル基であり、
    Ｙが、炭素数１～４のアルキル基で置換された炭素数１～４のアルキレン基であり、および
    Ｚが、単結合である、
    請求項１記載の角膜疾患の治療剤。
  4. 　Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
    ｎが０であり、
    Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
    Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
    請求項１記載の角膜疾患の治療剤。
  5. 　Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
    ｎが０であり、
    Ａｒが、水酸基またはハロゲン原子を有していてもよいフェニル基であり、および
    Ｙが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、
    請求項１記載の角膜疾患の治療剤。
  6. 　Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
    ｎが０であり、
    Ａｒが、水酸基またはメチル基を有していてもよいフェニル基であり、および
    Ｙが、単結合である、請求項１記載の角膜疾患の治療剤。
  7. 　Ｚが、単結合である、請求項４記載の角膜疾患の治療剤。
  8. 　Ｚが、メチル基またはエチル基を有していてもよいメチレン基である、請求項５または６に記載の角膜疾患の治療剤。
  9. 　角膜疾患が、角膜上皮障害、点状表層角膜症、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、角膜上皮剥離、無虹彩症、翼状片、強膜化角膜、角膜ジストロフィー、角膜炎、角膜上皮幹細胞疲弊症、薬傷、熱傷、スティーヴンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、糖尿病角膜症、水疱性角膜症、角膜内皮炎、フックス角膜内皮ジストロフィー、滴状角膜、虹彩角膜内皮症候群、および角膜移植後の移植不全からなる群から選択される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の剤。
  10. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、角膜疾患の治療方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
  11. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地組成物中で角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の培養することを特徴とする、角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の増殖を促進する方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ｛式中、Ｘは、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、各々独立して、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
  12. 　前記、請求項１１に記載の方法を用いることを特徴とする角膜上皮細胞または角膜内皮細胞の製造方法。
  13. 　下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    で示される化合物またはその塩。
     
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